Исследование структурно-функциональных свойств люменальных белков PSBO и САН3 фотосистемы 2 растений

Калинина, Юлия Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование структурно-функциональных свойств люменальных белков PSBO и САН3 фотосистемы 2 растений
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование структурно-функциональных свойств люменальных белков PSBO и САН3 фотосистемы 2 растений"

На правах рукописи

/^сгм^У

Калинина Юлия Владимировна

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ЛЮМЕНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ РБВО И САНЗ ФОТОСИСТЕМЫ 2

03 00 04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2008

003168700

Работа выполнена в Институте фундаментальных проблем биологии РАН

Научные руководители доктор биологических наук, профессор

Климов Вячеслав Васильевич

кандидат биологических наук Шутова Татьяна Витальевна

Официальные оппоненты

Ведущая организация

доктор биологических наук Москаленко Андрей Анатольевич

доктор биологических наук Мамедов Махир Джафар оглы

Институт физиологии растений РАН

Защита состоится « 22 » мая 2008 г в 11 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002 066 01 при Институте фундаментальных проблем биологии РАН

по адресу 142290, г Пущино, Московской обл , ул Институтская, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фундаментальных проблем биологии РАН

Автореферат разослан « -2/ » апреля 2008 г

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г Н Назарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Для стабильности и оптимального функционирования фотосистемы 2 (ФС 2), осуществляющей фотосинтетическое окисление воды, необходимо присутствие ряда периферических белков, ассоциированных с ФС 2 на донорной стороне, их называют также внешними белками водоокисляющего комплекса (ВОК) У высших растений и зеленых водорослей это белки PsbO, PsbP, PsbQ, а у красных водорослей, цианобактерий и зеленых фотобактерий - PsbO, PsbU, PsbV Однако открытия последних лет позволяют расширить традиционные представления о белковом составе ВОК У Synechocystis 6803 обнаружены белки, гомологичные PsbP и PsbQ эукариот (Thornton et al, 2004) У красной водоросли Cyanidium caldarium в составе ВОК обнаружен белок, гомологичный PsbQ (Enami et al, 1998) Кроме того, показано, что с донорной стороной ФС 2 одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtu ассоциирована карбоангидраза Cah3 (Karlsson et al, 1995, Villarejo et al, 2002) PsbO - это единственный белок ВОК, который присутствует у всех оксигенных фотосинтезирующих организмов, его появление связывают с возникновением способности к фотосинтетическому окислению воды PsbO играет ключевую роль в стабилизации и оптимизации функции окисления воды, однако молекулярный механизм его участия в этом процессе до сих пор не установлен Уникальным свойством PsbO является кислотно-щелочной гистерезис буферных свойств, связанный с существованием двух устойчивых протон-зависимых конформаций белка (Шутова с соавт, 1992, Shutova et al, 1997) In vivo функционирование PsbO осуществляется в условиях изменяющегося рН при освещении происходит подкисление люмена в результате выделения протонов при окислении воды, в темноте рН люмена близок к нейтральному (Siggel, 1975) В связи с этим можно предположить, что обнаруженные протон-зависимые конформационные состояния PsbO могут иметь место т vivo и играть функциональную роль

Первоначально предполагалось, что роль карбоангидразы СаНЗ, обнаруженной на люменальной стороне ФС 2 С reinhardtu, не связана с функцией окисления воды, а заключается в поставке субстрата С02 для Рубиско (Karlsson et al, 1995, Karlsson et al, 1998, Park et al, 1999) Впоследствии было проведено сравнение функциональных свойств ФС 2 у мутанта сшЗ, лишенного СаЬЗ, и дикого типа С reinhardtu, были получены данные, свидетельствующие о непосредственном участии СаЬЗ в работе ВОК (Villarejo et al, 2002) Однако для более прямого доказательства необходимости СаЬЗ для функционирования ВОК, а также для выяснения механизма участия этого белка в оптимизации функции окисления воды, необходимы эксперименты по реконструкции препаратов ФС 2 из мутанта сшЗ изолированной карбоангидразой Cah3

За исключением одного из белков свето-собирающего комплекса, LHCbll (Balmer et al, 2006), белки PsbO и Cah3 являются единственными белками ФС 2, имеющими парные остатки цистеина Обнаружение у люменального белка

иммунофилина FKBP13 дисульфидной связи, необходимой для активности (Gopalan et al, 2004), дало начало новому направлению в изучении фотосинтеза - редокс-регуляции в люмене (Buchanan and Luan, 2005) и привело к активному поиску других белков люмена, которые могут регулироваться за счет окислительно-восстановительных превращений Наличие у люменальных белков ФС 2, СаЬЗ и PsbO, парных остатков цистеина дает возможность рассматривать их как потенциальные мишени для редокс-регуляции в люмене Цель работы. Исследование структурно-функциональных свойств белков PsbO и СаЬЗ и выяснение их роли в функционировании ВОК ФС 2 В процессе исследования решались следующие задачи

1 Разработка системы экспрессии в клетках Escherichia colt и методики выделения и очистки рекомбинантных белков PsbO и Cah3 с последующей характеристикой их физико-химических и функциональных свойств

2 Изучение влияния рН на конформацию PsbO и на его способность связывать ионы кальция и марганца

3 Исследование функциональных свойств препаратов ФС 2 из мутанта С reinhardtn стЗ, лишенного Cah3, после реконструкции с помощью изолированной рекомбинантной карбоангидразы СаЬЗ

4 Изучение влияния окислителей и восстановителей сульфгидрильных групп на структуру и функцию белков PsbO и Cah3

Научная новизна работы Подобрана система экспрессии, выделения и очистки белков PsbO и СаЬЗ в Е colt, которая (в отличие от ранее использованной) позволяет получать PsbO в растворимой форме, избегая длительной процедуры рефолдинга Кроме того, с помощью данной экспрессионной системы впервые удалось получить гомогенный препарат СаЬЗ

Показано, что в физиологическом диапазоне рН (5,7 - 7,2) изолированный PsbO претерпевает протон-зависимые конформационные изменения, сопровождающиеся изменением степени доступности гидрофобного ядра белковой глобулы и способности связывать ионы Са2+ и Мп2+ Выдвинуто предположение о функциональной роли рН-индуцируемых конформационных изменений PsbO т vivo

Показано, что ионы Мп2+ и Са2+ оказывают разное влияние на конформацию изолированного PsbO, что свидетельствует о том, что эти металлы имеют независимые места связывания на белке Определена константа связывания ионов Мп2+с PsbO прирН 5,7, равная 1 2х104М"', и ионов Са2+-2,1х10б М"1

С использованием рекомбинантной карбоангидразы Cah3 проведены эксперименты по реконституции препаратов ФС 2 из мутанта С reinhardtn сгаЗ, лишенного СаЬЗ Получены данные, свидетельствующие о том, что СаЬЗ является специфичной для ФС 2 С reinhardtn карбоангидразой Связывание СаЬЗ с препаратами ФС 2 из мутанта сгаЗ, лишенного этого белка, стимулирует транспорт электронов на донорной стороне и приводит к полной реактивации кислородвыделяющей функции ФС 2 Таким образом, СаЬЗ может считаться одним из ключевых компонентов ВОК С reinhardtn, необходимым для его оптимальной активности

Исследовано влияние дисульфидных связей PsbO и Cah3 на структуру и функцию этих белков Показано, что единственная дисульфидная связь PsbO вносит существенный вклад в стабильность нативной структуры белка, что обусловлено положением одного из остатков цистеина, участвующего в образовании этой связи, в центре кластера с высокой плотностью межмолекулярных контактов Обнаружено, что белок Cah3 имеет дисульфидную связь, восстановление которой приводит к полной инактивации белка Выдвинуто предположение о роли редокс-регуляции в функционировании люменальных белков ФС 2, Cah3 и PsbO Практическая значимость работы Полученные результаты расширяют и углубляют представления о структурно-функциональной организации водоокисляющего комплекса фотосистемы 2, отличающегося повышенной чувствительностью к действию повреждающих факторов Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2004), на VII Скандинавском фотосинтетическом конгрессе (Турку, 2004)

Публикации По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы, в том числе 2 статьи

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования. В экспериментах использовали препараты ФС 2, выделенные из листьев шпината и клеток С reinhardtu согласно методу (Berthold et al, 1981) с модификациями PsbO выделяли из препаратов ФС 2 шпината согласно методу (Ono and Inoue, 1984) Рекомбинантные белки PsbO и СаЬЗ были получены с помощью разработанного нами метода, представленного в настоящей работе Мутантный штамм С reinhardtu сшЗ, лишенный активной карбоангидразы Cah3, был получен от проф Дж В Морони (Университет Луизианы, США) Клетки выращивали на среде (Sueoka, 1960) при барботировании 2% С02, интенсивность света 120 мкмоль/(м2 с)

Плазмида pBlueScript II KS/SK(+), содержащая полноразмерную копию гена шпинатного PsbO, была любезно предоставлена профессором Ч Ф Иокумом (Мичиганский Университет, США) Для клонирования последовательности зрелого PsbO в экспрессионных векторах рЕТ32Ь(+) и pET28b(+) («Novagen») были использованы праймеры psbO-Nco 5'- aaaccatggagggaggaaagagattga - 3' psbO-EcoR 5'- ttagaattcatacagacgttttacccttttattgcg - 3'

Энтерокиназный сайт в экспрессионной конструкции pET32-PsbO был заменен на сайт фактора Ха с использованием олигонуклеотидов Xa-Bgl 5'-gatctgattgagggtcg - 3' и Xa-Nco 5'- catgcgaccctcaat са - 3' Для клонирования последовательности зрелого Cah3 в рЕТ32Ь(+) использованы праймеры СаЬЗ-Bgl 5'- ttttagatctgatcgaaggtcgtgcagcttggaactatggcgaagtt- 3', Cah3-Xho 5'-tagcacctcgaggtccgctcacagctcgta- 3', при этом происходило введение сайта фактора Ха непосредственно перед последовательностью зрелого белка Cah3 Во всех случаях для экспрессии использовали Е coli штамм B834(DE3)pLysS («Novagen») Электрофорез в Ds-Na-ПААГ проводили согласно методу

(Laemmli, 1970), а электрофорез в градиенте мочевины - согласно методу (Goldenberg, 1989) Температурную зависимость собственной флуоресценции белка измеряли на лабораторно собранном спектрофлуориметре, описанном ранее (Permyakov et al, 1977) Фотоиндуцированные изменения выхода флуоресценции (dF) измеряли при помощи установки, описанной ранее (Климов с соавт, 1975) Скорость выделения 02 измеряли при помощи электрода Кларка С02-гидратазую активность измеряли как описано ранее (Karlsson et al, 1995)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Экспрессия шпинатного PsbO в Escherichia coli, разработка методики выделения и очистки рекомбинантного белка Существующие системы экспрессии PsbO высших растений не позволяют получать целевой белок в растворимой форме в цитоплазме Е coli Мы полагаем, что это связано с невозможностью формирования дисульфидной связи в белке в восстановительных условиях цитоплазмы клетки Е coli Известно, что для ряда белков экспрессия в слиянии с тиоредоксином (катализатором образования дисульфидных связей) позволяет получить белки в растворимой форме в цитоплазме Е coli В данной работе, проведенной совместно с Чернышевым С В (ФИБХ РАН), было проведено сравнение экспрессии PsbO двух векторных системах, с тиоредоксином (рЕТ32) и без него (рЕТ28) В рЕТ32 белок экспрессируется в слиянии с тиоредоксином (trx) и His6 Вектор также содержит последовательность, кодирующую сайт разрезания специфической протеазы, энтерокиназы, которая локализуется непосредственно перед геном целевого белка Таким образом, после аффинной очистки от целевого белка можно отщепить N-концевой 1гх-Н156-фрагмент В рЕТ28 белок экспрессируется без каких-либо дополнительных последовательностей В обоих случаях PsbO экспрессировался без лидерного пептида В случае обеих плазмид мы видим накопление целевого белка при индукции ИПТГ (рис 1, 2 и 3) Однако при экспрессии PsbO без trx весь целевой белок находился в нерастворимой фракции (рис 1, 4), а при экспрессии с trx весь целевой белок был растворим (рис 1, 7) Таким образом, экспрессия в слиянии с trx имеет критическое значение для растворимости PsbO Мы предполагаем, что это связано с тем, что тиоредоксин способствует образованию дисульфидной связи в PsbO и таким образом приводит к накоплению правильно свернутого и, следовательно, растворимого белка Для масштабной экспрессии PsbO была выбрана векторная система рЕТ32

При экспрессии PsbO в оригинальном векторе рЕТ32 от «Novagen» мы столкнулись с проблемой неспецифического расщепления целевого белка энтерокиназой С помощью варьирования условий инкубации с протеазой снизить степень неспецифического протеолиза не удалось Также не удалось очистить PsbO от продукта его протеолиза хроматографическими методами Поэтому последовательность энтерокиназного сайта в конструкции рЕТ32-PsbO была заменена на синтезированный фрагмент, кодирующий сайт другой

протеазы - фактора Ха. В итоге была получена плазмида, названная рЕТ32-Ха-РбЬО, кодирующая слитный белок ц-х-Шб-Ха-РэЮ, в котором последовательность сайта фактора Ха находится непосредственно перед последовательностью зрелого РбЬО. Очистку белка их-Н^-Ха-РвЮ проводили методом металл-аффинной хроматографии. Оптимизация условий хроматографии позволила получить препарат слитного белка с чистотой более 90% (рис. 2, 2). Удалось подобрать условия инкубации с фактором Ха, обеспечивающие максимальный выход целевого РэЬО без следов неспецифического протеолиза (рис. 2, 3). После расщепления протеазой рекомбинантный РбЬО очищали от нерасщепленного слитного белка и свободного ц-х-Шэ^ фрагмента методом аффинной хроматографии. Был получен препарат рекомбинантного РбЬО с чистотой более 95% (рис. 2, 4).

Рис. 1. Сравнение экспрессии РбЬО в векторах рЕТ28 и рЕТ32. (1) - лизат неиндуцированных клеток, с плазмидой рЕТ32-Р$ЬО; (2) - лизат клеток с плазмидой рЕТ28-РбЬО, после 3 ч индукции; (3) -лизат клеток, несущих рЕТ32-РзЬО, после 3 ч индукции; нерастворимая - (4) и растворимая - (6) фракции клеток с плазмидой рЕТ28-РзЬО; нерастворимая - (5) и растворимая - (7) фракции клеток с плазмидой рЕТ32-РзЬО.

Рис. 2. Постадийная очистка Р?ЬО, экспрессированного в векторе рЕТ32-Ха-РзЬО. (1) - растворимая фракция клеточного лизата; (2) - слитный белок ^х-Е^-Ха-РвЬС), полученный после аффинной очистки на колонке РПзТгар, заряженной ионами никеля; (3) - расщепление слитного белка фактором Ха; (4) - очищенный рекомбинантный РбЬО.

Структурно-функциональная характеристика рекомбинантного Р5ЬО

Спектр флуоресценции рекомбинантного РбЬО (рис. За, (.....)) не отличим от

спектра флуоресценции нативного шпинатного РбЬО (рис. За, (-)), что

свидетельствует о том, что рекомбинантный РбЬО имеет структуру, близкую к нативной с неповрежденной дисульфидной связью. Электрофорез в нативных условиях (рис. 36) показал, что рекомбинантный белок и белок, выделенный из шпината, имеют одинаковую степень компактности белковой глобулы. Рекомбинантный РйЬО эффективно и специфично связывается с препаратами ФС 2, лишенными внешних белков (рис. 4а), и восстанавливает исходный уровень кислородвыделяющей активности (рис. 46). Полученные данные свидетельствуют о том, что шпинатный РзЬО был успешно экспрессирован в Е.

coli, причем рекомбинантный белок имеет конформацию не отличающуюся от конформации природного белка и обладает функциональной активностью.

-е

32D ЗС 2Е0 2

длина волны.нм

«о 12 12

Рис. 3. (а) Спектры флуоресценции шпинатного РйЬО (—•), рекомбинантного РвЬО

(........), шпинатного РвЬО после восстановления дисульфидной связи (- - -),

денатурированного в мочевине шпинатного РбЬО {■-•-■-•-•). (б) Неденатурируюший ПААГ-электрофорез рекомбинантного РйЬО - (1) и шпинатного Р.яЬО - (2). Образцы инкубировались в присутствии (+) и в отсутствие (-) 200 мМ 2-меркаптоэтанола.

с- . т.

ёТ «Ю-

1 й та

■ PsbO

ED g

12 3 4

Рис. 4. (а) Связывание рекомбинантного PsbO (recPsbO) с препаратами ФС 2, лишенными PsbO, PsbP, PsbQ (usw-<E>C2). (!) - usw-®C2; usw-OC2 после инкубации с recPsbO в соотношении 2 моля - (2) и 5 молей - (3) белка на моль РЦ ФС 2. (4)- контроль

- препараты ФС 2, лишенные PsbP и PsbQ (sw-®C2), (степень связывания Psb0-100%). (б) Реконституция 02-выделяющей активности usw-<i>C2 препаратов рекомбинантным PsbO. Скорость выделения кислорода у usw-ФС 2 - (2); у usw-®C2 после инкубации с recPsbO - (3); у usw-®C2 после инкубации с шпинатным PsbO (Betts et al., 1996) - (4). (1)

- контроль - скорость выделения кислорода у sw-®C2 препаратов (100 %).

Экспрессия карбоангидразы СаЬЗ в Е. соИ, разработка методики выделения и очистки рекомбинантного белка. Для экспрессии СаЬЗ был использован тот же подход, что и для экспрессии РбЬО. Последовательность зрелого СаИЗ была клонирована в вектор рЕТ32Ь(+), использование специально разработанных праймеров позволило ввести последовательность сайта разрезания фактора Ха непосредственно перед последовательностью зрелого СаЬЗ. В результате была получена экспрессионная конструкция рЕТ32-Ха-СаЬЗ, кодирующая слитный белок йх-Швб-СаИЗ. Белок экспрессировался в

растворимой форме (рис. 5, 3). Стратегия очистки рекомбинантной карбоангидразы Cah3 была такая же, как и для PsbO. Оптимизация условий аффинной хроматографии и условий инкубации с фактором Ха позволила получить препарат Cah3 с чистотой более 95% (рис. 5, 7). Карбоангидраза СаЬЗ экспрессирована в активной форме, ее С02-гидратазная активность составляет 1400-1600 ед. Вильбура-Андерсона на мг белка.

"W Рис. 5. Экспрессия Cah3 в плазмиде рЕТ32-Ха-203 Cah3 и постадийная очистка рекомбинантного 9j белка. (1) - лизат неиндуцированных клеток; (2) -лизат клеток после 3 ч индукции; растворимая 50 фракция - (3) и нерастворимая фракция - (4) 37 индуцированных клеток; (5) - слитный белок trx-29 His6-Cah3, очищенный на аффинной колонке HisTrap, заряженной никелем; (6) - расщепление 20 слитного белка фактором Ха ; (7) - очищенный рекомбинантный белок Cah3.

Таким образом, в результате проведенной работы была подобрана система для экспрессии белков PsbO и СаЬЗ в Е. coli. Предложенная система экспрессии, в отличие от ранее использованной, позволяет получать PsbO в растворимой форме, избегая длительной процедуры рефолдинга. Кроме того, с помощью данной экспрессионной системы впервые удалось получить гомогенный препарат СаЬЗ.

Изучение влияния рН на конформацию PsbO in vitro и на его способность связывать ионы кальция и марганца Уникальным свойством PsbO является кислотно-щелочной гистерезис буферных свойств, предположительно связанный с существованием двух устойчивых протон-зависимых конформационных состояний белка (Шутова с соавт., 1992). В данной работе мы продолжили исследование роли рН в регуляции функции PsbO. Было проведено изучение влияния рН на конформацию PsbO и на способность белка взаимодействовать с ионами кальция и марганца, являющихся кофакторами реакции окисления воды. Как показано на рис. 6а кривые плавления апо-белка (*) и белка, в присутствии 2 мМ МпС12 (А) или 2 мМ СаСЬ (■) при рН 7,2 не отличаются друг от друга. Кривые плавления апо-белка при рН 5,7 и рН 7,2 отличаются друг от друга в диапазоне температур 20-65°С (не показано). Кроме того, при рН 5,7 кривые плавления апо-белка (•), белка в присутствии 2 мМ МпСЬ (-4) или 2 мМ СаСЬ (■) отличаются друг от друга (рис. 66). Из этих данных следует, что, PsbO претерпевает конформационные изменения при подкислении среды от рН 7,2 до рН 5,7. Эти конформационные изменения в свою очередь влияют на способность белка связывать ионы металлов. При рН 7,2 PsbO вероятно не способен связывать ни Са2+, ни Мп2+, тогда как при рН 5,7 оба иона связываются с белком. Ионы Са~г и Мп2" оказывают разное влияние на кривую плавления PsbO, из чего следует, что у этих ионов разные места связывания на белке.

-С- . ■ --—

Шг-•

■ ?> ■.

.-mfja,; «ЛЛА

7 М

■а

¡3

Температура, °С

Рис 6 Температурные зависимости собственной флуоресценции изолированного РвЬО при рН 7,2 (а) и рН 5,7 (б) В отсутствие добавок (апо-форма) (•), в присутствии 2 мМ СаС12 (■), в присутствии 2 мМ МпС12 (А)

Для дальнейшего изучения эффекта протонов и ионов металлов на структуру РэЬО была использована флуоресценция гидрофобного красителя АНС (8-анилино-1-нафталеносульфонат), который является пробой на доступность водному растворителю гидрофобного ядра белковой глобулы (Зегшзойюу е1 а1, 1991) В присутствии РбЬО флуоресценция АНС возрастает в 4 раза при подкислении среды от рН 7,5 до рН 4,0 (не показано), что согласуется с данными, полученными ранее (БЬЩоуа е1 а1, 1997) Последующее титрование щелочью этого образца приводит к обратному уменьшению флуоресценции (рис 7, •) Это указывает на то, что РзЬО отвечает на изменение рН среды частичным открытием гидрофобного ядра белковой глобулы при кислом рН и его закрытием при нейтральном рН Флуоресценция АНС в присутствии апо-белка монотонно убывает при титровании щелочью Добавление ионов Са2+ или Мп2+ к белку изменяет характер рН-зависимости интенсивности флуоресценции АНС (рис 7, в и А) Титрование РбЬО ионами Са2+ или Мп2+ при рН 5,7 вызывает увеличение интенсивности флуоресценции АНС (не показано) Это свидетельствует о том, что связывание ионов Са2+ и Мп2+ с РбЬО приводит к дополнительному увеличению доступности гидрофобного ядра молекулы белка Такой эффект характерен для кальций-сенсорных белков, которые при связывании кальция открывают гидрофобные регионы, и по ним осуществляется взаимодействие с белками-мишенями (Ве^агс! е( а1, 2000) Мы полагаем, что связывание ионов металлов с РбЬО может влиять на его способность взаимодействовать с другими белками комплекса ФС 2

Для определения констант связывания ионов металлов мы провели титрование белка ионами Са2+ и Мп2+ в присутствие АНС при рН 5,7 Была определена константа связывания ионов кальция с РэЬО, равная 2,1х106 М"1, и константа связывания ионов марганца, равная 1,2x104 М'1

Таким образом, показано, что изолированный РбЬО претерпевает рН-зависимые конформационные изменения в диапазоне рН 5,7 - 7,2, сопровождающиеся относительным открытием гидрофобного ядра белковой

глобулы, а также увеличением способности связывать ионы Са2+ и Мп2+ при рН 5,7, и напротив закрытием гидрофобного ядра и потерей способности связывать ионы металлов при рН 7,2 При этом ионы кальция и марганца имеют независимые участки связывания на РбЬО и оказывают разное влияние на конформацию белка при рН 5,7

Известно, что при освещении происходит подкисление люмена до рН около рН 5,5 (Siggel, 1975, Kramer et al, 2003), тогда как в темноте рН люмена близок к нейтральному В связи с этим мы предполагаем, что наблюдаемые рН-зависимые конформационные переходы PsbO, сопровождающиеся изменением способности связывать ионы кальция и марганца, могут происходить ш vivo и иметь функциональное значение Предполагается, что конформация изолированного PsbO при рН 5,7 аналогична конформации PsbO т vivo на свету, а конформация PsbO in vitro при рН 7,2, аналогична конформации PsbO in vivo в темноте Функциональное значение рН(свето)-индуцируемых конформационных переходов PsbO может также заключаться в регуляции высвобождения протонов и доставки воды к ВОК Кроме того, PsbO может участвовать в связывании и хранении ионов марганца и кальция, высвобождающихся из каталитического центра при фотоингибировании, эти ионы впоследствии могут быть использованы для реактивации ВОК

Реконструкция препаратов ФС 2 из мутанта С. remhardtii сшЗ с рекомбинантной карбоангидразой Cah3. Наличие изолированной рекомбинантной карбоангидразы Cah3 впервые дает возможность проводить эксперименты по реконструкции препаратов ФС 2, выделенных из мутанта сшЗ Известно, что при одинаковой концентрации хлорофилла в препаратах ФС 2 из мутанта сшЗ содержится приблизительно в 1,8 раз больше реакционных центров ФС 2, чем в препаратах из дикого типа (Villarejo et al, 2002) Исходя из этого скорость выделения кислорода у препаратов ФС 2 из мутанта, рассчитанная на реакционный центр, составляет чуть больше половины от скорости, наблюдаемой у препаратов ФС 2 из дикого типа, (рис 8а, сравнить 1 и 2) Добавление 2 мМ бикарбоната приводит к стимуляции кислородвыделяющей активности ФС 2 мутанта на 40%, что свидетельствует о частичной реактивации (рис 8а, 3) Это хорошо согласуется с уже известными

Рис 7 рН-зависимость интенсивности флуоресценции АНС в присутствие РбЬО Без добавок (•), в присутствии 2 чМ СаСЬ (■), в присутствии 2 мМ МпС12 (А) Образец, находящийся при рН 4 0, был оттитрован щелочью до рН 7,5 Концентрация белка - 1 мкМ концентрация АНС - 200 мкМ Длина волны возбуждающего света - 395 нм, флуоресценция регистрировалась при 487 нм

рн

данными Вилларехо с соавт (УШагер е1 а1,2002) При совместном добавлении рекомбинантной карбоангидразы СаЬЗ и бикарбоната наблюдается 85%-ная стимуляция кислородвыделяющей активности, что свидетельствует о полной реактивации ФС 2 мутанта сгаЗ (рис 8а, 4) При этом для максимальной стимуляции активности достаточно 50 мкМ бикарбоната (рис 86, ■), тогда как в отсутствие СаЬЗ максимальная стимуляция наблюдается при 2 мМ бикарбоната (рис 86, А) После подавления карбоангидразной активности СаЬЗ с помощью специфического ингибитора этоксизоламида, стимулирующий эффект СаЬЗ исчезает (рис. 8а, 6) Максимальная стимуляция скорости выделения кислорода наблюдается при добавлении СаЬЗ к препаратам ФС 2 из мутанта сшЗ в соотношении 1 1 на реакционный центр (не показано), что указывает на стехиометрию 1 1 Добавление к препаратам ФС 2 из мутанта другой а-карбоангидразы, бычьей карбоангидразы II, не приводит к стимуляции скорости выделения кислорода (рис 8а, 5), несмотря на высокую активность этого белка в растворе, это указывает на то, что СаЬЗ является специфичной для ФС 2 С гетЪагМи карбоангидразой

Рис 8 (я) Скорость выделения кислорода в расчете на РЦ ФС 2 (1)-контроль -препараты ФС 2 из дикого типа (кислородвыделяющая активность - 100%) Препараты ФС 2 из мутанта сшЗ без добавок-(2), в присутствии 2 мМ КНС03 -(3), в присутствии 2 мМ КНС03 и 0,1 мкМ рекомбинантной карбоангидразы СаЬЗ (1 моль белка/1 моль РЦ ФС 2)-(4), в присутствии 2 мМ КНС03 и 0,1 мкМ бычьей карбоангидразы II (1 моль белка/1 моль РЦ ФС 2)-(5), в присутствии 2 мМ КНС03 и 0,1 мкМ СаЬЗ, инактивированной этоксизоламидом-(б) (б) Зависимость скорости выделения кислорода от концентрации бикарбоната (С,) у препаратов ФС 2 из мутанта сшЗ в отсутствие - (•) и в присутствии - (■) 0,1 мкМ Cah3, (А) - скорость выделения кислорода у препаратов ФС 2 из мутанта сшЗ в присутствии 2 мМ КНС03 и 0,1 мкМ бычьей карбоангидразы II, (Т) - Зависимость скорости выделения кислорода от концентрации бикарбоната у препаратов ФС 2 из дикого типа 100 % (180 мкМ 02 (мг Хл)'1 ч"')- скорость выделения кислорода у препаратов ФС 2 из сшЗ в среде, лишенной С02/НС03

Наблюдаемая реактивация связана с событиями на донорной стороне ФС 2 Это было показано с помощью измерения фотоиндуцируемых изменений выхода флуоресценции хлорофилла а (<№) Добавление 50 мкМ бикарбоната к препаратам ФС 2 из мутанта приводило к увеличению амплитуды с!Р (рис 9, 2) вследствие увеличения эффективности донирования электронов от ВОК на реакционный центр ФС 2 Более значительное увеличение амплитуды с!Р происходило при одновременном добавлении 50 мкМ бикарбоната и рекомбинантной карбоангидразы СаЬЗ (рис 9, 4) После инактивации карбоангидразной активности СаЬЗ этоксизоламидом, стимулирующий эффект СаЬЗ не наблюдался (рис 9, 5)

Связывание СаЬЗ с ФС 2 проверяли методом иммуноблоттинга После измерения кислородвыделяющей активности в присутствии СаЬЗ, образцы отбирали из ячейки и центрифугировали Осадок и супернатант наносили на гель После электрофореза проводили иммуноблоттинг с антителами против СаЬЗ В супернатанте белок не детектировался, весь СаЬЗ находился во фракции осадка (данные не представлены) Таким образом, наблюдаемый эффект стимуляции вызывается связыванием рекомбинантной карбоангидразы СаЬЗ с комплексами ФС 2 мутанта сшЗ

Полученные данные свидетельствуют о том, что СаЬЗ является специфичной для ФС 2 С гетИагЛи карбоангидразой Связывание СаЬЗ с ФС 2 мутанта, лишенного этого белка, стимулирует транспорт электронов на донорной стороне и приводит к полной реактивации функции ФС 2 Это доказывает необходимость карбоангидразы СаЬЗ для оптимальной работы ФС 2 Таким образом, СаЬЗ может считаться одним из ключевых компонентов ВОК ФС 2 С геткагс1ш Мы полагаем, что СаЬЗ выполняет специфическую функцию в водоокисляющем комплексе, связанную с ее энзиматической активностью, поскольку стимулирующий эффект СаЬЗ пропадает после инактивации фермента специфическим ингибитором карбоангидраз этоксизоламидом СаЬЗ катализирует реакцию обратимой гидратации С02 с образованием ионов бикарбоната и протонов ВОК ФС 2, с другой стороны, осуществляет реакцию разложения воды с образованием молекулярного кислорода, электронов и протонов Известно, что для этого процесса большое

Рис 9 Фотоиндуцируемые изменения выхода флуоресценции хчорофилла а ФС2 (АР) в препаратах ФС 2 из мутанта сшЗ в отсутствие каких-либо добавок - (1), в присутствии 50 мкМ бикарбоната - (2), в присутствии 2 мМ бикарбоната - (3), в присутствии 50 мкМ бикарбоната и 0,7 мкМ рекомбинантной карбоангидразы СаЬЗ (1 моль белка на 1 моль РЦ ФС 2) - (4), в присутствии 50 мкМ бикарбоната, 0,7 мкМ СаЬЗ и 0,2 мкМ этоксизоламида - (5)

2 3

4 5

значение имеет удаление протонов от каталитического центра [Haumann et al, 2005] Мы предполагаем, что значение карбоангидразы СаЬЗ для работы ВОК заключается в ускорении «отвода» протонов, выделяющихся в результате реакции окисления воды, за счет катализируемой этим ферментом реакции дегидратации бикарбоната Н+ + НС03" <-> ССЬ + Н20 Хотя наличие карбоангидразы в составе ВОК показано только для одного организма (С reinhardtii), многочисленные данные свидетельствуют о наличии карбоангидразной активности, ассоциированной с ФС 2 у высших растений (Vaklmova et al, 1983, Stemler, 1986, Moskvin et al, 2004, Игнатова и др , 2006, Hillier et al, 2006) Это дает возможность предполагать, что карбоангидраза может быть ключевым компонентом ВОК всех эукариотических фотосинтезирующих организмов

Исследование влияния окисления и восстановления сульфгидрильных групп на структуру и функцию белков СаЬЗ и PsbO Наличие у белков СаЬЗ и PsbO парных остатков цистеина дает возможность рассматривать их как потенциальные мишени для редокс-регуляции в люмене В связи с этим целью исследований, описанных в данном разделе, было изучение влияния окисления и восстановления сульфгидрильных групп на структуру и функцию белков Cah3 и PsbO, в свете возможной редокс-регуляции их активности

Для активности многих растительных карбоангидраз необходимо присутствие в среде реагентов поддерживающих сульфгидрильные группы в восстановленном состоянии (Tiwari et al, 2005) Карбоангидраза СаЬЗ, напротив, полностью инактивируется в результате инкубации с 0,25 мМ дитиотреитолом (DTT) (рис 10а) После удаления DTT инактивированный белок может быть полностью реактивирован в результате инкубации с окислителями (окисленным глутатионом, пероксидом водорода) или кислородом воздуха (не показано) Инактивация фермента в результате инкубации с восстановителем дисульфидных групп указывает на наличие в белке дисульфидной связи необходимой для активности Возможность быстрой инактивации фермента низкими концентрациями восстановителя в отсутствие денатуранта свидетельствует о том, что эта дисульфидная связь расположена на поверхности белковой глобулы и доступна растворителю В первичной структуре Cah3 есть три остатка цистеина Cysl8, Cys55 и Cysl86 Поиск гомологов с помощью программы Blast, и выравнивание гомологичных последовательностей в программе ClustalW выявили группу а-карбоангидраз, у которых остатки цистеина Cysl8 и Cysl 86 по нумерации СаЬЗ консервативны Для некоторых из них, например для CAIV, CAVI, NGCA, показано наличие дисульфидной связи между этими остатками цистеина Гомологичное моделирование структуры СаЬЗ предсказывает наличие дисульфидной связи между Cysl8 и Cysl86 (рис 106) Все изученные карбоангидразы, имеющие цистеины в положении 18-186, являются внеклеточными связанными с мембраной или секреторными белками, и следовательно, СаЬЗ является первой известной внутриклеточной а-карбоангидразой, относящейся к этой группе Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что

карбоангидраза СаЬЗ имеет поверхностно расположенную дисульфидную связь. Обратимая инактивация СаЬЗ путем восстановления этой связи указывает на возможность редокс-регуляции функции белка.

Время, мин

Рис. 10. (я) Инактивация карбоангидразной активности Cah3 дитиотреитолом (■)- 0,5 мМ, (•)- 0,25 мМ. (б) Модель третичной структуры Cah3. Остатки Cysl 8 и Cys186. образующие дисульфидную связь представлены в виде сфер.

Вопрос о структуре PsbO в растворе и о влиянии дисульфидной связи на структуру и функцию белка на сегодняшний день остается дискуссионным. Широко распостранена гипотеза о том, что PsbO не имеет компактной высокоорганизованной структуры в растворе, и может быть отнесен к группе «нативно денатурированных» белков (Lydakis-Simantiris et al., 1999; Kruk et al., 2003; Loll et al., 2005). В работе (Tanaka et al., 1988) показано, что для сохранения структуры PsbO необходимо наличие дисульфидной связи. Дисульфидная связь в PsbO образована между остатками Cys28 и Cys51. Показано, что восстановленный белок теряет способность связываться с препаратами ФС 2 и реактивировать функцию выделения кислорода (Tanaka et al., 1988). Напротив (Betts et al., 1996; Wyman and Yocum, 2005) пришли к выводу, что дисульфидная связь не влияет на функцию PsbO, хотя ее восстановление может вызывать дополнительную дезорганизацию структуры белка. В нашей работе показано, что экспрессия PsbO в Е. coli в растворимой форме зависит от возможности формирования дисульфидной связи, из чего следует, что эта связь необходима для формирования нативной структуры белка. Для изучения стабильности нативной структуры белка и влияния дисульфидной связи на стабильность белка в совместной работе с Мельником Б.С. и Семисотновым Г.В. (ИБ РАН) были проведены эксперименты по денатурации/ренатурации белка в мочевине, используя метод электрофореза в градиенте мочевины. Денатурационный переход белка с интактной дисульфидной связью (рис 11а, /) хорошо обсчитывается в соответствии с моделью двух состояний. Рассчитаны следующие термодинамические параметры: dG(H20), свободная энергия стабилизации нативной формы белка, 14 кДж/моль; т, степень кооперативности денагурационного перехода, 6,2 кДж/моль. Восстановление дисульфидной связи приводит к сдвигу денатурационного перехода белка в область более низких концентраций

мочевины на 2 М по сравнению с переходом нативного белка (рис 11а, 2), что сопровождается изменением свободной энергии белка приблизительно на 9 кДж/моль. Из этого следует, что дисульфидная связь РбЬО вносит существенный вклад в стабилизацию нативной структуры белка.

О [мочевина] М 8

Рис. 11. (а) Электрофорез в градиенте мочевины PsbO с интаггной дисульфидной связью - (1) и после восстановления дисульфидной связи и алкилирования свободных Sil групп - (2). (б) Модель структуры PsbO шпината. Аминокислоты с высоким числом контактов (13-18) окрашены темно-серым цветом. Cys28 и Cys51 выделены объемной моделью. Кластеры аминокислот с высоким количеством контактов выделены кругами.

Известно много белков, которые стабилизируются дисульфидными связями (Rader et al., 2004; Guzzi et al., 1999). В большинстве случаев это внутренние дисульфидные связи, стабилизирующие гидрофобное ядро белка. Белок PsbO представляет собой р-«бочонок» и единственная дисульфидная связь закрепляет N-концевую петлю на внешней поверхности этого ß-бочонка (рис. 116). ß-бочонок - распространенный тип укладки белковой цепи, стабильность такой структуры обеспечивается за счет гидрофобных взаимодействий остатков, образующих ядро, и за счет сети водородных связей, объединяющей ß-тяжи (Cantini et al., 2006; Sacher et al., 2005). Поэтому, оказалось неожиданным, что разрыв дисульфидной связи сильно влияет на стабильность PsbO. Чтобы разобраться в структурных особенностях, которые могут приводить к такой дестабилизации, была рассчитана плотность контактов в молекуле PsbO, так как именно плотность контактов напрямую связана со стабильностью разных частей белка (Golovanov et al, 2000). Контакты рассчитывались следующим образом: если хотя бы один атом данной аминокислоты находится ближе, чем на 5 А к любому из атомов другой аминокислоты, считали, что между этими аминокислотами есть контакт. Оказалось, что аминокислоты с большим количеством контактов образуют два кластера (рис. 11 б), при этом Cys51 расположен в центре одного из них. Нарушение в упаковке аминокислот с большим количеством контактов обычно приводит к дестабилизации нативного состояния белков. Таким образом, логично предположить, что разрыв дисульфидной связи влияет на упаковку аминокислот в районе Cys51 (в регионе с высокой плотностью

межмолекулярных контактов) и, следовательно, приводит к дестабилизации нативного состояния молекулы белка

Результаты экспериментов по денатурации PsbO также дают информацию о структуре белка в растворе Параметры денатурационного перехода ширина перехода = 2 М, т ~ 6,2 кДж/моль, dG(H20) = 19 кДж/моль хорошо совпадают с аналогичными параметрами белков, являющихся классическими примерами глобулярных плотноупакованных белков, таких как ацилфосфатаза (Chiti et al, 1998), апофлаводоксин (Genzor et al, 1996) Из этого следует, что PsbO существует в растворе как компактная плотноупакованная структура и не может быть отнесен к группе «нативно денатурированных» белков

Существующее противоречие в вопросе о необходимости дисульфидной связи для функции PsbO может быть объяснено, если предположить что дисульфидная связь PsbO не существует на протяжении всего цикла функционирования белка, а может быть разрушена и образована заново, как способ модуляции функции Регуляция функции белков за счет обратимого окисления и восстановления дисульфидов широко распространена среди ферментов стромы Стромальные ферменты активируются на свету в результате восстановления дисульфидных связей (S-S—»SH) ферредоксин /тиоредоксиновой системой (Buchanan et al, 2002) На сегодняшний день известен только один редокс-регулируемый белок люмена, иммунофилин FKBP13 (Gopalan et al, 2004) Его открытие породило концепцию о редокс-регуляции в люмене, принципиальное отличие которой от редокс-регуляции в строме, заключается в активации люменальных белков на свету в результате образования дисульфидных связей (Buchanan and Luan, 2005) Акцептором электронов при окислении цистеинов в люмене может быть недавно обнаруженный в люмене Cytc6A (Marcaida et al, 2006) Предполагается, что Cytc<sa может принимать электроны от каких-то белков люмена (приводя к окислению цистеинов) и передавать их на пластоцианин

Наличие у Cah3 и PsbO дисульфидных связей, влияющих на активность, дает возможность считать эти белки потенциальными мишенями для редокс-регуляции, причем за исключением LHCbll, это единственные белки ФС 2, которые могут быть редокс-регулируемыми Активация этих белков за счет образования дисульфидной связи хорошо согласуется с предложенной концепцией о редокс-регуляции в люмене

ВЫВОДЫ

1. Подобрана система экспрессии в Е coli люменальных белков ФС 2, PsbO и Cah3, позволяющая экспрессировать целевые белки в слиянии с тиоредоксином, His6 и сайтом разрезания протеазой фактором Ха Разработана методика выделения и очистки рекомбинантных белков Предложенная система экспрессии в отличие от ранее использованной позволяет получать PsbO в растворимой форме, избегая длительной процедуры рефолдинга Кроме того, с помощью данной экспрессионной системы впервые удалось получить гомогенный препарат Cah3

2. Рекомбинантный PsbO способен реактивировать функцию выделения кислорода у препаратов ФС 2, лишенных PsbO, и обладает физико-химическими свойствами, характерными для белка, выделенного из растений Карбоангидраза СаЬЗ экспрессирована в активной форме, ее С02-гидратазная активность составляет 1400-1600 единиц Вильбура-Андерсона на 1 мг белка

3. Методами собственной флуоресценции белка и флуоресценции гидрофобной метки АНС показано, что изолированный PsbO претерпевает рН-зависимые конформационные изменения в диапазоне рН 5,7 - 7,2, сопровождающиеся относительным открытием гидрофобного ядра белковой глобулы, а также увеличением способности связывать ионы Са2+ и Мп2+ при рН 5,7, и напротив закрытием гидрофобного ядра и потерей способности связывать ионы металлов при рН 7,2 Предполагается, что конформация изолированного белка при рН 7,2 аналогична таковой у PsbO in vivo в темноте (когда рН люмена близок к нейтральному), тогда как при освещении реализуется конформация, характерная для рН 5,7, вследствие фотоиндуцируемого подкисления люмена

4. Показано, что ионы Мп2+ и Са2+ оказывают разное влияние на конформацию изолированного PsbO, что свидетельствует о том, что эти металлы имеют независимые места связывания на белке Определена константа связывания ионов Mn2+c PsbO при рН 5,7, равная 1,2x104 М"1, и ионов Са2+ - 2,1х10б М"1

5. Впервые показано, что связывание СаЬЗ с препаратами ФС 2 мутанта С reinhardtu сшЗ, не содержащего Cah3, приводит к стимуляции кислородвыделяющей активности на 85% и увеличению выхода переменной флуоресценции хлорофилла ФС 2 Показано, что бычья карбоангидраза II, относящаяся к тому же классу карбоангидраз, что и СаЬЗ, не приводит к стимуляции кислородвыделяющей активности ФС 2 из мутанта сшЗ, из чего следует, что СаЬЗ является специфичной для ФС 2 С remhardtu карбоангидразой Полученные данные подтверждают то, что СаЬЗ является необходимым компонентом ВОК ФС 2 С remhardtu, обеспечивающим оптимальное осуществление функции окисления воды

6. Показано, что Cah3 имеет дисульфидную связь, которая абсолютно необходима для активности фермента Инактивация Cah3 в результате восстановления дисульфидной связи полностью обратима Показано, что восстановление дисульфидной связи PsbO приводит к изменению свободной энергии белка на 9 кДж/моль Обнаружено, что Cys51, участвующий в образовании дисульфидной связи PsbO, находится в кластере с высокой плотностью межмолекулярных контактов, что, вероятно, является причиной дестабилизации белка в результате разрыва дисульфидной связи Показано, что формирование дисульфидной связи необходимо, для правильного сворачивания PsbO при экспрессии в Е coli Полученные данные свидетельствуют о необходимости дисульфидной связи для структуры PsbO Выдвинуто предположение о роли редокс-регуляции в функционировании люменальных белков ФС 2, Cah3 и PsbO

Публикации по теме диссертации

1 Shutova Т, Nikitina (Kahnina) J, Deikus G , Andersson В , Klimov V, Samuelsson G Structural dynamics of the manganese-stabilizing protein - effect of pH, calcium and manganese, Biochemistry, 2005,44, 15182-15192

2 Shutova T, Kenneweg H, Buchta J, Nikitina (Kalmina) J, Terentyev V, Chernyshov S , Andersson В , Allakhverdiev SI, Klimov V V , Dau H , Junge W and Samuelsson G The PSII-associated carbonic anhydrase m Chlamydomonas enhances the rate of oxygen production by proton removal, EMBOJ, online publication, doi 10 1038/emboj 2008 12

3 Никитина (Калинина) Ю В , Шутова Т В , Чернышев С В , Васильева J1 Г, Климов В В Выделение рекомбинантного марганец-стабилизирующего белка фотосистемы 2 растений Тезисы докл Биология - наука XXI века, 8-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 17-21 мая 2004 г), с 63

4 Shutova Т, Nikitina (Kahnina) J, Klimov V V, Andersson В and Samuelsson G The manganese-stabilizing protein as a lumenal buffer Abstracts Vll Nordic Photosynthesis Congress (Turku, Finland, 5-7 November, 2004)

Подписано в печать 17 04 2008 Печать трафаретная

Заказ № 286 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Калинина, Юлия Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структурно-функциональная организация фотосистемы 2.

1.2. Белки водоокисляющего комплекса фотосистемы 2.

1.2.1. Белки PsbP и PsbQ высших растений и зеленых водорослей.

Структура и взаимодействие с фотосинтетической мембраной.

Функция.

1.2.2. Белки PsbU и PsbV красных водорослей, цианобактерий и зеленых оксифотобактерий.

Структура и взаимодействие с фотосинтетической мембраной.

Функция.

1.2.3. Белки цианобактерий, гомологичные PsbP и PsbQ эукариот.

1.2.4. Белок красных водорослей, гомологичный PsbP эукариот.

1.3. Белок PsbO.

1.3.1. Структура PsbO.

Первичная структура белка.

Структура PsbO, связанного с фотосистемой 2.

Структура PsbO в растворе.

Дисульфидиая связь.

Кислотно-щелочной гистерезис буферных свойств белка.

1.3.2. Взаимодействие PsbO с фотосинтетической мембраной.

1.3.3. Фуикция PsbO.

Эффекты, возникающие в отсутствие PsbO.

Гипотезы о функциональном значении PsbO.

1.4. Карбоангидразная активность, ассоциированная с фотосистемой 2.

1.5. Карбоангидраза Cah3 одноклеточной зеленой водоросли

Chlamydomonas reinhardtii.

1.5.1. Внутриклеточная локализация.

1.5.2. Функциональное значение.'.

1.6. Редокс-регуляция фото синтетических процессов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Экспрессия PsbO в Escherichia coli, выделение и очистка рекомбинантного белка.

2.1.1. Конструирование плазмид для экспрессии PsbO.

2.1.2. Экспрессия рекомбинантных белков.

2.1.3. Выделение и очистка слитных белков trx-Hise-PsbO и trx-Hise-Xa-PsbO.

2.1.4. Разделение слитного белка trx-His6-PsbO.

2.1.5. Разделение слитного белка trx-His6-Xa-PsbO.

2.2. Сайт-направленный мутагенез PsbO.

2.3. Экспрессия СаЬЗ в Escherichia coli, выделение и очистка рекомбинантного белка.-.

2.3.1. Конструирование экспрессионного вектора.

2.3.2. Экспрессия и очистка СаЬЗ.

2.4. Получение препаратов ФС 2 из листьев шпината, выделение и очистка PsbO шпината.

2.5. Реконструкция usw-ФС 2 с помощью рекомбинантного PsbO.

2.6. Получение препаратов ФС 2 из клеток С. reinhardtii.

2.7. Реконструкция препаратов ФС 2 из мутанта С. reinhardtii cia с рекомбинантной карбоангидразой саЬЗ.

2.8. Исследование взаимодействия ионов Са2+ и Мп2+ с PsbO методом температурной зависимости собственной флуоресценции белка.

2.9. Исследование взаимодействия ионов Са и

Мп с PsbO и рН-индуцируемых конформационных переходов PsbO методом флуоресценции гидрофобного зонда АНС.

2.10. Температурная и солевая обработка з\¥-ФС2 препаратов на свету и в темноте.

2.11. Электрофорез в градиенте мочевины.

2.12. Расчет плотности межмолекулярных контактов в молекуле PsbO.

2.13. Электрофорез и иммуноблоттинг.

2.14. Определение концентрации белка.

2.15. Определение концентрации хлорофилла.

2.16. Определение карбоангидразной активности.

2.17. N-концевое секвенирование и масс-спектрометрия.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Экспрессия шпинатного PsbO в Escherichia coli, разработка методики выделения и очистки рекомбинантного белка.

3.1.1. Экспрессия PsbO в векторных плазмидах рЕТ28 и рЕТ32.

3.1.2. Выделение и очистка рекомбинантного PsbO, экспрессированного в векторной системе рЕТ32.

3.1.3. Замена последовательности сайта узнавания энтерокиназы в экспрессионном векторе pET32-PsbO на последовательность сайта узнавания фактора Ха.

3.1.4. Экспрессия PsbO в векторной плазмиде pET32-Xa-PsbO, выделение и очистка рекомбинантного белка.

3.1.5. Исследование структурно-функциональных свойств рекомбинантного PsbO.

3.2. Экспрессия карбоангидразы СаЬЗ в Escherichia coli, разработка методики выделения и очистки рекомбинантного белка.

3.3. Изучение влияния рН на конформацию PsbO in vitro и на способность белка взаимодействовать с ионами кальция и марганца.

3.3.1. Исследование взаимодействия ионов кальция и марганца с PsbO методом температурной зависимости собственной флуоресценции белка.

3.3.2. Исследование взаимодействия ионов кальция и марганца с PsbO и рН-ипдуцируемых конформационных переходов

PsbO с использованием гидрофобного красителя АНС.

3.4. Влияние освещения на экстракцию PsbO и ионов марганца из препаратов ФС 2.

3.5. Сайт-направленный мутагенез аминокислотных остатков PsbO, предположительно ответственных за рН-индуцируемые конформациопные изменения белка.

3.6. Реконструкция препаратов ФС 2 из мутанта С. reinhardtii cia с рекомбинантной карбоангидразой СаЬЗ.

3.6.1. Влияние рекомбинантной карбоангидразы СаЬЗ на скорость выделения кислорода у препаратов ФС 2 из мутанта cia3.

3.6.2. Влияние рекомбинантной карбоангидразы СаЬЗ на фотоиндуцируемые изменения выхода флуоресценции хлорофилла ФС 2 мутанта cia3.

3.6.3. Связывание СаЬЗ с комплексами ФС 2 из мутанта.

3.7. Исследование влияния окислителей и восстановителей сульфгидрильных групп на структуру и функцию белков СаЬЗ и PsbO.

3.7.1. Влияние окислителей и восстановителей сульфгидрильных групп на активность СаЬЗ.

3.7.2. Влияние дисульфидной связи на стабильность структуры PsbO.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование структурно-функциональных свойств люменальных белков PSBO и САН3 фотосистемы 2 растений"

Важнейший для энергетики биосферы процесс фотосинтетического окисления воды осуществляется во встроенном в мембрану тилакоидов пигмент-белковом комплексе, называемом фотосистемой 2 (ФС 2). Собственно реакция окисления воды происходит в энзиматическом центре, расположенном на люменальной стороне ФС 2 и состоящем из четырех атомов марганца и атома кальция. Лигандами для атомов марганца и кальция активного центра являются аминокислотные остатки интегральных белков Д1 и СР43 [Ferreira el al., 2004]. Однако для стабильности и оптимальной работы каталитического центра, осуществляющего окисление воды, необходимо присутствие ряда периферических белков, ассоциированных с ФС 2 на донорной стороне. Эти белки называют также внешними белками водоокисляющего комплекса (ВОК). У высших растений и зеленых водорослей это белки PsbO, PsbP, PsbQ, а у красных водорослей, цианобактерий и зеленых фотобактерий PsbO, PsbU, PsbV. Однако исследования последних лет показывают, что белковый состав ВОК вероятно более разнообразен. Недавно в составе высокоочищенных комплексов ФС 2 Synechocystis 6803 были обнаружены белки, гомологичные PsbP и PsbQ эукариот [Thornton et al., 2004]. У красной водоросли Cyanidium caldarium в составе ВОК обнаружен белок, гомологичный PsbQ зеленых растений [Enami et al., 1998]. Кроме того, показано, что с донорной стороной ФС 2 одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii ассоциирована карбоангидраза Cah3 [Karlsson et al., 1995; Park et al., 1999; Villarejo et al., 2001]. Полученные данные позволяют расширить традиционные представления о белковом составе водоокисляющего комплекса.

PsbO - единственный белок ВОК, который встречается у всех оксигенных организмов, он, по-видимому, появился одновременно с возникновением способности окислять воду [De Las Rivas et al., 2004]. Этот белок не принимает непосредственного участия в реакции окисления воды, однако он является минимальным внешним компонентом ВОК необходимым для оптимального осуществления этой реакции. Другие люменальные белки ФС 2 - PsbU, PsbV, PsbP и PsbQ эволюционно возникли позднее и служат для оптимизации работы ВОК в разных экологических условиях [De Las Rivas et al., 2004]. Несмотря на интенсивные исследования структуры и функции PsbO на протяжении вот уже тридцати лет, молекулярный механизм участия этого уникального белка в оптимизации функции окисления воды до сих пор не выяснен. Наиболее распространена гипотеза об участии PsbO в связывании ионов кальция, являющегося ключевым кофактором фотосинтетического окисления воды [Zhang et al., 1996; Heredia and De Las Rivas, 2003; Kruk et al., 2003; Murray and Barber, 2006]. Кроме того, существует предположение о том, что PsbO принимает участие в отводе протонов от каталитического центра и/или в транспорте к нему молекул воды [Shutova et al., 1997; Rutherford and Faller,

2001; De Las Rivas and Barber, 2004]. Уникальным свойством PsbO является кислотно-щелочной гистерезис буферных свойств, предположительно связанный с существованием двух устойчивых протон-зависимых конформаций белка [Шутова с соавт., 1992; Shutova et al., 1997]. In vivo функционирование PsbO осуществляется в условиях изменяющегося рН: при освещении происходит подкисление люмена в результате выделения протонов при окисления воды, в темноте рН люмена близок к нейтральному [Siggel, 1975; Kramer et al., 1999]. В связи с этим можно предположить, что обнаруженные протон-зависимые конформационные состояния PsbO могут иметь место in vivo и играть функциональную роль. Целью данной работы было изучение влияния рН на конформацию PsbO in vitro и in vivo, а также на его способность связывать ионы кальция и марганца.

Первоначально предполагалось, что роль карбоангидразы Cah3, обнаруженной на люменальной стороне ФС 2 С. reinhardtii, не связана с функцией окисления воды, а заключается в поставке субстрата (СО2) для стромального фермента рибулозобифосфаткарбоксилазы [Karlsson et al., 1995; Karlsson et al., 1998; Park et al., 1999]. Впоследствии в работе Вилларехо с соавт. было проведено сравнение функциональных свойств ФС 2 у мутанта cia3, лишенного СаЬЗ, и дикого типа С. reinhardtii; и были получены данные, свидетельствующие о непосредственном участии карбоангидразы СаЬЗ в работе ВОК [Villarejo et al., 2002]. Однако для более прямого доказательства необходимости СаЬЗ для функционирования ВОК, а также для выяснения механизма участия этого белка в оптимизации функции окисления воды, необходимы эксперименты по реконструкции препаратов ФС 2 из мутанта cia3 изолированной карбоангидразой СаЬЗ, что и является целью данной работы.

За исключением одного из белков свето-собирающего комплекса, LHCbll [Balmer et al., 2006], белки PsbO и СаЬЗ являются единственными белками ФС 2, имеющими парные остатки цистеина. Известно, что два цистеина в молекуле PsbO образуют дисульфидную связь [Tanaka and Wada, 1988]. Однако в вопросе о влиянии дисульфидной связи на структуру и функцию белка до сих пор существует противоречие [Tanaka and Wada, 1988; Irrgang et al., 1992; Burnap et al., 1994; Betts et al., 1996; Wyman and Yocum, 2005]. Обнаружение у люменального белка иммунофилина FKBP13 дисульфидной связи, необходимой для активности [Gopalan et al., 2004], дало начало новому направлению в изучении фотосинтеза - редокс-регуляции в люмене [Buchanan and Luan, 2005] и привело к активному поиску других белков люмена, которые могут регулироваться за счет окислительно-восстановительных превращений. Наличие у белков СаЬЗ и PsbO парных остатков цистеина дает возможность рассматривать их как потенциальные мишени для редокс-регуляции в люмене. В связи с этим целью данной работы было исследование влияния окисления и восстановления сульфгидрильных групп на структуру и функцию белков СаЬЗ и PsbO, в свете возможной редокс-регуляции их активности.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Калинина, Юлия Владимировна

выводы

1. Подобрана система экспрессии в Е. coli люменальных белков ФС 2, PsbO и СаЬЗ, позволяющая экспрессировать целевые белки в слиянии с тиоредоксином, Hise и сайтом разрезания протеазой фактором Ха. Разработана методика выделения и очистки рекомбинантных белков. Предложенная система экспрессии в отличие от ранее использованной позволяет получать PsbO в растворимой форме, избегая длительной процедуры рефолдинга. Кроме того, с помощью данной экспрессионной системы впервые удалось получить гомогенный препарат СаЬЗ.

2. Рекомбинантный PsbO способен реактивировать функцию выделения кислорода у препаратов ФС 2, лишенных PsbO, и обладает физико-химическими свойствами, характерными для белка, выделенного из растений. Карбоангидраза СаЬЗ экспрессирована в активной форме, ее СОг-гидратазная активность составляет 14001600 единиц Вильбура-Андерсона на 1 мг белка.

3. Методами собственной флуоресценции белка и флуоресценции гидрофобной метки АНС показано, что изолированный PsbO претерпевает рН-зависимые конформационные изменения в диапазоне рН 5,7 — 7,2, сопровождающиеся относительным открытием гидрофобного ядра белковой глобулы, а также увеличением способности связывать ионы Са и Мп при рН 5,7, и напротив закрытием гидрофобного ядра и потерей способности связывать ионы металлов при рН 7,2. Предполагается, что конформация изолированного белка при рН 7,2 аналогична таковой у PsbO in vivo в темноте (когда рН люмена близок к нейтральному), тогда как при освещении реализуется конформация, характерная для рН 5,7, вследствие фотоиндуцируемого подкисления люмена.

4. Показано, что ионы Мп и Са оказывают разное влияние на копформацию изолированного PsbO, что свидетельствует о том, что эти металлы имеют независимые

24" места связывания на белке. Определена константа связывания ионов

Мп с PsbO при рН 5,7, равная 1,2х104 М"1, и ионов Са2+-2,1хЮб М"1.

5. Впервые показано, что связывание СаЬЗ с препаратами ФС 2 мутанта С. reinhardtii cia3, не содержащего СаЬЗ, приводит к стимуляции кислородвыделяющей активности на 85% и увеличению выхода переменной флуоресценции хлорофилла ФС 2. Показано, что бычья карбоангидраза II, относящаяся к тому же классу карбоангидраз, что и СаЬЗ, не приводит к стимуляции кислородвыделяющей активности ФС 2 из мутанта cia3, из чего следует, что СаЬЗ является специфичной для ФС 2 С. reinhardtii карбоангидразой. Полученные данные подтверждают то, что СаЬЗ является необходимым компонентом

ВОК ФС 2 С. reinhardtii, обеспечивающим оптимальное осуществление функции окисления воды.

6. Показано, что Cah3 имеет дисульфидную связь, которая абсолютно необходима для активности фермента. Инактивация Cah3 в результате восстановления дисульфидной связи полностью обратима. Показано, что восстановление дисульфидной связи PsbO приводит к изменению свободной энергии белка на 9 кДж/моль. Обнаружено, что Cys51, участвующий в образовании дисульфидной связи PsbO, находится в кластере с высокой плотностью межмолекулярных контактов, что, вероятно, является причиной дестабилизации белка в результате разрыва дисульфидной связи. Показано, что формирование дисульфидной связи необходимо, для правильного сворачивания PsbO при экспрессии в Е. coli. Полученные данные свидетельствуют о необходимости дисульфидной связи для структуры PsbO. Выдвинуто предположение о роли редокс-регуляции в функционировании люменальных белков ФС 2, СаЬЗ и PsbO.

3.8. ЗАКЛЮЧЕНИЕ: БЕЛКИ PSBO И САНЗ КАК НЕОБХОДИМЫЕ КОМПОНЕНТЫ ВОДООКИСЛЯЮЩЕГО КОМПЛЕКСА ФС 2.

Водоокисляющий комплекс, а именно его белковая часть, это наиболее эволюционно вариабельный компонент ФС 2. ВОК высших растений и зеленых водорослей представлен белками PsbO, PsbP, PsbQ и отличается от ВОК цианобактерий, зеленых оксифотобактерий и красных водорослей, для которого характерно наличие белков PsbO, PsbU, PsbV. Кроме того, открытия последних лет приводят к необходимости расширения традиционных представлений о белковом составе ВОК. В составе высокоочищенных комплексов ФС 2 Synechocystis 6803 обнаружены белки, гомологичные PsbP и PsbQ эукариот [Thornton et al., 2004]. У красной водоросли Cyanidium caldarium в составе ВОК обнаружен белок, гомологичный PsbQ [Enami et al., 1998]. Также показано, что на люменальной стороне ФС 2 одноклеточной зеленой водоросли С. reinhardtii ассоциирована карбоангидраза Cah3 [Karlsson et al., 1995; Karlsson et al., 1998; Park et al., 1999; Villarejo et al., 2002]. PsbO - это единственный белок ВОК, который присутствует у всех оксигенных фотосинтезирующих организмов, его появление связывают с возникновением способности к фотосинтетическому окислению воды. Функциональная роль белков водоокисляющего комплекса заключается в оптимизации и стабилизации работы каталитического центра, осуществляющего окисление воды, однако специфическая роль каждого из белков в этом процессе до сих пор не установлена.

В данной работе было проведено исследование структурно-функциональных свойств люменальных белков ФС 2, PsbO и СаЬЗ, и предложена гипотеза о специфической роли этих белков в функционировании ВОК.

Для получения больших количеств белков, необходимых для проведения структурно-функциональных исследований, в том числе с применением сайт-направленного мутагенеза, целевые белки были экспрессированы в Е. coli. Разработанные системы экспрессии, выделения и очистки позволили получить достаточные количества белков PsbO и СаЬЗ, причем оба рекомбинантных белка были экспрессированы в функционально активной форме.

С использованием рекомбинантной карбоангидразы СаЬЗ впервые проведены эксперименты по реконструкции препаратов ФС 2 из мутанта С. reinhardtii cia3, лишенного СаЬЗ. Получены данные, свидетельствующие о том, что Cah3 является специфичной для ФС 2 С. reinhardtii карбоангидразой. Связывание СаЬЗ с препаратами ФС 2 из мутанта cia3, лишенного этого белка, стимулирует транспорт электронов на донорной стороне и приводит к полной реактивации кислородвыделяющей функции ФС 2. На основании данных, полученных в нашей работе, а также результатов, полученных ранее [Villarejo et al., 2002], можно сделать заключение, что СаЬЗ является одним из ключевых компонентов ВОК С. reinhardtii, необходимым для его оптимальной активности. Предполагаемый механизм участия СаЬЗ в функционировании ВОК заключается в ускорении отвода протонов, выделяющихся в результате реакции окисления воды, за счет катализируемой этим ферментом реакции дегидратации бикарбоната Н+ + НС03" Н20 + С02.

Хотя наличие СаЬЗ в составе ВОК показано только для одного организма (С. reinhardtii) многочисленные данные свидетельствуют о наличии карбоангидразной активности, ассоциированной с ФС 2 у высших растений [Stemler, 1986; Moskvin et al., 2004; Игнатова и др., 2006; Hillier et al., 2006J. Это дает возможность предполагать, что карбоангидраза может быть ключевым компонентом ВОК всех эукариотических фотосинтезирующих организмов.

В данной работе было показано, что в физиологическом диапазоне рН (5,7 — 7,2) изолированный PsbO претерпевает протон-зависимые конформационные изменения, сопровождающиеся изменением степени доступности гидрофобного ядра белковой глобулы и способности связывать ионы Са2+ и Мп2+. Предполагается, что аналогичные конформационные изменение могут иметь место in vivo и играть функциональную роль. Предложена гипотеза, согласно которой конформация PsbO, связанного с фотосинтетической мембраной, изменяется при освещении вследствие протопирования определенных аминокислотных остатков белка ионами Н+, выделяющимися в результате фотоокисления воды. PsbO в «световой» конформации обладает повышенным сродством к ионам Мп2"1 и Са2+. Предполагается, что эта конформация белка может принимать участие в связывании и «хранении» ионов марганца и кальция, высвобождающихся из каталитического центра при фотоингибировании, эти ионы впоследствии могут быть использованы для восстановления ВОК. Функциональное значение рН(свето)-индуцируемых конформационных переходов PsbO может также заключаться в регуляции высвобождения продукта (протонов) и доставки субстрата (воды) к водоокисляющему комплексу.

Отличительной чертой белков PsbO и СаЬЗ является наличие дисульфидной связи. Исходя из современных знаний о структуре ФС 2, это единственные белки этого комплекса, имеющие дисульфиды. В данной работе показано, что дисульфидная связь СаЬЗ абсолютно необходима для активности фермента. Инактивация фермента в результате восстановления этой связи полностью обратима. Вопрос о необходимости дисульфидной связи для структуры и функции PsbO остается дискуссионным. Данные Танаки и соавт. [Tanaka and Wada, 1988; Tanaka et al., 1989], Иррганга и соавт. [Irrgang et al., 1992], Бурнапа и соавт. [Burnap et al., 1994], а также результаты, полученные в данной работе, свидетельствуют о том, что дисульфидная связь необходима для структуры и функции PsbO. Беттс с соавт. [Betts et al., 1996] и Виман [Wyman and Yocum, 2005] напротив показывают, что восстановление дисульфидной связи не влияет на функцию белка. Такое противоречие может быть объяснено, если предположить что дисульфидная связь PsbO не существует на протяжении всего цикла функционирования белка, а может разрушаться и формироваться заново, как способ модуляции функции белка. На сегодняшний день известен только один люменальный белок, который предположительно является редокс-регулируемым - это иммунофилин FKBP13 [Gopalan et al., 2004]. Предполагается, что редокс-регуляция в люмене заключается в активации белков-мишеней на свету за счет окисления цистеинов, и в этом состоит принципиальное отличие от редокс-регуляции стромальных ферментов [Buchanan and Luan, 2005]. Белки PsbO и Cah3, имеющие дисульфидные связи, влияющие на активность, также могут считаться потенциальными мишенями для редокс-регуляции. Активация этих белков в результате окисления цистеинов хорошо согласуется с предложенной концепцией о редокс-регуляции в люмене. Необходимо отметить, что за исключением LHCbll (который имеет парные остатки цистеина [Balmer et al., 2006]) PsbO и Cah3 - это единственные белки ФС 2, которые могут быть редокс-регулируемым.

Ill

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Калинина, Юлия Владимировна, Пущино

1. Игнатова Л.К., Руденко Н.Н., Христин М.С., Иванов Б.Н. (2006) Гетерогенная природа карбоангидразной активности тилакоидных мембран. Биохимия, 71, 651-659.

2. Пермяков Е.А. (2003) Температурные зависимости параметров белковой флуоресценции. В кн.: Метод собственной люминесценции белка. М.: Наука, с. 107-113.

3. Пронина Н.А., Клячко-Гурвич Г.Л., Ладыгин В.Г., Семененко В.Е. (1990) Активность карбоангидразы у мутантов Chlamydomonas reinhardtii с различной организацией фотохимических систем хлоропластов. Физиология растений, 37, 899-906.

4. Пронина Н.А., Семененко В.Е. (1984) Локализация мембраносвязанной и растворимой форм карбоангидразы в клетках хлореллы. Физиол. Раст., 31, 241-251.

5. Комарова Ю.М., Доман Н.Г., Шапошников ГЛ. (1982) Две формы карбонагидрзы из хлоропластов бобов. Биохимия, 47, 1027-1034.

6. Шутова Т.В., Христин М.С., Опанасенко В.К., Ананьев Г.М., Климов В.В. (1992) Протон-акцепторные свойства водорастворимого белка 33 кДа фотосистемы 2 шпината. Биол. Мембр., 9, 836-842.

7. Akerlund H.-E., Jansson C., Andersson B. (1982) Reconstitution of photosynthetic water splitting in inside-out thylakoid vesicles and identification of a participating polypeptide. Biochim. Biophys. Acta, 681, 1-10.

8. Anati R., Adir N. (2000) Crystallization of dimers of the manganese-stabilizing protein of Photosystem II. Photosynth. Res., 64, 167-177.

9. Andersson В., Larsson С., Jansson С., Ljungberg U., Akerlund H.-E. (1984) Immunological studies on the organization of proteins in photosynthetic oxygen evolution. Biochim. Biophys. Acta, 766, 21-26.

10. Arnon D.I. (1949) Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenol oxidase in Beta vulgaris.1. Plant Physiol., 24, 1-24.

11. Balmer Y., Vensel W.H., Hurkman W.J., Buchanan B.B. (2006) Thioredoxin target proteins in chloroplast thylakoid membrane. Antioxid. Redox. Sign., 8, 1829-1832.

12. Bernier M., Carpentier R. (1995) The action of mercury on the binding of the extrinsic proteins associated with the water oxidizing complex of Photosystem II. FEBS Lett., 360, 251-254.

13. Berggad Т., Silow M., Thulin E., Linse S. (2000) Ca2+ and H+ dependent conformational changes of calbindin D28k. Biochemistry, 39, 6864-6873.

14. Betts, S.D., Huchigan T.M., Pichersky E., Yocum C.F. (1994) Reconstitution of the spinach oxygen-evolving complex with recombinant Arabidopsis manganese-stabilizing protein. Plant Mol. Biol., 26, 117-130.

15. Betts S.D., Ross J.R., Hall K.U., Pichersky E., Yocum C.F. (1996) Functional reconstitution of photosystem II with recombinant manganese-stabilizing proteins containing mutations that remove the disulfide bridge, Biochim. Biophys. Acta, 1274, 135-142.

16. Boekema E.J., Hankamer В., Bald D., Kruip J., Nield J., Boonstra A.F., Barber J., Roegner M. (1995) Supramolecular structure of the Photosystem II complex from green plants and cyanobacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 175-179.

17. Bondareva N., Beyer P., Krieger-Liszkay A. (2005) Function of the 23 kDa extrinsic protein of photosystem II as a manganese-binding protein and its role in photoactivation. Biochim. Biophys. Acta, 1708, 63-70.

18. Buchanan B.B. (1980) Role of light in the regulation of chloroplast enzymes. Annu. Rev. Plant Physiol., 31,341-374.

19. Buchanan B.B., Luan S. (2005) Redox regulation in the chloroplast thylakoid lumen: a new frontier in photosynthesis research. J. Exp. Bot., 56, 1439-1447.

20. Buchanan B.B., Schurmann P., Wolosiuk R.A., Jasquot J.-P. (2002) The ferredoxin/thioredoxin system: from discovery to molecular structures and beyond. Photosynth. Res., 73, 215-222.

21. Burnap R.L., Shen J.-R., Jursinic P.A., Inoue Y., Sherman L.A. (1992) Oxygen yield and thermoluminescence characteristics of a cyanobacterium lacking the manganese-stabilizing protein of photosystem II. Biochemistry, 31, 7404-7410.

22. Burnap R.L., Sherman L.A. (1991) Deletion mutagenesis in Synechocystis sp. PCC 6803 indicates that the Mn-stabilizing protein of Photosystem II is not essential for oxygen evolution. Biochemistry, 30, 440-446.

23. Burstein E.A., VedenkinaN.S., Ivkova M.N. (1973) Fluorescence and the location of tryptophan residues in protein molecules. Photochem. Photobiol., 18, 263-279.

24. Calderone V., Trabucco M., Vujicic A., Battistutta R., Giacometti G.M., Anreucci F., Barbato R., Zanotti G. (2003) Crystal structure of the PsbQ protein of photosystem II from higher plants. EMBO reports, 4, 900-905.

25. Carter C.J., Thornburg R.W. (2004) Tobacco Nectarin III is a bifunctional enzyme with monodehydroascorbate reductase and carbonic anhydrase activities. Plant Mol. Biol., 54, 415-425.

26. De Paula J.C., Li P.M., Miller A.F., Wu B.W., Brudvig G.W. (1986) Effect of the 17- and 23-kilodalton polypeptides, calcium, and chloride on electron transfer in Photosystem II. Biochemistry, 25, 6487-6494

27. De Las Rivas J., Heredia P. (1999) Structural predictions on the 33 kDa protein associated to the oxygen evolving complex of photosynthetic organisms. Photosynth. Res., 61, 11-21.

28. De Las Rivas J., Barber J. (2004) Analysis of the structure of the psbO protein and its implications. Photosynth. Res., 81, 329-343.

29. Dekker J.P., Boekema E.J. (2005) Supramolecular organization of thylakoid membrane proteins in green plants. Biochim. Biophys. Acta, 1706, 12-39.

30. Eaton-Rye, J.J., Murata, N. (1989) Evidence that the amino-terminus of the 33 kDa extrinsic protein is required for binding to the Photosystem II complex. Biochim. Biophys. Acta, 977,219-226.

31. Enami I., Yoshihara S., Tohri A., Okumura A., Ohta H., Shen J.R. (2000) Cross-reconstitution of various extrinsic proteins and Photosystem II complexes from cyanobacteria, red algae and higher plants. Plant Cell Physiol., 41, 1354-1364.

32. Fernley R.T., Wright R.D., Coghlan J.P. (1987) Complete amino acid sequence of ovine salivary carbonic anhydrase. Biochemistry, 27, 2815-2820.

33. Ferreira K.N., Iverson T.M., Maghlaoui K., Barber J., Iwata S. (2004) Architecture of the photosynthetic oxygen-evolving center, Science, 303, 1831-1838.

34. Fox J.D, Waugh D.S. (2003) Maltose-binding protein as a solubility enhancer. Methods Mol. Biol., 205, 99-117.

35. Fujikawa-Adachi K., Nishimori I., Taguchi Т., Onishi S. (1999) Human carbonic anhydrase XIV (CA14): cDNA cloning, mRNA expression, and mapping to chromosome 1.Genomics, 61, 74-81.

36. Gaidamashvili M., Ohizumi Y., Iijima S., Takayama Т., Ogawa Т., Muramoto K. (2004) Characterization of the yam tuber storage proteins from Dioscorea batatas exhibiting unique lectin activities. J. Biol. Chem., 279, 26028-26035.

37. Ghanotakis D.F., Babcock G.T., Yocum C.F. (1984a) Calcium reconstitutes high rates of oxygen evolution in polypeptide depleted Photosystem II preparations. FEBS Lett., 167, 127-130.

38. Ghanotakis D.F., Yocum C.F. (1985) Polypeptides of Photosystem II and their role in oxygen evolution. Photosynth. Res., 7, 97-114.

39. Goldenberg D.P. (1989) Analysis of protein conformation by gel electrophoresis, in: Т.Е. Creighton (Ed.), Protein Structure, a Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, pp. 225-250.

40. Golovanov A.P., Vergoten G., Arseniev A.S. (2000) Stabilization of proteins by enchancement of inter-residue hydrophobic contacts: lessons of T4 lysozyme and barnase. J. Biomol. Struct. Dyn., 18,477-491.

41. Gribenko A.V., Makhatadze G.I. (1998) Oligomerization and divalent ion binding properties of the S100P protein: a Ca2+/Mg2+-switch model. J. Mol. Biol., 283, 679-694.

42. Grove G.N., Brudvig G.W. (1998) Calcium binding studies of photosystem II using a calcium-selective electrode. Biochemistry, 37, 1532-1539.

43. Guex N., Pietsch M.C. (1997) SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling. Electrophoresis, 18, 2714-2723.

44. Hasler L., Ghanotakis D., Fedtke В., Spyridaki A., Miller M., Muller S.A., Engle A., Tsotis G. (1997) Structural analysis of Photosystem II: Comparative studies of cyanobacterial and higher plant Photosystem II complexes. J. Struct. Biol., 119, 273-283.

45. Hatner S.H., Provasoli L., Schatz A., Haskins C.P. (1950) Some approaches to the study of the role of metals in the metabolism of microorganisms. Proc. Am. Philos. Soc., 94, 152-170.

46. Heredia P., De Las Rivas J. (2003) Calcium-dependent conformational change and thermal stability of the isolated PsbO protein detected by FTIR spectroscopy, Biochemistry, 42, 11831-11838.

47. Hilvo M., Tolvanen M., Clark A., Bairong Shen В., Shah G.N., Waheed A., Halmi P., Hanninen M, Hamalainen J.M., Vininen M., Sly W.S., Parkkila S. (2005) Characterization o'f CA XV, a new GPI-anchored form of carbonic anhydrase. Biochem. J., 392, 83-92.

48. Hiller W., Wydrzynski T. (2000) The affinities for the two substrate water binding sites in the O2 evolving complex of photosystem II vary independently during S-state turnover. Biochemistry, 39, 4399-4405.

49. Hillier W., Hendry R.L., Burnap Т., Wydrzynski T. (2001) Substrate water exchange in photosystem II depends on the peripheral proteins. J Biol Chem., 276, 46917-46924.

50. Joliot P., Joliot A., Boughes B. and Barbieri G. (1971) Studies of system II photocenters by comparative measurements of luminescence, fluorescence and oxygen emission. Photochem. Photobiol., 14, 287-305.

51. Kamiya N., Shen J.-R. (2003) Crystal structure of oxygen-evolving photosystem II from Thermosynechococcus vulcanus at 3.7 A resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 98103.

52. Karlsson J., Hiltonen Т., Husic H.D., Ramazanov Z., Samuelsson G. (1995) Intracellular carbonic anhydrase of Chlamydomonas reinhardtii. Plant. Physiol., 109, 533-539.

53. Kashino Y., Inoue-Kashino N., Roose J.L., Pakrasi H.B. (2006) Absence of the PsbQ protein results in destabilization of the PsbV protein and decreased oxygen evolution activity in cyanobacterial photosystem II. J. Biol. Chem., 281, 20834-20841.

54. Kimpel D.L., Togasaki R.K., Miyachi S. (1983) Carbonic anhydrase in Chlamydomonas reinhardtii. I. Localization. Plant Cell Physiol., 24, 255-259.

55. Klimov V.V., Baranov S.V. (2001) Bicarbonate requirement for the water-oxidizing complex of photosystem II. Biocim. Biophys. Acta, 1503, 187-196.

56. Klimov V.V., Klevanik A.V., Shuvalov V.A., Krasnovsky A.A. (1977) Reduction of pheophytin in the primary light reaction of photosystem II. FEBS Lett., 82, 183-186.

57. Komenda J., Barber J. (1995) Comparison of psbO and psbFI deletion mutants of Synechocystis PCC 6803 indicates that degradation of D1 protein is regulated by the QB site and dependent on protein synthesis, Biochemistry, 34, 9625-9631.

58. Kramer D.M., Sacksteder C.A., Cruz J.A. (1999) How acidic is the lumen? Photosynth. Res., 60, 151-163.

59. Matsuzaki M., et al. (2004) Genome sequence of the ultrasmall unicellular red alga Cyanidioschyzon merolae 10D. Nature, 428, 653-657.

60. Mayfield S.P., Bennoun P., Rochaix J.-D. (1987) Expression of the nuclear encoded OEE1 protein is required for oxygen evolution and stability if photosystem II particles in Chlamydomonas reinhardtii. EMBO J., 6, 313-318.

61. Mavankal G., McCain D.C., Bricker T.M. (1986) Effects of chloride on paramagnetic coupling of manganese in calcium chloride-washed photosystem II preparations. FEBS Lett., 202, 235-239.

62. Miyao M., Murata N. (1984a) Calcium ions can be substituted for the 24 kDa polypeptide in photosynthetic oxygen evolution. FEBS Lett. 118-120.

63. Miyao M., Murata N. (1984b) Role of the 33 kDa polypeptide in preserving Mn in photosynthetic oxygen evolution. FEBS Lett., 170, 350-354.

64. Miyao M., Murata N. (1989) The model of binding of three extrinsic of 33 kDa, 23 kDa and 18 kDa in the photosystem II complex of spinach. Biochim. Biophys. Acta, 977, 315-321.

65. Miyao M., Murata M., Lavorel J., Maison-Petri В., Boussac A., Etienne A.-L. (1987) Effects of the 33 kDa protein on the S-state transition in photosynthetic oxygen evolution. Biochim. Biophys. Acta, 890, 151-159.

66. Moroney J.V., Togasaki R.K., Husic H.D., Tolbert N.E. (1987) Evidence that an internal carbonic anhydrase is present in 5% C02-grown and air grown Chlamydomonas. Plant. Physiol., 84, 757-761.

67. Murray J.W., Barber J. (2006) Identification of a calcium-binding site in the PsbO protein of photosystem II. Biochemistry, 45, 4128-4130.

68. Myers J.K., Pace C.N., Scholtz J.M. (1995) Denaturant m value and heat capacity changes: relation to changes in accessible surface areas of protein unfolding. Prorein Sci., 4, 21382148.

69. Nield J., Balsera M., De Las Rivas J., Barber J. (2002) Three-dimensional electron cryo-microscopy study of the extrinsic domains of the oxygen-evolving complex of spinach. Assignment of the PsbO protein. J. Biol. Chem., 275, 27940-27946.

70. Ohta H., Suzuki Т., Ueno M., Okumura A., Yoshihara S., Shen J.-R., Enami I. (2003) Extrinsic proteins of photosystem II. An intermediate member of PsbQ protein family in red algal PS II. Eur. J. Biochem., 270, 4156-4163.

71. Opavsky R, Pastorekova S, Zelni'k V, Gibadulinova A, Stanbridge EJ, Zavada J, Kettmann R, Pastorek J. (1996) Human MN/CA9 gene, a novel member of the carbonic anhydrase family structure and exon to protein domain relationships. Genomics, 33, 480-487.

72. Pace C.N., Vajdos F., Fee L., Grimsley G., Gray T. (1995) How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci., 11, 2411-2423.

73. Park Y.I., Karlsson J., Rojdestvenski I., Pronina N., Klimov V., Oquist G., Samuelsson G. (1999) Role of a novel Photosystem II-associated carbonic anhydrase in photosynthetic carbon assimilation in Chlamydomonas reinhardtii. FEBS Lett., 444, 102-105.

74. Philbrick J.B., Diner B.A., Zilinskas B.A. (1991) Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing protein of Photosystem II. J Biol. Chem., 266, 13370-13376.

75. Popelkova H., Im M.M., D'Auria J., Betts S.D., Lydakis-Simantiris N., Yocum C.F. (2002) N-terminus of the Photosystem II manganese-stabilizing protein: Effects of sequence elongation and truncation. Biochemistry, 41, 2702-2711.

76. Pronina N.A., Semenenko V.E. (1990) Membrane-bound carbonic anhydrase takes place in CO2-concentration in algal cells. In Current Research in Photosynthesis, Vol. 4 (ed. M. Baltscheffsky) pp. 489-492. Kluwer, Dordrecht.

77. Rader A.J., Anderson G., Isin В., Khorana H.G., Bahar I., Klein-Seetharaman J. (2004) Identification of core amino acids stabilizing rhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1001,7246-7251.

78. Raven J.A. (1997) CC>2-concentrating mechanisms: a direct role for thylakoid lumen acidification? Plant Cell Envirom., 20, 147-154.

79. Roose J.L., Kashino Y., Pakrasi H.B. (2007) The PsbQ protein defines cyanobacterial Photosystem II complex with highest activity and stability. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 104, 2548-2553.

80. Rosenberg A.M., Lade B.N., Chui D.-S., Lin S.-W., Dunn J.J., Studier F.W. (1987) Vector for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene, 56, 125-135.

81. Rutherford A.W., Faller P. (2001) The heart of photosynthesis in glorious 3D.Trends Biochem. Sci., 26, 341-344.

82. Sacher M., Di Bacco A., Lunin V.V., Ye Z., Wagner J., Gill G., Cygler M. (2005) The crystal structure of CREG, a secreted glycoprotein involved in cellular growth and differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 102, 18326-18331.

83. Santoro M.M., Bolen D.W. (1988) Unfolding free energy changes determined by the linear extrapolation method. 1. Unfolding of phenylmelhanesulfonyl alpha-chymotrrypsin using different denaturants. Biochemistry, 27, 8063-8068.

84. Schlarb-Ridley B.G., Nimmo R.H., Purton S., Howe C.J., Bendall D.S. (2006) Cytochrome c6A is a funnel for thiol oxidation in the thylakoid lumen, FEBS Lett., 580, 2166-2169.

85. Schwede Т., Kopp J., Guex N., Pietsch M.C. (2003) SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server. Nucleic Acids Research, 31, 3381-3385.

86. Schurmann P., Jacquot J.-P. (2000) Plant thioredoxin systems revisited. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 51, 371-400.

87. Seidler A., Michel H. (1990) Expression in Escherichia coli of the psbO gene encoding the 33 kd protein of the oxygen-evolving complex from spinach, EMBO J., 9, 1743-1748.

88. Seidler A., Rutherford A.W. (1996) The Role of the Extrinsic 33 kDa Protein in Ca2+ Binding in Photosystem II. Biochemistry, 35, 12104 -12110.

89. Semisotnov G., Rodionova N., Razgulyaev O., Uversky V., Gripas A., Gilmanshin R. (1991) Study of the molten globule intermediate state in protein folding by a hydrophobic fluorescent-probe. Biopolymers, 31, 119-128.

90. Shen J.-R., Ikeuchi M., Inoue Y. (1992) Stoichiometric association of extrinsic cytochrome c550 and the 12 kDa protein with a highly purified oxygen-evolving PS II core complex from Synechococcus vulcanus. FEBS Lett., 301, 145-149

91. Shen J.-R., Inoue Y. (1993a) Cellular localization of cytochrome C550: Its specific association with cyanobacterial Photosystem II. J Biol. Chem., 268, 20408-20413.

92. Shen J.-R., Inoue Y. (1993b) Binding and functional properties of two new extrinsic components, cytochrome C550 and a 12 kDa protein in cyanobacterial Photosystem II. Biochemistry, 32, 1825-1832.

93. Shen J.-R., Vermaas W.F., Inoue Y. (1995) The role of cytochrome C550 as studied through reverse genetics and mutant characterization in Synechocystis sp. PCC 6803. J. Biol. Chem., 270, 6901-6907.

94. Shen J.-R., Ikeuchi M., Inoue Y. (1997) Analysis of the psbU gene encoding the 12-kDa extrinsic protein of photosystem II and studies on its role by deletion mutagenesis in Synechocystis sp. PCC 6803. J. Biol. Chem., 17821-17826.

95. Shen J.-R., Qian M., Inoue Y., Burnap R.L. (1998) Functional characterization of Synechocystis sp. PCC 6803 ApsbU and ApsbV mutants reveals important roles of cytochrome c550 in cyanobacterial oxygen evolution. Biochemistry, 37, 1551-1558.

96. Shutova, Т., Deikus, G., Irrgang, K., Klimov, V., Renger, G. (2001) Origin and properties of fluorescence emission from the extrinsic 33 kDa manganese stabilizing protein of higher plant water oxidizing complex, Biochim. Biophys. Acta, 1504, 371-378.

97. Shutova, Т., Irrgang K.-D., Klimov, V.V., and Renger, G. (2000) Is the manganese-stabilizing 33 kDa protein of photosystem II attaining a 'natively unfolded' of 'molten globule' structure in solution? FEBS Lett., 467, 137-140.

98. Shutova Т., Irrgang K.-D., Shubin V., Klimov V.V., Renger G. (1997) Analysis of pll-induced structural changes of the isolated extrinsic 33 kilodalton protein of photosystem II, Biochemistry, 36, 6350 -6358.

99. Shutova Т., Klimov V.V., Andersson В., Samuelsson G. (2007) A cluster of carboxylic groups in PsbO protein is involved in proton transfer from the water oxidizing complex of Photosystem II. Biochim. Biophys. Acta, 1767, 434-440.

100. Shutova Т., Nikitina J., Deikus G., Andersson В., Klimov V., Samuelsson G. (2005) Structural Dynamics of the manganese-Stabilizing protein effect of pH, calcium, and manganese, Biochemistry, 44, 15182 -15192.

101. Shuvalov V.A. (1994) Composition and function of cytochrome b559 in reaction centers ofphotosystem II of green plants. J. Bioenerg. Biomembr., 26, 619-626. Siggel U. (1975) in Proceedings of the Third International Congress on Photosynthesis (Avron,

102. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 46, 83-91. Tachiki A., Fukuzawa H., Miyachi S. (1992) Characterization of carbonic anhydrase isozyme CA2, which is the CAH2 gene product, in Chlamydomonas reinhardtii. Biosci. Biotechnol. Biochem. 56, 794-798.

103. Thornton L.E., Ohkawa H., Roose J.L., Kashino Y., Keren N., Pakrasi H.B. (2004) Homologs of plant PsbP and PsbQ proteins are necessary for regulation of photosystem II activity in the cyanobacterium Synechocystis 6803. Plant Cell, 16, 2164-2175.

104. Tiwari A., Kumar P., Singh S., Anasari S.A. (2005) Carbonic anhydrase in relation to higher plants. Photosynthetica, 43, 1-11.

105. Villarejo A., Shutova Т., Moskvin O., Forssen M., Klimov Y.Y., Samuelsson G. (2002) A Photosystem II-associated carbonic anhydrase regulates the efficiency if photosynthelic oxygen evolution. EMBO J., 21, 1930-1938.

106. Virgin I., Styring S., Andersson B. (1988) Photosystem II disorganization and manganese release after photoinhibition of isolated spinach thylakoid membranes. FEBS Lett., 233, 408-412.

107. Yamamoto Y., Shinkai H., Isogai Y., Matsura K., Nishimura M. (1984) Isolation of Mn-carrying 33-kDa protein from an oxygen-evolving photosystem-II preparation by phase partitioning with butanol. FEBS Lett., 175, 429-433.

108. Yu H., Yu X., Britt R.D. (2006) The 33 kDa protein can be removed without affecting the association of the 23 and 17 kDa proteins with the lumenal side of PSII of spinach. Biochemistry, 41, 3404-3011.

109. Xu Q.A., Bricker T.M. (1992) Structural organization of proteins on the oxidizing side of photosystem II: two molecules of the 33 kDa manganese-stabilizing protein per reaction center. J. Biol. Chem., 267, 25816-25821.

110. Wales R., Newman B.J., Pappin D., Gray J.C. (1989) The extrinsic 33 kDa polypeptide of the oxygen-evolving complex of photosystem II is a putative calcium-binding protein and is encoded by a multi-gene family in pea. Plant Mol. Biol., 12, 439-451.

111. Whittington D.A., Waheed A., Ulmasov В., Shah G.N., Grubb J.H., Sly W.S., Christianson D.W. (2001) Crystal structure of the dimeric extracellular domain of human carbonic anhydrase

112. XII, a bitopic membrane protein overexpressed in certain tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 98, 9545-9550.

113. Wilbur K., Anderson N. (1948) Electrometric and colorimetric determination of carbonic anhydrase. J. Biol. Chem. 176, 147-154

114. Wyman A.J., Yocum C.F. (2005) Structure and activity of the photosystem II manganese-stabilizing protein: role of the conserved disulfide bond, Photosynth. Res., 17, 255-266.

115. Zhang L.X., Liang H.G., Wang J., Li W.R., Yu T.Z. (1996) Fluorescence and Fourier-transform infrared spectroscopic studies on the role of disulfide bond in the calcium binding in the 33 kDa protein of Photosystem II. Photosynth. Res., 48, 379-384.

116. Zhang H., Ishikawa Y., Yamamoto Y., Carpentier R. (1998) Secondary structure and thermal stability of the extrinsic 23 kDa protein of Photosystem II studied by Fourier transform infrared spectroscopy. FEBS Lett., 426, 347-351.

117. Zubrzycki I.Z., Frankel L.K, Russo P.S., Bricker T.M. (1998) Hydrodynamic studies on the manganese-stabilizing protein of Photosystem II. Biochemistry, 37, 13533-13558.

Информация о работе

Калинина, Юлия Владимировна
кандидата биологических наук
Пущино, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Исследование структурно-функциональных свойств люменальных белков PSBO и САН3 фотосистемы 2 растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы