Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Глутаминсинтетаза мозга человека в норме и при шизофрении

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Глутаминсинтетаза мозга человека в норме и при шизофрении"

На правах рукописи

РГ6 од

Терешкина Елена Борисовна

ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗА МОЗГА ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ ШИЗОФРЕНИИ. |

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2000

Работа выполнена в Научном Центре психического здоровья РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Г.Ш. Бурбаева

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор P.M. Худоерков доктор биологических наук С.П. Сяткин

Ведущая организация: Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 22 сентября 2000 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 053.22.02 в Российском Университете дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского Университета дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан «2-)» oJyUmi^ 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор В.Э. Торбек

Актуальность проблемы. Одной из нейрохимических гипотез патогенеза шизофрении, привлекающей в последнее время внимание исследователей, является "гипоглутаматергическая гипотеза" о нарушении функционирования глутаматного нейромедиаторного пути при этом заболевании. В основу гапоглугаматергической гипотезы были положены следующие факты: фенциклидин, антагонист глутаматных ММЛА-рецепторов, способен провоцировать у добровольцев позитивные и негативные расстройства, характерные для шизофрении [На1Ьеге1асЙ,1995]; в аутопсийных образцах мозга больных шизофренией обнаружены следующие биохимические нарушения: число NMDA-peцeптopoв в лобной коре и базальных ганглиях увеличено [АкЬапап е1 а1.,19?6,01пеу й а1.,1995, НегеБсо-Ьеуу е1 'а!., 1998]; экспрессия генов переносчика глутамата -ЕААТ2, локализованного в астроцитах, и метаботропных глутаматных рецепторов 3 и 5 в лобной коре снижена; в гиппокампе снижена экспрессия генов не-ЫМБА-глутаматных рецепторов ИиШ и 01иЯ2 [ОЬпита е1 а1.,1998]; концентрация глутамата в лобной коре, гиппокампе и в спинномозговой жидкости понижена [Тяа! й а1.,1995].

Измененный метаболизм глутамата, приводящий к нарушениям глутаматной нейромедиаторной системы в мозге при шизофрении, может быть обусловлен не только нарушением процессов его захвата переносчиками и его связывания со специфическими рецепторами, но и нарушениями в функционировании ферментов, участвующих в биосинтезе и превращении глутамата. Глутамат - один из возбуждающих нейромедиаторов - высвобождается нейронами в синаптическую щель, откуда поглощается окружающими астроцитами. В астроцитах глутамат превращается под действием глутаминсинтетазы (ГС, КФ 6.3.1.2.) в глутамин. Образовавшийся глутамин может захватываться глутаматергическими нейронами, в которых под действием фосфат-активируемой глутаминазы превращается в глутамат и пополняет таким образом нейромедиаторный пул. Таким образом, ГС играет центральную роль в функционировании глутамат/глутаминового цикла в нервной системе.

ГС мозга человека практически не изучена, тем более при патологии нервной системы. В литературе имеются противоречивые данные об изменении активности и содержания ГС при болезни Альцгеймера. В то же время, авторы предполагают, что появление при болезни Альцгеймера и отсутствие в норме ГС в спинномозговой жидкости, а также измененный уровень активности ГС дают возможность считать ГС потенциальным ранним прижизненным диагностическим маркером этого заболевания [Титаш е1 а1.,1995, Оиппегееп е1 а1.,1992]. ГС при шизофрении не изучалась. В связи с гипоглутаматергической гипотезой патогенеза шизофрении изучение ГС при этом заболевании представляется актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является оценка возможного участия ГС в нарушении метаболизма глугамата при шизофрении. В задачи исследования входило:

1. Выделение ГС из ткани мозга лиц, не страдавших психическими или неврологическими заболеваниями.

2. Характеристика физико-химических свойств ГС.

3. Сравнительная оценка уровня активности ГС в экстрактах белков различных областей мозга человека в норме и при шизофрении.

4. Получение поликлональных антител к ГС мозга человека.

5. Разработка способа определения содержания ГС с использованием полученных антител.

6. Сравнительное изучение содержания ГС в мозге в норме и при шизофрении.

Научная новизна работы. В работе предложен метод выделения ГС из мозга человека, позволяющий снизить инактивацию и увеличить выход фермента по сравнению с методами, известными по данным литературы [Уататои> е1 а1., 1987, Тишал! е1 а1., 1995]. Впервые в мозге обнаружен и выделен белок, подобный ГС по ферментативной активносги и иммунореактивности, названный "белком, подобным глутаминсинтетазе" (ГСПБ). Установлено, что трансферазная активность ГС, измеряемая в экстрактах белков мозга, является суммарной активностью ГС и ГСПБ.

Охарактеризованы биохимические свойства ГС мозга человека и впервые - ГСПБ. Молекулярная масса и изоэлектрическая точка (ИЭТ) субъединиц ГС и ГСПБ различны - 44±1 кДа, ИЭТ 6,4-6,7 для ГС и 54±1 кДа, ИЭТ 5,9-6,2 для ГСПБ. Для ГС и ГСПБ определены зависимости скорости ферментативной реакции от рН, от концентраций ионов Мп2+ и определены Кщ для глутамина; изучено влияние ингибитора Ь-метионин-Б-сульфоксимина в различных концентрациях на скорость ферментативной реакции.

Установлено, что ГС мозга и печени человека имеют гомологичные участки аминокислотной последовательности. Единственный просеквенированный декапептид ГСПБ не имеет гомологии с белками, содержащимися в базе данных 8\уЬ5Рго1.

Получены поликлональные антитела к ГС и к ГСПБ мозга человека. Установлено, что эти антитела, как и моноклональные антитела к ГС (СЬеписоп, США) дают перекрестную реакцию с ГС и ГСПБ в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА). Таким образом, иммунореактавность, выявляемая в экстрактах белков мозга методом ИФА, представляет собой суммарную иммунореактавность ГС и ГСПБ. Для раздельного выявления ГС и ГСПБ предложен метод вестерн-иммуноблотгинга с хемилюминесцентным усилением сигнала. Сравнительная оценка содержания иммунореактивных ГС и ГСПБ при шизофрении и в контрольных случаях в лобной, передней и задней

J

лимбической коре и коре мозжечка проведена с использованием этого метода. При этом установлено, что при шизофрении содержание ГСПБ повышено во всех исследованных областей мозга (р<0.01). Содержание ГС при шизофрении в лобной коре понижено (р<0.01), в задней лимбической коре - не изменено, тогда как в передней лимбической коре и коре мозжечка - повышено (р<0.01).

Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые обнаружен в мозге и охарактеризован белок, обладающий способностью катализировать реакцию, сходную с реакцией, катализируемой ГС. Разработан метод выделения ГС и ГСПБ из мозга человека и охарактеризованы физико-химические свойства этих белков. Выявлено изменение содержания ГС и ГСПБ в мозге при шизофрении по сравнению с контролем. Результаты исследования могут быть использованы при изучении метаболизма одного из медиаторов нервной системы - глутамата и при изучении патогенеза шизофрении.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Впервые в мозге обнаружеп, выделен и охарактеризован белок, подобный глутаминсинтетазе по ферментативной активности и иммунореактивности - ГСПБ.

2. Разработаны методы выделения ГС и ГСПБ из мозга человека.

3. Трансферазная активность, характерная для ГС и определяемая в экстракте белков мозга человека, представляет собой суммарную активность по меньшей мере двух ферментов - ГС и ГСПБ, и ее уровень в лобной, лимбической коре и коре мозжечка не изменен при шизофрении по сравнению с нормой.

4. Предложен способ определения содержания ГС и ГСПБ в экстрактах белков мозга. В основу метода положены элекфофйрез в ПААГ с ДС-Na, вестерн-иммуноблоттинг с хемшпоминесцентным усилением сигнала, сканирование на лазерном денситометре.

5. Содержание ГСПБ в лобной, передней и задней лимбической коре и коре мозжечка повышено при шизофрении по сравнению с контролем (р<0.01). Содержание ГС при шизофрении в лобной коре понижено (р<0.01), в задней лимбической коре - не изменено, в передней лимбической коре и коре мозжечка - повышено (р<0.01).

Апробация диссертационного материала.

Результаты исследования были доложены на: 6-th World Congress of Biological Psichiatry (Nice, France, 1997); Международном Симпозиуме "Структура, стабильность и фолдинг белков" (Институт биохимии им. Баха РАН, Москва, 1998); 12-th General Meeting of the European Society for Neurochemistry (St.Peterburg, Russia, 1998); конференции "Механизмы структурной, функциональной и нейрохимической пластичности мозга" (НИИ Мозга РАНМ, Москва, 1999г.); 7-th International Congress on

Schizophrenia Research, Santa Fe, USA, 1999); 10-th Biennial Winter Workshop on Schizophrenia (Davos, Switzerland, 2000); на межлабораторной конференции НЦПЗ РАМН "Прогресс в области биологической психиатрии",' посвященной памяти М.Е.Вартаняна (2000 г), на межлабораторной конференции НЦПЗ РАМН 2000 г.

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на ¿^страницах и состоит из 6 разделов, включающих введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов и указатель литературы. Обзор литературы посвящен исследованиям одного из ферментов метаболизма глутамата - глутаминсинтетазы - в мозге в норме и при психической патологии, изложена гипоглутаматергическая гипотеза патогенеза шизофрении. Библиографический указатель состоит из -/(/£> источников отечественной и зарубежной литературы. Диссертация иллюстрирована /£рисунками и таблицами/"&Х

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы исследования.

Объектом исследования служил аутопсийный материал: мозг психически здоровых людей и больных шизофренией.

Выделение ГС и ГСПБ проводили из мозга двух человек, не страдавших при жизни психическими и неврологическими заболеваниями. В сравнительных исследованиях уровней активности и содержания ГС и ГСПБ использовали аутопсийные образцы различных структур мозга по Бродману (лобная кора - поле 10, передняя лимбическая кора - поле 24, задняя лимбическая кора - поле 23, кора мозжечка). Контрольная группа насчитывала 9 случаев, группа больных шизофренией - 8 пациентов, из них 5 случаев с непрерывнотекущей параноидной формой и 3 случая с приступообразной прогредиентной формой. Причина смерти в обеих фуппах - острая сердечно- сосудистая недостаточность, инфаркт миокарда или тромбоэмболия легочной артерии. Группы не отличались по времени, прошедшему после смерти до взятия ткани мозга. Образцы структур мозга замораживали в жидком азоте и хранили до использования при температуре -70°С.

При приготовлении экстрактов 200 мг ткани гомогенизировали в четырех объемах буфера низкой ионной силы (20 мМ трис-HCl, рН 7,0). Гомогенат центрифугировали 1 час при 60.000g.

При выделении белков применяли дифференциальное центрифугирование, осаждение белков сульфатом аммония, ионообменную хроматографию на ДЭАЭ- и КМ-целлюлозах, колоночную гель-фильтрацию низкого давления на сефарозе CL-6B, афинную хроматографию на аминогексил-сефарозе 4В.

Гомогенность белков определяли методом электрофореза в ПААГ с ДС-Na [Laemmli,1970]. Для определения изоточки субьединиц ферментов проводили двумерный электрофорез по методу O'Farrel [1975] в градиенте рН 4,5-8,5.

Выделенные ферменты хранили замороженными при -20°С в 50 мМ трис-HCl буфере, содержащем 1,4 мМ 2-меркаптоэтанол и 40% глицерин, рН 7,4.

Концентрацию белка определяли по методу Lowry [1951] и по методу Bradford [1976].

"Трансферазную" (АДФ + L-глутамин + NH2OH) и "синтетазную" (АТФ + L-глутамат + NH2OH) активность ферментов определяли по методу Iqbal [1970] с модификациями. Использовали разработанный в лаборатории нейрохимии микровариант метода - постановку . реакции в иммунологических 96-луночных планшетах. Метод основан на определении образования у-глутамилгидроксамата. Удельную активность фермента выражали в микромолях образовавшегося в ходе реакции у-глутамилгидроксамата в расчете на 1 мг белка за 1 мин. Реакционная среда для определения трансферазной активности содержала (в конечных концентрациях): 50 мМ имидазол-HCl рН 6,8, 50 мМ NH2OH, 100 мМ L-глутамин, 0,5 мМ МпСЬ, 25 мМ KH^AsQ,, 0,2 мМ АДФ, раствор фермента Реакционная среда для определения синтетазной активности содержала (в конечных концентрациях): 50 мМ имидазол-HCl рН 6,8,100 мМ NH2OH, 50 мМ L-глутамат, 20 мМ MgCk, 10 мМ АТФ, 25 мМ 2-меркаптоэтанол, раствор фермента. После инкубации 30 мин при 37°С реакцию останавливали добавлением раствора 0,37 мМ FeCl3 в 0,3 М ТХУ и 0,6 М НС1. Поглощение окрашенного комплекса у-глутамилгидроксамата с Fe+3 измеряли при 505 нм на планшетном спектрофотометре Titertek Multiscan (Финляндия). В качестве стандарта использовался раствор 1 мкМ у-глутамил гидро ксамата.

Для получения антисывороток кроликов иммунизировали очищенными препаратами ГС и ГСПБ., Титр и специфичность антисывороток определяли методами твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) и вестерн-иммуноблотгинга [Towbin, 1979]. Полученные антисыворотки использовали для сравнительной оценки содержания ГС и ГСПБ по иммунореактивности методом вестерн-иммуноблотгинга с хемилюминесцентным усилением сигнала (Amersham-Pharmacia Biotech) с засветкой фотопленки, которую сканировали на лазерном денситометре (Zeineh Biomed, USA). Достоверность различий между группами измерений определяли по непараметрическому U-тесту Вилкоксона-Манна-Уитни [Гублер, 1978].

2. Основные результаты исследования.

Выделение ГС и ГСПБ из мозга человека.

В настоящей работе предложен способ очистки ГС мозга человека, позволяющий снизить инактивацию и увеличить выход фермента по сравнению с методами, известными по данным литературы [Yamamoto et al., 1987, Tumani et al., 1995]. Активность ГС в ходе выделения определяли по трансферазной реакции. Ткань мозга гомогенизировали в четырех объемах 20 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,1, содержащего 1,4 мМ 2-меркаптоэтанол; гомогенат центрифугировали при 100 ООО g в течение 1 часа. Затем из полученного супернатанта белки осаждали сульфатом аммония в интервале насыщения 20-40%. Далее осажденные белки растворяли и диализовали против того же буфера. Затем проводили анионообменную хроматографию batch-методом на стеклянном фильтре с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 20 мМ натрий-фосфатным буфером, рН 6,0, содержащим 1,4 мМ 2-меркаптоэтанол; белки элюировали тем же буфером, при этом активность была выявлена в свободном объеме, удельная активность увеличивалась за счет связывания с ДЭАЭ-целлюлозой балластных белков. Фракции с трансферазной активностью подвергали катионообменной хроматографии на стеклянном фильтре с КМ-целлюлозой, уравновешенной 20 мМ натрий-цитрат-фосфатным буфером, рН 5,5, содержащим 1,4 мМ 2-меркаптоэтанол. ГС связывалась с КМ-целлюлозой, элюцию проводили тем же буфером со ступенчатым повышением рН с 5,5 до 7,1. Фракции с трансферазной активностью концентрировали на мембране Amicon ХМ-50 и подвергали гель-фильтрации на колонке с сефарозой CL-6B, уравновешенной 20 мМ натрий-фосфатным буфером, рН 7,0, содержащим 1,4 мМ 2-меркаптоэтанол. Активность ГС в ходе гель-фильтрации элюировапась одним пиком. Затем фракции с активностью ГС объединяли и наносили на колонку с аминогексил-сефарозой 4В, уравновешенную тем же буфером, рН 7,0; активность ГС связывалась с носителем, элюцию проводили градиентом 0-0,5 М NaCl в том же буфере. В ходе элюции обнаружено два пика с трансферазной активностью: ГС и белок, который мы назвали белком, подобным глутаминсинтетазе (ГСПБ). ГС элюировалась с аминогексил-сефарозы 4В при 0,30-0,35М NaCl, ГСПБ при более высокой ионной силе элюирующего буфера - 0,5 М NaCl.

Выход ферментов составил: 1 мг ГС (0.015% от общего количества водорастворимых белков мозга) и 5 мг ГСПБ (0.07% от общего количества водорастворимых белков мозга) из 400 г ткани мозга.

Определение молекулярной массы и изоэлектрической точки субъединиц ГС и ГСПБ.

Выделенные ГС и ГСПБ представляли собой электрофоретически гомогенные белки при электрофорезе в ПААГ с ДС-Ыа с молекулярной массой субъединиц 44±1 кДа и 54±1 кДа, соответственно, (рис. 1). Выявлена микрогетерогенность ГС и ГСПБ субьединиц по значениям изоэлектрической точки. Субъединицы ГС разделяются на 6 "субфракций" в интервале ИЭТ 6,4-6,7, субъединицы ГСПБ на 4 "субфракции" в интервале ИЭТ 5,9-6,2 (рис.2).

Рисунок 1. Электрофореграмма ГС и ГСПБ (электрофорез в 10% ПААГсДС-Ыа).

1-маркеры молекулярных масс, кДа,

2-ГС, молекулярная масса субъединицы, 44±1 кДа,

3-ГСПБ, молекулярная масса субъединицы, 54±1 кДа.

я_ 5.0 . •< х

Рисунок 2. Двумерная электрофореграмма ГС (А) и ГСПБ (В). Маркеры молекулярных масс, кДа, указаны на рисунке слева, значения ИЭТ - внизу.

Влияние различных факторов на трансфертную активность ГС иГСПБ.

ГСПБ, так же как и ГС, проявлял активность в синтетазной (АТФ + Ь-глутамат + КН2ОН в присутствии Ме2+) и трансферазной (АДФ + Ь-глутамин + МН2ОН в присутствии или Мп ) реакциях. Однако,

активность ГСПБ в синтетазной реакции существенно ниже, чем активность ГС. В трансферазной реакции в присутствии ионов скорости реакции ГС и ГСПБ соизмеримы, а в присутствии ионов Мп2+ скорость реакции ГСПБ почти в два раза выше, чем для ГС (таблица 1).

Таблица 1. Удельные активности ГС и ГСПБ в трансферазной реакции.

Концентрация ионов металлов Удельная активность, цмоль у-глутамилгидроксамата/мг белка/мин ГС ГСПБ

10.0 мММБ^ 15.50+0.01 9.50Ю.01

0.5 мМ Мп'+ 28.00+0.01 52.30±0.01

Показано, что зависимости скорости реакции от рН ГС и ГСПБ различны. В присутствии ионов Мп2+ в концентрации 0,5 мМ ГС имеет максимум скорости трансферазной реакции при рН 6,5-6,8, а ГСПБ - при РН 7,1.

Показано, что специфический ингибитор синтетазной и трансферазной активностей ГС - Ь-метионин-Б-сульфоксимин, связывающийся с активным центром фермента [Уашашо1о,1987], является также ингибитором трансферазной активности ГСПБ.

Определение частичной аминокислотной последовательности ГС и ГСПБ.

Частичное секвенирование ГС и ГСПБ проведено в Институте молекулярной биологии РАН совместно с д.б.н. Ц.А.Егоровым и сотр. Установлено, что Ы-концевые аминокислоты ГС и ГСПБ модифицированы и заблокированы для прямого секвенирования. Секвенирование трех пептидов ГС мозга человека, полученных при обработке трипсином и содержащих 13, 5 и 5 аминокислот, показало полную гомологию с ГС печени человека, тогда как единственный просеквенированный декапептид ГСПБ не был гомологичным ни одному белку в базе данных Б^^эРго^

Сходство эпитопов ГС и ГСПБ,

Антисыворотки и моноклопальные антитела к ГС и ГСПБ были тестированы методами ИФА и вестерн-иммуноблоттинга с использованием в качестве антигенов очищенных ГС и ГСПБ. При этом были использованы

антисыворотки к ГС и ГСПБ мозга человека, полученные в лаборатории нейрохимии НЦПЗ РАМН, антисыворотка к ГС мозга быка, любезно предоставленная доктором М. Tardy (Institute Mondor de Medecine Moleculaire, Creteil, Франция), моноклональные антитела к ГС мозга овцы (Chemicon, США). Результаты тестирования приведены в таблице 2.

Таблица 2. Тестирование антисывороток и антител к ГС и ГСПБ методами ИФА и иммуноблотгинга.

Антитела i Антигены-) Методы определения ИФА иммуноблоттинг (разведение антител) (разведение антител)

ГС ГСПБ ГС ГСПБ

1 1:2000 1:1000 1:12000 1:15000

2 1:2000 1:2000 1:10000» 1:20000

3 1:3000 1:1500 1:15000 Нет реакции (1:1000)

4 1:100000 1:50000 1:80000 Нет реакции (1:1000)

1-антисыворотка к ГС мозга человека

2-антисыворотка к ГСПБ мозга человека

3-антисыворотка к ГС мозга быка, (предоставлена Dr. M. Tardy, Institute Mondor de Medecine Moleculaire, Creteil, Франция)

4-моноклональные антитела к ГС мозга овцы (Chemicon, США) примечание: * при разведении 1:20000 - нет реакции

Все исследованные антисыворотки, а также моноклональные антитела к ГС реагировали в ИФА как с ГС, так и с ГСПБ. Однако, моноклональные антитела к ГС в вестерн-иммуноблотгинге распознавали только ГС. Полученная нами антисыворотка к ГСПБ мозга человека распознавала в экстракте белков мозга либо оба белка (в разведении 1:10000), либо только ГСПБ (в разведении 1:20000).

Высокая перекрестная реакция антисывороток и антител к ГС и ГСПБ указывает на сходство эпитопов этих белков. Это иммунохимическое сходство не позволяет определить относительный уровень иммунореактивности ГС и ГСПБ в одном белковом образце методом ИФА. Однако, поскольку субъединицы ГС и ГСПБ имеют разную молекулярную массу, метод электрофореза в ПААГ с ДС-Na с последущим вестерн-иммуноблоггингом дает такую возможность. Поэтому мы применили этот метод для специфического выявления в образцах экстрактов белков мозга иммунореактивности ГС - с использованием

45000

Рисунок 3. Содержание ГСПБ в лобной коре (полеЮ), передней (поле24) и задней (поле 23) лимбической коре и коре мозжечка в норме и при шизофрении.

Двумя звездочками обозначены достоверные различия - (р<0.01).

46000 -

40000 -35000 -3000025000 -20000 15000 -«ООО -5000 ■

Д &

-П~

14

89

♦

*о

■: «контроль п.10 ! А контроль п.23 | • контроль п.24 ; ♦ контроль мозжечок

□ шизофрения п. 10 А шизофрения п.23 О шизофрения п.24 О шизофрения мозжечок]

в

о

Рисунок 4. Содержание ГС в лобной коре (полеЮ), передней (поле24) и задней (поле 23) лимбической коре и коре мозжечка в норме и при шизофрении.

Двумя звездочками обозначены достоверные различия - (р<0.01).

моноклональных антител к ГС (Chemicon, США), и иммунореактивности ГСПБ - с использованием кроличьих антисывороток к ГСПБ, распознающих только ГСПБ в разведении 1:20000.

Сравнительное изучение ферментативной активности и иммунореактивности ГС и ГСПБ в различных областях мозга в норме и при шизофрении.

Проведено определение суммарной трансферазной активности ГС+ГСПБ, а также содержания (по иммунореактивности) ГС и ГСПБ в лобной, передней и задней лимбической коре и коре мозжечка в контроле и при шизофрении.

Показано, что во всех перечисленных областях мозга суммарная трансферазная активность ГС+ГСПБ при шизофрении по сравнению с контрольными случаями не изменялась.

Выявлено, что содержание ГСПБ при шизофрении достоверно повышено в лобной, передней и задней лимбической коре й коре мозжечка (р<0.01), (рис. 3). Содержание ГС в лобной коре при шизофрении снижено (р<0.01), в задней лимбической коре - не изменено, в передней лимбической коре и коре мозжечка - достоверно повышено (р<0.01) (рис.

3. Обсуждение.

В настоящей работе из мозга человека выделены и охарактеризованы по физико-химическим свойствам два фермента, обладающие активностью ГС: один из них состоит из субъединиц с молекулярной массой 44±1 кДа (ГС), а второй - белок, подобный глутаминсинтетазе, (ГСПБ) с молекулярной массой субъединйц 54±1 кДа. ГС, выделенная в настоящей работе, близка по молекулярной массе субъединиц к ГС печени человека -42 кДа [Gibbs et al., 1987], а также ГС мозга человека - 44 у .-и 43 кДа [Yamamoto et al., 1987, Tumani et al., 1995, Gunnersen et al., 1992, nkaran et al., 1997], тогда как молекулярная масса субъединиц ГСПБ - М±1 кДа -отличается от человеческой ТС, но сходна с бактериальной ГС [Kremeckova et al., 1992]. ГС и ГСПБ очищены до электрофоретически гомогенного состояния при электрофорезе в ПААГ с ДС-Na. При двумерном электрофоретическом разделении выявлена

микрогетерогенность субъединиц ГС и ГСПБ - каждый из ферментов имеет несколько белковых зон, близких по молекулярной массе, но с разными значениями ИЭТ. Возможно, что микрогетерогенность вызвана ковалентными модификациями ГС и ГСПБ с изменением зарядов остатков аминокислот. Гетерогенность по заряду может быть обусловлена фосфорилированием: ГС - субстрат для протеин-киназы С in vitro [Reiss et

al., 1996]. Возможно, ГС мозга подвергается аденилированию подобно бактериальной ГС [Kremeckova et al., 1992].

Показано, что ГСПБ, как и ГС, является металлозависимым ферментом; при этом с ионами Мп2+ максимальная скорость реакции выше, чем с ионами Mg2+. Вероятно, активные центры ГС и ГСПБ похожи, так как оба фермента катализируют in vitro сходные трансферазные реакции и ингибируются одним ингибитором - Ь-метионин-Б-сульфоксимином. Однако, вид кривых зависимости скорости реакции ГС и ГСПБ от концентраций ионов металлов различен, что указывает на различия в связывании ферментов с субстратами и ионами металлов.

По данным литературы, кроме ГС трансферазной ферментативной активностью в мозге обладает у-глу-цис-синтетаза, и этот фермент также ингибируется Ь-метионин-Б-сульфоксимином [Dolphin, 1989]. Однако, молекулярная масса субъединиц ГСПБ значительно отличается от молекулярных масс двух субъединиц у-глу-цис-синтетазы (23 и 70 кДа) [Sun et al., 1996]. Факт выявления декапептида в составе ГСПБ, не обнаруженного в базах данных, в том числе в SwissProt, указывает на то, что ГСПБ является новым, неизученным белком.

Антисыворотки и антитела к ГС и ГСПБ имеют высокую перекрестную реакцию, что указывает на сходство эпитопов ГС и ГСПБ.

Задача количественного определения содержания каждого из ферментов в экстрактах белков мозга затруднена из-за того, что трансферазная активность, определяемая в экстрактах белков мозга, является суммой активностей ГС и ГСПБ. Иммунореактивность, регистрируемая в ИФА, тоже является суммой иммунореактивностей этих двух белков из-за высокого иммунологического сходства их эпитопов. Однако, нам удалось разработать способ раздельного определения содержания ГС и ГСПБ, используя различие молекулярных масс их субъединиц, разделенных путем электрофореза в ПААГ с ДС-Na с последующим вестерн-иммуноблотшнгом с хемилюминесцентным усилением сигнала.

В работе показано изменение содержания ГС и ГСПБ в лобной коре, передней лимбической коре и коре мозжечка при шизофрении по сравнению с нормой. Содержание ГСПБ изменено также в задней лимбической коре. Выявленные изменения содержания ГС и ГСПБ в аутопсийных образцах мозга человека свидетельствуют в пользу участия ГС и ГСПБ в нарушениях метаболизма глутамата при этом заболевании.

выводы

1. В мозге обнаружен белок, по ферментативной активности и иммунореактивности подобный глутаминсинтетазе. Этот белок, названный "белком, подобным глутаминсинтетазе" - ГСГТБ, выделен и очищен до электрофоретическн гомогенного состояния из мозга человека.

2. Охарактеризованы физико-химические свойства глутаминсинтетазы и белка, подобного глутаминсинтетазе:

• Гомоолигомеры глутаминсинтетазы и ГСПБ состоят из субъедиц с молекулярными массами, соответственно, 44±1 кДа и 54+1 кДа. Выявлена микрогетерогенность субъединиц: для глутаминсинтетазы - 4 субфракции в интервале ИЭТ 6,4-6,7 и для ГСПБ - 6 субфракций в интервале ИЭТ 5,9-6,2.

• Выявлены различия зависимости ферментативной активности глутаминсинтетазы и ГСПБ от рН, концентрации ионов Mg2+ и Мп2+, концентрации субстрата (глугамина).

• Ь-метионин-5-сульфоксимин, специфический ингибитор глутаминсинтетазы, ингибирует также ферментативную реакцию ГСПБ.

3. Разработан способ раздельной оценки содержания ГС и ГСПБ в экстрактах белков мозга.

4. Показано, что содержание ГСПБ при шизофрении повышено по сравнению с контрольными случаями в лобной коре, в задней и передней лимбической коре и коре мозжечка (р<0.01). Содержание глутаминсинтетазы при шизофрении в лобной коре понижено (р<0.01), в передней лимбической коре и коре мозжечка - повышено (р<0.01), а в задней лимбической коре - не изменено.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Бокша И.С., Терешкина Е.Б., Бурбаева Г.Ш. Выделение и некоторые свойства глутаминсинтетазы из мозга человека // Биохимия.-1995.-№10,-С. 1697-1704.

2. Burbaeva G.Sh., Boksha I.S., Tereshkina E.B. Glutamine syntetase from human brain: purification, properties, possible involvement in Alzheimer's disease pathogenesis // Abstracts of the 6-th World Congress of Biological Psichiatry, Nice, France. Supplément to Biological Psichiatry Journal of Psichiatric Research.-l 997.-V.42.-N. 1S.-P.93S.

3. Boksha I.S., Tereshkina E.B., Burbaeva G.Sh. Partial primary structure of human brain glutamine syntetase //Journal of Neurochemistry.-1998.-V.71Sl.-P.S84A.

4. Boksha I.S., Tereshkina E.B., Monakhov V.V. Protein folding influences the antibody-antigen interaction: human brain glutamine syntetase as an example. // In: Protein structure, stability and folding. Fundamental and medical aspects, Moscow, Russia, June 22-26.-1998.-P.181.

5. Burbaeva G.Sh., Boksha I.S., Tereshkina E.B., Savushkina O.K. Biochemical approaches to the brain gluiamate metabolism study in schizophrenia .// Schizophrenia research.-l999.-V.3 6.-N. 1 -3 .-P.70.

6. Бокша И.С., Терешкина Е.Б., Турищева M.C., Савушкина O.K., Воробьева Е.А., Бурбаева Г.Ш. Гетерогенность глутаминсинтетазы и глутаматдегидрогеназы мозга человека // Материалы конференции "Механизмы структурной, функциональной и нейрохимической пластичности мозга", НИИ Мозга РАНМ, Москва, 1999r.-1999.-C. 16.

7. Boksha I.S., Tereshkina Е.В., Savushkina О.К., Burbaeva G.Sh. Alterations of glutamine syntetase isoform levels in schizophrenic posterior cingulate cortex // Schizophrenia research.-2000.-V.41 .-N. 1.-P.256.

8. Терешкина Е.Б., Бокша И.С., Савушкина O.K., Бурбаева Г.Ш. Глутаминсинтетаза и белок, подобный глутаминсинтетазе, в лобной коре при шизофрении // Журнал невропатологии и психиатрии им. С.С. Корсакова.-2000.-№6.-С.51-53.

Терешкина Елена Борисовна

Россия

Глутаминсинтетаза мозга человека в норме и при шизофрении.

Из мозга человека выделены глутаминсинтетаза (ГС), ключевой фермент метаболизма глутамата (КФ 6.З.1.2.), и фермент, обладающий сходной с ГС Ь-глутамин-гидроксиламин трансферазной активностью и названный белком, подобным глутаминсинтетазе (ГСПБ). Установлено, что измеряемая в экстрактах мозга трансферазная активность ГС является суммарной активностью ГС и ГСПБ, Выявлена высокая перекрестная иммунореактивность ГС и ГСПБ в твердофазном иммуноферментном анализе. Разработан метод количественного определения ГС и ГСПБ в экстрактах мозга с использованием вестерн-иммуноблоттинга с хемилюминесцентным усилением сигнала. Показано изменение содержания ГС и ГСПБ в лобной коре, передней лимбической коре и коре мозжечка, а ГСПБ - также и в задней лимбической коре при шизофрении. Полученные данные указывают на участие ГС и ГСПБ в нарушении метаболизма глутамата в мозге при шизофрении.

Tereshkina Elena B.

Russia

Human brain glutamine synthetase in norma and schizophrenia.

Glutamine synthetase (GS, EC 6.3.1.2), a key enzyme of glutamate metabolism, and an enzyme possessing high hydroxylamine-L-glutamine transferase activity comparable with that of GS and termed GS-like protein (GSLP) were purified from human brain concurrently. The results from activity measurements suggest that the hydroxylamine-L-glutamine transferase activity measured in brain protein extracts is the sum of GS and GSLP activities. High immunological cross-reactivity between GS and GSLP was observed in ELISA. The method for separate detection of GS and GSLP in brain protein extracts with use of ECL-immunoblotting was developed. The relative contributions of GS and GSLP to the total immunoreactivity were evaluated by ECL-immunoblotting in normal and schizophrenic human brain. The alterations of the GS and GSLP level in frontal, anterior cingulate cortex and cerebellum cortex were detected. The level of GSLP was changed also in posterior cingulate cortex. The role of GS and GSLP in impairment of brain glutamate metabolism in schizophrenia is assumed.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Терешкина, Елена Борисовна

Список использованных сокращений.

I. ВВЕДЕНИЕ.

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Метаболическая связь нейронов и астроцитов.

Автономный метаболизм глутамата в мозге. Астроциты синтезируют углеродный скелет глутамата, используемый нейронами.

Поглощение глиальными клетками глутамата, высвобожденного нейронами.

Глутамат/глутаминовый цикл с участием нейронов и глиальных клеток.

Пути превращений глутамата в мозге.

Синтез глутамата в нейронах цитозолъно-митохондриальный «шаттл»).

Другие пути биосинтеза глутамата.

Утилизация глутамата в астроцитах.

Глутаминсинтетаза (ГС).

Биохимические свойства и сведения о структуре ГС.

Функции ГС в нервной системе.

Выводы о функциональной роли ГС на основе результатов по ингибированию ГС в экспериментах на животных.

Защитная функция ГС.

Множественность генов ГС человека, локализация известных генов и псевдогенов ГС.

Регуляция экспрессии ГС млекопитающих в ходе дифференцировки и развития нервной ткани.

Регуляция экспрессии гена ГС гормонами на уровне транскрипции.

Регуляция экспрессии гена ГС вторичными мессенджерами.

Регуляция уровня ГС возбуждающими аминокислотами.

Цитоспецифическая экспрессия гена ГС и ее контроль в ходе развития.

Регуляция экспрессии ГС в зрелом организме и тканях (модели).

Изменения уровня ГС как реакция на стресс.

Регуляция активности ГС на посттранскрипционном уровне. Пострансляционные модификации ГС.

ГС при патологических процессах в ЦНС.

Экспериментальные модели.

ГС и изменения метаболизма глутамата при патологиях нервной системы человека.

ГС и цикл Глу/Глн при болезни Альцгеймера.

Инактивация и снижение иммунореактивности ГС при окислительных модификациях.

Изменение клеточной локализации ГС при болезни

Алъцгеймера - иммуноцитохимические данные.

Глутаматергическая система при шизофрении.

Патологические изменения астроцигов при шизофрении.

Гипоглутаматергическая гипотеза шизофрении.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалы.

Методы.

Получение экстрактов белков мозга.

Определение ферментативной активности ГС.

Определение концентрации белка.

Определение частичной аминокислотной последовательности ГС и ГСПБ.

Хранение очищенных ферментов.

Ионнообменная хроматография.

Гель-фильтрация.

Аффинная хроматография.

Электрофорез в ДС-Na-ÜAAT.

Двумерный электрофорез.

Иммуноферментный метод анализа.

Вестерн-иммуноблоттинг с хемилюминесцентным усилением сигнала.

Статистическая оценка данных.

Получение антисывороток и их тестирование.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ.

Выделение глутаминсинтетазы и белка, подобного глутаминсинтетазе, из мозга человека.

Влияние различных факторов на ферментативную активность ГС и ГСПБ.

Определение молекулярной массы ГС и ГСПБ, молекулярной массы и ИЭТ их субъединиц.

Определение частичной аминокислотной последовательности

ГС и ГСПБ.

Получение поликлональных антител к ГС и ГСПБ.

Сравнительное изучение ферментативной активности и иммунореактивности ГС и ГСПБ в различных областях мозга в норме и при шизофрении.

V. ОБСУЖДЕНИЕ.

VI. ВЫВОДЫ.