Структурно-функциональные особенности мультиферментного комплекса цикла Кальвина

Бакаева, Наталья Павловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональные особенности мультиферментного комплекса цикла Кальвина
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные особенности мультиферментного комплекса цикла Кальвина"

РГ6Г o/l

i 2 ДОГ ЬЛ

На правах рукописи УДК 577. 15: 581. 19

БАКАЕВА Наталья Павловна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ МУЛЬТИФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА ЦИКЛА КАЛЬВИНА

03. 00. 04— виохилгия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ДУШАНБЕ — 1996

Работа выполнена в лаборатории Ферментологии при кафедре физиологии растений биологического факультета Таджикского государственного университета

научный консультант

доктор биологических наук, профессор М. А, Бабаджанова

официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н. А. Пронина; доктор биологических наук А. А. Абдуллаев; доктор химических паук В. К. Буриченко.

Ведущая организация: Таджикский аграрный университет.

на заседании диссертационного совета (Д 065. 01. 06) по присуждению ученой степени доктора наук в Таджикском государственном университете (734025, г. Душанбе, пр. Рудаки, 17).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Таджикского государственного университета (Душанбе, Рудаки, 17).

Автореферат разослан « » _ 1996г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Защита состоится «/£

доктор биологических наук

в. а. бободжанов

ощлл хт:сткпг,т;ш работа

Актуальность проблем;. В нагтокщое »ромя водулан роль фотосинтеза в продукционном процесс" не пипнвает соунскяЛ п доказана большим зкепориминтальнкм -ото риалом ( 1!я шпоров!:'!, ХУЬО, 1977, 194-2; Плсироп, 1975, 1УБ2, 1'Ж>; Тарчегскни, 1977; Мок; пмосов, 1901, 19^0 ). Поэтому <['ундл;«нтг,лыша ис-

следовании молокуллрннх ооюп фотосинтеза ллляптея вакным условием пнчплония способов унрлвления Нр')ДуКЦаО!МН\! ГфОЦОССОМ растении. Ь'огколысу рябулг.гюбис^^лт'арбоксчлйзз-очспгонязз ( М'^лО, П> '1.1.1,39 ) лпляотся кл^чоу;::.! $о]лкптсм '{отоспи-тетичас (0,1 ¡иксзщ'и ССо, го продуктивность растлит! в значительной асро :»:«ч5сят от струхтуряо-^унктшонлльнкх к регу.тятор-ннх особен,гостов этого (]ор,*онтч, а также ферментов,отгетотре!:-ш;х 3 1 регенерацию субстрата реакции карбоксилироплшл р'лбо-:ю1о(,'|- тгпзо. :ера:;п (, Р1, 1!.' .. I .Г ) и •.¡•осц'орлбуло^янззи ( 1'ГС, ¡1,' Р.7Д.19 ). ЫмллвН'Ю ;«Х'!НЯ5М0В регуляции скороятй •{отооинтотического ■лстчйо'лкзг-и уг\1ород'1 на уровне реакций регенорзции и кмрбоксиларовзняя акцептора углркислотн ж-от принести к стратегически пакннгл решениям, сшгзаьчшм с генетической \!ояя'1кчацио.! или химической регуляцией ¿огссяптэтп-ческих реакций ( Нпсиров, 1275, 1082, Юьб; Локроносов, 196] , 19ЬЗ, 19ИВ; Бар]оломооп, 19В8 ).

В настояк'.;о время одним из важноПгах механизмов регуляции метаболизма считается образование динамических 'луг-о:.-'.-ферменпшх ансамблеЛ-ассоциатов, соетавлякхпзх кэдуолокуляр-нн?. уровень организации Лермонтов ( »>рялрих, 19ВС>; Кургане:-., 1985, 1989, 1991, 1Ж; ;<чпрельят!, 19№; Каган, 1^.9; Ермаков, 1923 ). 'Лс следование надмолекулярной организация ^ор-.мп-тов различных метаболических путей является основное тенденцией современно!', энлиглология.

Вопрос о возможности образования зссо:и;атов РБКО робко, но все-таки обсуклзлся в литературе- Наибольшего внимания заслуживает предположение о существовании з стромо хлороп-ластов тройного комплекса [ерчентоз, состз-гцего из Г.П, ¿'Р.', я РБаКО, которое высказывалось рядом авторов I Р'.ч»гкэГяку , длоксг . ::,•;.;.-;:•••,;/ я1 •» '-''"Ь; аулунпч , 1970; -

..... , Ь70; , ^'72; Роч-шэьа, 1975, Г.,'91 ).

Дс :ст?лт- лько, »-ле,,э,'ят-зльн;х! цоЛстьяо этих $врг«гчтэз «о*-

но определить по фиксация ^С бикарбоната в присутствии Р5Ф и АТФ ( Каримове и др., 1967 ). тгсжг С 1965 ) обнаружил, что суммарная реакция ферментов сохраняется в процессе очистки РБ¿'КО длительное время. За1п1и с сотрудниками в 1У8С г. из листьев гороха, в 1У8У г. из листьев шпината выделили комплекс ферментов К'11, ч>РК л РБчКО. очгПего с сотрудниками ( 1938 ) выделили из хлороплаотов шпината функциональный муль-тиформентиы.1 комплекс, проявляющий пять ферментативных активностей цикла Кальвина. Мультиферментный комплекс ферментов рлбозофосфатизом?разы, фосфорибулокинизы и рибулозобисфосфат-карбоксилазы-был выделен из листьев хлопчатника и было установлено, что по своей природе этот комплекс является структурно-функциональным ( Бабаджанова, Насиров, 1992 ).

Образование комплексов имеет важный биологический смысл 'между функционально связанными ферментами, у которых при ассоциации достигается увеличение эффективности протекания сопряженных реакций вследствие прямой передачи метаболита с одного активного центра на другой; моментальная утилизация образующихся продуктов в сопряжениях реакциях обеспечивает термодинамические преимущества ферментативных реакций, протекающих в комплексе I Нэградоиа, Муронец, 1985 ). Таким образом, очевидна актуальность и необхоцимость исо ледова ни?, структурно-функциональных особенностей и механизмов регуляции различной сложности диьамичоских ферментных систем с помощью кинетических и биохимических методов.

На основании вышеизложенного била сформулирована цель настоящей работы: изучение структурно-функциональных особенностей мультиферментного комплекса цикла Кальвина. Кроме того, предполагалось исследовать механизмы функционирования и регуляции актлвности этих (¡ермектов в различных олигоме[>-ных состояниях и выявить особенности каталитических свойств свободных и организованных в комплекс ферментов кинетическими методами, а тлкхе определить ионизируюиу.еся группы активного центра ферментов и !>оль сульфгидрильных групп, принимающих участие б каталитическом акте рибоэофосфатизомеразной, фос-форибулокиаазной и рибулозобисфосфаткарбоксил.чзьоД реакций.

Ли достижения поставленной цели необходимо было роаить сладугаде УкгЕирк...еатальнио задачи:

-выделить электро^оротипес:«! гомогенные ^»парати фер.,:<»ц-тов РИ1, ФРК и РБ'КО, поднять суСъадшкцч изучзомчд фогмзнтоц определять величину пх молекулярных '.псс, з тлюха 1::г.;г;лить комплексы этих ферментов ;

-определить у выделенных комплексов ^ерментьу" препаратов наличие каталитически}' активностей ферменто;:* ишелч Лш.-вина ;

-исследовать регуляции аминокислота:.!:! и "этзбоптмд цикла Кзлышиа активности 1М1 и Ж, а таккв айпоцаэттше чоз~ мохноств субъедиющ РчИ при диморизац::!:';

-иеоледоЕать ялишоте рибулогсбчсфосфзтз I Г) - субстрата кярбоксплазноЛ :п рпбозсфосфатизо.мерззиу?. -зк ггг-иость различных ферментных ирог.агптов, а тглеже влияние рлс'г-зо-5-фосфата ( Р54> ) - метабояитг-пред'иоствонашса на актл&-нссть ФРК ;

-исследовать влияние рН на активность ферментов и роль оульфгидрилышх групп, определить кх количество, язу-нг-э су страт1г/ю стабилизацию сульфгадрильных групп актаннчх центроз РФИ и ;

-провести кинетические исследования ак-

тивностей мультиферментных комплексов.

Научная новизна, и практическая знтчимзстгиШ^•

В работе развиваются новые представления о фермой?:"; цикла Кальвина - рибозофосфатизсморазо, фосфор;5Сулс.::;:назп -л рибулозобисфосфаткарбоксалазе.

Впервые выделен из листьев хлопчзтнпна сорта 108-Ф !*уль-тиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кДз, продляющий шесть ферментативных активностей - ряйозойос$атияо-.г-разную, фосфорибулокиназнуи и рибулозобисфосфаткарбсксилазнуя, а также фосфогл/цераткиназкую ( ФГК, Н^ 2,7.2.3 ), гллп-~палъ-дегидфосфатдегидрогеназнуи { ГАфД, !К> 1.2,1.13 ) и фруктопо-бксфосфатазную I ФБ*<г, НФ 3.1.3.11 ). Проявление кости активностей ферментов цикла Кзльвинз позволяет назвать этот комплекс мультифе^мептшчм комллексом-аесоциато г. цикла Халь.чина.

Впервые ::з листьев хлопчатника индеюн днухфврмэнтннл комплекс Р*И- ^ 2х^л ). ЗызелокдкХ ко дамке обладает ;го~ лекулярноЛ масса.; 1ъ0 ¡{.¿а и состоит из трех идентичных субь-одикиг. с :.:олс.:уллр:;о:; лассо;'; £0 л. а. Лош.ъение температуры

инкубации ира денатурации пизьоляет получить модифицированные субг^дшшци с модикулярной ;лассой 52 кДа. Выделенный комплекс проявляет три '¿орментаташше актинности : рибозофосфат-изолоразную, фосфорибулокиназнув и рибулозобис<1ой'±аткарбокси-лаэнуи.

Ьпериио установленс, что 4ирлантиыо препараты с различной молекулярной waccoii - 52, 100, 240, 400, 4Ь0 и 520 кДа проявляют по три аналогичные фармантатинные актиьности : рибо-зофосфатизомеразную, фосфориоулокиназнуи и рчбулозобисфосфзт-карбоксилазну». Ото дает осноианле считать, что ф^ленти цикла Килььии су^(-стьуют и различной i{ор-ло - стабильных мульти-ферлентких комплексов и динамических комплексок-лссоциатов.

Определены значения pH, при которых происходит ионизация аминогрупп у >1ор.,;йитоь К-И, OR' и Pl^.îO. Результаты изучения ьлияния pH на млксилальную скорость и , катализируемых этими iep.'.ibiiTa.vUi реакций, дают основами считать изменение значений pli сигналов для образования фирдент-оубстратних ко.лплекооь и поддорония специфической каталитически активной кон[ор.лации ферментов. Следовательно, ноли чина pH является регулирующим фактором, обеспочилавдм настройку активного центра ферлонта на начяльнь'Л зтап - ci нзивание с субстратом и иослоиунк^е кон^ормационныо изменения, необходимо для осуществления каталитических актов.

Определены различные по своей природе, функционированию и местоположению сульфгндрильныа грушш ферментон. Очевидна, что в осуществлении катализа принимают участив только быстро-реагируювде суль4гидрллыш0 групгш. Субъидиница Р^И содержит одну сульггидрлльную группу, а для фермента Pill, субьедикнцы •iPK и большой субъедину.цы РБ*лО при проведении каталитических актов трабуются по дзе сулъфгидрильние грушш.

Обнаружено за^лтное действие субстратов активное i'u субъ-едшшц Pili, .jüp,:t'ii-roH Pili и 1P;\ при ит'иои[оьании суль]гид-ральних групп 5(5»-длтиоопс;£-нитроонкзо>ггои) { ДТИЬ ). Сравнение ».-тело ни знатного действия "риоо:ю-5-1'Ой4ата и риГ.уюзо-б-фоо^ата 1 Py5v ) на восстановление »о^орибулолгшкшой ак-тгьнооти Г PK доказало, что большой э^фа/.тиьностьи обладает puüü30-6-i0c4aT.

lia осчоваыш асучдг^я соотиогешн ста: они линия

сульфсидрилышх групп,защитного '¿фф^^'Л ОуСЛТр.:..'^ Л ¡!Л'.Я!-:!;1 их на восстановление фер'лелтагит;!;';;! зк :-л.:;.-гтг. р.: : изомеразы и фосфорлбулокина^и ии..-гл2:;о с.."".-.; . :г\:

участие сульфгидрлль¡шх групп, рась-о,г.гг.с •: :: / »:•:.....

центрах ферментов, со степенью аллос.^рп';.--■•:!>: ,;£•<-,:: „¿¿.иишх взаимодействий, а также коханлзг:-

Обнаружена регуляция но типу обр:.г.:с:1 с:- г :: : :.:■,/л ; ■ фосфатом рлбозофосфатизоморлзной егд;: • ¡.. • ?::

ниц Р*-Л, 2хМ и $ор::уцтнах пропзр.т • ;: 1

пол особенностью тялого мехлнлзт! г-лулт'лл :.-луг : • .• : изо тройного коглии-хсз ^ог.-зч7-'::.-.*, г;;:- ч.-

ляется иоло^ательаим глодуллторс:.' • V. -.фосфзтизо-лор >зкзХ тявностп. Даниил .-лзханпзм р'Л"/" :;• -уд? шед^чатьмл ллл • ключдться в аинлол^с".';! от с./... »-¡««л»« ;<ош(оц?ра.;лЛ л РБ1? л числа функционирую:^: -¡¿г\-.ыиг : лллост1ра*ис.{::х .•;= в составе различных |ор:д ^«¿\4«нтов.

Ипервио установлена координирэзлаа.-:! : ;,./у~

локлназноЙ активности *Ж< иетдболитом-:; г*, Г. Действуя лак аллосторлческлЛ П'{фол':ор, !•;.;• осу.. г •

ляцив непосредственно связываясь с г..-;;"-,: ;г - ; .

ч'РК. Увеличение фосфорлбудошшазиг.а ак^илнос*:: г.: ;:•.;: вследствие кон^ор-дациошшх пер?с?реа«с ттысул:; л зашли с пологителышглл аллостерлчосгхгI геп.: , •.- .• мотролннма кооперативными изаи.'лодоЛстьй)ГЛ! акглг-кцх терлческих цонтрэв ферментов.

Лшштическао исследования Зердонтатдгних мультлферментиых комплексов п присутствии субстр.:с.-и ' .'ли . :" обиарухать Функциональные свойства, характер:;5;;? д.гч мэнтиых комплексов - наличие "направленного" сзроаосз ц,-точных метаболитов, "облегчен.¡ого катал.!за" л лооу'лепп; ;>:' регуляторши эффектов, а такхе аллостеричоскрт. ул^/л-ля злгиз-ностн, осуществлямчупся ла уро м рчличиых гл'ллтла-^ <: циэтивныЛ механизм рогу.гвди ¡и -.гумлс хзм::локсо;:-.т:соцл5таа,

Лолуче.шио результаты позволяй! здг.-.ать ьисгч о су .¿¡"лис— ЬЛНИИ' фор-Л'Зат^Б ци :<;:.! Калььит ь различи.« -^¡ /ях - а.г-.'одлой, стасяль(ггх дультл^; мент.-^х ксмлл-.'лс.оз, дшуйч-^кях 1ер'.!1'нтн.;х .о'длзексой-а«^-олиатов я метаболСул-^гко^акгл 1ер'/енто!? ди.сла лал.ьан^ в р^зллч.ч.«* и^обто.гг.'С» для

реализации регуляторных механизмов разных уровней.

Полученные наш и имеющиеся в литературе экспериментальные дзнныо обобщены в виде схемы иерархии механизмов регуляции активности различных форм последовательно действующих в цикле Кальвина ферментов.

Результаты проведенных нами экспериментальных исследований представляют ' научный интерес для развития теории ферментативного катализа, теоретических и прикладных аспектов •¿Плскернол онзимологии и биотехнологии, разработки тест-систем на зысокоактивкый фотосинтетический аппарат для генетико-сеяек-ционных работ по визедению высокопродуктивных форм растений. Обьединеш!е ферментов цикла Кальвина в мультиферментные комплексы значительно сокращает объем гонетико-селекционных работ, так как возрастите каталитической эффективности одного из них инициирует повышение каталитической эффективности других ферментов.

Апробация результатов исследований. Основные результаты работы были доложены или представлены на 1У Всесоюзном биохимическом съезде ( .Ленинград, 1979 ), на П,ШДУ,У конференциях биохимиков Средней Азии и Казахстана I Фрунзе, 1976; Душанбе, 1981; Ашхабад, 1906; Ташкент, 1991 ), на Всесоюзных совещаниях: "Энергетика, метаболические пути и их регуляция в фотосинтезе" ( Пущина, 1981 ), "Кинетика фотосинтетического метаболизма углерода в С^-растениях" ( Таллинн, 1983 ), "Связь метаболизма углерода и азота при фотосинтезе" ( Пущено, 1985 ),на Всесоюзном научно-методическом семинаре "Результаты и перспективы использования модельного растения арабидопсис в космических исследованиях" ( Душанбе, 1986 ), на П Всесоюзном съезде физиологов растений ( Минск, 1990 ), на Международной конференции "Итбги и перспективы энзимологических исследований метаболизма углерода при фотосинтезе" ( Душанбе, 1991 ,, на конференциях молодых ученых и специалистов Таджикистана ( Душанбе, 1980, 1984, 1985 ), на Конференциях профессорско-преподавательского состава Таджикского государственного университета ( Душанбе, 1987-1996 ), на заселениях научных обществ Физиологов растений Таджикистана и Тажикского отделения биохимического общества ( Душанбе, 1995 ), на I Ко».]-зренции Ассоциации "Еенщинн наукп Таджикистана" ( Душанбе, 1996 ).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы «12 пе-

чаиша работа.

Структура и объем диссертации. Дяссортагчя чзлохена на 273 страницах машинописного текста, содерук? 60 рисунков, 28 таблиц и состоит из введения, шеста глаз, заключения, выводов и списка цитлрованион литературы, пклйчащего 293 работ.

ОСНОВШЕ .МЕТОДУ ИССЛЕДОВАВ

Объекты исследования. В работе использовали листья растопил хлопчатника ( ао.эа1р!ии ЫгоШт I,. ) сорт:: прайи-ДОПСИСа С АгаЫйоо'.Нз 111!'.11апа Ь. МеупЬ ) ' рзс:К счисха;1.'.«., гороха (.Ч;;и:л аиПуил Ь.) СОрТа ЛрЫШЛ И ПЬ'ШПЩи (ТгШс:п Ь\) сорта Ленинградка.

Со.пер>:а1 ие белка. :Соличесть«1шое оа^еркыше белка определяли по методу Лоури ( ю.чгу сч а! .. 1951 ), а также спс-пгро'сто-метрически по пох'лоадьиа при 200 и: на прибора марки 13~о-идз С сил ).

Опрод«.:леиия активности I)ео>:ентов. Активность РЯ'Л опр^у.здя-ли ¡ю модифицированному методу Лкседьрода и Лиг ( 1954 ). Определение продукта реакция кетосахара Ру5^ проводила карбазольшш методом по реакции Дишо ( ,Воге::Ггйш:<1 .

1951 ). Активность ЯРА определяли по .методу Гурыггца я др. ( ib.ir.vit г еЬ а1 1956 ). Количество а?олочогид род»;зуамого аос— ($.ора определяли по методу ■■¿иске-Оуббароу (. Рьакс.- , ЗиЬЬпго« 5 1925 ) в модификации ( Кочетов, 19£0 ). Определений а.ктлвнсг;.'! РБШ) проводили радиометрическим методом ( Гочанопа а лр., 1973 ) по скорости включения Н в кислото-устойччпий псс-дукти реакция в присутствии субстрата РБ2 или Р5■!/ и АТ!-. Определение $ос.1оглицораткинззно-глицврзльдвгял1ос^а?догалрогв:12з-иой, а также <{руктозобас4ос4»?азиой активности, проводила ас методикам, описанием А.д.РомановоЯ ( 19(30 ).

ратов. Для получения препаратов РГД, 11Рл к П^лС л/.счьов изучаемых объектов применялись .оотаетствугсдо метод« ¡ыд-глви?* и очистки, модифицированные или вновь рчзрабстат.^о с учатом спс-ци 1икя объектов ч ъ-./.^а/а в\ 1080; Гяхэ&за, нова, Езомясанова л др., 1Лб-%загймъх, У л/л-я.,

1-е"; Г ¡6аг„т.аах)2, ¡.'акаена, Г;*ясос, 19о?; Еа^ас-.-^г^Л !, ва, Алкс-:-!, ¡.¿'¿О 0/б';?гат для •»ос^риСуло.ииаоно,: :'уг-* :;:чтез,!ровал;! по м-тахякз Н.Г.Р..е/:,?ОЕ.С£ 'ГэТЬ).

Дяу*1ор:витны?. комплекс Pi'H-ФРК (2xwK ) получен в результате ¡!эдос>]оннух процедур очистки, которие предотвращали денатурацию двух £ар;ентоь - Pw! и <¿>PK. Субъединицы P>¿H и ФШ получала денатурацией форментных препаратов 2% додецилсульфатом н_трля ( ) ivy СМ мочовиной при 37°С, в течение 30 минут. .Us: ¡.олучонл,! бзлыгх субьединкц PDwíCO пользовались методами Kiohlrurs . Akar.nrca ( 1974 ); Andrews ( 1986 ).

Другая метод». г.с:пользуе?лцо в работе.

Аналитический диск-электрофорез в 7,5^ полиакриламидном геле использовали для определения гомогенности и молекулярной массы. Число пог.торностей каждого определения было двенадцатр-краТ:Ш,.".. 'Лолокулярная масса белков-метчиков в кДа: лизоцим-14, цктохром С-14,5, химстрнпмш-23, яичный альбумин-45, гемогло~ б;л:-57, альбумин бака ( мокомер-68, димер-136, тример-202, тотрзмар-270 ), глютаматдегчдрогенэза-290, апоферр1ШШ-443, ферритин-450.

Дополнительными критериями чистоты ферментных препаратов были: экстрагирование белков из гелей после электрофореза и определение их ферментативной активности, проведение диск-электрофореза с созданием денатурирующих условий, а также выполнимость отношений поглощений для РБЖО при ^gc/^260 Равного 1,9+0,07, а при Л28(/А240 ~ 1,5+0,05 С Романова, 1991 ), для РФЙ при ApsQ/AogQ - 1,19+0,04 ( Wood , 1970 ).

Константа Ыихаэлиса ( Kj, (каж)| fsJ 0,5 ^ рассчитывалась по методу Martin »Burgos ( 1979 ), коэффициент Хилла ( h , пи ) - по Курганову ( 1978 ) в Келетя ( 1990 ).

Определение количества сульфгидрильных групп, ингибирова-¡шо ревгонтаь-л и запета групп активах центров субстратами проводилась по ыэюдапаи, предложенным Ю.М.Торчинским (1971,1977).

Полученные результаты обработаны статистически ( Урбах, 1958; Лакин, IS73; Методы биохимического анализа, 1С1'.J ).

Продставлзнаые данные достоверны при доверительной вероятности 95-S8Í.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ Ш^НГАТИЗНЫХ АКТИВНОСТЕЙ. И МОЛЕКУЛЯРНОЙ - ' МАССЫ SEPAIEHTOB ЦИКЛА ШШШ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ИХ . СТРУКТУРНО^ ОРГАНИЗАЦИИ

Структурная организация ферментов цикла Калвина рибозо-фосфатпзомеразы, фоофорябулокиназы л рпбулозэбисфосфаткарбок-

силазы изучалась на злектрофоретлческн гомогешшх фермонтаих препаратах, с последующей денатурацией для получения суОъодн-ннц. У выделенных ферментов и их еубъединпц определялись молекулярная масса и различные ферментативные активности с использованном специфически:: для данных форментоз субстратов. Б ферментных препаратах ¿PK и РБ<л<0 определялись суидернь'о ак-гкаиоста с использование« в качество субстрата P5-Í,

На рис.1 представлены результаты изучения структурной организации рибозо.}осфатнзомеразы из ллстьен хлопчатника сорта 108-Ф. Молокуляриад масса фермента равна 52+2 кДз. -«ермаат состоит из двух идентичных субъвдааиц, молекулярная M¿r;ca которых равна 26+1 кДа. На рис.2 представлена електрс^ор'л'ра:.::,:^ ц калиброч-ний график для определения молекулярной массы двухи ермеитного когя'ликса РЛ1-*Рл. ¡Лодекуларнак ..ucea 2хЛ\ оказалась равной 180 кДа„ а субъединиц - G0+2 ;<Да. Iíovíul;млиз температуры деиатуравда позволило получить модифицированные субъедииицы с молекулярной массой 52+2 кДа. ¿ермент vPK имеет молекулярную массу 240+10 кДа и состоит из четырех идентичных субъсдшшц с молекулярной массой по 60+2 кДа (рис.З). Из листьев хлопчатника и гороха Сч-ла выделены три множественные молекулярное формы РБГлО, молекулярная масса которых была равна 400т20, 480+30 к 52G+J0 (рис.4). 4'орцентний препарат РБ-tXO хлопчатника обладает цо;гакуля риой массой 020£30 кДа а состоит из двух типов сусгодикяц • 52¿2 и I6+I кДа (рис.4), т.е. из 8 больших и В малых субкода.шц,

В таблице 1 прздетавлекн данные о величинах ;,;олекулл(лш~ масс ферментов и их субъедишщ, а также о величинах различии ферм«нТативнЫХ йКТИВйОСТсй, ПрОЯЬЛЯе^Х ййй. ají; г.;-;д;;о НЗ "рйг^ ден.шх з табл.1 результатов, оубъединицы Р;И проявляй только рибозо{осфатязо:ларазную активность. СермзктныК препарат Г-i'.í з сравнении с субъодишщами проявляет в два раза бо.1>л;уа v4óoió-^осфатизомеразнув активность а два другие активности, ^оо.тодойй-' Толь но действующих за РМ! в илуп .Сальыла ферлонтоа, jo:¿ орябу-локиназную и рибулозобнс4ос[зтг: •.рсоксилаз/гую. По-гучелиа-з гмьудь» таты лавт основание предположить, что суб-ьедишин Р1И представ-Лпют собой стабильный мономерkü.í аллостьраческяй I, Бакаева, Ба-баджановз, 1966 ) Вермонт, ¿эрмент,ий препарат р;'Л - «лбаляи! комплекс .{ерментоз с близкой по Еагачинз ¡¿ола.-гуляр-^Я узгсоЗ, вероятно, такой комплекс ¿ose» быть образован PK-!,

52+2 26+1 кДа

4,2

0,5 0,6 0,7 0,8 ИГ Рис.1. Улектрофореграмма (А) и калибровочный график (Б) для определения молекулярной массы фермента Рй1 (а) и субъединиц РФИ (б) хлопчатника. (Метчики указаны в методической части).

1вМг 5,4

5,2 5,0

•4,8

60+2 кДа

субъединица 60+2 субъодиница 52+2

и_I_I_

0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 52+2 кДа

Рис.2. Электрофореграмма (А) и калибровочный график (Б) для определения молекулярной массы 2хФК (а), субъединиц (б) я модифицированных субъединиц (в) из листьев хлопчатника.

IgMr 5,4

5,2 5,0 4,8

>40+10,Ж ^02

U»

240+10 G0+2 кДа

0,2 0,3 0,4 0,5 ¡if

Рис.3. Улектрофореграммл (Л) н калибровочный гра^чк (Б) для определения молекулярной массы йормента ФРК (a) a еуСг-единиц tPK (0) из листьев хлопчатника.

lgl.tr 5,6

5,2

4,8 4,4 4,0

520+30, PBi'KO \4bD

NOO^° 443 470

Б.субъедниица 52+2

М.субьедшшца T6+I

0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 нг IC + I кДа

Рис.4. Олектрофореграша (А) а калибровочных гр^ш; ¿Б) для определения'молекулярной ьшссы РБС.<0 la), болылгх lid) з малых (з) субъадяниц^.ц.ф.-многэственяиа иолекуляргшо ни РЕ «О (400+20, 4Ь0+ЗС и 520+30 хЛа) хлопчатклкв.

Таблица

Фэкэятатавныэ актлваостл, проявляема фермгнтшгли прэларатз

írK я

I I 1С J J

~2670+1Э Í440+I2 293-4+13 2854+21 2830-12 2834+28 28¿JS+x5 _ ~33ñI±I3~ ~ 3279+IÔ 3523+17

3740+21 _37£4¿0_ _ 0,25^0,05 0,э7+0,05 1,10+0,05

1,30+0,05

РБЯО ;о:опч2ТЕНка '^•Зстсат _ _ 7А_ J

í?X

Субъэдааица 4HÎ F5Ä0

Зэ рентный 5репарат_! Проявляемая акт£зностл_!

52^2

Рийозофосгат-изомзразяая

РЙ1

СуЗьедгаада Р*И 2xíK

26+1 180+10 240+10 60+2 520^30

. §2 ¿______________

_C¿6CTD3T Р5Ф Р52 P5i P5Í Р55 Р50 Р5Ф

i • К5Й 52+2 Р5Ф

1 2xK 160±Ю Сосфорибуло- Р5Ф

¡ 'ШС 240+10 кгназная Р5Ф

, Субъзданяда ЗЙС 60+2 -

i P55KQ 520+30 Р55

J_Cï6be33Hitûa_rïwA0_ _ 52+2__

i" Pïtf ,52¿2~ " "pif

¡ 2x2Í 180+10 Рябулозобяс- P5w

1 ¿Hí 240J0 йосфат- P5J

ja-^динлца ЛК 60¿ карбоксялазная -

1 РБЖ0 520^30 P5í

_ 52+2_ _ -

, "РБЛЭ 520+30 ¿ГТС-ГАй'дагздрогеяазяая -

i P¿¿\0 520+30 З'лосгпатазная -

" дзкныз кз работы А.Абдуллаеаа (1993).

?у5Ф Pyóí ?у5Ф ?y5i Py5¿

PBi

E3j FBw РЕФ

~rx "

3455+13 3148^20 3108+14 3515+13 3157+19 _347¿I3_ 0,83+0,05

0,33+0,05 0,75+0,05 1,10+0,05

•32,0^0,7 1,6-0,04

субъединицами ФРК и большие субьодякяцвма РЕЖО.

Двухфврмвнтный КОМПЛОКС, 4ep<BH7i:i;r; l![«!!!ipra ЛЧ й РБЛО проявляет по тра аналогичные фермьятятинько гьсг.гчнос'«:: рйбэ:«о-фосфатизомеразную, фос^орзбулолииази;» а рибу-¡ог^ис [ нткар-боксилазную (табл.1). Величины рибоа< Jсц:.(jt:i асиоpaко.: •«ктй.чнос-ти ферментных препаратов, представленные к а вел.I сиа:.;-'лтельно одинаковы. Величины Фос4ориСулокиназиоЛ и рибулгч.обяс-С-к«;и.:ар/-боксилазноА активности всех >}в|х4и.;?уих п;и пргсутстьаи Р54< на I3-I8/C выше н сравнения с ленол'-гоиак.'.ем с :;••:»•<! тпггких субстратов Ру51? или PDv\ Увеличен,'.:": р активности

при осуществлении суммарной {«удоги vovot бягу ¡¡¡■"••¡•Л'-нлеч "облегченного катализа" - характер icv;> .:::„.<отва для ..'.у^-.-Ичирмонг-hux комплексов i ¿радрих, ii'fcc ). :!;;: сравнении вслич::-: клр'а-с-силазиоА активности наблюдается возрастание с увояяп>>ш««« ко-лысуляриол 1UCCU <}üpuJfcii'»l!OrO крчЯ.'.раТЛ. Различи:! «чуду 'лрСО/СЯ-лазной активностью <[oj.ментного препарата с моличулпрной -и> -:oi 52 «Да и кДз составляет почт:! ¡О". .Мнохлствонмо v,«i'.yirtp-ные формы i'Li'.lO го]К>ха и хлопчатник проявляют рисо-:< , меразную, <1оо|орабулок1ыазаую и рибу-¡опоено ¡осч- г.и-ч;/я активности, причем высокомолекулярная форма ; я

величиной рибулозобдсфосфаткдрбоксил'г.яюй :!.?т/.зн0сгй ,

Выделенный из листьев хлопчатника ОДмштши прпг.зр.т РБФКО с молекулярной uaeeoä 020 кДа пропилят' смет*. мм- ••••.: ферментов цикла Кальвина - -рибозофсс^тизом'.-раунуЛосге^х'у.т"-киназнуо, рибулозобас$ос4аткарбоксилазнуи, loo^c-r,:-^о;-ную, глицдральдвгид4'0С1{'атдвгидр0г«1-:апную а ¿пухтсзс'лг.: луп (табл.1). Величины актавнолтбЗ сравнил; -■: гс.. v-wutv дольно выделенных 4армин?ов или с ародс?:«ши-:г.к<1',? i< мм.гугъ экспериментальными данные.

Выделенные ферментные препараты, д|.ух.5йрА;:1Тцка е

множественные молекулярные .{оргл с рачпично I .'оп-^ку.'ярюз чдз*-сой 160, 240, 400, 4bO а 520 кДа, ¡п:о.!Ьл::и:ус зо rf'-'j.tо.-:». логичных ферменту гигмшх skth»»но, товьа«ч- гг./ьт и 2/:. стьс--ванви •i0j«c:iT0B цикла '1"ллы.ч:нй « ;г плитах ux&iV.i4i.t-Atx

иуЛЬТй40р(.1гг!т:ш1 комнл 1 rvi«.

IIa протглзпил лиух послекпчх д1<:.чгйл»:га? тельаоч хо/зчздтво covijenji j toj 1ьуиь'.т.Юв-шиг чизг РГЛ/.О с Тйлахолдлуи! ан ( рочано.^а, "'/'-! ), jj :7i■•■ь хлокчатничн оортд lu- ХЛ \ а I -Ji\

Алиев и др., 1991 ) бала виделена мембраносвязанная РБФКО, отличающаяся по кинетическим параметрам от фермента в свободной форме.

Совокупность приведенных в литературе и полученных нами экспериментальных данных дэог основание предположить, что ферменты цикла Кальвина существуют в различных формах - свободной, стабильных мультиферме.нт.чых комплексов, динамических мультифер-ментных комплексов-асооциатов и надмолекулярной структуры, образованной мультиферментным комплексом и мембраной, метаболона. Эти формы ферментов находятся в динамическом равновесии друг с другом, причем их соотношение зависит от функционального состояния клетки ( Курганов, Любаров, 19ВЭ ).

Новые представления о ферментах цикла Кальвина требуют дополнительных экспериментальных доказательств, которые будут представлены в последующих главах.

ВЫЯВЛЕНИЕ ИОНИЗИРУКЩХСЯ И СУЛЬФГИДРИЛЬНЫХ ГРУПП, ПРИШМАВДХ УЧАСТИЕ В РИБОЗОЖ'МТИЗОМЕРАЗНО;1, ФОС-ЮШШОКИМЗИОЙ И РЛБУЛОЗОБИС'КШАТ-• • КАРБОКСИЛАЗНОЛ РЕАКЦИЯХ

Влияние рН на проявление активности Ферментов. Изучалось влияние рН на активность ферментов РЖ, «РК я РБОКО из листьев хлопчатника сорта 108-Ф с целью определения ионизирующихся групп, принимающих участие в каталитическом акте. Изучено также влияние рИ реакционной среды на максимальную скорость рибозофос-фатизомерззной и фосфорибулокиназной реакций и сродство РЖ и ¿РК к субстратам С Епкаеуа » ЕаЬо'а^агоуа > 1Э85; Бакаева, Ба-бадаанова, 1966 ). Полученные экспериментальные данные представлены в таблице 2. Из преведенных в таблице 2 данных видно, для реакции изомеризации рН-оптицум наблюдается при значениях рН 7,5-8,0, для реакции фосфорилирования - 8,0-6,2, а рзалцаи карбоксиларования - при 8,3-8,5, т.е. изменение рН внутри стро-мы хлоропласта мокет слукить регулирующим фактором активности ферментов, а такхе изменять направленность каталитических актов.

Из представленных в таблице 2 данных следует, что значения рН, при которых происходит ионизация групп в аг-тивннх центрах ферментов, также различаются: для Р*Л - при рН 7,0 и 8,33, ФРК - 7,6 и 8,5, РБС-КО - 7,9 и 8,3-и,4. ¡'о таблице -исалла ( Диксон, УэбС, 1902 ) определено, что специфическими ионизирующими-

ся группами для трех ферментов могут бигъ или дге аминогруппы, или одна аминогруппа и одна сулИгидрильная групп:». ( и'-групиа). По таблице Эдсалла невозможно определить какие конкретно аминогруппы ионизируются в активных центрах, обеспечивая максимальную активность ферментов, но значения рН, при которых происходит ионизация аминогрупп у изучаемых ферментов, закономэрно изменяются и возрастают от 7,0 у Р?И до 7,6 у ,Р.( и 7,9 у РШО, Очевидно, что изменения значении рН в месте их действия - это сигнал к настраиванию активного центра соответспухэдого фермента на его функцконкрованио, т.е. переход Е —Ех ,

Таблица 2

Влияние рН на протека.¡ле рнбтофосфлтизоме разной, фосфо--рабулокиназной и рибулозобкс .осфаткарбоксилазной реакций

1111111 Значечия_о/!,__

1 Фермент 'оптимума! которых ироисхо-_ виляющие _ — на_ изменения^ 1

1 , дат ионизация групп! У 1

1 _ 1 |В активном центре | Т.!) X _ _ _ 1- •-« 1

| РуИ 7,5-0,0 7,0 У ,33 В,0 7,о ь,0 е,5 ■

, да 8,о-е,2 7,6 В,5 7, 5 8,0 7,5 Ь,0 ь,5 '

1 РБ-ИО 1___ 8,3-8,5 7,9 в,3-0,4 - - -

Изучение влияния рН-реакционной среда на мзкса:гчльную скорость и константу Нихазлиса РЙ1 я уРК листьев .хлопчатника возможность более полно интерпретировать полученное резу.г-.тагч и позволило выявить в активных центрах ц :ю одлол дополнительной аминогруппе, ионкзирутаейся при рН 6,0, Таки-! обра^оа, в состав активного центра отих ферментов входа* три дояил/ру»*-щлеся группы: две аминогруппы и одна еульфгидрилькад группа (. у Р-;И - При рН 7,0 ; Ь,0 и Ь,Ь, у 1-Рл - лри 7,5 ; г С,') ). Ионизация аминогруппы при рН 7,") у Р;И и при р.! 7,5 у 4Рл обеспечивает протекание начальною ла и!э:гер>:за:ии а *$ос~ формирования. Ионизация второ?. .чмлкогру.д:ы при р.:{ В,0, а также суоьфгедрйльноД группы при рЛ г,о, как у ¡ормошз Р'.'Л, та:-: у ¿?К, г ероятно, об^сгочивакт с:;ег.д^ячес.-:у». каталиглч^скя .-'л явную АОн;орма;щг моле -ул , ¿рменти л гвя:-уяз а>н гг«елги, т.о. образов ше л{.оду'-":.г н.гэ /очм-лсл

3льно, • -лчй г» лт. ротуги;.'Орад

обеспечиваниям настройку активного центра ферментов на соотвог-ствувдую каталитическую реакцию, ее начальный этап - связывание субстрата с ферментом и послвдучацае конформяциониые изменения, необходимо дл;; протыкания каталитических актов.

Роль сулыТгидрйльных групп в проявлении каталитической активности исследуемых ферментов. При изучении влияния сульф-гидрильннх групп на проявление, ферментативной активности обнаружено, что ппрахлормеркурпбензоат ( ПХМБ ) на 82$ ингибирует активность РФИ из листьев хлопчатника сорта 108—"V и на 85$ - активность ее суб-ьединиц. Полученные результаты однозначно свидетельствуют об участии сульфгидрильннх групп в каталитическом акте субъединиц Р'-Ш и позволяют отности их к распо л яга гадимся в активном центре и обеспечивающим проявление ферментативной активности. У нативного фермента P'iíi сульфгидрильные группы располагаются в активном центре, обеспечивая проявление активности и участвуя в каталитическом акте, но это проявление наблюдается в меньшей степени по сравнению с субъединицамп, возможно, из-за структурных отличий. Титрованием ПХМБ ферментов ФРК и РБФКО из листьев хлопчатника установлено, что их активность ингибаруется на 65-68Í. Очевидно, что ферменты ФГК и РБФКО в сравнении с Р4И и субъединицами РФИ содержат значительно большее количество сульфгидрильннх групп на молекулу фермента. Эти сульфгидрильные группы участвуют но только в каталитическом акте, но к поддергивают нативнуа кокформацив белка, обеспечивая меясубъединичные контакты.

Определено количество сульфгидрплъннх групп в ферментах Р<Ш, «ГРК и РБ«К0. Для РХИ листьев хлопчатника и арабидопсиса выявлены всего два sil-группы, располагающиеся в активном центре фермукта. Для фермента ФРК, выделенного вз листьев хлопчатника, определено 40 сулъфгндрильных групп, гз которых: ü -быст-рореагирутшх, 24 - вялорэатирующих и 8 скрытых ( замаскированных ), проявляющихся после обработка додецилсульфатом натрия. Очевидно, что в каталитическом акте каждой оубъеднншш ФРК принимают участив по две бнетрореагиругчпие сульфгидрильные группы." Для фермента РБЖ) хлопчатника определены 16 бг-трореагкрупглх сульфгядрильных групп, проявляющихся в зависим;, тя от услогий инкубации: пря 30°С - 12 sil -групп, при 40°С - дополнят«?-4 льных четыре. После денатурации фермента проявляются ЬО

кироваинмх вследствие погруженное?:.* в г:,олг.->у. }.ги групп. Таким образом, каждая боягля ^¡^пы Г'1*'.и- • ..-г™

жи? по две бистрореагируоажа сулкдолдеязм^с ¿р/ьв-;. п. щие участие в каталитическом зхт^

Изучалось заьщтнсе дэйстн:'е -.-ч к-4 т >!■';. ! • ¡ив

ахтивйостг ;убьеди>шц РФЯ, ферме^то^. ГГ.» ч ,.|>. -ян агми. игси сульф'ициальчых г рун:» ДГЖ. :1:>луп«г1-<:к.- ¿¡-. ; >-?.т:.ч в таблица 3.

Г"

'Лнгибированяе оульфпздрядк'цл ! .»»^лл» ¿«г-?

ментов ДТНВ ч за^чтмив де^счакс •:убгт(п-> 4,1 аио активное^й субъединац РУЛ, фвр::и;гоь ч-Г« хлоч-

чатниха

I I I

I ФермоитниЯ1 »'пгмбкрогаише ¿кг.ти'с/ч ДЖ 8

I препарат !

.лос.до ир-ии ^.-¡Тилън

____ £

(

( Субъедшш-

.2 Г ЛГПБ_ I

! эьтиыювгя с.'- ■ .г г

ЛГН'^Г;; |

I цк рай 62-У6 Р5Ф !6~'>6

РФИ 63-36 ?5<5 33-5(1 ?6туД-

5?РК 65-70 Р5Ф 36-55 И'-'!' ,счи Ч^и.у

РубФ 37--С0

1 ЛТФ 4 С~6б

ОоН •1Й-64

Как видно из представленных в т&бд.З д&иннх, обр-^лЛг;. \ ментов а течение. 15 минут с шпала величину ^гозор.-Ч ,?/.<.'■.».<»>; пой активности субъодинац Р«И ш! .]<!пг:.\ч?а /".•■' - :(ч мента ФГК - на 705. Полного енкмнля ■![ьриипгя7.'--по> ч/;лук.о*::; ферментов РСИ в ФРК в сравнения с еуСгсГцяиатги стигнуто, ьероятно, И!»--эа плоыю<-?и структурно л орг<«:ь-! -.и.,: мучаемых фйрМвНТОВ: йолое З.'СУНИ.'Н. . ри а Г;<ЙТу-1 МЛ К иирокания их у ОРД, Пуйдвагкт»«!*!../? итнтл ,,к-т-пих суй: тратами зиачитлзао пошк-.яла ^ттч'ли лтл^р^яйьч." ной ьктавносгр. За 15 минут цаЗств*« :ГТ.'а: ак'лдк.е.:л*> г.у'т^ .,; уулиасила.чь й& С-5$, ф-.^л ч.чта 1':*' - < и'/> л , • .-.л-oe.wc-.-a у-г ао.полм''"ь?лиаго суйгтрдт.ч ¡ктч'х.с ыл

т-

55-60%, Шя большее защитное действие на активный центр 1ТК оказывает Р5Ф. В результате защитного действия Р5Г^ активность субъ-единм; Р4И восстанавливается почти полностью на 92% от первоначальной величины, фермента РФИ на 76%. Активность ФРК восстанавливается на 63-72% в зависимости от применявшегося субстрата.

Проведенное изучение соотношений степени ингибирования сульфгидрильшх групп, защитного эффекта субстратов и влияния кх на восстановление ферментативной активности РЖ и ФРК позво-.'.::ло сделать попытку связать участие сульфгидрилышх групп в обеспечении ферментативной активности со степенью аллосторичес-кпх гетеротропных или кооперативных гомотропных взаимодействий активных и аллостерических центров с каталитическим механизмом реакций. Неполная защита активных центров РЖ и ФРК субстратом Р5Ф от влияния ДТКБ, очевидно, происходит в результате возникающих конформациотшх состояний, обеспеченных действием Р5Ф не только как субстрата, но и как аллостерического эффектора, при этом возникают аллостеряческие гетеротропные взаимодействия аллостерического и активного центра, новое возникшее активное кон-формационное состояние ферментов дает возможность для проникновения ДТНБ в индуцированный активный центр. Предварительное заполнение субстратами Ру5Ф или АТФ активных центров ФРК обеспечило связывание не всех, а только тех активных центров, которые имели конформацяонное состояние, подготовленное к совершению каталитического акта. При функционировании ФРК из-за гомотропных взаимодействий осуществляющихся между одноименными активными и аллостерическиш центрами, активные центры, ранее не готовые к совершению катализа, оказались в активном состоянии, а сульфгпдрильные группы, находящиеся в них, прореагировали с ДТНБ.

Сопоставление степени восстановления фосфорибулокиназной активности ФРК при действии Р5Ф и Ру5Ф после обработки ДТНБ, дает основание считать, что функционирование ФРК обеспечивается определенны;,и информационными перестройками, которые соответствуют присутствию того или другого субстрата, причем, кон-формационкые перестройки, вызванные присутствие *. Р5Ф имеют большое значение для восстановления активности Ферм< нта ФРК.

ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ЖХАШШОВ ч'У1К1Е!01ШК)ЗА1Ш ФЕРМЕНТОВ РШ И ФРл ИЗ ЛИСТЬЕВ ШЯИАТЯШ

Для выявления механизмов функциснпрзвагля РМ1 л ч-РХ били изучена : регуляция ферментативных активностей метаболитами пахла Кальвина и отдельными аминокислотами ; условия ¿оссштцлк отдельных субъедшшц Р1И в днмернкй фермент ; влияние РР-- - субстрата карбоксилазной реакции на проявление рйбозофосфатияо..« разной активности субъедишщ Р«1 и рг)пличш;х лсгг.еь'йшх ¡их-паратов; влияние РоФ - субстрата рлбозофос.| атизомераз:-:ол реакции на щю-яиленае фосфорибулокиилзной активности фсргинтя СРХ.

Изучение влияния метаболитов щпига лзлъвл!' I показало, что они оказывают различнее действии н-» чермецти Р4-й л ФРК. Активность Р1>1 увеличивалась а нрисутечт;:« гл^хоэо-С-фосфя.та на 10/, фруктозо-6-фосфата - на 13^, З-фосфоглацорат и фруктозо-1,о-бисфосфат не шзнвали из:.:еневп;; дк'/п.аюсти фор.докта. Активность ЖС увеличивалась в присутствии гчюколо-С-фосфата на 23/.', 3-фос-фоглнцерчт и фруктозо-1биофосфат оказывали иигибируилее действие на активность фермента, а фруктозо-б-фосфат не вызывал изменений активности ФРХ. Полученные результаты дают основание полагать, что активность Р-'.П и ОР/. регулируется ¿.йуайолатаал цикла Кальвина по лллостерлчвскому механизму, при котором осуществляются необходимые кон^ормацпонние перестройки фор^.-лонтоп в соответствии с изменения;«! концентраций метлбо/лтоп в хлоропласте. Аминокислоты глицин и цистеан оказали поло^гуольнсо твие па активность и 1>РК, вероятно, усилив белик-оолховик взаимодействия.

Ассоциация субъелин/ц Р.И изучалась при иомс.'Д сездл.ел условий для восстановления четвертичной структура фирмеа?-; К'Н из листьев хлопчатника. Результаты изучения лссоляаглавой н)о~ мокиости отдельных субъедтшц представлены и та¿плие Хлк видно из нродстаплоиаих в таблице 4 дЬнних, все соадаааао условия способствовали процессу лссоцлацли суоьчд.'нак ч уколачивали активность до уровня сатгьнг/го ¡нрмевта. Очоь-иднс», что нролэоало восстаипълоиио ь-:ь..-рглч«?ой с г рука у ^унк-.ис— нальная роль чотп.'рглчдол сг.'рукг,;^ формс.-н:,:1 зтилячас-тг-д п обеспечении осокой рнбозг.фо,;^т/згг-.ер.^йиОЙ ¿дмнлолз, ¿ь.<;/.тл активного центра от деторгсьгн 'в ^.г.'нзацнл 6>г.:ти'П ли.

Таблица 4

Рая «шло уязлпчнмх условий ¡13 ассоциацию иу&едштц РФИ

хлопчатника сорта 100-Ф _ „ --------------------(

/дольная рлбозэфосфатлзомеразная активность I

активкость 1 Условия для ассоциации субъсдшшц

, 'Т.»"1 Г'*/'.':> *' 1 Р1-;' 1- .. .. .. „ ! , через 0 часов 1 хранения ( чор<!3 1,5 часа ! диализат« добавление иистсина. 10 мкМ"

1 ?С40±'~ | 1420ь?,0 * 2460+8 1 2Р20-14 1 ~ 2709*6

Регуляция рибулозоОисДосаатом »иРозофпса.этчзомрразной „активности оубгемщщ РФИ и различны^ Лв^шм^лавшадза« Исследовалась рибозо$осфатизомеразная активность субьедишщ РФИ ц фермента РФИ хлопчатника при различных концентрациях Р5Ф (0,02-2 мМ), Полученные результаты представлены в таблице 5, Добавление РБФ в среду реакции снижало величины К^, увеличивало максимальную скорость реактщи и значения коэффициента Хклла (п„). Максимальное значение коэффициента Хилла рзакцяи изомера-зациц субъедин5*ц без РБФ равно 1,4?. Зто дает основание считать действие Р54 не только как субстрата, но а как зялостеркческого эффектора, который усиливает процесс днмерязацяя. Добавление РБФ, действующех'о как яллостеркческий уффекхор, увеличивает зна-¿еииь коэффициента Хилла до трех, что свидетельствует о судзст-поваькк субь&дянии в трех равновесных состояниях (Кагяк5 1989): мойомерном, диквркоми л новой кон|ор?1ацяокном состоянии, индуцированном лрясутстагем РБ1, Для фермента РФИ субстрат ?5Ф служит, така^ как для суо-ьедячиц, аллостеряческяк эффектором, в результате его действия происходят аллостэрические гетеротропные взаимодействия активного к аллостерического центра; (кй=103). Положительный модулятор РБФ усиливает зто взаимодействие (пи=1,42).

Результаты цсследовзния влияния различных концентраций РБФ на рибозофоофптлчомуразную активность изучаемы? ферментных препаратов приставлены в таблице С.. Показано, что с увеличенном моле:'уляр:-:о1!. массы Ферментного препарата, присутствие Р53> уве-личпрает :.и:ксят,"альную скорость реакции и уменьшает значение Км„

r - ~ Г ~¡ — J

СП 1 1 t 1 1 СО -у СО CQ CJ ГО го ! С Л !Г> i l-'.-l

M 1 о ci о о о о о ö r.::> O O - ."j -) o

§ 1 1 1 о* сГ о" о* о" со о* о" -- ^ ..'.> O ' • O - ; O'

H 1 1 -ti +1 + 1 +1 1-1 -11 fi ti ;

CU Я i 3) и ¡> г- C\¡ со :о СО Ч J - С - . . ! j

ce > Ч И 1 in ** Ю f-l С-- '.О . ! - f) <-v- -, . -i

И « i ««•

о ч 'Я, 1 о M и о и Оч о t-t

H i 1- 1 I 1

1 н I J

et а i

Рн 1 о> 1 S ! s

СП Я H ю о о m о о > .-1 о OI u-, .

с4 i ctf ol

» 1 >tí< HI о" и OJ i о 1 -1 С\> с S- 1 V - i

ö •ж 1 H en 1 1 1 1 1 1 t i " ¡ ' i " 1

ч) 1 CD M a| С-1 С.! с > i

а О 1 «> Г-i о 1Г> о о LO о > - i :: o 1 -> '- Г: J ^^ í . -s

CD 1 M 1 oí

-îjK о о 1-1 о о (-1 о O O ' ; • -

1 О >i

« fâ 1 к о 1 i

í5 1 — - 1 I !

Рч tí

l-S

ч я

ta ci Ч <5 CD О сЧ Ft О >. о

sí vp

з ь,

и «

СП Ен ф СП

О.

Ж О

О о

ta t>,

эт о м

сц м

q w

о fj

m eg M С, И H га к •ü< о о о •í* о

s *

Pi R'

0 O

ta n

w я

а) ец ¡?

I». Ы

л см

C'J

I o

O lO H f>1

M W

.-A

ía §

¡2 o

^ 5, -

o t->

§ g

»тГ

' h '

H »

о о*

О Lfï

w ill

И ь

aj H,

a, g 1>

■о 5

со Г) t r- Vi M

o ; - o о сд

o o > 1 o о*

H • 1 ; 1 и -t' ïl

o LO . и-1

vVl r- -, ! с \i lù с U

n ;-1 1 Cvi M о

i -(

Ci I

о*

го

£> Р5

ví 8

0} о

о с-г

ÍU

l\¡ i ti

а'

< i i*

ГЛ

о.» с :

1 t~t i Í-*

о о

Таблица 6

Изучение рпбозофосфатазомеразной реакции субъединяд Р-Й1 а изучаемых ферментных препаратов хлопчатника при 2 .-.¿.1 Р5£ и различных концентрациях РЕ£

( ( . 1 ¡ 1'ер:.!аатнай| Субстрат! Модификатор I Умах' 1 К^ х Ю-3М лоэффацагнт лилда ,

| препарат > ?5£,ыМ < мкмоль/мин 1 для РБФ 1 концектрацкл 1 1 1 п„ ,

I 1 1 1 1 модификатора. -Л 1 Ц 1 Н ----- -1

1 Субъаданл- 2,0 0,5-2,0 0,59+0,06 8,8+0,02 0,1-0,5 0,85+0,03 ,

, цы РЖ 0,5-1,0 1,63+0,05 •

1,0-1,6 1,93+0,04 1

1А6-2А0 3,65+0,02 '

, РЖ 2,0 0,02-2,0 1,94+0,04 3,8+0,02' 0,02-0,1 0,72+0,02 :

0,1 -0,2 0,85+0,05 '

0А2-0А5 I,69+0х05 '

, 2:ОХ 2,0 0,02-1,0 2,01+0,03 3,0+0,05 0,02-0,1 0,51+0,02 1

0,1 -0,3 1,17+0,03 1

0А3 -0,5 2,20+0л01 I

1 ' 2,0 0,02-0,5 2,09+0,03 • 2,9+0,08 0,02-0,1 0,55+0,04 1

0,1 -0,3 1,17+0,02 '

0А3 -0,5 2 ,41+0аС6

РГ^лО 2,0 0,02-1,0 2,10+0,03 2,8+0,05 0,02-0,1 0,57-0,03

0,1 -0,4 1,18+0,03

0.4 -0,7 2.47+0.04

Увеличение концентраций РБ1> увеличивает значение коэфф ¿пийг.та Хилла, что подтверждает последовательней переход сусгецкннн Pvíl в процессе реакции из мономорного в дкчэрис» состой ни е. 11; л концентрации РЕФ I,6-2:.¡M (пн=3,65) возникают три равновесных состояния, одно из которых индуцирование РБК йун-.-лыоллровйг^.о субъединиц в трех равновесных состояниях обеспечивается соответствующими аллостерцческями гетеротролнымл: пуал:гоцейсл иямн активного и аллостерического центров. Макс/.млъвое значение коэффициенты Хилла реакции изомеризации осуществляемой Вермонтом Р-И при влиянии PEI' равно 1,7, ксюрое -.-.ок-ат означать, что единственное конформационное состояние оСеепечн^ангоя только одного рода адлостерлчееким гетер.угр;;ш;:;м ¡у» «••.одйпссг.Лг.ч ;«.;-тивного и аллостерического центров. Максимальное значение koü$-фиционга Хилла'для реакции кзо:.:орлпяц]:;: СРП и !/'.'-.СО, пгл

влиянии PEI', больше двух, что укалывает нч возможность •jyfwcr-вованил •¡•ер-лентов, по крайней :лсi о3 в д.чух' р .шювесних кш'чо;.--цационних состояниях, одно из когешх оби-нечимеген ополло';".*» структурной организации формЭнт.штс препаратов. Та-.лмл волн./о-действия:.'^ могут бить алюстерлческоа готоротропиоо п кооперативное гомотропное взаимодействия.

Изучение влияния РБФ на проявление ¿ноо:ю'К'С\|.л ,:&г/>оt:,< :¡-ной активности изучаемых ферментных препаратов д»ло в."л..ю^вость сформулировать своеобразный маханием регуллн:^ риоезопоефи.-о-меразной активности рабулоэобне¡.осфатом по типу обратно.» с'..>.зз, в соответствии с кратковременный! изцоаеничмп .ошижтрац/^ в хлоропласте, при это:/, образуется тройной хомглело t .«г. '..„»v» субстрзт-лиганд, где РБФ является ножшгте-.иг.ьч мод-/;-«гз(.о«. Важной особенностью такого чеха низка являете, то, что он '-t/írv "включаться" или "выключаться" в зависимости от условий ггодч ( соотношения концентраций PbV и PEI» ) и числа ^ун;пи!о;л|-уиу1х нктивных центров в составе "различной утешна олигс^чосга ферментных препаратов.

ИЕезодонаМО яяя.цздя P5Q на фосф^^^^^хл^^^д. $РК. ÍUa изучения вллднич И:i - гл-лр .-да-..члво.

актавьоеть фермента IPX онр^д^ллась диатда со свойс-т.-йснп.! субстратом Ру5-2 в субстратом рлбо-и !осф.гглзом. р ¡-,вой ¡х ачг.-яи

(рис.Га). Обо кривые имеют резкий ыа->д ¡¿a i./.vfo, но г ьичк-нч активности- а присутствии i-'yíV* сш ич let ил*.) ь -¿¡.¿¡¡¿аю

Субстрат, мМ Р5Ф,«/М

Рис.5. Зависимость фосфорибулошшазной активности ФРК •от различных концентраций субстрата 4 Р5Ф (а) или Ру5Ф (б).

Рис.6. Зависимость фосфорибулокиназной активности ФРК хлопчатника от различных концентраций Р5Ф при постоянной концентрации Ру5Ф (0,5гА1).

Таблица ?

Вляянла Р5Ф на некоторые параметры фосфорабулокиназной реакции ФРК хлопчатника сорта 108-Ф

1 I V ' к дКГ3},! 1 _Ко э йфици ент_Хилла_

Субстрат1 Эффектор1 ^т™ 'концентрация 1 п

, | ' , ';„ть/ | I субстрата или I пн

I , субстрата диктора,мМ ,

Р5Ф

Р5Ф . - 4,510,03 0,50+0,03 0,002-0,01 0,73+0,01

0,01 -0,2 0,41+0,03

0,2 -0,5 0,69+0,02

Ру5Ф

Ру5Ф 4,1+0,02 0,60+0,03 0,002-0,01 0,70+0,03

0,01 -0,2 0,73+0,03

0,2 -0,5 1,13+0,02

Р5Ф

Ру5Ф Р5Ф 14,3±0,04 0,57+0,02 0,01 -0,06 0,78+0,03

0,06 -0,5 0,88+0,01

0а5_ . I,82+0^02

с использованием в качестве субстрата Р5Ф.

Для изучения регуляции рмбозо-Ь-фосфатом фосфорибулокяназ-ной активности Ферментного препарата ФРК было проведено модифицирование активных центров субстратом Ру5Ф при помощи двухминутной инкубации. По, реакция не могла бить осуществлена так как в реакционной среде отсутствовал второй субстрат - АТФ. При одновременном добавяенли в сроду реакции АТФ и Р5Ф осуществления рпбозофосфатязомеразной реакции не было возможным из-за заполненности активных центров Ру5Ф, поэтому связывание Р5Ф происходило только в аллостерических центрах. Данные о проявлении ^"осфорибулокинэзкой реакции при связквэнии Ру5'=> з активном, а Р5Ф в алтостерическом центре ФРК представлены на рис.6. Максимальная величина фосфорибулокяназной активности равна 8,4 ми моль РБФ в минуту. При сравнении данных, представленных на рисунках 5 и 6 видно, что произошла активация метаболитом-предшественником Р5Ф более чем в 4 раза. Для выяснения механизм активации фосфорябулокиназной активности рябозо-5-фосфатом были рассчитаны величины максимальной скорости реакции, константы Михаэлиса и коэффициенты Хилла (табл.7). Анализ полученных величин показывает, что при протекании специфической фосфори-булокиназной реакции происходят только кооперативные гомотроп-нне взаимодействия активных центров фермента, в суммарной реакции - усиление этих взаимодействий. В реакции с использованием специфического субстрата Ру5Ф и аллостерического эффектора Р5Ф максимальные значения коэффициентов Хплла близки к двум, что свидетельствует об осуществлении двух типов взаимодействий активных и аллостерических центров: гетеротропных и гомотропных.

Таким образом, в результате довольно сложных экспериментов по модифицированию активных центров ФРК, показана координированная активация ФРК хлопчатника метаболитом-предшественником - Р5Ф. Действуя как аллостерический эффектор, Р5Ф значительно увеличивает фосфорибулокиназную активность, вследствие конформациошшх изменений, вызванных полопителъныот аллостори-ческями гетерггропными и гомотропннмя кооперативными взаимодействиями активных и аллостерических центров.

ЛЖВШСКИЕ ИСЖДОВАШ líJHláibtl СУБСТРАТОВ НА ЧЕРдЕНТАТНЗШЕ АКТИВНОСТИ РА'ЛЧПЧШХ VEP,.1EÍ1T1L1X ПРЕПАРАТОВ ХЛОПЧАТНИКА ООРГА ЮВ-Ф

Характерное съолство ыультнфир^ен'ши комплексов - "обдег-чояшл катализ", "напраьД'Мный" Пиронос метаболитов и координированный регуллторные зфф-.лты могут Сыть обнаружены при кинетических исследованиях. Поэтому нами изучалось влияние субстратов на ферментативные активности ферментных препаратов К/И, 2хФК,. ФРК и РБФКО из листьев хлопчатника.

Г^оао^осфатизомевизная активность. При изучении, кинетики накопления продукта в рибозофосфчтнзомеразной реакции различными! фармонтныш препаратами полученнне формы кривых характеризовались высокой начальной иг.оростьи реакции и в результате этого резкшд выходом на плато. Стационарное состоим;« сохранялось и точение 0,5-1 ¡.ишуты.

При изучении рийо:»сф.0йфашзо;лйразной активности в процис-со иасищшич активных центров фир^сьтних препаратов субстратом í-lji' получены кривый, характерные для аллос.теричиских ферментов vivtóc.7). оти Формы кривых ну является спгыоицным* как было получено ршое Бакаева, ьибадааисt, Í98U ), Различии обусловлены, ье роят но 'j'tíM, что в данных .иитах нспользоваио меньшее количество белка, по кик и в pa.n.j опубликованной работе полу-4t:Hii:jc¡ криви» (рис.7) характеризуй? аллосач-ричоскио ферменты, который в процесса каталитического акта осуществляют кооперат-гиыше лза1ь.л"-депстния ( Курганов, j978 ). При сравнении ьелич-Ч1П1 р1к1о:к>:!Осфатнзо:ийра:ию.1 -ктивности различных 'рарлвнпшл яролчратоь, различающихся молекулярной ласссй видно, что при он так. u «и. пол коицентрацпи субстр гга веяичшш рпбозофосфатиаомо-

рл.шол й.чтивнйсти ферментного i¡penap.r.;j Kil на 11$; ышо.ак-мыюотл «¡ор,житных нропаратов Ci'Á л PtiKO.

Ь тасл-из К представлены на личины максимдеыюЗ скорости, uoile'i'itHTi! .l.r.. 'ЗЛИ'!.-; и коаффцциепкн. Хклла риЛозофосфатизичерлз-i.o; j* {»Kiy;;i р;»^ллч:п:х фер.моцтиих nj ui¿jufo¿, Виллчлпи мьисимл-c.uopov-'ni pa:i .as-iwTcn lu-jua читальне. лол-ныш К, умонь-

4,'u>íl:.-1 С yZa.li.Hi'IOiiM ..МЛи'чУДЯрЛО» :¿'U!'JtJ -¿oj¡4(:H'fUOfO Iip "Hl.'ipaTa

y KOiiiM'-HU ил 1СV »/i« л ('рлнлзнип с Максклаль-

¿^»¡-¡¡¿л i.., ''хльи.ч- fe.;uji'.4u д ¡.рисли-тамся к ituja, ivu '•'< ¿ гогн'с.-р.ч-ша »•.'Ы'мок.астй-'Л, обуслок-

«>

Рис.7„ Зависимость от ¡гонцеятгоцик субстрата Р5Ь рибозе-фосфатизомеразной активности различных ферментных препаратов РФП (а), 2хФК (б), ФРК (и) и РШХО (г) из листьев хлошгатнгся.

ленных присутствием субстрата при проявлении рибозофосфчтизо-меразной активности ферментным! препаратам.

Изменения константы Михаэлиса и коэффициентов Хилла, а также одинаковая с ферментным препаратом РШ форма кинетических кривых зависимости от концентрации субстрата рибозофос-фатизомеразной активности, проявляемой ферментными препаратами 2хФК, ФРК и_ РБФКО, свидетельствует о том, что 2гГК, ФРК и РБФКО представляют собой ассоциаты, в состав которых входят фермент Р'<Н.

фосфорибулокиназная активность. Ферментные препараты РФИ, 2хФК, ФРК и РБФКО из листьев хлопчатника были исследованы на проявление фосфорибулокиназной активности в зависимости от длительности реакции при использовании в качестве субстраточ Р5Ф или Ру5Ф, Для полученных крчвых тчоплепЯя продукта рактерно сохранение стационарного состочч.тт в течение 0,о-I минуты. Сравнение г>чди"гш •1,ос]орчбул,;к1чпэ1ю'Д ялтрлжхяи, проявляемой рналлчняли гТер :зпт; ¡р.ч.: р-тз'лп при иснодь;)о-вании различных су^т )эт-зи мза 5, что ."3л;!чини ^.'стпгчоптл Вк.ше в феруептяо! ь - >т-г грк нсяольсэвак'.:;! л ¡:я " га

Л 11 N

m д

о я

■о о

IU О Рч а

X §

У, о к >о

CU К О,

£-< 01

СП W

р" ь

п я

о >н<

Й 8

Я С)

CCI О

PI ч

ÜÍ t»J

Р, хз

И N

Ч m

Cl, nj

■13»

cil E;

Cl) Cl,

Oi о

Li;

a: (.3

Г.-1 О

uî

X •ъ

.11

Гг

У1 "•)

y Ь

i4 о н<

ч £1

uj О

ч*

со I

1 OJ О 8 и о M О 1

CU 1 О о о о 1

и +l +1 +1 +1

1 CO с\г LT3 СО 1

— — из с- СО П5

I—I 1—i 1-1 ч

ОТ а]| 1

а,Ен о

£-1 COL V. 1

X о, M

Ф Е-1 I 1

а ° in

О fc-, o

M Ol 1

1 из СО 1 ГО

1 о о о О 1

1 о о о' о* 1

+l И +1 И

1 с\г M 03 СО 1

1 « C>¡ 1.-1 1—1 1 1

1 и; H 1 CO И со 1 CV 1

о о о о

S-! i « р.

о о о о

И i +¡ j.l +1 +11

о LO Л' С J аз

I -1 O о о 1

£ i i см OJ N W 1 i

i i о V* »'■* i i

m ю ю

i i Ан р. Рн А. ' 1

1 1 1

1 al 1

tu ** al

Ei I О а 1

О о си

О I 'ri' П} 1

:ii О о,

Щ I а> 1

Isl о

fr' I •о о 1

!»< со

Л! I ;x¡ 1

: i

■Ti

' Я

0 о о М. н,н 02

■+J Н <"

'S) сз .з о Ю Л V1 сЧ

1 1 :ч со

.V;

:<~> 'й & Рч 1,М »

'.-.< и

сосч сом1 rpo« у со оо Ьо оо оо

оо оо оо оо +1+1 ИИ +1+1 +1+1

C\jO эти Г-M tro

оом из (Л! осо аз из озаз

НИИ 1-11-1 1—1 HI Ml-t M M M ММ'

о о

1-1 1—t 1

LO ю

о о*

Ml- 1 OJ 1—1 OJCQ им со со см NCO

оо" +1 + 1 сою о"о" И И НН ov; + IH ' í4 Ni* о о +1+1 OJ l—l % о $ о" fl Cvi оо" +1+11 ЧСО

Oi\! НИ 1 НСО им H со Htl—1 03 OJ M £> £> CD юо

oci '.neo оо о о 4'OJ о о и о о о M о о 88 ! оо

оо оо оо оо + ¡ !| Н+1 +1 + 1 +1+1

о о СГЗ t> ОС- ою ООО vl'Cví ^OJ "КЧ

оо o*o~ o~o~ o"o"

ч'} . o

O LO <.4 LO "HLO

, m Ьч LO Ю ti

, P-.ÍÍ, РчА, fnP-i

ч ч

ЧЭ 53

ц го

Cl. п

о M

>н. се

о M

.А

о о о

-1 l-í со

+1 l.¡ - M

с-; ö сз о

со. aj V* C~J

1 1 CV ю

Í W,

•"s ' . 4 •»1

о«

н-ч ht

— V* ,

s as

00 o

ООО оо +1 +1 +1 +1+1

M vf tj< tD«

ООО ОО +1 +1 +1 +1+1

£> C\¡ С- ОЗм Ю in Ю Г-<£> ООО оо

о" о" о* о*о*

о по ю ЮМ ГЦ рнрц

g Ю LOffl

Е->

Я trj

'S' en

с ui

о со

tr Щ

!Я tu

V3 о

M о

ЧЭ

t>> аз

s 4 i" Рч

ооо

N, M, М, СО

+1 И í + сч о О о

1Л W <f "

И (.'■)

H IH

Й A+

-, L

'ï

si, fi

Результаты псслсдошнрй влачния разлкчсэ'х кониеитгоця?. Р5Ф или ?у5<!> на фосЛорибулокиназкую яктпхшспть изучаемых ¡'ер-ментных препаратов представлены на рис. ñ и 9. jico крвиыч хчр-рактеризуются резкам выходом к ;лакся»уму. При сравнении влияния различных конце итрзцл.1. субстрь'.'ов Р5Ф или Ру5Ф на Фоофо-рибулокиназную активность обив руке;о, что при использования Р5Ф активность ъсох nj^iiajатов выше« Ранее нами бчла получена кривая эависямостя чктк:и«.стп vP?. от концентрации PyS't более сложной -Тоi Г.З.:-»'доно»з. Бзкаела, Алиев, ), Разня»» форм-.' кривых líosiio обт^сгшть использованием в экспериментах различных котачесгв белка. Но обе формы кривых хэр^ктг-рнч для яллостерическах Лермонтов ( Курганов, 1978 ).

В таблице íi представлена зеличкны максимально.! скорости, К и коэффициенты Хиля* д.яг. фосфорябулокичаоцо'/ реакции- осуществляемой лзучаеглнмк ¿е^нтнкя® лрепзратте с использоълнч-з:л Р5Ф или РуоФ б лачг'стге субстрат-!. Из лредстяв-юнjkx в табл«8 данных видно, что ■.максимальная скорость фосфорибугоки-назной реакции выше при использовании в качестве субстрата Р5Ф и уменьшается с увеличением :,«ояекуяярной массч феру-знтяо-го препарата. Нэимсньжан величина кокстлнтк Мкхааласч полутень для ферментного препарата ТБ&ьО, но лр•/. соксстдвлоиш кс сатин f^j ферментных препаратов ?Ш я Ж йак«зккайо значзнае. ймзег ферментный арзпара? РОИ. Коэффициент Хялла у всех ферментных препаратов ¿меэт чнзче* аяв больше эдикяпч я увстпчгвгетоя . до стух лрк гспользозаний Р5Ф в качестве субстрата, лрк использования ?у5Ф - ¡-пибольдее значение нозффицявкте раз не 1,2 я наблюдаемся: арямгк зязискмоеть: с узеляченяем долекударко? мгсса ферментного лрег'Дра?! увеличивается значение козфтиииен--Т£ Хклла арк яспслььор.йний как ?5Ф, так л

?гяш образом, лслученкне ¿ормк кривых заялсимостк скорос-ts шссфс.рлбулслчнназно'к: реакция от ¿онцектрагши cyocvp-.тз зависят от концентрации белка в ферд'лктатиряол сред*. "то указывает на соствптоисо фер>чятоь "«'И, ^PiC а РБйСО \«о;у>лй ••. ЛОШЮ дпссошг.р.'. :r,cvo адлостеркческого фпрмснтч по Чургаиог£ ( 1986 ).

?и було з о б i? с j о оф i ti-н обе/.сил а з н ая ■: .• т и в н о с ть. Проводило-* сравнительное азу ;г,н;'е рябуяо^яс^осфаткчрбокспляз.'Г.Р vr.иг-

ностк РК-КО при: йтюльзср.чири различиях сгос"рзто!.' -J~>'>' или

Субстрат, м, Î Субстрат,mí.!

Рис.Ь. Зависимость от концентрации субстрата Р5Ф (а) или Pyöi' (б) фосфорйбулэкинаэнои активности ферментных. препаратов Til' (А.) и 2х*т; vD) хлопчатника.

íbс.1-). Эаьйсаиость от концентрации субстрата Р5Ф (л) ííjuj i'pi «ioü'íориСул .»канн зной активности ферментных рре-И'-.рато? ¡u'i\ \к) в PE-i'Kû >.Б> хлопчатника.

РБФ в зависимости от длительности реакции. Показано, что в стационарном состоянии, наступающим к двум минутам, активность выше при использовании в качестве субстрата Р5Ф. Величина ферментативной активности при использовании РБФ в качестве субстрата достигает максимального значения к четырем минутам.

Изучение зависимости рибулозоблсфосфаткарбоксилазной активности ферментных препаратов РФИ, 2хФК, ФГК и РБФКО от различного количества белка в реакционной среде показзло, что максимальная активность проявляется при 5Оли г белка. Все полученные кривые имеют сигмоидную форму, характерную для обратимо диссоциирующих систем.

На рисунке 10 представлены результаты изучения влияния различных концентраций субстратов Р5Ф или РБФ на рибулозобнс-фосфаткарбоксилазную активность ферментного препарата РБФКО. Анализ полученных данных показывает, что рибулозобнсфосфзт-карбоксилазная активность ингибируется на 16% высокими концентрациями РБФ, возможно, за счет его связывания в месте связывания второго субстрата реакции. При использовании Р5Ф ингибиро-вания не наблюдалось, так как РБФ образовывался в результате эндогенных превращений в соответствии с потребностью фермента и обеспеченностью вторым субстратом. Величина рибулозобисфос-фаткарбоксилазной активности при использовании в качестве субстрата Р5Ф на 20% выше в сравнении с использованием РБФ.

Па рисунке II представлены результаты влияния различных концентраций субстрата Р5Ф на рибулозобисфосфаткарбоксилазную активность ферментных препаратов РФИ, 2хФК и ФРК. Форма'кривых аналогична кривым, представленным на рис. 10. Величина рибулозобисфосфаткарбоксилазной активности возрастает с увеличением молекулярной массы ферментного препарата, причем величина активности, проявляемой ферментным препаратом РЕФКО на 32$ превосходит величину активности, проявляемой ферментными препаратами Р1>И, ФР:£ и 2хФд.

В табиши 0 приводятся величины максимальной скорости,

К, и коэффициентов Хиллз рпбулозобисноо/Тэткапбокснлазной м *

реакции изучаемых 'Тзрдэнтних препаратов. Представленные величины покэяылачт: ¡лэксы'злъизя скорость карбоксилазно"! рол1'-цик одипякога у 1?рментпы < препаратов РМ1, и ЗхП; мак-

лг.

Су Остр,'IV, м!д ?5Ф,мМ

Рйс.Ю. Влияние концентр... дни субстрата Р64 (3) иди ?!>!' (б) на карооксллазную активность РЫ'КО хлопчатника»

Рис.«II, Влияние различных концентрации Р50 на карбок-сплазную активность ферментных препаратов (а), 2хФК (б) а. ФРЛ (в) из листьев хлопчатника сорта 106-*/,

онмдлвнад скорость реакции карбоксилкровэпин ферментного про-, парата 7'1>'Л0 амеог больнее знамени» при использовании Р5Ф. Величина уменьшается с увеличению» молекулярной массы фермент лого препарата, тпы ферментного препарата РЕФлО величина К меньше нца использований Ро^. Значения коэффициента Хнлла одинаков!;, и й;:лзки к двум лл« всех ферментных препаратов,

Таклм образом, релцчи.чы саксгм&льной скорости, Км и коэф-г фи'.'.ипцтов ¡Си для, цолучоннии прк исдользования РпФ в ^ачесре• оусегр^ть ка^езкоясаякой. реакция, является суммой значений а,ч-;х ЗД1да« или *Тох р.ооаедоватедьных реакцай. Укгдгчн-., ■ рцо,?юаней«-'.]активности цра _^спол^чь

вании P5<î в качестве субстрата обусловлено, вероятно, тупнеля-рованием образующихся интермедизтов и мгновенным использованием их в следующей реакция данной метаболической последова- • тельностя.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что олигожрное состояние аллостерических ферментов меняется при изменении условий среда ( рН, ионной силы, температуры и т.д. ) или ¡.од действием субстратов, кофермен-топ и аллостерических эффекторов. Изменения олигпмерного со -стояния ферментов являотсм одним из механизмов регуляции активности ферментов в клетке ( Курганов, 1970, 1992 ).

Анализ приведенных в литературе экспериментальных дэнннх показал, что рибозофосфатизочеразную, фосфорибулокиназнул и рибулозоСисфос}эткарбоксилазнуп активность проявляют белки с различной молекулярной массой. Молекулярная масса болкои-^ер-монтов, проявляющих рибозо']ос}атизомеразнуп активность колеблется В пределах 26-669 кДа ( Ar.deraon et ni ., is^b,' Rutnrr , 1970; UoTiQt;k et ni ., 1973, 1974; Ecoe-nberg , Cooper . 1975; NorLtou et ol ., 1376; KnwnuhlMa , ТчпаЬе , 1976а, 19766; r.id-dnugh , yaoElroy , 1976; Ивзнптеп, Нясыров, I9BI; Бакаева, Ra~ бапяпновп, 1ЭЬ4; Snlnts ,Нагг1з , 1906; Бчбаджанова, Бчкаева, 1987, IStm; Oontero et al 1988; Snlnio et al ., £989 ), фосфорибулокинаэнуп - 42-ГВО кТа ( aibson , Hart , 1969; Fut-ner , 1970; Huiler . 1972; Abdelnl Schlegel ,-1974; Tabita, I960; Wnra-Anv«|iat.i et al I^BO; sieber et ni 1Ш', Hutnrr -Tumor • PrnJbecr. 1984; лзСЛНОВ, 1985; Krtedor , Hlziorki). Î5L6; Hninlfi , Hnrrlt. , 1936; Oor.tero et h1 ., I9f?»i; Saints <\i ,f l%9; p0rtor , 1990', Бакаева, 199Г, Бзкччзз, Лебэдевэ, 1994 ), рибулопосиофосф&ткарбокгилаянув - 40-850 к-Да ( Siar-î-iJ-n, T®Mtn, Романова, 1975, 199Г, RUtn«r •

t.nne , 1957; ЗччПя-м ГХ7, l'.TP, 1Э7Г, K***dhlm . Tho-npr-on , L.'•">;»; Эдачряе, Уопер, Р.'ЬГ-; Рон.'гн-;».л, IW7; -tera et s'. .. -:-.1гЛи el, ni L'.'^S; чол ,r Rt h\ .Д-'По;

Езбад^чно1м, .»l/,;'.чорчхико!1, Гтся.тзг, Л^Д'Фч, 1993 ). Ни основании этих ,-"1/Ч1Ч.х н.т.!и било п;>-"1паЛ''.?с'!ио, что причиной столь большого :•■■ млт'личх- ^о.ж.ул.-'рн:« касс фер7ч!;?ов яв-

ляются И'Ч ¡' ч '•/■¡mil" го''и:»,:оя получении фдр'шнтччх П[иларятоз, n ь; .-.-•-• :ч:'<! -¡•••:f"-.TOi' л р):*.-;"М!;< ол.:го:«)р!МХ состпнипх или

различной степени стабильности динамических мультиферментных ассоциатов.

Нами выделены из листьев хлопчатника, арабидопсиса и гороха алектрофоретически гомогенные ферментные препараты РЭД, ФРК, РБФКО и двухферментного комплекса РФИ-ФРК, а также множественные молекулярные формы РБФКО. Независимо от объекта ферменты имели следующие величины молекулярных масс: РФИ -52 кДа, ФРК - 240 кДа, РБФКО - 520 кДа, двухферментный комплекс РФИ-ФРК - 180, а множественные форш РБФКО - 400, <180, 520 кДа. Все препараты были исследованы на наличие.у них ри-бизофосфатизомеразной, фосфорибулокиназкой и рибулозобисфосфат-карбоксилазной активностей. Фосфорибулокиназная и рабулозобис-фосфаткарбоксилазная активности определялись ь присутствии специфических для этих реакций субстратов - Ру5Ф и РБ£, соответственно, а также субстрата предшествующей реакции - Р5Ф. Но величинам удельной рибозофосфатизомеразной активности ферментные препараты не различались. Величина удельных фосйорибу-локинаэной и рибулозобисфосфаткарбоксилазной активностей всех ферментных препаратов, определенные при использовании в качестве субстрата Р5Ф на 11-1выше в сравнении с величинами удельных активностей, полученными при использовании собствен -них субстратов - Ру5Ф и РБФ. Полученные результаты свидетельствуют о проявлении исследуемыми ферментными препаратами ванней-ших функциональных свойств, характерных-для мультиферментных комплексов - "направленного" переноса метаболитов и "облегченного катализа". "Направленный" перенос метаболитов заключается в том, что при катализе данными ферментными препаратами последовательных реакций цикла Кальвина

АТФ СО,

Р5Ф Ру5Ф N. > РБФ N , 3_^ГК

происходит тушшлирование Р5£ по конфейеру активных центров без выделения промежуточных продуктов в округкзюцун среду, т.е. происходит микроксмпартментализнция метаболитоп. Проявлением "облегченного катализа" является 5олсе высокая скорость фосфо-расулокаказной и риСулозобвсфос^лткарбокскллзкоЛ реакций в вриеутстк/и РоФ, а не собствен.;ых -уйстратор - Ру51< к РБФ.

Для ыуль?и4еравнтш»х комплексов характерны координирование регуллторные аф.|октк, о?нлрузи!В-*е:.ше при кинетических

исследованиях, координированные регуляторные аффекты проявляются в повышении субстратом первого фермента комплекса величины максимальной скорости последующих реакций и сродства к субстратам второй и третьей реакгдй данной метаболической цепи ( Фридрих, 1ЭЬ6 ). Полученные нами результаты показывают, что скорость фосфорибулокиназной и рибулозобисфосфаткарбокси-лазпой реакций, катализируемы* исследуемыми ферментными препаратами, действительно, зкз штельно ( на 17-40Я ) выше при использовании в качестве с/бстратэ РГ<Ф, а не Ру5Ф и РБФ. Сродство этих ферментных грепэратов к Р5Ф на 15-24^, больше, чем к Ру5Ф и РБФ. При проявлении ферментными препаратами фосфорибулокиназной и рибулэзобисфосфаткарбоксллэзной активностей значения коэффициента Хилла больше единицы, что свидетельствует о положительной кинетической кооперативное™ по субстрату субъединиц ферментов, Физиологическая важность положительной кинетической кооперагивности по субстрату состоит в том, что благодаря ей уменьшается интервал концентраций субстрата, необходимый для существенного изменения активности фермента ( Курганов, 1978, 1902 ). При использовании для фосфорибулокиназной реакции в качестве субстрата Р5Ф значения коэффициента Хиллл на I6-3G',' выше, чем при использовании собственного субстрата Ру5Ф. Значения коэффициента Хилла и Ку указывают на проявление ферментными препаратами большей чувствительности к более низким концентрациям Р5Ф в сравнении с концентрациями специфических субстратов - Ру5Ф и РБФ. Вследствие этого при меньших концентрациях РБФ достигаются более высокие значения максимальных скоростей фосфорибулокиназной н рибулозобисфосфаткарбоксилазной реакций.

Для фермента фосфорибулокиназы установлена координированная зктивацяя фосфорчбулскиназной активности метаболитом-предшественником - Р5Ф. В результате действия Р5Ф-как аллостерл-ческого эффекторз происходят значительное увеличение максимальной скорости реакции, снижение значений Км и усиление положительных гоиотрошшх и гетеротропких взаимодействий активных и аллостернческих центров ,'ерментэ.

Таким образом, значения максимально1, скорости реакций, К, , коэффициента Хилла, актпвзцил фосфорлбулокллазной актив-лости метзболитом-прелшественлико.л Р5Ф свидетельствуют о ка-

личии у ферментных препаратов РФИ, 4РЛ и РБОКО, а также двухферментного комплекса Pill-vPK характерах для мультифер-ментных комплексов координированных регуляторных аффектов.

Результаты кинетических исследований каждой ферментативной активности, проявляемой ферментными препаратами Р£И, ФРК и РБ'ЖО, а также 2хФК;свидетельствуют о соответствии кинетического поведения ферментов модели медленно диссоциируще-го аллостерического фермонта по Курганову, Следовательно, образование различных по молекулярной массе динамических цульти-фармелтных комплексов-ассоциатов является проявлением диссоциативного механизма регуляции активности последовательно действующих в цикле Кальвина ферментов Pvll, <¿PK и TOiKO.

Анализ величин максимальной скорости и Ку каждой ферментативной активности по моро увеличения моликулярных масс -мультиферментных комплексов-ассоциатов подтверждает наличие диссоциативного механизма регуляции активности ферментов цикла Кальвина. С увеличением молекулярной массы ферментных препаратов величины максимальной скорости рибоэофосфатизомераз-ной реакции не изменяются, значения же постепенно снижаются и у РБНО на 18?« ниже в сравнении с Pl-Я. Величины максимальной скорости фосфорибулокиназной реакции постепенно снизится с увеличением моаекуляриой массы ферментных препаратов, а значения К увеличивается, причем при использовании ь качестве субстрата Р5Ф наблюдаются большие различия. Так, максимальная скорость фосфорибулокиназной реакции для ферментного препарата РБйКО на 40$ ниже в сравнения с ферментным препаратом РИ1, ара использовании ко в качестве субстрата Ру5íf эти различия составляют 11%. Полученные результаты подтверадапт данные других авторов { Хасанов, Ахмедов, 1902; Rutnur -Turner i. I9Ö4', tortor, ) о том, что мономер СРК активнее в сравнении с одигомерной формой фермента.

Рибулозобисфосфаткарбоксилсзная активность с уволиче*-¡:nja моликулнрной массыферментных препаратов уьепкчиьается, так цолйчинп максимальной скорости реакции при использовании в хячоотиь субстрата РОЬ у ферментного препарата- РБОлО на 30Í выл ь c]mu¡iü.uu; а фермент ним препаратом Г vil, а ьеличина Н4 '•'vi ними.,

ВяжкиПлзд ийжлм-ллиои регуляции активности ферментов в .

клетке является регуляция по типу обратной связи ( Келети, 1930 ). Нами установлена регуляция по типу обратной связи рибулозобисфосфатом рибояофосфатизомеразной активности, проявляемой ферментными препаратами Pill, ФРК , РБФКО и 2хФК. У ферментов с усложнением четвертичной структуры появляются новые свойства, индуцированные : ¡уи РФИ - усиление аллос-терических взаимодействий; для двухферментного комплекса,ФРК и РБФКО - усиление гомотрспных и появление гетеротропных взаимодействий активных и аллостерических центров. Совокупность представленных результатов изучения влияния РБФ на проявление рибозофосфатизомеразной активности свидетельствует о механизме регуляции, проявляющемся в образовании тройного ком-плес? фермент-субстрат-лиганд, включающемся или выключающемся в зависимости от создавшихся .для реакции условий.

Изучение влияния pH на активность ферментов Р>Ш, ФРК и РБФКО показало, что образование фермент-субстратных комплексов и поддержание специфической каталитически активной конфор-мации .молекул атих ферментов происходит при определенных значениях pH.' Следовательно, величина pH является регулирующим фактором, обеспечивающим настройку активного центра ферментов на соответствующую реакцию, связывание субстрата с ферме н-г том и .последующие конфориэционгше изменения, происходящие при адекватных каталитических актах.

Сульфтидрилыгее группы могут оказывать существенное влияние на проявление активности ферментов, непосредственно находясь в их активных центрах или обеспечивая стабильную пространственную структуру молекулы ( Торчинский, 1977 ). При фо-тоактивьция, при переходе цистин/цистеин сульфгидрильные группы участвуют з создании такой конфОрмации молекулы, которая изменяет активные центры, обеспечивая их активное состояние ( Anderson , 1973, 1979; Эдварде, Уокер, I98S; Говинджи, 1987 ). Изучение влияния сульфгидрилышх групп на проявление ферментативных активностей оубъедикиц РФИ, ферментов РФИ,ФРК и РБФКО показало, что в активных центрах фермента РФИ, субъединицы ФРК и Сопьшой субъсдинщы РЕФКО располагаются по две сульфгидоильные группы, обеспечивавшие проявление (Сермэнтатив-HOvi активности. Другие сульфгндрилькые группы ч'акже участвуют в каталитических актах, обэспечинзя различные взаимодействия

обусловленные структурной организацией ферментов. Так в молекуле РФИ возникают аллосторические гетеротропные взаимодействия активного и аллостерического центра, в молекуле ФРК -как гетеротропные, так и кооперативные гомотропные взаимодействия одноименных активных и аллостерических центров. Данные о соотношении степени ингибирования сульфгидрильных групп и восстановлении фосфорибулокиназной активности ФРК глютатионом, Р5Ф и Ру5Ф свидетельствуют о том, что наибольшее защитное действие оказывает Р5Ф.

Полученные результаты дают основание полагать, что функционирование диссоциирующих ферментных систем различной степени олигомерности происходит в зависимости от создавшихся условий протекания реакции: наличия субстратов, кофакторов, аллостерических эффекторов, освещения, рН и др., индуцирующих глубокие структурные трансформации целых молекул, меж-субъединичных связей, активных и аллостерических центров,

Появление сведений о существовании мембраносвязанной РШ/ХО и зависимости ее содержания от освещенности и онтогенеза листа ( Русинова, Ле Тхи Лань Оань, Доман, 1901; Васильева, Фархади, Алиев, 1987; Алиев и др., 1991; Романова, 1991 ) дало основание полагать, что при встраивании в мембрану мультиферментного комплекса-ассоциата последовательно действующих в цикле Кальвина ферментов образуется метаболой.

Таким образом, совокупность полученных нами и имеющихся в литоратуре экспериментальных данных свидетельствует о том, что в хлэропластах имеются разные формы ферментов цикла Кальвина - свободные, стабильные «ультиферментные комплексы, динамические цультиферментные ассоциаты и метаболон. Ыетабо-лони являются динамическими структурам и положение равновесия мекду разныш формами ферментов и метаболоном зависит от функционального состоянии клетки С Курганов, Любарев, 1991 ).

С учетом существования иерархии регуляторных механизмов подученных нами и приведенные в литературе результаты экспериментальных исследований обобщены в виде представленной нике схема.

Уохя низки изобарической и аллостерпческоп р.гуллции свойственны всем формам .¿ерментов. Оти механизм регуляции

Регуляция системы как единого целого

¡2 Ф

и *а

^ ш

5 10

я ё

и: а х

>0< со

•а ё

>Й< С*7

о а,

•а о

5 а со

х *а

►3 о

РЧ ?! Си И

9 Ы

в Я

я о д о ы н =1

в> а.

о ^

о И

:=( £

м н ж

о Ш

о га

§ *Р У •й о

ш сг о

>-э м к

с и

Я т

¿ассоциативная ■ регуляция

реализуются с участием субстратов и других клеточных метаболитов, обеспечивая саморегуляцию метаболических путей и го-меостаз. Координированные и диссоциативные механизмы регуляции осуществляются с помощью мультиформентных комплексов, динамических мультнфермвнтных ассоциатов и метаболоков, обеспечивая слеконие за сигналами, поступающими от более высоких уровней контроля метаболизма. Роль сигналов выполняют вторые посрздники, например, гормоны. Образование метаболона сопровождается появлением нового, иерархически болео высокого ро-гуляторного механизма по типу включение-выключение или переключение системы как единого целого на новый режим функционирования ь соответствии с требованиями внешней среды. Механизм контроля функционировали метаболона как единой системы относится к механизмам регуляции типа слежения.

Таким образом, на выделанных нами свободных ферментах, стабильных мультиферментных комплексах и динамических мульти-ферментных ассоциатах исследована изосторический, аллостерп-ческнй, координированный и диссоциативный механизмы регуляции активности ключевых ферментов фотосинтетической ассимиляции С0^ - рибозофосфатизомеразы, ||осфорибулокиназы и рибуло-зобисфосфаткарооксилазы-окскгеназы.

Изучение механизмов ригуляции активности метаболона квк единой системы является предметом дальнейших исследований.

Познание механизмов регуляции активности метаболона, цо-ьидимому, приведет к стратегически вакным рошениям, связанных с регуляцией фотосинтетической продуктивности.

ВЫВОДЫ

1. Впервые из листьев хлопчатника выделен мультифермант-ный комплекс с моликулярной массой 520 кДа, проявляющий и есть ферментативных активностей: рибозо^ос^атизоморазную, фосфори-булокиназьую, рпбулозобисфоефаткарйокеилазную, фосфоглицерат-киназную, глнцеральдегидфосфатдегидрогеназную и фруктозобис-фосфатазную. Проявление шести активностей ферментов цикла .Сильвина позволяет считать этот комплекс мультифермантным комплексом цикла Кельвина.

2. Виерчгз из п/.стьев хлопчатника вы цел .м квух le рмс-нт-ниа комплекс Р-:И-;Рл с молекулярной массой ICO кДп, состоя-

41 ' "

щий из трех идентичных субъединиц, проя^-я1' дй три ферментативные активности: рибозофосфатизомерззную, фосфорибулокиназ-ную и рибулозобисфосфаткарбоксилазную.

Выделенные свободные ферменты, а также различные по молекулярной массе мультпферментные комплексы, проявляющие аналогичные ферментативные активности, указывают на возможность существования ферментов цикла Кальвина в различных олигомер-ных состояниях.

3. Обнаружено возрастайте значений рН, прп которых происходит ионизация гминогрупп у фермонтоз РФИ, ФГК и ГЪФлО. Результаты изучения влияния рН на максимальную скорость я Ку катзлпзируемнх этими ферментами реакций дают основание считать изменение значений рН сигналом ,цля образования ферглент-субст-ратных комплексов п поддаркания каталитически активной конфор-мации ферментов. Следовательно, величина рН является регулирующим фактором, обеспечивающим настройку активного центра ферменхов на начальный этап реакции - связывание с субстратом и последующие копформационные изменения, необходимые для осуществления каталитических актов.

4о Выявлены различные по своей природе, функционированию и местоположению сульфгидрильные группы ферментов РФИ, ФРК и РБФКО. Обнаружено, что РФИ содержит две сульфгидрильные группы ; ФРК - 8 быстрореагирующих с реагентами сульфгидрильных групп, 24 вялореэгирующлх и 8 замаскированных в глобуле ; РБФКО - быстрореэгирующие сульфгидрильные группы проявляющиеся в зависимости от условий инкубации: 12 при 30°С, четыре дополнительные группы при 40°С; 80 замаскированных сульфгидрильных групп проявляются при разрушении четвертичной структуры.

Соотношение степени ингибирования сульфгидрильных групп активных центров, защитного эффекта их субстратами реакций и восстановления активности различными концентрациями субстратов ферментов РФИ и ФРК позволили сделать попытку связать роль сульфгидрильных групп активных центров со степенью ал-лостерических л кооперативных взаимодействий, а такие с каталитически;.* механизмом ферментативных реакций.

5. Обнаружена регуляция по типу обратной связи рибозо-фосфатизомеразной активности изучаемых форы ферментов рибуло-зобясфосфатом, который является положительным модулятором активности.

Установлена координированная активация фосфорибулокиназ-ной активности ФРК метаболитом-предшественником Р5Ф, который непосредственно воздействует на аллостерический центр фермента.

6. Кинетические исследования кавдоИ ферментативной активности, проявляемой ферментными препаратами РФИ, ФРК и РБФКО, а также двухферментным комплексом позволили обнаружить функциональные свойства, характерные для мультифермент-ных комплексов: "направленный" пернос метаболитов, "облегченный кытэлиз" и координированные регуляторнно эффекты.

Кинетическое поведение ферментов РФЛ, ФРК и РБФКО соответствует модели медленно диссоциирующего аллостирического фермента по Курганову. Следовательно, образование различных по молекулярной массе мультифермзнтных комплексов-ассоциатов является проявлением диссоциативного механизма регуляции активности ферментов цикла Кальвина.

7. Совокупность полученных результатов позволяет сделать вывод о существовании ферментов цикла Кальвина в различных формах - свободных ферментов, стабильных мультифермэнтных комплексов, динамических мультиферментных комплексов-ассо-циатов и метаболоыов. Физиологический смысл существования ферментов ь различных формах заключается в реализации рогу-лятораых механизмов разных уровней.

8. Полученные нами и имеющиеся в литературе экспериментальные данные обобщены в вице схемы иерархии механизмов регуляции активности различных форм последовательно действующи в цикле Кальвина ферментов.

СПИСОК ОСНОВШХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАН 1ЫХ ПО !(МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Babadjanovo К.A., Eakaova К.P., Avtoraonovn L.E., Uoir.a-nova O.V. On the regulation of phosphoribulokinase - the en7y-me of cnrboxylation phase of photosynthesis // Arabidopsio Information Service.-Frankfurt атп M; in, 1976.-N13.-P.147-149.

2. Бабадаанова M.A., Бакаева П.П., Автояонова Л.Е., Хаса-вов W.T. Рибозофосфаткзо-.w раза, фосфорибулокиназа, рибулозобис-фосфаткарбсксилаза из листьев исходной формы хлопчатника сорта 108-Ф и его высокопродуктивного мутанта Дуплекс // ТУ Всесоюзный биохимический сьезд: Тез.докл.-Ленинград, 1979.-Т.I.-С.265.

3. Bnkaeva К.P., Giesov T.D., Kharanov К.Т., Babadjanova И.A. Frnctionntion by an-mnia sulphate of ribosephoaphateisorr.e-raoe ferment preparations, phosphoribulokinaec and ribulosedie-

phosphatecarboxilast: from Arabi.dop3i3 Thalinna leaves Snkheim race // Arabidopais Information Service.-Frankfurt кш Koin, I9W>«-KI7.-P.120-12?.

4. Eabadjanova M.A., Bakaeva N.P. Hibonopbosphatcisomera-se from Arabidopsis Thaliana leaves of Enkheim race and it3 raytant3 5B/I5, triplex // Ibid.-P.123-121.

5. Бакаева Н.П., Бабадпзнова M.A. Очистка РфИ из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта .Дуплекс // Изв.АН ТадаССР. Отд-ние биол.наук.- 1984 .-.'М .-С. 50-55.

6. Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П. Рибозофосфатизомераза листьев исходных и мутантпнх форм растений различающихся по продуктивности // Всесоюзный симпозиум ."Связь метаболизма углерода и азота при фотосинтезе": Тез.докл.-Пущино, 1985.-С.100.

7. Бакаева Н.П., Буянова Н.Н. Исследование рибозофосфат-изомеразы высших растений методом диск-электрофореза // Республиканская конференция молоднх ученых и специалистов Таджикистана: Тез.докл.-Душанбе. I985.-4.I.-C.I20.

8. Bakaeva II.P., P.abadjanova M.A. Influence of pil on activity of ribosool.osohateisomerase of Arabido)si3 Thaliana and 5G/I& // Arabidopsis Infcr-istion 3 arvico.-Frarkfurt air. ;.;ain,

9. Бакаева Н.П.. Еабэдклнова M.A. Регуляция активности ри-бозофосфатизомеразы рибулозобнсфосфатом // 1У Конференция бяо-хи?ликов республик Средней Азии и Казахстана: Тез.докл. -Ашха-

бад, 1986.-С.234.

10. Бакаева Н.П., Еабз_.->шнова М.А. Влияние pH на активность рибозофосфатизомаразп из листьев исходных и мутантных форм хлопчатника и арабидопсиса // Биохимия.-1936.-Т.51, Jé б. -С.926-930.

11. Бабадманова 1.1.А., Бакаева II.П. Четвертичная структура и некоторые свойства рибозофосфатизомерази из листьев арабидопсиса расы Энхайм и ого мутантов триплекс, 58/15 // Биохимия; -1987.-Т.52, ¡i I.-С.146-153.

12. Бакаева II.П., Бабаджаноиа М.А. Влияние рибуиозобис-фосфата на активность рибезофосфатизомеразы // Докл. АН ТпдаССР.-1988.-Т.31, Jí G.-С.415-418.

13. Бабадканова М.А., Бакаева П.П., Алиев К.А. Влияние субстратов и температуры на активность фосфорибулокиназы из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс // Докл. АН ТаджССР.-1939.-Т.32, » Ю.-С.702-705.

14. Бабадканова H.A., Бакаева Н.П., Алиев К.А. Влияние З-фосфоглицериновой кислоты на активность рибозофосфатизомера-зы и фосфорибулокиназы листьев хлопчатника сорта 108-Ф // Докл. АН ТаджССР.-1990.Т.33 № I.-G.57-C0.

15. Бакаева H.H. рН-зависимыа изменения и роль сульфгид-рильных групп в проявлении активности фосфорибулокиназы хлопчатника // У Конференция биохимиков республик Сродной Азии и Казахстана: Тез.докл..-Ташкент, 1991.-С.148.

16. Бакаева H.I1. Зависимые изменения в проявлении активности фосфорибулокиназы хлопчатника // Конференция профессорско-преподавательского состава ТГУ: Тез.докл.-Дуванбе, 1991.

—С .28. \

17. Бабаджанова М.А., Бакаева II.П. Регуляция активности рибозофосфатизомеразы и фосфорибулокиназы метаболитами цикла Кальвина // П Всесоюзный съезд общества физиологов растений (Минск, сент. 1990г.): Тез.докл.-Москва, 1992.-Ч.2.-С.17.

18. Бакаева К.П., Лебедева Г.II. Изучение .активностей рибозофосфатизомеразы и фосфорибулокиназы хлопчатника в двух-формеьтном комплексе // Хончеренщп прорессореко-преподагатель-ского состава ТГУ: Тез.дзкл.-Лу-;э.чбг, IS£'3.-C.?-í.

19. Da•:лова Н.П., Баблдуанова 'I.A., Лебедева Г.П. Ьух-.¡ормпитпкй ко:/.Л1«-ке рабозо*ос'лтизо.',ер:>г>ы и íocjo; 'иСулокинг.-зн аз .чготгеъ хлопчатника сорт.-. -7 Тя.м т.-..-3.75.

20. Лебедева Т.П., Бакаева 11.11. Активация фосфорибулоки-нази метаболитом предшественником // Там же.-С.76.

21. Бакаева И.О., Бабядканоьа М.А., Лебедева Г.П., Исследование фермент-ферментных взаимодействий на примере РФИ и ФРК хлопчатника // Там же.-С.77.

22. Бабаджанова М.А., Бакаева ПЛ., Лебедева Т.Н., Бабаджанова М.Ч., .Лирзорахимов А,К. Проявление рибулозобисфосфаткар-бикоильзой-оксигиназоЯ других фержнгативных актинносгей // Там же.- С.70.

23. Бабаджанова М.А., Бакчеьа 11.П., Лоб-здевч Р.II. Днух-формонтлый комплекс рибозофос^атизомерчзы а фосфорибулокиьазы из листызи пшеницы сорта Ленинградка /./ I Конференция баохиаи-ков Таджикистана: Тез.докл.-Душанбе, I993.-C.I0.

24. Габицжанова М.Л., Лебедева Г.П., Мариорахиыои А,К., Бабадх-пюва М.11., Бакаева И.И. функциональный мультиферментниЯ комплекс цикла Кальвина // Там че.-С.И.

25. Бакаева II.П. Митчболитная регуляция активности ферментов фотосинтеза рнбозофосфатизомерази и фосфорибулокинази // Там «о.-С,13.

26. Еабадканова М.А., Мирзорихи:«юв А.К,, Бакаеьа И.П., Лебедева Г.П. Мнокистиешшв молекулярные формы рибулозобис£ос-фзткарбоксилазы из листьев хлопчатника // Докл. А!1 ТадаССР. -I993.-T.36, » 3.-С.230-233.

27. Бакаииа Н.П. Субстратная стабилизация сульфгидриль-ных групп фармеитоп рибозофосфатизомэразы и фосфорибулокиназы // Конференция профессорско-преподавательского состава ТРУ: Тез.докл. Естеств,науки.:-Душанбе, I994.-C.73.

2Ь, Бакаева Н.П., Бабадаонова И.А., Мирзорахимов А.К. Определение ионизируицихся групп активных центрои фосфорибулокиназы и риСулозобисфосфаткарбоксилазы хлопчатника // Та* во. -С.74.

29. Бакаева Н.П, Влияние рН реакционной среди ызнса-мальнуи скорость фосфорибулоки !азно1 реакция а сродство *РК к субстрату Ру51>. // Таи яг,.- '.'5.

30. Ьабчдханэвд М.П., Мирзорахвмов А.л., Бакаьда Н.П. Изучение .жтпзноети Р.И, ¿РК и ?Г.1Л0 хлопчатника ир-л рльллчних условиях хранкШ цропаратой // Таи »е.-С.Тб»

31. Мирзорахимов А.К., Бакаева H.H., Бабадканова М.Л. Исследование условий проявления высокой активности ферментов РФИ, £'РК и РБФХО хлопчатника сорта 100-Ф // Там же.-С.77.

32. Бакаева Н.П., Лебедева Г.П. Влияние рябозофосфатизоме-разы и-рибозо-5-фосфата на проявление активности фосфорябулоки-назы хлопчатника // Вестник Таджикского госуниверситета.-1994. -» I»-С»47-53.

33. Бакаева II.П., Бабаджанова М.А. Ионизирующиеся группы активного центра фосфорибулокиназы хлопчатника // Докл. АН Тадж.ССР.-19Ь'5.-Т.38, № II-I2.-C.73-77. (В печати).

34. Бакаева Н.П, Ыультиферментный комплекс цикла Кальвина // Конференция Ассоциации "Еиии'яны науки Таджикистана": Тез. докл.-Душанбе, I99S.-C.I3.

.lOiTl-lOnC г.Зпказ 25.Т|'р(ок 100 экз.

Ротапринт 1 ГУ,Душо»1бо(у;:.Лл2>"ТН 2.

Информация о работе

Бакаева, Наталья Павловна
доктора биологических наук
Душанбе, 1996
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Структурно-функциональные особенности мультиферментного комплекса цикла Кальвина ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные особенности мультиферментного комплекса цикла Кальвина"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональные особенности мультиферментного комплекса цикла Кальвина
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия