Роль различных путей образования свободных радикалов в токсическом действии глутамата при ишемии переднего мозга крыс

Молчанова, Светлана Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль различных путей образования свободных радикалов в токсическом действии глутамата при ишемии переднего мозга крыс
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль различных путей образования свободных радикалов в токсическом действии глутамата при ишемии переднего мозга крыс"

На правах рукописи

МОЛЧАНОВА Светлана Михайловна

РОЛЬ РАЗЛИЧНЫХ ПУТЕЙ ОБРАЗОВАНИЯ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ В ТОКСИЧЕСКОМ ДЕЙСТВИИ ГЛУТАМАТА ПРИ ИШЕМИИ ПЕРЕДНЕГО МОЗГА КРЫС

Специальность 03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2006 г.

Работа выполнена в лаборатории сравнительной нейрохимии Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург.

Научный руководитель - доктор биологических наук

зае.лаб. Н.Ф. Аврова

Официальные оппоненты -

Ведущая организация

доктор биологических наук вед. н. сотр. Р.Г. Парнова

доктор биологических наук вед. н. сотр. Ф.Е. Путилина

Институт

высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Защита состоится 11 апреля 2006 г. в 11 часов на заседании специализированного диссертационного совета Д 002.127.01 при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН (194223, Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЭФиБ им. И.М. Сеченова РАН

Автореферат разослан 7 марта 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

М.Н. Маслова

200GA

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ишемия головного мозга возникает в результате снижения мозгового кровотока при окклюзии артерий мозга или нарушениях системного кровообращения. На сегодняшний день эффективный способ лечения последствий глобальной церебральной ишемии неизвестен, поэтому изучение метаболических изменений, приводящих к нарушению функции нейронов при ишемии головного мозга, является актуальной задачей.

Для стойкого увеличения [Са2+]„ необходимого для запуска каскада патобиохимических реакций при ишемии, одного входа Са2+ через ионотропные глутаматные рецепторы недостаточно. Активация этих рецепторов инициирует обменные процессы, которые приводят к устойчивому повышению [Са2+], (Paschen, 2000, Limbrick et al., 2001). К числу таких процессов относят и образование свободных радикалов. Было показано, что образование свободных радикалов усугубляет дисбаланс ионов Са2+ и приводит к повышению их концентрации в цитозоле (Mattson et al., 1995, Castilho et al., 1999, Pereira, Oliveira, 2000, Starkov et al., 2004). Образование свободных радикалов при ишемии происходит за счет активации ряда ферментативных реакций, в том числе катализируемых фосфолипазой Аг, циклооксигеназой, NO-синтазой и ксантиноксидазой, а так же в результате работы электрон-транспортной цепи митохондрий. Различия в механизме образования свободных радикалов в разных областях головного мозга могут, наряду с другими факторами, определять региональные особенности ишемической гибели нейронов в этих областях (Sims, Zaidan, 1995). Это определяет актуальность изучения вклада разных путей образования свободных радикалов в нарушения метаболизма в нервных клетках в разных областях головного мозга при действии на них глутамата.

Цель и задачи исследований. Целью данного исследования является сравнительное изучение роли различных путей образования свободных радикалов в инициации вызванных глутаматом нарушений метаболизма в нервных окончаниях из трех отделов переднего мозга (кора больших полушарий, стриатум, гиппокамп). Поставленная цель достигается путем решения ряда задач, среди которых необходимо выделить следующие:

1. Изучение действия глутамата на [Ca ]„ вход Ca , активность Na , К -АТФазы и накопление конечного продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ) малонового диальдегида (МТ1Л) в ттттнщтпг.г' пдргтттг' окончаниях (синаптосомах) коры больших полушарод^ОДгОДМювхщдею&мпа in vitro.

I библиотека J

2. Определение влияния антиоксидантов на изменение [Ca2+]¡, входа 45Са2+ в синаптосомы, активности Na+, К+-АТФазы и содержания МДА, вызванное глутаматом в синаптосомах коры головного мозга.

3. Определение влияния ингибиторов фосфолипазы А2, циклооксигеназы, ксантиноксидазы, NO-синтазы и комплекса I электрон-транспортной цепи митохондрий на обусловленное глутаматом изменение изученных параметров в синаптосомах коры больших полушарий, стриатума и гиппокампа in vitro.

4. Изучение действия глобальной церебральной ишемии и реперфузии in vivo на внеклеточную концентрацию глутамата, аспартата и глицина в стриатуме.

5. Изучение действия глобальной церебральной ишемии и реперфузии, а также ингибиторов фосфолипазы Аг и циклооксигеназы на активность Na+, К+-АТФазы и накопление продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов) в коре головного мозга, стриатуме и гиппокампе.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное изучение роли различных путей образования свободных радикалов (NO-синтазного, фосфолипазного, циклооксигеназного, ксантиноксвдазного и митохондриального) в вызванном глутаматом нарушении метаболизма в нервных окончаниях разных областей переднего мозга. Объектами исследования были области мозга, наиболее чувствительные к ишемии - кора больших полушарий, стриатум и гиппокамп. Впервые были отмечены существенные региональные особенности механизмов нарушения метаболизма в нервных окончаниях коры головного мозга, стриатума и гиппокампа при действии токсических доз глутамата. Так, было показано большее влияние NO-синтазного пути образования свободных радикалов на нарушения метаболизма синаптосом коры мозга и стриатума, чем гиппокампа. Впервые были описаны различия во вкладе фосфолипазного пути образования свободных радикалов в нарушении метаболизма при действии глутамата и ишемическом повреждении нервной ткани различных областей переднего мозга. Показано, что этот путь образования свободных радикалов в большей степени участвует в ишемическом поражении коры головного мозга, чем стриатума.

Научно-практическое значение. Проведенное исследование вносит вклад в понимание процессов, происходящих на ранних этапах ишемии и токсического действия глутамата на клетки мозга. Полученные данные подтверждают участие свободных радикалов, образующихся в результате активации фосфолипазного, циклооксигеназного, NO-синтазного и ксантиноксвдазного путей, в нарушении метаболических процессов в выделенных нервных окончаниях под действием глутамата. Так, было показано, что ингибиторы фосфолипазы А2, циклооксигеназы, NO-синтазы и ксантиноксидазы предотвращают или значительно снижают нарушения метаболизма в выделенных нервных окончаниях коры головного мозга, вызванные глутаматом. Аналогичный эффект на изученные метаболические показатели оказывали антиоксиданты а-токоферол и супероксидцисмутаза (СОД).

метаболизма в выделенных нервных окончаниях коры головного мозга и гиппокампа, но не стриатума. В то же время ингибитор NO-синтазного пути образования свободных радикалов снижал вызванное глутаматом увеличение [Са2+], и инактивацию Na+, К+-АТФазы в синаптосомах коры головного мозга, но не гиппокампа. Полученные данные вносят вклад в понимание различий в развитии ишемического поражения ткани этих областей.

Было определено, что ингибирование митохондриального пути образования свободных радикалов приводило к нарушению метаболизма в синаптосомах из всех изученных областей мозга, и усугубляло токсическое действие глутамата в синаптосомах коры мозга. Полученные данные согласуются с представлениями о том, что на ранних этапах ишемического воздействия митохондрии могут выполнять защитную роль, аккумулируя излишки Са2+ из цитозоля и тем самым предотвращая активацию путей образования свободных радикалов в цитозоле (Khodorov et al., 1999, Saybasili et al., 2001).

Данные, полученные при использовании модели токсического действия глутамата на нервные окончания, сравнивали с результатами экспериментов, проведенных с использованием модели глобальной двухсосудистой ишемии переднего мозга крыс. Было показано многократное увеличение содержания глутамата, аспартата и глицина во внеклеточном пространстве мозга при ишемическом воздействии. При этом также были выявлены существенные региональные особенности механизмов нарушения метаболизма в коре головного мозга, стриатуме и гиппокампе при ишемии и реперфузии. Полученные данные подтверждают результаты, полученные при исследовании выделенных нервных окончаний, и, наряду с другими экспериментальными данными, могут быть использованы в дальнейшем при разработке рекомендаций по медикаментозному лечению последствий инсультов в разных областях головного мозга.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены в форме устных сообщений и постерных презентаций на 7 Российских и Международных конференциях и симпозиумах: "Free radicals and antioxidants in the development and functions of the central nervous system: from fetus to aging" (Санкт-Петербург, 2001); XII Международное совещание и V школа по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2001); Пятая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2002); Ш Съезд Биохимического Общества (Санкт-Петербург, 2002); Симпозиум "Reactive oxygen and nitrogen species: diagnostic, preventive and therapeutic values" (Санкт-Петербург - Кижи, 2002); X Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов" (Москва, 2003); Summer school of molecular neurobiology (Варшава, Польша, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ - 7 тезисов докладов, представленных на Международных и Российских конференциях и симпозиумах, и 6 полнотекстовых статей, из которых 4 - в отечественных журналах, 1 - в международном журнале и 1 - в сборнике статей.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, методы, результаты и обсуждение), заключения,

выводов и списка литературы. Работа содержит 154 страницы машинописного текста, включая 17 рисунков, 6 таблиц и список литературы из 228 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование роли свободных радикалов в токсическом действии глутамата in vitro проводили на фракции очищенных синаптосом и фракции неочищенных митохондрий (Р2 фракции), содержащей синаптосомы. В опытах использовали самцов крыс линии Wistar весом 250-270 г. Фракции синаптосом коры головного мозга, стриатума и гиппокампа выделяли методом дифференциального центрифугирования в водных растворах сахарозы согласно методике (Hajos, 1975) с модификациями. Полученные фракции инкубировали с 1 мМ глутаматом в течение 15 минут при 37°С. Преинкубацию с а-токоферолом (0,133 мМ), СОД (10 ME/мл), МК-801 (1цМ), квинакрином (50 цМ), L-ÑAME (метиловый эфир N°-нитро-Ь-аргинина, 200цМ), аллопуринолом (100|iM), индометацином (100 цМ), ротенононом (20 цМ) и олигомицином (20 jxM) проводили в течение 5 минут при комнатной температуре. При использовании растворов ингибиторов в спирте или диметилсульфоксиде конечная концентрация растворителей не превышала 0,5 %. В этом случае равные объемы растворителя добавлялись и в пробы, не содержащие ингибитора. По окончании инкубации синаптосом с глутаматом проводили определение [Са2+]„ входа Са2+, содержания МДА или активности Ыа+,К+-АТФазы.

Определение [Са2+], проводили с использованием флюоресцентного зонда фура-2 AM (Giynkiewicz et al., 1985, Yates et al., 1992) и выражали в нМ. Вход Са2+ в синаптосомы определяли с помощью изотопного метода в среде, содержащей 45Са2+ (Тюрина и др., 1998). Концентрацию МДА определяли спектрофотометрически по продуктам реакции этого соединения с тиобарбитуровой кислотой (Владимиров, Арачков, 1972). Активность Na+,K+-АТФазы оценивали по сопряженной реакции с участием пируваткиназной регенерирующей системы, регистрируя скорость уменьшения содержания НАДНг в среде инкубации (Leon et al., 1981). Вход 45Са2+, активность Na+, К+-АТФазы и содержание МДА выражали в нмоль 45Са2+/мг белка/30 с, ¡хмоль Ф„/мг белка в час и нмоль/мг белка, соответственно. Содержание белка определяли модифицированным методом Лоури с использованием додецилсульфата натрия (Markwell et al., 1978).

Определение роли свободных радикалов в ишемическом поражении нервной ткани in vivo проводили с использованием модели глобальной двухсосудистой ишемии переднего мозга. Ишемию вызывали у самцов крыс линий Wistar и Sprague-Dawley весом 250-300 г. путем окклюзии сонных артерий в сочетании с гипотензией (Dirnagi et al., 1993). Все процедуры проводили под наркозом, вызванным внутрибрюшинной инъекцией нембутала (50 мг/кг веса) либо ингаляцией галотана (0,8-1,2% в воздухе). Время ишемии составляло 20 минут, время реперфузии - 1 час. Индометацин (10 мг на 1 кг веса, в 100 мМ ШНСОз) или квинакрин (5 мг на 1 кг веса, в физиологическом растворе) вводили внутрибрюшинно за 20 минут до начала ишемии.

Внеклеточные концентрации глутамата, аспартата и глицина в стриатуме определяли до, во время и после ишемии методом микродиализа. Концентрации этих аминокислот в диализате измеряли при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ

их производных с последующей флюоресцентной детекцией (Kendrick et al., 1996) и выражали в цМ. По окончании ишемии или ишемии в сочетании с реперфузией проводили определение активности Na+,K+-AT<Da3bi и содержания диеновых конъюгатов в коре головного мозга, стриатуме и гиппокампе. Активность Na+,K+-АТФазы определяли в Р2 фракции тем же методом, который использовался в исследованиях in vitro. Содержание диеновых конъюгатов определяли спектрофотометрически в гомогенате исследуемых областей мозга (Владимиров, Арачков, 1972) и выражали в нмоль/цг Ф„. Содержание в пробах неорганического фосфата определяли с использованием аскорбиновой кислоты (Fiske, Subbaraw, 1925).

При анализе полученных данных расчитывались среднее арифметическое первичных результатов и стандартная ошибка среднего арифметического. Для проверки статистической гипотезы о различии между полученными средними значениями был использован критерий Стьюдента (í-тест) и критерий Стьюдента (/-тест) для зависимых выборок.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В диссертационной работе было проведено изучение роли различных путей образования свободных радикалов в нарушении метаболизма нейронов, вызванном действием токсических концентраций глутамата или ишемией. Исследования влияния глутамата и ингибиторов разных путей образования свободных радикалов на показатели метаболизма нервной ткани проводились in vitro на выделенных нервных окончаниях (синаптосомах) коры головного мозга, стриатума и гиппокампа. Результаты, полученные in vitro, были подтверждены исследованиями in vivo, проведенными при использовании модели двухсосудистой ишемии переднего мозга крыс.

Синаптосомы, представляющие собой выделенные нервные окончания, содержат наружную мембрану, цитозоль, митохондрии и другие субклеточные органеллы. Так как синаптосомы не содержат ядра, они являются удобной моделью для изучения метаболических нарушений в нервных клетках на ранних этапах токсического действия глутамата, предшествующих изменению экспрессии генов. Эта модель была выбрана для проведения исследований роли фосфолипазного, циклооксигеназного, NO-синтазного, ксантиноксидазного и митохондриального путей образования свободных радикалов в нарушении метаболизма под действием глутамата в нервных окончаниях коры головного мозга, стриатума и гиппокампа. Для того, чтобы охарактеризовать роль свободных радикалов в нарушении ионного гомеостаза синаптосом, были выбраны несколько параметров: [Са2+]„ вход 45Са2+, накопление МДА и активность Na+, К+-АТФазы. Токсическое воздействие глутамата на выделенные нервные окончания было наиболее полно изучено при использовании препарата синаптосом коры головного мозга. В частности, было показано, что глутамат приводит к увеличению [Са2+], и входа Са2+, снижению активности Ыа+,К+-АТФазы и накоплению продуктов ПОЛ, а антиоксиданты а-токоферол и СОД предотвращают либо уменьшают эти нарушения метаболизма (таблица 1). Это свидетельствует о том, что активация свободнорадикальных реакций, вызванная взаимодействием глутамата с его рецепторами, приводит к изменению изученных параметров метаболизма синаптосом. В частности, наши данные подтверждают участие свободных

Таблица 1 Действие глутамата, а-токоферола и СОД на показатели метаболизма в синаптосомах коры больших полушарий мозга крыс

Условия эксперимента [Са2+]„ нМ Вход 43Са"!+, нмоль 45Са2+/мг белка/30 с Активность Na+,K+-АТФазы, цмоль Фн/мг белка в час Содержание МДА, нмоль/мг белка

Контроль 251±17,6 0,34±0,02 18,74±1,5 1,74±0,1

Глутамат, 1 мМ 301,9±23,7а 0,63±0,02" 12,41±1,74° 2,91±0,23а

Глутамат + МК-801, 1 цМ не определено 0,36±0,02б 17,58±1,366 2,13±0,166

Глутамат + а-токоферол, 0,133 мМ 186,5±18,56 0,38±0,026 16,32+1,46" 1,2±0,086

Глутамат + СОД, ЮМЕ/мл не определено 0,33±0,026 17,16±1,34б 1,68±0,116

Данные представлены в виде: среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего арифметического из 4-10 опытов. Различия достоверны "-по сравнению с контролем, б,в-по сравнению с действием одного глутамата, 6 - р<0,05," - р<0,05 методом попарных сравнений.

радикалов в процессе внутриклеточного накопления Са2+, который является ключевым для последующей гибели клеток при ишемии. Описанные изменения связаны с активацией NMDA рецепторов, так как преинкубация с антагонистом этих рецепторов МК-801 предотвращала повреждающее действие глутамата.

Далее было исследовано участие разных путей образования свободных радикалов в нарушении метаболизма в синаптосомах под действием глутамата. На настоящий момент образование оксида азота считается одним из ключевых факторов в патологическом ответе мозга при ишемии (Jiang et al., 2002, Iravani et al., 2004, Kumar, 2004). В диссертационной работе показано, что L-NAME предотвращает глутамат-индуцированное увеличение [Са2+]„ но не увеличение входа Са2+ в синаптосомах коры головного мозга и стриатума (рисунок 1). В то же время при инкубации синаптосом с ингибитором NO-синтазы L-NAME в отсутствие глутамата достоверных изменений изученных параметров не обнаружено. Полученные результаты позволяют предположить, что эффект оксида азота, образующегося в результате активации NO-синтазы в синаптосомах коры мозга и стриатума, может быть обусловлен его влиянием на внутриклеточные процессы, в частности, происходящие в митохондриях. Действительно, оксид азота ингибирует ферменты дыхательной цепи митохондрий нервных клеток и вызывает деполяризацию наружной мембраны этих органелл, а глутамат в присутствии ингибитора NO-синтазы не оказывает повреждающего действия на митохондрии (Bolaflos et al., 1997, Almeida et al., 1999, Brown, 1999). Однако, генерация свободных радикалов NO-сштгазой по-видимому, слабо влияет на изменение функции мембран и входа ионов Са2+ в клетку извне.

Нами были показаны существенные региональные различия в эффектах ингибитора NO-синтазного пути. В частности, было показано, что ингибирование

АТФаза

МДА

вход [Са2+]| 45Са2+

I контроль ■гяутамат Пгпутамат + 1_-МАМЕ

стриатум

N3+,«+-АТФаэз

МДА

вход 45Са2+

(Са2+]|

• контроль шгпутамзт □ глутамат + 1-МАМЕ

N8+,«+-АТФаэа

■ контроль ■ глутамат □ глутамат + 1_^АМЕ

АТФаза

МДА

вход 45Са2+

I контроль ■ глутамат □ глутамат + квинакрин

стриатум

Ма+,К+- МДА АТФаэа

I контроль ■ глутамат а глутамат + квинакрин

АТФаза

■ контроль ■ глутамат □ глутамат + квинакрин

Рис. 1 Влияние глугамата, Ь-ЫАМЕ и квинакрина на показатели метаболизма в синаптосомах коры головного мозга крыс, стриатума и гиппокампа. Различия достоверны *-по сравнению с контролем, +-по сравнению с действием одного глутамата (р<0,05 методом попарных сравнений).

NO-синтазы предотвращает глутамат-индуцированное увеличение [Са2+], и накопление МДА в синаптосомах коры головного мозга. В синалтосомах стриатума этот ингибитор также оказывает защитное действие, снижая [Са2+], и предотвращая окислительное ингибирование Ка+,К+-АТФазы при действии токсических концентраций глутамата. Однако ингибитор NO-синтазы не оказывал никакого эффекта на нарушения метаболизма синаптосом гиппокампа, вызванные глутаматом, не изменяя ни [Са2+]1; ни вход 45Са2+, ни активность №+,К+-АТФазы, ни содержание МДА. Исходя из полученных результатов можно предположить, что в коре головного мозга и стриатуме активация этого пути образования свободных радикалов участвует в инициированном глутаматом устойчивом повышении [Са2+],. В то же время в гиппокампе NO-синтазный путь образования свободных радикалов, скорее всего, играет меньшую роль на ранних этапах токсического действия глутамата.

Фосфолипазный путь образования свободных радикалов играет важную роль в нарушении функционирования нейронов при ишемии (Bonventre, 1997, Lancelot et al., 1997, Iadecola et al., 2001). Под действием фосфолипазы A2 от фосфолипидов клеточных мембран происходит отщепление полиеновых жирных кислот, в том числе и арахидоната. Это активирует перекисное окисление полиеновых жирных кислот с образованием активных форм кислорода и продуктов ПОЛ. Кроме того, окисление арахидоновой кислоты циклооксигеназой и другими ферментами также приводит к образованию свободных радикалов (супероксид радикала) и простагландинов.

Нами было показано, что ингибитор фосфолипазы А2 квинакрин предотвращает глутамат-зависимое накопление МДА, ингибирование Na+,K+-АТФазы и увеличение входа 43Са2+ в нервных окончаниях коры мозга и гиппокампа (рисунок 1). При этом квинакрин не влиял на значения изученных параметров метаболизма в синаптосомах при их инкубации в отсутствие глутамата. В синаптосомах стриатума защитного эффекта квинакрина не выявлено. Эти данные предполагают большее участие фосфолипазного пути образования свободных радикалов на начальном этапе развития нейротоксичности в коре мозга и гиппокампе, чем в стриатуме. Различная чувствительность областей мозга к действию ингибитора не связана с различиями в распределении кальций-зависимой фосфолипазы А2, так как экспрессия этого фермента находится на одном уровне в стриатуме и гиппокампе (Molloy et al., 1998).

В коре мозга и гиппокампе эффект ингибитора фосфолипазы А2 выражен сильнее, чем эффект ингибитора циклооксигеназы индометацина, препятствующего ферментативному окислению арахидоната. Так, при действии квинакрина наблюдалось снижение образования МДА в синаптосомах коры мозга и гиппокампа, а при действии индометацина имеет место лишь тенденция к нормализации. Индометацин также предотвращает глутамат-зависимое ингибирование №+,К+-АТФазы в синаптосомах этих областей мозга (рисунок 2). При этом индометацин не влияет на значения изученных параметров метаболизма синаптосом при их инкубации в отсутствие глутамата. Возможным объяснением может служить активация неферментативного свободнорадикального окисления полиеновых жирных кислот, а также ферментативное окисление арахидоната липоксигеназами.

№+.К+-АТФаза

МДА

■ контроль ■ гпутамат о глутамат + индометацин

250 200 160 100 50

аШ

№+,К+-АТФаза

МДА

■ контроль

■ глутамат

а глутамат + ротенон + олигомицин

стриэтум 160 -| стриатум

1Б0 -140 ■ * 140 • *

щ 120 ■ §. 100 -| 80 -5 60 • 35 40 ■ 20 -0 ■ | Ш+К+-АТФаа 1 ■а МЛА — ? 120 -I- 1001 80-& 60-3е 40 -200 - т №+,К+-АТФаза МДА —

■ контроль ■ глутамат □ глутамат + индометацин ■ глутамат □ глутамат + ротенон + олигомицин

Ыа+К-ь-АТФаза

МДА

■ контроль

■ глутамат

□ глутамат + ротенон + олигомицин

Рис. 2 Влияние глутамата, индометацина и ротенона в сочетании с олигомицином на показатели метаболизма в синаптосомах коры головного мозга крыс, стриатума и гиппокампа. Различия достоверны *-по сравнению с контролем, +-по сравнению с действием одного глутамата (р<0,05 методом попарных сравнений).

В работе показано, что ингибитор ксантиноксидазы аллопуринол предотвращает ингибирование Na+, К+-АТФазы, вызванное глутаматом, но не влияет на накопление МДА в синаптосомах коры головного мозга. Ксантиноксидаза локализована в мозгу млекопитающих в основном в клетках эндотелия (Betz, 1985, Terada et al., 1991). Этим, по-видимому, может объясняться слабое нейропротекторное действие ингибиторов ксантиноксидазы на препараты синаптосом (Peeters et al, 2003).

Накопление свободных радикалов в клетке происходит также в результате утечки активных форм кислорода с электрон-транспортной цепи митохондрий (Зенков и др., 2001). Для изучения вклада этих органелл в образование свободных радикалов при действии глутамата в диссертационной работе использован ингибитор митохондриального комплекса I ротенон и ингибитор АТФ синтазы олигомицин. Ротенон и олигомицин в значительной мере предотвращают продукцию свободных радикалов митохондриями, повышая жизнеспособность клеток в культуре (Castilho et al., 1999). Но в то же время эти соединения вызывают деполяризацию митохондрий, нарушая захват Са этими органеллами (Khodorov et al., 1999). В результате этого может происходить увеличение [Са2+], и активация образования свободных радикалов в цитозоле (Luetjens et al., 2000, Saybasili et al., 2001). Согласно полученным результатам, ротенон и олигомицин не защищают мембраны синаптосом всех изученных областей переднего мозга от повреждающего действия глутамата (рисунок 2). Более того, в синаптосомах коры мозга эти ингибиторы достоверно усиливают эффекты глутамата. В отсутствие глутамата ротенон и олигомицин также приводят к снижению активности Na+, К+-АТФазы и увеличению содержания МДА в синаптосомах всех изученных областей мозга. Полученные данные подтверждают представления о том, что на ранних этапах ишемического воздействия митохондрии могут выполнять защитную роль, аккумулируя излишки Са2+ из цитозоля. Важно отметить, что повреждающее действие этих веществ не связано с потерей макроэргов, так как эффект ротенона на фоне олигомицина выражен сильнее, чем эффект одного ротенона. В условиях блокады электрон-транспортной цепи олигомицин, как известно (Castilho et al., 1999), предотвращает использование АТФ, образующегося в результате гликолиза, на поддержание разницы потенциалов на мембране митохондрий. Поэтому при действии одного ротенона потеря макроэргов более выражена, чем при его совместном действии с олигомицином.

Таким образом, нами было показано, что активация NO-синтазного и фосфолипазного путей образования свободных радикалов участвует в раннем ишемическом ответе клеток, обуславливая нарушения метаболизма нервных окончаний при токсическом действии глутамата. Также были выявлены существенные региональные особенности нарушений обмена веществ в синаптосомах из разных отделов мозга при действии на них глутамата. Для того, чтобы проверить, наблюдаются ли эти региональные особенности при ишемии мозга, было проведено исследование in vivo. В литературе имеются данные о клинической перспективности модуляторов циклооксигеназного пути образования свободных радикалов (Rogers et al., 1993, Blain et al., 2000, Ferenik et al., 2001). В связи с этим, нами был исследован вклад активации фосфолипазы А2 и циклооксигеназы в нарушение метаболизма нервных клеток при глобальной

Таблица 2 Влияние двухсосудистой ишемии и реперфузии на внеклеточные концентрации нейротрансмиттерных аминокислот в стриатуме_

Условия эксперимента (минуты) Концентрации нейротрансмиттерных аминокислот, % от среднего арифметического базальных значений

глутамат аспартат глицин

60-40 минут до ишемии 107,7±3,5 106,3±14,8 107,2+4,7

40-20 минут до ишемии 102,5±4,4 112,3±19,3 97,8±3,6

20-0 минут до ишемии 89,8±4,2 81,4±12,1 96,5±4,7

0-10 минут ишемии 221,5±41,2" 610,2+120,7" 307,6±74,1"

10-20 минут ишемии 766,7±145,9" 2005,5±3 86,1" 549,3+126,4'

0-20 минут реперфузии 110,9±11,6 576,2±16,6" 468,9±183,2а

20-40 минут реперфузии 121,6±19,8 157,3±1,5 166,3±45,9

40-60 минут реперфузии 154,3±45,9 93,4+5,0 143,0+50,3

Данные представлены в виде: среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего арифметического из 5-6 опытов. Базальные концентрации аминокислот в диализате составляли: глутамат 1,79+0,29 цМ; аспартат 0,14±0,06 цМ; глицин 0,90±0,26 jiM. Различия достоверны "-по сравнению с базальными значениями (р< 0,05) и контролем (ложнооперированные животные, р<0,05).

церебральной ишемии. Было изучено влияние двухсосудистой ишемии переднего мозга и последующей его реперфузии на внеклеточные концентрации глутамата и других нейромедиаторных аминокислот, активность Ка+,К+-АТФазы и накопление продуктов ПОЛ в разных областях переднего мозга крыс (коре, стриатуме и гиппокампе). Также были исследованы способности квинакрина и индометацина при их прижизненном введении предотвращать нарушения метаболизма, вызванные в клетках мозга ишемией и реперфузией.

При ишемии мозга в межклеточном пространстве происходит накопление высоких концентраций глутамата, взаимодействующего с рецепторами и вызывающего нарушения метаболизма, приводящие к гибели нервных клеток (Benveniste et al., 1984; Globus et al., 1991). В нашей работе методом микродиализа показано, что глобальная церебральная ишемия приводит к значительному (в семь раз) увеличению внеклеточного содержания глутамата, и к многократному повышению содержания другой возбуждающей аминокислоты аспартата и коагониста NMDA-рецепторов глицина во внеклеточном пространстве стриатума (таблица 2). Однако, другие метаболические нарушения были обнаружены нами только после часа реперфузии.

Результаты, полученные при использовании модели ишемии/реперфузии, в целом согласуются с данными, полученными in vitro. Так, ишемия и последующая реперфузия приводила к увеличению содержания продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов) в коре головного мозга и снижению активности Ыа+,К+-АТФазы в коре и стриатуме. Аналогичные изменения были показаны и при изучении действия глутамата на синаптосомы из этих структур. Ингибиторы фосфолипазного и циклооксигеназного путей образования свободных радкиалов (квинакрин и индометацин) при их прижизненном введении нормализовали активность Ка+,К+-АТФазы в коре мозга крыс, подвергнутых двухсосудистой

<8 Т ш 20

С, 15

2 10

ё 5

? 0

кора

стриагум гиппокамп

■ ложнооперированные

■ ишемия реперфузия □ ишемия реперфузия квинакрин

кора

стриатум

■ ложнооперированные

■ ишемия реперфузия

□ ишемия реперфузия индометацин

Рис. 3 Влияние глобальной церебральной ишемии и реперфузии и введения квинакрина и индометацина на активность №+,К+-АТФазы в коре мозга, стриатуме и гиппокампе. Различия достоверны *-по сравнению с контролем; +- по сравнению с действием ишемии и реперфузии (р<0,05).

ишемии с последующей реперфузией (рисунок 3). При действии глутамата на синаптосомы этой области мозга эти ингибиторы также обладали способностью нормализовать активность №+,К+-АТФазы. Введение индометацина уменьшало накопление одного из продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов в коре больших полушарий после ишемии и реперфузии. В синаптосомах этой структуры мозга снижение накопления продуктов ПОЛ наблюдалось при действии на них другого ингибитора - квинакрина.

Сравнение данных, полученных in vitro и in vivo по гиппокампу затруднено в связи с тем, что ишемия и реперфузия не приводили к достоверному изменению изученных показателей обмена в этой области мозга. По-видимому, это связано с разнонаправленными эффектами глутамата, который может не только вызывать окислительную инактивацию Na+,K+-ATOa3bi, но и приводить к дефосфорилированию фермента и повышению его активности (Marcaida et al., 1996; Villa et al., 2002). Однако эффект индометацина в этой области мозга был сходным в опытах in vivo и in vitro (достоверное повышение активности Na+,K+-АТФазы и отсутствие эффекта на содержание продуктов ПОЛ).

Квинакрин не изменял активность №+,К+-АТФазы в стриатуме крыс, подвергнутых ишемии и реперфузии, тогда как индометацин достоверно повышал активность этого фермента. При этом индометацин не влиял на накопление продуктов ПОЛ. В опытах, проведенных на синаптосомах стриатума, нами также было показано, что квинакрин не предотвращал нарушений метаболизма, вызванных глутаматом. Индометацин же и в синаптосомах этой структуры оказывал нормализующее действие на активность №+,К+-АТФазы. Таким образом, и в опытах, проведенных in vivo, эффект ингибитора фосфолипазного пути образования свободных радикалов был более выражен в коре головного мозга, чем в стриатуме.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе было проведено исследование роли различных путей образования свободных радикалов в метаболических нарушениях, вызванных токсическими концентрациями глутамата в синаптосомах из трех областей головного мозга. Синаптосомы представляют собой выделенные нервные окончания, имеющие в своем составе цитозоль, митохондрии и другие клеточные органеллы, однако в них отсутствуют ядра. Воздействие глутамата на нервные окончания нейронов из разных отделов мозга может служить модельной системой для изучения ранних этапов метаболических нарушений в нервных клетках, происходящих при ишемии до изменения экспрессии генов.

Токсическое воздействие глутамата на выделенные нервные окончания было наиболее полно изучено при использовании препарата синаптосом коры головного мозга. В частности, было показано, что глутамат приводит к увеличению [Са2+], и входа Са2+, снижению активности №+,К+-АТФазы и накоплению продуктов ПОЛ в синаптосомах, а антиоксиданты а-токоферол и СОД предотвращают либо уменьшают эти нарушения метаболизма. Эти данные подтверждают участие свободных радикалов в процессе внутриклеточного накопления Са2+, который является ключевым для последующей гибели клеток при ишемии.

В результате дальнейшей работы были изучены возможные источники свободных радикалов, участвующие в нарушении метаболизма в синаптосомах коры головного мозга, стриатума и гиппокампа при действии на них глутамата. Была изучена роль NO-синтазного, фосфолипазного, циклооксигеназного, ксантиноксидазного и митохондриального путей образования свободных радикалов в таких нарушениях метаболизма, как повышение [Са2+]„ увеличение входа 45Са2+, инактивация Ка+,К+-АТФазы и накопление МДА. Было показано, что существенный вклад в токсическое действие глутамата на синаптосомы вносят NO-синтазный и фосфолипазный пути образования свободных радикалов. Однако при этом были обнаружены существенные региональные различия в механизмах нарушения метаболизма в синаптосомах. В частности, было показано, что ингибирование NO-синтазы предотвращало глутамат-индуцированное увеличение [Са2+], в синаптосомах коры головного мозга и стриатума, но не гиппокампа. Ингибитор фосфолипазы А2 предотвращал все изученные нарушения метаболизма, вызванные глутаматом в синаптосомах коры головного мозга и гиппокампа, но не стриатума.

Ингибирование электрон-транспортной цепи митохондрий приводило к нарушению метаболизма в синаптосомах всех изученных областей мозга, и усугубляло токсическое действие глутамата в синаптосомах коры мозга. Предполагается, что обнаруженный эффект ротенона и олигомицина обусловлен нарушением регуляции обмена Са митохондриями. Полученные данные согласуются с представлениями о том, что на ранних этапах ишемического воздействия митохондрии могут выполнять защитную роль, аккумулируя излишки Са2+ из цитозоля.

глутамата, аспартата и коагониста NMDA рецепторов глицина. После ишемии и реперфузии имело место ингибирование Ыа+,К+-АТФазы и увеличение содержания продуктов ПОЛ в коре больших полушарий. Показано, что ингибиторы фосфолипазы А2 и циклооксигеназы предотвращали изменение изученных параметров метаболизма в коре головного мозга, вызванных ишемией и реперфузией. Эта результаты согласуются с данными, полученными при изучении метаболических эффектов этих ингибиторов и токсических концентраций глутамата на синаптосомы коры головного мозга in vitro. В гиппокампе ишемия с последующей реперфузией не приводила к достоверному снижению активности Ш+,К+-АТФазы, что затрудняет анализ действия ингибиторов фосфолипазного и циклооксигеназного пути образования свободных радикалов. В стриатуме не было показано защитного эффекта ингибитора фосфолипазы А2 как при ишемии и реперфузии in vivo, так и при токсическом действии глутамата на выделенные нервные окончания in vitro. Эти данные свидетельствуют о том, что фосфолипазный путь образования свободных радикалов играет большую роль в токсическом действии глутамата в коре больших полушарий, чем в стриатуме.

Таким образом, в диссертационной работе были показаны существенные региональные различия в участии ферментативных реакций образования свободных радикалов в действии глутамата на синаптосомы из трех областях головного мозга: коры, стриатума и гиппокампа. Региональные различия были показаны и в опытах по изучению действия ишемии и реперфузии in vivo. Полученные нами данные подтверждают участие реакций образования свободных радикалов в нарушении метаболизма, в частности, обмена ионов при ишемическом поражении клеток. Наряду с результатами других исследований, они могут быть использованы при разработке селективного подхода к лечению ишемических поражений различных областей мозга.

ВЫВОДЫ

1. Токсические концентрации глутамата вызывают увеличение [Ca2+]¡, входа Са2+, накопление МДА и снижение активности №+,К+-АТФазы в синаптосомах коры головного мозга и гиппокампа. Инкубация синаптосом стриатума с глутаматом также приводит к увеличению входа Са2+, накоплению МДА и снижению активности Ка+,К+-АТФазы. Антиоксид анты а-токоферол и СОД предотвращают изменение этих параметров в синаптосомах коры головного мозга, вызванное действием глутамата.

2. Ингибитор фосфолипазы А2 квинакрин предотвращает или снижает действие глутамата на все изученные показатели метаболизма в синаптосомах коры головного мозга и гиппокампа. В то же время в синаптосомах стриатума квинакрин не эффективен. Эти данные позволяют предполагать, что активация фосфолипазы А2, приводящая к увеличению образования свободных радикалов, играет значительно большую роль в токсическом действии глутамата на нервные окончания коры больших полушарий и гиппокампа, чем стриатума. Ингибитор циклооксигеназы индометацин предотвращает вызванную глутаматом инактивацию 1*Га+,К+-АТФазы, но не влияет на накопление МДА в синаптосомах всех изученных структур переднего мозга.

3. Ингибитор NO-синтазы L-NAME в присутствии глутамата снижает [Са2+], в нервных окончаниях коры головного мозга и стриатума. Кроме того, L-NAME снижает накопление МДА в синаптосомах коры головного мозга и ингибирование №+,К+-АТФазы в синаптосомах стриатума. Однако L-NAME не оказывает никакого эффекта на изменение изученных показателей в синаптосомах гиппокампа, вызванное глутаматом. Эти данные дают основание полагать, что NO-синтазный пуп. образования свободных радикалов участвует в нарушении метаболизма, вызванного действием глутамата, в нервных окончаниях коры головного мозга и стриатума, тогда как в нервных окончаниях гиппокампа его вклад менее выражен.

4. Ингибитор митохондриального комплекса I ротенон в сочетании с ингибитором АТФ синтазы олигомицином усугубляют токсическое действие глутамата на активность Ыа+,К+-АТФазы и содержание МДА в синаптосомах коры головного мозга. Более того, эти соединения сами вызывают нарушения метаболизма в синаптосомах коры больших полушарий, стриатума и гиппокампа. Предполагается, что обнаруженный эффект ротенона и олигомицина обусловлен нарушением регуляции обмена Са + митохондриями.

5. Глобальная церебральная двухсосудистая ишемия приводит к увеличению внеклеточных концентраций глутамата, аспартата и глицина в межклеточном пространстве, тогда как последующая реперфузия снижает их концентрацию до контрольных величин. Ишемия в сочетании с реперфузией снижает активность Ка+,К+-АТФазы в коре головного мозга и стриатуме, и приводит к накоплению диеновых конъюгатов в коре головного мозга.

6. Введение ингибитора фосфолипазы А2 квинакрина перед ишемическим воздействием предотвращает снижение активности Ка+,К+-АТФазы, вызванное ишемией и реперфузией, в коре головного мозга, но не в стриатуме и гиппокампе. В то же время ингибитор циклооксигеназы индометацин предотвращает накопление диеновых конъюгатов и инактивацию Na+,K+-АТФазы в коре головного мозга, а также увеличивает активность этого фермента в стриатуме и гиппокампе при ишемии и реперфузии. Полученные данные подтверждают участие образования свободных радикалов в результате активации фосфолипазы А2 в ишемическом поражении нервных окончаний коры головного мозга, и говорят о существенных региональных различиях в механизме ишемического поражения нервной ткани.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Avrova, N.F., Zakharova, I.O., Shestak, K.I., Tyurin, V.A., Tyurina Yu.Yu., Sokolova, T.V., Lavrenova, S.M., Nosova, I.Yu. The rôle of free radical reactions in the disturbance of ionic homeostasis in synaptosomes from various brain régions caused by exposure to glutamate// Advances in gerontology. - 2001. - V. 6. - P. 2122

2. Аврова Н.Ф., Захарова И.О., Тюрин В.А., Тюрина Ю.Ю., Шестак К.И., Соколова Т.В., Лавренова С.М., Новоселова Н.Ю. Различия в механизме токсического действия глутамата на синаптосомы из разных областей мозга крыс// ХП Международное совещание и V школа по эволюционной физиологии, СПб. - 2001. - С. 6

I 1

3. Юрлова JIA., Лавренова C.M. Роль митохондрий в поражении нейронов при ишемии мозга// "Человек и его здоровье". Пятая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей, СПб. - 2002. - С. 276277

4. Аврова Н.Ф., Лавренова С.М., Тюрина Ю.Ю., Новоселова Н.Ю., Юрлова Л.А., Захарова И.О. Роль свободнорадикальных реакций в нейротоксичности глутамата// HI Съезд Биохимического Общества, СПб. - 2002

5. Avrova, N.F., Zakharova, I.O., Lavrenova, S.M., Tyurina, Yu.Yu., Yurlova, L.A., Tyurin, V.A. The role of free radical reactions in the disturbance of ionic homeostasis in the nerve terminals of various brain regions in ischemia// International symposium "Reactive oxygen and nitrogen species: diagnostic, preventive and therapeutic values", St.-Petersburg - Kizhi. - 2002. - P. 47

6. Аврова Н.Ф., Захарова И.О., Молчанова С.М., Новоселова Н.Ю. Роль свободных радикалов в нарушении ионного гомеостаза в синаптосомах из разных областей мозга крыс при действии глутамата// Успехи функциональной нейрохимии, сб. ст. - С.А. Дамбинова, А.В. Аратюнян (ред.). - СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2003, с. 318-327

7. Захарова И.О., Новоселова Н.Ю., Юрлова Л.А., Лавренова С.М., Аврова Н.Ф. Влияние глутамата и ингибиторов разных путей образования свободных радикалов на вход 45Са2+ в синаптосомы из разных областей мозга крыс// Нейрохимия - 2003. - Т. 20. - С. 183-189

8. Yurlova, L.A., Molchanova, S.M. Brain ischemia-reperfusion: arachidonate and mitochondrial pathways of neuronal injury// Summer School of Molecular Neurobiology, Warsaw, Poland. - 2003. - P. 56

9. Юрлова Л.А., Новоселова Н.Ю., Лавренова C.M. Изучение влияния глутамата на синаптосомы гиппокампа головного мозга крыс при угнетении функций митохондрий// X Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», М. - 2003. - Р. 113

10. Аврова Н.Ф., Молчанова С.М., Юрлова Л.А., Тюрина Ю.Ю., Новоселова Н.Ю., Захарова И.О. Влияние глутамата и ингибиторов разных путей образования свободных радикалов на активность Na+, К+-АТФазы и накопление продуктов перекисного окисления липидов в синаптосомах коры мозга крыс// Ж. Эвол. Биохим. Физиол. - 2004. - Т. 40. - С. 39-46

11. Молчанова С.М., Новоселова Н.Ю., Тюрина Ю.Ю., Захарова И.О., Юрлова Л.А., Аврова Н.Ф. Роль арахидоновой кислоты и ее метаболитов в поражении синаптических мембран при действии глутамата на нервные окончания из разных областей мозга крыс// Нейрохимия. - 2004. - Т. 21. - С. 100-109

12. Molchanova S., KôSbi P., Oja S.S., Saransaari P. Interstitial concentrations of amino acids during global forebrain ischemia and potassium-evoked spreading depression// Neurochem. Res. - 2004. -V. 29. -P. 1519-1527

13. Молчанова C.M., Москвин A.H., Захарова И.О., Юрлова Л.А., Носова И.Ю., Аврова Н.Ф. Влияние двухсосудистой ишемии переднего мозга и введения индометацина и квинакрина на активность Na+, К+-АТФазы в разных областях мозга крыс// Ж.. Эвол. Биохим. Физиол. - 2005. - Т. 41. - С. 33-38

Формат бумаги 60*90 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз Отпечатано в ПК «Объединение Вента» с оригинал-макета заказчика. 197198, Санкт-Петербург, Большой пр. П.С., д. 29а, тел.718-4636.

ZOQÇb

SIM

$-5731

t«

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Молчанова, Светлана Михайловна

• СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Биохимические механизмы поражения нервных клеток при ишемии.

1.1.1 Этап инициации.

1.1.2 Этап экспрессии.

1.1.3 Этап терминации.

1.2 Различия в чувствительности нейронов разных областей мозга к ишемическому воздействию.

1.2.1 Области мозга, особо чувствительные к ишемии.

1.2.2 Причины селективной гибели клеток.:.

1.3 Токсическое действие глутамата при ишемии.

1.3.1 Пути выброса глутамата при ишемии.

1.3.2 Типы глутаматныхрецепторов.

1.3.3 Эксайтотоксичность при ишемии и нейродегенеративных заболеваниях.

Ф 1.4 Образование свободных радикалов при ишемии.

1.4.1 Типы свободных радикалов.

1.4.2 Пути образования свободных радикалов при ишемии.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Модели токсического действия глутамата при ишемии.

2.1.1 Модель воздействия глутамата на нервные окончания мозга.

2.1.2 Модель глобальной ишемии переднего мозга in vivo.

2.1.3 Микродиализ при глобальной ишемии переднего мозга in vivo. 2.2 Показатели метаболических процессов в ткани мозга.

2.2.1 Определение ёнутриклеточной концентрации ионов кальция.

2.2.2 Определение активности Na+,lC-АТФазы.

2.2.3 Определение содержания малонового диальдегида.

2.2.4 Определение входа 45Са2+ в синаптосомы.

2.2.5 Определение содержания диеновых конъюгатов.

2.2.6 Определение концентрации нейромедиаторных аминокислот.

2.2.7 Определение содержания белка.

2.2.8 Определение содержания фосфора неорганического.

2.3 Анализ данных и статистическая обработка результатов.

2.3.1 Анализ данных, полученных in vitro.

2.3.2 Анализ данных, полученных in vivo.

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Роль различных путей образования свободных радикалов в токсическом действии глутамата in vitro.

3.1.1 Действие глутамата и ингибиторов реакций образования свободных радикалов на показатели метаболизма в синаптосомах коры больших полушарий.

3.1.2 Действие глутамата и ингибиторов реакций образования свободных радикалов на показатели метаболизма в синаптосомах стриатума.

3.1.3 Действие глутамата и ингибиторов реакций образования свободных радикалов на показатели метаболизма в синаптосомах гиппокампа.

3.2 роль фосфолипазного пути образования свободных радикалов в токсическом действии глутамата in vivo.

3.2.1 Действие ишемии и реперфузии на внеклеточную концентрацию нейромедиаторных аминокислот, активность Na+,fC-АТФазы и накопление диеновых конъюгатов.

3.2.2 Действие ингибиторов фосфолипазы А2 и циклооксигеназы на активность Na+, 1С-А ТФазы и накопление диеновых конъюгатов при глобальной церебральной ишемии.

ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 роль различных путей образования свободных радикалов в токсическом действии глутамата IN VITRO.

4.1.1 Участие свободных радикалов в токсическом действии глутамата.

4.1.2 Роль NO-синтазного пути образования свободных радикалов.

4.1.3 Роль фосфолипазного пути образования свободных ф радикалов.

4.1.4 Роль ксантиноксидазного пути образования свободных радикалов.

4.1.5 Роль митохондриалыюго пути образования свободных радикалов.

4.2 роль фосфолипазного пути образования свободных рдикалов в токсическом действии глутамата IN VIVO.

4.2.1 Общая характеристика модели глобальной церебральной ишемии и реперфузии.

4.2.2 Роль фосфолипазного пути образования свободных радикалов в Ф окислительном ингибировании Na+, tC-А ТФазы и накоплении диеновых конъюгатов при ишемии и реперфузии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль различных путей образования свободных радикалов в токсическом действии глутамата при ишемии переднего мозга крыс"

Актуальность проблемы. Ишемия головного мозга возникает в результате снижения мозгового кровотока при окклюзии артерий мозга или нарушениях системного кровообращения. На сегодняшний день эффективный способ лечения последствий глобальной церебральной ишемии неизвестен, поэтому изучение метаболических нарушений, происходящих в нервных клетках при ишемии головного мозга и приводящих к нарушению функции нейронов, является актуальной задачей.

При глобальной церебральной ишемии мозговой кровоток снижается в различных областях головного мозга, вызывая гибель нейронов в особо чувствительных к ишемии областях мозга, таких как кора головного мозга, стриатум и гиппокамп. Процесс гибели нейронов возможно предотвратить лишь на ранних этапах развития ишемического поражения, тогда как сама гибель клеток происходит через несколько дней после начала заболевания (Lipton, 1999, Demaerschalk, 2003). Динамика ишемического поражения нейронов в значительной мере отличается в разных областях головного мозга, что может быть обусловлено биохимическими особенностями каскада патологических реакций (Sims, Zaidan, 1995).

Недостаточное снабжение нервной ткани кислородом при снижении мозгового кровотока приводит к сокращению выработки АТФ и как следствие к нарушению активного ионного транспорта, деполяризации плазматической мембраны нейронов и выбросу во внеклеточное пространство нейротрансмиттеров, в частности глутамата (Phillis, O'Regan, 2000, Erecinska, Silver, 2001). Выброс глутамата во внеклеточное пространство, активация его рецепторов и повышение внутриклеточной концентрации свободного кальция ([Са ]i) являются ключевыми событиями каскада патобиохимических реакций, приводящих к формированию инфаркта мозга. При этом происходит стимуляция работы кальций-зависимых протеаз, фосфолипаз и эндонуклеаз, окислительная деструкция белков и ДНК, и как следствие, активация процесса клеточной гибели (Lipton, 1999). Для стойкого увеличения [Ca2+]i, необходимого для запуска каскада патобиохимических реакций при ишемии, одного входа Ca через ионотропные глутаматные рецепторы недостаточно. Активация этих рецепторов инициирует обменные процессы, которые приводят к устойчивому повышению [Са2+]; (Paschen, 2000, Limbrick et al., 2001). К числу таких процессов относят и образование свободных радикалов. Ранее считалось, что активация свободнорадикальных реакций происходит непосредственно перед гибелью нервных клеток. Однако в последнее время появились свидетельства того, что повышение образования свободных радикалов характерно и для ранних стадий ишемического поражения нейронов, усугубляя дисбаланс ионов Ca и приводя к повышению их концентрации в цитозоле (Mattson et al., 1995, Castilho et al., 1999, Pereira, Oliveira, 2000, Starkov et al., 2004). Образование свободных радикалов при ишемии происходит за счет активации ряда ферментативных реакций, в том числе катализируемых фосфолипазой А2, циклооксигеназой, NO-синтазой и ксантиноксидазой, а так же в результате работы электрон-транспортной цепи митохондрий. Различия в механизме образования свободных радикалов могут, наряду с другими факторами, определять региональные особенности ишемической гибели нейронов в наиболее чувствительных к ишемии областях головного мозга (Sims, Zaidan, 1995).

Таким образом, как свидетельствуют данные последних лет, повышенное образование свободных радикалов, происходящее в нервных клетках при действии на них токсических концентраций глутамата при ишемии, может, по-видимому, вносить вклад в нарушение гомеостаза ионов кальция. При этом в различных областях головного мозга могут преимущественно активироваться разные пути образования свободных радикалов (фосфолипазный, NO-синтазный, митохондриальный и другие), что может обуславливать особенности механизма гибели нейронов в этих областях. Это определяет актуальность изучения вклада разных путей образования свободных радикалов в нарушения метаболизма в нервных окончаниях из разных областей головного мозга при действии на них глутамата.

Синаптосомы, представляющие собой выделенные нервные окончания, содержат практически все органеллы нервных клеток, кроме ядра, и являются удобной моделью для изучения метаболических нарушений на ранних этапах токсического действия глутамата, предшествующих изменению экспрессии генов. Эта модель была выбрана для проведения исследований роли флсфлипазного, NO-синтазного, ксантиноксидазного и митохондриального путей образования свободных радикалов в нарушении ионного гомеостаза под действием глутамата в нервных окончаниях коры головного мозга, стриатума и гиппокампа. Для подтверждения полученных результатов было проведено сравнительное изучение влияния ингибиторов арахидонатного пути образования свободных радикалов на метаболические нарушения в нервной ткани коры, стриатума и гиппокампа, вызванные глобальной церебральной ишемией и реперфузией.

1. Изучение действия глутамата на [Ca2+]i? вход 45Са2+, активность Na+, К+-АТФазы и накопление конечного продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ) малонового диальдегида (МДА) в выделенных нервных окончаниях (синаптосомах) коры больших полушарий, стриатума и гиппокампа in vitro.

2. Определение влияния антиоксидантов на изменение [Ca2+]j, входа 45Са2+ в синаптосомы, активности Na+, К+-АТФазы и содержания МДА, вызванное глутаматом в синаптосомах коры головного мозга.

3. Определение влияния ингибиторов фосфолипазы Аг, циклооксигеназы, ксантиноксидазы, NO-синтазы и комплекса I электрон-транспортной цепи митохондрий на обусловленное глутаматом изменение изученных параметров в синаптосомах коры больших полушарий, стриатума и гиппокампа in vitro.

5. Изучение действия глобальной церебральной ишемии и реперфузии, а также ингибиторов фосфолипазы А2 и циклооксигеназы на активность Na+, К+-АТФазы и накопление продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов) в коре головного мозга, стриатуме и гиппокампе.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное изучение роли различных путей образования свободных радикалов (NO-синтазного, фосфолипазного, циклооксигеназного, ксантиноксидазного и митохондриального) в вызванном глутаматом нарушении метаболизма в нервных окончаниях разных областей переднего мозга. Объектами исследования были области мозга, наиболее чувствительные к ишемии - кора больших полушарий, стриатум и гиппокамп. Впервые были отмечены существенные региональные особенности механизмов нарушения метаболизма в нервных окончаниях коры головного мозга, стриатума и гиппокампа при действии токсических доз глутамата. Так, было показано большее влияние NO-синтазного пути образования свободных радикалов на нарушения метаболизма синаптосом коры мозга и стриатума, чем гиппокампа. Впервые были описаны различия во вкладе фосфолипазного пути образования свободных радикалов в нарушении метаболизма при действии глутамата и ишемическом повреждении нервной ткани различных областей переднего мозга. Показано, что этот путь образования свободных радикалов в большей степени участвует в ишемическом поражении коры головного мозга, чем стриатума.

Научно-практическое значение. Проведенное исследование вносит вклад в понимание процессов, происходящих на ранних этапах ишемии и токсического действия глутамата на клетки мозга. Полученные данные подтверждают участие свободных радикалов, образующихся в результате активации фосфолипазного, циклооксигеназного, ИО-синтазного и ксантиноксидазного путей, в нарушении метаболических процессов в выделенных нервных окончаниях под действием глутамата. Так, было показано, что ингибиторы фосфолипазы А2, циклооксигеназы, 1чЮ-синтазы и ксантиноксидазы предотвращают или значительно снижают нарушения метаболизма в выделенных нервных окончаниях коры головного мозга, вызванные глутаматом. Аналогичный эффект на изученные метаболические показатели оказывали антиоксиданты а-токоферол и супероксиддисмутаза (СОД).

В результате проведенного исследования были показаны существенные различия в механизме нарушения метаболизма нервных клеток под действием глутамата в трех особо чувствительных к ишемии областях переднего мозга: коре, стриатуме и гиппокампе. Так, было показано, что ингибитор фосфолипазного пути образования свободных радикалов предотвращает все изученные нарушения метаболизма в выделенных нервных окончаниях коры головного мозга и гиппокампа, но не стриатума. В то же время ингибитор N0-синтазного пути образования свободных радикалов снижал вызванное глутаматом увеличение [Са2+]; и инактивацию К+-АТФазы в синаптосомах коры головного мозга, но не гиппокампа. Полученные данные вносят вклад в понимание различий в развитии ишемического поражения ткани этих областей.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены в форме устных сообщений и постерных презентаций на 7 Российских и Международных конференциях и симпозиумах: "Free radicals and antioxidants in the development and functions of the central nervous system: from fetus to aging" (Санкт-Петербург, 2001); XII Международное совещание и V школа по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2001); Пятая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2002); III Съезд Биохимического Общества (Санкт-Петербург, 2002); Симпозиум "Reactive oxygen and nitrogen species: diagnostic, preventive and therapeutic values" (Санкт-Петербург - Кижи, 2002); X Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов" (Москва, 2003); Summer school of molecular neurobiology (Варшава, Польша, 2003).

Положения, выносимые на защиту. 1. Токсические концентрации глутамата вызывают увеличение [Ca ]¡, входа 45Са2+, накопление МДА и снижение активности Na+, К+-АТФазы в выделенных нервных окончаниях (синаптосомах) из разных отделов переднего мозга. Антиоксиданты а-токоферол и СОД предотвращают изменение этих параметров в синаптосомах коры головного мозга, вызванное действием глутамата.

2. Выявлены региональные особенности нарушения метаболизма при действии глутамата и ингибиторов разных путей образования свободных радикалов на синаптосомы, выделенные из различных областей переднего мозга. Показано, что фосфолипазный и МО-синтазный пути образования свободных радикалов вносят различный вклад в нарушения метаболических процессов в синаптосомах коры больших полушарий, стриатума и гиппокампа при действии на них глутамата.

3. При глобальной ишемии переднего мозга крыс во внеклеточном пространстве мозга происходит многократное увеличение содержания возбуждающих аминокислот глутамата и аспартата, а также коагониста ЫМОА рецепторов глицина.

4. Фосфолипазный путь образования свободных радикалов играет, очевидно, большую роль в токсическом эффекте глутамата при ишемии в коре больших полушарий, чем в стриатуме, что показано в опытах на синаптосомах и подтверждено при использовании модели глобальной ишемии переднего мозга.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Молчанова, Светлана Михайловна

выводы

Токсические концентрации глутамата вызывают увеличение [Са2+],-, входа Са2+, накопление МДА и снижение активности Ка+,К+-АТФазы в синаптосомах коры головного мозга и гиппокампа. Инкубация синаптосом стриатума с глутаматом также приводит к увеличению входа Са2+, накоплению МДА и снижению активности Ка+,К+-АТФазы. Антиоксиданты а-токоферол и СОД предотвращают изменение этих параметров в синаптосомах коры головного мозга, вызванное действием глутамата.

Ингибитор фосфолипазы А2 квинакрин предотвращает или снижает действие глутамата на все изученные показатели метаболизма в синаптосомах коры головного мозга и гиппокампа. В то же время в синаптосомах стриатума квинакрин не эффективен. Эти данные позволяют предполагать, что активация фосфолипазы А2, приводящая к увеличению образования свободных радикалов, играет значительно большую роль в токсическом действии глутамата на нервные окончания коры больших полушарий и гиппокампа, чем стриатума. Ингибитор циклооксигеназы индометацин предотвращает вызванную глутаматом инактивацию №+,К+-АТФазы, но не влияет на накопление МДА в синаптосомах всех изученных структур переднего мозга.

Ингибитор МО-синтазы Ь-КАМЕ в присутствии глутамата снижает [Са в нервных окончаниях коры головного мозга и стриатума. Кроме того, Ь-КАМЕ снижает накопление МДА в синаптосомах коры головного мозга и ингибирование Ка+,К+-АТФазы в синаптосомах стриатума. Однако Ь-КАМЕ не оказывает никакого эффекта на изменение изученных показателей в синаптосомах гиппокампа, вызванное глутаматом. Эти данные дают основание полагать, что МО-синтазный путь образования свободных радикалов участвует в нарушении метаболизма, вызванного действием глутамата, в нервных окончаниях коры головного мозга и стриатума, тогда как в нервных окончаниях гиппокампа его вклад менее выражен.

Ингибитор митохондриального комплекса I ротенон в сочетании с ингибитором АТФ синтазы олигомицином усугубляют токсическое действие глутамата на активность №+,К+-АТФазы и содержание МДА в синаптосомах коры головного мозга. Более того, эти соединения сами вызывают нарушения метаболизма в синаптосомах коры больших полушарий, стриатума и гиппокампа. Предполагается, что обнаруженный эффект ротенона и олигомицина обусловлен нарушением регуляции обмена Са2+ митохондриями.

Глобальная церебральная двухсосудистая ишемия приводит к увеличению внеклеточных концентраций глутамата, аспартата и глицина в межклеточном пространстве, тогда как последующая реперфузия снижает их концентрацию до контрольных величин. Ишемия в сочетании с реперфузией снижает активность №+,К+-АТФазы в коре головного мозга и стриатуме, и приводит к накоплению диеновых конъюгатов в коре головного мозга.

Введение ингибитора фосфолипазы Аг квинакрина перед ишемическим воздействием предотвращает снижение активности Ка+,К+-АТФазы, вызванное ишемией и реперфузией, в коре головного мозга, но не в стриатуме и гиппокампе. В то же время ингибитор циклооксигеназы индометацин предотвращает накопление диеновых конъюгатов и инактивацию №+,К+-АТФазы в коре головного мозга, а также увеличивает активность этого фермента в стриатуме и гиппокампе при ишемии и реперфузии. Полученные данные подтверждают участие образования свободных радикалов в результате активации фосфолипазы Аг в ишемическом поражении нервных окончаний коры головного мозга, и говорят о существенных региональных различиях в механизме ишемического поражения нервной ткани.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Высвобождение в межклеточное пространство глутамата и активация его рецепторов инициируют ишемическую гибель клеток в особо чувствительных к ишемии областях головного мозга. Несмотря на то, что гибель нервных клеток наступает в течение нескольких дней после ишемии, именно ранние метаболические реакции обуславливают селективную гибель клеток в особо чувствительных областях головного мозга. Причины селективной гибели клеток при ишемии на настоящий день неизвестны, однако предполагается, что степень повреждения нейронов в разных областях головного мозга может в значительной мере определяться различиями в механизмах образования и действия свободных радикалов в этих клетках.

В работе было проведено исследование роли различных путей образования свободных радикалов в метаболических нарушениях, вызванных токсическими концентрациями глутамата в нервных окончаниях (синаптосомах) из трех областей головного мозга. Синаптосомы имеют в своем составе практически все клеточные органеллы, кроме ядра. Воздействие глутамата на нервные окончания нейронов из разных отделов мозга может служить модельной системой, отражающей ранние этапы метаболических нарушений в нервных клетках, происходящих до изменения экспрессии генов.

Токсическое воздействие глутамата на выделенные нервные окончания было наиболее полно изучено при использовании препарата синаптосом коры головного мозга. В частности, было показано, что глутамат приводит к увеличению [Са2+], и входа Са2+, снижению активности Ыа+,К+-АТФазы и накоплению продуктов ПОЛ, а антиоксиданты а-токоферол и СОД предотвращают либо уменьшают эти нарушения метаболизма. Эти данные подтверждают участие свободных радикалов в процессе внутриклеточного накопления Са2+, который является ключевым для последующей гибели клеток при ишемии.

В ходе дальнейшей работы были изучены возможные источники свободных радикалов, участвующие в нарушении метаболизма синаптосом при действии глутамата. В частности, была изучена роль Ж)-синтазного, фосфолипазного, ксантиноксидазного и митохондриального путей образования свободных

О 4радикалов в таких нарушениях метаболизма, как повышение [Са ];, увеличение входа 45Са2+, инактивация №+,К+-АТФазы и накопление МДА. Результаты, полученные на синаптосомах коры головного мозга, сравнивали с данными, полученными на синаптосомах стриатума и гиппокампа.

Было показано, что в действии глутамата на синаптосомы участвуют все изученные пути образования свободных радикалов в цитозоле. Однако при этом были обнаружены существенные различия в механизмах образования и действия свободных радикалов в синаптосомах коры головного мозга, стриатума и гиппокампа. В частности, было показано, что ингибирование N0-синтазы предотвращало глутамат-индуцированное увеличение [Са ], и накопление МДА в синаптосомах коры головного мозга. В синаптосомах стриатума этот ингибитор также был эффективен, снижая [Са2+], и предотвращая окислительное ингибирование №+,К+-АТФазы при действии токсических концентраций глутамата. Однако ингибитор Ж)-синтазы не оказывал никакого эффекта на нарушения метаболизма синаптосом гиппокампа, вызванные глутаматом, не изменяя ни [Са2+];, ни вход 45Са2+, ни активность №+,К+-АТФазы, ни содержание МДА. Можно предположить, что в коре головного мозга и стриатуме активация этого пути образования свободных радикалов участвует в инициированном глутаматом устойчивом

04- л I повышении [Са ];, действуя главным образом на высвобождение Са из внутриклеточных депо, и в меньшей степени изменяя вход Са2+ извне. В гиппокампе >Ю-синтазный путь образования свободных радикалов, скорее всего, играет незначительную роль или не участвует на ранних этапах развития эксайтотоксичности.

Ингибитор фосфолипазы А2 квинакрин предотвращал глутамат-зависимое ингибирование №+,К+-АТФазы, инициацию ПОЛ и увеличение входа 45Са2+ в синаптосомах коры головного мозга и гиппокампа. Однако применение этого ингибитора было неэффективно в синаптосомах стриатума, так как он не изменял ни один из изученных показателей обмена. Следует отметить, что при активации фосфолипазы А2 активные формы кислорода образуются в результате неферментативного свободнорадикального окисления арахидоната и других свободных полиеновых жирных кислот, а также ферментативного окисления арахидоната, катализируемого циклооксигеназами и липоксигеназами. В этой работе мы проверили влияние ингибиторов циклооксигеназы, и, соответственно, одного из этих путей метаболизма арахидоната, на глутамат-индуцированное нарушение метаболизма синаптосом. Оказалось, что индометацин при действии глутамата предотвращал снижение активности Ыа+,К+-АТФазы, но не накопление МДА во всех изученных областях головного мозга. В связи с тем, что в синаптосомах коры головного мозга и гиппокампа эффект квинакрина наблюдался на все изученные показатели обмена, эти данные позволяют предполагать, что, хотя циклооксигеназа вносит свой вклад в образование свободных радикалов в этих структурах мозга при действии глутамата, другие пути (липоксигеназный и неферментативный) также активируются. В синаптосомах стриатума в отличие от квинакрина, не влиявшего на изученные показатели метаболизма, индометацин предотвращал вызванное глутаматом ингибирование №+,К+-АТФазы, но не влиял на накопление МДА. По-видимому, фосфолипазный путь образования свободных радикалов в меньшей мере участвует в реализации токсических эффектов глутамата в стриатуме, хотя циклооксигеназа, возможно, вносит определенный вклад в нарушение метаболизма в этих условиях.

Показано, что в синаптосомах коры головного мозга некоторый вклад в токсическое действие глутамата вносит и ксантиноксидазный путь образования свободных радикалов. Ингибирование ксантиноксидазы предотвращало инактивацию №+,К+-АТФазы в синаптосомах коры головного мозга, не влияя на накопление МДА.

Ингибирование электрон-транспортной цепи митохондрий не защищало мембраны синаптосом всех изученных областей головного мозга от действия глутамата. Очевидно, это объясняется тем, что при совместном действии ротенона и олигомицина происходит быстрое нарушение мембранного потенциала и выброс кальция из митохондрий. По-видимому, на ранних этапах воздействия глутамата на нервные клетки при ишемических и других поражениях головного мозга превалирует роль митохондрий в качестве депо ионов кальция, что позволяет предотвращать активацию свободнорадикальных реакций в цитозоле. Токсический эффект митохондрий, выраженный в генерации свободных радикалов компонентами электрон-транспортной цепи, видимо, преобладает на более поздних стадиях ишемического воздействия.

Данные о роли реакций образования свободных радикалов в повреждающем действии глутамата, полученные на синаптосомах, были потверждены in vivo при использовании модели глобальной церебральной ишемии. При использовании метода микродиализа было показано, что при ишемии внеклеточные концентрации глутамата увеличивались в семь раз, снижаясь до базального уровня в течение реперфузии. Кроме того, увеличивались внеклеточные концентрации возбуждающей аминокислоты аспартата и коагониста NMDA рецепторов глицина. Хотя концентрация возбуждающих аминокислот падала при начале реперфузии, метаболические нарушения в разных отделах мозга (ингибирование №+,К+-АТФазы и накопление продуктов ПОЛ) были более выражены после часа реперфузии. Эффект ингибиторов реакций образования свободных радикалов также наблюдался на стадии реперфузии. Эти данные подтверждают представления о том, что генерация свободных радикалов при ишемии активируется при возобновлении снабжения ткани кислородом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Молчанова, Светлана Михайловна, Санкт-Петербург

1. Болдырев A.A., Булыгина Е.Р., Волынская Е.А., Курелла Е.Г., Тюлина О.В. Действие перекиси водорода и гипохлорита на активность Na,K-АТФазымозга//Биохимия.- 1995.-Т. 60.-№. 10.-С. 1688-1696

2. Булыгина Е.Р., Ляпина Л.Ю., Болдырев A.A. Активация глутаматных рецепторов ингибирует Na/K-АТФазу гранулярных клеток мозжечка// Биохимия. 2002. - Т. 67. - С. 1209-1214

3. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972

4. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. М.: Медицина, 2001.-328 с.

5. Захарова И.О., Новоселова Н.Ю., Юрлова Л.А., Лавренова С.М., Аврова Н.Ф. Влияние глутамата и ингибитоов разных путей образования свободных радикалов на вход 45Са2+ в синаптосомы из разных областей мозга крыс//Нейрохимия. -2003. Т. 20. -№ 3. - С. 183-189

6. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б. Окслительный стресс. Биохимический и патофизиологический аспекты. М.: МАИК «Наука/Интерпериодика», 2001. 343 с.

7. Лукьянова Л.Д. Биоэнергетическая гипоксия: понятие, механизмы и способы коррекции// Бюлл. Экспер. Биол. Мед. 1997. - Т. 9. - С. 244-254

8. Маслова М.Н. Биохимические и функциональные изменения в мозгу животных при возбуждении// Труды IV всесоюзной конференции по биохимии нервной системы. Тарту, 1969. - С. 625-633

9. Самойлов М.О. Мозг и адаптация. Молекулярно-клеточные механизмы. -СПб.: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, 1999. 272 с.

10. Самойлов М.О. Реакции нейронов мозга на гипоксию. JL: Наука, 1985. -190 с.

11. Akdemir Н., A§ik Z., Pa§aoglu Н., Karaku?uk I., Oktem I.S., Ко? R.K. The effect of allopurinol on focal cerebral ischaemia: an experimental study in rabbits// Neurosurg. Rev. 2001. - V. 24. - N. 2-3. - P. 131 -135

12. Almeida A., Bolanos J.P., Medina J.M. Nitric oxide mediates glutamate-induced mitochondrial depolarization in rat cortical neurons// Brain Res. -1999. V. 816. -N. 2. - P. 580-586

13. Araki Т., Kato H., Kogure K. Selective neuronal vulnerability following transient cerebral ischemia in the gerbil: distribution and time course// Acta Neurol. Scand. 1989. - V. 80. - N. 6. - P. 548-553

14. Arundine M., Tymianski M. Molecular mechanisms of glutamate-dependent neurodegeneration in ischemia and traumatic brain injury// Cell. Mol. Life Sci. -2004.-V. 61.-P. 657-668

15. Atlante A., Calissano P., Bobba A., Giannattasio S., Marra E., Passarella S. Glutamate neurotoxicity, oxidative stress and mitochondria// FEBS Lett. -2001.-V. 497. P. 1-5

16. Avshalumov M.V., Rice M.E. NMDA receptor activation mediates hydrogen peroxide-induced pathophysiology in rat hippocampal slices// J. Neurophysiol. 2002. - V. 87. - P. 2896-2903

17. Basic Neurochemistry, Molecular, Cellular, and Medical Aspects 6th ed./ G.J. Siegal, B.W. Agranoff, R.W. Albers, S.K. Fisher, M.D. Uhler, editors. -Philadelphia: Lippincott, Williams and Wilkins, 1999.

18. Battelli M.G., Buonamici L., Abbondanza A., Virgili M., Contestabile A., Stripe F. Excitotoxic increase of xanthine dehydrogenase and xanthine oxidase in the rat olfactory cortex// Brain Res. Dev. Brain Res. 1995. - V. 86. - N. 1-2.-P. 340-344

19. Battelli M.G., Buonamici L., Virgili M., Abbondanza A., Contestabile A. Sinulated ischemia-reperfusion conditions increase xanthine dehydrogenase and oxidase activities in rat brain slices// Neurochem. Int. 1998. - V. 32. - N. 1. -P. 17-21

20. Betz A.L. Identification of hypoxanthine transport and xanthine oxidase activity in brain capillaries// J. Neurochem. 1985. - V. 44. - N. 2. - P. 574-579

21. Bolanos J.P., Almeida A. Roles of nitric oxide in brain hypoxia-ischemia// Biochim. Biophys. Acta. 1999. -V. 1411. -N. 2-3. - P. 415-436

22. Bonventre J.V. Roles of phospholipases A2 in brain cell and tissue injury associated with ischemia and excitotoxicity// J. Lipid Mediators Cell Signalling. 1997. -V. 16.-P. 199-208

23. Brocard J.B., Tasseto M. Reynolds I.J. Quantitative evaluation of mitochondrial calcium content in rat cortical neurons following a glutamate stimulus// J. Physiol. 2001. - V. 531. - Pt. 3. - P. 793-805

24. Brown G.C. Nitric oxide and mitochondrial respiration// Biochim. Biophys. Acta. 1999. - V. 1411. - N. 2-3. - P. 351-369

25. Candelario-Jalil E., Mhadu N.H., Al-Dalain S.M., Martínez G., León O.S. Time course of oxidatiove damage in different brain regions following transient cerebral ischemia in gerbils// Neurosci. Res. 2001. - V. 41. - P. 233-241

26. Cardozo-Pelaez F., Brooks PJ., Stedeford T., Song S., Sanchez-Ramos J. DNA damage, repair, and antioxidant systems in brain regions: a correlative study// Free Rad. Biol. Med. 2000. - V. 28. - N. 5. - P. 779-785

27. Castilho R.F., Ward M.W., Nicholls D.G. Oxidative stress, mitochondrial function, and acute glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells// J. Neurochem. 1999. - V. 72. - P. 1394-1401

28. Chan P.H., Kawase M., Murakami K. Overexpression of SOD1 in transgenic rats protects vulnerable neurons against ischemic damage after global cerebral ischemia and reperfusion// J. Neurosci. 1998. - V. 18. - P. 8292-8299

29. Chang Y.S., Park W.S., Lee M., Kim K.S., Shin S.M., Choi J.H. Effect of hyperglycemia on brain cell membrane function and energy metabolism during hypoxia-ischemia in newborn piglet// Brain Res. 1998. - V. 798. - N. 1-2. -P. 271-280

30. Chen Q., Harris C., Brown C.S., Howe A, Surmeier D.J., Reiner A. Glutamate-mediated excitotoxic death of cultured striatal neurons is mediated by non-NMDA receptors// Experimental Neurology. 1995. - V. 136. - P. 212-224

31. Choi D.W. and Rothman S.M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death//Ann. Rev. Neurosci. 1990. -V. 13. - P. 171-182

32. Choi D.W. Calcium-mediated neurotoxicity: relationship to specific channel types and role in ischemic damage// Trends Neurosci. 1988. - V. 11. - N. 10. -P. 465-469

33. Choi D.W. Excitotoxic cell death// J. Neurobiol. 1992. - V. 23. - P. 12611276

34. Choi D.W. Ionic dependence of glutamate neurotoxicity// J. Neurosci. 1987. -V. 7.-N. 2.-P. 369-379

35. Cotman C.W., Monaghan D.T., Ottersen O.P., Storm-Mathisen J. Anatomical organization of excitatory amino acid receptors and their pathways// Trends Neurosci. 1987. - V. 10. - P. 273-280

36. Crain B.J., Westerkam W.D., Harrison A.H., Nadler J.V. Selective neuronal death after transient forebrain ischemia in the Mongolian gerbil: a silver impregnation study// Neuroscience. 1988. - V. 27. - N. 2. - P. 387-402

37. Cummings B.S., McHowat J., Schnellmann R.G. Phospholipase A2s in cell injury and death// J. Pharmacol. Exp. Ther. 2000. - V. 294. - N 3. - P. 793799

38. Curtin J.F., Donovan M., Cotter T.G. Regulation and measurement of oxidative stress in apoptosis// J. Immunol. Meth. 2002. - V. 265. - P. 49-72

39. Dawson V.L., Dawson T.M., Bartley D.A., Uhl G.R., Snyder S.H. Mechanisms of nitric oxide-mediated neurotoxicity in primary brain cultures// J. Neurosci. -1993.-V. 13.-N. 6.-P. 2651-2661

40. Dawson V.L., Dawson T.M., London E.D., Bredt D.S., Snyder S.H. Nitric oxide mediates glutamate neurotoxicity in primary cortical cultures// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. -V. 88. - P. 6368-6371

41. Demaerschalk B.M. Diagnosis and management of stroke (brain attack)// Semin Neurol. 2003. - V. 23. - N. 3. - P. 241 -252

42. Denninger J.W., Marietta M.A. Guanylate cyclase and the NO/cGMP signaling pathway// Biochim. Biophys. Acta. 1999. - V. 1411. - P. 334-350

43. Dirnagi U., Thoren P., Villringer A., Sixt G., Them A., Einhaupl K.M. Global forebrain ischemia in the rat: controlled reduction of cerebral blood flow by hypobaric hypotension and two-vessel occlusion//Neurol. Res. 1993. - V. 15. -N. 2.-P. 128-130

44. Doble A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy// Pharmacol. Ther. 1999. - V. 81. - N. 3. - P. 163-221

45. Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function// Physiol. Rev. 2002. - V. 82. - P. 47-95

46. Duan M., Li X.J., Wag G., Fu S. Factors involved in the neuronal death during postischemic reperfiision: experimental study in rabbits// J. Clin. Med. J. (Engl).-1999.-V. 112. -N. 2. -P. 153-156

47. Duchen M.R. Mitochondria and calcium: from cell signalling to cell death// J. Phys. 2000. - V. 529. - N. 1. - P. 57-68

48. Dugan L.L., Choi D.W. Excitotoxicity, free radicals, and cell membrane changes// Ann. Neurol. 1994. - V. 35. - P. S7-S21

49. Dunah A.W., Standaert D.G. Subcellular segregation of distinct heteromeric NMDA glutamate receptors in the striatum// J. Neurochem. 2003. - V. 85. -N. 4.-P. 935-943

50. Dykens J.A., Stern A., Trenkner E. Mechanism of kainic toxicity to cerebellar neurons in vitro is analogous to reperfusion brain injury// J. Neurochem. -1987.-V. 49.-N.4.-P. 1222-1228

51. East S.J., Parry-Jones A., Brotchie J.M. Ionotropic glutamate receptors and nitric oxide synthesis in the rat striatum// Neuroreport. 1996. - V. 8. - N. 1. -P. 71-75

52. Engerson T.D., McKelvey T.G., Rhyne D.B., Boggio E.B., Snyder S.J., Jones H.P. Conversion of xanthine dehydrogenase to oxidase in ischemic rat tissues// J. Clin. Invest. 1987. - V. 79. - N. 6. - P. 1564-1570

53. Ereciriska M., Silver I.A. Relationship between ions and energy metabolism: cerebral calcium movements during ischemia and subsequent recovery// Can. J. Physiol. Pharmacol. 1992. - V. 70. - P. S190-S193

54. Ereciriska M., Silver I.A. Tissue oxygen tension and brain sensitivity to hypoxia// Respir. Physiol. 2001. - V. 128. -N. 3. - P. 263-276

55. Facchinetti F., Virgili M., Contestabile A., Barnabei O. Antagonists of the NMDA receptor and allopurionl protect the plfactory cortex but not the striatum after intra-cerebral injection of kainic acid// Brain Res. 1992. - V. 585. - N. 1-2.-P. 330-334

56. Ferencik M., Novak M., Rovensky J., Rybar I. Alzheimer's disease, inflammation and non-steroidal anti-inflammatory drugs// Bratisl. Lek. Listy. -2001.-V. 102.-N. 3.-P. 123-132

57. Fifkova E., Marsall J., 1967. Stereotaxic atlases for the cat, rabbit and rat. Elecrophysiological methods in biological research. Eds J. Bures, M. Petran, J. Zahar. - Prague: Academia, 1967

58. Fiske C.H., Subbaraw Y. The colorimetric determination of phosphorus// J. Biol. Chem. 1925. - V. 66. - P. 375-400

59. Francis A., Pulsinelli W. The response of GABAergic and cholinergic neurons to transient cerebral ischemia// Brain Res. 1982. - V. 243. - P. 271-278

60. Frantseva M.V., Carlen P.L., Velazquez J.L.P. Dynamics of intracellular calcium and free radical production during ischemia in pyramidal neurons// Free Rad. Biol. Med.-2001.-V. 31.-N. 10.-P. 1216-1227

61. Furukawa H., Takahashi M., Nakajima M., Yamada T. Prospects of the therapeutic approach to Creutzfeldt-Jakob disease: a clinical trial of antimalarial, quinacrine// Nippon Rinsho. 2002. - V. 60. - N. 8. - P. 16491657

62. Garcia J.H., Lassen N.A., Weiller C., Sperling B., Nakagawara J. Ischemic stroke and incomplete infarction// Stroke. 1996. - V. 27. - N. 4. - P. 761-765

63. Golde S., Chandran S., Brown G.C., Compston A. Different pathways for iNOS-mediated toxicity in vitro dependent on neuronal maturation and NMDA receptor expression// J. Neurochem. 2002. - V. 82. - P. 269-282

64. Greenlund L.G.S., Deckworth T.L., Johnson Jr. E.M. Superoxide dismutase delays neuronal apoptosis: a role for reactive oxygen species in programmed neuronal death//Neuron. 1995. - V. 14. - P. 303-315

65. Griffiths C., Garthwaite G., Goodwin D.A., Garthwaite J. Dynamics of nitric oxide during simulated ischaemia-reperfusion in rat stratal slices measured using an intrinsic biosensor, soluble guanylyl cyclase// Eur. J. Neurosci. 2002. -V. 15.-P. 962-968

66. Grynkiewicz G., Poenie M., Tsien R.Y. A novel generation of Ca indicators with greatly improved fluorescent properties// J. Biol. Chem. 1985. - V. 260. - P. 3440-3450

67. Hajomohammaadreza I., Probert A.W., Cougenhour L.L. A specific inhibitor of calcium/calmodulin-dependent protein kinase-II provides neuroprotection against NMDA- and hypoxia/hypoglycemia-induced cell death// J. Neurosci. -1995. -V. 15.-P. 4093-1101

68. Hajos F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity// Brain Res. 1975. - V.93. - P.485-489

69. Hara H., Kato H., Kogure K. Protective effect of a-tocopherol on ischemic neuronal damage in the gerbil hippocampus// Brain Res. 1990. - V. 510. - P. 335-338

70. Hara H., Onodera H., Yoshidomi M., Matsuda Y., Kogure K. Staurosporine, a novel protein kinase C inhibitor, prevents postischemic neuronal damage in the gerbil and rat// J. Cereb. Blood Flow Metab. 1990a. - V. 10. - P. 646-653

71. Hartley D.M., Kurth M.C., Bjerkness L., Weiss J.H., Choi D.W. Glutamate receptor-induced 45Ca2+ accumulation in cortical cell culture correlates with subsequent neuronal degeneration// J. Neurosci. 1993. - V. 13. - N. 5. - P. 1993-2000

72. Hayashi T., Saito A., Okuno S., Ferrand-Drake M, Dodd RL, Chan PH. Damage to the endoplasmic reticulum and activation of apoptotic machinery by oxidative stress in ischemic neurons// J. Cereb. Blood Flow Metab. 2005. - V. 25.-N. 1. -P. 41-53

73. Hillered 1., Chan P.H. Role of arachidonic acid and other free fatty acids in mitochondrial dysfunction in brain ischemia// J. Neurosci. Res. 1988. - V. 20. -N4.-P. 451-456

74. Homi H.M., Freitas J.J.S., Curi R., Velasco I.T., Junior B.A.S. Changes in superoxide dismutase and catalase activities of rat brain regions during early global transient ischemia/reperfusion// Neurosci. Lett. 2002. - V. 333. - P. 37-40

75. Horakova L., Stole S., Chromikova Z., Pekarova A., Derkova L. Mechanisms of hippocampal reoxygenation injury// Mol. Chem. Neuropathol. 1998. - V. 33.-N.3.-P. 223-236

76. Hsu M., Buzsaki, G. Vulnerability of mossy fiber targets in the rat hippocampus to forebrain ischemia// J. Neurosci. 1993. - V. 13. -N. 9. - P. 3964-3979

77. Huang W.H., Wang Y., Askari A. (Na+,K+)-ATPase: inactivation and degradation induced by oxygen radicals// Int. J. Biochem. 1992. - V. 24. - N. 4.-P. 621-626

78. Hughes M.N. Relationships between nitric oxide, nitroxyl ion, nitrosonium cation and peroxynitrite// Biochim. Biophys. Acta. 1999. - V. 1411. - P. 263272

79. Iravani M.M. Liu L., Rose S., Jenner P. Role of inducible nitric oxide synthase in TV-methyl-D-aspartic acid-induced strio-nigral degeneration// Brain Res. -2004.-V. 1029.-P. 103-113

80. Jiang M.H., Kaku T., Hada J., Hayashi Y. Different effects of eNOS and nNOS inhibition on transient forebrain ischemia// Brain Res. 2002. - V. 946. - P. 139-147

81. Katchanov J., Waeber C., Gertz K., Gietz A., Winter B., Bruck W., Dirnagl U., Veh R.W., Endres M. Selective neuronal vulnerability following mild focal brain ischemia in the mouse// Brain Pathol. 2003. - V. 13. - N. 14. - P. 452464

82. Kaufmann W.E., Andreasson K.I., Isakson P.C., Worley P.F. Cyclooxigenases and the central nervous system// Prostaglandins. 1997. - V. 54. - P. 601-624

83. Keynes R.G., Duport S., Garthwaite J. Hippocampal neurons in organotypic slice culture are highly resistant to damage by endogenous and exogenous nitric oxide//Eur. J.Neurosci. -2004.- V. 19.-N. 5.-P. 1163-1173

84. Khodorov B., Pinelis V., Storozhevykh T., Yuravichus A., Khaspekhov L.i

85. Blockade of mitochondrial Ca uptake by mitochondrial inhibitors amplifies the glutamate-induced calcium response in cultured cerebellar granule cells// FEBS Lett. 1999. - V. 458. - P. 162-166

86. Kiedrowski L. N-methyl-D-aspartate excitotoxicity: relationships among plasma membrane potential, Na+/Ca2+ exchange, mitochondrial Ca2+ overload, and cytoplasmic concentrations of Ca2+, U1", and K+// Mol. Pharmacol. 1999. -V. 56.-N.3.-P. 619-632

87. Kimura S., Katayama Y., Terashi A. Effect of indomethacin on delayed death of hippocampal CA1 sector in gerbil under different levels of controlled cranial temperatures// Nippon Ika Daigaku Zasshi. 1992. - V. 59. - N. 4. - P. 335343

88. Kimura S., Katayama Y., Terashi A. Effect of indomethacin on delayed death of hippocampal CA1 sector in gerbil under different levels of controlled cranial temperatures// Nippon Ika Daigaku Zasshi. 1992. - V. 59. - N. 4. - P. 335343

89. Kindy M. S. Inhibition of tyrosine phosphorylation prevents delayed neuronal death following cerebral ischemia// J. Cereb. Blood Flow Metab. 1993. - V. 13.-P. 372-377

90. Kinuta Y., Kimura M., Itokawa Y., Ishikawa M., Kikuchi H. Changes on xanthine oxidase in ischemic rat brain// J. Neurosurg. 1989. - V. 71. -N. 3. -P. 417-420

91. Kolko M., Rodriguez de Turco E.B., Diemer N.H., Bazan N.G. Neuronal damage by secretory phospholipase A2, platelet-activating factor, and cyclooxygenase-2 in neuronal cells in culture// Neurosci. Lett. 2003. - V. 338. -P. 164-168

92. Kondo F., Kondo Y., Makino H., Ogawa N. Delayed neuronal death in hippocampal CA1 pyramidal neurons after forebrain ischemia in hyperglycemic gerbils: amelioration by indomethacin// Brain Res. 2000. - V. 853. - P. 93-98

93. Kondo F., Kondo Y., Makino H., Ogawa N. Delayed neuronal death in hippocampal CA1 pyramidal neurons after forebrain ischemia in hyperglycemic gerbils: amelioration by indomethacin// Brain Res. 2000. - V. 853. - P. 93-98

94. Kristian T. Metabolic stages, mitochondria and calcium in hypoxic/ischemic brain damage// Cell Calcium. 2004. - V. 36. - P. 221-233

95. Kristian T., Siesjo B.K. Calcium in ischemic cell death// Stroke. 1998. - V. 29. -P. 705-718

96. Kukreja R.C., Kontos H.A., Hess M.L., Ellis E.F. PGH synthase and lipoxygenase generate superoxide in the presence of NADH or NADPH// Circ. Res. 1986. - V. 59 - N 6. - P. 612-619

97. Kumar U. Characterization of striatal cultures with the effect of QUIN and NMD A// Neurosci. Res. 2004. - V. 49. - P. 29-38

98. Lancelot E., Revaud M.-L., Boulu R.G., Plotkine M., Callebert J. A microdialysis study investigating the mechanisms of hydroxyl radical formation in rat striatum exposed to glutamate// Brain Res. 1998. - V. 809. - P. 294-296

99. Lee K., Frank S., Vanderklish P., Arai A., Lynch G. Inhibition of proteolysis protects hyppocampal neurons from ischemia// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1991.-V. 88.-P. 7233-7237

100. Leon A., Facci L., Toffano G., Sonnino S., Tettamanti G. Activation of Na+,K+-ATPase by nanomolar concentrations of GM1 ganglioside// J.Neurochem. -1981.-V. 37.-P. 350-357

101. Lerea L.S., Carlson N.G., Simonato M., Morrow J., Roberts J.L., McNamara J.O. Prostaglandin F2alpha is required for NMDA receptor-mediated induction of c-fos mRNA in dentate gyrus neurons// J. Neurosci. 1997. - V. 17. - P. 117-124

102. Lerma J. Roles and rules of kainate receptors in synaptic transmission// Nature Rev. Neurosci. 2003. - V. 4. - P. 481-495

103. Limbrick D.D. Jr., Pal S., DeLorenzo R.J. Hippocampal neurons exhibit both persistent Ca2+ influx and impairment of Ca2+ sequestration/extrusion mechanisms following excitotoxic glutamate exposure// Brain Res. 2001. — V. 894.-N. l.-P. 56-67

104. Lin C.S., Polsky K., Nalder J.V., Crain BJ. Selective neocortical and thalamic cell death in the gerbil after transient ischemia// Neuroscience. 1990. - V. 35. -N. 2.-P. 289-299

105. Lipton P. Ischemic cell death in brain neurons// Physiol. Rev. 1999. - V. 79. -N. 4.-P. 1431-1568

106. Lu C., Chan S.L., Haughey N., Lee W.T., Mattson M.P. selective and biphasic effect of the membrane lipid peroxidation product 4-hydroxy-2,3-nonenal on N-methyl-D-aspartate channels// J. Neurochem. 2001. - V. 78. - N. 3. - P. 577589

107. Lucas D.R., Newhouse J.P. The toxic effect of sodium L-glutamate on the inner layers of the retina// Arch. Pharmacol. 1957. - V. 58. - P. 193-201

108. Maciel E.N., Vercesi A.E., Castilho R.F. Oxidateve stress in Ca2+-induced membrane permeability transition in brain mitochondria// J. Neurochem. -2001.-V. 79.-P. 1237-1245

109. Maiese K., Boniece I.R., Skurat K., Wagner J.A. Protein kinases modulate the sensitivity of hippocampal neurons to nitric oxide toxicity and anoxia// J. Neurosci. Res. 993. - V. 36. - P. 77-87

110. Maragos W.F., Rockich K.T., Dean J.J., Young K.L. Pre- or post-treatment with the mitochondrial uncoupler 2,4-dinitrophenol attenuates striatal quinolinate lesions// Brain Res. 2003. - V. 966. - P. 312-316

111. Marcaida G., Kosenko E., Minana M.D., Grisolia S., Felipo V. Glutamate induces a calcineurin-mediated dephosphorylation of Na+,K+-ATPase thatresults in its activation in cerebellar neurons in culture// J. Neurochem. 1996. -V. 66. N. l.-P. 99-104

112. Mark R.J., Hensley K., Butterfield D.A., Mattson M.P. Amyloid (3-peptide impairs ion-motive ATP-ase activities, evidence for a role in loss of neuronal Ca2+ homeostasis and cell death// J. Neurosci. 1995. - V. 15. - P. 6239-6249

113. Markwell M.A.H., Haos S.M., Bielber L.L., Tolbert N.E. A modification of Lowry procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples// Analyt. Biochem. 1978. - V. 87. - P. 206-210

114. Matejovicova M., Machac S., Lehotsky J., Jakus J., Mazesova V. Synaptosomal Na,K-ATPase activity during forebrain ischemia in Mongolian gerbils // Chem. Neuropathol. 1996. - 29. -N. 1. - P. 67-78

115. Matsui T., Nagafuji T., Kumanishi T., Asano T. Role of nitric oxide in pathogenesis underlying ischemic cerebral damage// Cell. Mol. Neurobiol. -1999.-V. 19.-N. l.-P. 177-189

116. Matsuyama T., Michishita H., Nakamura H. Induction of copper-zink dismutase in gerbil hippocampus after ischemia// J. Cereb. Blood Flow Metab. 1993. -V. 13.-P. 135-144

117. Meneshian A., Bulkley G.B. The physiology of endothelial xanthine oxidase: from urate catabolism to reperfusion injury to inflammatory signal transduction// Microcirculation. 2002. - V. 9. -N. 3. - P. 161-175

118. Molloy G.Y., Rattray M., Williams R.J. Genes encoding multiple forms of phospholipase A2 are expressed in rat brain// Neurosci. Lett. 1998. - V. 258. -P. 139-142

119. Murphy MP. Nitric oxide and cell death// Biochim. Biophys. Acta. 1999. - V. 1411.-P. 401-414

120. Nakayama M., Uchimura K., Zhu R.L. Cyclooxygenase-2 inhibition prevents delayed death of CA1 hippocampal neurons following global ischemia// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. -V. 95. - P. 10954-10959

121. Nelson R.M., Lambert D.G., Richard Green A., Hainsworth A.H. Pharmacology of ischemia-induced glutamate efflux from rat cerebral cortex in vitro//Brain Res.-2003.-V. 964.-N. l.-P. 1-8 .

122. Nogawa S., Zhang F., Ross M.E., Iadecola C. Cyclo-oxygenase-2 gene expression in neurons contributes to ischemic brain damage// J. Neurosci. -1997. -V. 17.-P. 2746-2755

123. O'Regan M.H., Song D., VanderHeide S.J., Phillis J.W. Free radicals and the ischemia-evoked extracellular accumulation of amino acids in rat cerebral cortex//Neurochem. Res. 1997. -V. 22. -N. 3. - P. 273-280

124. Olney J.W.E., McGeer J.W., Oiney P. Neurotoxicity of excitatory aminoacids: Kainic acid as tool in neurobiology. McGeer J.W. ed. New York 1978 95-121

125. Ozawa S., Kamiya H., Tsuzuki K. Glutamate receptors in the mammalian central nervous system// Prog. Neurobiol. 1998. - V. 54. - P. 581-618

126. Panahian N., Yoshida T., Huang P.L., Hedley-Whyte E.T., Dalcara T. Attenuated hippocampal damage after global cerebral ischemia in mice mutant in nitricoxide synthase// Neurosci. 1996. - V. 72. -N. 2. - P. 343-354

127. Parent A., Hazrati L.-N. Functional anatomy of the basal ganglia. I. The cortico-basal ganglia-thalamo-cortical loop// Brain Res. Rev. 1995. - V. 20. -P. 91-127

128. Paschen W. Role of calcium in neuronal cell injury: which subcellular compartment is involved?// Brain Res. Bull. 2000. - V. 53. - N. 4. - P. 409413

129. Paxinos G., Watson, C. The rat brain stereotaxic coordinates. 2nd edition. -Sydney: Academic Press, 1996

130. Pellegrini-Giampietro D.E., Pulsinelli W.A., Zukin R.S. NMDA and non-NMDA receptor gene expression following global brain ischemia in rats: effect of NMDA and non-NMDA receptor antagonists// J. Neurochem. 1994. - V. 62.-N.3.-P. 1067-1073

131. Pereira C.F., Olivera C.R. Oxidative glutamate toxicity involves mitochondrial dysfunction and perturbation of intracellular Ca2+ homeostasis// Neurosci. Res. 2000. - V. 37. - N. 3. - P. 227-236

132. Petito C.K., Feldmann E., Pulsinelli W.A., Plum F. Delayed hippocampal damage in humans following cardiorespiratory arrest// Neurology. 1987. - V. 37.-P. 1281-1286

133. Phillis J.W., and Sen S. Oxypurinol attenuates hydroxyl radical production during ischemia/reperfusion injury of the rat cerebral cortex: an ESR study// Brain Res. 1993. - V. 628. - P. 309-312

134. Phillis J.W., O'Regan M.H. Characterization of modes of release of amino acids in the ischemic/reperfused rat cerebral cortex// Neurochem. Int. 2003. -V. 43.-P. 461-467

135. Phillis J.W., O'Regan M.H. The role of phospholipases, cyclooxygenases, and lipoxygenases in cerebral ischemic/traumatic injuries// Crit. Rev. Neurobiol. -2003a.-V. 15.-N. 1.-P. 61-90

136. Pilitsis J.G., Diaz F.G., O'Regan M.H., Phillis J.W. Differential effects of phospholipase inhibitors on free fatty acid efflux in rat cerebral cortex during ischemia-reperfusion injury// Brain Res. 2002. - V. 951. - P. 96-106

137. Quan N., Whiteside M., Herkenham M. Cyclooxygenase 2 mRNA expression in rat brain after peripheral injection of lipopolysaccharide// Brain Res. 1998. -V. 802.-P. 189-197

138. Randall R.D., Thayer S.A. Glutamate-induced calcium transient triggers delayed calcium overload and neurotoxicity in rat hippocampal neurons// J. Neurosci.- 1992. V. 12.-N. 5.-P. 1882-1895

139. Rego A.C. and Oliveira C.R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases// Neurochem. Res. 2003. - V. 28. - N. 10. - P. 1563-1574

140. Roberts-Lewis J.M., Savage M.J., Marcy V.R., Pinsker L.R., Siman R. Immunolocalization of calpain 1-mediated spectrin degradation to vulnerableneurons in the ischemic gerbil brain// J. Neurosci. 994. - V. 14. - P. 39343944

141. Rogers J., Kirby I.C., Hempelman S.R., Berry D.I., McGeer P.L., Kaszniak A.W., Zalinski J., Cofield M., Mansukhani L., Wilson P. et al. Clinical trial of indomethacin in Alzheimer's diseas//. Neurology. 1993. - V. 43. - N. 8. - P. 1609-1611

142. Rogers J., Kirby L.C., Hempelman S.R., Berry D.L., McGeer P.L., Kaszniak A.W., Zalinski J., Cofield M., Mansukhani L., Willson P., and Kogan F. Clinical trial of indomethacin in Alzheimer's disease// Neurology. 1993. - V. 43.-N. 8.-P. 1609-1611

143. Rothman S.M. Synaptic activity mediates death of hypoxic neurons// Science. -1983.-V. 220.-P. 536-537

144. Sancesario G., Iannone M., Morllo M., Nistico G., Bernardi G. Nitric oxide inhibiton aggrevates ischemic damage of hippocampal but not of NADPH neurons in gerbils// Stroke. 1994. - V. 25. - N. 2. - P. 436-443

145. Sanganahalli B.G., Joshi P.G., Joshi N.B. Xanthine oxidase, nitric oxide synthase and phospholipase A2 produce reactive oxygen species via mitochondria// Brain Res. 2005. - V. 1037. - P. 200-203

146. Sasaki T., Nakagomi T., Tamura A., Noguchi M., Saito I., Takakura K. Indomethacin ameliorates ischemic neuronal damage in the gerbil hippocampal CA1 sector//Stroke.- 1988.-V. 19.-N. 11.-P. 1399-1403

147. Sasaki T., Nakagomi T., Tamura A., Noguchi M., Saito I., Takakura K. Indomethacin ameliorates ischemic neuronal damage in the gerbil hippocampal CA1 sector//Stroke.- 1988.-V. 19. N. 11.-P. 1399-1403

148. Sastry P.S. and Rao K.S. Apoptosis and the nervous system// J. Neurochem. -2000.-V. 74.-P. 1-20

149. Sattler R., Charlton M.P., Hafner M., Tymianski M. Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity// J. Neurochem. 1998. -V. 71. -N. 6. - P. 2349-2364

150. Saybasili H., Yuksel M., Haklar G., Yalcin A.S. Effect of mitochondrial electron transport chain inhibitors on superoxide radical generation in rat hippocampal and striatal slices// Antioxid. Redox. Signal. 2001. - V. 3. - N.6.-P. 1099-1104

151. Schinder A.F., Olson E.C., Spitzer N.C., Montal M. Mitochondrial dysfunction is a primary event in glutamate neurotoxicity// J. Neurosci. — 1996. V. 16. -N. 19.-P. 6125-6133

152. Schmidt-Kastner R., Freund T.F. Selective vulnerability of the hippocampus in brain ischemia//Neuroscience. 1991. -V. 40. -N. 3.-P. 599-636

153. Selvam R., Subramanian L., Gayathri R., Angayarkanni N. The anti-oxidant activity of turmeric (Curcuma longa)// J. Ethnopharmacol. 1995. - V. 47. - N. 2.-P. 59-67

154. Siesjo B.K., Zhao Q., K. Pahlmark K., Siesjo P., Katsura K., Folbergrova J. Glutamate, calcium, and free radicals as mediators of ischemic brain damage// Ann. Thorac. Surg. 1995. -V. 59. - P. 1316-1320

155. Silver I.A., Ereciriska M. Oxygen and ion concentrations in normoxic and hypoxic braion cells, in: A.G. Hudetz, D.F. Brulye (Eds.), Oxygen transport to Tissue XX, New York, Plenum Press, 1998, pp. 7-15 (Adv Exp Med Biol 454)

156. Simonson S.G., Zhang J. Jr., Canada A.T., Su Y.-F., Benveniste H., Piantadosi C.A. Hydrogen peroxide production by monoamine oxidase during ischemiareperfusion in the rat brain// J. Cereb. Blood Flow Metab. 1993. - V. 13. - P. 124-134

157. Smith M.-L., Auer R.N., Siesjo B.K. The density and distribution of ischemic brain injury in the rat following 2-10 min of forebrain ischemia// Acta Neuropathol. 1984b. - V. 64. - P. 319-332

158. Smith M.L., Auer R.N., Siesjo B.K. The density and distribution of ischemic brain injury in the rat following 2-10 min of forebrain ischemia// Acta Neuropathol. (Berl.). 1984. - V. 64. - N. 4. - P. 319-332

159. Smith M.-L., Bendek G., Dahlgren N., Rosen I., Wieloch T., Siesjo B.K. Models for studying long-term recovery following forebrain ischemia in the rat. 2. A 2-vessel occlusion model// Acta Neurol. Scand. 1984a. - V. 69. - P. 385401

160. Smith-Swintosky V.L., Mattson M.P. Glutamate, P-amyloid precursor proteins and calcium-mediated neurofibrillary degeneration// J. Neural Transm. Suppl. -1994.-V. 44.-P. 29-45

161. Soehle M., Heimann A., Kempski O. Postischemic application of lipid peroxidation inhibitor U-101033E reduces neuronal damage after cerebral ischemia in rats// Stroke. 1998. - V. 29. - P. 1240-1247

162. Solenski N.J., Kwan A.-L. Attenuation of free radical generation during reversible focal cerebral ischemia with the nitric oxide inhibitor, L-NAME (L-A^-nitro-L-arginine methyl ester)// Brain Res. 2000. - V. 862. - P. 262-265

163. Starkov A.A., Chinopoulos C., Fiskum G. Mitochondrial calcium and oxidative stress as mediators of ischemic brain injury// Cell Calcium. 2004. - V. 36. -N. 3-4.-P. 257-264

164. Stuehr D.J. Mammalian nitroc oxide synthases// Biochim Biophys Acta. -1999.-V. 1411.-N. 2-3.-P. 217-230

165. Sugawara T., Fujumura M., Noshita N., Whan Kim G., Saito A., Hayashi T., Narasimhan P., Maier C.M., Chan P.H. Neuronal death/survival signaling pathways in cerebral ischemia// Neurorx. 2004. - V. 1. - P. 17-25

166. Sugimoto K., Iadecola C. Delayed effect of administration of COX-2 inhibitor in mice with acute cerebral ischemia// Brain Res. 2003. - V. 960. - P. 273276

167. Tariq M., Khan H.A., A1 Moutaeiy K., A1 Deeb S. Protective effect of quinacrine on striatal dopamine levels in 6-OHDA and MPTP models of Parkinsonism in rodents// Brain Res. Bull. 2001. - V. 54. N. 1. - P. 77-82

168. Teismann P., Ferger B. The salicylate hydroxylation assay to measure hydroxyl free radicals induced by local application of glutamate in vivo or induced by the Fenton reaction in vitro// Brain Res. Protocols. 2000. - V.5. - P. 204-210

169. Terada L.S., Willingham I.R., Rosandich M.E., Leff J.A., Kindt G.W., Repine J.E. generation of superoxide anion by brain endothelial cell xanthine oxidase// J. Cell. Physiol.-1991.-V. 148.-N. 2-P. 191-196

170. Tomimoto H., Shibata M., Ihara M., Akiguchi I., Ohtani R., Budka H. A comparative study on the expression of cyclooxygenase and 5-lipoxygenase during cerebral ischemia in humans// Acta Neuropathol. (Berl.). 2002. - V. 104.-N. 6.-P. 601-607

171. Tretter L., Adam-Visi V. Early events if free radical-mediated damage of isolated nerve terminals: effects of peroxides on membrane potential andintracellular Na and Ca concentrations// J. Neurochem. 1995. -V. 66. — P. 2057-2066

172. Tretter L., Chinopoulos Ch., Adam-Vizi V. Enhanced depolarization-evoked calcium signal and reduced ATP./[ADP] ratio are unrelated events induced by oxidative stress in synaptosomes// J. Neurochem. 1997. - V. 69. - P. 25292537

173. Tzingounis A.V., Lin C.L., Rothstein J.D., Kavanaugh M.P. Arachidonic acid activates a proton current in the rat glutamate transporter EAAT4// J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. -N 28. - P. 17315-17317

174. Vallet P., Charnay Y., Steger K., Ogier-Denis E., Kovari E., Herrmann F., Michel J.P., Szanto I. Neuronal expression of the NADPH oxidase N0X4, and its regulation in mouse experimental brain ischemia// Neuroscience. 2005. -V. 132.-N2.-P. 233-238

175. Vergun O., Sobolevsky A.I., Yelshansky M.V., Keelan J., Khodorov B.I., Duchen M.R. Exploration of the role of reactive oxygen species in glutamate neurotoxicity in rat hippocampal neurons in culture// J. Physiol. 2001. - V. 531.-N. l.-P. 147-163

176. Villa R.F., Gorini A., Hoyer S. ATPases of synaptic plasma membranes from hippocampus after ischemia and recovery during ageing// Neurochem. Res. -2002. V. 27. N. 9. - P. 861-870

177. Volterra A., Trotti D., Tromba C., Floridi S., Racagni G. Glutamate uptake inhibition by oxygen free radicals in rat cortical astrocytes// J. Neurosci. -1994.-V. 14.-N. 5.-P. 2924-2932

178. Watkins J.C., Evans R.H. Excitatory amino acid transmitters// Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1981. - V. 21. - P. 165-204

179. Weissman B.A., Kadar T., Brandeis R., Shapiro S. Ng-nitro-L-arginine enhances neuronal death following transient forebrain ischemia in gerbils// Neurosci. Lett.-1992.-V. 146.-N. 2.-P. 139-142

180. Wilde G.J., Pringle A.K., Wright P., Iannotti F. Differential vulnerability of the CA1 and CA3 subfields of the hippocampus to superoxide and hydroxy 1 radicals in vitro// J. Neurochem. 1997. - V. 69. - N. 2. - P. 883-886

181. Yang C.S., Tsai P.J., Chen W.Y., Kuo J.S. Ionotropic glutamate receptors are involved in malondialdehyde production in anesthetized rat brain cortex: a microdialysis study// Redox Rep. 2003. - V. 8. - N. 1. - P. 35-39s

182. Yates S.L., Fluhler E.N., Lippello P.M. Advances in the use of the fluorescent probe fura-2 for the estimation of intrasynaptosomal calcium// J. Neurosci. Res. 1992.-V. 32.-P. 255-260

183. Yue T.-L., Gu J.-L., Lysko P. G., Cheng H.-Y., Barone F. C., Feuerstein G. Neuroprotective effects of phenyl-t-butyl nitrone in gerbil global brain ischemia and in cultured rat cerebellar neurons// Brain Res. 1992. - V. 574. - P. 193197

184. Zhou Y., Gopalkrishnan V., Richardson J.S. Actions of neurotoxic P-amyloid on calcium homeostasis and viability of PC 12 cells are blocked by antioxidants but not by calcium channel antagonists// J. Neurochem. 1996. - V. 67. - N. 4. -P. 1419-1425

185. Zini I., Tomasi A., Grimaldi R., Vannini V., Agnati L.F. Detection of free radicals during brain ischemia and reperfiision by spin trapping and microdialysis//Neurosci. Lett. 1992. -V. 138. -P. 279-282

Информация о работе

Молчанова, Светлана Михайловна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Роль различных путей образования свободных радикалов в токсическом действии глутамата при ишемии переднего мозга крыс - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы