Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электрогенные реакции в пигмент-белковом комплексе фотосистемы 2

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Электрогенные реакции в пигмент-белковом комплексе фотосистемы 2"

На правах рукописи

Тгоняткина Анна Анатольевна

Электрогенные реакции б пигмент-белковом комплексе фотосистемы 2

Специальность: 03.00,02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ООЗиьо^""

Москва — 2007

003066963

Работа выполнена в отделе биоэнергетики НИИ Физико-химической биологии им. АЛ. Белозерского Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук Мамедов Махир Джафар оглы

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Надточенко Виктор Андреевич

доктор биологических наук Нокс Пётр Петрович

Ведущая организация:

Институт фундаментальных проблем биологии РАН

Защита состоится «25» октября 2007 г. в ___ ч мин на заседании Совета Д.501.001.96 в Московском Государственном Университете по адресу: 119992, г. Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, кафедра биофизики, Новая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « № сентября 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук, профессор Т.Е. Кренделева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Одной из основных проблем современного естествознания является изучение молекулярных механизмов фотосинтеза Основным итогом фотохимической стадии преобразования энергии света при оксигенном фотосинтезе является фотоперенос электронов от воды к НАДФ+ за счет нециклического транспорта электронов при последовательном участии пигмент-белковых комплексов фотосистемы 2 (ФС 2), цитохромного b6f комплекса и фотосистемы 1, локализованных в тилакоидных мембранах цианобактерий, водорослей и высших растений Фотосинтетическое окисление воды является важнейшим фундаментальным процессом, глобальный масштаб которого (при ярком солнечном свете ФС 2 окисляет около 100 молекул воды в секунду) и его значимость в круговороте веществ в природе трудно переоценить (Tommos, Babcock, 2000) Однако вследствие сложной организации и лабильности кислород-выделяющего комплекса (КВК) остается неясным молекулярный механизм функционирования его ключевых этапов

Значительный прогресс в изучении комплекса ФС 2 был связан с проведением рентгеноструктурного анализа (РСА) кристаллов сердцевинных комплексов (CK) ФС 2 из двух термофильных цианобактерий Thermosynechococcus elongatus и Thermosynechococcus vulcanus с разрешением 3,8-3,0 A (Kamiya and Shen, 2003, Ferreira et al. 2004, Loll et al 2005) Комплекс ФС 2 представляет собой димер, каждый мономер которого содержит 19 отдельных белковых субъединиц (16 интегральных и 3 периферических) и 77 кофакторов Хлорофилл-содержащие светособирающие антенные белки СР43 и СР47, входящие в состав CK ФС 2, передают энергию возбуждения к реакционному центру (РЦ), который состоит из двух псевдогомологичных субъединиц D1 и D2 и содержит кофакторы, участвующие в электрон-транспортной цепи В комплексе ФС 2 связаны воедино одноэлектронный процесс переноса электрона между первичным донором электрона Р680 и хинонным акцептором QA с последующим восстановлением Р6во+ от редокс-активного аминокислотного остатка тирозина-161 (Yz) Dl-субъединицы, двухэлекгронное восстановление вторичного хинона Qb (2 QB + 4 е" + 4 Hh 2 QbH2) и четырехэлектронное окисление молекулы воды (2 Н20 02 + 4е" + 4 НГ)

Одной из наиболее актуальных проблем в изучении функционирования этого ферментного комплекса является выяснение физико-химического механизма сопряжения переноса электронов и протонов в железо-хинонном акцепторном комплексе Другой актуальной проблемой, имеющей большое значение для выяснения механизма фотолиза воды, является изучение реакции переноса электрона на донорной стороне ФС 2 Исследования с помощью прямого электрометрического метода, проводимые на протеолипосомах, содержащих комплексы ФС 2, позволяют выявить кинетики и относительный вклад отдельных электрогенных реакций в суммарный электрогенез в ответ на единичные вспышки света А сами протеолипосомы могут служить хорошей моделью для изучения механизмов внутрибелкового переноса заряда

Целью настоящей работы явилось выяснение молекулярных механизмов образования трансмембранной разности электрических потенциалов (А1?), генерируемой комплексом ФС 2 в модельной системе с помощью прямого электрометрического метода Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

1 выделить препараты СК ФС 2 с активным и неактивным (лишенным марганцевого кластера (—Мп)) КВК с последующим включением их в липосомальную мембрану,

2 изучить образование мембранного потенциала, обусловленного переносом зарядов на акцепторном участке ФС 2 с активным КВК,

3 изучить образование мембранного потенциала, обусловленного переносом электронов в присутствии таких редокс-медиаторов, как Н,М,1Ч'1Ч'-тетраметил-и-фенилендиамин (ТМФД), 2,6-дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) и метиленовый синий (МС) в препаратах СК ФС 2 (-Мп)

Научная новизна работы Показано, что протеолипосомы, содержащие препараты СК ФС 2, в которых КВК расположен вблизи наружной поверхности протеолипосомальной мембраны, являются удобной моделью для исследования механизма образования АЧ* с помощью электрометрии

В условиях реконструкции функции СЬ на акцепторном участке ФС 2 в ответ на вторую вспышку света было продемонстрировано наличие дополнительной электрогенной фазы, обусловленной протежированием дважды восстановленной

формы Ов Максимальная амплитуда данной фазы составляет ~11% от кинетически-неразрешимой фазы У20К(3Л-

Установлено, что элекгрогенная реакция восстановления окисленного негемового железа, (Ренг3+), наблюдаемая в ответ на первую вспышку света, обусловлена переносом протона из внешней водной фазы к неидентифицированному аминокислотному остатку X вблизи Рекг

Впервые на протеолипосомах, содержащих СК ФС 2, лишенные марганцевого кластера, было продемонстрировано наличие электрогенной стадии, обусловленной векторным переносом электрона от редокс-медиаторов (ТМФД и ДХФИФ) к редокс-активному тирозину У20К Эти данные свидетельствуют об электроизолированной локализации внутри белкового гетеродимера Т>\Ю2

Научно-практическая значимость работы. Полученные в работе данные вносят вклад в решение фундаментальной проблемы изучения механизмов переноса зарядов в мембранных энергопреобразующих белках, а также могут являться основой для создания искусственных систем, преобразующих и запасающих солнечную энергию, в том числе осуществляющих фотолиз воды с образованием водорода и кислорода Кроме того, эти результаты могут найти применение при изучении светозависимого синтеза АТФ в системе бесклеточного синтеза белка и при тестировании эффективности гербицидов

Адробапия работы. Материалы диссертации были представлены на IV съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), на 13ой Европейской биоэнергетической конференции (Пиза, Италия, 2004), на юбилейной конференции, посвященной 70-летию В П Скулачева «Российская Биоэнергетика от молекул к клетке» (Москва, 2005), на Московском городском семинаре по биоэнергетике (2005,2006, 2007), на Зей и 4ой Всероссийских школах-симпозиумах «Динамика и структура в химии и биологии» (Черноголовка, 2005, 2006), на 14ой Европейской биоэнергетической конференции (Москва, 2006), на Международной конференции «Фотосинтез в постгеномную эру структура и функции фотосистем» (Пущино, 2006), на Международной конференции «Солнечная энергия и искусственный фотосинтез» (Лондон, Великобритания, 2007), а также на семинарах фотобиологического общества России и кафедры биофизики биологического факультета МГУ (Москва, 2007)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них 1 в реферируемом научном российском журнале (из списка ВАК), 1 в реферируемом зарубежном журнале и 7 в тезисах конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Диссертация изложена на

_страницах текста и включает_таблицы и_рисунка Список литературы

содержит_источника (из них_на английском языке)

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования были использованы препараты СК ФС 2 с активным комплексом окисления воды (Ghanotakis et al, 1987), выделенные из листьев шпината. Выбор объекта, прежде всего, обусловлен тем, что данные препараты характеризуются минимальным субъединичным составом, сохраняющим способность к выделению кислорода Степень очистки ферментного комплекса ФС 2 контролировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле Скорость выделения кислорода измеряли полярографически с использованием закрытого электрода Кларка Препараты СК ФС 2 (-Мп) были получены путем инкубации образцов в присутствии 0,8 мМ Tns-HCl (рН 9,0) в течение 30 мин при комнатной температуре с последующей отмывкой и центрифугированием (Albrink et al, 2002) Содержание марганца в препаратах СК ФС 2 определяли с помощью пламенно-абсорбционного спектрометра AAC КВАНТ-2А (Россия) Липосомы были получены путем озвучивания суспензии азолектина (L-a-лецитин, тип II-S, Sigma) в среде, содержащей 20 мМ HEPES-NaOH (рН 7,5) и 2% холат натрия с помощью дезинтегратора УЗДН-2Т до просветления Протеолипосомы были приготовлены путем смешивания фосфолипидных везикул с препаратами СК ФС 2 в соотношении липид белок 50.1 по весу Удаление детергента осуществлялось на колонке с сефадексом G-25, уравновешенной соответствующим буфером Для реконструкции вторичного хинонного акцептора Qb, в раствор липида добавляли децил-пластохинон dPQ (2,3-диметил-5-децил-1,4-бензохинон). Кинетику генерации ДТ на мембранах протеолипосом, содержащих СК ФС 2 с активным КВК и СК ФС 2 (-Мп), регистрировали при помощи прямого электрометрического метода (Семенов и др, 2004) Суть метода сводится к встраиванию замкнутых белково-липидных везикул в

коллодиевую пленку (нитроцеллюлоза в амилацетате), пропитанную раствором фосфолипидов в декане и регистрации М* при помощи хлорсеребряных макроэлектродов, погруженных в раствор по обе стороны от искусственной липидной мембраны Время разрешения измерительной системы составляет 0,1 мкс В качестве источника возбуждающего света использовали вспышки неодимового YAG лазера (YG-481 Quantel, длина волны 532 нм, полуширина импульса 15 не, энергия вспышки 30 мДж/см2) Кинетический анализ сигналов проводили с помощью пакета программ Pluk (разработан Я Калайдзидис (Kalaidzidis et al, 1997), а также программы Origin 6 0 (Microcal, США)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разделение зарядов в ФС 2

На рис 1 показан типичный электрический ответ протеолипосом, содержащих препараты СК ФС 2, индуцированный вспышкой лазера Видно, что в ответ на вспышку света происходит быстрое нарастание электрического потенциала за время более короткое, чем временное разрешение измерительной установки (~0,1 мкс) Как было показано ранее (Мамедов, 1999), наблюдаемое быстрое образование АЧ* обусловлено разделением зарядов между «специальной парой» молекул хлорофилла Р68о и хинонным акцептором Qa с последующим восстановлением фотоокисленного Рб80+ от редокс-активного тирозина Yz- Судя по знаку фотоэлектрического ответа («минус» внутри протеолипосом), КВК расположен вблизи наружной поверхности протеолипосомальной мембраны Отсутствие влияния непроникающего через мембрану восстановителя дитионита натрия на амплитуду фотоэлектрического ответа указывает на то, что в протеолипосомах СК ФС 2 практически полностью ориентированы акцепторным участком во внутрь везикулы Такие протеолипосомы представляют собой удобную модель для исследования электрогенных реакций КВК, активность которого можно стабилизировать глицинбетаином

Медленный спад фотоэлектрического ответа обусловлен переходом из состояния S2Qa" в состояние SjQa (S2/Si - состояния окисления марганцевого кластера КВК), для которого типичные времена жизни составляют порядка нескольких секунд при комнатной температуре (Rappaport et al, 2002) В протеолипосомах, содержащих препараты СК ФС 2 с неактивными КВК, фотоэлектрический ответ имеет более быстрый спад (см рис 9) и определяется, в

основном, рекомбинацией заряда между (3А~ и Yzж в ответ на единичные вспышки света

О ~1

-3

о

1000 2000 3000

Время, мс

Рис. 1. Образование трансмембранной разности электрических потенциалов в протеолипосомах, содержащих СК ФС 2 с активным КВК Среда инкубации содержала 20 мМ НЕРЕ^аОН (рН 7,0), 15 мМ N3«, 10 мМ СаС12 и 5 мМ 1У^С12. Здесь и далее стрелкой указан момент лазерной вспышки.

Следует отметить, что в образцах с активным КВК в присутствии добавленного акцептора электронов 2,5-дихлор-и-бензохинона амплитуда быстрой кинетически-неразрешимой фазы ДЧР в ответ на третью вспышку света оказалась на ~10% меньше, чем амплитуда в ответ на первую вспышку (не показано) Таким образом, в используемых препаратах протеолипосом в -90% ФС 2 восстановление У^* происходит за счет переноса электронов от КВК.

Электрогенное восстановление вторичного хинонного акцептора (2В

Одной из наиболее актуальных проблем в изучении функционирования комплексов ФС 2 является выяснение физико-химического механизма сопряжения процессов переноса электронов и протонов в хинонном акцепторном комплексе в ходе двухэлектронного каталитического цикла восстановления вторичного акцептора

Ранее с помощью электрометрического метода на протеолипосомах, содержащих ФС 2 из шпината (Hook, Brzezmki, 1994) и из цианобактерий Anacystis nidulans (Mamedov et al, 1994) было продемонстрировано, что протонирование дважды восстановленной формы Qb сопровождается появлением дополнительной фазы в кинетике генерации с амплитудой -5% от фазы YzokQa~ Однако

Qb

оставался неясным вопрос, почему электрогенная «хинонная» фаза в комплексах ФС 2 имеет значительно меньшую амплитуду, чем аналогичная фаза, наблюдаемая в хроматофорах и РД пурпурных фотосинтезирующих бактерий (~20% от Р! Qa ) (Semenov, 1991, Shinkarev et al, 1993) Поэтому представлялось необходимым исследовать механизм генерации мембранного потенциала, обусловленный функционированием хинон-акцепторного комплекса в препаратах СК ФС 2 из шпината с активным КВК

При выделении препаратов СК ФС 2 происходит экстракция QB (Ghanotakis et al, 1987) Однако, как было показано ранее, функция QB может быть в значительной степени восстановлена добавлением экзогенного хинона (Mamedov et al, 1999) Возможность реконструкции функции вторичного хинона QB в протеолипосомах, содержащих СК ФС 2, позволила нам с помощью прямого электрометрического метода изучить реакции переноса заряда на акцепторном участке Известно, что пластохинон (PQ) и децил-пластохинон (dPQ) имеют близкие значения среднеточечных потенциалов (Em) и рК, но dPQ является более гидрофильным и имеет больший коэффициент распределения в системе вода-липид (Rich, Harper, 1990). Для реконструкции функции QB в декановый раствор фосфолипидов был добавлен dPQ (~30 мг/мл)

На рис 2 показаны фотоэлектрические ответы, индуцированные первой (А) и второй (Б) лазерными вспышками, на адаптированных к темноте протеолипосомах, содержащих СК ФС 2 в условиях реконструкции переноса электрона от QA к QB Кинетически-неразрешимая фаза, наблюдаемая под действием как первой, так и второй вспышек света, соответствует разделению зарядов между P6so и QA с последующим восстановлением Р68о+ от YZ0K (Мамедов и др, 1999) Как видно на рис 2Б в кинетике фотоэлектрического ответа на вторую вспышку появляется дополнительная электрогенная фаза Разность между кинетическими кривыми фотоответов, индуцированных первой и второй вспышками, приведена на рис 2В. Амплитуда данной электрогенной фазы максимальна при временном интервале между двумя вспышками до 5 с При дальнейшем увеличении интервала амплитуда этой фазы снижается, и разница в амплитудах ответов на первую и вторую вспышки исчезает (данные не приведены) Максимальная амплитуда дополнительной фазы с характерным временем х ~0,85 мс при рН 7,3 составляет ~11% от величины

кинетически-неразрешимой фазы фотоэлектрического ответа, обусловленной образованием Уг^Си Эта фаза исчезает при добавлении 5 мкМ диурона, являющегося ингибитором переноса электрона от (2а к <Зв (не показано)

£

и, о

т, мс

Рис. 2. Образование трансмембранной разности электрических потенциалов в адаптированных к темноте

протеолипосомах, содержащих СК ФС 2 с активным комплексом окисления воды, в ответ на первую (А) и вторую (Б) лазерные вспышки; (Л) - разность фотоответов (А— Б). Среда инкубации содержала 25 мМ Нерея^аОН, рН 7,3, 10 мМ СаС12 и 30 мг/мл <1РС>.

На Рис 3 представлена зависимость величины дополнительной электрогенной фазы от концентрации <1Р(3 По сравнению с хроматофорами фотосинтезирующих бактерий (вЬткатеу е1 а1, 1993) для полной реконструкции функции вторичного хинонного акцептора в ФС 2 необходим^ большая концентрация хинона Возможной причиной этого могут быть различные значения констант связывания убихинона-10 и с сайтом Рв в бактериальных РЦ и РЦ ФС 2, соответственно Максимальная амплитуда электрогенной «хинонной» фазы достигается при концентрации с1Р(3 свыше 25 мг/мл

На Рис 4А представлена зависимость амплитуды «хинонной» электрогенной фазы от рН Амплитуда данной фазы составляет ~11% от амплитуды кинетически-неразрешимой фазы, связанной с образованием У20К<3А~ в интервале рН от 6,0 до 8,1 и резко уменьшается при дальнейшем повышении рН Такое изменение амплитуды может объясняться уменьшением константы равновесия суммарного процесса восстановления, протонирования и диссоциации хинона после второй вспышки света (БЬюкагеу, МУгащЬЛ, 1993).

10£

5 0

Рис 4. Зависимость от рН амплитуды (А) и константы скорости (к = 1/т) (Б) «хинонной» электрогенной фазы. Амплитуда представлена в процентах от амплитуды фазы, обусловленной образованием Уг01С(2А~- Среда инкубации содержала 10 мМ СаСЬ, 30 мг/мл ЙР<2 и соответствующий буфер со значением рК в области задаваемого рН.

Зависимость логарифма константы скорости (к=1/х) электрогенного протонирования (¿в2~ от рН среды инкубации показана на Рис 4Б В интервале значений рН от 6,0 до 8,3 скорость реакции слабо зависит от рН, в то время как при дальнейшем повышении рН наблюдается ее значительное замедление Появление

7'5Рн

такой зависимости в щелочных условиях свидетельствует о том, что при высоких значениях рН лимитирующей стадией в образовании дополнительной фазы является перенос протона из водной фазы

Таким образом, чувствительность дополнительной электрогенной фазы к диурону, зависимость ее амплитуды от номера вспышки света, а также зависимость амплитуды и константы скорости от рН свидетельствуют о том, что наблюдаемая в ответ на вторую вспышку света фаза обусловлена протежированием дважды восстановленной формы СЬ в комплексах ФС 2 При этом реакция переноса электрона между хинонами Од" и неэлектрогенна, хотя образование <3В~ может быть сопряжено с такими электрогенными процессами как (1) поглощение протонов аминокислотными остатками, расположенными вблизи поверхности белка РЦ, (2) перераспределение протонов внутри белка РЦ, (3) смещение заряженных аминокислотных остатков при конформационных изменениях в белке (Окатига й а1, 2000) Полученные нами результаты показывают, что сайт связывания СЬ погружен вглубь гидрофобной фазы белка, и протежирование дважды восстановленного СЬ (~11% от Уг0КС>А~) сопряжено со связыванием Н+-ионов из наружной водной фазы

В соответствии с моделью, описанной в работе (Хюгщ е1 а1, 1996), гидрокарбонат, являющийся лигандом для негемового Ре2+ на акцепторном участке ФС 2, может выступать в качестве донора первого протона для СЬ2" через интермедиат Б1-Н252, а молекула связанной воды, в свою очередь, может донировать второй протон на С>в2"

Fe ©

Рис 5. Гипотетические водородные связи в сайте связывания Qb (Ishikita, Knapp, 2005).

Согласно данным РСА, в комплексах ФС 2 QB локализован в глубине полости белка и, в отличие от бактериальных фотосинтетических РЦ, окружен исключительно

гидрофобными аминокислотными остатками (Ferreira et al, 2004, Loll et al, 2005) Расположение ближайших аминокислотных остатков указывает на возможное участие His252 и Ser264 Dl-субъединицы в реакции протонирования QB2" (Рис 5) В работе (Ishikita, Knapp, 2005) было предположено, что захват протона из внешней водной фазы происходит с участием His252, a Ser264 переносит протон к дистальному кислороду QB

Связанный с протоном перенос электрона между первичным хинонным акцептором QA~ и окисленным негемовым железом Fe3*

В комплексах ФС 2 семихиноны QA" и QB" находятся в магнитном взаимодействии с негемовым железом (FeHr2+), локализованным между ними (Fufezan et al, 2005) Однако роль железа в переносе электрона между QA и QB не выяснена В ФС 2 негемовое железо может окисляться в темноте в присутствии феррицианида калия (Diner, Petrouleas, 1987, Diner et al, 1991) В этих условиях в ответ на первую вспышку света восстановление Fe3+ от QA~ сопровождается захватом одного протона из внешней водной фазы (Bögershausen, Junge, 1995) При этом, как перенос электрона, так и транспорт протона в ФС 2 могут иметь либо электрогенный, либо неэлектрогенный характер Измерения электрохромного сдвига полос поглощения каротиноидов при инкубации тилакоидов в присутствии феррицианида калия показали, что в ответ на первую вспышку света, помимо быстрой фазы, обусловленной образованием Yz°KQA", в субмиллисекундном временном диапазоне появляется дополнительная электрогенная фаза (Haumann et al, 1995) На основании полученных данных был сделан вывод о том, что электрогенными реакциями являются как перенос электрона между QA" и Fe3+, так и захват протона из внешней водной фазы (Haumann et al, 1995) Однако это предположение требовало строгого экспериментального доказательства. Дополнительная генерация мембранного потенциала в ответ на первую вспышку света, обусловленная восстановлением негемового железа, была также продемонстрирована на протеолипосомах, содержащих комплексы ФС 2 (Mamedov et al, 2000) Нашей целью было выявить природу данной дополнительной электрогенной фазы, то есть установить обусловлена ли она переносом электрона на Fe3+ или протонированием близлежащего аминокислотного остатка Для этого нами было изучено влияние замены Н20 на D2O и температуры на кинетику электрогенной фазы, связанной с восстановлением Fe3+

Рис. 6. Образование трансмембранной разности электрических потенциалов в адаптированных к темноте протеолипосомах, содержащих СК ФС 2 с активным КВК, в ответ на первую (1) и вторую (2) лазерные вспышки (А); разность фотоответов (1-2) (Б). Среда инкубации содержала 20 мМ НЕРЕв^аОН (рН 7,0), 10 мМ N301, 5 мМ СаС12,0,4 М сахарозы и 1 М глицинбетаина. Интервал между вспышками 1 с.

На Рис 6А показан электрический сигнал в ответ на первую (1) и вторую (2) лазерные вспышки в адаптированных к темноте СК ФС 2 в присутствии 1 мМ феррицианида калия внутри протеолипосом В этих условиях <За восстанавливает Ре3+ между вспышками и стабилизируется в ответ на вторую вспышку света В ответ на первую вспышку света в кинетике фотоэлектрического ответа помимо быстрой фазы, обусловленной образованием У20К(3А", появляется дополнительная электрогенная фаза в субмиллисекундном диапазоне (кривая 1), в то время как эта фаза отсутствует в ответ на вторую (кривая 2) и последующие (данные не приведены) вспышки света

Дополнительная электрогенная фаза, индуцированная первой лазерной вспышкой, наблюдается после 10 мин темновой адаптации образца Известно, что негемовое железо, локализованное на акцепторном участке, окисляется в минутном временном диапазоне (Неп^ег et а1, 1987) Разница между фотоответами на первую и вторую вспышки света показана на Рис 6Б и характеризуется временем —0,1 мс при рН 7,0 Амплитуда дополнительной электрогенной фазы, обусловленной восстановлением негемового железа Ре3+ от <3А", составляет -20% от амплитуды компоненты, соответствующей разделению зарядов У2°*С)А~ Несколько большее значение амплитуды аналогичной фазы наблюдалось в тилакоидах (-30%) с помощью измерения электрохромного сдвига полос поглощения каротиноидов (Нашпапп е1 а1, 1995) Такое расхождение, по-видимому, может объясняться различием в

используемых образцах и методах измерения Добавление в среду инкубации диурона подавляет дополнительную фазу генерации ДЧ* в ответ на первую вспышку (не показано) Аналогичные результаты были получены на тилакоидах (Haumann et al, 1995, см также Wraight, 1985) Отсутствие дополнительной электрогенной фазы в присутствии диурона может объясняться структурными изменениями вокруг QA, появление которых, вероятно, предотвращает связывание протонов белковым окружением (Haumann, Junge, 1994) Как упоминалось выше, восстановление окисленного негемового железа сопровождается захватом протона (Bögershausen, Junge, 1995) В этих условиях выброс протона на донорной стороне фермента в ответ на первую вспышку света блокируется (Renger et al, 1987) Кинетика дополнительной электрогенной фазы аппроксимируется одной экспонентой (рис 6Б) Это указывает либо на сопоставимые значения скоростей электронного и протонного транспорта при фотоиндуцированном восстановлении Fe3+, либо на незначительный вклад одной из этих компонент в общий электрогенез Для выяснения природы субмиллисекундной электрогенной компоненты кинетика генерации Д*Р изучалась в условиях изотопного замещения Н20 на D20 (рис 7)

0,25

4»,75

0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Время, мс

Рис. 7 Влияние изотопного замещения НгО на 020 на дополнительную электрогенную фазу, обусловленную восстановлением окисленного негемового железа.

Фотоэлектрические ответы нормированы по амплитуде кинетически-неразрешимой

электрогенной фазы.

При этом кинетически-неразрешимая фаза, обусловленная разделением зарядов Yz°kQa\ не изменилась, а дополнительная электрогенная фаза замедлилась примерно в 2 5 раза Подобные эффекты наблюдались для некоторых протон-зависимых этапов переноса заряда в КВК ФС 2 (Karge et al, 1997), бактериальных РЦ (Maroti, Wraight, 1997) и для цитохромоксидазы (Siletsky et al, 2004) Полученное значение изотопного

эффекта позволяет говорить о первичном изотопном эффекте, при котором протон напрямую участвует в скорость-лимитирующем этапе реакции (DeCoursey, Cherny, 1997) В случае вторичного изотопного эффекта, характеризующегося более низкими значениями (1,02-1,4), замена протона на дейтерон происходит на удалении от участка первичной реакции (Kirsch, 1977) Таким образом, полученные нами данные являются доказательством того, что субмиллисекундная электрогенная компонента определяется транспортом протона Данные РСА препаратов CK ФС 2 показали, что Qa и негемовое железо локализованы на одинаковой глубине по отношению к предполагаемой границе липидного бислоя (Ferreira et al, 2004) Таким образом, вкладом реакции переноса электрона в суммарный электрогенез можно пренебречь Тем самым, можно предположить, что электрогенная фаза, сопровождающая восстановление Fe3+, может быть объяснена векторным внутрибелковым транспортом протона к предполагаемому аминокислотному остатку вблизи негемового железа Это предположение подтверждается также и наблюдавшейся зависимостью дополнительной электрогенной фазы от температуры Кинетические кривые для дополнительной электрогенной фазы, приписываемые протон-зависимому электронному транспорту от QA" к Fe3+ при 5°С и 32°С, показаны на Рис 8А Сопоставление этих кривых указывает на значительное замедление кинетики реакции при уменьшении температуры Рис SE показывает зависимость константы скорости субмиллисекундной компоненты при температуре ниже 33°С (pH 7,0) в координатах Аррениуса

Энергия активации, определенная по наклону кривой, составляет ~47 ± 3,5 кДж/моль Похожие значения энергии активации наблюдались для светозависимых и редокс-зависимых внутрибелковых перемещений протона (Tittor et al, 1989, Gopta et al, 1998, Siletsky et al, 2000) В то же время реакции транспорта электрона, не связанные с переносом протона, имеют значительно более низкое значение энергии активации.

По-видимому, высокая энергия активации, вызвана редокс-зависимыми или светозависимыми конформационными изменениями структуры белка, включающими изменение положения ключевых аминокислотных остатков В результате этого происходит' (а) сдвиг(и) значений(-ия) рК групп(ы) акцепторов протонов вблизи негемового железа и/или (б) формирование внутрибелковой непрерывной сети (цепи)

водородных связей в протон-проводящих путях, связывающих негемовое железо и строму

Рис. 8 Кинетические кривые для дополнительной субмиллисекундной фазы при 5 и 32 °С (А). Фотоэлектрические ответы нормированы по амплитуде быстрой электрогенной фазы; температурная зависимость константы скорости дополнительной электрогенной фазы (Б). Энергия активации, определенная по наклону кривой, составляет ~ 47 ± 3,5 кДж/моль.

Следует отметить, что амплитуда электрогенной фазы, обусловленной протонированием QB2" в ответ на вторую вспышку света, оказалась примерно в 2 раза меньше, чем амплитуда реакций переноса протона из внешней водной фазы к группе X вблизи негемового железа Одним из объяснений может являться наличие большой диэлектрической постоянной вблизи QB Действительно, согласно данным РСА кристаллов препаратов СК ФС 2 из термофильных цианобактерий (Loll et al, 2005), QB находится в глубокой щели, вероятно, содержащей большое число молекулы воды

Истинная роль негемового железа до сих пор точно не установлена В физиологических условиях участие негемового железа в реакциях переноса зарядов на акцепторном участке комплексов ФС 2 имеет, вероятно, второстепенное значение из-за высоких скоростей доминирующих реакций - окисления воды до молекулярного кислорода и восстановления пластохинона до пластогидрохинона Однако в условиях стресса, а именно, при нарушении работы КВК может иметь место альтернативный путь переноса электронов с участием негемового железа Подавление КВК ведет к увеличению Ет пластохинона Qa на 150-200 мВ и ингибированию переноса

электронов от Qa" на QB (Krieger et al, 1995, Johnson et al, 1995) В результате возникает возможность переключения ФС 2 на одноэлектронный режим циклического переноса по схеме Р680 Фео QA цит Ь559 хлорофилл Хлг Peso Промежуточным компонентом межу Qa и цит Ь559 могло бы быть Fe„r, участие которого, как показано в работе (Haumann et al, 1995) и в настоящей работе, ведет к увеличению электрогенной активности ФС 2.

Влияние редокс-медиаторов на светоиндуцированную генерацию мембранного потенциала в препаратах CK ФС 2, лишенных марганцевого кластера

Наличие марганцевого кластера на донорной стороне ФС 2 предотвращает окисление экзогенных доноров электронов редокс-акгивным тирозином Yz и способствует высокой скорости электронного транспорта на участке Yz —> Р680+-Удаление марганца обычно приводит к изменениям в белковом окружении вблизи Yz Как следствие, Yz становится доступным действию экзогенных восстановителей, включая Mn2+(Delneu, 1995, Chrom, Ghanotakis, 2001) Образование трансмембранной разности электрических потенциалов, обусловленное восстановлением YZ0K Мп-кластером в ответ на первую вспышку света, было продемонстрировано на тилакоидах с помощью измерения электрохромного сдвига полос поглощения каротиноидов (Ghanotakis et al, 1987), а также электрометрически на протеолипосомах, содержащих ФС 2 с активным КВК (Haumann et al, 1997, Мамедов и др , 1999) При этом, поскольку редокс-активный Yz локализован в гидрофобной области белка, то можно предположить, что электрогенный характер восстановления YZ0K не является специфичным для Мп2+ как донора электронов

В настоящем разделе приведены результаты по исследованию влияния таких редокс-медиаторов, как К^М'Ы'-тетраметил-и-фенилендиамина (ТМФД), 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ) и метиленового синего (MC) на кинетику фотоэлектрических ответов препаратов CK ФС 2, лишенных марганца (-Мп) Структура и значения среднеточечных потенциалов этих медиаторов представлены в Таблице 1

Таблица 1. Структура и значения среднеточечных потенциалов использованных редокс-медиаторов

Редокс-медиатор Структура Еш, мВ при pH 7.0

N,N,N'N'-TeTpaMe™ji-n-фенилендиамин (ТМФД) НзСч /==\ /СНз Н3С ^—J сн3 +260 мВ

2,6-дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) CI Na+ rV +217 MB

Метиленовый синий (метилтионинхлорид) (H3C)2N. ^ /N(CH3)2 Cf +11 мВ

На Рис 9А показан индуцированный лазерной вспышкой фотоэлектрический ответ протеолипосом, содержащих СК ФС 2 (-Мп) Как и в случае препаратов ФС 2 с активным КВК под действием светового импульса генерируется со знаком «минус» внутри протеолипосомальной мембраны и кинетикой более быстрой, чем временное разрешение установки Препараты СК ФС 2 (-Мл) не содержат природных доноров электронов для окисленного Yz, а также вторичного хинонного акцептора Qb, те в этих образцах терминальным акцептором электронов является QA (Ghanotakis et al, 1987) Соответственно, в ответ на единичные вспышки света происходит разделение зарядов между Peso и QA с последующим восстановлением Рб80+ ОТ Yz (Pokorny et al, 1994, Haumann et al, 1997)

Кинетика спада фотоэлектрического ответа может быть аппроксимирована четырьмя экспоненциальными фазами с т -14 мкс (19%), 2,4 мс (18%), 20 мс (17%) и 275 мс (46%) Компоненты с т -20 и 275 мс, по-видимому, соответствуют реакции рекомбинации зарядов между QA" и Yz0K, компонента с т 2,4 мс - реакции рекомбинации между QA~ и Рв80+, в то время как более быстрая компонента (-14 мкс), вероятно, обусловлена реакцией рекомбинации электрона от феофитина (Rappaport et

а1, 2002) Добавление аскорбата натрия практически не влияет на кинетику фотоэлектрического ответа (рис 9Б, кривая 2)

Рис. 9 Образование трансмембранной разности электрических потенциалов в протеолипосомах, содержащих CK ФС 2 (-Мп), в ответ на единичную лазерную вспышку. Среда инкубации: 20 мМ HEPES-NaOH (pH 7,2), 10 мМ NaCl, 0,3 М сахарозы А - в отсутствие добавок; Б - в отсутствие (1) и в присутствии (2) 1 мМ аскорбата натрия.

На рис 10А продемонстрированы светоиндуцированные фотоэлектрические ответы, наблюдаемые в исследуемых образцах в отсутствие и в присутствии пары ТМФД/аскорбат натрия Добавление 1 мМ ТМФД приводит к существенному увеличению вклада кинетически-неразрешимой фазы и появлению дополнительной фазы нарастания мембранного потенциала Относительный вклад дополнительной фазы нарастания составляет около ~30% от фазы Yz0KQa~ при концентрации ТМФД порядка 1-2 мМ, в то время как дальнейшее увеличение концентрации ТМФД приводит к уменьшению вклада миллисекундной фазы Незначительное ускорение кинетики дополнительной фазы с увеличением концентрации ТМФД, вероятно, связано со слабым разобщающим эффектом радикальной формы ТМФД (Trebst, Reimer, 1973) Наблюдаемая дополнительная генерация мембранного потенциала в миллисекундной шкале времени, вероятно, обусловлена векторным переносом электрона от редокс-медиатора к YzOIt

Вставка к рис 10А показывает, что амплитуда неразрешаемой фазы YzokOa" практически не изменяется при добавлении ТМФД в концентрации до 10 мкМ, в то

время как дальнейшее увеличение концентрации ТМФД приводит к двукратному увеличению амплитуды быстрой фазы и насыщению при концентрации >2 мМ

Влияние окисленной формы ТМФД (в присутствии 2 мМ феррицианида калия) на кинетику фотоэлектрических ответов протеолипосом, содержащих СК ФС 2 (-Мп), показано на рис 10£ Добавление 1 мМ ТМФД приводит к увеличению амплитуды кинетически-неразрешимой фазы и существенному замедлению спада Значительное увеличение кинетически-неразрешимой фазы в случае как окисленной, так и восстановленной форм ТМФД может объясняться существованием анионной семихинонной формы С>а во фракции ФС 2 перед вспышкой, которая непосредственно окисляется окисленной формой ТМФД (Вик1юу е1 а1., 2003)

-ТМФД

(-ТМФД)* 1 7

1 мМ ТМФД 5 10

I, мс

Рис. 10. Влияние восстановленной (А) и окисленной (Б) форм ТМФД на кинетику фотоэлектрического ответа. Вставка* зависимость амплитуды кинетически-неразрешимой компоненты от концентрации восстановленной формы ТМФД (логарифмическая шкала).

Среднеточечный потенциал (Ет) редокс-пары ТМФД/ТМФД+ составляет +260 мВ при рН 7,0 В присутствии избытка аскорбата натрия (Ет= +80 мВ) концентрация окисленной формы ТМФД примерно в 1000 раз меньше концентрации восстановленной формы Таким образом, при добавлении в среду 1 мМ ТМФД, конечная концентрация окисленной формы ТМФД составит ~1 мкМ Эта концентрация сопоставима с концентрацией реакционных центров ФС 2 в образце Таким образом, концентрация окисленной формы ТМФД при концентрации его восстановленной формы 1 мМ оказывается достаточной для равновесного

т

£

10е 10* [тмфд! мкм

-ТМФД

4 мМ ТМФД

ТМФД

2 мМДМФД "

Время, мс

Врем

восстановления Ра" и переходу неактивной фракции Р680<За" в активное состояние РййоОа

Влияние другого лилофильного медиатора, ДХФИФ на кинетику фотоэлектрических ответов показано на Рис 1 \А.

о-

%-г £

\

200 мкМ ДХФИФ 8 мМ ДХФИФ 4 ММ ДХФИФ

8 400

Время, мс

800

Ой

£ £

о -2 -4-1 -6 -8-10

-МС

-у/ .■ i . ,

0,0 0,1 2 4 6 8 10

Время, мс

Рис. 11. Влияние ДХФИФ (А) и МС (Б) на кинетику фотоэлектрического ответа. Замедление кинетики спада фотоэлектрического ответа в присутствии ДХФИФ и избытка аскорбата натрия свидетельствует об эффективном взаимодействии между медиатором и окисленным Yz При концентрации ДХФИФ 4 мМ, помимо замедления спада, в кинетике фотоэлектрического ответа наблюдается дополнительное медленное нарастание Д*Р Последнее, вероятно, обусловлено электрогенным вое становлением Угж Отсутствие быстрого нарастания генерации мембранного потенциала, а также меньшая эффективность ДХФИФ по сравнению ТМФД в качестве донора электрона для У20К могут объясняться наличием отрицательного заряда у восстановленной формы ДХФИФ, предотвращая тем самым взаимодействие ДХФИФ с донорным участком ФС 2

Нами было также изучено влияние акцептора электронов метиленового синего (МС) на кинетику генерации мембранного потенциала (рис И Б) Увеличение концентрации МС вплоть до 4 мкМ приводит к увеличению амплитуды кинетически-неразрешимой фазы и замедлению спада фотоответа Оба этих эффекта, вероятно, обусловлены окислением С>А~ метиленовым синим (Мкгап й а1, 1994) Отсутствие

дополнительной генерации Д*Р связано с тем, что МС не может служить донором электронов в наших экспериментальных условиях

На основании результатов, полученных на препаратах ФС 2 с активным КВК и тилакоидах, суммарный электрогенез на донорном участке фермента, амплитуда которого составляет ~10,5% в ФС 2 и -16% в тилакоидах (Haumann et al, 1997), может быть приписан 1) транспорту электрона от Мп к YzOK и 2) транспорту протона от аминокислотного остатка X, расположенного вблизи Мп в люмен Однако, поскольку расположение атома Мп, донирующего электрон на YZ0K в ответ на первую вспышку света, и остатка X не известно, диэлектрически взвешенное расстояние между сайтом связывания Мп и Yz не может быть оценено Кратчайшее расстояние между сайтом связывания атома Мп2 (наиболее удаленного от Pego) и поверхностью раздела белок-вода в ФС 2 в отсутствие периферических белков составляет ~12 Á Анализ профиля гидрофобности этого белкового участка выявил наличие значительного количества неполярных аминокислот Поэтому транспорт электрона между поверхностью белок-вода и сайтом связывания Мп может вносить существенный вклад в электрогенез при переносе электрона от восстановленных форм ТМФД и ДХФИФ к Yz0K

На Рис 12 показана предполагаемая схема расположения редокс-кофакторов ФС 2 в протеолипосомальной мембране Согласно схеме окисленные формы ТМФД и МС способны окислять частично восстановленный Qa~ в темноте и тем самым увеличивать число функционально активных (открытых) (РбвоСЬО РЦ Быстрая фаза нарастания Д*Р обусловлена разделением зарядов между Рбво и QA с последующим восстановлением Р6во+ от Yz, в то время как медленная фаза связана с электрогенным восстановлением YzOK от восстановленных форм ТМФД и ДХФИФ Схема также показывает предполагаемую локализацию ХН-группы и Mn-кластера (который отсутствует в используемых образцах) Вертикальными серыми стрелками показаны возможные электрогенные стадии, обусловленные переносом электрона и протона в образцах ФС 2 с активным КВК

Таким образом, полученные результаты дают основания полагать, что электрогенез, обусловленный донированием электронов к Yz0* не является специфичным для Мп2+ как донора электронов, а наблюдаемые электрогенные реакции в присутствии редокс-медиаторов связаны с векторным переносом электрона между

поверхностью белок-вода и Уг°*- Эти результаты свидетельствуют об электроизол ированной локализации внутри П1/02 сете роди мера. Кроме того, вклад электрогенного восстановления У?0* рсдокс-медиаторам и в суммарный элекгрогенеЗ (по крайней мере, в препаратах ФС 2, лишенных Мп-кластера) больше, чем вклад реакций переноса электрона Мп—*ЧЪ и последующего выброса протона (Наитапп е( а1., 1997; Мамедов и др., 1999). Эти данные также свидетельствуют об электроизол ированной локализации марганца.

Н*

Рис. 12 Схема расположение р едоке-ко фа кторов ФС 1 в протеолилисомальной мембране.

23

ВЫВОДЫ

1) Сконструирована модельная система, представляющая собой протеолипосомы со встроенными сердцевинными комплексами фотосистемы 2 из шпината, в которых кислород-выделяющий комплекс расположен вблизи наружной поверхности протеолипосомальной мембраны и стабилизирован глицинбетаином Продемонстрировано, что эта модельная система позволяет изучать природу и механизмы электрогенных реакций в фотосистеме 2 с помощью прямого электрометрического метода

2) Показано, что в кинетике фотоэлектрического ответа на вторую вспышку света помимо быстрой фазы образования АЧ', обусловленной разделением зарядов между первичным донором Р68о и первичным хинонным акцептором С2д с последующим восстановлением Р680+ от редокс-активного тирозина (Ухж0а)> наблюдается дополнительная электрогенная фаза, амплитуда которой составляет -11% (т -850 мкс при рН 7,5) от кинетически-неразрешимой фазы У2ок(За\ Чувствительность этой фазы к ингибитору переноса электрона между хинонными акцепторами <3А и <3В диурону, зависимость амплитуды и константы скорости от рН среды, а также зависимость амплитуды этой фазы от концентрации экзогенно добавленного децил-пластохинона свидетельствуют о том, что наблюдаемая фаза обусловлена протонированием дважды восстановленной формы СЬ Оа'СЬ" + 2 Н* -> ОдСЬНг

3) Показано, что в условиях, когда негемовое железо (Ренг) на акцепторном участке ФС 2 исходно окислено, в ответ на первую вспышку света наблюдается дополнительная электрогенная фаза, амплитуда которой составляет -20% (т-120 мкс при рН 7,2) от Уг01^". Чувствительность данной фазы к диурону, а также влияние изотопного состава воды и температуры на ее кинетику свидетельствуют в пользу векторного переноса протона из внешней водной фазы к гипотетическому аминокислотному остатку X вблизи Ренг Различие в амплитудах элеюрогенных реакций, обусловленных захватом протона группой X вблизи Реяг в ответ на первую вспышку и протонированием <3в2" в ответ на вторую вспышку, может быть обусловлено большим значением диэлектрической постоянной вблизи сайта связывания <3В

4) На протеолипосомах, содержащих сердцевинные комплексы ФС 2, лишенные марганца, впервые было продемонстрировано появление дополнительной электрогенной стадии, обусловленной векторным переносом электрона от редокс-медиаторов НН^М'-тетраметил-п-фенилендиамина (ТМФД) и 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ) к редокс-активному тирозину Ухт Полученные данные свидетельствуют о том, что Ух погружен в гидрофобную область В1Я)2-гетеродимера, и таким образом является электроизолированным от водной фазы Различие в амплитудах электрогенных реакций в сердцевинных комплексах ФС 2, лишенных марганцевого кластера, и нативных комплексах ФС 2 свидетельствует о том, что Мп-связывающий сайт локализован в белковом домене с относительно низким значением диэлектрической постоянной

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

. Тюняткина А, А.. Семенов А.Ю., М а медов М.Д. Эл «про генное протонирование вторичного хинонного акцептора в комплексах фотосистемы 2. // Сборник материалов IV съезда биофизиков России. - Воронеж, 2004,- Т.П. - С.470-47 L

:. Mamedov M.D., Tyunyatkina A.A.. Semenov A.Yu. Electrogenic proton transfer in the photosystem II core complexes. // 13th European bioenergetics conference. - Pisa, Italy., 2004. - P.259.

'. Тюняткина А-А.. Семенов А.Ю., Мамедов М.Д. Электрогенез на акцепторной стороне в комплексе фотосистемы II. // XVIII Пущинские чтения гю фотосинтезу и Всероссийски конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе». - М.: НИА - Природа, 2005. - С.36.

Мамедов М.Д., Тюняткина А.А., Семенов А.Ю. Электрогенное протон ирование вторичного хинонного акцептора QB в комплексах фотосистемы П из шпината, включенных в липндные везикулы. // Биохимия, - 2005. - Т.70. - СЛ639-1645.

I Mamedov M.D., Tyunyatkina A .A.. Siletsky S.A., Semenov A.Yu. Voltage changes involving photosystem II (jLiinone-iron complex turnover. // Eur. Biophys. J. - 2006. - V.35. - P.647-654.

% Tyunyatkina A.A.. Kurashov V.N., Semenov A.Yu., Mamedov M.D. Electric potential difference generation involving oxygen-evolving photosystem II complex turnover. // International Meeting «Photosynthesis in the Post-Genomic Bra: Structure and Function of Photosynthesis». - Moscow: NIA-Naturc, 2006. - P.172.

Tyunyatkina A.A., Kurashov V.N., Gopta O.A., Semenov A.Yu., Mamedov M.D. Electrogenic reduction of tyrosine Yz* by exogenous rcduciants in photosystem Ili // International Meeting «Photosynthesis in the Post-Genomic Era: Structure and Function of Photosynthesis». - Moscow: KIA-Nature, 2006. - P.185.

!. Tyunyatkina A.A.. Siletsky S.A., Semenov A.Yu., Mamedov M.D. Electrogenieity due to quinone-iron complex turnover, // 14* European bioenergetics conference. - Moscow. Russia,, - 2006.-P.245.

). Semenov A.Yu., Gopta O.A., Kurnhov V.N., Tyunyatkina A.A.. Mamedov M.D. Effect of redox mediators on the flash-induced membrane potential generation in Mn-depleted photosystem II core particles. // A Satellite Meeting of the SEB 14th Internationa) Congress on Photosynthesis. - London: The Royal Society, 2007. - P.36.

Издательство ЦПИ при механ и ко-математическом факультете МГУ им. М. В. Ломоносова

Подписано в печать -/У.О^.О? Формат 60x90 1/16. Уел, печ. л. Тираж ВО экз. Заказ

Отпечатано с оригинал-макета на типографском оборудовании механико-математического факультета

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Тюняткина, Анна Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Струтурные и функциональные особенности ФС 2.

1.1.1. Молекулярная архитектура тилакоидной мембраны.

1.1.2. Рентгеноструктурный анализ кристаллов ФС 2.

1.1.3. Первичные реакции разделения зарядов.

1.2. Акцепторный участок ФС2.

1.2.1. Структурные, кинетические и термодинамические особенности хинонов

ФС 2.

1.2.2. Перенос электрона на акцепторной стороне ФС 2.

1.2.3. Захват протона на акцепторной стороне ФС 2.

1.2.4. Негемовое железо и роль гидрокарбоната в переносе электрона и протона на акцепторной стороне ФС 2.

1.3. Донорный участок ФС 2.

1.3.1. Кинетика и механизм образования Yz°K в присутствии Рбво+.

1.3.2. Цикл окисления воды.

1.4. Фотоиндуцированные изменения разности электрических потенциалов на тилакоидной мембране.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Препаративные методы.

2.1.1. Используемые реактивы.

2.1.2. Выделение мембранных фрагментов, обогащенных ФС 2 (BBY-частиц).

2.1.3. Выделение сердцевинных комплексов ФС 2.

2.1.4. Приготовление протеолипосом, содержащих СК ФС 2.

2.2. Аналитические методы.

2.2.1. Измерение спектров оптического поглощения.

2.2.2. Электрофорез.

2.2.3. Переменная флуоресценция.

2.2.4. Полярографический метод измерения кислорода.

2.2.5. Прямой электрометрический метод регистрации ДЧ*.

2.2.6. Кинетический анализ сигналов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Особенности препаратов СК ФС 2 из шпината.

3.2. Стабилизация Мп-кластера комплекса окисления воды ФС 2.

3.3. Разделение зарядов в ФС 2.

3.4. Электрогенное восстановление вторичного хинонного акцептора Qb.

3.5. Связанный с протоном перенос электрона между первичным хинонным акцептором Qa и окисленным негемовым железом Fe3+.

3.6. Влияниередокс-медиаторов на светоиндуцированную генерацию мембранного потенциала в препаратах СК ФС 2, лишенных марганцевого кластера.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Электрогенные реакции в пигмент-белковом комплексе фотосистемы 2"

Актуальность проблемы. Одной из основных проблем современного естествознания является изучение молекулярных механизмов фотосинтеза. Основным итогом фотохимической стадии преобразования энергии света при оксигенном фотосинтезе является фотоперенос электронов от воды к НАДФ+ за счет нециклического транспорта электронов при последовательном участии пигмент-белковых комплексов фотосистемы 2 (ФС 2), цитохромного b$f комплекса и фотосистемы 1, локализованных в тилакоидных мембранах цианобактерий, водорослей и высших растений. Фотосинтетическое окисление воды является важнейшим фундаментальным процессом, глобальный масштаб которого (при ярком солнечном свете ФС 2 окисляет около 100 молекул воды в секунду) и его значимость в круговороте веществ в природе трудно переоценить. Однако вследствие сложной организации и лабильности кислород-выделяющего комплекса (КВК) остается неясным молекулярный механизм функционирования его ключевых этапов.

Значительный прогресс в изучении комплекса ФС 2 был связан с проведением рентгеноструктурного анализа (РСА) кристаллов сердцевинных комплексов (СК) ФС 2 из двух термофильных цианобактерий Thermosynechococcus elongatus и Thermosynechococcus vulcanus с разрешением 3,8-3,0 А. Комплекс ФС 2 представляет собой димер, каждый мономер которого содержит 19 отдельных белковых субъединиц (16 интегральных и 3 периферических) и 77 кофакторов. Хлорофилл-содержащие светособирающие антенные белки СР43 и СР47, входящие в состав СК ФС 2, передают энергию возбуждения к реакционному центру (РЦ), который состоит из двух псевдогомологичных субъединиц D1 и D2 и содержит кофакторы, участвующие в электрон-транспортной цепи. В комплексе ФС 2 связаны воедино одноэлектронный процесс переноса электрона между первичным донором электрона Р680 и хинонным акцептором QA с последующим восстановлением P6go+ от редокс-активного аминокислотного остатка тирозина-161 (Yz) D1-субъединицы, двухэлектронное восстановление вторичного хинона QB (2 QB + 4 е" + 4 Н* 2 QBH2) и четырехэлектронное окисление молекулы воды (2 Н20 02+ 4е" + 4 НГ1").

Одной из наиболее актуальных проблем в изучении функционирования этого ферментного комплекса является выяснение физико-химического механизма сопряжения переноса электронов и протонов в железо-хинонном акцепторном комплексе. Другой актуальной проблемой, имеющей большое значение для выяснения механизма фотолиза воды, является изучение реакции переноса электрона на донорной стороне ФС 2. Исследования с помощью прямого электрометрического метода, проводимые на протеолипосомах, содержащих комплексы ФС 2, позволяют выявить кинетики и относительный вклад отдельных электрогенных реакций в суммарный электрогенез в ответ на единичные вспышки света. А сами протеолипосомы могут служить хорошей моделью для изучения механизмов внутрибелкового переноса заряда.

Целью настоящей работы явилось выяснение молекулярных механизмов образования трансмембранной разности электрических потенциалов (АЧ1), генерируемой комплексом ФС 2 в модельной системе, с помощью прямого электрометрического метода. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Выделить препараты СК ФС 2 с активным и неактивным (лишенным марганцевого кластера (-Mn)) КВК с последующим включением их в липосомальную мембрану;

2. Изучить образование мембранного потенциала, обусловленного переносом зарядов на акцепторном участке ФС 2 с активным КВК;

3. Изучить образование мембранного потенциала, обусловленного переносом электронов в присутствии таких редокс-медиаторов, как М,М,Ы'М'-тетраметил-и-фенилендиамин (ТМФД), 2,6дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) и метиленовый синий (МС) в препаратах СК ФС 2 (-Мп).

Научная новизна работы. Показано, что протеолипосомы, содержащие препараты СК ФС 2, в которых КВК расположен вблизи наружной поверхности протеолипосомальной мембраны, являются удобной моделью для исследования механизма образования с помощью электрометрии. В условиях реконструкции функции Qb на акцепторном участке ФС 2 в ответ на вторую вспышку света было продемонстрировано наличие дополнительной электрогенной фазы, обусловленной протонированием дважды восстановленной формы QB. Максимальная амплитуда данной фазы составляет 1% от кинетически-неразрешимой фазы YZ0KQA\ Установлено, что электрогенная реакция восстановления окисленного негемового железа, (FeHr3+), наблюдаемая в ответ на первую вспышку света, обусловлена переносом протона из внешней водной фазы к неидентифицированному аминокислотному остатку X вблизи FeHr. Впервые на протеолипосомах, содержащих СК ФС 2, лишенные марганцевого кластера, было продемонстрировано наличие электрогенной стадии, обусловленной векторным переносом электрона от редокс-медиаторов (ТМФД и ДХФИФ) к редокс-активному тирозину YZ0K. Эти данные свидетельствуют об электроизолированной локализации Yz внутри белкового гетеродимера D1/D2.

Научно-практическая значимость работы. Полученные в работе данные вносят вклад в решение фундаментальной проблемы изучения механизмов переноса зарядов в мембранных энергопреобразующих белках, а также могут являться основой для создания искусственных систем, преобразующих и запасающих солнечную энергию, в том числе осуществляющих фотолиз воды с образованием водорода и кислорода. Кроме того, эти результаты могут найти применение при изучении светозависимого синтеза АТФ в системе бесклеточного синтеза белка и при тестировании эффективности гербицидов.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Тюняткина, Анна Анатольевна

ВЫВОДЫ

1) Сконструирована модельная система, представляющая собой протеолипосомы со встроенными сердцевинными комплексами фотосистемы 2 из шпината, в которых кислород-выделяющий комплекс расположен вблизи наружной поверхности протеолипосомальной мембраны и стабилизирован глицинбетаином. Продемонстрировано, что эта модельная система позволяет изучать природу и механизмы электрогенных реакций в фотосистеме 2 с помощью прямого электрометрического метода.

2) Показано, что в кинетике фотоэлектрического ответа на вторую вспышку света помимо быстрой фазы образования обусловленной разделением зарядов между первичным донором Рб8о и первичным хинонным акцептором QA с последующим восстановлением Рб8о+ от редокс-активного тирозина Yz (YZ0KQA"), наблюдается дополнительная электрогенная фаза, амплитуда которой составляет ~11% (т ~850 мкс при рН 7,5) от кинетически-неразрешимой фазы YZ0KQA". Чувствительность этой фазы к ингибитору переноса электрона между хинонными акцепторами QA и Qb диурону, зависимость амплитуды и константы скорости от рН среды, а также зависимость амплитуды этой фазы от концентрации экзогенно добавленного децил-пластохинона свидетельствуют о том, что наблюдаемая фаза обусловлена протонированием дважды восстановленной формы QB: Qa Qb" + 2 Н* QaQbH2.

3) Показано, что в условиях, когда негемовое железо (FeHr) на акцепторном участке ФС 2 исходно окислено, в ответ на первую вспышку света наблюдается дополнительная электрогенная фаза, амплитуда которой составляет ~20% (т~120 мкс при рН 7,2) от YZ0KQA\ Чувствительность данной фазы к диурону, а также влияние изотопного состава воды и температуры на ее кинетику свидетельствуют в пользу векторного переноса протона из внешней водной фазы к гипотетическому аминокислотному остатку X вблизи FeHr. Различие в амплитудах электрогенных реакций, обусловленных захватом протона группой X вблизи FeHr в ответ на первую вспышку и протонированием Qb " в ответ на вторую вспышку, может быть обусловлено большим значением диэлектрической постоянной вблизи сайта связывания QB.

4) На протеолипосомах, содержащих сердцевинные комплексы ФС 2, лишенные марганца, впервые было продемонстрировано появление дополнительной электрогенной стадии, обусловленной векторным переносом электрона от редокс-медиаторов Н,Н,Ы'Ы'-тетраметил-«-фенилендиамина (ТМФД) и 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ) к редокс-активному тирозину Yz°K. Полученные данные свидетельствуют о том, что Yz погружен в гидрофобную область 01ЛЭ2-гетеродимера, и таким образом является электроизолированным от водной фазы. Различие в амплитудах электрогенных реакций в сердцевинных комплексах ФС 2, лишенных марганцевого кластера, и нативных комплексах ФС 2 свидетельствует о том, что Мп-связывающий сайт локализован в белковом домене с относительно низким значением диэлектрической постоянной.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целью настоящей диссертационной работы явилось исследование молекулярных механизмов образования трансмембранной разности электрических потенциалов (АЧ0, генерируемой пигмент-белковым комплексом ФС 2 в модельной системе с помощью прямого электрометрического метода.

В данной диссертационной работе удалось (1) сконструировать модельную систему, представляющую собой протеолипосомы со встроенными сердцевинными комплексами ФС 2, в которых кислород-выделяющий комплекс расположен вблизи наружной поверхности мембраны и стабилизирован глицинбетаином; (2) продемонстрировать наличие электрогенной реакции, обусловленной протонированием дважды восстановленной формы вторичного хинонного акцептора QB2"; (3) показать наличие электрогенной реакции, обусловленной переносом протона из внешней водной фазы к неидентифицированному аминокислотному остатку X вблизи негемового железа и 4) показать наличие электрогенной стадии, обусловленной векторным переносом электрона от редокс-медиаторов ТМФД и ДХФИФ к редокс-активному остатку тирозину-160 (Yz).

93

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Тюняткина, Анна Анатольевна, Москва

1. Nelson N., Yocum C.F. Structure and functions of photosystems I and II. // Annual Review of Plant Biology. 2006. - V.57, - P. 521-565.

2. Kaftan D., Brumfeld D., Nevo R., Scherz A., Reich Z. From chloroplasts to photosystems: in situ scanning force microscopy on intact thylakoid membranes. // EMBO J. 2002. - V.21, - P. 6146-6153.

3. Kamiya N., Shen J-R. Crystal structure of oxygen-evolving photosystem II from Thermosynechoccus vulcanus at 3.7 A resolution. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - V.l00, P. 98-103.

4. Ferreira K.N., Iverson T.M., Maghlaoui K., Barber J., Iwata So. Architecture of the photosynthetic oxygen-evolving center. // Science. 2004. - V.303, -P. 1831-1838.

5. Loll В., Kern J., Saenger W., Zouni A., Biesiadka J.K. Towards complete cofactor arrangement in the 3.0 A resolution structure of photosystem II. // Nature. 2005. - V.418, - P. 1040-1044.

6. Zouni A., Witt H-T., Kern J, Fromme P, Krauss N, Saenger W., Orth P. Crystal structure of Photosystem II from Synechococcus elongatus at 3.8 Angstrom resolution. // Nature. 2001. - V.409, - P. 739-743.

7. Hankamer В., Morris E.P., Nield J., Gerle C., Barber J. Three-dimensional structure of the Photosystem II core dimer of higher plants determined by electron microscopy. //J Struct. Biol. 2001. - V.135, - P. 262-269.

8. Deisenhofer J., Michel H. The photosynthetic reaction centre from the purple bacterium Rhodopseudomonas viridis. // EMBO J. 1989. - V.8, -P. 2149-2170.

9. Kern J., Loll В., Zouni A., Saenger W., Irrgang K.D., Biesiadka J. Cyanobacterial Photosystem II at 3.2 A resolution the plastoquinone binding pockets. // Photosynth. Res., - 2005. - V.84, -P. 153-159.

10. Kurisu, G., Zhang, H., Smith, J. L., Cramer, W. A. Structure of the cytochrome b6f complex of oxygenic photosynthesis: tuning the cavity. // Science. 2003. - V.302, - P. 1009-1014.

11. Lange C., Nett, J. H., Trumpower, B. L., Hunte, C. Specific roles of protein-phospholipid interactions in the yeast cytochrome bci complex structure. // EMBO J. 2001. - V.20, - P. 6591-6600.

12. Kwa S. L. S., Newell W. R., van Grondelle R., Dekker, J. P. The reaction center of Photsystem II studied with polarized fluorescence spectroscopy. // Biochim. Biophys. Acta. 1992. - V.1099, - P. 193-202.

13. Peloquin J. M., Britt R. D. EPR/ENDOR characterization of the physical and electronic structure of the OEC Mn cluster. // Biochim. Biophys. Acta. -2001. V.1503, - P. 96-111.

14. Robblee J. H., Cince R. M., Yachandra V. K. X-ray spectroscopy based structure of the Mn cluster and mechanism of photosynthetic oxygen evolution. // Biochim. Biophys. Acta. 2001. - V.1503, - P. 7-23.

15. Holzwarth, A. R., Muller, M. G., Gatzen, G., Hucke, M., Griebenow, K. Ultrafast spectroscopy of the primary electron and energy transfer processesin the reaction center of photosystem II. // J. Luminesc. 1994. - V.60 - 61, - P. 497-502.

16. Konermann L., Gatzen G., Holzwarth, A. R. Primary processes and structure of the Photosystem II reaction center. 5. Modeling of the fluorescence kinetics of the Dl-D2-cyt-6559 complex at 77 K. // J. Phys. Chem. B. -1997.-V. 101, P. 2933-2944.

17. Schatz G. H., Brock H., Holzwarth A. R. Kinetic and energetic model for the primary processes in photosystem II. // Biophys. J. 1988. - V.54, - P. 397405.

18. Шинкарев В.П. Функционирование хинонов у фотосинтезирующих бактерий. Итоги науки и техники (ВИНИТИ). // Серия Биофизика. -1990.-Т. 35.

19. Wraight С. A. Proton and electron transfer in the acceptor quinone complex of photosynthetic reaction centers from Rhodobacter sphaeroides. // Front. Biosci. 2004. V.9, -P. 309-337.

20. Paddock M. L., Feher G., Okamura M. Y. Proton transfer pathways and mechanism in bacterial reaction centers. // FEBS Lett. 2003. - V.555, - P. 45-50.

21. Rutherford A. W., Faller, P. The heart of photosynthesis in glorious 3D. // Trends Biochem. Sci. 2001. - V.26, - P. 341-344.

22. Fromme P., Jordan P., Krauss, N. Structure of photosystem I. // Biochim. Biophys. Acta. -2001. -V. 1507, -P. 5-31.

23. Hunte C., Palsdottir H., Trumpower, B. L. Proton motive pathways and mechanisms in the cytochrome bci complex. // FEBS Lett. 2003. - V.545, - P. 39-46.

24. Cramer W. A., Zhang H., Yan J., Kurisu G., Smith J. L. Evolution of photosynthesis: Time-independent structure of the cytochrome b6f complex. // Biochemistry. 2004. - V.43, - P. 5921-5929.

25. Stroebel D., Choquet Y., Popot J. L., Picot D. An atypical haem in the cytochrome b6fcomplex. //Nature.-2003.-V.426, P. 413-418.

26. Lancaster C. R. Wolinella succinogenes quinokfumarate reductase and its comparison to E. coli succinate:quinone reductase. // FEBS Lett. 2003. -V.555, - P. 21-28.

27. Cecchini G., Maklashina E., Yankovskaya V., Iverson Т. M., Iwata S. Variation in proton donor/acceptor pathways in succinate:quinone oxidoreductases. // FEBS Lett. 2003. - V.545, - P. 31-38.

28. Zhu Z., Gunner M.R. Energetics of quinone-dependent electron and proton transfers in Rhodobacter sphaeroides photosynthetic reaction centers. // Biochemistry. 2005. - V.44, - P. 82-96.

29. Rich P. R., Bendall D. S. A mechanism for the reduction of cytochromes by quinols in solution and its relevance to biological electron transfer reactions. // FEBS Lett. 1979. -V. 105, - P. 189-194.

30. Diner B.A., De Vitry C., Popot J.L. Quinone exchange in the QA binding site of photosystem II reaction center core preparations isolated from

31. Chlamydomonas reinhardtii. II Biochim Biophys Acta. 1988. - V.934, - P. 47-54.

32. Liu B.L., Hoff A.J., Gu L.Q., Li L.B., Zhou P.Z. The relationship between the structure of plastoquinone derivatives and their biological activity in Photosystem II of spinach chloroplasts. // Photosynth Res. 1991. - V.30, -P. 95-106.

33. Johnson G. N., Rutherford A. W., Krieger A. A change in the midpoint potential of the quinone QA in Photosystem II associated with photoactivation of oxygen evolution. // Biochim. Biophys. Acta. 1995. -V.1229, - P. 202-207.

34. Ishikita H., Knapp E.-W. Control of quinone redox potentials in photosystem II: Electron transfer and photoprotection. // J. Am. Chem. Soc. 2005. -V.127, - P. 14714-14720.

35. Wraight C.A. Electron acceptors of photosynthetic bacterial reaction centers. Direct observation of oscillatory behaviour suggesting two closely equivalent ubiquinones. // Biochim. Biophys. Acta. 1977. - V.459, - P. 525-531.

36. Reifarth F., Renger G. Indirect evidence for structural changes coupled with QB" formation in photosystem II. // FEBS Letters. 1998. - V.428, P. 123126.

37. Ke B. Photosynthesis: Photobiochemistry and Photobiophysics. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers - 2001.

38. McPherson P. H., Okamura M. Y., Feher G. Electron transfer from the reaction center of Rb. sphaeroides to the quinone pool: Doubly reduced QB leaves the reaction center. I I Biochim. Biophys. Acta. 1990. - V.1016, - P. 289-292.

39. Hansson O., Wydrzynski T. Current perceptions of Photosystem II. // Photosynth. Res. 1990. -V.23, - P. 131-162.

40. Shinkarev V.P. Flash-induced oxygen evolution in photosynthesis: simple solution for the extended S-state model that includes misses, double-hits, inactivation, and backward-transitions. // Biophys J. 2005. - V.88, - P. 412-421.

41. Shinkarev V.P. Ubiquinone (coenzyme Q10) binding sites: Low dielectric constant of the gate prevents the escape of the semiquinone. // FEBS Lett. -2006. V.580, - P. 2534-2539.

42. Giardi M.T., Marder J.B., Barber J. Herbicide binding to the isolated Photosystem II reaction center. // Biochim. Biophys. Acta. 1988. - V.934, -P. 64-71.

43. Kurreck J, Garbers A, Parak F, Renger G. (1997) Highly purified D1 /D2/cyt b559 preparations from spinach do not contain the non-heme iron center. FEBS Lett. 403(3):283-286.

44. Nagatsuka Т., Fukuhara S., Akabori K., Toyoshima Y. Disintegration and reconstitution of Photosystem-II reaction center core complex. II. Possible involvement of low-molecular-mass proteins in the functioning of Qa in the

45. PS II reaction center. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. - V.1057, - P. 223231.

46. Shinkarev V.P. Photosystem II: Oxygen evolution and chlorophyll a fluorescence induced by multiple flashes. Chlorophyll fluorescence: a signature of photosynthesis. / Papageorgiou G. and Govindjee (eds), 2004. - Chapter 8, - P. 197-229.

47. Collins M.D., Jones D. Distribution of isoprenoid quinone structural types in bacteria and their taxonomic implications. // Microbiol. Rev. 1981. - V.45, -P. 316-354.

48. Tieleman D.P., Marrink S.J., Berendsen, H.J.C. A computer perspective of membranes: molecular dynamics studies of lipid bilayer systems. // Biochim. Biophys. Acta. 1997. - V. 1331, - P. 235-270.

49. Crofts A. R., Robinson H. H., Snozzi M. Reactions of quinones at catalytic sites; a diffusional role in H-transfer. / Advances in Photosynthesis Research // Sybesma C. (ed.), The Hague: Kluwer 1984. - P. 461-468.

50. Wraight CA. Electron acceptors of bacterial photosynthetic reaction centers. II. H+-binding coupled to secondary electron transfer in the quinone acceptor complex. // Biochim. Biophys. Acta. 1979. - V.548, - P. 309-327.

51. Shinkarev V.P., Wraight C.A. Oxygen evoluton in photosynthesis: from unicycle to bicycle. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V.90, - P. 18341838.

52. Crofts A.R., Baroli I., Kramer D., Taoka S. Kinetics of electron transfer between QA and QB in wild type and herbicide resistant mutants of

53. Chlamydomonas reinhardtii. I I Z. Naturforsch. 1993. - V.48c, - P. 259266.

54. Crofts A. R., Wraight C. A. The electrochemical domain of photosynthesis. //Biochim. Biophys. Acta. 1983. - V.726, - P. 149-185.

55. Amesz J., Duysens L.N.M. Electron donors and acceptors in photosynthetic reaction centers. // Photosynth. Research. 1986. - V.10, - P. 337-346.

56. Diner B.A., Petrouleas V., Wendoloski J.J. The iron-quinone electron-acceptor complex of Photosystem II. // Physiol. Plantarum. 1991. - V.81, -P. 423-436.

57. Okamura M.Y., Paddock M.L., Graige M.S., Feher G. Proton and electron transfer in bacterial reaction centers. // Biochim. Biophys. Acta. 2000. -V.1458, - P. 148-163.

58. Wraight C. A. Proton and electron transfer in the acceptor quinone complex of photosynthetic reaction centers from Rhodobacter sphaeroides. II Front. Biosci. 2004. - V.9, - P. 309-337.

59. Mathis P., Sinning I., Michel H. Kinetics of electron transfer from the primary to the secondary quinone in Rhodopseudomonas viridis. II Biochim. Biophys. Acta. 1992. - V.1098, - P.151-158.

60. Shuvalov V.A. Time and frequency domain study of different electron transfer processes in bacterial reaction centers. / The photosynthetic reaction center, 2. // Deisenhofer J. and Norris J.R. (eds.), San Diego: Academic Press.- 1993.-P. 89-103.

61. Reifarth F., Renger, G. Indirect evidence for structural changes coupled with QB. Formation in photosystem II. // FEBS Lett. 1998. - V.428, - P. 123126.

62. Graige M. S., Paddock M. L., Bruce J. M., Feher G., Okamura M. Y. Mechanism of proton-coupled electron transfer for quinone (QB) reduction in reaction centers of Rb.sphaeroides. II J. Am. Chem. Soc. 1996. - V.l 18, -P. 9005-9016.

63. Lavergne J. Mode of action of 3-(3,4-dichlorophenyl)-l,l-dimethylurea. Evidence that the inhibitor competes with plastoquinone for binding to a common site on the acceptor side of Photosystem II. // Biochim. Biophys. Acta. 1982. - V.682, - P. 345-353

64. Fowler С. F. Proton translocation in chloroplasts and its relationship to electron transport between the photosystems. // Biochim. Biophys. Acta. -1977. V.459, - P. 351-363.

65. Hope A.B., Matthews D.B. Further studies or proton translocations in chloroplasts after single-turnover flashes. 1. Proton uptake. // Austr. J. Plant. Physiol. 1983, - V. 10, - P. 363-372.

66. Auslander W., Junge W. The electric generator in the photosynthesis of green plants: II Kinetic correlation between protolytic reactions and redox reactions. // Biochim. Biophys. Acta. 1974. - V.357, - P. 285-298.

67. Haumann M., Junge W. The rates of proton uptake and electron transfer at the reducing side of Photosystem II in thylakoids. // FEBS Lett. 1994. -347, - P. 45-50.

68. Diner B. A., Babcock, G. T. Structure, dynamics, and energy conversion efficiency in photosystem II. / Oxygenic Photosynthesis: The Light Reactions // Ort, D. R., and Yocum, C. F. (eds.), Dordrecht: Kluwer, -1996.-P. 213-247.

69. Rutherford W. Photosystem II, the water-oxidizing enzyme. // Trends Biochemistry. 1989. - V. 14, - P. 227-232.

70. Deisenhofer J., Epp 0., Miki K., Huber R., Michel H. Structure of the protein subunits in the photosynthetic reaction centre of Rhodopseudomonas viridis at 3 A resolution. // Nature. 1985. - V.318, - P. 618-624.

71. Hienerwadel R., Berthomieu C. Bicarbonate binding to the non-heme iron of photosystem II investigated by Fourier transform infrared difference spectroscopy and 13C-labeled bicarbonate. // Biochemistry. 1995. - V.34, -P. 16288-16297.

72. Semin B.K., Loviagina E.R., Aleksandrov AY., Kaurov Y.N., Novakova A.A. Effect of formate on Mossbauer parameters of the non-heme iron of PSII particles of cyanobacteria. // FEBS Lett. 1990. - V.270, - P. 184-186.

73. Noguchi Т., Kurreck J., Inoue Y., Renger G. Comparative FTIR analysis of the microenvironment in cyanide-treated, high pH-treated and iron-depleted photosystem II membrane fragments. // Biochemistry. 1999. - V.38, - P. 4846-4852.

74. Berthomieu C., Hienerwadel R. Iron coordination in photosystem II: interaction between bicarbonate and the QB pocket studied by FTIR. // Biochemistry. 2001. - V.40, - P. 4044-4052.

75. Ikegami I., Katoh S. Studies on chlorophyll fluorescence in chloroplasts II. Effect of ferricyanide on the induction of fluorescence in the presence of 3-(3,4-dichloropheny 1)-1,1 -dimethylurea. // Plant. Cell. Physiol. 1973. V.14, -P. 829- 836.

76. Petrouleas V., Diner B.A. Identification of Q400, a high-potential electron acceptor of photosystem II, with the iron of the quinone-iron acceptor complex. // Biochim. Biophys. Acta. 1986. - V.849, - P. 264-275.

77. Bogershausen O., Junge W. Rapid proton transfer under flashing light at both functional sides of dark adapted photosystem II core particles. // Biochim. Biophys Acta. 1995. - V.1230, - P. 177-185.

78. Zimmerman J.-L., Rutherford A.W. Photoreductant-induced oxidation of Fe in the electron-acceptor complex of Photosystem II. // Biochim. Biophys. Acta. 1986. V.851, - P. 416-423.

79. Vermaas W.F.J., Vass I., Eggers В., Styring S. Mutation of a putative ligand to the non-heme iron in photosystem II. // Bicohim. Biophys. Acta. 1994. -V. 1184,-P. 263-272.

80. Debus R.J., Feher G., Okamura M.Y. Iron-depleted reaction centers from Rhodopseudomonas sphaeroides R-26.1: characterization and reconstitution with Fe2+, Mn2+, Co2+, Ni2+, Cu2+, and Zn2+. // Biochemistry. 1986. - V.25, - P. 2276-2287.

81. Gardiner A.T., Zech S.G., MacMillan F., Kass H., Bittl R., Schlodder E., Lendzian F., Lubitz W. Electron paramagnetic resonance studies of zinc-substituted reaction centers from Rhodopseudomonas viridis. II Biochemistry. 1999. V.38, - P. 11773-11787.

82. Van Rensen J.J.S., Xu C., Govindjee. Role of bicarbonate in Photosystem II, the water-plastoquinone oxidoreductase of plant photosynthesis. // Physiol. Plant. 1999. - V.105, - P. 585-592.

83. Vermaas W.F.J., Rutherford A.W. EPR measurements on the effect of bicarbonate and triazine resistance on the acceptor side of Photosystem II. // FEBS Letters. 1984. - V.175, - P. 243-248.

84. Bowden S.J., Hallahan B.J., Ruffle S.V., Evans M.C.W., Nugent J.H.A. Preparation and characterization of Photosystem II core particles with and without bound bicarbonate. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. - V.1060, - P. 89-96.

85. Petrouleas V., Deligiannakis Y., Diner B.A. Binding of carboxylate anions at the non-hem Fe(II) of PS И. II. Competition with bicarbonate and effects on the Qa/Qb electron transfer rate. // Biochim. Biophys. Acta. 1994. -V.l 188, - P. 271-277.

86. Deligiannakis Y., Petrouleas V., Diner B.A. Binding of carboxylate anions at24* 34"the nonheme Fe(II) of Photosystem И. 1. Effects on the QA~ Fe and QAFe

87. EPR-spectra and the redox properties of the iron. // Biochim. Biophys. Acta. 1994.-V.l 188, - P. 260-270.

88. Xiong J., Subramaniam S., Govindjee. A knowledge-based three-dimensional model of the Photosystem II reaction center of Chlamydomonas reinhardtii. II Photosynth. Res. 1998. - V.56, - P. 229-254.

89. Klimov V.V., Allakhverdiyev S.I., Feyziev Y.M., Baranov S.V. Bicarbonate requirement for the donor side of photosystem II. // FEBS Letters. 1995. -V.363,-P. 251-255.

90. Klimov V.V., Baranov S.V. Bicarbonate requirement for the water-oxidizing complex of photosystem II. // Biochim. Biophys. Acta. 2001. - V.l503, -P. 187-196.

91. Barry В., Babcock G.T. Tyrosine radicals are involved in the photosynthetic oxygen-evolving system. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V.84, - P. 7099-7103.

92. Boska M., Sauer K., Buttner W., Babcock G.T. Similarity of EPR signal II, rise and P-680+ decay kinetics in tris-washed chloroplast photosystem II preparations as a function of pH. // Biochim. Biophys. Acta. 1983. - V.722, -P. 327-330.

93. Weiss W., Renger G. On the functional connection between the reaction center complex and the water oxidizing enzyme system Y. // Biochim. Biophys. Acta. 1986. - V.850, - P. 173-183.

94. Renger G., Wolff Ch. The existence of a high photochemical turnover rate at the reaction centers of system II in Tris-washed chloroplasts. // Biochim. Biophys. Acta. 1976. V.423, - P. 610- 614.

95. Glaser M., Wolff Ch., Renger G. Indirect evidence for a very fast recovery kinetics of chlorophyll-a II in spinach chloroplasts. // Z. Naturforsch. 1976, -V.31,-P. 712-721.

96. Renger G., Eckert H.J., Weiss W. Studies on the mechanism of photosynthetic oxygen formation. / The oxygen evolving system in photosynthesis. // Inoue Y., Crofts A.R., Murata N., Renger G., Satoh K. (eds.), Japan: Academic Press, 1983. - P. 73- 82.

97. Christen G., Karge M., Eckert H.-J., Renger G. The role of protonation steps in electron transfer reactions in Tris-treated PS II membrane fragments. // Photosynthetica. 1997. - V.33, - P. 529-539.

98. Ahlbrink R., Haumann M., Cherepanov D., Bogershausen D., Mulkidjanian 0., Junge W. Function of tyrozine Z in water oxidation by Photosystem II: electrostatical promotor instead of hydrogen abstractor. // Biochemistry. -1998. V.37, - P. 1131-1142.

99. Reinman S., Mathis P. Influence of temperature on photosystem II electron transfer reactions. // Biochim. Biophys. Acta. 1981. - V.635, - P. 249258.

100. Tommos С., Babcock G.T. Proton and hydrogen currents in photosynthetic water oxidation. // Biochim. Biophys. Acta. 2000, - V.1458, - P. 199-219.

101. Schlodder E., Brettel K., Witt H.T. Relation between microsecond reduction kinetics of photooxidized chlorophyll a (P-680) and photosynthetic water oxidation Biochim. // Biophys. Acta. 1985. - V.808, - P. 123-131.

102. Schilstra M.J., Rappaport F., Nugent J.H.A., Barnett C.J., Klug D.R. Proton/hydrogen transfer affects the S-state-dependent microsecond phases of P680+ reduction during water splitting. // Biochemistry. 1998. - V.37, -P. 3974-3981.

103. Кок В., Forbuch В., McGloin M. Cooperation of charges in photosynthetic O2 evolution. A linear four step mechanism. // Photochem. Photobiol. -1970.-V.il,-P. 457-475.

104. Meyer В., Schlodder E., Dekker J.P., Witt H.T. 02 evolution and Chl„+ (P680+) nanosecond reduction kinetics in single flashes as a function of pH. // Biochim. Biophys. Acta. 1989. - V.974, - P. 36-43.

105. Conjeaud H., Mathis P. The effects of pH on the reductions kinetics of P68o in Tris-treated chloroplasts. // Biochim. Biophys. Acta. 1980. - V.590, - P. 353-359.

106. Ahlbrink R., Haumann M., Cherepanov D., Bogershausen 0., Mulkidjanian A., Junge W. Function of tyrosine Z in water oxidation by photosystem II: electrostatical promotor instead of hydrogen abstractor. // Biochemistry. -1998.-V.37.-P. 1131-1142.

107. Hays A.M., Vassiliev I.R, Golbeck J.H., Debus R.J. Role of Dl-Hisl90 in the proton-coupled oxidation of tyrosine Yz in manganese-depleted photosystem II. //Biochemistiy. 1999. - V.38, - P.l 1851-11865.

108. Eckert H.-J., Renger G. Temperature dependence of P680+ reduction in O2-evolving PS II membrane fragments at different redox states Si of the water oxidizing system. // FEBS Lett. 1988. - V.236, - P. 425-431.

109. Reinman S., Mathis P. Influence of temperature on photosystem II electron transfer reactions. // Biochim. Biophys. Acta. 1981. - V.635, - P. 249-258.

110. Климов B.B., Аллахвердиев С.И., Деметр С., Красновский А.А. Фотовосстановление феофитина в фотосистеме 2 из хлоропластов в зависимости от редокс-потенцала среды. // ДАН СССР 1979. - Т. 249, - С. 227-230.

111. Vass I., Styring S. pH-dependent charge equilibria between tyrosine-D and the S states in photosystem II. Estimation of relative midpoint redox potentials. // Biochemistiy. 1991. - V.30, - P. 830-839.

112. Krishtalik L.I. Energetics of multielectron reactions. Photosynthetic oxygen evolution. // Biochim. Biophys. Acta. 1986. - V.849, - P. 162-171.

113. Buser C.A., Thompson L.K., Diner B.A., Brudvig G.W. Electron-transfer reactions in manganese-depleted photosystem II. // Biochemistry. 1990. -V.29, - P. 8977-8985.

114. Babcock G.T., Sauer K. The rapid component of electron paramagnetic resonance signal II: a candidate for the physiological donor to photosystem II in spinach chloroplasts. // Biochim. Biophys. Acta. 1975. - V.376, - P. 329-344.

115. Tommos C., McCracken J., Styring S., Babcock G.T. Stepwise disintegration of the photosynthetic oxygen evolving complex. // J. Am. Chem. Soc. 1998. - V.120, - P. 10441-10452.

116. Ananyev G.M., Dismukes G.C. High-resolution kinetic studies of the reassembly of the tetra-manganese cluster of photosynthetic water oxidation: proton equilibrium, cations, and electrostatics. // Biochemistry. 1996. -V.35, - P. 14608-14617.

117. Saygin O., Gerken S., Meyer В., Witt H.T. Total recovery of O2 evolution and nanosecond reduction kinetics of chlorophyll-a. // Photosynth. Res. -1986. -V.9,- P. 71-78.

118. Boussac A., Setif P., Rutherford A.W. Inhibition of tyrosine Z photooxidation after formation of the S3 state in Ca(2+)-depleted and Cl(-)-depleted photosystem II. // Biochemistry. 1992. - V.31, - P. 1224-1234.

119. Joliot P. Kinetic studies of photosystem II in photosynthesis. // Photochem. Photobiol. 1968. - V.8, - P. 451-463.

120. Haumann M., Liebisch P., Muller C., Barra M., Grabolle M., Dau H. Photosynthetic O2 formation tracked by time-resolved x-ray experiments. // Science, 2005. - V.310, - P. 1019-1021.

121. Clausen J., Junge W. Detection of an intermediate of photosynthetic water oxidation. // Nature (London), 2004. - V.430, - P. 480-483.

122. Junge W., Clausen J. Photosynthetic oxygen production. // Science. 2006. -V.312,-P. 1470-1472.

123. McEvoy J.P., Brudvig G.W. Water-splitting chemistry of photosystem II. // Chemical Reviews. 2006. - V.106, - P. 4455-4483.

124. Rappaport F., Lavergne J. Charge recombination and proton transfer in manganese-depleted photosystem II. // Biochemistry. 1997. - V.36, - P. 15294-15302.

125. Rappaport F., Lavergne J. Coupling of electron and proton transfer in the photosynthetic water oxidase. // Biochim. Biophys. Acta. 2001. - V.l503, - P. 246-259.

126. Schlodder E., Witt H. T. Stoichiometry of proton release from the catalytic center in photosynthetic water oxidation. Reexamination by a glass electrode study at pH 5.5-7.2. // J. Biol. Chem. 1999. - V.274, - P. 30387-30392.

127. Mitchell P. Chemiosmotic coupling in oxidative and photosynthetic phosphorylation. // Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 1966. - V.41, - P. 445502.

128. Junge W., Witt H.T. On the ion transport system of photosyntrhesis. Investigations on a molecular level. // Z. Naturforsch. 1968. - V.222, - P. 244-254.

129. Bulychev A.A., Andrianov V.K., Kurella G.A., Litvin F.F. Micro-electrode measurements of the transmembrane potential of chloroplasts and its photoinduced changes. //Nature. 1972. - V.236, - P. 175-177.

130. Fowler C.F., Кок B. Direct observation of a light-induced electric field in chloroplasts. // Biochim. Biophys. Acta. 1974. - V.357, - P. 308-318.

131. Schuurmans J.J., Casey R.P., Kraayenhof R. Transmembrane electrical potential formation in spinach chloroplasts. Investigation using rapidly-responding extrinsic probe. // FEBS Letters. 1978. - V.94, - P. 405-409.

132. Семенов А.Ю., Чаморовский С.К., Мамедов М.Д. Электрогенные реакции в комплексах фотосистемы I. // Биофизика. 2004. - Т.49, - Р. 227-238.

133. Cruz JA, Sacksteder СА, Kanazawa A., Kramer DM. (2001) Contribution of electric field (Ay) to steady-state transthylakoid proton motive force ipmf) in vitro and in vivo. Control of pmf parsing Ay and ApH by ionic strength. Biochemistry, 40, 1226-1237.

134. Рубин А.Б. Биофизика. M.: Книжный дом «Университет», - 2000.

135. Рубин А.Б., Кренделева Т.Е. Регуляция первичных процессов фотосинтеза. // Успехи биологической химии. 2003. - Т.43, - Р. 225266.

136. Grooth B.G.D., van Gorkom H.J. External electric field effects on prompt and delayed fluorescence in chloroplasts. // Biochim. Biophys. Acta. 1981. - V.635, - P. 445-456.

137. Witt H.T. Energy conversion in the functional membrane of photosynthesis. Analysis by light pulse and electric pulse methods. The central role of the electric field. // Biochim. Biophys. Acta. 1979. - V.505, - P. 355-427.

138. Bulychev A.A., Andrianov V.K., Kurella G.A., Litvin F.F. Photoinduction kinetics of electrical potential in a single chloroplast as studied with microelectrode technique. // Biochim. Biophys. Acta. 1976. - V.430, - P. 336-351.

139. Trissl H.-W., Leibl W. Primary charge separation in photosystem II involves two electrogenic steps. // FEBS Letters. 1989. - V.244, - P. 85-88.

140. Pokorny A., Wulf K., Trissl H.W. An electrogenic reaction associated with the re-reduction of P680 by Tyr Z in photosystem II. // Biochim. Biophys. Acta. 1994. - V.l 184, - P. 65-70.

141. Мамедов М.Д., Ловягина Е.Р., Верховский М.И., Семенов А.Ю., Черепенов Д.Ю., Шинкарев В.П. Генерация разности электрических потенциалов фотосистемой II термофильных цианобактерий. // Биохимия. 1994. - Т.59, - С.916-922.

142. Haumann М., Mulkidjanian A.Ya., Junge W. Electrogenicity of electron and proton transfer at the oxidizing side of photosystem II. // Biochemistry. -1997. V.36, - P. 9304-9315.

143. Мамедов М.Д., Бешта О., Туровская К.Н., Мамедова А.А., Неверов К.В., Самуилов В.Д., Семенов А.Ю. Фотоэлектрические ответы кислород-выделящих комплексов фотосистемы II. // Биохимия. 1999. - Т.64, - С.606-611.

144. Hook F., Brzezinki P. Light-induced voltage changes associated with electron and proton transfer in photosystem II core complexes reconstituted in phospholipid monolayers. // Biophys. J. 1994. - V.66, - P. 2066-2072.

145. Mamedov M.D., Beshta O.E., Samuilov V.D., Semenov A.Yu. Electrogenicity at the secondary quinone acceptor site of cyanobacterial photosystem II. // FEBS Letters. 1994. - V.350, - P. 96-98.

146. Arnon D.I. Copper enzymes in isolated chloroplasts Polyphenoloxidase in Beta vulgaris. II Plant Physiol. - 1949. - V.24, - P. 1-15.

147. Provencher S.W. A Fourier method for the analysis of experimental decay curves. // Biophys. J. 1976. - V. 16, - P. 27-41.

148. Kalaidzidis Ya.L., Gavrilov A.V., Zaitsev P.V., Kalaidzidis A.L., Korolev, E.V. PLUK-An Environment for Software Development. // Programming and Computer Software. 1997 - V.23, - P. 206-212.

149. Bogershausen, O., and Junge, W. Rapid proton transfer under flashing light at both functional sides of dark-adapted Photosystem II particles. // Biochim. Biophys. Acta. 1995. - V.1230, - P. 177-185.

150. Murata N., Mohanty P.S., Hayashi H., Papageorgiou G.G. Glycinebetaine stabilizes the association the extrinsic proteins with the photosynthetic oxygen-evolving complex. // FEBS Letters. 1992. - V.296, - P. 187-189.

151. Deshnium P., Los D.A., Hayashi H., Mustardy L., Murata N. Transformation of Synechococcus with a gene for choline oxidase enhances tolerance to salt stress. // Plant Mol. Biol. 1995. - V.29, - P. 897-907.

152. Mamedov M.D., Beshta O.E., Shutilova N.I., Semenov A.Yu., Samuilov V.D. Photoelectric response generated under non-heme iron reduction on the photosystem II acceptor side. // Biochemistry (Moscow). 2000. - V.65, - P. 728-731.

153. Rappaport F, Guergova-Kuras M., Nixon P.J., Diner BA., Lavergne J. Kinetics and pathways of charge recombination in photosystem II. // Biochemistry. 2002. - V.41, - P. 8518-8527.

154. Semenov A.Yu. Electrogenic reactions in photosynthetic reaction centres of purple bacteria. // Sov. Sci. Rev. D. Physicochem. Biol. 2001. - V.l0, - P. 1-43.

155. Ghanotakis, D.F., Demetriou, D.M., Yocum, C.F. Isolation and characterization of an oxygen-evolving Photosystem II reaction center corepreparation and a 28 kDa Chl-a-binding protein. // Biochim. Biophys. Acta. 1987. - V.891, - P. 15-26.

156. Rich P.R., Harper R. Partition coefficients of quinones and hydroquinones and their relation to biochemical reactivity. // FEBS Letters. 1990. -V.269, - P. 139-144.

157. Xiong J., Subramaniam S., Govindjee Modeling of the D1/D2 proteins and cofactors of the photosystem II reaction center: Implications for herbicide and bicarbonate binding. // Protein Sci. 1996. - V.5, - P. 2054-2073.

158. Renger G. Mechanistic aspects of photosynthetic water cleavage. Photosynthetica. 1987. - V.21, - P. 203-224.

159. Wraight C.A. Modulation of herbicide-binding by the redox state of Q400, an endogenous component of photosystem II. // Biochim. Biophys. Acta. -1985. V.809, - P. 320-330.

160. Maroti P., Wraight C.A. Kinetics of H* ion binding by the P+QA" state of biochemical photosynthetic reaction centers: rate limitation within the protein. // Biophys. J. 1997. - V.73, - P. 367-381.

161. Siletsky S.A., Pawate A.S., Weiss K., Gennis R.B., Konstantinov A.A. Transmembrane charge separation during the feriyloxo oxidized transition in a nonpumping mutant of cytochrome с oxidase. // J. Biol. Chem. 2004. -V.279, - P. 52558-52565.

162. DeCoursey Т.Е., Cherny V.V. Deuterium isotope effects on permeation and gating of proton channels in rat alveolar epithelium. J. Gen. Physiol. 1997. -V.l 09,- P. 415^34.

163. Kirsch J.F. Secondary kinetic isotope effects. / Isotope effects on enzyme-catalyzed reactions. // Cleland W.W., O'Leary M.H., Northrop D.B. (eds), Baltimore: University Park Press, 1977. - P. 100-121.

164. Tittor J., Soell C., Oesterhelt D., Butt H.-J., Bamberg E. A defective proton pump, point-mutated bacteriorhodopsin Asp96 —» Asn is fully reactivated by azide. // EMBO J. 1989. - V.8, - P. 3477-3482.

165. Delrieu M.J. A two-electron reaction at the catalytic site of water oxidation in manganese photosystem II vesicles in the presence of an electron donor.

166. Coupled electron and proton transfer processes. // Biochim. Biophys. Acta. -1995.-V.1231,-P. 47-57.

167. Chroni S., Ghanotakis D.F. Accessibility of tyrosine Yz to exogenousл .reductants and Mn in various photosystem II preparations. // Biochim. Biophys. Acta. 2001. - V.1504, -P. 432-437.

168. Misran M., Matthews D., Valente P., Hope, A. Photochemical electron transfer between methylene blue and quinones. // Aust. J. Chem. 1994. -V.47, - P. 209-216.