Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение генетических факторов риска развития и эффективности терапии параноидной шизофрении

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение генетических факторов риска развития и эффективности терапии параноидной шизофрении"

На правах рукописи

Т

ЗАКИРОВ ДЕНИС ФИЛАРИСОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ РИСКА РАЗВИТИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ ПАРАНОИДНОЙ ШИЗОФРЕНИИ

03.02.07 - генетика

1 9 2013

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2013

005544181

Работа выполнена на кафедре генетики и фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО Башкирского государственного университета совместно с лабораторией молекулярной генетики человека ФГБУН Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель:

Хуснутдинова Эльза Камилевна Доктор биологических наук, профессор

Научный консультант:

Валинуров Ринат Гаянович

Официальные оппоненты:

Бахтиярова Клара Закиевна

Спицын Виктор Алексеевич

Доктор медицинских наук, профессор главный врач ГУЗ Республиканской психиатрической больницы №1 Минздрава Республики Башкортостан

Доктор медицинских наук, профессор кафедры неврологии с курсами нейрохирургии и медицинской генетики ФГБОУ ВПО Башкирского государственного медицинского университета Минздрава России

Доктор биологических наук, профессор зав. лабораторией экологической генетики ФГБУ Медико-генетического научного центра РАМН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Защита диссертации состоится «J5» (^HOljiJj 2013 г. в « часов на заседании диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: Уфа, пр. Октября, 71; с электронной версией автореферата - на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН: ibg.anrb.ru

e-mail: molgen@anrb.ru.

«/5»

Автореферат разослан « РСОЛУМ 2013г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.б.н --------- С.М. Бикбулатова

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Заболевание шизофренией поражает около 1% населения, при этом начало заболевания приходится, как правило, на молодой возраст, что нарушает общественную, профессиональную активность пациента, накладывает значительное бремя на семью и общество. Этиология шизофрении до конца не выяснена. Условия окружающей среды, безусловно, вносят вклад в развитие шизофрении, но определяющим фактором является генетическая предрасположенность: шизофрения наследуется в более чем в 80% случаев, что характерно для наиболее высоко наследуемых многофакторных заболеваний (Cardno et al., 2000; Sullivan et al., 2003).

Многочисленные молекулярно-генетические исследования показали, что развитие психических заболеваний опосредовано межгенными и ген-средовыми взаимодействиями. К настоящему времени учеными из разных стран выявлено небольшое число генов, демонстрирующих более или менее доказанную связь с риском развития шизофрении (Steinberg et al., 2011; Williams et al., 2011; Peerbooms et al., 2012; Kang et al., 2012; Walton et al., 2013; Zhang et al. 2013; Hamshere et al.", 2013; Kukshal et al., 2013; Ni et al., 2013).

Ответ на терапию нейролептиками у больных шизофренией неоднозначен. Это свидетельствует о важном значении поиска факторов, предсказывающих степень эффективности ответа на нейролептики и побочные эффекты в лечении шизофрении, для оптимизации лечения (Nnadi, Malhotra, 2007). В результате фармакогенетических исследований рядом зарубежных ученых идентифицированы некоторые маркеры эффективности, переносимости и развития побочных эффектов при приеме нейролептиков (Cacabelos et al., 2011; Zhang et al., 2011).

Таким образом, молекулярно-генетическое исследование шизофрении, а также поиск генетических предикторов ответа на нейролептики имеет огромное значение для создания стратегии раннего выявления и своевременного медицинского и психосоциального вмешательства.

Цель работы - изучение генетических маркеров риска развития и эффективности терапии параноидной шизофрении в Республике Башкортостан. Задачи исследования: 1. Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных локусов гена, кодирующего ЫЯ2В-субъединицу глутаматного NMDA-рецептора (GRIN2B'), гена, кодирующего субъединицу 2 каинатного рецептора глутамата (GRIK2'), гена, регулирующего сигнальную активность G белка 2 типа (RGS2% гена, кодирующего GLUR2 субъединицу АМРА-рецептора глутамата (GRIA2) у больных параноидной шизофренией и индивидов контрольной группы.

2. Исследование полиморфных локусов, ассоциированных с шизофренией по данным полногеномных анализов и локализованных в областях 12р 13.33 (САСШ1С), 6р.22.1 (НКИШАв), 10ц21 {АЫКЗ), Зр21.1 (1Т1Н4), у больных параноидной шизофренией и индивидов контрольной группы.

3. Анализ ассоциации исследованных полиморфных локусов с развитием параноидной шизофрении с учетом этнической принадлежности и ответом на терапию препаратом «галоперидол».

4. Исследование межгенных взаимодействий, предрасполагающих к развитию параноидной шизофрении.

Научная новизна исследования. Впервые в этнических группах русских и татар из Республики Башкортостан охарактеризованы частоты генотипов и аллелей 22 полиморфных локусов 8 генов ЯСБ2, ОИШВ, БШК2, С А СЫА / С, Н1БТ1Н2АС, АЫКЗ, 1Т1Н4, США2. Выявлены генетические маркеры повышенного и пониженного риска развития параноидной шизофрении (ПШ) в этнических группах русских и татар. Установлены модели межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов ЛС52, АЫКЗ, СШК2 и СКШ2В у больных параноидной шизофренией русской этнической принадлежности. Определены фармакогенетические маркеры ответа на терапию галоперидолом и развития нейролептического паркинсонизма у больных ПШ, русских и татар.

Научно-практическая значимость работы. Результаты работы вносят вклад в общее представление о генетических основах предрасположенности к шизофрении и послужат шагом в понимании механизмов различной чувствительности к нейролептикам у больных шизофренией, в создании генетических предикторов ответа на нейролептики, повышении эффективности терапии и минимизации побочных эффектов, что, в конечном итоге, улучшит качество жизни больных шизофренией. Данные диссертационной работы могут послужить основой для разработки адекватных лечебно-профилактических мероприятий, а также могут быть использованы в преподавании спецкурсов по медицинской генетике на медицинских и биологических факультетах, на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Апробация диссертации. Материалы диссертационной работы были представлены на ежегодных международных конференциях Европейского общества генетики человека (Нюрнберг, 2012; Париж 2013), международных конгрессах Европейской коллегии по нейропсихофармакологии (Париж, 2011; Вена, 2012), II Всероссийской школе-конференции молодых ученых по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 146 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и библиографического списка, который включает 263 источников. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 48 рисунками.

Благодарность. Автор выражает глубокую благодарность научному сотруднику лаборатории молекулярной генетики человека ИБГ УНЦ РАН, к.м.н. Гареевой А.Э. за неоценимую помощь в проведении совместных исследований, обсуждении и интерпретации полученных результатов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы исследования. В исследовании приняли участие 251 больной с диагнозом параноидной шизофрении (F.20.0xx) согласно международной классификации болезней (МКБ-10) различной этнической принадлежности: 108 русских (48 женщин и 60 мужчин) и 143 татарина (67 женщин и 76 мужчин), находящихся на лечении в Республиканской психиатрической больнице № 1 г. Уфы. Средний возраст больных составлял 42,9±11,1 лет. Контрольная группа включала в себя 252 добровольца - 99 русских (42 женщины и 57 мужчин) и 153 татар (68 женщин и 85 мужчин). Средний возраст здоровых доноров составлял 32,4±12,4 лет. От каждого больного было получено подписанное информированное согласие. Данное исследование было одобрено локальным биоэтическим комитетом ИБГ УНЦ РАН. Эффективность типичного нейролептика - галоперидола у больных с ПШ оценена по шкале позитивных и негативных синдромов (PANSS). Шкала PANSS позволяет проводить стандартизированную оценку различных векторов психопатологической симптоматики шизофрении: позитивной (POSIT), негативной (NEGAT) и общей психопатологической симптоматики (PSYCH); определять клинический профиль больного и прослеживать динамику состояния в процессе терапии (Тиганов с соавт, 1999). Эффективность терапии и развитие побочных эффектов оценивали в 1-й день назначения препарата, а затем на 21-й и 45-й дни. Экстрапирамидный синдром (ЭПС) является побочным эффектом, наблюдаемым у 20-30% больных шизофренией при длительном приеме типичных нейролептиков (Zai et al., 2007; Bakker et al., 2008). Критерием развития ЭПС, вызванного приемом нейролептиков, послужило наличие балла свыше 3 по шкале SAS.

Методы исследования. ДНК выделяли из периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984). Анализ полиморфных маркеров генов RGS2, GRIN2B, GRIK2 осуществляли методом ПЦР - ПДРФ с последующим электрофоретическим разделением фрагментов в 7-8% полиакриламидном геле и визуализацией в ультрафиолетовом свете.

Полиморфные локусы генов CACNA1C, HIST1H2AG, ANK3, IT1H4, GRIA2 были исследованы с помощью ПЦР с флюоресцентной детекцией (FLASH/RTAS) (ФГУГТ «ГосНИИгенетика», Москва).

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных программ: MS Office Excel 2007 (Microsoft), Statistica v.6.0 (StatSoft), BIOSTAT (AnalystSoft). При попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и контроля использовался двусторонний тест Фишера. Сила ассоциаций оценивалась значениями показателя отношения шансов Odds Ratio (OR). Расчет показателя D', используемого для оценки неравновесия по сцеплению пары полиморфных локусов, а также определение частот гаплотипов в изученных выборках с помощью ЕМ-алгоритма осуществлялся с помощью программы Haploview v. 4.1 (Barrett et al., 2005). Анализ межгенных взаимодействий проводили с помощью программ MDR (Ritchie et al., 2001), GMDR (Lou et al., 2007; Chen et al, 2011), PLINK (http://pngu.mgh. harvard.edu/~purcell/plink/index.shtml). Анализ ассоциации генотипов (аллелей) изученных локусов со средними значениями по шкалам PANSS и SAS у больных ПШ, русских и татар, проведен с использованием однофакторного дисперсионного анализа - ANOVA (пакет прикладных программ «SPSS v. 13.0») для идентификации генетических маркеров индивидуальной чувствительности к нейролептикам.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ ассоциации полиморфных локусов rs2 746071, rs2746072, rs2 746073, rs4606, rs3 767488 гена RGS2 с риском развития параноидной шизофрении и ответом на галоперидол

Ген RGS2, регулирующий сигнальную активность G белка 2 типа, локализован на lq31 и состоит из 5 экзонов и 4 интронов. (Roy et al., 2003).

Изучением семейства генов, регулирующих сигнальную активность G-белка RGS, занимаются многие лаборатории, поскольку эти гены модулируют трансдукцию сигнала рецепторов нейротрансмиттеров, играющих роль в патогенезе шизофрении (De Vries et al., 2000; De Blasi et al, 2001; Rethelyi et al., 2010; Okahisa et al., 2011). Была показана роль гена RGS2 в модуляции активности рецепторов - мишеней для большинства нейролептиков (Yalcin et al., 2004; Bakker et al, 2008).

Сравнительный анализ распределения частот генотипов и аллелей изученных полиморфных локусов гена RGS2 показал, что частота генотипа RGS2*G/G (rs2746071) была статистически значимо выше у больных как татарской (р=0,0005; OR=4,88; 95%С1 2,55-9,35), так и русской этнической принадлежности (р=0,001; OR=4,08; 95%С1 1,67-9,89) по сравнению с соответствующим контролем (Рисунок 1, 2). Частота генотипа RGS2*A/A (rs2746071) у больных татар (р=0,0001; OR=Q,39;

95%С1 0,24-0,63) и русских (р=0,001; СЖ=0,36; 95%С1 0,21-0,64) статистически значимо ниже частот в группе соответствующего контроля (Рисунок 1, 2). Также показано, что аллель является аллелем риска развития ПШ у татар

(р=0,0005; (Ж=2,51, 95%С1 1.80-3,49) и русских (р=0,00003; СЖ=2,37; 95%С1 1,593,56) (Рисунок 1,2).

I

Г

II II

СЖ=2,51 \

I I III

*.4/*4 *.4/*с »с/*о *Л

Контроль ■ Больны«

Контроль ■ Больные

Рисунок 1. Распределение частот Рисунок 2. Распределение частот аллелей

аллелей и генотипов («2746071) гена и генотипов («2746071) гена у лиц с

ЯОБ2 у лиц с ПШ и индивидов ПШ и индивидов контрольной группы,

контрольной группы, русских по татар по этнической принадлежности этнической принадлежности

Частота аллеля ЯС82*А статистически значимо ниже у больных ПШ татарской (р=0,0005; 011=0,39, 95%С1 0,29-0,55) и русской этнической принадлежности (р=0,00003; СЖ=0,42; 95%С1 0,28-0,63) (Рисунок 1, 2). Статистически значимых различий в распределении частот генотипов и аллелей локусов гв2746072, «2746073, «4606, «3767488 гена ЯСЖ между больными и здоровыми индивидами русской и татарской этнических групп выявлено не было.

Сравнительный анализ распределения частот гаплотипов гена 1Ю82 показал, статистически значимое повышение гаплотипа 1Ю82*АСТСТ гена в группе

здоровых русских (р=0,0001; (Ж=0,38; 95%С1 0,26-0,57) и татар (р=0,0001; СЖ=0,44; 95%С1 0,32-0,61) чем у больных ПШ (Рисунок 3, 4).

I

И I

• Контроль ■ Больные

Рисунок 3. Распределение частот гаплотипов («2746071, «2746072, «2746073, «4606 и «3767488) гена Яв82 в выборках лиц с ПШ и индивидов контрольной группы, русских по этнической принадлежности

.О .0 л

- Коятрачь и Бппкы»

Рисунок 4. Распределение частот гаплотипов («2746071, «2746072, «2746073, «4606 и «3767488) гена 1^82 в выборках лиц с ПШ и индивидов контрольной группы, татар по этнической принадлежности

Напротив, частота гаплотипа RGS2*GGTCT гена RGS2 оказалась статистически значимо выше у больных русских р=0,0001; OR=21,47; 95%С1 6,5969,95) и татар (р=0,0001; OR=18,72; 95%С1 6,69-52,31) по сравнению с соответствующим контролем (Рисунок 3, 4).

Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) выявил статистически значимые отличия в средних значениях баллов по подшкале NEGAT21 (F=2,93; р=0,030) у носителей разных генотипов локуса rs4606 гена RGS2 за счет понижения средних значений у больных татар, несущих генотип RGS2*C/C, по сравнению с больными, несущими генотип RGS2*G/G (Р=0,018) (Рисунок 5).

Среднее NEGAT21

Рисунок 5. Показатели средних значений баллов по шкале NEGAT21 у носителей разных генотипов по полиморфному локусу rs4606 гена RGS2 у больных ПШ татарской этнической группы

Были выявлены статистически значимые отличия в средних значениях баллов по шкале SAS21 у носителей разных генотипов по полиморфным локусам rs2746073 (F=3,08; р=0,030), rs4606 (F=4,52; р=0,010), rs2746071 (F=3,87; p=0,030) гена RGS2 y русских, что позволило установить генетические маркеры повышенного риска развития нейролептического паркинсонизма (НП) у русских больных ПШ при приеме галоперидола: RGS2*T/T rs2746073 (р=0,040) (Рисунок 6а), RGS2*C/C rs4606 (р=0,010) (Рисунок 66), RGS2*A/A rs2746071 (р=0,024) (Рисунок 6в).

ТТ GG

AT Я^^^Н CG

ГТ| 0 2 4 6 Щ 0 2 4 6 [~7"|

0 2 4

Рисунок 6. Показатели средних значений баллов по шкале SAS21 у носителей разных генотипов по полиморфному локусу rs2746073 гена RGS2 у больных ПШ русской этнической группы (а); по полиморфному локусу rs4606 гена RGS2 у больных ПШ русской этнической группы (б): по полиморфному локусу rs2746071 гена RGS2 у больных ПШ русской этнической группы (в).

Таким образом, генетическими маркерами повышенного риска развития ПШ у русских и у татар являются генотип RGS2*G/G и аллель RGS2*G (rs2746071)

гена RGS2 и гаплотип RGS2*GGTCT (rs2746071, rs2746072, rs2746073, rs4606, rs3767488) гена RGS2. Генетическими маркерами пониженного риска развития ПШ у русских и у татар являются генотип RGS2*A/A, аллель RGS2*A (rs2746071) гена RGS2 и гаплотип RGS2*AGTCT (rs2746071, rs2746072, rs2746073, rs4606, rs3767488) гена RGS2. Генетическими маркерами эффективности терапии ПШ галоперидолом в отношении негативной симптоматики является генотип RGS2*С/С (rs4606) у татар. Генотипы RGS2*T/T (rs2746073), RGS2*C/C (rs4606), RGS2*A/A (rs2746071) являются генетическими маркерами повышенного риска развития НП у больных ПШ при приеме галоперидола, русских по этнической принадлежности.

Полученные нами результаты совпадают с данными других авторов, которые показали, что имеется ассоциация полиморфных локусов гена RGS2 с возникновением экстрапирамидных расстройств, вызванных нейролептиками, у евреев (Bakker et al., 2008). Эти же авторы обнаружили протективный эффект аплеля RGS2*G функционального полиморфного локуса rs4606, находящегося в З'-области гена RGS2, при развитии ЭПС во время приема нейролептиков у афроамериканцев и европейцев (Greenbaum et al., 2009).

Анализ ассоциации полиморфных локусов rs2227281, rs2227283, rs2235076, rs995640 гена GRIK2 с риском развития параноидной шизофрении и ответом на галоперидол

Ген, кодирующий субъединицу 2 каинатного рецептора глутамата GRIK2 (6q 16-21) локализован в области, сцепленной с шизофренией (Bah et al., 2004).

Проведенный сравнительный анализ распределения частот генотипов и аллелей полиморфных локусов rs2227281, rs2227283, rs2235076, rs995640 гена GRIK2 между группами больных и здоровых, русских и татар, статистически значимых различий не выявил.

При проведении гаплотипического анализа был сконструирован один гаплотипический блок на основе 4-х полиморфных локусов rs995640, rs2227281, rs2227283, rs2235076 гена GRIK2, находящихся в неравновесии по сцеплению в этнической группе русских (D'>0,73). При оценке частот гаплотипов гена GRIK2 у татар было выявлено неравновесие по сцеплению между маркерами блока 1 rs995640, rs2227281, rs2227283 (D'>0,75) и между маркерами блока 2 rs2227281, rs2227283, rs2235076 (D'>0,59). В результате проведенного гаплотипического анализа было обнаружено статистически значимое повышение частот гаплотипов GRIK2*АTG (р=0,021, OR=3,51, 95%С1 1,24-9,83) (блок 1) и GRIK2*TGG (р=0,025, OR=3,12, 95%С1 1,19-8,16) (блок 2) в группе больных татарской этнической принадлежности, чем у здоровых индивидов (Рисунок 7). Частоты остальных гаплотипов были схожи у больных ПШ и здоровых индивидов, русских и татар.

0.5 0.4 OJ

ол ол

II

OR=3,5

II

■ ■ --

V

Ни..

OR-3,12

-.О »с

И

3 Больные

га

™ Контроль ■ Больные

Рисунок 7. Распределение частот гаплотипов полиморфных локусов в блоке 1 («995640, «2227281, «2227283) и блоке 2 («2227281, «2227283, «2235076) гена йЯ1К2 в выборках больных ПШ и индивидов контрольной группы татарской этнической принадлежности, а - блок1, б - блок 2.

Анализ вариаций АГ^ОУА выявил статистически значимые отличия в средних значениях баллов по подшкале ^ОАТ21 (Р=4,30; р=0,015) у носителей разных генотипов локуса ге995640 гена ОШК2 за счет повышения средних значений баллов у больных ПШ татарской этнической принадлежности, имеющих генотип СШК2*А/А по сравнению с носителями генотипа СМК2*АЮ (Рисунок 8). Кроме того, выявлено повышение средних значений баллов по подшкале ЖОАТ21 (Р=6,68; р=0,002) у больных ПШ русской этнической принадлежности, имеющих генотип СЯ1К2*Т/Т по сравнению с носителями генотипа СЮК2*С/С (гз2227281) гена вШК2 (Рисунок 9).

Среднее NEGAT2I

Среднее NEGAT21

Рисунок 8. Показатели средних значений баллов по подшкале КЕОАТ21 у носителей разных генотипов («995640) гена СШК2 у больных ПШ татарской этнической принадлежности

Рисунок 9. Показатели средних значений баллов по подшкале ЫЕОАТ21 у носителей разных генотипов («2227281) гена СШК2 у больных ПШ русской этнической принадлежности

На настоящий момент данных об ассоциации изученных полиморфных локусов гена GRIK2 с развитием шизофрении не существует, однако имеются данные об ассоциации ряда полиморфных локусов гена GRIK2 с другими психическими заболеваниями (Sampaio et al., 2011; Smith et al., 2011; Myung et al., 2012).

Результаты настоящего исследования показали, что носительство гаплотипов GRIK2*ATG и GRIK2*TGG гена GRIK2 является фактором, повышающим риск развития ПШ в исследованной группе татар. Кроме того, было

определено, что генотипы вШК2*А/А (ге995640) у татар и СЛ/АГ2*77Т (гс2227281) у русских являются генетическими маркерами низкой эффективности галоперидола в отношении негативной симптоматики.

Анализ ассоциации полиморфных локусов гв6536221, г*4441НО4, п4302506 гена СИ1А2 с риском развития параноидной шизофрении и ответом на галоперидол

Ген СЮА2 локализован в области 4ц32-33, сцепленной с риском развития шизофрении по данным полногеномных исследований (Ек1ю1т е1 а1., 2003; Мс1птз е1 а1., 2003). Анализ ассоциаций выявил статистически значимое повышение частоты генотипа СМА2*Т/Т (ге43025506) гена вНШ (р=0,034; (Ж=0,34; 95%С1 0,13-0,88) у больных татарской этнической принадлежности по сравнению со здоровыми индивидами (Рисунок 10). Сравнительный анализ распределения частот генотипов и аллелей полиморфных локусов ге6536221, ге4441804 гена США2 между группами больных и здоровых, русских и татар, статистически значимых различий не выявил.

При проведении гаплотипического анализа у русских был сконструирован один гаплотипический блок на основе 3 полиморфных локусов гз6536221, гв4302506, гв4441804 гена СЯ1А2, находящихся в неравновесии по сцеплению (0'>0,61). В то же время, сильное неравновесие по сцеплению было выявлено между маркерами ге6536221 и ге4302506 (0'=0,91) (блок 1) и между маркерами ге4302506 и ге4441804 (0'>0,91) (блок 2) в группе больных и здоровых татар.

В результате проведенного гаплотипического анализа в группе больных, русских по этнической принадлежности, было обнаружено статистически значимое повышение частоты гаплотипа США2*ССС (р=0,001; ОЯ=9,вО; 95%С1 2,10-43,76) по сравнению с соответствующим контролем (Рисунок 11). Напротив, частота гаплотипа СЯ1А2*ССТ (р=0,013; СЖ=0,481; 95%С1 0,27-0,85) достоверно чаще встречалась у здоровых русских (Рисунок 11).

= II ИТ III.

•о-с *ст т/т «с т

■ Контроль "Больные

Рисунок 10. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса rs4302506 гена GRIA2 у лиц с ПШ и индивидов контрольной группы, татар по этнической принадлежности

0,3

' II

" || / \

О II НН - ■ -Ж

•С'Г'С *с*с*т г*г*г *с*г*т *с~с*с

■ Контроль " Больные

Рисунок 11. Распределение частот гаплотипов (ге4441804, ге6536221, гэ4302506) гена ОЯ1А2 в выборках лиц с ПШ и индивидов контрольной группы, русских по этнической принадлежности

Анализ вариаций ANOVA выявил статистически значимые отличия средних значений баллов по подшкале NEGAT21 (F=3,95; р=0,022) у носителей разных генотипов локуса rs4441804 гена GRIA2 в группе лиц с ПШ русской этнической принадлежности. При введении поправки Бонферрони на множественные сравнения, было выявлено статистически значимое повышение средних значений баллов по подшкале NEGAT21 у русских больных, имеющих генотип GRIA2*C/C, по сравнению с носителями генотипа GRIA2*C/T (р<0,05) и GRIA2*T/T (р<0,05) (Рисунок 12). Кроме того, выявлено повышение средних значений баллов по подшкале POSIT21 (F=4,28; р=0,016) у больных русской этнической принадлежности, имеющих генотип GRIA2*C/C, по сравнению с носителями генотипа GRIA2*C/T (р<0,05) и GRIA2 *Т/Т (р<0,05) (rs4441804) гена G RIA 2 (Рисунок 13). В результате проведенного однофакторного дисперсионного анализа статистически значимых отличий в средних значениях баллов по шкалам PANSS и SAS между носителями разных генотипов по полиморфным локусам rs4441804 гена GRIA2 у татар и rs4302506 гена GRIA2 у русских и татар выявлено не было.

Сроднее NECAT21 Среднее POS1T21

Рисунок 12. Показатели средних значений Рисунок 13. Показатели средних значений

баллов по подшкале негативной баллов по подшкале позитивной

симптоматики ЫЕОАТ21 у носителей симптоматики Р081Т21 у носителей

разных генотипов (ге4441804) гена GRIA2 разных генотипов (ге4441804) гена GR¡A2

у больных ПШ русской этнической у больных ПШ русской этнической

принадлежности принадлежности

Исследования, посвященные изучению ассоциации полиморфных вариантов гена GRIA2 с риском развития шизофрении и индивидуальной чувствительностью к типичным нейролептикам, единичны и неоднозначны. На настоящий момент не существует данных, подтверждающих ассоциацию полиморфных локусов ге6536221, ге4403097, ге4441804, ге4302506 гена GRIA2 с шизофренией (Ма^ е1 а1„ 2008, СпваАдШ ег а!., 2012).

Результаты настоящего исследования показали, что носительство генотипа GRIA2*T/T (ге4302506) является фактором, понижающим риск развития ПШ у татар. Генетическим маркером низкой эффективности галоперидола в отношении негативной и позитивной симптоматики является генотип GR1A2*C/C полиморфного локуса ге4441804 гена GR1A2 у русских.

Анализ ассоциаций полиморфныхлокусов «1805502, гя1805476, г*1805247, п1805482, ^7301328, ^343 ¡5573 гена GRÍN2B с риском развития параноидной шизофрении и ответом на галоперидол

Многочисленные исследования по изучению ассоциации полиморфных вариантов гена СЛ/Л^В (12р13.1), кодирующего N1*213 субъединицу ^МА рецептора глутамата, с риском развития ПШ и с индивидуальной чувствительностью к типичным нейролептикам показали ассоциацию ряда полиморфных локусов с развитием шизофрении (ОЫвиИ et а!., 2001; М1уа1аке е{ а!., 2002; 01 Мапау е1 а]., 2004; От е1 а1„ 2005; МаПиса е1 а1„ 2006).

Сравнительный анализ распределения частот генотипов и аллелей по изученным полиморфным локусам гена СЯШ2В в выборках больных русских и татар выявил, что частота генотипа СЯШ2В*Т/Т (ге1805247) была статистически значимо выше как у больных татарской (р=0,003; (Ж=2,33; 95%С1 1,34-4,04), так и русской этнической принадлежности (р=0,038; (Ж=2,12; 95%С1 1,09-4,11) по сравнению с соответствующим контролем. Частоты генотипов («1805247) СЯШ2В*С/Т (р=0,029; СЖ=0,52; 95%С1 0,29-0,91) и ОиЮВ*С/С (р=0,029; СЖ=0,08; 95%С1 0,01-0,66) у больных татар с ПШ были статистически значимо ниже таковых в группе контроля. Кроме того, было показано статистически значимое повышение частоты аллеля СШШВ*Т (ге1805247) у больных татарской (р=0,001; СЖ=2,36; 95%С1 1,43-3,92) и русской этнической принадлежности (р=0,028; (Ж=2,03; 95% С11,11-3,69) (Рисунок 14).

0.9

0.3

0,7 0,6

2,12 ^ ^ок-:.

« 1 1> . Н I. 8

/ II I.

*СУ*Т *С/*С *Г *с +т/*т *с/*т *с/*с

■ Контроль "Больные б "Контроль "Больны«

□

Рисунок 14. Распределение частот аллелей и генотипов (гя1805247) гена ОЯШ2В у лиц с ПШ и индивидов контрольной группы, русских и татар по этнической принадлежности. Русские - а, татары - б.

Анализ ассоциации полиморфного локуса гв1805476 гена СЯШ2В с риском развития шизофрении показал статистически значимое повышение частоты генотипа СШЫ2В*А/А у больных ПШ, русских по этнической принадлежности (р=0,042; СЖ=2,12; 95%С11,07-4,21) по сравнению со здоровыми индивидами (Рисунок 15).

0,6

*Л/*А *Л *(* *С/*С " I *С

■ Контроль * Больные

Рисунок 15. Распределение частот аллелей и генотипов («1805476) гена йШШВ у лиц с ПШ и индивидов контрольной группы, русских по этнической принадлежности

Сравнительный анализ ассоциаций не выявил статистически значимых различий в распределении частот генотипов и аллелей по полиморфным локусам п>1805502, «1805482, «7301328, «34315573 гена вЯШВ между больными и здоровыми индивидами русской и татарской этнической принадлежности из РБ.

При оценке частот гаплотипов гена СШЫ2В сильное неравновесие по сцеплению между маркерами «1805502 и « 1805476 (Э'>0,90), и между «7301328 и «34315573 (В'~1) было получено как в группе больных и здоровых русских, так и в группе татар (Рисунок 16).

Рисунок 16. Неравновесие по сцеплению (О") между полиморфными локусами «1805502, «1805476, «1805247, «1805482, «7301328, «34315573 гена ОШМ2В в группе русских (а) и татар (б) по этнической принадлежности.

Анализ распределения частот гаплотипов показал, статистически значимое увеличение частот гаплотипов первого блока СВШ2В*ТАТС (р=0,018; (Ж=1,63; 95%С1 1,10-2,42) и ОиШВ *ССТС (р=0,046; (Ж=2,29; 95%С1 1,06-4,94) в этнической группе русских больных ПШ, по сравнению с соответствующим контролем. (Рисунок 17). Напротив, гаплотип первого блока СКШ2В*ТСТТ достоверно чаще встречался у здоровых русских, чем у больных (р=0,048; (Ж=0,58; 95%С1 0,36-0,97) (Рисунок 17). В этнической группе татар был обнаружен протективный маркер - гаплотип первого блока СЯШ2В*СССС (р=0,05; СЖ=0,55; 95%С1 0,31-0,97) (Рисунок 18).

0,5 0,4 03

од 0.1

, OR-1.63

OR-O.58

In.

II Ii !■ ..

■ Контроль ■ Больны f

* .

Рисунок 18. Распределение частот гаплотипов (гб 1805502, гв 1805476, гэ 1805247 и ге1805482) гена ОШЮВ в выборках лиц с ПШ и индивидов контрольной группы, татар по этнической принадлежности

Рисунок 17. Распределение частот гаплотипов («1805502, ге1805476, ге1805247 и ге1805482) гена ОиШВ в выборках лиц с ПШ и индивидов контрольной группы, русских по этнической принадлежности

Анализ вариаций АТЧОУА показал статистически значимые отличия в средних значениях баллов по шкале РАШБ21 (Р=5,049; р=0,008) за счет их повышения (Рисунок 19а) у носителей генотипа СЯШ2В*С/С (гэ1805502) по сравнению с носителями генотипов СКМ2В*С/Т (р=0,011) и СШЮВ*Т/Т (р=0,05); по подшкале Р8УСН21 (Р=4,037; р=0,02) за счет повышения средних значений баллов (Рисунок 196) у носителей генотипа 01Ш2В*С/С по сравнению с носителями генотипа СШтВ*С/Т (р=0,011); по подшкале ЫЕОАТ21 (Р=4,626; р=0,011) за счет повышения средних значений баллов (Рисунок 19в) у носителей генотипа СЯ1Ы2В*С/С (ге1805502), по сравнению с носителями генотипа СЮЮВ*С/Т{ р=0,015).

И'

100 150

И"

10 10 30

Рисунок 19. Показатели средних значений баллов по шкалам PANSS (а), PSYCH (б), NEGAT (в) у носителей разных генотипов по полиморфному локусу rsl 805502 гена GRIN2B у больных ПШ татарской этнической принадлежности.

Генетическими маркерами повышенного риска развития ПШ у татар являются

- генотип GRIN2B*T/T и аллель GRIN2B*T (rsl 805247) гена GRIN2B, у русских -генотипы GRIN2B*Т/Т (rsl805247) гена GRIN2B, GRIN2B*A/A (rsl805476), аллель GR1N2B*T (rsl805247), гаплотипы GR1N2B*TATC и GR1N2B*C.CTC (rsl805502, rsl805476, rsl805247, rsl805482 и rsl805482). Полученные результаты согласуются с данными Qin с соавторами и Li с соавторами, обнаружившими ассоциацию полиморфного локуса rsl805247 гена GRIN2B у китайцев (Qin et al., 2005; Li et al„ 2007). Генетическими маркерами пониженного риска развития ПШ у татар является

- гаплотип GRIN2B*CCCC (rsl805502, rsl805476, rsl805247, rsl805482, rsl805482). Генетическими маркерами низкой эффективности терапии шизофрении

галоперидолом у татар в отношении общей психопатологической симптоматики и в отношении негативной симптоматики является генотип GR1N2B*C/C(rsl805502). Анализ ассоциации полиморфных локусов rs4765905 гена CACNA1C, rs2239547 гена ITIH4, rsl0994359 гена ANK3, rs6913660 гена H1ST1H2AG с риском развития параноидной шизофрении и ответом на галоперидол При проведении полногеномного анализа ассоциаций (GWAS) в европейских популяциях была выявлена ассоциация полиморфных локусов rs4765905 гена CACNA1C (р=7,0х10"9), rs2239547 гена ITIH4 (р=7,8х10"9), rsl0994359 гена AN КЗ (р=2,5х10"8) (Ripke et al., 2011), rs6913660 гена HISTIH2AG (p=2,4xl0"8) с риском развития шизофрении (Shi et al., 2009).

Анализ ассоциации полиморфного локуса rs4765905 гена CACNA1C с риском развития параноидной шизофрении и ответом на галоперидол Ген а-субъединицы кальциевого канала L-типа (CACNA1C') локализован в области Зр21.1, сцепленной с риском развития шизофрении в европейских популяциях (Ripke et al., 2011). Полногеномное исследование, проведенное в рамках международного консорциума PGC, подтвердило результаты предыдущего, обнаружив ассоциацию гена CACNA1C с шизофренией у европейцев (Hamshere et al., 2013). Было выявлено статистически значимое повышение частоты генотипа CACNAIC*C/C гена CACNA1C (р=0,016; OR=2,32; 95%С1 1,22-4,42) у больных шизофренией, русских по этнической принадлежности, по сравнению со здоровыми индивидами (Рисунок 20). Сравнительный анализ ассоциаций не выявил статистически значимых различий в распределении частот генотипов и аллелей по полиморфному локусу rs4765905 гена CACNA1C между больными и здоровыми индивидами татарской этнической принадлежности.

Анализ вариаций ANOVA выявил статистически значимые отличия в средних значениях баллов по подшкале NEGAT21 (F=5,49; р=0,005) у носителей разных генотипов полиморфного локуса rs4765905 гена CACNA1C за счет повышения средних значений у больных татарской этнической принадлежности, несущих генотип CACNA1C*G/G, по сравнению с носителями генотипа CACNA !С*С/С (Рисунок 21).

4

I 1П

*С/*С *C/*G *G/*G *С IB Ктьныс П Контроль

I I

С реднее NEGAT21

яшшшшшш

Рисунок 20. Распределение частот Рисунок 21. Показатели средних значений аллелей и генотипов (г$4765905) гена баллов по подшкале ЫЕОАТ21 у носителей

CACNAIC у лиц с ПШ и индивидов разных генотипов (rs4765905) гена CACNAIC контрольной группы, русских по у больных ПШ, татар по этнической этнической принадлежности принадлежности

В результате данного исследования было показано, что носительство генотипа CACNAIC*C/C полиморфного локуса rs4765905 гена CACNAIC является фактором, повышающим риск развития шизофрении у русских (OR=2,32), что согласуется с данными, полученными в результате полногеномного анализа ассоциаций у европейцев (Ripke et al., 2011, Hamshere et al., 2013).

Кроме этого, было выявлено, что генотип CACNAIC*G/G является генетическим маркером низкой эффективности галоперидола у татар в отношении негативной симптоматики.

Анализ ассоциаций полиморфного локуса rs2239547 гена ¡TIH4 с риском развития параноидной шизофрении и ответом на галоперидол

Ген ингибитора тяжелой цепи 4 интер-альфа трипсина (ITIH4) локализован в области Зр21.1, сцепленной с риском развития шизофрении в европейских популяциях (Ripke et al., 2011). В результате анализа ассоциаций полиморфного локуса rs2239547 гена ITIH4 с риском развития параноидной шизофрении, не было выявлено ассоциации с риском развития данного заболевания ни в одной из изученных этнических групп, что не согласуется с данными проведенного полногеномного анализа ассоциаций полиморфного локуса rs2239547 гена ITIH4 у европейцев.

В то же время, в ходе данного исследования было выявлено, что генетическим маркером риска развития нейролептического паркинсонизма у татар является генотип 1Т1Н4*С/С гена ITIH4 (F=3,63; р=0,029) (Рисунок 22).

СГрелнее SAS21

11 ^ШЯШШЯШШШШШЯШ ( i яяшёшшяшшяёяшшшё сс ШШШЯШЯЯШШШЯШЁЁ^ШЯШШЯЯКЯЯВЯЯ

О 2 4 6 Я 10

Рисунок 22. Показатели средних значений баллов по шкале SAS на 21 оценочный день SAS21 у носителей разных генотипов по полиморфному локусу rs2239547 гена ITIH4 у больных ПШ татарской этнической принадлежности

Анализ ассоциаций полиморфного локуса rsl0994359 гена ANK3 с риском развития параноидной шизофрении и ответом на галоперидол

Ген ANK3 локализован в области 10q21.2, сцепленной с риском развития шизофрении (Athanasiu et al., 2010; Gella et al., 2011; Yuan et al., 2012), и играет интегративную роль в регуляции нейрональной активности (Logue et al., 2013). В результате проведенного анализа не было выявлено ассоциаций полиморфного локуса rsl 0994359 гена AN КЗ с развитием параноидной шизофрении ни в одной из

изученных этнических групп, что не согласуется данными проведенного полногеномного анализа, согласно которому обнаружена ассоциация полиморфного локуса rsl0994359 гена AN КЗ с ПШ у европейцев (Ripke et al., 2011). Различия в ассоциациях между определёнными генотипами и предрасположенностью к возникновению шизофрении в разных этнических группах обусловлены тем, что разные народы мира могут характеризоваться различным набором аллелей и, следовательно, соотношением факторов риска заболевания.

Кроме того, в ходе данного исследования генетических маркеров эффективности галоперидола по полиморфному локусу rsl 0994359 гена AN КЗ у русских и татар обнаружено не было.

Анализ ассоциаций полиморфного локуса rs6913660 гена HIST1H2AG с риском развития параноидной шизофрении и ответом на галоперидол Ген канонического гистона Н2А в кластере HIST1 (HIST1H2AG') локализован в области главного комплекса гистосовместимости1 (МНС1) 6р21-р22.1, сцепленной с риском развития шизофрении по данным полногеномных исследований (Shi et al., 2009; Stefansson et al., 2009). В результате проведенного анализа не было обнаружено ассоциации полиморфного локуса rs6913660 гена HISTIH2AG с развитием параноидной шизофрении и с эффективностью терапии галоперидолом ни в одной из изученных этнических групп, что не согласуется с данными проведенного полногеномного анализа ассоциации полиморфного локуса rs6913660 гена HIST1H2AG у европейцев.

Анализ межгенных взаимодействий, детерминирующих предрасположенность к развитию параноидной шизофрении В настоящей работе был проведен анализ межгенных взаимодействий 22 полиморфных локусов 8 генов в детерминации риска развития ПШ в этнических группах русских и татар из Республики Башкортостан. В результате анализа изученных генов были установлены две модели межгенных взаимодействий в этнической группе русских - RGS2*GRIN2B, ANK3'"GRIK2. Согласно полученным моделям были выявлены сочетания генотипов повышенного и пониженного риска развития ПШ (таблица 1).

В группе лиц с ПШ и контроле русской этнической принадлежности статистически значимой моделью определена комбинация из двух ДНК-локусов: RGS2 (rs2746071) и GRIN2B (rs34315573) (р=0,0107), взаимодействие которых детерминирует риск развития параноидной шизофрении (таблица 1). Тестируемая сбалансированная точность (Bal. Асс.) данной модели составила 0,64, чувствительность (Se) - 0,69, специфичность (Sp) - 0,58, воспроизводимость результата (CV Consistency) - 10/10.

К сочетаниям повышенного риска развития заболевания были отнесены 4 различных комбинации генотипов, из которых наиболее значимой является

п274б071*С/в и пч34315573*С/С (х2=12,31, р=0,0004, (Ж=7,85, С195% 2,26-27,18). К сочетаниям пониженного риска развития заболевания были отнесены 3 различных комбинации генотипов, из которых наиболее значимой оказалась п2746071*А/А и г.ч34315573*0/С (#=12,15, р=0,0005, (Ж=0,33, С195% 0,18-0,61) (таблица 1).

Таблица 1

Сочетания генотипов повышенного и пониженного риска развития

параноидной шизофрении у русских

Сочетание генов Сочетание и генотипов 12 Р (Ж 95%С1

аитв гх274607¡ЮЮ х г.ч34315573 *С/С 12,31 0,0004 7,85 2,26-27,18

п274б071*А/А х 12,15 0,0005 0,33 0,18-0,61

АЫКЗ* ОН1К2 гх 10994359*С/Т х к995640Ю/С 7,54 0,0068 13,67 1,65-112,92

гз10994359*Т/Т х п995640Ю/С 3,98 0,0450 0,20 0,04-0,92

В результате анализа информационной значимости полиморфных локусов данных генов в формировании предрасположенности к ПШ было выявлено, что наиболее значимый вклад вносит полиморфный локус «2746071 гена 1Ю52 (Н=6,01%). Менее выраженный вклад вносит полиморфный локус «34315573 гена ОМтВ (Н=0,55%).

При исследовании ген-генных взаимодействий изученных полиморфных локусов с помощью программы ОМОЯ определена двухлокусная модель взаимодействия ДНК-локусов: АЫКЗ («10994359) и ОиК2 («995640), приводящая к развитию ПШ в группе русских по этнической принадлежности (таблица 1). Тестируемая сбалансированная точность данной модели составила 0,57, чувствительность - 0,63, специфичность - 0,51, повторяемость результата - 10/10, достоверная значимость - р=0,0079.

К сочетаниям повышенного риска развития заболевания были отнесены 4 различные комбинации генотипов, из которых наиболее значимой оказалась г.чЮ994359*С/Гн п995640*С/С (#=7,54, р=0,0068, 011=13,67, С195% 1,65-112,92). К сочетаниям пониженного риска развития заболевания были отнесены 4 различных комбинации генотипов, из которых наиболее значимой оказалась г8Н)994359*Т/Т и г.ч995640*СЮ (#=3,98, р=0,0450, СЖ=0,20, С195% 0,04-0,92). Установлено, что в данной модели больший вклад в развитие ПШ вносит полиморфный локус гя 10994359 гена АЫКЗ (Н=0,99%). По другому полиморфному локусу показатель энтропии имеет более низкое значение - Н=0,52%.

Таким образом, проведенный анализ межгенных взаимодействий изученных маркеров дал возможность установить взаимодействие ДНК-локусов, при формировании предрасположенности к параноидной шизофрении в этнической группе русских.

Данное исследование подтвердило полученные нами результаты при анализе ассоциации отдельных полиморфных вариантов генов с ПШ и показало, что основу генетической предрасположенности к ПШ у лиц русской этнической принадлежности составляет взаимодействие генов ЛС52 («2746071), АЫКЗ («10994359), вЫК2 («995640) и СНШ2В («34315573).

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено, что генетическими маркерами повышенного риска развития параноидной шизофрении в этнических группах как русских, так и татар являются генотип гя2746071Ю/С и аллель гв2746071*С7 гена генотип гэ1805247*Т/Т и аллель гб1805247*Т гена Ои№В, гаплотипы 1Ю82*ССТСТ и Кв82*АСТСТ («2746071, «2746072, «2746073, «4606, «3767488) гена Генетическими маркерами пониженного риска развития параноидной шизофрении у русских и татар являются генотип гя2746071*А/А и аллель гз2746071*А гена Яв82 и гаплотип 1Ю82*АСТСТ («2746071, «2746072, ге2746073, «4606, «3767488) гена Л052.

2. Установлено, что в этнической группе татар генетическими маркерами повышенного риска развития параноидной шизофрении являются гаплотипы ОиК2*АТС («995640, «2227281, «2227283) и СШК2*ТСС («2227281, «2227283, «2235076) гена СП1К2. Выявлено, что генотип гх4502506*Т/Т гена вЯ1А2, гаплотип вШ№В*СССС («1805502, «1805476, «1805247, «1805482) гена ОиЮВ являются маркерами устойчивости к развитию данного заболевания.

3. Показано, что в этнической группе русских маркерами повышенного риска развития параноидной шизофрении являются генотип гэ1805476*А/А гена ОиЮВ, генотип к4765905*С/С гена САСЫА1С, гаплотипы СКШ2В*ТАТС и аитв*сстс («1805502, «1805476, «1805247, «1805482) гена втШВ. Обнаружено, что маркером устойчивости к развитию данного заболевания является гаплотип аЯШ2В*ТСТТ («1805502, «1805476, «1805247, «1805482) гена аашв.

4. Выявлено, что генетическим маркером низкой эффективности терапии галоперидолом в этнической группе русских являются генотип гя4441804*С/С гена США2, генотип г.^2227281*Т/Т гена ОиК2, в этнической группе татар -генотип г.ч995640*А/А гена СК1К2, генотип п1805502*С/Степа СЯ1Ы2В.

5. Установлена ассоциация генотипов rs2746073*T/T, rs4606*C/C, rs2746071*A/A гена RGS2 с риском развития нейролептического паркинсонизма у больных параноидной шизофренией при приеме галоперидола, русских по этнической принадлежности. Обнаружена ассоциация генотипа rs2239547*C/C гена ITIH4 с развитием нейролептического паркинсонизма у татар.

6. Идентифицированы две модели межгенного взаимодействия, ассоциированные с развитием параноидной шизофрении у индивидов русской этнической принадлежности - RGS2xGRIN2B, ANK3xGRIK2.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых научных журналах:

1. Галактионова, Д. Ю. Анализ ассоциации полиморфизма генов HTR2A, BDNF и SLC6A4 с развитием параноидной формы шизофрении и суицидального поведения с помощью биочипов / Д. Ю. Галактионова, О. А. Гра, И. И. Низамутдинов, В. Е. Шершов, А. В. Чудинов, А. Э. Гареева, Д. Ф. Закиров, Э. К. Хуснутдинова, Ю. П. Лысов, Т. В. Наседкина // Журнал неврологии и психиатрии им. С. С. Корсакова. -2012.-№ 10.-С. 39-44.

2. Гареева, А. Э. Репликативное исследование полиморфных вариантов генов PRSS16, PSORS1CJ, АРВА2, NRXN1, CHRNA7, ZNF804A, ассоциированных с шизофренией по данным полногеномных исследований в популяциях Волго-Уральского региона России / А. Э. Гареева, А. Г. Зайнуллина, Д. Ф. Закиров, Э. К Хуснутдинова. // Медицинская генетика. - 2012. - Т. 11(115). - № 1. - С. 22-28.

3. Гареева, А. Э. Изучение ассоциации полиморфных вариантов генов DRD2, СОМТ и GNB3 с ответом на типичные нейролептики. А. Э. Гареева, Д. Ф. Закиров, И. Ю. Ахмерова, Р. Г. Валинуров, Э. К. Хуснутдинова // Молекулярная медицина. - 2012. -№ 2. - С. 33-38.

4. Гареева, А. Э. Анализ ассоциации полиморфных вариантов гена GRIN2B с параноидной шизофренией и эффективностью терапии типичными нейролептиками у русских и татар из Республики Башкортостан / А. Э. Гареева, Д. Ф. Закиров, Э. К. Хуснутдинова// Генетика. - 2013. - Т. 49. - № 9. - С. 1106-1113.

5. Гареева, А. Э. Анализ ассоциации полиморфных вариантов гена RGS2 с параноидной шизофренией и ответом на терапию типичными нейролептиками / А. Э. Гареева, Д. Ф. Закиров, Э. К. Хуснутдинова// Молекулярная биология. - 2013. - Т. 47. -№6. -С. 1-8.

Тезисы докладов и статьи в сборниках конференций:

1. Gareeva, A. Genetic polymorphisms in dopamine-related genes and treatment response to typical antipsychotics / A. Gareeva, D. Zakirov, D. Kuznetsov, L. Samigullina, I. Akhmerova, R. Valinurov, E. Khusnutdinova // Journal: European Neuropsycho-pharmacology. - Paris - 2011. - V. 21, Suppl. 3. - P. 237.

2. Закиров, Д. Ф. Изучение полиморфных вариантов гена DRD2 / Д. Ф. Закиров, Э. М. Сулейманова, А. Э. Гареева, И. Ю. Ахмерова, Р. Г. Валинуров, Э. К. Хуснутдинова // Материалы 2-ой Всероссийской школы - конференции молодых ученых «Биомика-наука21 века». — 2011.-Т. 1. - № 2. - С. 44-46.

3. Gareeva, A. Genetic association of RGS2 gene variants with schizophrenia and antipsychotic response / A. Gareeva, D. Zakirov, E. Khusnutdinova // European Journal of Human Genetics. - Nürnberg - 2012. - V. 20. - P. 244.

4. Gareeva, A. Genetic association of RGS2 gene polymorphic loci with schizophrenia and typical antipsychotics response / A. Gareeva, D. Zakirov, E. Khusnutdinova // Journal: European Neuropsychopharmacology. - Vienna - 2012. - V. 22, Suppl. 2. - P. 344-345.

5. Zakirov, D. Influence of GRIN2B gene polymorphic loci on antipsychotic treatment response and susceptibility to schizophrenia / D. Zakirov, E. Suleimanova, A. Gareeva, E. Khusnutdinova // European Journal of Human Genetics. - Nürnberg - 2012. - V. 20. - P. 244

6. Gareeva, A. Genetic association oiRGS2 gene polymorphic loci with schizophrenia and typical antipsychotics response / A. Gareeva, D. Zakirov, E. Khusnutdinova // European Journal of Human Genetics. - Paris - 2013. - V. 21. - P.199.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

РБ Республика Башкортостан

ПШ Параноидная шизофрения

Р Уровень значимости

OR Соотношение шансов

95% CI Доверительный интервал

ANOVA - Однофакторный дисперсионный анализ

PANSS Шкала позитивной и негативной симптоматики

POSIT Подшкала позитивной симптоматики

NEGAT Подшкала негативной симптоматики

PSYCH Подшкала общей психопатологической симптоматики

SAS Шкала экстрапирамидных синдромов

ЭПС Экстрапирамидный синдром

Отпечатано с готового оригинал - макета на собственной полиграфической базе ИСЭИ УНЦ РАН 450054, РБ, г. Уфа, пр. Октября, 71 Тел: (8-347) 235-55-33, факс: (8-347) 235-55-44 Заказ № 21. Подписано в печать 22.11.2013 г. Формат 60x84, 1/16. Бумага типа «Снегурочка» Гарнитура «Times». Усл. печ. л. 01,14 Уч.-изд. л. 01,44 Тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Закиров, Денис Филарисович, Уфа

ФГБОУ ВПО «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» ФГБУ НАУКИ «ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ГЕНЕТИКИ УФИМСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК»

На правах рукописи

04201454592

Закиров Денис Филарисович

Изучение генетических факторов риска развития и эффективности терапии параноидной шизофрении

03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д.б.н., проф. Хуснутдинова Э.К.

Научный консультант: д.м.н., проф. Валинуров Р.Г.

Уфа-2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................4

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.......................................................................9

1.1. Эпидемиология шизофрении..........................................................................9

1.2. Этиология и патогенез шизофрении............................................................10

1.3. Гены предрасположенности к шизофрении................................................16

1.4. Фармакогенетика шизофрении и ответ на нейролептики..........................24

1.4.1. Фармакодинамические исследования фармакогенетики шизофрении.......................................................................................................26

1.4.2. Фармакокинетические исследования....................................................30

1.5. Фармакогенетические тест-системы............................................................35

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ................................38

2.1. Материалы исследования..............................................................................38

2.2. Методы исследования....................................................................................39

2.2.1. Выделение геномной ДНК.....................................................................39

2.2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК........................................40

2.2.3. Рестрикционный анализ.........................................................................40

2.2.4. Метод электрофореза..............................................................................43

2.2.5. Метод полимеразной цепной реакции в реальном времени с флуоресцентной меткой....................................................................................48

2.2.6. Клинико-диагностические методы........................................................49

2.2.7. Статистическая обработка полученных результатов..........................50

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ........................................................53

3.1. Анализ ассоциации полиморфных локусов гб2746071, гб2746072, гб2746073, ^4606, гб3767488 гена 1Ю82 с риском развития параноидной шизофрении и ответом на галоперидол..............................................................53

3.2. Анализ ассоциации полиморфных локусов rs2227281, rs2227283, rs2235076, rs995640 гена GRIK2 с риском развития параноидной шизофрении и ответом на галоперидол..............................................................63

3.3. Анализ ассоциации полиморфных локусов rs6536221, rs4441804, rs4302506 гена GRIA2 с риском развития параноидной шизофрении и ответом на галоперидол.......................................................................................................71

3.4. Анализ ассоциаций полиморфных локусов rsl 805502, rsl805476,

rsl805247, rsl 805482, rs7301328, rs34315573 гена GRIN2B с риском развития параноидной шизофрении и ответом на галоперидол.......................................79

3.5. Анализ ассоциации полиморфных локусов rs4765905 гена CACNA1C, rs2239547 генаШШ, rsl0994359 гена ANK3, rs6913660 гена HIST1H2AG с риском развития параноидной шизофрении и ответом на галоперидол.........89

3.5.1. Анализ ассоциации полиморфного локуса rs4765905 гена CACNA1C

с риском развития параноидной шизофрении и ответом на галоперидол.. 89

3.5.2. Анализ ассоциаций полиморфного локуса rs2239547 генаITIH4

с риском развития параноидной шизофрении и ответом на галоперидол.. 93

3.5.3. Анализ ассоциаций полиморфного локуса rsl0994359 TQ\mANK3

с риском развития параноидной шизофрении и ответом на галоперидол.. 95

3.5.4. Анализ ассоциаций полиморфного локуса rs6913660 гена HIST1H2AG с риском развития параноидной шизофрении и ответом на

галоперидол........................................................................................................98

3.6. Анализ межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к развитию параноидной шизофрении......................100

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................................................................................................106

ВЫВОДЫ.................................................................................................................114

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................117

/

ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования

По данным ВОЗ 45 миллионов человек во всем мире страдают шизофренией. Этиология заболевания до конца не выяснена. Условия окружающей среды, безусловно, вносят вклад в развитие шизофрении, но определяющим фактором является генетическая предрасположенность: шизофрения наследуется в более чем 80% случаев, что характерно для наиболее высоко наследуемых многофакторных заболеваний (Cardno et al., 2000; Sullivan et al., 2003).

Заболевание шизофренией поражает около 1% населения, при этом начало заболевания приходится, как правило, на молодой возраст, что нарушает общественную, профессиональную активность пациента, обусловливает -значительное бремя на семью и общество. 70% больных, несмотря на адекватно проводимую поддерживающую терапию, страдают от рецидивов или резидуальных симптомов долгое время. Несмотря на определенные успехи в изучении этиологии и патогенеза, а также в поиске эффективных средств фармакотерапии шизофрении, это заболевание по-прежнему занимает лидирующую позицию в списке патологических состояний центральной нервной системы, приводящих к инвалидизации и социальной дезадаптации больных.

Шизофрения не является смертельным заболеванием, однако смертность среди страдающих этим расстройством в 2 раза выше, чем среди населения в целом. Доказано, что основной причиной смерти больных шизофренией являются самоубийства. Около 50% больных шизофренией за 20-летний период болезни совершают суицидальные попытки, причём, 10% из них оказываются завершёнными (Крыжановская с соавт., 2000; Ефремов с соавт., 2004; Kaplan, Sadock, 2005; Buzan, Butt, 2005; Юрьева с соавт., 2006; Располова с соавт., 2007; Вербенко с соавт., 2008; Петрюк с соавт., 2009).

Многочисленные молекулярно-генетические исследования показали, что развитие психических заболеваний опосредовано межгенными и ген-средовыми взаимодействиями. Идентификация генов, которые участвуют в развитии нервной

системы и формировании психики, а также факторов среды, которые модулируют экспрессию этих генов, является первым шагом в исследовании шизофрении. К настоящему времени учеными из разных стран выявлено небольшое число генов, демонстрирующих более или менее доказанную связь с риском развития шизофрении (Steinberg et al., 2011; Williams et al., 2011; Peerbooms et al., 2012; Kang et al., 2012; Hamshere et al., 2012; Walton et al, 2013; Zhang et al., 2013; Kukshal et al., 2013; Ni et al., 2013). Однако, поиск генов-кандидатов, вовлеченных в этиопатогенез шизофрении и фармакогенетических маркеров эффективности нейролептиков не завершен.

Ответ на терапию нейролептиками у больных шизофренией неоднозначен: более 70% больных перестают принимать эти лекарства из-за их низкой эффективности или толерантности больного к терапии. Это свидетельствует о важном значении поисков факторов, предсказывающих степень эффективности ответа на нейролептики и побочные эффекты в лечении шизофрении, для оптимизации лечения (Nnadi et al., 2007).

В результате фармакогенетических исследований, рядом зарубежных ученых идентифицированы некоторые маркеры эффективности, переносимости и развития побочных эффектов при приеме нейролептиков (Cacabelos et al., 2011; Zhang et al., 2011). Однако необходимо дальнейшее изучение роли данных генов, а также поиск новых, что в перспективе даст возможность создания генетических предикторов ответа на нейролептики, а также повысить эффективность терапии и минимизировать побочные эффекты, что в конечном итоге улучшит качество жизни больных шизофренией. Кроме того, результаты успешной работы будут способствовать улучшению понимания механизмов действия нейролептиков, и, безусловно, приведут к созданию новых препаратов.

Таким образом, молекулярно-генетическое исследование шизофрении имеет огромное значение для создания стратегии раннего выявления и своевременного медицинского и психосоциального вмешательства, что будет способствовать более мягкому течению заболевания, улучшению долгосрочного прогноза, минимизации негативных социальных последствий, как для пациента, так и его

окружения, а также для общества в целом. Перспектива индивидуализации терапии шизофрении, основанная на генетической информации, повысит интерес ученых и даст большой оптимизм относительно коммерческого использования результатов исследования этой проблемы.

В связи с вышеизложенным были определены цели и задачи настоящего исследования.

Цель исследования: Изучение генетических маркеров риска развития и эффективности терапии параноидной шизофрении в Республике Башкортостан. Задачи исследования:

1. Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных локусов гена, кодирующего М12В-субъединицу глутаматного МУГОА-рецептора (ОШШВ), гена, кодирующего субъединицу 2 каинатного рецептора глутамата (ОиК2), гена, регулирующий сигнальную активность в белка 2 типа (ЯбЖ?), гена, кодирующего ОЫЖ2 субъединицу АМРА-рецептора глутамата (011А2) у больных параноидной шизофренией и индивидов контрольной группы.

2. Исследование полиморфных локусов, ассоциированных с шизофренией по данным полногеномных анализов и локализованных в областях 12р13.33 ОСАСИА1С), 6р.22.1 (Н18Т1Н2АС), 10ц21 (АИКЗ), Зр21.1 (1Т1Н4) у больных параноидной шизофренией и индивидов контрольной группы.

3. Анализ ассоциации исследованных полиморфных локусов с развитием параноидной шизофрении с учетом этнической принадлежности и ответом на терапию препаратом «галоперидол».

4. Исследование межгенных взаимодействий, предрасполагающих к развитию параноидной шизофрении.

Научная новизна исследования Впервые в этнических группах русских и татар из Республики Башкортостан охарактеризованы частоты генотипов и аллелей 22 полиморфных вариантов 8 генов ДСЖ, вШ2В, вМК2, САСИА1С, Н18Т1Н2Ав, АИКЗ, 1Т1Н4, США2. Выявлены генетические маркеры повышенного и пониженного риска

развития параноидной шизофрении в этнических группах русских и татар. Установлены модели межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов 1Ю82, АИКЗ, вШК2 и ОШШВ у больных параноидной шизофренией русской этнической принадлежности. Определены фармакогенетические маркеры ответа на терапию галоперидолом и развития нейролептического паркинсонизма у больных ПШ, русских и татар.

Научно - практическая значимость работы Результаты работы вносят вклад в общее представление о генетических основах предрасположенности к шизофрении и послужат шагом в понимании механизмов неодинаковой чувствительности к нейролептикам у больных шизофренией, в создании генетических предикторов ответа на нейролептики, повышении эффективности терапии и минимизации побочных эффектов, что в конечном итоге улучшит качество жизни больных шизофренией. Данные диссертационной работы могут послужить основой для разработки адекватных лечебно-профилактических мероприятий, а также могут быть использованы в преподавании спецкурсов по медицинской генетике на медицинских и биологических факультетах, на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Положения, выносимые на защиту:

1. Развитие параноидной шизофрении у индивидов русской и татарской этнической принадлежности ассоциировано с полиморфными локусами гз2746071 гена 1Ю82 и гэ 1805247 гена вШЮВ, а так же с гаплотипами ввТСТ и АСТСТ по полиморфным вариантам гена ЯС82 (гб2746071, гб2746072, гб2746073, гб4606, гб3767488).

2. В этнической группе татар генетическими маркерами повышенного риска развития параноидной шизофрении являются гаплотипы АЮ (гб995640, гб2227281, гб2227283) и ТС7С7 (гэ2227281, гб2227283, ге2235076) гена вШК2.

3. Развитие ГТШ у русских ассоциировано с полиморфными вариантами генов вШШВ (гб 1805476) и САСИА1С (гб4765905) и с гаплотипами ТА ТС и ССТС гена ОШШВ (ге 1805502, гб 1805476, ге 1805247, гб 1805482).

4. Генетическим маркером низкой эффективности терапии галоперидолом в этнической группе русских являются полиморфные локусы гб4441804 гена ОША2 и гб2227281 гена ОиК2, в этнической группе татар - гб995640 гена вШК2, гб 1805502 гена вЫШВ.

5. Полиморфные локусы ^2746073, ^4606, гб2746071 гена ЯС82 у русских и полиморфный локус гб2239547 гена 1Т1Н4 у татар ассоциированы с риском развития нейролептического паркинсонизма у больных параноидной шизофренией при приеме галоперидола.

6. Модели межгенных взаимодействий ассоциированы с риском развития параноидной шизофрении у индивидов русской этнической принадлежности

и АЫКЗ-вШК2).

Апробация диссертации. Материалы диссертационной работы были представлены на ежегодных международных конференциях Европейского общества генетики человека (Нюрнберг, 2012; Париж 2013), международных конгрессах Европейской коллегии по нейропсихофармакологии (Париж, 2011; Вена, 2012), II Всероссийской школе-конференции молодых ученых по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК.

Объём и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 146 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и библиографического списка, который включает 263 источников. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 48 рисунками.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Эпидемиология шизофрении

Шизофрения является тяжелым хроническим заболеванием, характеризующееся дисгармоничностью и утратой единства психических функций (мышления, эмоций, моторики), а также значительным ухудшением социальной адаптации. (Тиганов с соавт., 1999). Распространенность шизофрении в мире оценивается в пределах 0,8-1%, а заболеваемость составляет 15 на 100000 населения. Этот показатель устойчив во всём мире, поскольку заболеваемость не зависит от национальности или расы. Хотя половые различия заболеваемости не являются бесспорными, считают, что в общей популяции больны 1,1% мужчин и 1,9% женщин; причём. Исследования в области генетической эпидемиологии показывают огромный вклад наследственности в развитии шизофрении. По последним оценкам наследуемость шизофрении варьирует от 70-80% (Sullivan et al., 2003) и ставит шизофрению среди наиболее высоко наследуемых многофакторных заболеваний.

Средний возраст начала составляет 15-25 лет для мужчин и 25-35 лет для женщин. После 35 лет заболевают 17% женщин и 2% мужчин. В этом, возможно, сказывается не истинная разница в возникновении заболевания, а влияние социокультуральных факторов. Шизофрения крайне редко начинается ранее 10 и позже 50 лет. Приблизительно 90% случаев шизофрении приходится на возраст 15-54 года (Ховард, Леви, 2003; Попов, 2004; Сергеев, 2004; Снежневский, 2004; Фрит, Джонстон, 2005; Джонс, Бакли, 2008).

По данным ВОЗ шизофрения входит в десятку ведущих причин инвалидности, ее называют «наихудшим заболеванием, поражающим человека» (Tandon, 2008).

По данным Отдела эпидемиологических и организационных проблем психиатрии ФГУ «Государственного научного центра социальной и судебной психиатрии им. В. П. Сербского» (руководитель проф. А. А. Чуркин) в Российской Федерации контингента больных психическими расстройствами,

зарегистрированных учреждениями здравоохранения, в 2008 г. составили 4226899 человек (2977,6 на 100 тыс. населения), 2009 г. - 4215043 (2970,2 на 100 тыс. населения), 2010 г. - 4187873 (2951,0 на 100 тыс. населения). Из них, на контингенты зарегистрированных больных шизофренией приходилось в 2008 г. -507607 человек (357,6 на 100 тыс. населения), 2009 г. - 504706 (355,7 на 100 тыс. населения), 2010 г. - 502883 (354,4 на 100 тыс. населения) Несмотря на интенсивные исследования в течение последнего века, этиология и патогенез остаются сравнительно неясными.

1.2. Этиология и патогенез шизофрении

Прогресс в области биологических исследований шизофрении, достигнутый в последние годы, привел к пониманию того, что в патогенез этого заболевания вовлечены различные нейрохимические системы мозга (дофаминовая, серотониновая, норадренергическая, холинергическая, глутаматергическая), иммунная система, а также генетические факторы.

Ключевым в дофаминовой гипотезе шизофрении является вопрос о состоянии рецепторов дофаминергических нейронов. При помощи позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) были получены данные, свидетельствующие о повышении плотности дофаминовых рецепторов при шизофрении (Wong et al., 1986; Crowley et al., 1988; Tune et al., 1992; Тиганов с соавт., 1999).

Согласно серотониновой теории, развитие шизофрении обусловлено недостаточностью серотонинергической нейротрансмиссии (Mita et al., 1986; Arora, Meitzer, 1991; Joyce et al., 1993).

Норадреналин играет значительную роль в патогенезе шизофрении. В большинстве исследований показана высокая активность норадренергических нейронов в острой фазе шизофрении (Ackenheil et al., 1998). Различные взаимоотношения между уровнями норадреналина и дофамина могут определять некоторые симптомы шизофрении (Van Kämmen et al., 1991).

В последнее десятилетие возрос интерес к холинергической системе мозга. Эта система состоит из нейронов, выделяющих ацетилхолин - её

нейротрансмиттер. Холинергические нейроны достаточно широко представле�