Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ассимиляция неорганического азота клетками хлореллы при фотосинтезе

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Ассимиляция неорганического азота клетками хлореллы при фотосинтезе"

РГО од

: р. • " •' МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УБИВЕРСИТЕТ : им.М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

Павлова Елена Алексеевна

УДК 581.132:13^

АССИМИЛЯЦИЯ НЕОРГАНИЧЕСКОГО АЗОТА КЛЕТКАМИ ХЛОРЕЛЛЫ ПРИ ФОТОСИНТЕЗЕ

(03.00.12 - физиология растений)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена в Институте почвоведения и фотосинтеза Российской Академии Наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор, А.К.Романова;

кандидат биологических наук, ст.н.с. Э.Д.Демидов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, 3.Г.Евстигнеева; кандидат биологических наук, Е.В.Харитонашвили

Ведущее учреждение: Институт физиологии растений

им. К.А.Тимирязева Российской Академии Наук

Запета диссертации состоится 1993 г.

в час, на заседании специализированного совета К.053.05.14. в Московском государственном университете по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

\

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан СШ^^л^А, 1993 Г-

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук. Полесская О.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ. Эффект усиления светом процесса ассимиляции неорганического азота, известный для фотосинтезируювдх организмов, несмотря на давность открытая, до сих пор является предметом многочисленных научных исследований в поисках установления его механизмов. Несомненным является факт сопряжения процессов фотосинтеза и нитратредукции. Из разнообразия мест взаимодействия этих процессов наиболее существенной и интересной является возможность непосредственного использования энергии фотовосстановителя. Как известно, фотосянтезируадие зеленые клетки генерируют восстановительную силу при фоторазложении вода и могут использовать ее нэ только на восстановление COg, но и на другие процессы, и в том числе на восстановление нитрата. Помимо энергетического, необходимо также учитывать и субстратный- аспект этого взаимодействия, поскольку продукты фотосинтеза и (или) их запасные углеродсодержащие соединения являются исходными субстратами, из которых в последующих темновых окислительных процессах образуются непосредственные углеродные акцепторы для ассимиляции неорганического азота в аминогруппы аминокислот. Кроме того, само дыхание способно быть источником необходимых для нитратредукции восстановителей и АТФ, а значит поддерживать ассимиляцию азота независимо от фотосинтеза.

Наряду с успехами в изучении механизмов восстановления неорганических форм азота (Syrett, 1932; Turpin et all,1988; Андреева, 1982; Измайлов,1986; Кретович,]987) имэится противоречивые данные о способах использования фотовосстановитвля на редукцию нитрата. Доказательства, дополняющие друг друга выполнены на разных объектах, носят, главным образом, качественный характер.

Одноклеточные зеленые водоросли представляют собой удобный объект для решения этих задач, а также способствуют пониманию ключевого взаимодействия углеродного и азотного метаболизма при фотосинтезе у высших растений.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью работы было исследование энергетических и субстратных взаимодействий нитратредукции и фотосинтеза у одноклеточной зеленой водоросли Chlorella sp к.

Были поставлены следующие задачи:

1). Получить количественные доказательства светозависимости восстановления нитрата.

2). Оценить долю фзговосстаяовителя, идущую на ассимиляцию

нитрата по сравнения с восстановлением С02.

3). Выяснить потенциальные возможности ассимиляции нитрата и аммония у клеток с разным углеводным статусом.

4). Оценить участий темновых окислительных: процессов в ассимиляции нитрата и аммония у клеток, обогащенных углеводами.

5). В качестве практического приложения показать возможности фотосинтетического получения аммиака из азота воздуха клетками сине-зеленых водорослей Anabaena variabilis.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. На примере одноклеточной зеленой водоросли Chlorella вр К экспериментально получены количественные подтверждения светозависимости восстановления нитрата: в отсутсвие С02 - на основании сгехиометрических отношений между поглощенным нитратом, выделившимся кислородом (Og/HOg) и образованным аммиаком (NOj/NH^); в присутствии С02 - за счет дополнительного выделения 02 соответствующих теоретическому уравнению пряного фотохимического восстановления нитрата. Определена доля восстановительной силы, идущей на редукцию нитрата по сравнению с ассимиляцией С02. Получены новые факты, доказывающие, что восстановление нитрата до аммония в клетках хлореллы может осуществляться без участия всей цеш реакций, связанных с ассимиляцией С02 в цикле Кальвина. Установлено, что скорость' ассимиляции аммиака коррелирует с размерами фондов запасенных углеводов и мало зависит от энергии света.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Основным направлением работы является развитие теоретических представлений о сопряженности процессов фотосинтеза и ниграгредукции. Получены экспериментальные подтверждения этой связи. В то же время найденные закономерности имеют чисто практическое значение. Так, на основании скоростей ассимиляции нитрата можно оценить углеводный статус водорослей (запас безазотистых соединений), а значит судить о конкретных экологических условиях, предшествовавших отбору пробы. С другой стороны, зная условия окружающей среда, можно предсказать направленность метаболизма и разработать режимы, облегчающие превращения неорганического азота, например, для экскретирования во внешнюю среду аммиака или нитрита. Использование в качестве объекта азотфиксирующей культуры циаяобактерий дало возможность непосредственного получения из азота воздуха аммиака, ценного соединения, находящего применение как в сельском хозяйстве, так и в технологии.

АПРОБАЦИЯ РАбОТЫ. Результаты исследований по теме диссертации

были доложены на семинарах лаборатории углеродного и азотного метаболизма ИПФС РАН; на 5ой конференции по биоорганической химии социалистических стран (Пущино,1988); на заседании ВОФР (Пущино,1989); на Всесоюзной конференции "Экологические проблемы накопления нитратов в окружающей среде" (Пущино,1989); на Советско-Индийском симпозиуме (Пущшо,1990): на Российско-Американском симпозиуме по фотосинтезу (Пущино,1992). ПУБЛИКАЦИИ По материалам диссертации опубликовано 9 работ. СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ - Диссертация состоит из введения, 4-х глав обзора литературы, 5-ти глав экспериментальной части, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, который содержит 212 источников. Работа изложена на 133 стр. машинописного текста и содержит 24 рисунка и 5 таблиц.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основным объектом исследования являлась зеленая водоросль Chlorella sp К, полученная из коллекции Института физиологии растений РАН.

Культивирование осуществляли стерильно на среде Тамия с нитратным азотом при температуре 36° и непрерывном двустороннем

освещении люминесцентными лампами белого света (75 р

Вт/иг).Суспензию аэрировали воздухом, содержащим 1,8* со2. Культуру выращивали в накопительном режиме В опытах использовали клетки, находящиеся в начале экспоненциальной фазы роста. Часть этой культуры использовали в опытах в качестве контрольного варианта. Другую часть продолжали культивировать на свету в течение 24 часов при полном отсутствии источников азота. Третью часть исходной культуры выдерживали в течение 24 часов на полной питательной среде в темноте с продуванием воздухом, обогащенным 1,856 со2. Клетки первого вариага рассматривали как нормальные, второго - как азот-дефицитные и третьего - как углерод-дефицитные.

Газообмен по кислороду в присутствии ССц, измеряли амеромет-рическим методом в термостатированной ячейке с помощью кислородного датчика Кларка (Гришина, Белл, Букина, ¡96S).

Измерение скорости газообмена по в отсутствие СОо проводили манометрическим методом в аппарате Варбурга (Семихатова, Чулановская, 1965).

Относительные скорости поглощения измеряли в присутс-

твии меченого бикарбоната.

Содержание ионов ыо^, NH^, NOg определяли спектрофотомет-рически в надосадочной жидкости после осаздения клеток центрифугированием: нитрат по поглощению при 210 нм (Cawse.1967), аммоний - фенолгипохлоритным методом при 640 нм (Solorsano, 1969). нитрит - НЭДА-сульфаниламидным методом при 540 НМ (Guerrero ,1982).

Активность нитрат- и нитритредуктаз in vitro определяли в супернатанте, полученном после осаждения разрушенных клеток , при I4000g. Активность нитратредуктазы оценивали по измерению количества нитрита, образованного из нитрата, а активность нитритредуктазы - по исчезновению нитрита из реакционной смеси (Guerrero, 1982).

Суммарное содержание углеводов определяли фенолсернокислым методом (Dubois et all,1956) при 490 нм.

Определение сухого веса биомассы клеток проводили с использованием мембранных фильтров Сышгар-З.

Концентрацию хлорофилла определяли спектрофотометрически по методу Арнона (Arnon, 1949)-

Объект и методы при фотосинтетическом получении аммиака

Оъектом служил бактериологически чистый штамм цианобактерии Anabaena variabilis АТСС 79413, полученный из коллекции ЛГУ. Культуру выращивали в накопительном режиме стерильно на безазотистой среде Арнона (Arnon et al., 1974) в тех же условиях, что и клетки хлореллы.

Иммобилизацию осуществляли двумя способами: в Са-альгинат-ном геле и в пенополиуретане.

Определение скорости выделения аммиака в непроточном режиме проводили двумя способами'. I )в тех же сосудах и в тех же условуIX, при которых проводили выращивание культуры; 2) в модифицированных сосудах Варбурга на качалке, при постоянном освещении и продувании воздухом. Для определения скорости выделения аммиака в проточной системе использовали стеклянный реактор.

Для определения содержания хлорофилла клетки, иммобилизованные в пенополиуретане, предварительно механически выжимали из носителя. Концентрацию хлорофилла определяли спектрофотометрически при 653 нм по методу Арнона (Arnon et al.,1974) после разрушения клеток ультразвуком (0,2А, 60 секунд) и обработки 80% ацетоном.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Методические подхода.

Возможность использования восстановителя, образующегося в фотосинтетической электрон-транспортной цэпи при редукции нитрата или иными словами, прямое фотохимическое восстановление нитра та, сопряженное с выделением 02 в интактных клетках водорослей можно показать с использованием двух экспериментальных подходов. Первый заключается в определении в отсутствие С02 стехиометрии, с одной стороны, выделения 02 и поглощения но^ (Og/HO^) и с другой поглощения N0^ и выброса iffi^ (NO^/NH^).

В отсутствие С02 реакция непосредственного фотохимического

восстановления нитрата на свету в результате фоторазлокения

воды выглядит следующим образом:

„ свет ж HNO" + 4 HgO -> Ifflg + 20g 4- 3 HgO (1)

Из этого уравнения следует, что на одну молекулу

восстановленного нитрата при фотосинтезе должно выделиться две

молекулы 02 и одна молекула НН3, т.е. отношение Og/NO^ равно 2,

а ко^/мн^ равно I.

Второй подход заключается в измерении скоростей выделения 02 при насыщающих концентрациях С02. Если в клетках одновременно с ассимиляцией С02 происходит и восстановление нитрата за счет фоторазложения воды, го очевидно, что в присутствии нитрата должно наблюдаться дополнительное выделение 02-

СБЕТ03АВИСИМ0Е ВОССТАНОВЛЕНИЕ НИТРАТА.

I. Восстановление нитрата в отсутствие С02.

При исключении С02 клетки хлореллы были способны использовать нитрат в качестве конечного акцептора электронов. На свету при добавлении нитрата наблюдалось заметное усиление выделения 02 по сравнению с его отсутствием (рис.1). Стационарная скорость выделения 02 достигалась после I часа эксперимента и была равна 24,?мкмолей/мг Хл.ч. В темноте клетки помогали 02 с низкими скоростями независимо от присутствия в среде нитрата.

Одновременно с изучением газообмена измеряли поглощение нитрата и выделение аммиака (рис.2). Ассимиляция нитрата на свету также значительно ускорялась. Так, на свету скорость поглощения нитрата была равна .12,6 мкмолям/мг ЗОьч., тогда как в темноте лишь 1,5 мкмолям/мг Хл.ч. Поглощенный нитрат в отсутствие С02 восстанавливался до конечного продукта - NfiJ, о чем свидетельствует динамика его накопления в среде по мере ис-

1,5

о Т Г) о, х>и о

а о,5

я

д

о

-0,2!

60 120 Рис.1

V

-г.

я 0,{

0,6

& 0,4 и

3 й

Время, мин

60 120 Рис.2

Рис.1. Газообмен клеток хлореллы в присутствии и в отсутствие нитрата на свету и в темноте в атмосфере без СО

I - свет, добавлен нитрат, 2 - свет, без нитрата, 3 - темнота, добавлен нитрат, 4 - темнота, без нитрата. Содержание хлоро-, филла-25 мкт/ьш, ЮЮ^-0,84 Ш, интенсивность света - 28 Вт/кг,

температура 30°. Вше нулевого уровня - выделение 02< шже -

поглощение.

Рис.2. Поглощение нитрата и выделение аммиака в отсутствие С02

на свету и в темнота. I - содержание нитрата в темноте, 2 - выделение аммиака на свету, 3 - поглощение нитрата на свету, 4 - выделение аммиака в темноте. Остальные условия - см.рис.1.

Рис.3. Отношение между

поглощением нитрата и выделением аммиака в отсутствие С02.

черпания нитрата. После индукционного периода 60 минут) количество выделившегося в среду аммиака практически соответствовало количеству поглощенного. нитрата в соотношении 1:1 (рис.3). Можно заключить, что у хлореллы в отсутствие С02 поглощенный нитрат не запасается, а восстанавливается до аммиака Это давало основания полагать, что и в последующих опытах по поглощению нитрата измерение динамики содержания N0^ соответствовало скорости его ассимиляции.

Отношение стационарной скорости выделения 02 к скорости поглощения нитрата было равно 1,96 т.е близко к теоретическому, равному 2. Нитрат-зависимое выделение 02 находилось и в стехиометрическом отношении с выделением аммония (2:1).

Ингибитор фотосинтеза - даурон (дихлорфенилдиметилмочевина) подавлял как поглощение нитрата, так и выделение аммиака. Это можно рассматривать как свидетельство того, что в редукции нитрата участвует восстановитель, образующийся при нециклическом переносе электронов.

Таким образом, в отсутствие С02 свет стимулировал поглощение нитрата и фотосинтетичэское выделение 02. А стехиометрическке отношения между поглощенным нитратом, выделившимся 02 и образованным аммиаком соответствовали уравнению прямого фотохимического восстановления нитрата в результате фоторазложения воды (уравнение 1).

2. Восстановление нитрата в присутствии С02.

В том случае если восстановление нитрата происходит в присутствии С02 (т.е. в клетке синтезируются акцепторы для связывания аммиака), восстановление нитрата протекает до аминогрупп аминокислот, т.е. помимо 8 электронов, потребленных в реакции I будут израсходованы еще 2 электрона для превращения ИН^ в глутаминовую кислоту:

свет

Н20 + НН3 +• 2-оксоглугарат -> глутамат 4- 1/2 0£ (2)

Значит, теоретически в присутствии С02 при насыщающей интенсивности света на одну молекулу восстановленного нитрата должно выделиться (2 + 0,5) 2,5 молекулы 02.

Основываясь на таких расчетах нам удалось в результате подбора экспериментальных условий получить еще одно количественное подтверждение светозависимости восстановления нитрата при' фотосинтезе. Для этого измеряли скорости фотосинтеза

по выделению 02 в отсутствие и в присутствии нитрата в зависимости от интенсивности света с одновременной регистрацией скорости поглощения нитрата.

Из рис.4, видно, что на плато световой кривой (при насыщающих интенсивностях света) нитрат усиливал скорость выделения 02. Так, если в отсутствие нитрата максимальная скорость выделения 02 была 75 мкмолей/мг 1л.'ч., то в его присутствии - 108 мкмолей/мг Хл.< ч. На плато световой кривой скорость поглощения нитрата составила 12 мкмолей/мг Хл.'Ч. На линейном же участке световой кривой скорости выделения 02 в отсутствие и в присутствии нитрата были одинаковы.

По расчетам, на плато световой кривой прибавка к скорости выделения 02 должна составить : 12 . 2,5 = 30 мкмолей/мг Хл.-ч. Тогда в присутствии нитрата скорость выделения 02 должна быть равна : 75 + 30 = 105 мкмоль/мг Хл. • ч. Экспериментально измеренная скорость составила - 108. Таким образом, в присутствии С02 увеличение скорости выделения 02 практически соответствовало скорости поглощения нитрата, т.е эффект повышенного выделения 02 ("экстра - Og") вызван присутствием альтернативного акцептора электронов - нитрата.

3. Количественное определение доли фотовосстановителя, используемого на ассимиляцию нитрата.

При анализе световых кривых поглощения было установ-

лено, что нитрат подавлял ассимиляцию С02 на 20% только при малых интенсивностях света, тогда как при насыщающих интенсивностях света скорости поглощения 14С02 были Ч?™9?110 одинаковы при добавлении нитрата и в его отсутствие, т.е. конкуренции за восстановитель между ассимиляцией углекислого газа и нитратом на плато световой кривой не существует.

Для вычисления доли фотовосстановителя, идущей на редукцию нитрата при одновременной ассимиляции С02,основывались на сравнении скоростей поглощения этих элементов. На основании результатов П-ти опытов было показано, что отношение скоростей поглощения С02 и нитрата колебалось от 15,2 до 7,2, однако в среднем было близким к 10, т.е. соответствовало имеющимся литературным данным по соотношению элементов (с/10 в клетках микроводорослей (Неа1еу, 1973). Поскольку на восстановление 10 молекул С02 должно

о

а §

о

V

5

(В

ч

(О

И 63 я

л л

н ч

50

50 100 150

Интенсивность света, Вт/м2

Рис.4. Световые кривые фотосинтеза в присутствии (I) и в

отсутствие (2) нитрата. Содержание хлорофилла - 6,5 мкг/мл, МС03 - 7 мМ, М>ъ -0,2 мМ.

п о

о,б:

э

М! Щ

Ш 0.2

А Б В I

3 ^^ 2 X 3 «1 А » Iх) 2 3 ^ <., . 1 _ .1 ..а. , 4-.- .1

60 120 0 60 120 Время, мин.

60

120

йю.5. Динамика содержания нитрата и аммония в суспензии

хлореллы на свету и в темноте в отсутствие СО^. А - клетки, выросшие в стандартных условиях, Б - азот-дефицитные клетки, В - углерод-дефицитные клетки. I - поглощение нитрата в темноте, 2 - поглощение нитрата на свету, 3 -выделение аммиака на свету. Содержание хлорофилла - 25мкг/мл интенсивность света - 50 Вт/м2, температура 36°.

расходоваться 40 е (на восстановление I молекулы С02 требуется 2 молекулы НДЦ®2 или 4 5), а на восстановление I молекулы нитрата - Ю е (или 5 молекул НАДОН^), отсюда следует, что на восстановление Ю^ должна расходоваться 1/5 часть или 20% восстановительной силы.

ВОССТАНОВЛЕНИЕ НИТРАТА КЛЕТКАМИ С РАЗШМ УГЛЕВОДНЫМ СТАТУСОМ

При исследовании закономерностей поглощения нитрата в атмосфере без С02 было показано наличие индукционного периода в течение которого не происходит экскретирования аммония (рис.Я) Можно было предположить, что это связано с эндогенным запасом углеводов, дащим некоторое количество акцепторов для связнвания аммиака.

Для проверки этого предположения были проведены эксперименты с клетками, имеющими необходимые резервы для образования акцепторов, связывающих аммиак. Исходили из того, что расширить этот запас, в конечном итоге, клетки могли только за счет продуктов фотосинтеза, как запасенных ранее, так и вновь образованных.

Влияние запасенного фонда эндогенных акцепторов изучали по динамике восстановления нитрата и ассимиляции аммония на клетках с разным запасом углеводов, который создавали путем варьирования условий выращивания культуры (см.методику). Основные характеристики этих вариантов клеток представлены в табл.I.

Таблица I

Основный показатели роста,содержание хлорофиллу и углеводов в клетках хлореллы в разных условиях

Вариант опыта Число клеток в I мл Хлорофилл в мкг/мл Вес биомассы в мкг/мл Углевода в мкг/мл глюкозы % углеводов от сухого веса

Нормальные

клетки 57-Ю6 18 305±15 73±9 23,9

Азот-дефнцит-

ше клетки 64«Ю6 16 546-5 219^5 40,1

Углерод-дефи-

нитные клетки 77.10® 16 273±13 41±3 15,0

Влияние фонда свежеобразованных продуктов фотосинтеза в экспериментах устраняли путем кратковременного продувания суспензии воздухом, лишенным С02-

На рис.5 показана динамика содержания нитрата и аммония суспензией хлореллы на свету и в темнота в отсутствие С02. Можно видеть, что свет в сильной степени стимулировал поглощение нитрата. Поглощение нитрата на свету "нормальными" клетками начиналось немедленно после его добавления , выделение аммиака, образованного в результате нитратредукции начиналось на I час позже и затем отношение между поглощенным нитратом и выделившимся аммиаком приближалось к I. В темноте поглощение нитрата было значительно меньше, а выделение аммиака не наблюдалось вовсе. Клетки, богатые углеводами в тех же условиях характеризовались высокими скоростями поглощения нитрата как на свету, так и в темноте и отсутствием выделения аммиака. Отсутствие экскреции аммония в среду свидетельствовало о его полном включении в аминокислоты, в отличие от ситуации у клеток, выращенных на среде с нитратом. У клеток с малым запасом углеводов поглощение нитрата и выделение аммиака начиналось одновременно после ,1 часа выдерживания на свету с равными, но низкими скоростями. Клетки этого варианта не выделяли аммоний в темноте. На основании этих наблюдений был сделан вывод, что начало экскреции аммония совпадало с истощением доступного фонда углеводов, в результате окисления которых образовались акцепторы аммония.

Однако предшественники акцепторов аммония могут образовываться не только из запасенных, но и из "молодых" т.е. свежесинтеэированных продуктов фотосинтетической ассимиляции С02- Для доказательства этого положения использовали клетки, которые исчерпали внутренние резервы акцепторов аммиака, о чем можно судить по экскреции аммиака в среду. Из рис.6 видно, что если в культуру клеток хлореллы, выращенных в нормальных условиях, поглощающих нитрат и выделяющих аммоний в отсутствие С02, добавляли углекислоту, начиналась реассимиляция выделенного в окружающую среду аммиака, тогда как поглощение нитрата прекращалось.

Следует заметить, что в подобных опытах (рио'.б), аммоний, находившийся в среде, не влиял на скорость поглощения нитрата: ингибирование восстановления нитрата в присутствии аммония

Рис.6. Действие СО2 на содержание нитрата (I) и аммония (2) в суспензии клеток хлореллы, выращенных при стандартных условиях. Содержание хлорофилла - 21 шг/мл, интенсивность света -50 Вт/м2, температура 36°.

Рис.7. Динамика содеряания аммония в клеточных суспензиях

хлореллы в отсутствие С02 в темноте (I) и на свету(2). А - клетки, выращенные в стандартных условиях, Б - азот-дефицитные клетки, В - утлерод-дефициггше клетки. Остальные условия - см. рис.5.

проявлялось только после активации фэтосинтетичэского метаболизма углекислотой. На основании этого наблюдения мокно заключить, что давно известное ингибирование поглощения нитрата клетками водорослей в присутствии аммиака связано не с прямым действием иона аммония на нитратредукцию, а скорее обусловлено продукта-ами его ассимиляции. Такого же мнения придерживаются и другие авторы (Syrett, Morris,1963; Plores et all,1983).

ассимиляция шюния клетками хлореллы

С РАЗНЫМ УГЛЕВОДНЫМ СТАТУСОМ

Расчетные энергетические затраты на превращение иона NH^ в аммиачный азот значительно меньше, чем для нитратредукции, поэтому можно было ожидать, что поглощение аммония не будет заметным образом зависеть от энергии света. Из результатов, представленных, на рис>7 видно, что скорости ассимиляции аммония в отсутствие С02 на свету мало отличались от темновых у нормальных, азот-дефицитных и углерод-дефицитных клеток. В противоположность этому наблюдались заметные различия в количестве связываемого аммония в зависимости от содержания углеводов в -клетках. Так, нормальные клетки хлореллы были способны поглощать некоторое количество аммония с умеренной скоростью на свету и в темноте, азот-дефицитные клетки поглощали аммоний с наибольшей скоростью как на свету, так и в темноте, углерод- дефицитные клетки практически не поглощали аммоний ни на свету, ни в темноте, что подтверждает безусловную потребность процесса ассимиляции аммония в свободном фонде безазотистых акцепторов, также как и представленные выше данные (рис.6 и 7)

УЧАСТИЕ ФОТОСИНТЕЗА И ДЫХАНИЯ В АССИМИЛЯЦИИ НЕОРГАНИЧЕСКИХ ФОРМ АЗОТА.

Выше было показано, что в отличие от нормальных клеток, у клеток, характеризующихся повышенным содержанием углеводов, скорости темновоЯ ассимиляции нитрата приближались к световой (рис.5)■ Возникает вопрос, за счет каких процессов осуществляется ассимиляция нитрата у азот- дефицитных клеток на свету, каково соотношение процессов фотосинтеза и темнового дыхания в восстановлении нитрата и нитрита и ассимиляции аммония у таких клеток. Для изучения этого вопроса было проведено сравнительное изучение 02 газообмена и динамики потребления источников азота в сочетании с ингибиторным анализом на свету и в темноте.

Было установлено, что у й-дефицитных клеток фотосинтез по 02-выделекию подавлен. Скорость выделения 02 на свету снижалась в процессе голодания и достигала 20$ от исходного значения после 22 часов голодания (таб.2).

Таблица 2

Действие разных форм азота на скорость выделения и поглощения 02 (V, в мкмоль 02/мг Хл-час)клетками хлореллы на свету и в темноте

Источник азота

Нормальные клетки V %

Клетки,голодавшие по азоту

4 часа 22 часа

V % V %

Без доба вок

Нитрат Нитрит Аммоний Без доба вок

Нитрат Нитрит Аммоний

-9,7 -10,8 -12,7 -15,4

На свету

117,8 100 83,2 100 24,0 100

127,3 108,1 90,8 107,9 21,8 90,8

128,4 109,0 88,3 106,1 19,7 82,1

117,1 100 70,2 84,4 -9,5 -

100 III ,3 130,9 158,8

В темноте -10,1 -12,3 -15,3 -26,5

100 123,0 153,0 265,0

-11,2 -16,3 -23,6 -37,1

/

100

145.5

210.6 331,2

Примечание: содержание хлорофилла - ¡6 мкг/мл; концентрация кио^, иаШ2 И ЛН4С1 - 1 тМ, ИаНС03 - 5 тМ. Скорости измеряли в течение первых 5 мин. инкубации. Знак (-) означает поглощение 02. Свет насыщающий, температура 30°.

Действие добавок нитрата и нитрита после длительного голода ния отличалось. Резкое снижение скорости фотосинтетического вы-делеления 02 после 22-х часов голодания приводило к потере способности к восстановлению нитрата за счет фотосинтетической ЭТЦ В то же время добавка окисленных источников азота усиливала темновое поглощение 02- Отсутствие дополнительного выделения "эксгра-02" при фотоассимиляции нитрата и нитрита у длительно

голодавших, клеток можно объяснить усилением темнового дыхания на фоне низкой скорости выделения 02.

Ионы аммония не влияли на выделение 02 на свету у нормальных клеток, однако заметно ингибировали 'его после 4-х часового голодания. У клеток после 22-х часов голодания,на свету, наблюдалось даже поглощение 02, что свидетельствовало об усилении дыхания.

Действительно,из данных, представленных в таб.2 видно, что при добавлении разных форм связанного азота в темноте скорость дыхания клеток, в противоположность фотосинтезу, увеличивалась как у нормальных так и у И-дефицитных клеток, причем, увеличение скорости поглощения 02 в темноте было тем больше, чем более был восстановлен азот в использованных источниках. Усиление дыхания наблюдалось также с увеличением продолжительности голодания по азоту. Увеличение скоростей поглощения 02,(особенно у и-дефицитных клеток) в присутствии всех трех форм азота и наибольшее при ассимиляции аммония, можно рассматривать как свидетельство увеличения активности ЦТК.

В табл.3 приведены скорости поглощения разных форм азота нормальными и И-дефицитными клетками. У нормальных клеток, выращенных на среде с нитратом, скорость потребления добавленного азота в темноте была мала независимо от его формы. Свет сильно стимулировал поглощение всех форм азота. В атмосфере аргона на свету потребление ионов нитрата и нитрита заметно снижалось, а потребление аммония практически не наблюдаюсь.

В отличие от нормальных и-дефицитные клетки хлореллы в темноте на воздухе с 1,858 С02 потребляли все формы азота. В атмосфере аргона, так же как и у нормальных клеток, ни одна из форм азота не поглощалась. Потребление азота у ы-дефицитных клеток на свету было менее чувствительно к диурону, чем у нормальных клеток, причем на свету в присутствии диурона скорости поглощения всех трех форм азота были сравнимы со скоростями, наблюдаемыми-в темноте. В атмосфере аргона на свету снизились скорости восстановления ионов нитрата и нитрита, но особенно резко уменьшилась скорость ассимиляции аммония.

Из приведенных данных можно видеть, что источники восстановителей для окисленных форм неорганического азота у клеток хлореллы, выращенных в оптимальных условиях питания и после азотного дефицита, различны.

Таблица 3

Поглощение нитрата, нитрита и аммония нормальными и голодавшими по азоту клетками хлореллы (в мшолъ/мг Хл-ч)

Условия

Нормальные клетки

нитрат нитрит аммоний

Голодавшие по азоту 22 часа

нитрат нитрит аммоний

В темноте: воздух + I,8% аргон На свету: воздух +1,8% воздух + 1,8% дхмм

аргон

аргон + ДХММ воздух - С02 воздух - С02 н ДХММ

С0о

С02 С02+

0,5 О

1,0

0,8

14,7 24,2

2,6 8,3 1,3 10,5

2,1

2,6 12,0 1,3 20,0

2,5

0,5 0,4

12,6

4.2

1.3 0,4 1,6

2,1

7,1 6,8 0,8 1,3

10,6 12,6

7,3 7,8 3,5

6,8 6,8 3,1

6,0 7,9 5,6 4,2

12,1

1.7

13,7

12,1 3,1 1,3

9.8

10,0

Примечание: содержание хлорофилла - 20 мкг/мл, концентрации КШ^, НаЮ2, мн4С1 - 0,7 шИ, ДОМ - 10~5М. Продолжительность инкубации 2,5 часа. Остальные условия как при выращивании культуры. Содержание азота в культураль-ной жидкости определяли с 30 мин интервалом. Приведены скорости, рассчитанные по углу наклона линейных участков кривых поглощения.

Отличительной чертой К-дефицитных клеток являлась их способность ассимилировать все формы азота с высокими скоростями в темноте. Высокая скорость потребления нитрата в темноте у Н-дефицитных клеток резко снижалась в атмосфере инертного газа, что свидетельствовало о роли окислительных (темновых) процессов в образовании восстановителей для нитратредукции. Можно считать, что доля участия фотосинтетического восстановителя у Я-дефицитных клеток существенно меньше, чем у нормальных.

фОТОСИНТЕТИЧЕСКОЕ ПОЛУЧЕНИЕ АШИАКА ИЗ АЗОТА ВОЗДУХА КЛЕТКАМИ ЦИАНОБАКТЕРИИ ANABAEMA VARIABILIS.

Исследование закономерностей ассимиляции нитрата и условий, способствующих выделению аммиака наводило на мысль о возможности использования фотосинтезирующих клеток для биогехнологического получения аммиака. Для этой цели наш была использована азотфиксирующая цианобакгерия Anabaena variabilis,

Суспензия клеток цианобактерии на свету в атмосфере с 1,8% С02 в отсутствие иных источников азота, кроме азота воздуха, выделяла аммиак в питательную среду в присутствии МСиГ Максимальные скорости наблюдались при добавлении МСИ в концентрациях от 4 • до Ю~4М. Скорость выделения аммиака возрастала с увеличением интенсивности света, Так, при освещенности юо Вг/м2 она достигала величины 33,8 мкмоль/мг Хл-ч по сравнению с 6,3 при 19 Бт/м^. Увеличение продолжительности опыта , особенно при больших освещенностях света оказалось пагубным для клеток цианобактерии. Наибольшие скорости выделения аммиака клетками цианобактерии в наших условиях экспериментов составляли 30-35 мкмоль/мг Хл * ч на протяжении I суток. При пересчете на содержание сухого вещества I г клеток способен выделить во внешнюю среду I г аммиака за 3 суток.

Как известно, иммобилизация дает преимущества по сравнению с использованием свободнохивущих клеток; . прежде всего, возможность более длительного использования системы, удобство манипуляций с закрепленными клетками.

На рис.8 приведены результаты опыта с иммобилизованными клетками в Са-альгинатном геле и в пенополиуретане в накопительном режиме культивирования. Видно, что клетки в этом состоянии состоянии способны выделять аммиак с достаточной эффективностью Через 24 часа накопление аммиака прекращалось, однако после переноса этих иммобилизованных клеток в свежую среду с МСИ, способность к фотопродукции аммиака восстанавливалась с прежней скоростью. Средняя скорость выделения аммиака в пенополиуретане была 35,2 мкмоль/мг Хл-ч, а в Са-альгинатном геле - 14,5 мкмоль/ мг Хл-ч.

Опыты по выделению аммиака в проточном режиме мы проводили с клетками, иммобилизованными в пенополиуретане, поскольку Са-альгинатный гель оказался нестабильным.

Результаты двух опытов, проведенных в разные сроки и при

МСИ - ОЬ-нетионинсульфоксинин, ингибитор глут&минскнтет&зы

1,0

0,6

а

^

а, о РГ о о

0,2

20 { Время,

40 часн

Рис,8. Выделение аммлака иммобилизованными клетками

ЛмхИньиа, уаЫаЯи^, в накоштельвом режиме. I- Са-альгинатннй гель, общее содержание хлорофилла - 165мкг, 2 - пенополиуретан, общее содержание хлорофилла - 68 миг. Концентрация МОИ - 4-Ю-5 М, освещенность - 50 Вт/м2, температура 36°, продувка воздухом. Стрелкой обозначено вреш, когда иммобилизованные клетки отмывались и переносились в свекую среду с ЫСЙ.

>4

и о

1500

1000

от

о,

ф

8

Вреш,

Рис.9. Образование аммиака клетками , иммоби-

лизованными в пенополиуретане, в проточном реяиме. А - накопление аммиака: I - опыт №1, общее содержание хлорофилла 1,8 мг: 2 - опыт №2, общее содержание хлорофилла 0,4Емг. Освещение двустороннее, 70 Вт/м2, температура 24°, концентрация МСИ - г-Ю-5!*!. Б - скорость образования аммиака (V , мкмоль/мг Хл-ч) в опыте №2. Стрелками обозначены моменты выключения и включения света.

разном содержании хлорофилла на единицу носителя, показаны на рис.9 А. Так, в случав общего содержания хлорофилла в реакторе 0,45 мг, средняя скорость образования аммиака за 114 часов составила 14,7 мкмоля/ мг Хл-ч, а при более высоком содержании хлорофилла (1,8 мг) - 7,4.

На рис.9 Б показано изменение скорости образования аммиака иммобилизованными клетками в реакторе для опыта с относительно низким содержанием хлорофилла (0,45 мг). Видно, что после некоторых осцилляций скорость процесса несколько стабилизировалась и достигала максимальных значений. При выключении света образование аммиака прекращалось. Повторное включение света восстанавливало способность клеток к образованию аммония.

Результаты работы могут Сыть использованы при разработке технологии биологического получения аммиака.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспериментально полученное количественное подтверждение прямой светозависимосги восстановления нитрата, позволило определить, что на него расходуется до 20% энергии фотовосстановителя. Это означает, что восстановление нитрата на свету в энергетическом отношении является вторым по важности после ассимиляции С02 фотоэндоэргоническим процессом, осуществляемым автотрофной клеткой.

Однако рассмотрение связей между ассимиляцией неорганических форм азота и фотосинтезом, несмотря на возможность их прямого сопряжения на стадиях восстановления, неминуемо ведет к опосредованию этих взаимоотношений через дыхание. Происхождение как энергетических эквивалентов, так и необходимых углеродных акцепторов, связано с темновыми окислительными процессами. И поэтому их яебходимо учитывать при изучении закономерностей усвоения неорганического азота на свету. Тем более, что подтверждается ранее оспариваемое мнение о функционировании митохондриального дыхания на свету ' et а1,1988;

Иейег, Тигрш,1989).

Об этом же свидетельстуют и показанные выше особенности восстановления неорганических форм азота у азот-дефицитных клеток (с высоким содержанием углеводов), у которых скорости темновой и световой ассимиляции нитрата практически одинаковы. В отличив от нормальных клеток, у которых восстановление нитрата и

нитрита осуществляется, в основном, за счет восстановителя фотосинтетического происхождения, у азот-дефицитных клеток могут использоваться также и восстановительные эквиваленты темнового дыхания.

ВЫВОДЫ

Исследования, проведенные на одноклеточной зеленой водоросли Chlorella sp К позволили:

1. Получить количественные доказательства в пользу прямого использования восстановителя, образованного при фотосинтезе на восстановление нитрата.

2. Показать, что на восстановление нитрата расходуется до 20% энергии, генерируемой при фотосинтезе.

3. На плато световой кривой энергии фотосинтетического восстановителя достаточно не только для ассимиляции COg, но и для фэтоассимиляции нитрата. Конкуренцию за фотовосстановитель можно наблюдать только на линейном участке световой кривой.

4. В отличие от процесса нигратредукции ассимиляция аммония в меньшей степени зависит от энергии света и осуществляется как за счет запаса эндогенных источников, так и за счет вновь образующихся продуктов фотосинтеза.

5. Скорость ассимиляции аммиака коррелирует с размерами фондов запасенных углеводов.

6. В отличие от нормальных клеток, у которых восстановление нитрата и нитрита осуществляется, в основном, за счет восстановителя фотосинтегического происхождения, у азот-дефицитных клеток могут использоваться также и восстановительные эквиваленты темнового. дыхания.

7. Клетки цианобактерии Anabaena variabilis как в свободном, так и в иммобилизованном состоянии способны восстанавливать азот воздуха с выделением аммиака в питательную среду на свету в присутствии ингибитора глутаминсинтетазы -мвтионинсульфоксимина, что может быть использовано при разработке технологии биологического получения аммиака.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Павлова Е.А., Демидов Э.Д. Фотосинтез и поглощение нитра та клетками хлореллы. Тезисы докладов "Связь метаболизма углерода и азота при фотосинтезе", Пущино,1985, с.24.

2. Демидов Э.Д..Павлова Е.А.,Смолов А.П. Светозависимое

восстановление нитрата клетками хлореллы // Физиология растений. 1986.Т.33. В.5. С.913-921.

3- Pavlova Е.А., Demidov E.D. Photosynthetic production of ammonium from air nitrogen by oyanobacterium Anabaena variabilis. Abstr. 5 oonferenoe of young scientists- of

socialist countries on bioorganio chemistry". Pushchino.1988. P.133.

4.Павлова E.А.,Демидов Э.Д. Фотообразование аммиака клетками цианобактерии Anabaena variabilis. // Прикладная биохимия и микробиология. 1989. Г.25. В.2. С.192-196.

5. Демидов Э.Д., Павлова Е.А., Романова А.К. Участие С02 в восстановлении нитрата и ассимиляции аммония клетками хлореллы.// Физиология растений. 1989. Т.36. В.6. C.II64-II70.

6. Павлова Е.А., Демидов Э.Д. Ассимиляция нитрата и аммония нормальными и азот-дефицитными клетками хлореллы.// Тезисы докладов "Экологические проблемы накопления нитратов в окружающей среде" Пущино.1989. СЛ06.

7. Demidov E.D..Pavlova Е.А. A study of NO-.- assimilation

J ti,

by Chlorella oells in the absence of COg. Abstr. 7 Congress of FESPP, Umea, Sweden. // Physiologia plantarum. 1990. V.79. P.2. P.457.

8. Демидов Э.Д., Павлова Е.А., Романова А.К. Участие фотосинтеза и дыхания в ассимиляции минерального азота клетками хлореллы в норме и при азотном голодании. // Физиология растений. 1992; Т.39 . В.4. С.796-804.

9. Demidov Е. and Pavlova Н. Photosynthesis, respiration and N-assimilation in N-sufficient and N-starved cells of Chlorella. Abstr. IX - th International Congress on Photosynthesis. // Photosynthesis Eesearch. 1992. V.34- N 1. P-600.