Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности метаболизма глутамата при шизофрении

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности метаболизма глутамата при шизофрении"

Научный Центр Психического Здоровья Российская Академия медицинских наук

На правах рукописи

БОКША ИРИНА СЕРГЕЕВНА

ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА ГЛУТАМАТА ПРИ ШИЗОФРЕНИИ

03.00 04 Биохимия

003445006

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2008

2 ИЮЛ 2008

003445006

Работа выполнена в Научном центре психического здоровья РАМН Научный консультант - доктор биологических наук, профессор Бурбаева Г Ш. Официальные оппоненты

Ведущая организация - Институт биохимической физики РАН

Защита состоится 19 сентября 2008 г. на заседании Диссертационного Совета Д 212 203 13 при Российском университете дружбы народов по адресу 117198 Москва, ул. Миклухо-Маклая, д 8, Медицинский факультет

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу 117198 Москва, ул Миклухо-Маклая, д 6

Академик РАМН, д м.н., профессор Чехонин В П. Доктор биологических наук, профессор Сяткин С П Доктор биологических наук, профессор Болдырев А А.

Автореферат разослан . ..2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 212 203.13 Доктор биологических наук, профессор Лукашева Е В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ КТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

В последние годы существенно расширились представления о роли различных ейрохимических систем (дофаминергической, серотонинергической, ГАМК-ргической и других) и соответствующих нейромедиаторов в деятельности нервной истемы Особенно важным для понимания функционирования мозга в норме и па-ологии является факт их взаимодействия на рецепторном уровне [Shutoh et al, ООО, Svensson, 2000] Это делает необходимым не только уточнение, но и, возмож-о, пересмотр существующих гипотез патогенеза эндогенных психозов, в частности, изофрении, большинство из которых основаны на относительной дискретности ейрохимических систем.

В свете сказанного особое внимание привлекает к себе глутаматергическая истема мозга Глутамат (Глу) - это основной возбуждающий нейромедиатор в цен-ральной нервной системе. Глутаматергическая система включает в себя рецепторы онотропные и метаботропные) и переносчики Глу Особенность передачи сигнала синапсе при посредстве Глу состоит в том, что кроме нейронов в процессе непо-редственно участвуют глиальные клетки, поскольку для прекращения возбуждаю-его действия Глу необходима его эвакуация из синаптической щели, Глу перено-ится в астроциты, где «нейтрализуется», превращаясь в глутамин (цикл лу/глутамин работает значительно интенсивнее «обратного захвата» нейромедиа-ора нейронными переносчиками Глу).

Такой факт, как образование многими монаминергическими нейронами (до-аминовыми, серотониновыми, норадреналиновыми, холинергическими) «глутама-ергических» синапсов и высвобождение ими Глу в качестве второго нейромедиато-а [Trudeau, 2004, Gras et al,, 2002, Allen et al, 2006], принципиально изменил посту-аты, господствовавшие еще в конце прошлого века Некоторые исследователи рас-матривают глутаматергическую систему как своего рода регулятор (или модуля-ор) активности других нейромедиаторных систем [Zarate, 2003, Tamminga, 2006], о этот аспект еще не нашел достаточного отражения в литературе.

Возникновение глутаматергической (глутаматной) гипотезы патогенеза ши-офрении можно отнести к 1980 г., когда J Kim и соавт. обнаружили пониженные онцентрации Глу в спинномозговой жидкости больных шизофренией Некоторое ремя гипотеза оставалась без должного внимания, вероятно, из-за ограниченных наний о глутаматной системе мозга человека и главенствующих представлений о ом, что нарушение ее функции приводит к развитию Глу-индуцированной «нейро-оксичности», вызывающей нейродегенеративные изменения либо глубокие нару-

шения развития и функционирования нервной системы, каких не наблюдается при шизофрении Следующие 20 лет происходило постепенное накопление фундаментальных знаний и клинических наблюдений, способствующих формированию глу-таматергической гипотезы патогенеза шизофрении

Сформировавшаяся на рубеже веков гипотеза предполагала снижение активности Глу-зависимого проведения нервных импульсов в мозге больных из-за недостаточной активности (ингибирования) Глу- рецепторов NMDA типа Первоначально гипотеза основывалась на общих представлениях о дисфункции этих рецепторов и психотомиметических свойствах их антагонистов, а затем были получены и нейрохимические, а также фармакологические доказательства ее правомерности [Heresco-Levy & Javitt 1998, Kiystal et al., 1999] Появились и предположения о том, что модулирование активности глутаматергической системы (в частности, регуляция функции рецепторов Глу) может быть перспективным подходом к лечению шизофрении [Carlsson, 2000, Goff et al,, 1999, 2001], хотя на практике использовалось мало препаратов, действие которых направлено на глутаматергическую систему [Anand et al, 2000, Patil et al, 2007].

Ситуация, сложившаяся в области развития глутаматергической гипотезы шизофрении связана с тем, что проведение глутаматного нейромедиаторного сигнала зависит не только от количества и активности компонентов глутаматергической системы - рецепторов и переносчиков Глу, - но и от интенсивности метаболизма Глу. Публикуется все больше данных генетических, протеомных и биохимических исследований о том, что патологический процесс при шизофрении затрагивает ферменты важнейших путей метаболизма Глу - Глу/глутаминового, у-глутамильного (глутатионового), N-ацетиласпартил-глутаматного (NAAG) циклов и глутаматде-карбоксилазу, декарбоксилирующую Глу с образованием у-аминомасляной кислоты [Gluck et al., 2002, Beasley et al., 2006, Tosic et al., 2006].

Тем не менее, полученная информация о ферментах метаболизма Глу в мозге человека еще недостаточна, и в этом отношении представляют интерес прежде всего ключевые ферменты метаболизма Глу - глутаминсинтетаза (ГС) и глутаматдегидро-геназа (ГДГ)

Катализируемый ГС синтез глутамина из Глу глиальными клетками в мозге -важная реакция Глу/глутаминового цикла, впервые описанного Berl и Clark в 1969г. На рубеже веков были получены прямые доказательства существования этого цикла методом ядерного магнитного резонанса in vivo ГС играет важную роль в азотном метаболизме практически у всех живых организмов Этот мультимерный фермент, регуляция активности которого подчинена сложному механизму, практически не

изученному у млекопитающих, катализирует реакцию превращения Глу и аммония в глутамин за счет энергии гидролиза АТФ. Поскольку в мозге млекопитающих ГС играет важную роль в регуляции пула нейромедиатора-Глу и защите нейронов от повышенных концентраций Глу, в прекращении передачи нейромедиаторного сигнала Глу, ассимиляции и обезвреживании аммония, очевидна важность изучения молекулярной структуры ГС, а также факторов, влияющих на ее активность Изучение структуры ГС актуально не только для понимания механизма ее функционирования, но и для разработок способов определения ее количества ГС всех живых организмов имеют гомоолигомерную структуру с различной степенью олигомериза-ции (октамеры, додекамеры), но о ГС млекопитающих вообще и о ГС мозга человека в частности в этом аспекте информации было сравнительно мало, а вопрос о четвертичной структуре ГС мозга человека оставался открытым.

Другой ключевой фермент метаболизма Глу - ГДГ. Это один из многофункциональных ферментов, связывающих азотный и углеродный метаболизм: ГДГ катализирует обратимое окислительное дезаминирование Ь-Глу с образованием а-кетоглутаровой кислоты (а-КГ), используя в качестве коферментов НАД/НАДФ В мозге млекопитающих открыты различные изоформы ГДГ, которые адресуются в разные клеточные структуры, различаются силой ассоциации с мембранами и функциями, однако, способов очистки ГДГ мозга человека ранее опубликовано не было. Хотя благодаря молекулярно-биологическим иследованиям в геноме человека обнаружены гомологичные последовательности, которые могут кодировать разные изоформы ГДГ, лишь немногие работы посвящены белковым продуктам этих генов [ЗЬаБЫёЬагап й а1,1997, РкиаЫз е1 а1., 2000, 2003] Эти авторы выдвинули гипотезу о том, что одна изоформа ГДГ играет роль в «базовом метаболизме», а вторая - специфическая для нервной ткани - задействована в поддержании пула нейромедиаторного Глу.

Если локализация ГС в глиальных элементах в ткани мозга здоровых лиц не вызывала сомнений (ГС обнаружена в астроцитах и олигодендроцитах), то данные о ГДГ в этом отношении противоречивы есть сведения о том, что ГДГ - преимущественно глиальный фермент, хотя были получены также данные о локализации ГДГ не только в глии, но и в нейронах.

Что касается нейрональных ферментов - активируемой фосфатом глутамина-зы, локализованной в нейронах и участвующей в синтезе нейромедиаторного Глу, а также глутаматдекарбоксилазы - из литературы известны работы, в которых обнаружено изменение интенсивности экспрессии генов, кодирующих эти ферменты, при шизофрении [МсСиИшшгтЛ ег а1 2002, Вгипеаи ег а1., 2005], однако, информация о ГС и ГДГ в мозге человека очень скудна, структура и биохимические свойства

этих ферментов не исследованы, а при патологии нервной системы об этих ферментах сведений еще меньше. В известных из литературы отдельных ранних работа посвященных ГС и ГДГ, внимание уделялось окислительной инактивации ГС и ко личественным изменениям ГС и ГДГ при нейродегенеративных процессах. Измене ние количества этих ферментов в ткани мозга, их повреждение или изменение рас пределения оценивалось по ферментативной активности, а также иммунохимиче скими методами с использованием в качестве зондов антител, полученных к антиге нам из мозга млекопитающих (ввиду отсутствия препаративных способов выделе ния ферментов из мозга человека) [Plaitakis et al., 1984, Hussam et al, 1989, Le Princ et al., 1995]

В связи со сказанным выше, актуальной является разработка способов выде ления нативных ферментов ГС и ГДГ из ткани мозга человека и изучение и свойств

Недавно в литературе появились работы, посвященные изучению отдельны ферментов метаболизма Глу в мозге при шизофрении Результаты свидетельствую об измении количества отдельных ферментов метаболизма Глу [Tsai, 2005, Beasle et al, 2006], однако эти исследования пока разрознены, и данные требуют подтвер ждения Поскольку существуют теснейшие нейронально-глиальные метаболически связи, в том числе и через метаболизм Глу, необходимы комплексные исследован метаболизирующих Глу ферментов и глиальных белков Развитие новых техноло гий, особенно количественных методов анализа белков/ферментов, позволяет реал зовать такие комплексные системные нейрохимические исследования

Известно, что патологический процесс при шизофрении затрагивает многи структуры мозга, при этом нарушение функций префронтальной коры (ПФК, пол 10 по Бродману) рассматривается как центральное событие в клинической маниф стации и патогенезе заболевания Помимо ПФК затрагиваются и лимбическая кор базальные ганглии (хвостатое ядро), мозжечок [Manoach et al, 2000, Bottmer et al 2005, Daskalakis et al., 2005] Поэтому при проведении комплексных исследовани мозга при шизофрении важно обследовать параллельно несколько структур, что п ка редко встречается в нейрохимических работах, известных из литературы.

Нейрохимические исследования аутопсийного мозга помогают понять патог нез шизофрении. Но важно было бы также найти в периферической крови биохим ческие изменения, сопряженные с клиническими симптомами шизофрении. Это п могло бы правильному выбору и прогнозу эффективности антипсихотической тер пии В этом случае особое внимание обращают на себя тромбоциты крови, которь являются, по данным ряда авторов [Bosetti et al., 2002, Брусов и др. 2005], биохим ческой моделью, отражающей происходящие в нервной ткани процессы. В тромб

цитах найден ряд компонентов глутаматной системы - рецепторы и переносчики Глу (Глу-зависимые ионные каналы), зарегистрирована также глутаминазная ферментативная активность. Более того, в тромбоцитах больных шизофренией обнаружены «аномалии» работы глутаматергической системы - сверхчувствительность глутаматных рецепторов к Глу [Berk et al, 1999, 2000]. Представляется важным найти в тромбоцитах периферической крови и другие ферменты глутаматного обмена и оценить их в качестве «периферических маркеров» состояния метаболизма Глу с целью поиска и выделения таких подгрупп больных шизофренией, для которых лечение препаратами, воздействующими на глутаматергическую систему, окажется наиболее эффективным.

Таким образом, дальнейшее исследование функции глутаматергической системы мозга и особенно метаболизма Глу и его изменений при психической патологии, в частности при шизофрении, является одним из важных направлений биологической психиатрии, которое может способствовать как выяснению механизма развития шизофрении, так и разработке путей ее лечения.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Целью настоящей работы являлась характеристика ключевых ферментов метаболизма Глу в мозге и периферической крови человека в норме и при шизофрении на основе решения соответствующих методических вопросов по препаративному выделению ферментов, изучению их структуры, биохимических свойств и количественной оценки ЗАДАЧИ работы включали

1) разработку препаративных способов выделения и очистки ключевых ферментов метаболизма Глу - ГС и ГДГ - из аутопсийного мозга психически здоровых лиц,

2) изучение биохимических свойств и структуры этих ферментов;

3) разработку способов количественной оценки ГС и ГДГ в экстрактах мозга;

4) проведение сравнительных количественных исследований концентраций изучаемых ферментов в различных структурах мозга здоровых людей и больных шизофренией;

5) обнаружение ферментов метаболизма Глу (ГС и ГДГ) в элементах периферической крови человека и разработку способов их количественной оценки,

6) установление связи количества ГС и ГДГ в крови с выраженностью психопатологических проявлений шизофрении с использованием влияния антипсихотических средств

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые выделены в электрофоретически гомогенном виде и охарактеризованы ключевые ферменты метаболизма Глу - ГС и три изоформы ГДГ мозга человека, определена первичная структура ГС мозга человека и охарактеризована её четвертичная структура, впервые обнаружен и изучен белок (фермент), по свойствам подобный ГС мозга человека - ГСПБ.

Впервые в тромбоцитах человека иммунохимическим методом обнаружены ферменты метаболизма Глу - ГСПБ и ГДГ и определена Ь-глутамин гидроксила-мин трансферазная ферментативная активность, за которую отвечает ГСПБ Разработаны и представлены соответствующие методы определения перечисленных показателей

Получены новые экспериментальные данные о корреляциях, связывающих друг с другом концентрации ключевых ферментов метаболизма Глу в мозге психически здоровых лиц (предполагается, что это может отражать взаимосвязи экспрессии соответствующих генов, или их согласованную регуляцию) Установлены различия в корреляциях между концентрациями ключевых глиальных ферментов метаболизма Глу и ряда белков глии у психически здоровых лиц и больных шизофренией, указывающие на рассогласованность синтеза ферментов метаболизма Глу и глиальных белков при шизофрении.

Обнаруженные корреляции количества метаболизирующего Глу тромбоци-тарного фермента - ГСПБ - с выраженностью клинической патологии при шизофрении, а также с длительностью лечения до достижения положительного эффекта терапии могут служить предиктором ее эффективности в целом.

Впервые установлено изменение количества ГСПБ и ГДГ в тромбоцитах больных хронической шизофренией в процессе антипсихотического лечения, что

позволяет предполагать участие глутаматергической системы не только в патогенезе заболевания, но и в реализации терапевтического эффекта.

Показана перспективность системного (метаболомного) подхода к изучению биохимических процессов в мозге лиц, не страдающих психической патологией, и больных шизофренией для выявления особенностей метаболизма Глу при шизофрении.

Проведенное исследование позволило расширить и дополнить новыми сведениями об участии ферментов метаболизма Глу в патогенезе шизофрении современную глутаматергическую гипотезу шизофрении.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ

Открытие нескольких изоформ ГДГ, описание нового белка ГСПБ и свойств высокоочищенных ГДГ и ГС мозга человека и изучение структуры ГС расширяет представление о метаболизме Глу в мозге человека

Соответствующие методы, разработанные в настоящем иследовании, могут быть использованы в повседневной работе других научных и практических учреждений

Данные о том, что количества ключевых ферментов метаболизма Глу - ГС, ГСПБ и ГДГ - изменяются в различных областях мозга при шизофрении, а изменения взаимосвязаны, расширяют и дополняют «глутаматергическую» гипотезу патогенеза этого заболевания. Эти данные наряду с обнаружением связи между количественными изменениями ферментов метаболизма Глу и других глиальных белков подтверждают наличие аномалий в метаболических циклах с участием Глу между нейронами и глией в мозге больных шизофренией

Данные об изменениях метаболизма Глу при шизофрении открывают новые перспективы в выработке подходов к лечению этого заболевания, в том числе поиск модуляторов активности ферментов метаболизма Глу и в дальнейшем, возможно, регуляторов экспрессии генов, кодирующих эти ферменты

Подтверждено, что биохимические изменения (количества ферментов метаболизма Глу) в крови до некоторой степени отражают нейрохимические процессы в мозге при шизофрении.

Обнаружен один из возможных биохимических «предикторов» эффективности фармакологического воздействия на психопатологическую симптоматику шизофрении - это количество ГСПБ, определенное в тромбоцитах крови, взятой до начала лечения- чем оно больше, тем быстрее достигается положительный эффект терапевтического вмешательства

Предполагается, что изучение метаболизма Глу окажется продуктивным в дальнейшем изучении не только шизофрении, но и других расстройств (аутизма, се-нильной деменции, болезни Альцгеймера, эпилепсии и т.д), в патогенезе которых, по современным представлениям, важная роль отводится глутаматной системе.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1 Разработанные способы выделения и очистки до электрофоретически гомогенного состояния ферментов метаболизма Глу - ГС, ГСПБ и ГДГ из ткани мозга человека позволяют получить эти ферменты в олигомерной форме, с высокой удельной активностью в количествах, достаточных для изучения их структуры и свойств В мозге человека ГДГ представлена тремя изоформами, а ГСПБ может выполнять функции ГС

2. Разработанные иммунохимические способы оценки относительных количеств ГС, ГСПБ и изоферментов ГДГ в экстрактах ткани мозга человека позволяют проводить сравнительные исследования образцов, полученных от психически здоровых лиц и больных психическими заболеваниями. Сравнительные исследования количества ГС, ГСПБ и трех изоформ ГДГ в образцах из коллекции структур мозга контрольной группы и группы больных шизофренией показали существование достоверных различий между группами обследованных в каждой из изученных структур мозга (префронтальная кора, хвостатое ядро, мозжечок).

3. В мозге здоровых людей определяются положительные коррелятивные связи между количеством ферментов метаболизма Глу, а также уровнями креатинфосфо-киназы ВВ (КФК ВВ), глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ) и основного миелинового белка (ОМБ). Коррелятивные связи при шизофрении отличаются от таковых у здоровых (большинство связей, установленных у здоровых людей, отсутствуют при шизофрении). Кластер-анализ позволяет сделать вывод, что психически

здоровые и больные шизофренией представляют собой разные «типы» метаболизма Глу. у больных повышена концентрация изученных ферментов метаболизма Глу. 4 Обнаруженные в тромбоцитах периферической крови ферменты метаболизма Глу (ГСПБ и изоформы ГДГ I и И) проявляют ферментативную активность и поддаются количественной оценке с помощью специфических поликлональных антител, полученных к высокоочшценным ферментам мозга человека. Количество ГСПБ и в мозге, и в тромбоцитах при шизофрении достоверно выше, чем у здоровых лиц того же возраста и пола Количество ГСПБ в тромбоцитах больных шизофренией до лечения коррелирует с длительностью антипсихотического лечения до достижения положительного эффекта (чем оно выше, тем меньше длительность лечения) Достоверно изменяющееся в ходе лечения количество ГСПБ и ГДГ подтверждает влияние атипсихотического лечения на метаболизм Глу.

АПРОБАЦИЯ. ВНЕДРЕНИЕ, ПУБЛИКАЦИИ

Основные результаты исследований доложены на российских и международных совещаниях, симпозиумах, конференциях. 1996 - 8-й Междунар Конгр Чешского и Словацкого Нейрохимического Общества, Мартин, Словакия, 1998 - Междунар Конференция «Структура, стабильность и фолдинг белков. Фундаментальные и медицинские аспекты» Москва, Россия,

1999 - Конференция «Механизмы структурной, функциональной и нейрохимической пластичности мозга» Москва, Россия, 2000 - Зимнее рабочее совещание по шизофрении Давос, Швейцария,

2000 - XIII съезд психиатров России Москва, Россия, 2001 - 7-й Всемирный Конгр по Биол психиатрии Берлин, Германия, 2002 - XXIII Конгр Междунар Коллегии по Нейропсихофармаколо-гии Монреаль, Канада, 2002 - Конгр по Биол Психиатрии "Биология психозов", Копенгаген, Дания, 2002 - V-й Европейский Симпозиум по функции глиальных клеток в здоровом мозге и при патологии Италия, Рим, 2002 - Конференция по Проблемам медицинской энзимологии Москва, Россия, 2003 - Рабочее совещание НАТО по научным исследованиям «Креатинкиназа и энергетический метаболизм мозга функционирование и роль при патологии» Тбилиси, Грузия, 2006 - Научно-практическая конференция с международным участием, посвященная 25-летию ГУ НИИ психического здоровья ТНЦ СО РАМН, «Психическое здоровье населения Сибири и Дальнего Востока» Томск, Россия, 2006 -Продвинутый Курс Wellcome Trust по молекулярной неврологии и невропатологии Хинкстон, Великобритания, 2006 - Междунар Конференция по психическим расстройствам Стамбул, Турция, 2006 - Конгресс по Социальной психиатрии Москва, Россия, 2007 - Конгресс Балканской Федерации Клинических Лабораторий Анталия, Турция; 2007 - 39-ая Ежегодная Генеральная Ассамблея Европейского Сообщества исследования мозга и поведения Триест, Италия; 2007 - 2-й Конгресс Всемирной Федерации Общества Биологической Психиатрии. Сантьяго, Чили, 2007 - Конференция по Биологической психиатрии памяти М Е Вартаняна Москва, Россия, 2007 - Конференция «Взаимодействие науки и практики в современной психиатрии» Москва, Россия, 2008 - 4-ая международн Конференция «Геномика, протеомюса, биоинформатика и нанобиотехнологии в медицине», Москва-Нижний Новгород, Россия

Диссертация выполнена в соответствии с планами научных исследований НЦПЗ РАМН и апробирована на межлабораторной научной концеренции НЦПЗ РАМН

Результаты диссертационной работы применяются в научной работе лаборатории нейрохимии НЦПЗ РАМН. Различные аспекты диссертационной работы являлись основанием для планирования новых тем, продолжающих данное научное направление

По теме диссертационной работы опубликовано 28 научных статей (из них 10 - в отечественных журналах из перечня, рекомендуемого ВАК, 11 - в рецензируемых зарубежных изданиях) и 20 тезисов в сборниках трудов конференций и симпозиумов.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 196 страницах, иллюстрирована 26 рисунками, содержит 9 таблиц Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения и заключения, выводов, списка цитированной литературы

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клинико-анатомический и клинический материал Исследования проведены на образцах мозга - префронтальная кора, хвостатое ядро и мозжечок - от 22 лиц контрольной группы и 23 больных шизофренией В контрольную группу вошли образцы мозга от лиц, не страдавших психическими или неврологическими заболеваниями Этот аутопсийный материал был получен из патолого-анатомической лаборатории Московской медицинской академии им И М Сеченова Ау-топсийную ткань мозга в случаях шизофрении получали из московских городских психиатрических больниц Диагностика шизофрении осуществлялась клиницистами соответствующих психиатрических учреждений по DSM-IV-TR и МКБ-10 Образцы структур ткани мозга во всех случаях брались из левого полушария, обрабатывались (в основном - не позднее 6 ч с момента смерти) при 4°С, замораживались в жидком азоте и хранились при -80°С до исследования

Также исследованы тромбоциты из образцов крови 33 психически здоровых лиц и 40 больных шизофренией из отделения психофармакологии НЦПЗ РАМН (руководитель - д м н М А Морозова) - во всех случаях это были больные параноидной шизофренией с приступообразным течением (без остаточной симптоматики между приступами) По DSM-TV-TR они были отнесены к рубрике 295 30, а по МКБ-10 к параноидной шизофрении с эпизодическим ремитирующим течением - рубрика F20 03 Лечение больных оланзапином состояло из нескольких фаз - начального, wash-out периода (9 дней), в течение которого проводился скрининг больных и подготовка исследованию Следующий затем основной курс лечения состоял из интенсивной фазы (первые 8 недель) и поддерживающей фазы (последующие 20 недель) Средняя доза оланзапина составлял 12,7 ± 3,6 мг/день, начальная доза - 5 мг/день, затем - 20 мг/день в ходе интенсивной и 10 мг/день ходе поддерживающей фаз лечения

Методы лабораторных исследований.

Выделение, очистка и характеристика ферментов Экстракция белков из ткани мозг проводилась следующими способами «Цитоплазматические легко растворимые белки» экстраги

ровали рН-нейтральным буфером низкой ионной силы с восстановителем (2-меркаптоэтанолом) -такая экстракция предотвращала инактивацию изучаемых ферментов. «Ассоциированные с мембранами» белки экстрагировали с добавлением Тритона Х-100 и NaCl (при выделении ассоциированной с мембранами изоформы ГДГ) «Лизаты» получали, когда требовалась наиболее полная экстракция всех исследуемых белков В этом случае гомогенизацию ткани проводили на кипящей водяной бане с додецилсульфатом натрия (ДС-Na) - с целью дальнейшего электрофореза и имму-ноблоттинга экстрактов.

Экстракция белков из тромбоцитов проводилась путем гомогенизации с ДС-Na При выделении, очистке белков и характеристике очищенных препаратов применялись методы препаративного ультрацентрифугирования, жидкостной колоночной хроматографии низкого давления (ионообменной, гель-фильтрации, сорбционной, гидрофобной, аффинной), ультрафильтрации, спектрофотометрического определения ферментативной активности, электрофореза в по-лиакриламидном геле, а также двумерного электрофореза (изоэлектрофокусирование в первом направлении, электрофорез с ДС-Na - во втором) При тестировании антител применялся твердофазный ИФА, при определении относительных количеств исследуемых белков - фермент-сопряженный вестерн-иммуноблоттинг с хемилюминесцентным усилением сигнала (ECL) и компьютерным анализом изображения, с применением моноклональных (коммерческих) и поликло-нальных (полученных путем иммунизации животных) антител

Поликлональные антитела к ГС мозга млекопитающих были любезно предоставлены д-ром М Тарди (Париж, Франция), поликлональные антитела к различным белкам семейства CRMP, клеточные линии- сверхпродуценгы CRMP и лимфоциты человека с повышенной экспрессией CRMP были исследованы в совместной работе с проф М -Ф Белан и д-ром М Турэ (INSERM, Лион, Франция), в этих совместных исследованиях применялся метод фермент-сопряженного вестерн-иммуноблоттинга с флуоресцентным усилением сигнала и компьютерным анализом изображения

При изучении структуры очищенных белков в совместных исследованиях с д-ром Г-Дж Шйнфельдом (научный отдел фирмы Hoffmann-La Roche, Базель, Швейцария) применялись методы аналитического ультрацентрифугирования, квазиупругого светорассеяния, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), определения первичной структуры белка пептидным картированием - частичным гидролизом трипсином и времяпролетной масс-спектрометрией с лазерной десорбцией с матрицы и ионизацией (MALDI-TOF) пептидов либо их прямым секвениро-ванием на секвенаторе после разделения ВЭЖХ

Статистический анализ данных производился с помощью программы Statistica б 0 (непараметрический модуль - U-тест Манна-Уитни, корреляции по Спярмену, парный тест Вилкоксона, Крускал-Уоллиса ANOVA, уровень значимости - Р<0,05) При множественных сравнениях проводилась корректировка Бонферрони (ужесточение критерия значимости, т е 0,05 делили на п - число определяемых параметров, и различия/корреляции считали достоверными при р<0,05/п) Прогностическое значение полученных данных оценивали с помощью "модели выживания" - регрессионный анализ) Кластерный анализ проводили посредством программы Clust, разработанной в НЦПЗ РАМН [Судаков, Мясоедов, 2005]

РЕЗУЛЬТАТЫ

ГС мозга человека

Разработанный оригинальный способ выделения и очистки ГС мозга человека основан главным образом на колоночной хроматохрафии низкого давления. Схема очистки включает дифференциальное ультрацентрифугирование, дробное осаждение сульфатом аммония, последовательные колоночные- анионо- и катионообмен-ную хроматографию (на ДЭАЭ- и КМ-целлюлозах или сефацелях), гель-фильтрацию (на поперечно сшитой сефарозе 6В), аффинную хроматографию (на аминогексил-сефарозе). Очищенный фермент концентровали ультрафильтрацией или осаждением сульфатом аммония

Благодаря разработанному способу очистки [Бокша и др 1995, Boksha et al 2000] из ткани мозга лиц без психических отклонений была выделена и очищена ГС в препаративных количествах, что позволило провести исследование первичной и четвертичной структуры фермента [Бокша и др. 2002]

Характеристика субъединиц ГС методом электрофореза в ПААГ. При одномерном электрофорезе ГС, выделенная из мозга человека, мигрировала в градиентном (4 - 20%) ПААГ с ДС-Na как белковая зона с молекулярной массой ~ 44 кДа (рис 1), что близко к расчетной молекулярной массе мономера ГС печени человека (42,1 кДа, база данных Swiss Prot, Р15104).

Очищенную ГС характеризовали также методом двумерного электрофореза В

нашей работе ГС выделяли как из замороженной, так и из незамороженной ткани мозга человека (в последнем случае ГС была выделена из цитоплазматической фракции ткани мозга) Для сравнения свойств субъединиц ГС, выделенных в обоих случаях, проводили двумерный электрофорез в ПААГ обоих образцов в одинаковых условиях (рис. 2) Образцы очищенной ГС мозга при двумерном электрофорезе в обоих случаях разделились на несколько белковых зон, все они локализовались в интервале изоэлектрических точек от 6,7 до 6,4 и имели молекулярные массы ~ 44 кДа, при этом распределение белковых зон по плотностям у ГС из незамороженной и замороженной ткани оказалось различным

Итак, у обоих препаратов ГС наблюдается микрогетерогенность. Этот феномен отмечали и другие исследователи [Tumani et al 1995] Различные интенсивности

белковых «ж на двумерных гелях, во ¡можно, отражают рлличные соотношения субьешннц ГС, о,тип in которых принадлежат цитозольнон ГС, а другие -компартменгализованной ГС, высвободившейся в результате замораживания-опанвшшя

Разные субъедннпцы ГС могут представлять различные пролеты мндиоилуальнмч генов, тк в геноме человека идентифицировано несколько ГС-подобных последовательностей [Wang et al 1996] Изофсрмешы ГС могут возникать н в результате гюсттрансляционной модификации, которая, вероятно, происходит в разной степени в цпгозоле н в клеточных компартментах (процесс замораживания, безусловно, влияет на высвобождение ГС из субклеточных органелл) Микрогстерогенность может быть обусловлена и окислением метнониновых остатков полппептпда [Berletl et al 1998]

Определение пер.тпоп cm/num/w (аминокислотой последов агсльност и) ГС человека ранее не проводилось, хотя была известна аминокислотная последовательность ГС печени человека, выведенная из нуклеошдиой последовательности гена [Gibbsetal, 1987, Christa et al, 1994]

Претринятые в настоящей работе неоднократные попытки прямого секвенировання конца полипептнда ГС мозга человека с помощью аминокислотного секвестора не дали результата Было сделано предположение, что V полипенша ГС N-копец блокирован [Боша и др 2002, Burbae\a et al 1998] Вероятно. N-консц заблокирован как у компаршенгализованной, так н у цптозолыюй форм ГС мозга человека, подобно тому, как ло было обнаружено у предшественника мнгохондрналыюй ГС печени других позвоночных [Laud & Campbell 1994]

Пиролиз ГС мозга человека трипсином в геле с последующим разделением пептидов ВЭЖХ и определение прямым секвснированнем на аминокислотном секвенаюрс аминокислотных последовательностей трех внутренних пептидов (обшей длиной 20 аминокислот) [Burbaeva et al 1998] дали полное совпадение с последовательностью ГС печени человека из базы данных SwissProi

Дальнейшая расшифровка первичной струыуры ГС мозга человека проводилась посредством масс-спскгрометрни пептидов, полученных в результате внутреннего гидролиза трипсином полнпепгида ГС После электрофореза с ДС-Na в ПААГ препарата ГС (рис I) полосу ГС вырезали, расщепляли трипсином, анализировали MALDI ТОГ масс-спектрометрней и сравнивали с известными пептидными последовательностями по базе данных SwissProt

дз

Л14

na ni EO

Рисунок I. Картина электрофореза в 11АА1' с ДС-№ 1 С мозга человека {правая дорожка). ГС (показана стрелкой, -44 кДа) анализировалась триитическим гидролизом и мае с-с пе ктрометр ие й. Левая дорожка - белки-стандарты, слева от геля - их молекулярные массы в кДа.

Шесть пептидных масс точно соответствовали массам пептидов, получающихся при гидролизе трипсином белка-продуюа гена ГС иечеии человека (Swiss f'roi, PI 5104).

Рисунок 2. Изображения гелей, окрашенных кумасси R-250, после двумерного »лектрофореза в i 1AAI ГС, очищенной из незамороженной

i i

(а) и замороженной (б) тканей мозга. Справа - молекулярные массы, под каждой панелью - шкала изоэлектрических точек ( ЮТ).

В целом идешифицироваиные нет иды ГС составляю] - 24% последовательности гипотетического продукта трансляции кДНК ГС человека [Ьокша и др. 2002]. Четвертичная структура ГС мозга человека.

Гель-фшгьтрщин и евешриссенние. При ИЗуЧСНИИ ЧСТВСрТИЧНОЙ Структуры ОЧИЩСННОЙ ГС мозга человека в совместных исследованиях с научным отделом фирмы

* '

¡J а 7 С4

Hoffmann-La Roche (Базель, Швейцария) применялось несколько методов, поскольку структура олигомера ГС была неизвестна В ходе гель-фильтрации на сефарозе CL 6В или Superdex 200 (ВЭЖХ) ГС элюировалась как олигомер с кажущейся молекулярной массой ~ 290 кДа. Однако этот способ не дает точных результатов для белков с неглобулярной формой молекул, также вносят свой вклад неспецифические взаимодействия с гелевым носителем [Schonfeld & Behlke 1998]. В связи с этим был применен альтернативный подход к исследованию белковых молекул - метод квазиупругого рассеяния света (исследования проводятся в растворе, и влияния носителя исключаются). Наблюдаемая при анализе этим методом монодисперсность образца ГС указывала на узкое распределение молекул по размерам [Бокша и др 2002], а в соответствии с полученным коэффициентом диффузии расчетная молекулярная масса ГС составила ~ 270 кДа, если предположить, что молекула имеет глобулярную форму [Schonfeld et al 1998] Эта масса хорошо соответствует результатам, полученным при гель-фильтрации, но поскольку форма молекул ГС человека была неизвестна, невозможно сказать, насколько верна оценка массы молекулы ГС обоими этими методами

Аналитическое ультрацентрифугирование. Аналитическое центрифугирование, в отличие от двух предыдущих способов, дает возможность точно определить молекулярные массы растворенных белков с неизвестной формой молекул [Schoenfeld et al 1998] В опытах по седиментационному равновесию с ГС профили радиального распределения, полученные через 40 ч после начала эксперимента, хорошо соответствовали однокомпонентной октамерной модели Качество соответствия всех образцов немного возрастало, если вводили многокомпонентную модель (т.е. кроме октамеров в модель вводили тетрамеры, 16-меры - димеры октамеров - и олигомеры высшего порядка), а алгоритм подгонки всегда указывал на присутствие минимум 80% молекул в виде октамеров при концентрации белка 0,4 мг/мл (10 мкМ в расчете на субъединицу белка) Добавление 0,2 - 1,0 мМ Мп2+ или 5-20 мМ Mg2+, варьирование pH (7,8 и 7,1) или состава буфера не оказывало заметного влияния на результат. Средняя молекулярная масса ГС составила 351 ± 8 кДа, что близко к теоретической массе октамера ГС (336,5 кДа). Модель октамера хорошо подтверждается величиной и правильностью распределения остаточных членов В другом эксперименте по равновесному центрифугированию изучалась ГС при различных концентрациях белка- 0,4 и 0,04 мг/мл Средние молекулярные массы, рассчитанные по приближенным кривым шести различных профилей при различных концентрациях, для однокомпонентной модели составили 339 ± 13 и 254

± 11 кДа для 0,4 и 0,04 мг/мл соответственно, что указывает на слабую | равновесную диссоциацию. }

Итак, впервые была исследована первичная и четвертичная структура ГС, выделенной из мозга человека. Аминокислотная последовательность ГС мозга человека гомологична ГС печени человека (минимум 24% их последовательностей идентичны), а октамерная четвертичная структура совпадает с симметрией укладки, известной у ГС мозга млекопитающих. |

!

Обнаружение и изучение белка, подобного глутаминсинтетазе (ГСПБ) I

В ходе фракционирования белков, экстрагированных из замороженной ткани мозга человека с целью очистки ГС (которую отслеживали по ферментативной активности - Ь-глутамин : МН2ОН трансферазной реакции) было обнаружено, что на последней стадии очистки (хроматография на аминогексил-сефарозе) с колонки элюируются две фракции, в одной из которых содержится описанная выше ГС, а в другой - фермент, обладающий высокой удельной трансферазной активностью. Этот фермент был назван «белком, подобным ГС» (ГСПБ). ГС и ГСПБ прочно связываются с аминогексил-сефарозой в условиях низкой ионной силы буфера [ВокзИа е! а1. 2000], но их элюция происходит при различной ионной силе элюирующего буфера (около 0,3 М и 0,5 М №С1 соответственно).

1 2 з,

: Рисунок 3. Электрофореграмма очи-

* ' щенных препаратов ГС и ГСПБ.

Е7 «ДО

Шц 1 - белковые стандарты молекулярных

« ф тт-Кх масс; 2 - ГС; 3 - ГСПБ.

Белки разделяли электрофорезом с ДС-. , Ыа в 10%-ном ПААГ и окрашивали

Кумасси 11-250.

Поскольку выделенный препарат ГСПБ казался гомогенным при одномерном; ЭФ с ДС-Na (рис. 3, дорожка 3), была идентифицирована мажорная белковая зона в препарате ГСПБ методом ее вырезания, триптического гидролиза и MALDI-TOF; масс спектрометрии пептидов (совместные исследования с фирмой Hoffmann-La, Roche, Базель, Швейцария). Эксперименты показали, что мажорная белковая зона в, препарате ГСПБ содержит в качестве основного компонента CRMP2 - белок из се-;

мейства гомологов дигидропиримидиназы, участвующий в стимулируемом коллап-сииом каскаде остановки аксонального роста в процессе развития нервной ткани При одномерном ЭФ в ПААГ субъединицы CRMP2 маскируют ГСПБ (по-видимому, вследствие близких значений молекулярных масс) при кажущейся гомогенности препарата [Boksha & Schönfeld 2002]. Однако, дополнительные опыты по иммунохимическому окрашиванию белков, разделенных ЭФ в ПААГ, методом вес-терн-иммуноблоттинга антителами, специфичными к CRMP2 (любезно предоставленными для совместных исследований д-ром М Турэ, INSERM, Лион, Франция), явно указали на различия в молекулярных массах субъединиц белков CRMP и ГСПБ Очевидно, ГСПБ и белки семейства CRMP выделяются совместно при использовании схем фракционирования, разработанных для очистки ГС/ГСПБ. Учитывая склонность CRMP к образованию функциональных комплексов в процессе развития нервной ткани, можно предположить, что «совыделение» ГСПБ и CRMP обусловлено формированием комплекса между ними Дальнейшие совместные исследования показали, что CRMP2 не обладает трансферазной ферментативной активностью. Это подтверждает тот факт, что ГСПБ и CRMP - разные белки, а ГСПБ - ранее не описанный фермент, способный катализировать трансферазную реакцию с L-Глн

Ферментативная активность ГС и ГСПБ Ферментативная активность ГС мозга обычно измеряется посредством упомянутой выше трансферазной (АДФ + L-Глн + NHüOH в присутствии Мп2+), а не синтетазной (АТФ + L-Глу + NH2OH в присутствии Mg2+) реакции по двум причинам высокие активности АТФаз, присутствующих в экстрактах ткани мозга, быстро расщепляют АТФ, используемый в качестве субстрата в синтетазной реакции [Dennis et al 1980], кроме того, измеряемая синтетазная активность ингибируется продуктом реакции АДФ [Yamamoto et al. 1987], так что в экстрактах мозга измеряется лишь кажущийся, сильно заниженный уровень ферментативной синтетазной активности

Очищенный ГСПБ эффективно катализирует трансферазную реакцию, однако, удельная активность его в синтетазной реакции по меньшей мере на 2 порядка ниже, чем у очищенной ГС [Boksha et al 2000] Кинетический анализ ферментных препаратов ГС и ГСПБ показал линейное накопление во времени продукта, т.е. у-глутамилгидроксамовой кислоты, в течение первых 30 мин инкубации после запуска трансферазной реакции, а углы наклона зависели от концентраций ферментов (ГС или ГСПБ) в условиях, описанных в публикации [Boksha et al. 2000].

Из результатов следует практически важный вывод: измеряемая в рутинных

анализах трансферазная активность в экстрактах мозга человека является суммарной

активностью, в которую вносят вклад минимум два фермента (ГС и ГСПБ). Это обстоятельство важно учитывать в сравнительных (например, прикладных, медицинских) исследованиях ферментативной активности ГС

Отметим также, что ингибитор метионинсульфоксимин (MSOX), считающийся специфическим ингибитором ГС, способен подавлять не только ее ферментативную активность, но и активность ГСПБ, выполняющего т vivo еще не известную функцию в метаболизме Глу/глутамина [Boksha et al. 2000] Из этого следует, что в основе «нейротоксических эффектов», наблюдаемых при действии MSOX in vivo, может лежать не только повышение концентрации Глу из-за ингибирования ГС, но и нарушение пути, в котором задействован ГСПБ

Оценка относительного количества ГС и ГСПБ иммунохимическим методом

Поскольку данные показывают, что оба фермента - ГС и ГСПБ - вносят вклад в ферментативную трансферазную активность белковых экстрактов ткани мозга, можно предположить, что оценку количества каждого из ферментов адекватно было бы проводить посредством определения «парциального» вклада иммунореактивных ГС и ГСПБ с помощью иммунохимического метода В связи с этим был разработан иммунохимический способ обнаружения ГС и ГСПБ и их количественного определения в образцах мозга.

В результате иммунизации кроликов очищенными белками ГС и ГСПБ было получено несколько кроличьих сывороток. Все сыворотки кроликов, иммунизированных ГСПБ по различным схемам иммунизации, характеризовались высокими титрами в твердофазном ИФА, однако, они окрашивали несколько белковых зон при иммуноблоттинге легко растворимых цитоплазматических белков мозга человека (данные не представлены) и не могли быть использованы в количественном анализе ГСПБ ни ИФА, ни иммуноблоттингом.

Также было проведено тестирование различных моно- и поликлональных антител к ГС разных видов млекопитающих на предмет пригодности анализа ГС и ГСПБ в образцах мозга человека Интересно, что все антитела, полученные к ГС овцы, быка, либо человека (в настоящей работе), реагировали в твердофазном ИФА с ГС и ГСПБ, при этом титры всех антител, тестированных в ИФА, приблизительно вдвое выше к ГС, чем к ГСПБ Однако, моноклональные антитела, полученные к ГС мозга овцы (фирмы Biogénesis, Великобритания), узнавали только ГС в иммуноблоттинге (рис 4) Поликлональные антитела, полученные к ГС мозга человека, узнавали ГС и ГСПБ при ECL-вестерн-иммуноблоттинге экстрактов мозга человека.

67

43

!

I \

картина окрашивания ГС и ГСПБ в экстракте легко растворимых белков ткани |лозга человека зависела от разведения сыворотки (антител): окрашенные зоны, соответствующие обоим белкам, получались при разведении антител 1:12000 (данные це показаны на рисунке), а при дальнейшем разведении антител (1:15000) окрашивалась одиночная зона белка, соответствующая ГСПБ (рис. 4).

i i

| 12

I Рисунок 4, Окраска ГС и ГСПБ в экстрактах «легко

j j растворимых белков» из замороженной ткани мозга

человека методом ECL-иммуноблоттинга. Шкала молекулярных масс приведена слева. Экстракты ткани мозга человека (10 мкг на 1 дорожку) подвергали разделению ЭФ в 10% ПААГ с ДС-Na с последующим ECL-иммуноблоттингом. 1 - окраска моноклональ-ными антителами к ГС (Biogenesis, Великобритания), j Г.' 1:80000, 2 - окраска поликпональными антителами,

! гоШ • 7 1:15000.

I

Таким образом, ГС и ГСПБ обладают не только общей ферментативной активностью (способностью катализировать трансферазную реакцию), но и дают Сильную «перекрестную» реакцию в твердофазном ИФА. Однако, использование штител, реагирующих с ГС и ГСПБ, и ECL-иммуноблоттинга (но не твердофазного 1ФА) в качестве метода исследования дает возможность оценить относительное <оличество иммунореактивных ГС и ГСПБ, присутствующих в одном образце (в кстракте мозга), благодаря различным молекулярным массам субъединиц ГС и "СПБ (разделенных ЭФ в ПААГ с ДС-Na) [Boksha et al. 2000].

Глутаматдегидрогеназа (ГДГ) мозга человека

Обнаружение, выделение и исследование изоформ ГДГ мозга человека. При ¡азработке способа выделения и очистки ГДГ белки экстрагировали из ткани мозга ;иц без психических отклонений. Экстракцию проводили буфером с добавлением Детергента (1% Тритона Х-100) и 0,5 М NaCl. Экстракт хроматографировали на колонке с фенил-сефарозой 4В. При элюции с колонки линейно повышающимся градиентом концентрации (0-> 90%) этиленгликоля были получены три белковые фрак-

ции, проявляющие активность ГДГ (рис. 5) Наблюдаемая картина позволила предположить существование нескольких изоформ ГДГ, различающихся гидрофобно-стью.

Для разделения с последующим выделением и очисткой индивидуальных изоформ ГДГ разработаны способы, основанные на дифференциальном центрифугировании, фракционировании сульфатом аммония, колоночной гидрофобной (на фенил-сефарозе 4В), ионообменной - (на сефарозе 0 и ДЭАЭ-сефацеле), сорбцион-ной (на оксиапатите) и аффинной (на ГТФ-агарозе) хроматографии. При этом для получения двух легко растворимых изоформ ГДГ исходным материалом служит экстракт ткани, полученный с буфером низкой ионной силы без детергентов, а для получения ассоциированной с мембранами изоформы - буфером повышенной ионной силы (0,5 М ЫаС1) с добавлением детергента (1% Тритона Х-100). Разделение легко растворимых и ассоциированной с мембраной изоформ ГДГ в основном достигается на этапе экстракции из ткани Разделение двух легко растворимых ГДГ обеспечивается на этапе сорбционной хроматографии.

Итак, в результате многостадийных процедур фракционирования удалось получить высокоочищенные препараты трех изоформ ГДГ - двух «легко растворимых» (ГДГ I и II) и одной ассоциированной с мембранами (ГДГ III) (рис. 6, рис 7) и охарактеризовать их свойства Показано, что измеряемая в белковых экстрактах мозга ферментативная активность ГДГ складывается из активностей различных изоформ (присутствующих одновременно в соизмеримых количествах), хотя биохимические свойства (кинетические константы взаимодействия с субстратами, термоустойчивость, гидрофобность) выделенных и очищенных изоферментов ГДГ различны Подход к решению проблемы анализа ферментов, представленных в мозге несколькими изоформами, упоминался выше - это разработка иммунохимического способа количественного обнаружения. Были получены специфические поликло-нальные антитела, окрашивающие при иммуноблотгинге две легко растворимые ГДГ I и II, а также поликлональные антитела, окрашивающие ассоциированную с мембранами изоформу ГДГ III [ВигЬаеуа й а1. 2002, Воробьева 2003] Эти иммунологические зонды позволили провести сравнительную оценку количества изоферментов ГДГ в экстрактах различных образцов мозга человека [ВигЬаеуа et а1, 2002, 2003].

О 20 40 60 80 1 00 1 20 1 40

ф р а кц и и

Рисунок 5. Профиль элюции белков мозга человека, экстрагированных 1% тритоном + 0,5М ЖС1, при хроматографии на колонке с фенил-сефарозой 4В. Черными символами обозначен профиль поглощения А28о> белыми - профиль активности ГДГ, ЭГ - этиленгликоль (прямая - градиент концентрации ЭГ в элюирующем буфере).

Рисунок 6. Электрофореграмма изоформ ГДГ I и II (смесь) и ГДГ III (электрофорез в 10% ДС-Иа-ПААГ). 1 - белковые маркеры и значения их молекулярных масс, кДа, 2 -смесь ГДГ I и ГДГ II, молекулярная масса субъединиц - 58 и 56 кДа, 3 - ГДГ III, молекулярная масса субъединиц 56 кДа.

Рисунок 7. Электрофореграмма ГДГ I и ГДГ II (электрофорез в 10% ПААГ с ДС-№).

Слева - смесь ГДГ I и ГДГ II, молекулярная масса субъединиц: 58 и 56 кДа, средняя дорожка - очищенная ГДГ I, молекулярная масса субъединяц 58 кДа, правая дорожка - очищенная ГДГ II, молекулярная масса субъединиц 56 кДа.

т*

! Ф*

1 г з

Приведенные данные о существовании нескольких изоформ ГДГ мозга человека могут служить объяснением расхождений во мнениях, встречающихся в литературе относительно клеточной локализации ГДГ в ЦНС (преимущественно глиаль-ной или глиально-нейрональной) [Aree et al 1990; Subbalakshmi & Murthy 1985, Aoki et al 1987, Kaneko et al. 1987, Rothe et al. 1990, Schmitt & Kugler 1999]. Изоформы ГДГ могут представлять продукты разных генов, но могут и транслироваться с различных мРНК ГДГ, образованных путем альтернативного сплайсинга, или образовываться в результате посттрансляционных модификаций. Показана множественность генов (и наличие псевдогенов) ГДГ в геноме человека, по меньшей мере три гена функциональны [Anagnou et al 1993, Deloukas et al. 1993, Tzimagiorgis et al 1993, Michaehdis et al. 1993, Mavrothalassitis et al. 1988, Shashidharan et al 1994]

Итак, разработанные иммунохимические способы оценки относительных количеств изоформ ГДГ позволяют провести сравнительные исследования уровней этих изоформ в контрольных образцах мозга и при патологии (образцы мозга от больных хронической шизофренией)

Ферменты метаболизма глутамата в мозге в норме и при шизофрении

Основная методология, применяемая на этом этапе исследований - сравнение относительного количества ферментов метаболизма глутамата в экстрактах аутоп-сийных образцов мозга контрольной группы и больных шизофренией. Экстракты белков ткани мозга готовили двумя различными способами - с использованием буфера низкой ионной силы без детергентов («цитоплазматические легко растворимые белки») и с добавлением детергента (ДС-Na) при нагревании («лизаты»), В первом случае исследования проведены на образцах префронтальной коры (ПФК), причем параллельно оценивались «общие, или суммарные» ферментативные активности всех изоформ и сравнивалось относительное количество каждого изофермента им-мунохимическим способом Во втором случае исследования проведены на образцах трех структур мозга (ПФК, хвостатого ядра и мозжечка), причем сравнивалось относительное количество каждого изофермента иммунохимическим способом (ферментативные активности не определялись, т.к. ферменты инактивировались) Этим способом более полно извлекаются исследуемые белки, но подвижность изоформ ГДГ I и II при электрофорезе с ДС-Na такова, что они плохо разрешаются на электрофоре-граммах, поэтому их оценивали вместе (ГДГ I+II).

ГС, ГСПБ и ГДГ в цитоплазматической фракции ПФК контрольной группы и больных шизофренией

Сравнительное исследование относительных количеств ГС, ГСПБ и изоформ ГДГ у лиц контрольной группы и больных шизофренией проведено иммунохимическим методом ЕСЬ-вестерн-иммуноблоттинга с параллельной оценкой ферментативной активности ГДГ и трансферазной активности [ВокэЬа е! а1 2000; Терешкина и др 2000, ВигЬаеуа а1 2002]. Наблюдалось достоверное (Р<0,01) повышение ферментативной активности ГДГ и количества всех трех ее изоферментов, а также разнонаправленные изменения количества ГС и ГСПБ (т е увеличение ГСПБ и снижение ГС) в группе больных шизофренией по сравнению с контрольной [Терешкина и др 2000, ВигЬаеуа ег а1. 2003]

ГС, ГСПБ, ГДГ и глиальные белки в трех структурах мозга контрольной группы и

больных шизофренией Следующим этапом работы было комплексное сравнительное исследование

относительного количества ГС, ГСПБ и трех изоферментов ГДГ, а также трех гли-альных белков - центрального фермента энергетического метаболизма - креатин-фосфокиназы ВВ (КФК ВВ), глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ) и основного миелинового белка (ОМБ) в группе контроля и у больных шизофренией Сравнительные исследования групп (контрольной и больных шизофренией) проведены на фракции белков, полученных экстракцией буфером с ДС-Ыа («лизаты») [Бурбаева и др.2007, ВигЬаеуа ег а1. 2007] Это исследование было проведено на более многочисленных обследуемых группах, чем в предыдущем случае, (22 случая контроля и 23 - больных шизофренией) одновременно на трех структурах мозга к ПФК были добавлены хвостатое ядро (ХЯ) и мозжечок

Хотя обследуемые группы (больные и контроль) не различались достоверно по возрасту и времени с момента смерти до момента взятия материала (постморальному интервалу - ПМИ), было неизвестно, влияют ли эти параметры на количества исследуемых белков. Поэтому был проведен поиск корреляционных связей между количествами белков с возрастом представителей каждой группы и ПМИ.

Количество ГФКБ в мозжечке достоверно коррелировало с возрастом пациентов в обеих группах (больных и контрольной) (11=0,66, р=0,0007 и 11=0,64,/?=0,002)

В контрольной группе количество ГФКБ отрицательно коррелировало с ПМИ в ПФК (R= - 0,71, />=0,0002). На биохимические параметры в группе больных шизофренией ПМИ не оказывал влияния

Было проведено сравнение относительного количества всех перечисленных белков (ГС, ГСПБ, ГДГI, II и III, КФК ВВ, ГФКБ и ОМБ) в трех указанных структурах мозга у лиц контрольной группы Применялся статистический метод ANOVA Крускал-Уоллиса, а различия считали достоверными при Р<0,007, т.е после введения поправки Бонферрони Количество ГС, КФК ВВ и ОМБ оказалось достоверно различным в ПФК, ХЯ и мозжечке (количество остальных белков в этих структурах достоверно не различалось) Наиболее сильное различие между медианами значений, определенных в трех структурах, наблюдалось для ГС' минимальное количество ГС было обнаружено в мозжечке, за ним следовали ХЯ и ПФК (Р=0,0003). Наименьшее количество КФК ВВ было также обнаружено в мозжечке, за ним следовали ПФК и ХЯ (Р=0,0001) Сходным образом, наименьшее количество ОМБ было обнаружено в мозжечке, за ним следовали ПФК и ХЯ (Р=0,002)

В группе больных шизофренией количество ГС и ГДГ III оказалось различным в проанализированных структурах мозга Так, низшие уровни ГС были обнаружены в мозжечке и ХЯ, высший - в ПФК (Р=0,0001). Низший уровень ГДГ III опять найден в мозжечке, он достоверно отличался от ПФК и ХЯ (Р=0,003) Количество остальных белков в трех структурах мозга достоверно не различалось

Затем было проведено сравнение между группой контроля и группой больных шизофренией количества тех же белков в тех же трех структурах мозга

Достоверные различия (повышение в группе больных по сравнению с контролем, Р<0,007 с учетом корректировки Бонферрони) обнаружены в случае ГС в ПФК (различие медиан в 2,25 раза); в ХЯ достоверно различались количества ГДГ I+II (двукратно), а в мозжечке ГС, ГСПБ (двукратно) и ГДГ I+II (в 1,6 раз).

Интересно, что в работе с цитоплазматической фракцией ПФК мы наблюдали достоверно сниженный уровень ГС при шизофрении по сравнению с контролем, тогда как в экстрактах ПФК с детергентом количество ГС оказалось достоверно по-

ышенным Эти результаты указывают на возможность «перехода» ГС из цито-лазматической в мембранную фракцию при шизофрении

Отметим, что при шизофрении картина изменений количества метаболизи-ующих Глу ферментов различна в разных структурах мозга Действительно, как в орме, так и при патологии регуляция экспрессии генов (например, гена ГС) зависит т области мозга [КЪеШ е1 а1 1990].

Хотя в каждой из обследованных областей мозга образцы от больных досто-ерно отличались от контроля по меньшей мере по одному из определяемых пара-етров, зона «перекрытия, или смешения» значений для «больных» и «контроля» оставила существенную долю для любого из параметров. Рассмотрим, например, оличество ГДГ1+И, ГС и ГСПБ, измеренное в образцах мозжечка обеих групп На иаграмме (рис 8) различными символами показано количество этих белков (в отн. д [Бурбаева и др 2007, ВигЬаеуа е! а1. 2007]) для каждого объекта. Символы рас-ределены в парные колонки: красные для каждой пары символов - больные ши-офренией, серым отмечены представители контрольной группы, а горизонтальные инии соответствуют медианам по группам. При сравнении групп «больные шизоф-енией» с «контрольной» с помощью непараметрического теста Манна-Уитни для сех трех белков были получены достоверные различия между группами (ГДГ1+Н -=0,002, ГС -р=0,0005, ГСПБ -/И),0001)

Из данных диаграммы (рис. 8) видно, что в случае ГС и ГСПБ даже при почти вукратном различии медиан группы сильно смешаны между собой: зона перекры-ия настолько велика, что лишь 2 «контрольных» объекта и 7 «больных» выходят за е пределы в случае ГС (6 и 9 объектов, соответственно, в случае ГСПБ, т е по это-у параметру получается лучшее разделение групп).

Как видно, в образцах от двух исследуемых групп наблюдаются количествен-ые различия по ряду параметров, но в случае любого отдельно взятого параметра аблюдается значительное «смешение» групп В связи с этим у нас возникло пред-оложение о продуктивности комплексного подхода в анализе биохимических анных.

Комплексный подход в исследовании белков мозга

Изложенные цели и задачи были ориентированы на выдвигаемую нами гипотезу о том, что уровни метаболизирующих глутамат ферментов и ключевых глиаль-ных белков в различных областях мозга здоровых людей регулируются совместно и взаимосвязаны Проверке этой гипотезы посвящен следующий экспериментальный раздел Вначале был проведен поиск коррелятивных связей между количествами ферментов и глиальных белков в трех разных структурах мозга у лиц контрольной группы Структуры рассматривали попарно: ПФК/ХЯ, ХЯ/мозжечок и ПФК/мозжечок) Коррелятивные связи считали достоверными при Р<0,007 (с поправкой для множественных сравнений) В ряде случаев наблюдалась взаимозависимая регуляция количества отдельно взятого белка в разных структурах мозга Так, уровни ГСПБ достоверно связаны между собой в ПФК и ХЯ (коэффициент корреляции К—0,58), Для каждого из белков — ГСПБ и ГФКБ — наблюдались достоверные корреляции их количества в ХЯ и мозжечке (11=0,57 и 11=0,70, соответственно)

В группе больных шизофренией связи, характерные для группы контроля, отсутствовали Исчезновение коррелятивных связей, типичных для контрольного мозга, свидетельствует о том, что при шизофрении нарушаются регуляторные механизмы, поддерживающие в норме гомеостаз нейромедиаторных систем и глиальных клеток. В то же время, в группе больных, в отличие от контроля, появились новые коррелятивные связи- количество ГС оказалось связанным в ПФК и ХЯ (11=0,54), а ГДГ 1+П - в ПФК и мозжечке (11=0,55). Возможно, появление новых связей служит свидетельством включения компенсаторных механизмов в мозге при шизофрении.

Связи между количеством ферментов и других белков в трех структурах мозга в каждой обследуемой группе (контроль, шизофрения) Анализ корреляционной матрицы позволил обнаружить достоверные связи (непараметрический анализ - коэффициенты Спирмена с поправкой Бонферрони) между количествами анализируемых ферментов/белков (ГС, ГСПБ, ГДГ I, II и III, КФК ВВ, ГФКБ и ОМБ) в пределах каждой из структур мозга в контрольной группе Картина обнаруженных коррелятивных связей схематично изображена на рис. 9

Аналогично обнаружены достоверные связи в группе больных шизофренией Картина коррелятивных связей схематично изображена на рис. 10

Общая картина коррелятивных связей, очевидно, изменена в группе больных шизофренией по сравнению с контрольной группой

нок 8 Относительные количества ГДГ1+И, ГС и ГСПБ в мозжечке больных френией (красные символы) и контрольной группы (серые символы) начения ГДГ1+11 - кружочки, ГС - ромбики, ГСПБ - треугольнички.

I-1! 1)1 I»

ГСПБ

1>-1\ Ы12-1

Рисунок 9 Картнна коррелятивных связей между ожосительиыми количествами ферментов метаболизма гпутамата (ГС, ГСПБ, ГДГ) н других ишальныч белков (КФК ВВ, ОМБ, ГФКБ) в трех структурах мозга лиц контрольной группы Красным показаны святи в префронгальной коре, зглепым - в хностаюм ядре, черным - в мозжечке Первое число - Я, коэффициент корреляции Спнрмепа, второе - Р Жирными линиями на Рнс 9-10 выделены связи, достоверные после корректировки Бонферрони

ГСП? 1, Ч <1 "■! ГДГ 1*11"

П.!. ^ гЛ.'.

Рисунок 10 Картнна корреляционных связей между относительным« количествами ферментов метаболизма глутамата (ГС, ГСПБ, ГДГ) и других глиальных белков (КФК ВВ, ОМБ, ГФКБ) в трех структурах мозга больных шизофренией Красным показаны связи в префронтальной коре, Jc.nL.4i.TM - в хвостатом ядре, черным - в мозжечке Сделками указаны достоверные изменения ири шизофрении но сравнению с контролем

Наблюдения позволили выдвинуть гипотезу о системных нейрохимических менениях в мозге при шизофрении [Boksha et al, 2006, Boksha, 2007, Бурбаева с оавт 2007, Burvaeva et al, 2007].

Кластерный анализ нейрохимических данных Применяя в качестве основной методологии сравнение относительных коли-еств ферментов метаболизма глутамата и глиальных белков в экстрактах аутопсий-ых образцов мозга контрольной группы и больных шизофренией, мы обрабатывали ейрохимические данные с помощью статистических методов непараметрического нализа (пользуясь программой Statistica, версия 6 0) С помощью такого подхода ыла получена информация о достоверных различиях между группами (больных онической шизофренией по сравнению с контролем) по некоторым отдельным араметрам Однако, «классические» методы непараметрического анализа не позво-ют составить полной картины, в которую вносили бы вклад все измеряемые пара-етры

Таким требованиям (одновременного учета многочисленных разнородных па-аметров) удовлетворяет кластерный анализ, который представляется адекватным нформативным способом описания и обработки информации, полученной нейро-имическими методами

Действительно, кластерный анализ (с помощью программы Clust - см мето-ы) 25 параметров-признаков (количества пяти ферментов - ГС, ГСПБ, ГДГ I+II, ДГ III, КФК ВВ и двух глиальных белков - ГФКБ и ОМБ, определенных в ПФК, ■ и мозжечке, а также таких признаков, как возраст, пол, ПМИ и диагноз - отсут-вие/наличие шизофрении) на выборке из 44 объектов (лица контрольной группы и ольные шизофренией) позволил отделить случаи психически здоровых от больных изофренией с высокой степенью достоверности (средняя ошибка смешения < 20%, « 0,00004) Таким образом, группы «психически здоровые» и «больные шизофре-ией» объективно составляют различные «метаболические типы» [Бурбаева и др, 08]: больные характеризуются повышенными количествами ключевых ферментов етаболизма Глу.

Измерения количества компонентов глутаматной системы в периферической

крови

Далее описаны экспериментальные подходы к моделированию на тромбоци-х (элементах периферической крови) биохимических закономерностей, установ-

ленных в ЦНС, и поиск корреляционных связей между количеством ферментов метаболизма Глу в тромбоцитах и тяжестью психической патологии при шизофрении.

Обнаружение ГСПБ и изоферментов ГДГ в тромбоцитах лиц контрольной группы В экстрактах тромбоцитов человека количества иммунореактивной ГС и ассоциированной с мембраной изоформы ГДГ III оказались ниже порога обнаружения методом ECL-иммуноблоттинга с использованием моноклональных (Biogenesis) либо поликлональных [Boksha et al 2000, Burbaeva et al. 2003] антител соответственно Однако, в тромбоцитах человека нам удалось обнаружить ферменты метаболизма Глу - ГСПБ и два легко растворимых изофермента ГДГ I и ГДГ II [Boksha 2006, Бурбаева и др 2003, Burbaeva et al 2006] Эти ферменты обнаруживаются по специфической активности и иммунореактивности (возможно их количественное обнаружение антителами, полученными к мозговым изоформам этих ферментов) (рис 11) Значит, наряду с ранее обнаруженной глутаминазой [Gluck et al 2000], тромбоциты человека содержат ферменты метаболизма Глу - ГСПБ и две изоформы ГДГ

Рисунок 11. Картина окрашивания экстрактов тромбоцитов, полученных экстракцией с ДС-Na, в ECL-вестерн-иммуноблоттинге с антителами к ГСПБ (слева) и ГДГ I, II (справа) Числа справа и слева - молекулярные массы субъединиц, посередине - положения белковых стандартов молекулярных масс.

ГСПБ и ГДГ I+II были обнаружены в количествах, поддающихся сравнительному анализу, у всех обследованных лиц без психической патологии (33 человека, составившие контрольную группу) Относительное количество иммунореактивных белков (ГСПБ, ГДГ1+П) в каждом контрольном случае оценивались с использованием калибровочной кривой, построенной с использованием «внутреннего стандарта»

ЩЮа

Ж.

--~58kDa

~55kDa —mi м--56 Юа

43

ГСПБ ГДГ1,И

Тромбоцитарные ГСПБ и ГДГ в контрольной группе и у больных шизофренией (до и в ходе антипсихотического лечения)

ГСПБ и ГДГ1+И были обнаружены в достаточных для сравнительного анализа оличествах также и у всех 40 обследованных больных шизофренией Относитель-ые количества иммунореактивных ГСПБ и ГДГ 1+П у каждого больного оценива-ись и выражались в тех же единицах, что у лиц контрольной группы

В наших исследованиях проверялась гипотеза о том, что (1) уровень фермен-ов, метаболизирующих Глу, может быть изменен в тромбоцитах больных шизоф-енией по сравнению с контролем, и что (2) на этот уровень может влиять лечение типичным нейролептиком - оланзапином, который, как известно, может модулиро-ать концентрацию Глу в мозге и плазме крови [Оо£Г е! а1,2002]

Группы (контроль и больные) были уравнены по возрасту (18-63 года) и со-тношению представителей обоих полов Количество ГСПБ и ГДГ 1+Н измеряли в онтрольной группе однократно, а у больных - до и после «интенсивной» и «под-ерживающей» фаз лечения

Хотя количество ГДГ1+П в двух группах достоверно не различалось, количе-тво ГСПБ в тромбоцитах больных до начала антипсихотического лечения оказа-ось достоверно больше, чем в контрольной группе, р<0,01 Отметим, что это согла-уется с данными о повышенном уровне ГСПБ в мозге больных шизофренией и моет свидетельствовать о системной регуляции экспрессии гена, кодирующего этот ермент.

В контрольной группе наблюдалась корреляционная связь между уровнями СПБ и ГДГ (корреляция по Спирмену 11 = 0,414; Р = 0,02).

В группе больных связь между уровнями ГСПБ и ГДГ была обнаружена до ачала антипсихотического лечения (корреляция по Спирмену 11= 0,616, Р = ,00002) Корреляций между количествами исследуемых ферментов и полом или озрастом ни в группе контроля, ни в группе больных не обнаружено (р>0,1)

Вариабельность количества ГСПБ и ГДГ, измеренного до лечения, оказалась ысокой, поэтому была выделена подгруппа больных, обладающих изначально ровнем ГСПБ выше медианы по всей группе (т е половина всех больных) В этой одгруппе было обнаружено, что уровни ГСПБ достоверно изменяются как после

интенсивной, так и после поддерживающей фазы лечения (Р= 0,007 и 0,004, соответственно, метод парных сравнений Вилкоксона). В этой подгруппе в целом общее снижение ГСПБ оказалось достоверным и по критерию Манна-Уитни (Р=0,009 и 0,003, соответственно), но после поддерживающей фазы лечения все еще отличалось от контроля (Р = 0,0001, U-тест Манна-Уитни) Количество ГДГ в этой подгруппе достоверно изменилось в результате лечения (Р = 0,002 и 0,025 после острой и поддерживающей фаз соответственно, метод парных сравнений Вилкоксона), и было неотличимым от контрольной группы (U-тест Манна-Уитни, Р>0,1)

Таким образом, количество ГСПБ и ГДГ достоверно изменяется в ходе лечения больных шизофренией оланзапином, что подтверждает влияние этого атипичного нейролептика на метаболизм Глу и согласуется с известным фактом модуляции оланзапином уровня Глу в мозге и плазме крови больных шизофренией [Goff et al 2002] Отмечено также уменьшение разброса уровней ГСПБ и ГДГ (в результате лечения в группе больных уровни ГСПБ не нормализуются, но «выравниваются»)

В ходе клинического обследования состояние больных оценивалось врачами не только традиционным клинико-психопатологическим методом, но и с помощью психометрической шкалы выраженности позитивных и негативных синдромов шизофрении (PANSS), которая позволяет количественно оценить тяжесть психической патологии и наличие или отсутствие эффекта лечения

В связи с этим с разрешения врачей клинического отделения НЦПЗ РАМН (руководитель - д м н М А Морозова) мы использовали соответствующие количественные показатели для установления клинико-биохимических корреляций. Основные данные «суммарной оценки» по PANSS в обследованной нами группе больных были следующими- до лечения - 76,5 (54-127) баллов, в фазе интенсивного лечения - 51 (50-102) балл и в фазе поддерживающего лечения - 49 (30-93) баллов.

Клиническая реакция на лечение оланзапином была определена a priori как снижение «суммарной оценки» по PANSS на 20% и более от начального уровня (до лечения). Эта клиническая реакция была использована в качестве критерия, по которому разделялись больные с выраженным эффектом терапии («респондеры») и с отсутствием такового («нонреспондеры»). Проведен анализ т. наз «кривой выжи-

аемости» с применением корреляционного регрессионного анализа данных [Реб-ова, 2002] (Survival Analysis, регрессионная модель программы Statistica 6.0).

Анализ кривой «выживаемости» в регрессионной модели для всей группы

ольных позволил определить регрессионный параметр (ß) для ГСПБ в ходе под-

ерживающей фазы он составил /3= - 0,00276 (значение t = -2,453, константа с =

,854, получилось значимое значение критерия хи квадрат х2 = 4,795, р = 0,0285).

араметр регрессии ß отрицателен, значит, количество ГСПБ и время перехода па-

иентов в категорию «респондер» связаны обратной корреляцией, т.е чем больше

личество ГСПБ в тромбоцитах до лечения пациента, тем меньшее время необхо-

мо для перехода этого больного в категорию «респондер» Число недель от начала

чения до этого момента связано с количеством ГСПБ, измеренным до начала ле-

ния, следующей зависимостью

=ехр(2 854-0 00276«ГСПБ), где S - число недель от начала лечения, ГСПБ - коли-ество ГСПБ (отн ед), измеренное до начала лечения

ыводы

На основании проведенных фундаментальных исследований установлены единст-и сопряженность нейрохимических процессов в глутаматергической системе, ротекающих на уровне мозга и периферической крови человека - как в норме, так при развитии психической патологии

2) Впервые определена аминокислотная последовательность ГС мозга человека, ставляющая 24% длины гипотетического продукта трансляции кДНК ГС человека идентичная имеющейся в базе данных Swiss Prot последовательности ГС печени еловека (PI5104) Установлено, что по четвертичной структуре ГС мозга человека

ляется гомооктамером.

3) Установлено, что ГДГ мозга человека представлена тремя изоформами (легко астворимые ГДГ I, ГДГ II и ассоциированная с мембранами ГДГ III), которые вы-елены в электрофоретически гомогенном виде и охарактеризованы биохимически.

4) В ткани мозга человека обнаружен и биохимически охарактеризован ГСПБ, обладающий т vitro трансферазной ферментативной активностью ГС и дающий перекрестную иммунологическую реакцию с антителами, специфичными к ГС мозга животных и человека

5) Сравнительные исследования экстрактов трех структур аутопсийного мозга -префронтальной коры, хвостатого ядра и мозжечка - выявили различия между этими структурами в количестве ГС и ГДГ ИГ у психически здоровых различается только количество ГС (минимальное - в мозжечке, максимальное - в префронтальной коре), а у больных шизофренией - ГС и ГДГШ (в мозжечке количество этих ферментов меньше, чем в двух других структурах).

Установлены положительные корреляционные связи как между концентрациями отдельных ферментов метаболизма глутамата, так и этих ферментов с уровнями глиальных белков КФК ВВ, ГФКБ Эти корреляционные связи характерны для каждой структуры мозга, при этом общая картина связей различается у здоровых и больных шизофренией

Типы метаболизма глутамата различаются у психически здоровых людей и больных шизофренией в мозге больных достоверно повышено количество ГС, ГСПБ и ГДГ по сравнению со здоровыми

6) Методами определения ферментативной активности и ECL-иммуноблоттингом в тромбоцитах крови выявляются ГСПБ и изоформы ГДГ I и II ECL-иммуноблоттинг позволяет определить относительные количества ГСПБ и изофер-ментов ГДГ в тромбоцитах крови У больных шизофренией количество ГСПБ в тромбоцитах выше, чем у здоровых.

7) Изменения количества ГСПБ и ГДГ при шизофрении по сравнению с контролем обнаруживаются в мозге и элементах периферической крови, что позволяет говорить о нарушениях метаболизма глутамата при шизофрении в организме в целом, т е как на гуморальном, так и на мозговом уровнях

8) Количество ГСПБ и ГДГ достоверно изменяется в ходе антипсихотического лечения, что свидетельствует о влиянии такой терапии на метаболизм глутамата Изучение влияния атипичного нейролептика оланзапина позволяет предположить,

то его эффект связан с действием на глутаматную систему (помимо известного ействия на другие нейромедиаторные системы).

9) Результаты работы подтверждают правомочность существования глутаматной ипотезы патогенеза шизофрении, которая может быть представлена следующим бразом: в патогенезе шизофрении играют роль не только рецепторы и переносчики лутамата, но также ферменты обмена глутамата При этом особенности метаболиз-а глутамата при шизофрении состоят в изменениях количества ключевых метабо-ических ферментов в мозге и крови больных по сравнению с психически здоровы-и лицами, а также в изменениях корреляционных связей между концентрациями тих ферментов в мозге больных по сравнению с психически здоровыми

ПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1 Бокша И С , Данилов В С , Лебедева Н В Биосенсор для экспресс-анализа ионов аммония // Биологические науки (МГУ) - 1992 - №5 -С 71-77

Бокша И С , Данилов В С. Ферментативный способ определения ионов аммония в растворе зт Свидет-во 1752766 бюлл No 9229, 05 11 1992

3 Бокша И С Глутаминсинтетаза мозга человека //Нейрохимия (Москва) -1995 -Т 12, №2 -С 62-63

Бокша И С, Бурбаева Г Ш, Терешкина Е Б Очистка и некоторые свойства глутаминсинтетазы озгачеловека //Биохимия -1995 -Т 60,№10-С 1299-1303

5 Tereshkma Е В , Boksha IS , Burbaeva G Sh Metal ion actions on the activity of human brain glutamine synthetase 8-th International Congress of the Czech and Slovak Neurochemical Soc, Martin, Slovakia (Proceedings) 1996 -P 34

6 Boksha IS , Tereshkma E В, Burbaeva G Sh Partial primary structure of human bram glutamine synthetase //J Neurochemistry -1998-V 71 SI -P S84A

7 Burbaeva G Sh , Boksha I S , Tereshkma E В , Savushkma О К Biochemical approaches to the brain glutamate metabolism study in schizophrenia // Schizophrenia Res -1999 -V 36, N1-3 -P 70

8 Бокша И С , Терешкина Е Б , Турищева М С , Савушкина О К, Воробьева Е А , Бурбаева Г Ш Гетерогенность глутаминсинтетазы и глутаматдегидрогеназы мозга человека Тезисы докладов конференции "Механизмы структурной, функциональной и нейрохимической пластичности мозга" -1999-М-С 16

9 Boksha I S , Tereshkma Е В , Burbaeva G Sh Glutamine synthetase and glutamine synthetase-hke protein from human brain Purification and comparative characterization //J Neurochemistry -2000 -V 75 -P 2574-2582

10 Терешкина Е Б , Бокша И С, Савушкина О К, Бурбаева Г Ш Глутаминсинтетаза и белок, подобный глугаминсинтетазе, во фронтальной коре больных шизофренией !ГЖ Невропатол и психиатрии им С С. Корсакова - 2000,-№ 7 -С 51-53

11 Boksha I S , Tereshkina Е В , Savushkina О К, Burbaeva G Sh Alterations of glutamine synthetase levels in schizophrenic posterior cingulate cortex //Schizophrenia Res -2000 - V 41 N1 - P 256

12 Burbaeva G Sh, Boksha I S , Tunshcheva M S , Savushkina О К, Tereshkina E В Increase of glutamate dehydrogenase level m frontal and cingulate cortex in schizophrenia // Schizophrenia Res -2000-V 41, N1 -P 255

13 Бурбаева Г Ш, Бокша И С , Турищева M С , Савушкина О К, Терешкина Е Б , Воробьева Е А Нарушение метаболизма глутамата в мозге при психической патологии (болезни Альцгей-мера и шизофрении) //Вестник РАМН - 2001 -т 7.-С. 34-37

14 Burbaeva G Sh, Boksha IS , Tereshkina E В, Vorobyeva E В, Morozova M A, Jarkova N В, Tunshcheva M S, Savushkina О К Glutamate dehydrogenase immunoreactivity in platelets in schizophrenia //WorldJ Biol Psychiatry -2001 -V3S1.-P.32

15 Бокша И С , Шёнфельд Г -И, Ланген X, Мюллер Ф , Терешкина Е Б , Бурбаева Г Ш Глутаминсинтетаза мозга человека октамерная структура и гомология с глутаминсинтетазой печени человека //Биохимия - 2002 -т 67 -С 1012-1020

16 Boksha IS , Burbaeva G Sh , Savushkina О К Comparative studies of brain creatine kinase levels m various bram cortex areas in schizophrenia by ECL-immunoblottmg with the use of monoclonal antibody Boksha IS , Savushkina О К, Burbaeva G Sh NATO Advanced Research Workshop «Creatine Kinase and Brain Energy Metabolism Function and Disease 2003 Tbilisi, Georgia, June 14-18,2001 (http //spl bwh harvard edu 8000/conferences/ARW01/index html)

17 Burbaeva G Sh, Tunshcheva M S, Vorobyeva E В, Savushkina О К, Tereshkina E В, Boksha IS Diversity of glutamate dehydrogenase in human bram // Prog Neuropsyhopharmacol Biol Psychiatry -2002 -V 26,N3 -P 427-435.

18 Boksha I S , Schônfeld H -J Human bram glutamine synthetase-like protein is homologous to collapsin response mediator protem-2 In The Internat J Neuropsychopharmacology-2002-V 5, S.l, S191, Abstracts from the XXIIICINP Congress, Montréal, Canada, 23-27 June, 2002

19 Burbaeva G Sh, Boksha I S , Tunshcheva M S , Tereshkina E В , Savushkina О К Vorobyeva E A, Prokhorova T A Glial glutamate metabolizing enzymes m frontal cortex of patients with schizophrenia V-th European Meeting on Glial Cell Function m Health and Disease //Glia - 2002 V S 1 -PS80

20 Бурбаева Г Ш , Бокша И С , Турищева M С , Терешкина Е Б , Воробьева Е А, Савушкина О К Метаболизирующие глутамат ферменты в мозге и тромбоцитах больных шизофренией //Сибирский Вестник Психиатрии и наркологии -2003 -т 1 ,№27 -С 36-39

21 Burbaeva G Sh, Savushkina О К, Boksha IS Comparative study of creatine kinase BB decrease in brain of patients with Alzheimer's disease and schizophrenia // NATO Science Senes, IOS Press, Netherlands - 2003 -V 342 -P 125-132

22 Burbaeva G Sh , Savushkina О К, Boksha I S Creatine kinase BB in brain in schizophrenia //World J Biol Psychiat -2003-V 4-P 177-183

23 Burbaeva, G. Sh, Boksha, IS , Tunshcheva, M S, Vorobyeva, E A, Savushkina, О К, Tereshkina, E В Glutamine synthetase and glutamate dehydrogenase m prefrontal cortex of patients with schizophrenia. //Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry -2003 - V 27 -P 675-680

24 Burbaeva G Sh, Boksha IS , Tunshcheva M S , Tereshkina E В , Savushkina О К, Vorobyeva E A, Prokhorova T A Glial glutamate metabolizing enzymes in cingulate cortex in schizophrenia // Glia -2003 -V S2 -P. 65

25 Бокша И С Взаимосвязь нейронов и глиальных клеток через метаболизм глутамата в мозге здоровых людей и больных психическими заболеваниями //Биохимия -2004 - т 69, №7.-С 869-886

26 Burbaeva G Sh , Boksha IS , Tereshkina E В , Savushkina О К , Starodubtseva LI, Tunshcheva M S Glutamate metabolizing enzymes m prefrontal cortex of Alzheimer's disease patients, //Nerochem Res -2005 -V30.N11-P 1443-1451

27 Burbaeva G Sh , Boksha IS , Morozova M A, Starodubtseva L I, Tereshkina E В Platelet GSLP as predictor of olanzapine efficacy m schizophrenia. //World J Biol Psychiat -2005 -V 6(S1) P 249-250

28 Бокша И С Биохимические аномалии при аутизме //Аутизм и нарушения развития -2005 -Т 72, №2 -С 1-24

29 Бурбаева Г Ш , Бокша И С , Савушкина О К, Стародубцева Л И , Терешкина Е Б , Турищева М С , Брусов О С , Каледа В Г, Цуцульковская М Я, Морозова М А Компоненты глутамат-

ой системы в крови больных шизофренией прогностическая ценность и корреляция с клиническими параметрами // II Национальный кошресс по социальной психиатрии «Социальные преобразования и психическое здоровье» Труды -2006 - С 170

30 Бурбаева Г Ш , Бокша И С , Терешкина Е Б , Савушкина О К, Турищева М С , Стародубцева Л И, Брусов О С , Морозова М А Мониторинг ферментов метаболизма глутамата в тромбоцитах больных шизофренией в ходе лечения оланзапином Научно-практическая конференция с международным участием, посвященная 25-летию ГУ НИИ психического здоровья ТНЦ СО РАМН «Психическое здоровье населения Сибири и Дальнего Востока» Труды // Сибирский вестник психиатрии и наркологии -2006 -Т 41 - С 57-58

31 Burbaeva G Sh, Boksha I S , Tereshkina E В , Savushkina О К, Tunshcheva M S , Starodubtseva LI, Brusov О S , Morozova M A. Effect of olanzapine treatment on platelet glutamine syn-thetase-like protein and glutamate dehydrogenase lmmunoreactivity in schizophrenia //World J. Biol Psychiat -2006 -V 7,N2 -P 75-81

32 Boksha I S Glutamine synthetase-like protein in bram and blood of patients with schizophrenia Wellcome Trust Advanced course in Molecular Neurology and Neuropathology, UK, Proceedings 2006 -P 18

33 Boksha I S , Burbaeva G Sh, Savushkina О К , Starodubtseva L I, Tereshkina E В, Tunshcheva MS Glutamate Metabolism m Schizophrenia Systemic Approach //Abstracts of International Conference on Mood Disorders, Istanbul, Turkey - 2006 - P 90

34 Бурбаева Г HI, Бокша И С , Стародубцева Л И, Савушкина О К , Терешкина Е Б , Турищева М С , Прохорова Т А, Воробьева Е А , Морозова М А Нарушение метаболизма глутамата при шизофрении, наблюдаемое в мозге и тромбоцитах периферической крови // Вестник РАМН -2007-Т 3 -С 19-24

35 Бурбаева Г Ш , Бокша И.С , Воробьева Е А, Морозова М А , Прохорова Т А, Савушкина О К, Стародубцева Л И, Терешкина Е Б, Турищева М С Системные биохимические нарушения при шизофрении метаболизм глутамата // Психиатрия -2007 -Т 4, №28 - С 72-78

36 Boksha I S , Burbaeva G Sh, Tereshkina E В Systemic biochemical alterations in brain m schizophrenia 39th Annual General Meetmg of the European Brain and Behaviour Society 2007 Tn-este, Italy http //www sissa it/EBBS2007/

37 Burbaeva G S,, Boksha I S , Tereshkina E В , Savushkina О К , Starodubtseva LI, Turishcheva M S , Mukaetova-Ladinska E В Systemic neurochemical alterations in schizophrenic brain glutamate metabolism m focus //Neurochemical Res -2007.- V 32, N9 -P 1434-1444

38 Бурбаева Г HI, Бокша И С , Судаков С А, Мясоедов С Н, Савушкина О К, Терешкина Е Б, Стародубцева JIИ, Турищева М С, Воробьева Е А Использование кластерного анализа омплексной нейрохимической оценки глиальных метаболических ферментов и мажорных белков в мозге психически здоровых лиц и больных хронической шизофренией // Ж Неврол психиатрии им С С Корсакова. - 2008 -Т. 108, №2 - С 44-50

39 Boksha IS, Burbaeva G S, Savushkina О К, Tereshkina E В , Turishcheva M S, Starodubtseva LI, Vorobyeva E A Proteomics in biological psychiatry 4-th International Conference "Genomics, proteomics, bioinformatics and nanobiotechnologies for medicine" 2008. Moscow, Russia P 73

40. Бурбаева Г Ш , Бокша И С , Савушкина О К, Терешкина Е Б, Стародубцева Л И, Турищева М С, Воробьева Е А Ферменты метаболизма глутамата в тромбоцитах больных шизофренией Конференция «Взаимодействие науки и практики в современной психиатрии». Труды 2007 С 319-320.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

MALDITOF-MC - Времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной десорбцией с

матрицы и ионизацией

MSOX - метионинсульфоксимин

NAAG - N-ацетиласпартилглутамат

NMDA - N-метил-О-аспартат

PANSS - positive and negative syndrome scale

а-КГ - а-кетоглутаровая кислота

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГАМК - 7-аминомасляная кислота

ГДГ - глутаматдегидрогеназа

Глу - глутаминовая кислота

ГС - глутаминсинтетаза

ГСПБ - белок, подобный глутаминсинтетазе

ГФКБ - глиальный фибриллярный кислый белок

ДС-Na - додецилсульфат натрия

ИЭТ - изоэлектрическая точка

ИФА - иммуноферментный анализ

КФК ВВ - мозговая изоформа креатинкиназы

ОМБ - основной миелиновый белок

ПААГ - полиакриламидный гель

ПМИ - постмортальный интервал

ПФК - префронтальная кора

ХЯ - хвостатое ядро

ЦНС - центральная нервная система

ЭФ - электрофорез

Features of glutamate metabolism in schizophrenia

ne fundamental research has enabled to reveal unity and coupling between neurochemi-al processes at the levels of human brain (HB) and peripheral blood in norma and mental athology. Enzymes involved in HB glutamate (Glu) metabolism, such as glutamine syn-etase (GS) and Glu dehydrogenase (GDH) have been studied. Partial (-1/4) amino acid equence of HB GS proved to be identical to that of human liver GS, quaternary structure f HB GS is homooctameric. Three isoenzymes of HB GDH (readily soluble GDH I, II, d membrane-associated GDH III) are purified to apparent homogeneity on 1-D electro-horesis and characterized GS-like protein (GSLP) is revealed in HB tissue, purified and haractenzed Like GS, GSLP possesses in vitro specific enzymatic activity and cross-activity with antibodies to animal- and HB GS. Comparative immunochemical study of xtracts from postmortem HB prefrontal cortex (PFC), caudate nucleus (CN), and cerebel-m (CER) has revealed differences between these structures in GS and GDH III amounts nly GS is different m mentally healthy controls (with minimum in CER, and maximum in FC), and both - GS and GDH III - in schizophrenia (SCH) patients (minimum in CER) mounts of Glu metabolizing enzymes are linked together with positive correlative links, well as the levels of these enzymes are linked with amounts of glial proteins, such as eatine phosphokinase and glial fibrillary acidic protein (GFAP). These correlative links e typical for each brain structure, whereas general pattern of links in controls differs om that in SCH Concerted regulation of GSLP level is found m PFC and CN, and both, SLP and GFAP levels, are subjected to concerted regulation m CN and CER in controls, t not in SCH patients Healthy controls differ from SCH patients in types of brain Glu etabolism. total amounts of GS, GSLP, and GDH are elevated in the patients GSLP and DH I and II are detected in platelets by enzymatic activity and ECL-immunoblotting, hich enables to compare relative amounts of platelet GSLP and GDH GSLP amount in CH is higher than m control Changes in GSLP and GDH levels in SCH compared with ntrols are found in HB and peripheral blood thus enabling to judge of Glu metabolism pairment in whole organism in SCH, both at humoral and brain levels Changes in SLP and GDH amounts found in the course of antipsychotic treatment suggest the influ-ce of such therapy on Glu metabolism, the effect of olanzapine is likely associated with influence on Glu system in addition to its known effects on other neurotransmitter sys-ms. The results of the study confirm validity of glutamate hypothesis of SCH pathogenes, which can be presented as follows, enzymes of Glu metabolism play an important role mparable with that of Glu receptors and transporters in SCH pathogenesis, wherein the atures of Glu metabolism in SCH comprise the elevation in amounts of key enzymes in - and blood of patients with SCH compared with controls.

Исследованы ферменты, метаболизирукяцие глутамат (Глу) в мозге человека (М - глутаминсинтетаза (ГС) и глутаматдегидрогеназа (ГДГ) Определенная аминоки лотнал последовательность ГС (—1/4 длины полипептида) идентична таковой ГС п чени человека, по четвертичной структуре ГС является гомооктамером Очищены охарактеризованы три изоформы ГДГ МЧ (легко растворимые ГДГ I, II и ассоци рованная с мембранами ГДГ III). В ткани МЧ обнаружен и охарактеризован Г подобный белок (ГСПБ)' подобно ГС, ГСПБ обладает in vitro специфической фе ментативной активностью, а также способностью связываться с антителами к ГС МЧ и мозга животных Сравнительное иммунохимическое исследование экстракт аутопсийного МЧ - хвостатого ядра (ХЯ), префронтальной коры (ПФК) и мозжечка обнаружило различия между этими структурами в количестве ГС и ГДГ III. у пс хически здоровых (контроль) различается только количество ГС (минимум в мо жечке, максимум - в ПФК), а у больных шизофренией - различается количест обоих ферментов (минимум - в мозжечке). Проведенное исследование позволи установить единство и сопряженность нейрохимических процессов в МЧ - как норме, так и при шизофрении1 установлено, что уровни метаболизирующих Г ферментов в МЧ связаны положительными корреляционными связями, как меж собой, так и с количеством глиальных белков - креатинфосфокиназы и глиально фибриллярного белка (ГКФБ). Эти связи характерны для каждой структуры МЧ, п этом общая картина связей в контроле отличается от таковой при шизофрении контроле (но не у больных шизофренией) количество ГСПБ согласованно регулир ется в ХЯ и ПФК, а количество ГСПБ и ГФКБ - в ХЯ и мозжечке Контрольный М отличается от мозга больных шизофренией типом метаболизма Глу. количество Г ГСПБ и ГДГ повышено при шизофрении. ГСПБ и ГДГ I и II обнаружены в тромб цитах человека по ферментативной активности и методом ECL-иммуноблоттинг который позволяет сравнить относительное количество тромбоцитарных ГСПБ ГДГ- уровень ГСПБ при шизофрении выше, чем у психически здоровых Изменен уровней ГСПБ и ГДГ, обнаруженные в мозге и крови при шизофрении, позволя говорить о нарушении метаболизма Глу в организме человека как на гуморальн уровне, так и на уровне мозга Изменения в количестве ГСПБ и ГДГ в ходе антипс хотического лечения свидетельствует о влиянии такой терапии на метаболизм Гл действие оланзапина, вероятно, связано с его влиянием на глутаматную систему, н ряду с его известными эффектами на другие нейромедиаторные системы. Результ ты исследования подтверждают справедливость глутаматной гипотезы патогене шизофрении, которая может быть представлена следующим образом: ферменты м таболизма Глу в патогенезе шизофрении играют роль, сопоставимую со значени рецепторов и переносчиков Глу, причем особенность метаболизма Глу при шизо рении заключается в повышении количества ключевых ферментов - как в мозге, т и в крови больных - по сравнению с психически здоровыми.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N00510 от 01 12 99 г Подписано к печати 24 06 2008 г Формат 60x90 1/16 Услпечл 2,0 Тираж 100 экз Заказ 353 Тел 939-3890 Тел/Факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им М В Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Бокша, Ирина Сергеевна

I. ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЦЕЛЬ И ОСНОВНЫЕ ЗАДА ЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

НА УЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ РАБОТЫ

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. МЕТАБОЛИЗМ ГЛУТАМАТА В МОЗГЕ ЧЕЛОВЕКА

ВЗАИМОСВЯЗЬ НЕЙРОМЕДИА ТОРНЫХ СИСТЕМ

ГЛУТАМАТЕРГИЧЕСКАЯГИПОТЕЗА ШИЗОФРЕНИИ 16 МОЗГ ПСИХИЧЕСКИ ЗДОРОВЫХ ЛИЦ. СОПРЯЖЕННОСТЬ

ФУНКЦИИ НЕЙРОНОВ И ГЛИИ ЧЕРЕЗ МЕТАБОЛИЗМ ГЛУТАМАТА

ГЛУТАМАТ/ГЛУТАМИНОВЫЙ ЦИКЛ

СХЕМА МЕТАБОЛИЗМА ГЛУТАМАТА

СИНТЕЗ ГЛУТАМАТА В НЕЙРОНАХ

ДРУГИЕ ПУТИ БИОСИНТЕЗА ГЛУТАМАТА

УТИЛИЗАЦИЯ ГЛУТАМАТА В НЕРВНОЙ ТКАНИ 30 ВКЛЮЧЕНИЕ ГЛУТАМАТА В ПЕПТИДЫ

И ЕГО ОТЩЕПЛЕНИЕ ОТ ПЕПТИДОВ 32 ПОГЛОЩЕНИЕ ГЛУТАМАТА И СИНТЕЗ ГЛУТАМИНА

- ЭНЕРГОЗАВИСИМЫЕ ПРОЦЕССЫ

ВЛИЯНИЕ рН И ДЕФИЦИТА ЭНЕРГИИ НА МЕТАБОЛИЗМ ГЛУТАМАТА 36 ОТ ЧАСТНЫХ ВОПРОСОВ (ОТДЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ МЕТАБОЛИЗМА

ГЛУТАМАТА) К ОБЩЕМУ (СИСТЕМНЫЕ СВЯЗИ)

ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗА МОЗГА ЧЕЛОВЕКА

СТРУКТУРА ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗЫ МОЗГА ЧЕЛОВЕКА

ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗА МОЗГА ЧЕЛОВЕКА 42 НАРУШЕНИЯ МЕТАБОЛИЗМА ГЛУТАМАТА ПРИ ПАТОЛОГИЯХ

НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

ФЕРМЕНТЫ ОБМЕНА ГЛУТАМА ТА В МОЗГЕ ПРИ ШИЗОФРЕНИИ 47 ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ЛЕЧЕНИЮ ШИЗОФРЕНИИ

НА ОСНОВЕ «ГЛУТАМА ТНОЙ ГИПОТЕЗЫ» ЕЕ ПА ТОГЕНЕЗА 49 БИОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ

КРОВИ ПРИ ШИЗОФРЕНИИ 5 0 КОМПОНЕНТЫ ГЛУТАМАТНОЙ СИСТЕМЫ

В ТРОМБОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

III. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

КЛИНИКО-АНА ТОМИЧЕСКИЙ И КЛИНИЧЕСКИЙ МА ТЕРИАЛ

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ФЕРМЕНТОВ

ВЫДЕЛЕНИЕ ГС

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ИЗОФЕРМЕНТОВ ГДГ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ОЧИЩЕННЫХ БЕЛКОВ

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЭКСТРАКТОВ БЕЛКОВ ТКАНИ МОЗГА

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ 63 ВЕСТЕРН-ИММУНОБЛОТТИНГ С ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫМ

УСИЛЕНИЕМ СИГНАЛА

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ТРОМБОЦИТОВ

СТАТИСТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ.

ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗА МОЗГА ЧЕЛОВЕКА

СТРУКТУРА ГС МОЗГА ЧЕЛОВЕКА

ОБНАРУЖЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ГСПБ

ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗА МОЗГА ЧЕЛОВЕКА

И30Ф0РМЫ ГДГ МОЗГА ЧЕЛОВЕКА

СВОЙСТВА ОЧИЩЕННЫХ ИЗОФОРМ ГДГ 102 ФЕРМЕНТЫ МЕТАБОЛИЗМА ГЛУТАМАТА

В МОЗГЕ В НОРМЕ И ПРИ ШИЗОФРЕНИИ

ГС, ГСПБ И ГДГ В ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЕ 107 КОЛИЧЕСТВО ГС, ГСПБ, ГДГ И ГЛИАЛЬНЫХ БЕЛКОВ

В РАЗЛИЧНЫХ СТРУКТУРАХ МОЗГА 112 ГС, ГСПБ, ГДГ, КФК ВВ, ГФКБ И ОМБ: СРАВНЕНИЕ

ГРУППЫ КОНТРОЛЯ С БОЛЬНЫМИ ШИЗОФРЕНИЕЙ

КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД В ИССЛЕДОВАНИИ БЕЛКОВ МОЗГА

СВЯЗИ МЕЖДУ КОЛИЧЕСТВОМ БЕЛКОВ

В ТРЕХ СТРУКТУРАХ МОЗГА 117 СВЯЗИ МЕЖДУ КОЛИЧЕСТВОМ БЕЛКОВ

В КАЖДОЙ ОБСЛЕДУЕМОЙ ГРУППЕ (КОНТРОЛЬ, ШИЗОФРЕНИЯ)

КЛАСТЕРНЫЙ АНАЛИЗ НЕЙРОХИМИЧЕСКИХ ДАННЫХ 121 ИЗМЕРЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА КОМПОНЕНТОВ ГЛУТАМАТНОЙ

СИСТЕМЫ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

ТРОМБОЦИТАРНЫЕ ГСПБ И ГДГ В КОНТРОЛЬНОЙ ГРУППЕ И

У БОЛЬНЫХ ШИЗОФРЕНИЕЙ (ДО КУРСА ЛЕЧЕНИЯ) 125 ГСПБ И ГДГ ТРОМБОЦИТОВ ДО И В ХОДЕ

АНТИПСИХОТИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ

V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Бокша, Ирина Сергеевна

9) Результаты работы подтверждают правомочность существования глутаматной гипотезы патогенеза шизофрении, которая может быть представлена следующим образом: в патогенезе шизофрении играют роль не только рецепторы и переносчики глутамата, но также ферменты обмена глутамата. При этом особенности метаболизма глутамата при шизофрении состоят в изменениях количества ключевых метаболических ферментов в мозге и крови больных по сравнению с психически здоровыми лицами, а также в изменениях корреляционных связей между концентрациями этих ферментов в мозге больных по сравнению с психически здоровыми лицами.

VI. Заключение

В настоящей работе для понимания закономерностей, регулирующих количества ферментов метаболизма Глу в нервной ткани, использован системный подход [1, 89]. Можно отметить положительные моменты применения такого подхода в изучении метаболизма глутамата при шизофрении:

1) обнаружены корреляции количеств ряда белков, включая ферменты метаболизма глутамата, в мозге психически здоровых лиц и изменения корреляций при шизофрении;

2) обнаружены корреляции между количествами ключевых ферментов Глу (ГСПБ, ГДГ) в тромбоцитах и психопатологическими проявлениями шизофрении (повышение количества ферментов метаболизма Глу у больных шизофренией по сравнению с контролем зарегистрированы не только в

153 мозге, но и крови - в тромбоцитах), выяснено, антипсихотическое лечение влияет на количество тромбоцитарных ферментов метаболизма Глу; (3) выяснено, что количество ГСПБ, определенное до лечения, позволяет предсказать скорость достижения положительного эффекта от лечения (т.е. момент, когда больной становится «респондером»).

Таким образом, особенности метаболизма глутамата в мозге при шизофрении заключаются не только в изменении количеств ключевых ферментов метаболизма глутамата, но также нарушении регуляторных связей, поддерживающих уровни этих ферментов, причем изменяется также картина связей между уровнями ферментов и количествами основных структурных глиальных белков. Кроме того, в мозге появляется (регистрируется) новая, по-видимому, компенсаторная связь между количеством ключевых ферментов метаболизма глутамата и энергетического метаболизма (ГС и КФК ВВ).

Можно также отметить больший разброс уровней ферментов метаболизма Глу (особенно количеств ГСПБ) у больных по сравнению с психически здоровыми лицами, и эта особенность обнаружена при изучении мозговых и тромбоцитарных ферментов (в отсутствие различий между группами в возрасте и при равном числе представителей каждого пола).

Исходя из результатов исследования, представляется перспективным определение количеств ГСПБ и ГДГ в тромбоцитах с целью поиска и выделения подгрупп больных шизофренией, для которых лечение атипичными нейролептиками может быть более эффективным.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Бокша, Ирина Сергеевна, Москва

1. Александров Ю.И. Введение в системную психофизиологию. // Психология XXI века. -2003.-М., Пер Се. С. 39-85.

2. Андросова JI.B., Бурбаева Г.Ш. Изучение антигенных свойств тубулина, выделенного из нервной ткани. Нейрохимия. -1985.-Т.4, №1.-С. 10-15.

3. Бокша И.С. Биохимические аномалии при аутизме. // Аутизм и нарушения развития. -2005.- т.72, № 2.-С.1-24.

4. Бокша И.С. Взаимосвязь нейронов и глиальных клеток через метаболизм глутамата в мозге здоровых и психически больных людей. // Биохимия. -2004.-т.69, № 7.-С. 869-886.

5. Бокша И.С. Глутаминсинтетаза мозга человека. // Нейрохимия (Москва), Наука. 1995. Т.12, №2. С. 62-63.

6. Бокша И.С., Бурбаева Г.Ш., Терешкина Е.Б. Очистка и некоторые свойства глутаминсинтетазы мозга человека. //Биохимия. -1995.- Т. 60, №10.- С.1299-1303.

7. Бокша И.С., Данилов B.C. Ферментативный способ определения ионов аммония в растворе. Авт. Свидет-во: 1752766 бюлл. No:9229, 05.11.1992.

8. Бокша И.С., Данилов B.C., Лебедева Н.В. Биосенсор для экспресс-анализа ионов аммония. // Биологические науки (МГУ).- 1992.-Т.5.-С.71-77.

9. Бурбаева Г.Ш., Бокша И.С., Воробьева Е.А., Морозова М.А., Прохорова Т.А., Савушкина O.K., Стародубцева Л.И., Терешкина Е.Б., Турищева М.С. Системные биохимические нарушения при шизофрении: метаболизм глутамата. // Психиатрия. -2007.-№04(28).-С.72-78.

10. Бокша И.С., Шёнфельд Г.-И., Ланген X., Мюллер Ф., Терешкина Е.Б., Бурбаева Г.Ш. Глутаминсинтетаза мозга человека: октамерная структура и гомология с глутаминсинтетазой печени человека. // Биохимия. -2002.-Т.67, №9. -С.1012-1020.

11. Бурбаева Г.Ш., Бокша И.С., Терешкина Е.Б. Фосфорилирование белков в нервной системе в норме и при болезни Альцгеймера. // Вестник РАМН.- 1996.Т. 4.-С.13-18.

12. Бурбаева Г.Ш., Бокша И.С., Турищева М.С., Савушкина O.K., Терешкина Е.Б., Воробьева Е.А. Нарушение метаболизма глутамата в мозге при психической патологии (болезни Альцгеймера и шизофрении). // Вестник РАМН -2001.- Т.7.-С.34-37.

13. Бурбаева Г.Ш., Бокша И.С., Турищева М.С., Терешкина Е.Б., Воробьева Е.А, Савушкина O.K. Метаболизирующие глутамат ферменты в мозге и тромбоцитах больных шизофренией. // Сибирский Вестник Психиатрии и наркологии. 2003.-Т.1, №27.-С.36-39.

14. Бурбаева Г.Ш., Бокша И.С., Турищева М.С., Терешкина Е.Б., Воробьёва Е.А., Савушкина O.K. Нарушение функционирования ключевых ферментов метаболизма глутамата в лобной коре при шизофрении. // Тез. XIII съезда психиатров России.- 2000.- С. 352.

15. Воробьёва Е.А., Турищева М.С., Бурбаева Г.Ш. Повышение активности и содержания глутаматдегидрогеназы в лобной коре при шизофрении. // Тез. Конференции «Новое в изучении пластичности мозга».- М.- 2000.- С.23.

16. Воробьева Е.А. Глутаматдегидрогеназа мозга человека в норме и при шизофрении. // Автореферат диссертационной работы на соискание степени канд. биол. наук 2003.

17. Дамбинова С.А., Одинак М.М., Скулябин Д.И., Хунтеев, Г.А., Скворцова В.И. Лабораторные методы при эпилепсии и нарушениях мозгового кровообращения. //Ж. Неврол. и психиатрии им. С.С.Корсакова. -2001.-Т. 101, №1.-С.58-64.

18. Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. Мир, Москва.-1980.-Т.З.- С.97.

19. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. Москва, МедиаСфера, 2002. 312 с.

20. Савушкина O.K. Дисфункция мозговой изоформы креатинфосфокиназы при психической патологии (болезнь Альцгеймера и шизофрения). // Автореферат диссертационной работы на соискание степени канд. биол. наук. 2000.

21. Судаков С.А., Мясоедов С.Н. Неклассическая статистика в задачах психиатрии. //Психиатрия. 2005.-Т.2. - С.33-38.

22. Терешкина Е.Б. Глутаминсинтетаза мозга человека в норме и при шизофрении. // Автореферат диссертационной работы на соискание степени канд. биол. наук.- 2000.

23. Терешкина Е.Б., Бокша И.С., Савушкина O.K., Бурбаева Г.Ш. Глутаминсинтетаза и белок, подобный глутаминсинтетазе, во фронтальной коре больных шизофренией. // Ж. Невропатол. психиатрии им. С.С. Корсакова.- 2000.-Т.6.-С. 51-53.

24. Чехонин В.П., Турина О.И., Дмитриева Т.Б., Семенова А.В., Савченко Е.А., Григорьев М.Э. Основной белок миелина. Строение, свойства, функции, роль в диагностике демиелинизирующих заболеваний. // Вопросы медицинской химии.-2000, т.46,№6, с.549-563.

25. Чехонин В.П., Дмитриева Т.Б., Жирков Ю.А. Иммунохимический анализ нейроспецифических антигенов. М., Медицина 2000.

26. Швырков В.Б. Введение в объективную психологию. Нейрональные основы психики. М. Институт психологии РАН. 1995.

27. Aledo JC, Gomez-Fabre PM, Olalla L, Marquez J. Identification of two human glutaminase loci and tissue-specific expression of the two related genes. // Mamm. Genome.-2000.-V. 11, N. 12. -P. 1107-1110.

28. Alexander, G.E., and Crutcher, M.D. Functional architecture of basal ganglia circuits: Neural substrates of parallel processing. // Trends Neurosci.-1990a.-V. 13.-P.266-270.

29. Alexander, G.E., Crutcher, M.D., and DeLong, M.R. Basal ganglia-thalamocortical circuits: Parallel substrates for motor, oculomotor, prefrontal and limbic functions. // Prog. Brain Res. -1990. V.85.-P.119-146.

30. Arce C, Canadas S, Oset-Gasque MJ, Castro E, Gonzalez MP. Glutamate dehydrogenase: some properties of the rat brain enzyme from different cellular compartments. // Comp. Biochem. Physiol. -1990.-V.97, N2.-P.265-267.

31. Atkins W.M, Cader B.M., Hemmingsen J., Villafranca J.J. Time-resolved fluorescence and computational studies of adenylylated glutamine synthetase: Analysis of intersubunit interactions. //Protein Sci. 1993. -V.2, N5.-P. 800-813.

32. Baas D, Dalencon D, Fressinaud C, Vitkovic L, Sarlieve LL. Oligodendrocyte-type-2 astrocyte (0-2A) progenitor cells express glutamine synthetase: developmental and cell type-specific regulation. // Mol. Psychiatry. -1998.-V.3, N4.-P.356-361.

33. Baas D., Fressinaud C., Vitkovic L., Sarlieve L.L. Glutamine synthetase expression and activity are regulated by 3,5,3'-triiodo-L-thyronine and hydrocortisone in rat oligodendrocyte cultures. // Int. J.Dev.Neurosci. -1998.- V.16, N5.-P.333-340.

34. Barnett N.L., Pow D.V., Bull N.D. Differential perturbation of neuronal and glial glutamate transport systems in retinal ischaemia. // Neurochem. Int.- 2001. -V.39, N4.-P.291-299.

35. Bartha R., Drost D.J., Menon R.S., Williamson P.C. Comparison of the quantification precision of human short echo time 'H spectroscopy at 1.5 and 4.0 Tesla. // Magn. Reson. Med. -2000.- V.44.-P. 185-192.

36. Baslow M.H. Functions of N-acetyl-L-aspartate and N-acetyl-L-aspartylglutamate in the vertebrate brain: role in glial cell-specific signaling. // J. Neurochem. -2000.-V.75, N2.-P.453-459.

37. Baslow M.H. NAAG peptidase as a therapeutic target: Potential for regulating the link between glucose metabolism and cognition. // Drug News Perspect. -2006.- V.19, N3.-P.145-150.

38. Baslow M.H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. // Neurochem. Res. -2003.- V.28, N6.-P.941-953.

39. Beasley C.L., Pennington K., Behan A., Wait R., Dunn M.J., Cotter D. Proteomic analysis of the anterior cingulate cortex in the major psychiatric disorders: Evidence for disease-associated changes. // Proteomics. -2006.- V.6, N11 .-P.3414-3425.

40. Benes F.M., Lim B., Matzilevich D., Walsh J.P., Subburaju S., Minns M. Regulation of the GABA cell phenotype in hippocampus of schizophrenics and bipolars. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2007.- V.104, N24.-P. 10164-10169.

41. Bergles D.E., Jahr C.E. Glial contribution to glutamate uptake at Schaffer collateral-commisural synapses in the hippocampus. // J. Neuroscience. -1998.- V.18.-P.7709-7716.

42. Berk M., Plein H., Belsham B. The specificity of platelet glutamate receptor supersensitivity in psychotic disorders. // Life Sci. -2000.- V.66, N25.-P. 2427-2432.

43. Berk M., Plein H., Czismadia T. Supersensitive platelet glutamate receptors as a possible peripheral marker in schizophrenia. // Int. Clin. Psychopharmacol. -1999.-V.14, N2.-P. 119-122.

44. Berl S., Clark, D.D. in: Handbook on Neurochemistry. Chemical and Cellular Architecture. -1969.- V.l. Plenum Press, N.Y., P.P. 447, 472.

45. Berndt P., Hobohm U., Langen H. Reliable automatic protein identification from matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric peptide fingerprints. // Electrophoresis. -1999.- V.18.-P.3521-3526.

46. Boksha I. S., Schonfeld H.-J. Human brain glutamine synthetase-like protein is homologous to collapsin response mediator protein-2. // XXIII Congress of the Collegium Internationale NeuroPsychopharmacologicum, June 23-27, on-line Proceedings. -2002.

47. Boksha I., Burbaeva G.Sh., Tereshkina E.B. Protein folding influences the antibody-antigen interaction: Human brain glutamine synthetase as an example. //

48. Protein structure, stability and folding. Fundamental and medical aspects. Moscow, Russia, (Proceedings). -1998.- P.181.

49. Boksha I.S. Glutamine synthetase-like protein in brain and blood of patients with schizophrenia. Wellcome Trust Advanced course in Molecular Neurology and Neuropathology, July 20-26, UK, Proceedings.- 2006.-P.96.

50. Boksha I.S., Burbaeva G.Sh., Savushkina O.K., Starodubtseva L.I., Tereshkina E.B., Turishcheva M.S. Glutamate Metabolism in Schizophrenia: Systemic Approach. // Abstracts of International Conference on Mood Disorders, Istanbul, Turkey. -2006.-P. 90.

51. Boksha I.S. Systemic biochemical alterations in brain in schizophrenia. // Neural Plasticity. 39th Annual European Brain and Behaviour Society Abstracts. Hindawi Publishing Corporation. Vol. 2007.- P.56. http://www.sissa.it/EBBS2007/.

52. Boksha I.S., Tereshkina E.B., Burbaeva G.Sh. Glutamine synthetase in Alzheimer's disease brain. // X World congress of psychiatry, Madrid, August 23-28, Spain (Proceedings). -1996.-P.32.

53. Boksha I.S., Tereshkina E.B., Burbaeva G.Sh. Glutamine synthetase and glutamine synthetase-like protein from human brain: purification and comparative characterization. // J. Neurochemistry. -2000.- V.75, N6.- P.2574-2582.

54. Boksha I.S., Tereshkina E.B., Burbaeva G.Sh. Partial primary structure of human brain glutamine synthetase. // J. Neurochemistry. -1998.- V.71S1.-P. S84A.

55. Boksha I.S., Tereshkina E.B., Savushkina O.K., Burbaeva G.Sh. Alterations of glutamine synthetase levels in schizophrenic posterior cingulate cortex. // Schizophrenia Res. -2000.-V.41, Nl.-P.256.

56. Bottmer C., Bachmann S., Pantel J., Essig M., Amann M., Schad L.R., Magnotta V., and Schroder J. Reduced cerebellar volume and neurological soft signs in firstepisode schizophrenia. // Psychiatry Res. -2005.-V. 140, N3. -P.239-250.

57. Brown J.R., Masuchi Y., Robb F.T., Doolittle W.F., Evolutionary relationships of bacterial and archael glutamine synthetase genes. // J.Mol.Evol.- 1994.-V.38-P.566-576.

58. Burbaeva G. Sh., Boksha I.S., Tereshkina E.B., Vorobyeva E.B., Morozova M.A., Jarkova N.B., Turishcheva M.S., Savushkina O.K. Glutamate dehydrogenase immunoreactivity in platelets in schizophrenia // World J. Biol. Psychiatry.-2001.-V.3.-S.1.-P.32.

59. Burbaeva G. Sh., Boksha I.S., Turishcheva M.S., Tereshkina E.B., Savushkina O.K., Vorobyeva E.B., Prokhorova T.A. Glial glutamate metabolizing enzymes in cingulate cortex in schizophrenia. // Glia.- 2003.- V.S2.- P.65.

60. Burbaeva G. Sh., Savushkina O.K., Boksha I.S. Comparative study of creatine kinase BB decrease in brain of patients with Alzheimer's disease and schizophrenia. // NATO Science Series, IOS Press, Netherlands. -2003.-V.342.-P. 125-132.

61. Burbaeva G. Sh., Savushkina O.K., Boksha I.S. Creatine kinase BB in brain in schizophrenia. // World J. Biol. Psychiat. -2003.-V.4.-P. 177-183.

62. Burbaeva G. Sh., Turishcheva M.S., Vorobyeva E.B., Savushkina O.K., Tereshkina E.B., Boksha I.S. Diversity of glutamate dehydrogenase in human brain. // Prog. Neuro-psyhopharmacology Biol. Psychiatry. -2002.V.26, N 3.-P.427-435.

63. Bruneau E.G., McCullumsmith R.E., Haroutunian V., Davis K.L., Meador-Woodruff J.H. Increased expression of glutaminase and glutamine synthetase mRNA in the thalamus in schizophrenia. // Schizophr. Res. 2005.- V.75, Nl.-P. 27-34.

64. Burbaeva G.Sh., Boksha I.S., Tereshkina E.B. Reduced Zn/Mg-stimulated tyrosine kinase activities in Alzheimer's disease brain. // CINP Regional Conference "Neuroscience and neuropsychopharmacology HOMOEB 36" Abstracts. -1995.- Pt.l. -P. 30.

65. Burbaeva G.Sh., Boksha I.S., Tereshkina E.B., Monakhov V.V. The level of glutamine synthetase in Alzheimer's disease brain. // XX CINP Congress, Melbourne, Australia. Abstracts. -1996.

66. Burbaeva G.Sh., Boksha I.S., Tereshkina E.B., Savushkina O.K. Biochemical approaches to the brain glutamate metabolism study in schizophrenia. // Schizophrenia Res. -1999.-V.36, N1-3.-P.70.

67. Burbaeva G.Sh., Boksha I.S., Tereshkina E.B., Savushkina O.K., Starodubtseva L.I., Turishcheva M.S. Glutamate metabolizing enzymes in prefrontal cortex of Alzheimer's disease patients. //Neurochem. Res. -2005.-V.30, N11-P. 1443-1451.

68. Anand A., Charney D.S., Oren D.A. Attenuation of the neuropsychiatrie effects of ketamine with lamotrigine: support for hyperglutamatergic effects of N-methyl-D-aspartate receptor antagonists. //Arch. Gen.Psychiat.-2000.-V. 57.-P. 270-276.

69. Burbaeva G.Sh., Boksha I.S., Turishcheva M.S., Savushkina O.K., Tereshkina E.B. Increase of glutamate dehydrogenase level in frontal cortex in schizophrenia. // Schizophrenia Res. -2000.-V.41, Nl.-P.255.

70. Burbaeva G.Sh., Boksha I.S., Turishcheva M.S., Tereshkina E.B., Boksha I.S. Increase of glutamate dehydrogenase levels in frontal and cingulate cortex in schizophrenia. // Schizophrenia Res. -2000.-V. 41, Nl.-P.255.

71. Журавин И.А., Наливаева H.H., Плеснева C.A., Туманова H.JI., Васильев Д.С., Дубровская Н.М., Кочкина Е.Г., Гаврилова С.И., Бурбаева Г.Ш., Бокша

72. Burbaeva G.Sh.; Boksha I.S.; Morozova M.A., Starodubtseva L.I., Tereshkina E.B. Platelet GSLP as a predictor of olanzapine efficacy in schizophrenia. // World J. Biol. Psychiat. -2005.- V.6 (S.l). -P.249-250.

73. Adler C.M., Malhorta A.K., Elman I., Goldberg T., Egan M., Pickar D., Breier A. Comparison of ketamine-induced thought disorder in healthy volunteers and thought disorder in schizophrenia. //Am.J.Psychiatry.-1999.-V.156, N10.-P.1646-1649.

74. Akhonzadeh Sh., Mackinejad K., Ahmadi-Abhari S.A., Alem Z.M. Does the addition of lamotrigine to risperidone improve psychotic symptoms and cognitive impairments in chronic schizophrenia? //Therapy.-2005.-V.2, N3.-P.399-406.

75. Caizzi R., Bozzetti M.P., Caggese C. Homologous nuclear genes encode cytoplasmic and mitochondrial glutamine synthetase in Drosofila melanogaster.// J.Mol.Biol. -1990.-V.212.-P. 17-26

76. Campbell J.W., Smith D.D. Jr. Metabolic compartmentation of vertebrate glutamine synthetase: putative mitochondrial targeting signal in avian liver glutamine synthetase. //Mol. Biol. Evol. -1992.- V.9,N5.-P.787-805.

77. Carlsson A., Waters N., Carlsson M.L. Neurotransmitter interactions in schizophrenia-therapeutic implications. // Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci. -1999.-V.249, S4.-P.37-43.

78. Carlsson A., Waters N., Waters S., Carlsson M.L. Network interactions in schizophrenia therapeutic implications. // Brain Res. Reviews. - 2000.- V.31, N2-3.-P. 342-349.

79. Carlsson M.L. Hypothesis: is infantile autism a hypoglutamatergic disorder? Relevance of glutamate-serotonin interactions for pharmacotherapy. // J.Neural Transm. -1998.-V.105.-P.525-535.

80. Cavalier L., Jazin E., Eriksson I., Prince J., Bave B., Oreland L., Gyllensten, U. Decreased cytochrome-c oxidase activity and lack of age related accumulation of mtDNA in the brains of schizophrenics. // Genomics. -1995. -V.29.-P. 217-228.

81. Cavallaro, S., Meiri N., Yi C.-L., Musco S., Ma W. Goldberg J., Alkon D. L. Late memory-related genes in the hippocampus revealed by RNA fingerprinting. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1997. -V.94. -P.9669-9673.

82. Chakrabarti R., McCracken Jr. J.B., Chakrabarti D., Souba W.W. Detection of a functional promoter/enhancer in an intron-less human gene encoding a GS-like enzyme. // Gene.- 1995.-V.153, N2. -P. 163-169.

83. Chastain G. Alcohol, neurotransmitter systems, and behavior. // J. Gen. Psychol. -2006.- V.133, N4.-P.329-335.

84. Cho S.-W., Lee J., Choi S.Y. Two soluble forms of glutamate dehydrogenase isoproteins from bovine brain. // Eur. J. Biochem. -1995.- V.233.-P. 340-346.

85. Cho S-W., Lee J.E. Modification of brain glutamate dehydrogenase isoproteins with pyridoxal 5'-phosphate. //Biochimie. -1996.-V.78.-P. 817-821.

86. Choi D.W. Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system. // Neuron.- 1988.- V.I.- P.623-634.

87. Choi S.,Y., Hong J.W, Song M-S., Jeon S.G., Bahn J.H, Lee B.R., Ahn J.-Y, Cho S-W. Different antigenic reactivities of bovine brain glutamate dehydrogenase isoproteins. // J. Neurochem. -1999.-V. 72.-P. 2162-2169.

88. Choi Y.B., Lipton S.A. Redox modulation of the NMDA receptor. // Cell Mol. Life Sci. -2000.- V.57.-P.1535-1541.

89. Choi M.-M., Kim E.A., Choi S.Y., Kim T.U., Cho S.-W., Yang S.-J. Inhibitory properties of nerve-specific human glutamate dehydrogenase isozyme by chloroquine. // J. Biochem. Mol. Biol. -2007.-V.40, N6.-P. 1077-1082.

90. Christa L., Simon M.T., Flinois J.P., Gebhardt R., Brechot, C., Lasserre C. Amino acid sequence of human liver glutamine synthetase from NA sequence. // Gastroenterology. -1994.- V.106.-P. 1312-1320.

91. Cohen D.M. Inhibition of glutamine synthetase induces crytical energy threshold for neuronal survival. // Ann. N.Y. Acad.Sci. -1997,- V.826.-P.456-460.

92. Colon A.D., Plaitakis A., Perakis A., Berl S., Clarke D.D. Purification and characterization of a soluble and a particulate glutamate dehydrogenase from rat brain. //J. Neurochem. -1986.-V.46.-P. 1811-1819.

93. Cooper A.J. Role of glutamine in cerebral nitrogen metabolism and ammonia neurotoxicity. // Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 2001.-V.7, N4.-P.280-286.

94. Cooper A.J., Abraham D.G., Gelbard A.S., Lai J.C., and Petito C.K. High activities of glutamine transaminase K (dichlorovinylcysteine (3-lyase) and omega-amidase in the choroid plexus of rat brain. // J .Neurochem.-1993 .-V.61 .-P. 1731 -1741.

95. Danbolt N.C., Storm-Mathisen J., and Kanner B.I. An Na++K+. coupled L-glutamate transporter purified from brain is located in glial cell processes. // Neuroscience.-l 992.-V.51 .-P.295-310.

96. Daskalakis Z.J., Christensen B.K., Fitzgerald P.B., Fountain S.I., and Chen R. Reduced cerebellar inhibition in schizophrenia: a preliminary study. // Am. J. Psychiatry. -2005.-V.162, N6.-P. 1203-1205.

97. Deakin J.F., Slater P., Simpson A.C. Frontal cortical and left temporal glutamatergic dysfunction in schizophrenia. // J.Neurochem.-1989.-V.52.-P.1781-1786.

98. Deloukas P.; Dauwerse J. G.; Moschonas N. K.; van Ommen G. J. B.; van Loon A. P. G. M. -P. Three human glutamate dehydrogenase genes (GLUD1, GLUDP2, and

99. GLUDP3) are located on chromosome lOq, but are not closely physically linked. // Genomics. -1993.-V. 17.-P. 676-681.

100. DeMarco V., McCain M.D., Strauss D., Chakrabarti R., Neu J. Characterization of glutamine synthetase transcript, protein and enzyme activity in the human placenta. //Placenta. -1997.- V. 18, N7.-P.541-545.

101. Denman R.B., Wedler F.C. Association-dissociation of mammalian brain glutamine synthetase. Effects of metal ions and other ligands. // Arch.Biochem.Biophys. -1978.-V.232, N2.-P. 427-440.

102. Dennis S.C., Lai J.C.K., and Clark J.B. The distribution of glutamine synthetase in subcellular fractions of rat brain. // Brain Res. -1980.- V.197-P.469-475.

103. Derouiche A., Frotscher M. Astroglial processes around identified glutamatergic synapses contain glutamine synthetase: evidence for transmitter degradation. // Brain Res. -1991.-V.552.-P. 346-350.

104. Derouiche A., Rauen T. Coincidence of L-Glu/L-Asp transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance. // J.Neurosci.Res.- 1995.-V.42.-P. 131-143.

105. Deutsch S.I., Rosse R.B., Schwartz B.L., Mastropaolo J. A revised excitotoxic hypothesis of schizophrenia: therapeutic implications.// Clin. Neuropharmacol. -2001.-V.24, Nl-P.43-49.

106. Di Monte D.A., Tokar I., Langston J.W. Impaired glutamate clearance as a consequence of energy failure caused by MPP(+) in astrocytic cultures. // Toxicol. Applied Pharmacol. -1999.- V.158.-P.296-302.

107. Dolphin D. Coenzymes and Cofactors. Glutathione: Chemical, Biochemical and Medical Aspects, P. 19-20, 379-381, New-York. 1989

108. Dracheva S., Elhakem S.L., Davis K.L., Haroutunian V. GAD65 and GAD67 protein expression in dorsolateral prefrontal cortex of elderly schizophrenia patients. // Biol. Psychiatry.- 2002.-V.51, Suppl.-P.166S.

109. Duncan G.E., Zom S., Lieberman J. A. Mechanisms of typical and atypical antipsychotic drug action in relation to dopamine and NMDA receptor hypofimction hypotheses of schizophrenia. // Mol. Psychiatry. -1999. N4.-P. 418-428.

110. Duvoisin R.C.; Chokroverty S.; Lepore F.; Nicklas W. J. Glutamate dehydrogenase deficiency in patients with olivopontocerebellar atrophy. // Neurology. -1983.-V.33-P. 1322-1326.

111. Elgadi K.M., Meguid R.A., Qian M., Souba W.W., Abcouwer S.F.Cloning and analysis of unique human glutaminase isoforms generated by tissue-specific alternative splicing. //Physiol. Genomics.- 1999. V.l, N2.-P.51-62.

112. Erecinska M., Silver I. A. Metabolism and role of glutamate in mammalian brain. //Prog. Neurobiol.- 1990.-V. 35-P.245-296.

113. Fang J., Hsu B.Y.L, MacMullen C.M., Poncz M., Smith T.J., Stanley C.A. Expression, purification and characterization of human glutamate dehydrogenase (GDH) allosteric regulatory mutations. //Biochem. J. -2002.- V.363, Pt l.-P. 81-87.

114. Farber N.B., Jiang X.P., Heinkel C., Nemmers B. Antiepileptic drugs and agents that inhibit voltage-gated sodium channels prevent NMDA antagonist neurotoxicity. // Mol. Psychiatry. -2002.-V.7, N7.-P.726-733.

115. Fonnum F., Myhrer T., Paulsen R.E., Wangen K., Oksengard A.R. Role of glutamate and glutamate receptors in memory function and Alzheimer's disease. // Ann. NY Acad. Sci.-1995.-V.757.-P.475-486.

116. Fukuzako H. Neurochemical investigation of the schizophrenic brain by in vivo phosphorus magnetic resonance spectroscopy. // World J. Biol. Psychiatry. -2001.-V.2-P.70-82.

117. Gaby A.R. Natural approaches to epilepsy. // Altern. Med. Rev. -2007.- V. 12, Nl.-P.9-24.

118. Gao J., Duan B., Wang D.G., Deng X.H., Zhang G.Y., Xu L., Xu T.L. Coupling between NMDA receptor and acid-sensing ion channel contributes to ischemic neuronal death. //Neuron. -2005.- V.48, N4-P.635-646.

119. Gargiulo P.A., Acerbo M.J., Krug I., Delius J.D. Cognitive effects of dopaminergic and glutamatergic blockade in nucleus accumbens in pigeons. // Pharmacol. Biochem. Behav. -2005.- V.81, N4.-P.732-739.

120. Gebhardt R., Schmid H., Fitzke H. Immunohistochemical localization of glutamine synthetase in human liver. // Experientia.-1989.-V.45, N2.-P.137-139.

121. Gibbs C.S., Campbell K.E., Wilson R.H. Sequence of a human glutamine synthetase cDNA. //Nucleic Acids Res. -1987.- V.15.-P.6293.

122. Gibbs M.E., O'Dowd B.S., Hertz L., Robinson S.R., Sedman G.R., Ng K.T. Inhibition of glutamine synthetase activity prevents memory consolidation. // Cognitive Brain Res. -1996.- V.4, N1.-P.57-64.

123. Gluck M.R., Thomas R.G., Davis K.L., Haroutunian V. Implications for altered glutamate and GABA metabolism in the dorsolateral prefrontal cortex of aged schizophrenic patients. // Am. J. Psychiatry.- 2002.-V. 159, N7.-P. 1165-1173.

124. Goff D.C., Coyle J.T. The emerging role of glutamate in the pathophysiology and treatment of schizophrenia. // Am. J. Psychiatry.- 2001.-V. 158.-P.1367-1377.

125. Goff D.C., Henderson D.C., Evins A.E., Amico E. A placebo-controlled crossover trial of D-cycloserine added to clozapine in patients with schizophrenia. // Biol. Psychiatry. -1999.- V.45, N4-P.512-514.

126. Goff D.C., Leahy L., Berman I., Posever T., Herz L., Leon A.C., Johnson S.A., Lynch G. A placebo-controlled pilot study of the ampakine CX516 added to clozapine in schizophrenia. // J. Clin. Psychopharmacol. -2001.- V.21, N5.-P.484-487.

127. Goff D.C., Tsai G., Manoach D.S., Flood J., Darby D.G., Coyle J.T. D-cycloserine added to clozapine for patients with schizophrenia.// Am. J. Psychiatry. -1996.-V.153, N12.-P.1628-1630.

128. Gorovits R., Avidan N., Avisar N., Shaked I., Vardimon L. Glutamine synthetase protects against neuronal degeneration in injured retinal tissue. // Proc.Natl.Ac.Sci. USA.- 1997.- V.94, N13.-P.7024-7029.

129. Greenamyre J.T., Maragos W.R., Albin R.L., Penney J.B., Johng A.B. Glutamate transmission and toxicity in Alzheimer's disease. // Progr. Neuropsychopharmac. Biol.Psychiat.- 1988.-V.12.-P.421-430.

130. Gruetter R., Seaquist E.R., Kim S., Ugurbil K. Localized in vivo 13C NMR of glutamate metabolism in the human brain: Initial results at 4 Tesla. // Dev. Neurosci. -1998.-V.20.-P.380-388.

131. Gunnersen D., Haley B. Detection of glutamine synthetase in the cerebrospinal fluid of Alzheimer diseased patients: A potential diagnostic biochemical marker. // Proc.Natl. Ac. Sci. USA.-1992.-V.89, N24.-P.11949-11953.

132. Gupta D.S., McCullumsmith R.E., Beneyto M., Haroutunian V., Davis K.L., Meador-Woodruff J.H. Metabotropic glutamate receptor protein expression in the prefrontal cortex and striatum in schizophrenia. //Synapse.-2005.-V.57,N3.-P. 123-131.

133. Haghighat N. Estrogen (17beta-estradiol) enhances glutamine synthetase activity in C6-glioma cells. //Neurochem. Res. -2005.-V.30, N5.-P.661-667.

134. Heresco-Levy U., Javitt D.C. The role of NMDA-receptor-mediated neurotransmission in the patophysiology and therapeutics of psychiatric syndromes. // Eur. Neuropsychopharmacology. 1998. -V. 8.-P.141-152.

135. Hertz L., Bock E., Schousboe A. GFA content, glutamate uptake and activity of glutamate metabolizing enzymes in differentiating mouse astrocytes in primary cultures. // Devel. Neuroscience. -1978.-V.1.-P.226-238.

136. Hertz L., Dringen R., Schousboe A., Robinson S.R. Astrocytes:Glutamate producers for neurons // J. Neurosci. Res. -1999.-V.57.-P. 417-428.

137. Hertz L., Fillenz M. Does "the mystery of the extra glucose" during CNS activation reflect glutamate synthesis? //Neurochem. Int. -1999.- V.34.-P.71-75.

138. Hertz L., Swanson R.A., Newman G.C., Mariff H., Juurlink B.H.J., Peng L. Can experimental conditions explain the discrepancy whether or not glutamate stimulates aerobic glycolysis? // Devel. Neuroscience. -1998.- V.20.-P.339-347.

139. Hertz L., Yu A.C.H., Kala G., Schousboe A. Neuronal-astrocytic and cytosolic-mitochondrial metabolite trafficking during brain activation, hyperammonemia and energy deprivation //Neurochem. Int. -2000.-V.37, N2-3. P.83-102.

140. Herzfeld A. The distiction between y-glutamylhydroxamate synthetase and L-glutamine hydroxylamine glutamyltransferase activities in rat tissues. Studies in vitro. //Biochem. J. -1973.-V.133.-P.49-57.

141. Herzfeld A., Estes N. A. The distiction between y-glutamylhydroxamate synthetase and L-glutamine hydroxylamine glutamyltransferase activities in rat tissues. Studies in vivo. // Biochem. J. -1973.-V.133.-P.59-66.

142. Honey G.D., Pomarol-Clotet E., Corlett P.R., Honey R.A., McKenna P.J., Bullmore E.T., Fletcher P.C. Functional dysconnectivity in schizophrenia associated with attentional modulation of motor function. //Brain.-2005.-V.128, Pt 11.-P.2597-2611.

143. Humphries C., Mortimer A., Hirsh S., de Belleroche J. NMDA receptor mRNA correlation with antemortem cognitive impairment in schizophrenia. // Neuroreport. -1996.-V.7. -P.2051-2055.

144. Hutchinson P.J., O'Connell M.T., Kirkpatrick P.J., Pickard J.D. How can we measure substrate, metabolite and neurotransmitter concentrations in the human brain? //Physiol. Meas.- 2002.-V. 23.-P.75-109.

145. Iqbal K., Ottaway J.H. Glutamine synthetase in muscle and kindey. // BiochemJ. -1970.-V.119.-P. 145-156.

146. Itokawa M., Yoshikawa T. Hypoglutamatergic hypothesis of schizophrenia: evidence from genetic studies. // Seishin Shinkeigaku Zasshi.- 2003.-V.105, N11.-P. 1349-1362. [Transl. from Japanese]

147. Jackowski G., Takahashi M. Process for determining the presence of monomeric brain associated human glutamine synthetase in patients exhibiting mild cognitive impairment. // United States Patent 7,070,945 July 4, 2006.

148. Jelinski S.E., Yager J.Y., Juurlink B.H. Preferential injury of oligodendroblasts by a short hypoxic-ishemic insult. // Brain Res. -1999.- V.815.-P.150-153.

149. Kanamori K., Ross B.D. Steady-state in vivo glutamate dehydrogenaseactivity in rat brain measured by N NMR. // J. Biol. Chem. -1995. -V.270.-P. 24805- 24809.

150. Kanavouras K., Mastorodemos V., Borompokas N., Spanaki C., Plaitakis A. Properties and molecular evolution of human GLUD2 (neural and testicular tissue-specific) glutamate dehydrogenase. // J. Neuroscience Res. -2007.- V. 85.-P.3398-3406.

151. Kaneko T., Akiyama H., Mizuno N. Immunohistochemical demonstration of glutamate dehydrogenase in astrocytes. //Neurosci. Lett. -1987.- V.77.-P. 171-175.

152. Katsel P., Davis K.L., Haroutunian V. Variations in myelin and oligodendrocyte-related gene expression across multiple brain regions in schizophrenia: a gene ontology study. //Schizophrenia Res.-2005.-V.79,N2-3.-P. 157173.

153. Kharazia V.N., Weinberg R.J. Tangential synaptic distribution of NMDA and AMPA receptors in rat neocortex. // Neurosci Lett. -1997.- V.238, N1-2.-P.41-44.

154. Khelli M., Rolland B., Fages C., Tardy M. Glutamine synthetase modulation in astrocyte cultures of different mouse brain areas. // Glia.- 1990.- V.3-P.75-80.

155. Kim J.S., Kornhuber H.H., Schmid-Burgk W., Holzmuller B. Low cerebrospinal fluid glutamate in schizophrenic patients and a new hypothesis on schizophrenia. // Neurosci. Lett. -1980.- V.20.- P. 379-382.

156. Klushnik T.P., Spunde A.Ya., Yakovlev A.G. Decreasing of creatine phosphokinase BB in water soluble fraction of schizophrenic brains revealed by two-dimensional electrophoresis. // Neurokhimiya (Yerevan). -1991.-V. 10-P.46-52.

157. Klushnik T.P., Spunde A.Ya., Yakovlev A.G. Intracellular alterations of the creatine kinase isoforms in brain of schizophrenic patients. // Mol. Chem. Neuropathol. -1991a.- V.15.-P.271-280.

158. Knable M.B., Torrey E.F., Webster M.J., Bartko J.J. Multivariate analysis of prefrontal cortical data from the Stanley Foundation Neuropathology Consortium. // Brain Res. Bull. -2001.-V.55, N5.-P.651-659.

159. Kojima S., Nakamura T., Nidaira T., Nakamura K., Ooashi N., Ito E., Watase K., Tanaka K., Wada K., Kudo Y., Miyakawa H. Optical detection of synaptically induced glutamate transport in hippocampal slices. // J.Neuroscience. -1999.- V.19.-P.2580-2588.

160. Konarski J.Z., Mclntyre R.S., Grupp L.A., Kennedy S.H. Is the cerebellum relevant in the circuitry of neuropsychiatrie disorders? // J. Psychiatry Neurosci. -2005.-V. 30, N3.-P. 178-186.

161. Kornhuber H. Chemistry, physiology and neuropsychology of schizophrenia: toward earlier diagnosis of schizophrenia. // Archiv Psychiat. Nervkrankheiten. -1983.-V.233.-P.15-22.

162. Krajnc D., Norton H.Neff, Hadijiconstantinou M. Glutamate, glutamine and glutamine synthetase in the neonatal rat brain following hypoxia. //Brain Res.-1996.-V.707, N1.-P.134-137.

163. Krystal J.H., Belger A., D'Souza D.C., Anand A., Charney D. S., Aghajanian G.K. and Moghaddam B. Therapeutic implications of the hyperglutamatergic effects of NMDA antagonists.//Neuropsychopharmacology.-1999.-Suppl.V.21, s6.-P.S143-S157.

164. Krystal J.H., D'Souza D.C., Sanacora G., Goddard A.W., Charney D.S. Current perspectives on the pathophysiology of schizophrenia, depression, and anxiety disorders. // Med. Clin. North. Am. -2001.- V.85, N3.-P.559-577.

165. Kugler P. Enzymes involved in glutamatergic and GABAergic neurotransmission. // Int. Rev. Cytol. -1993.-V.147.-P. 285-336.

166. Kvamme E., Svenneby G., Trogner A.A., Drejer J., Schousboe A. Postnatal development of glutamate developing enzymes in hippocampus from mice. // Int. Dev. Neurosci. -1995.- V.3.- P.359-364.

167. Kvamme E., Torgner I. A., Roberg B. Kinetics and localization of brain phosphate activated glutaminase. // J. Neurosci. Res. -2001.- V.66, N5.-P.951-958.

168. Laake J.H., Slyngstad T.A., Haug F.-M.S., Ottersen O.P. Glutamine from glial cells is essential for maintenance of the nerve terminal pool of glutamate: immunogold evidence from hippocampal slice cultures. //J.Neurochemistry.-1995.-V.65.-P.871-881.

169. Labow B.I., Souba W.W., Abcouwer S.F. Glutamine synthetase expression in muscle is regulated by transcriptional and postranscriptional mechanisms. // Am. J. Physiol. -1999.-V. 276, N6 Pt 1.-P.E1136-1145.

170. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature.- 1970.-V. 227.-P. 680-685.

171. Lahm H. W., Langen H. Mass spectrometry: a tool for the identification of proteins separated by gels. // Electrophoresis. -2000.- V.21, N11.-P.2105-2114.

172. Laud P.R., Campbell J.W. Genetic basis for tissue isozymes of glutamine synthetase in elasmobranchs. // J. Mol. Evol. -1994.- V.39, N1.-P.93-100.

173. Le Prince Gh., Delaere P., Fages Ch., Lefrancois Th., Touret M., Salanon M., Tardy M. Glutamine synthetase expression is reduced in senile dementia of the Alzheimer type. //Neurochem. Res. -1995.-V.20, N7. -P.859-862.

174. Lehre P., Danbolt N.C. The number of glutamate transporter subtype molecules at glutamatergic synapses: chemical and stereological quantification in young adult brain. // J.Neuroscience. 1998.-V.18.-P.8751-8757.

175. Levy R., Friedman H.R., Davachi L., Goldman-Rakic P.S. Differential activation of the caudate nucleus in primates performing spatial and nonspatial working memory tasks. // J. Neurosci. -1997.-V.17-P.3870 -3882.

176. Listrom C.D., Morizono H., Rajagopal B.S., McCann M.T., Tuchman M., Allewell N.M. Expression, purification and characterization of recombinant human glutamine synthetase. //Biochem. J. 1997.- V.328.-P.159-163.

177. Lowe S.L., Bowen D.M., Francis P.T., Neary D. Ante mortem cerebral amino acid concentrations indicate selective degeneration of glutamate-enriched neurons in Alzheimer's disease // Neuroscience.-1990.-V.38.-P.571-577.

178. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem. -1951.-V.193.-P. 265-275.

179. Magistretti P.J., Pellerin L., Rothman D.L., Shulman R.G. Energy on demand. // Science. -1999.-V. 283.-P. 496-497.

180. Martin P., Albers M. Cerebellum and schizophrenia: A selective review. // Schizophr. Bull. -1995.- V.21, N2.-P.241-250.

181. Mastorodemos V., Zaganas I., Spanaki C., Bessa M., Plaitakis A. Molecular basis of human glutamate dehydrogenase regulation under changing energy demands. // J.Neurosci.Res. -2005.-V.79.-P.65-73.

182. Matthews C., Zielke H.R., Wollack J.B., Fishman P.S. Enzymatic degradation protects neurons from glutamate excitotoxicity. // J.Neurochemistry. -2000.-V. 75, N3.-P. 1045-1052.

183. Maurer I., Zierz S., Moller H. Evidence for a mitochondrial oxidative phosphorylation defect in brains from patients with schizophrenia. // Schizophr. Res. -2001.-V.48, N1.-P.125-136.

184. McCullumsmith R.E., Haroutunian V., Davis K.L., Meador-Woodruff J.H. Expression of glutaminase transcripts in the thalamus of subjects with schizophrenia. // Biol. Psychiatry. -2002.- V.51.-P.25S.

185. Mclnnes, L.A., and Lauriat, T.L. 2006. RNA metabolism and dysmyelination in schizophrenia. Neurosci. Biobehav. Rev. 30(4):551-561.

186. McKenna M.C., Tildon J.T., Couto R., Stevenson J.H., Caprio F.J. The metabolism of malate by cultured rat brain astrocytes. // Neurochem. Res. -1990.-V.15.-P.1211-1220.

187. McKenna M.C., Tildon J.T., Stevenson J.H., Boatright R., Huang S. Regulation of energy metabolism in synaptic terminals and cultured rat brain astrocytes: differences revealed using aminooxyacetate. // Dev. Neurosci. -1993.-V. 15, N3-5.-P.320-329.

188. McKenna M.C., Tildon J.T., Stevenson J.H., Hopkins I.B. Energy metabolism in cortical terminals from weanling and mature rat brain: evidence for multiple compartments of TCA cycle activity. //Dev. Neurosci. -1995.- V.16.-P. 291-300.

189. McKenna M.C., Sonnewald U., Huang X., Stevenson J., Zielke H.R. Exogeneous concentration regulates the metabolic fate of glutamate in astrocytes. // J.Neurochem. -1996.-V. 66.-P.386-393.

190. McKenna M.C., Gruetter R., Sonnewald U., Waagepetersen H., Schousboe A. Energy metabolism of the brain. // In: Siegel G.J., Albers R.W., Brady S.T., Price D.L. editors. Basic neurochemistry. N.Y. Elsevier Ac. Press. 2006.- P.531-557.

191. Memmerick S., Benz A., Zorumski C.F. Presynaptic influence on the time course of fast excitatory synaptic currents in cultured hippocampal cells. // J.Neuroscience.- 1995.-V. 15.-P.3178-3192.

192. Memmerick S., Zorumski C.F. Glial contributions to excitatory neurotransmissionin cultured hippocampal cells. //Nature.-1994.-V.368.-P.59-62.

193. Mendrek A., Laurens K.R., Kiehl K.A., Ngan E.T., Stip E., Liddle P.F. Changes in distributed neural circuitry function in patients with first-episode schizophrenia. // Br. J. Psychiatry. -2004.-V.185.-P.205-214.

194. Michaelidis T.M., Tzimagiorgis G., Moschonas N., Papamatheakis J. The human glutamate dehydrogenase gene family, gene organization and structural characterization.//Genomics.- 1993.-V.16.-P. 150-160.

195. Miki Y.; Taki T.; Ohura T.; Kato H.; Yanagisawa M.; Hayashi Y. -P. Novel missense mutations in the glutamate dehydrogenase gene in the congenital hyperinsulinism-hyperammonemia syndrome. // J. Pediat. -2000.-V.136.-P.69-72.

196. Mukaetova-Ladinska E.B., Hurt J., Honer W.G., Harrington C.R., Wischik C.M. Loss of synaptic but not cytoskeletal proteins in the cerebellum of chronic schizophrenics. //Neurosci. Lett. -2002.-V. 317, N3.-P. 161-165.

197. Neale J.H., Olszewski R.T., Gehl L.M., Wroblewska B., Bzdega T.-P. The neurotransmitter N-acetylaspartylglutamate in models of pain, ALS, diabetic neuropathy, CNS injury and schizophrenia.// Trends Pharmacol. Sci. -2005.- V.26, N9.-P.477-484.

198. Newcomb R., Sun X., Taylor L., Curthoys N., Giffard R.G. Increased production of extracellular glutamate by the mitochondrial glutaminase following neuronal death. // J. Biol. Chem.- 1997.- V.272.-P.11276-11282.

199. Newcomer J.W., Krystal J.H. NMDA receptor regulation of memory and behavior in humans. // Hippocampus. -2001.-V.11, N5.-P.529-542.

200. Nilsson M., Waters S., Waters N., Carlsson A., Carlsson M.L. A behavioural pattern analysis of hypoglutamatergic mice- effects of four different antipsychotic agents. // J. Neural Transm. 2001.-V. 108.-P. 1181-1196.

201. Nimmo G.A., Tipton K.F. The distribution of soluble and membrane-bound forms of glutaminase in pig brain. // J. Neurochem. -1979.- V.33, N5.-P.1083-1084.

202. Nissim I. Newer aspects of glutamine/glutamate metabolism: the role of acute pH changes. //Am. J. Physiol. -1999.- Y.277, N4 Pt 2.-P.F493-497.

203. O'Farrell P.H. High-resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. // J. Biol. Chem. -1975.-V.250. -P. 4007- 4021.

204. Olalla L., Gutierrez A., Campos J.A., Khan Z.U., Alonso F.J., Segura J.A., Marquez J., Aledo J.C. Nuclear localization of L-type glutaminase in mammalian brain. // J. Biol. Chem. -2002.-V.277, N41.-P.38939-38944.

205. Olney J.W. Glutamate-induced neuronal necrosis in the infant mouse hypothalamus: an electron microscopic study. // J. Neuropathol. Experimental Neurol. -1971 .-V.30.-P.75-90.

206. Olney J.W., Farber N.B. Glutamate receptor dysfunction and schizophrenia. // Arch. Gen. Psychiatry. -1995.-V.52.-P. 998-1007.

207. Pascual J.M., Carceller F., Roda J.M., Cerdan S. Glutamate, glutamine and GABA as substrates for neuronal and glial compartments after focal cerebral ishemia in rats. // Stroke. -1998.-V.29.-P. 1048-1057.

208. Plaitakis A.; Berl S.; Yahr M.D. Abnormal glutamate metabolism in an adult-onset degenerative neurological disorder. // Science. -1982 V. 216.-P. 193-196.

209. Plaitakis A., Berl S., Yahr M.D. Neurological disorders associated with deficiency of GDH. //Ann. Neurol. -1984.-V.15. -P.144-153.

210. Plaitakis A., Flessas P., Natsiou A.B., Shashidharan P. Glutamate dehydrogenase deficiency in cerebellar degenerations: clinical, biochemical and molecular genetic aspects. // Can. J. Neurol. Sci. -1993.- V.3, Suppl.-P. S109-S116.

211. Plaitakis A., Metaxari M., Shashidharan P. Nerve tissue-specific (GLUD2) and housekeeping (GLUD1) human glutamate dehydrogenases are regulated by distinct allosteric mechanisms.// J. Neurochemistry. -2000.-V.75.-P.1862-1869.

212. Poitry S., Poitry-Yamate C., Ueberfeld J., MacLeish P.R., Tsacopoulos M. Mechanisms of glutamate metabolic signaling in retinal glia (Muller) cells. // J. Neuroscience. -2000.- V.20.-P. 1809-1821.

213. Pow D.V. Visualising the activity of the cystine-glutamate antiporter in glial cells using antibodies to aminoadipic acid, a selectively transported substrate. // Glia. -2001.- V.34, N1.-P.27-38.

214. Preiss T., Hall A.G., Lightowlers R.N. Identification of bovine glutamate dehydrogenase as an RNA-binding protein. //J.Biol.Chem.-1993.-V.268.-P.24523-24526.

215. Premkumar T.S., Pick J. Lamotrigine for schizophrenia. // Cochrane Database Syst Rev. -2006.- V.4.-P.CD005962.

216. Prince J. A., Oreland L. Mitochondrial activity in the mapping of functional brain changes in schizophrenia. // Restorative Neurol. Neurosci. -1998.-V.12, N2-3.-P.185-193.

217. Rajas F., Gire V., Rousset B. Involvement of a membrane-bound form of glutamate dehydrogenase in the association of lysosomes to microtubules. // J.Biol.Chem. -1996.-V. 271.-P.29882-29890.

218. Rajas F., Rouset B. A Membrane-bound form of glutamate dehydrogenase possesses an ATP-dependent high-affinity microtubule-binding activity. // Biochem. J. -1993.-V.295.-P.447-455.

219. Reiss N., Hermon J., Oplatka A., Naor Z. Interaction of purified protein kinase C with key proteins of energy metabolism and cellular motility. // Biochem. Mol. Biol. International. 1996.-V.38, N4. P. 711-719.

220. Robinson S.R. Neuronal expression of glutamine synthetase in Alzheimer's disease indicates a profound impairment of metabolic interactions with astrocytes. // Neurochem. International. 2000. -V. 36, N4-5. -P.471-482.

221. Rothe F., Wolf G., Schunzel G. Immunohistochemical demonstration of glutamate dehydrogenase in the postnatally developing rat hippocampal formation and cerebellar cortex, comparison to activity staining. //Neuroscience. -1990.-V.39.-P. 419-429.

222. Schmitt A., Kugler P. Cellular and regional expression of glutamate dehydrogenase in the rat nervous system, non-radioactive in situ hybridization and comparative immunocytochemistry. //Neuroscience. -1999.-V.92.-P. 293-308.

223. Schonfeld H.J., Behlke J. Molecular chaperones and their interactions investigated by analytical ultracentrifugation and other methodologies. // Methods Enzymol. -1998.-V.290-P.269-296.

224. Schonfeld H.J., Poschl B., Muller F. Quasi-elastic light scattering and analytical ultracentrifugation are indispensable tools for the purification and characterization of recombinant proteins. // Biochem. Soc. Trans. -1998.- V.26, N4.-P.753-758.

225. Schousboe A., Westergaard N. Transport of neuroactive amino acids in astrocytes. 1995, In: Ransom B.R., Kettenmann H. (Eds) Neuroglia 246-258 N. Y.P.Oxford Univ. Press.

226. Schousboe A., Westergaard N., Sonnewald U., Petersen S., Huang R., Peng L., Hertz L. Glutamate and glutamine metabolism and compartmentation in astrocytes. // Developmental Neuroscience. -1993.- V.15.-P.359-366.

227. Schousboe A., Westergaard N., Waagepetersen H.S., Larsson O.M., Bakken I.J., Sonnewald U. Trafficking between glia and neurons of TCA cycle intermediates and related metabolites. //Glia. -1997.-V.21.-P. 99-105.

228. Schuck P. Simultaneous radial and wavelength analysis with the Optima XL-A analytical centrifuge. //Progr. Colloid Polym. Sci. -1994.-V.94.-P. 1-13.

229. Semenova S., Markou A. The effects of the mGluR5 antagonist MPEP and the mGluR2/3 antagonist LY341495 on rats' performance in the 5-choice serial reaction time task. // Neuropharmacology. -2007.-V. 52. -N 3.- P. 863-872.

230. Shashidharan P., Clarke D.D., Ahmed N., Moschonas N., Plaitakis A. Nerve tissue-specific human GDH that is thermolabile and highly regulated by ADP. // J. Neurochem. -1997.-V.68.-P. 1804- 1811.

231. Shashidharan P., Michaelidis M., Robakis N.K., Kresovali A., Papamatheakis J., Plaitakis A. Novel human GDH expressed in neural and testicular tissues and encoded by an X-linked intronless gene. // J. Biol. Chem. -1994.-V.269.-P. 16971-16976.

232. Shen J., Rothman D.L. Magnetic resonance spectroscopic approaches to studying neuronal-P. glial interactions. // Biol. Psychiat. -2002.-V.52.-P.694-700.

233. Shen J. In vivo carbon-13 magnetization transfer effect. Detection of aspartate aminotransferase reaction. // Magn. Reson. Med. 2005.-V.54.-P.1321-1326.

234. Shin D., Park C. N-terminal extension of canine glutamine synthetase created by splicing alters its enzymatic property.//J.Biol.Chem.-2004.-V.279,N2.-P.l 184-1190.

235. Shin D., Park S., Park C. A splice variant acquiring an extra transcript leader region decreases the translation of glutamine synthetase gene. // Biochem. J. -2003.-V.374, Pt 1.-P. 175-184.

236. Shutoh F., Hamada S., Shibata M., Narita M., Shiga T., Azmitia E.C., Okado N. Long term depletion of serotonin leads to selective changes in glutamate receptor subunits. //Neurosci. Res.- 2000.- V.38, N4.-P.365-371.

237. Sibson N.R., Dhankhar A., Mason G.F., Behar K.L., Rothman D.L., Shulman R.G. In vivo 13C NMR measurement of cerebral glutamine synthesis as evidence for glutamate-glutamine cycling. //Proc. Natl.Ac.Sci. USA. -1997.-V.94.-P.2699-2704.

238. Sibson N.R., Dhankhar A., Mason G.F., Rothman D.L., Behar K.L., Shulman R.G. Stoichiometric coupling of brain glucose metabolism and glutamatergic neuronal activity. //Proc. Natl.Ac.Sci. USA.- 1998.- V.95.-P.316-321.

239. Simon R., Xiong Z. Acidotoxicity in brain ischaemia. //Biochem. Soc. Trans. -2006.- V.34, Pt 6.-P.1356-1361.

240. Simpson M.D., Slater P., Royston M.C., Deakin J.F. Alterations in phencyclidine and sigma binding sites in schizophrenic brains: effects of disease processes and neuroleptic medication. // Schizophrenia Res.-1991.-V.6.-N.41-48.

241. Smith D. D., Jr., Campbell J. W. Subcellular location of chicken brain glutamine synthetase and comparison with chicken liver mitochondrial glutamine synthetase. //J. Biol. Chem. -1983.- V.258, N20.- P.12265-12268.

242. Snyder G.I., Allen P.B., Feinberg A.A., Valle C.G., Huganier R.I., Nairn A.C., Greengard P. Regulation of phosphorylation of the GluRl AMPA receptor in the neostriatum by dopamine and stimulants in vivo. // J.Neurosci. -2000.-V. 20.-P.4480-4488.

243. Soghomonian J.-J., Martin D.L. Two isoforms of glutamate decarboxylase: Why? // Trends Pharmacol. Sci. -1998.- V.19, N12.-P.500-505.

244. Sonnewald U., Westergaard N., Schosboe A. Glutamate transport and metabolism in astrocytes. // Glia. -1997.-V. 21.-P.56-63.

245. Spitzer R.L., Endicott J., Robins E. Research Diagnostic Criteria for a Selected Group of Functional Disorders (ed. 3). New York. New York State Psychiatric Institute. 1978.

246. Suarez I., Bodega G., Arilla E., Fernandez B. Region-selective glutamine synthetase expression in the rat central nervous system following portacaval anastomosis. //Neuropathol. Appl. Neurobiol. -1997.- V.3.-P.254-261.

247. Subbalakshmi G.Y., Murthy C.R. Isolation of astrocytes, neurons, and synaptosomes of rat brain cortex: distribution of enzymes of glutamate metabolism. // Neurochem. Res. -1985.- V.10, N2.- P.239-250.

248. Sun W.-M., Huang Z.-Z., Lu Sh.C. Regulation of gamma-glutamyl-cysteine synthetase by protein phosphorylation. // Biochem. J. -1996.-V. 320.-P. 321-328.

249. Svensson T.H. Dysfunctional brain dopamine systems induced by psychotomimetic NMDA-receptor antagonists and the effects of antipsychotic drugs. // Brain Res. Rev. -2000.- V.31, N2-3.-P.320-329.

250. Swanson R.A., Graham S.H. Fluorcitrate and fluoroacetate effects on astrocyte metabolism in vitro. // Brain Res. -1994.- V.664.-P.94-100.

251. Tamminga C.A. The neurobiology of cognition in schizophrenia. // J. Clin. Psychiatry. -2006.- V.67, N9.-P.ell.

252. Tamminga C.A., Frost D.O. Changing concepts in the neurochemistry of schizophrenia // Am. J. Psychiat. -2001.- V.158, N 9.-P.1365-1366.

253. Tansey F.A., Farooq M., Cammer W. Glutamine synthetase in oligodendrocytes and astrocytes-: new biochemical and immunocytochemical evidence. // J. Neurochem. -1991. V.56, N1.-P.266-272.

254. Tapiero H., Mathe G., Couvreur P., Tew K.D. II. Glutamine and glutamate. // Biomed. Pharmacother. -2002.- V.56.- P.446-457.

255. Tate S.S., Meister, A. Identity of maleate-stimulated glutaminase with y-glutamyl transpeptidase in rat kidney. // J. Biol. Chem. -1975.-V.250.-P. 4619-4627.

256. Teller J.K., Fahien L.A., Valdivia E. Interactions among mitochondrial aspartate aminotransferase, malate dehydrogenase, and the inner mitochondrial membrane from heart, hepatoma, and liver. // J. Biol. Chem. -1990.- V.265, N32.-P. 19486-19494.

257. Tereshkina E.B., Boksha I.S., Burbaeva G.Sh. Metal ion actions on the activity of human brain glutamine synthetase. // 8-th International Congress of the Czech and Slovak Neurochemical Soc., Martin, Slovakia. Proceedings. -1996.- P.34.

258. Toro, C.T., Hallak, J.E., Dunham, J.S., Deakin, J.F. 2006 Glial fibrillary acidic protein and glutamine synthetase in subregions of prefrontal cortex in schizophrenia and mood disorder. Neurosci. Lett. 404(3):276-281.

259. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1979. V.76, N9.- P.4350-4354.

260. Tsai G., Coyle J. T., Kleinman J. E., Baer L., Carter R., Slusher B. S., and Passani L. A. Abnormal excitatory neurotransmitter metabolism in schizophrenic brains. //Arch. Gen. Psychiatry. -1996.-V.52.-P. 829-836.

261. Tsai S.J. Central N-acetyl aspartylglutamate deficit: a possible pathogenesis of schizophrenia. // Med. Sci. Monit. -2005.- V.l 1, N9.-P.HY39-45.

262. Tsakopoulos M., Magistretti P.J. Metaboilc coupling between glia and neurons. // J. Neurosci. -1996.- V.16.-P.877-885.

263. Tumani H., Shen G.Q., Peter J.B. Purification and immunocharacterization of human brain glutamine synthetase. // J.Immunol.Meth.-1995.-V.188.-P.155-163.

264. Ventura R., Harris K.M. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes. // J.Neuroscience. -1999.-V. 19.-P.6897-6990.

265. Walterfang M., Wood S.J., Velakoulis D., Copolov D., Pantelis C. Diseases of white matter and schizophrenia-like psychosis. // Aust. N. Z. J. Psychiatry. -2005.-V.39, N9.-P.746-756.

266. Ward H.K., Bradford H.F. Relative activities of glutamine synthetase and glutaminase in mammalian synaptosomes. //J. Neurochem. -1979.-V. 33.-P. 339-342.

267. Werner P., Pitt D., Raine C.S. Multiple sclerosis: altered glutamate homeostasis in lesions correlates with oligodendrocyte and axonal damage. // Ann. Neurol. 2001 .-V.50, N2.-P.169-180.

268. Westergaard N., Sonnewald U., Schousboe A. Release of alpha-ketoglutarate, malate and succinate from cultured astrocytes: possible role in amino acid neurotransmitter homeostasis. // Neurosci Lett. -1994.- V.176, N1.-P.105-109.

269. Woo T.U., Crowell A.L. Targeting synapses and myelin in the prevention of schizophrenia. 11 Schizophr. Res. -2005.-V.73, N2-3 .-P. 193-207.

270. Yamaguchi T., Hayashi K., Murakami H., Ota K., Maruyama S. Glutamate dehydrogenase deficiency in spinocerebellar degeneration. //Neurochem. Res. -1982.-V.7.-P.627-636.

271. Yamamoto H., Konno H., Yamamoto T., Ito K., Mizugai M., Iwasaki Y. Glutamine synthetase of the human brain: Purification and characterization. // J. Neurochemistry.-1987.-V.49, N2.-P. 603-608.

272. Yanchunas J., Dabrowski M.J., Schurke P., Atkins M. Supramolecular self-assembly of Escherichia coli glutamine synthetase: Characterization of dodecamer stacking and high order association. // Biochemistry (USA). -1994,- V.33, N50. -P. 14949-14953.

273. Yu A.C.H., Schousboe A., Hertz L. Metabolic fate of 14C-labeled Glu in astrocytes in primary cultures // J. Neurochem.-1982.-V.39.-P.954-960.

274. Yudkoff M. Brain metabolism of branched-chain amino acids. // Glia.-1997.-V. 21-P.92-98.

275. Yudkoff M., Daikhin Y., Nissim II., Nissim Itz. Acidosis and astrocyte amino acid metabolism. //Neurochem. International. -2000.-V.36.-P.329-339.

276. Yudkoff M., Nissim I., Nelson D., Lin Z.P., Erecinska M. Glutamate dehydrogenase reaction as a source of glutamic acid in synaptosomes. // J. Neurochem. -1991.-V.57.-P. 153-160.

277. Zielke H.R., Collins R.M., Baab P.J., Huang Y., Zielke C.L., Toldon J.T. Compartmentation of 14C. glutamate and [14C]glutamine oxidative metabolism in the rat hippocampus as determined by microdialysis. // J. Neurochem. -1998.- V.71.-P.1315-1320.

278. Rrall J. Schizophrenia and liver dysfunction caused by portacaval shunting. // Current Psychiatry Rev. -2007.-V.3.-P.205-212.

279. Krell J. Schizophrenia and liver dysfunction. //Med. Hypotheses.- 2001.-V. 56, N5.-P. 634-636.

280. Trudeau L.E. Glutamate co-transmission as an emerging concept in monoamine neuron function. //J. Psychiatry Neurosci. -2004.- V.29, N4.-P.296-310.196

281. Gras Ch., Herzog E., Bellenchi G.C., Bernard V., Ravassard P., Pohl M., Gasnier B., Giros B., Mestikawy S. E. A third vesicular glutamate transporter expressed by cholinergic and serotoninergic neurons. //J. Neurosci. -2002.- V.22, N13.-P.5442-5451.

282. Allen T.G. J., Abogadie F. C., Brown D.A Simultaneous release of glutamate and acetylcholine from single magnocellular "Cholinergic" basal forebrain neurons. // J.Neurosci.- 2006.- V. 26, N5.-P.1588 -1595.

283. Sulzer D., Joyce M. P., Lin L., Geldwert D., Haber S. N., Hattori T., Rayport S. Dopamine Neurons Make Glutamatergic Synapses In Vitro. //J. Neurosci.- 1998.-V.18, N12.-P.4588-4602.

284. Losi G., Vicini S., Neale J. NAAG fails to antagonize synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in cerebellar granule neurons.//Neuropharmacology.-2004.-V.46, N4.-P.490-496.