Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности структурной организации и дивергенции повторов в геноме DROSOPHILA MELANOGASTER

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Особенности структурной организации и дивергенции повторов в геноме DROSOPHILA MELANOGASTER"

РГБ ОД

1 о МР та

ГОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА Биологический факультет

На правах рукописи УДК 575.577

БЕНЕВОЛЕНСКАЯ Елизавета Вадимовна

ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ И ДИВЕРГЕНЦИИ ПОВТОРОВ В ГЕНОМЕ ВКОБОРШЬА МЕЬАМООАБТЕК (НА ПРИМЕРЕ ГЕНОВ рРНК И АННЕКСИНА X)

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1995

Работа выполнена на Кафедре молекулярной биологии Московского Государственного Университета

Научный руководитель: доктор биологических наук В. А. Гвоздев.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Тарантул В.3.

кандидат биологических наук Минин A.A.

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии РАН

Защита состоится "_"_ 1995 г. в_час

на заседании Специализированного ученого совета Д. 053.05.70 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова'

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "_" _ 1995 г.

Ученый секретарь Совета кандидат химических наук

В. Н. Каграмаков

Актуальность темы,- Протяженные кластеры повторящейся ДНК являются • одним' из основных компонентов эукариотического генома,' однако их детальная структура, а таксе способы коррекции отдельных повторов остаются предметом исследований. До сих пор • не расшифрованы молекулярные механизмы локальной амплификации • генома., которые могут приводить к образованию мультигенных семейств. Продолжает обсуждаться вклад процессов незаконной рекомбинации, а также генной конверсии и неравного кроссинговера • в эволюцию единиц кластера. Ход эволюции (дивергенции или. напротив, - коррекции членов, семейства) может различаться для разных мультигенных семейств. Структурный анализ отдельных генов . хорошо ' изученных семейств, таких как рибосомные гены, а также обнаружение новых мультигенных семейств представляет большой .. интерес в планв^азвития современных представлений, касающихся как вопросоз эволюции этих семейств. так и их структурно-функциональной организации.

В настоящей работе описана экзон-интронвая* структура гена кальций-связывающего белка аннексина X. Показано, что ген аннек-. сина прилежит к видоспецифичному повтору, включающему амплифици-рованные единицы,- содержаще лишь 3' фрагмент гена аннексина. а также последовательности, гомологичные гену, кодирующему одну из ■ субъединиц цитоплазматического -Дивеийа. " Обнаружение' такой структуры, увключающей ген.аннексина и прилежащие амплифицированные последовательности линейна и аннексина, открывает перспективы для детального исследования особенностей эволюции этой структуры и ее возможной функциональной роли. Секвенирование гомологичных -¿г . последовательностей в составе кластера позволяет оценить время ' его образования в эволюции вида D. melanogaster. Проблема коррекции и дивергенции генов рассматривается также на примере псездогена 18S рРНК. обнаруженного вне рибосомного кластера.

Задачи исследования. Целью настоящей работы являлось: 1) Исследование молекулярной структуры гена аннексина X Drosophlla melanogaster и прилежащих повторяющихся последовательностей.. 2) Определение, нуадеотидной последовательности псевдогена 18S рРНК, •. локализованного вне кластера рДНК.

■Научная новизна результатов исследования. Определена эк-зон-интронная структура гена аннексина D. melanogaster. Показана консервативность, отдельных экзон-интронных границ в генах дрозо-, филы и млекопитающих. что указывает на существование древней эк-зон-интронной структуры гена, кодирующего аннексии. В составе фрагмента Х-хромосомы.размером '70-100 т. п.н. описана структура кластера, включающего ген аннексина X и несколько тандешо повторяющихся амшшфищфованных копий по 7.8 т. п. н. , ч каждая из которых включает последовательность интермедиатной цепи цитоплаз-матического динеина и 3' фрагмент гена аннексина X. Локализация гена динеина в районе 19В совпадает с положением- локуса Su(Gl)27 - супрессора летальной мутации в гене G toed, кодирующем субъединицу 150 кДа динеина. Возможно, супрессия этой мутации достигается за счет восстановления белок-белковых взаимодействий. . нарушенных мутацией Glued. Кластер является приобретением вида D. melanogaster и отсутствует у других видов подгруппы melanogaster. Можно предполагать, что кластер является результатом события локальной амплификации, предшествовавшим образованию нового мулътигенного семейства.

Определена нуклеотидная последовательность псевдогена 18S рРНК, локализованного вне кластера рДНК. Продемонстрирована ре. комбинантная природа псевдогена,. указывающая да возможность коррекции последовательностей единиц кластера рДНК в результате кроссинговера (генной конверсии) с псевдогенами/генами рРНК.

Обсуждаются вопросы дивергенции и гомогенизации ■ кластера повторов на примерах последовательностей генов аннексина и рРНК.

Практическая ценность. Впервые описана экзон-интронная структура гена аннексина X. г Обнаружение копий генов аннексина и динеина открывает возможность изучения их специфических функций.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Ежегодных научных конференциях ИМГ РАН (Москва, 1992. \l993. 1994, 1995). Отчетной конференции по программе "Приоритетные направления генетики" (Москва, 1993), 13й Европейской конференции по дрозофиле (Крит. Греция, 1993), 35й и 36й Научной конференции по дрозофиле (Чикаго. США. 1994; Атланта, США, 1995), XXIм Форуме Молодых Ученых (Реймс, Франция, 1994).

Обьем диссертации. Материал диссертации изложен на страницах машинописного текста, содержит рисунков и таблицы. Список цитированной литературы состоит из работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Клонирование в плазмидах, скрининг геномной библиотеки, введение радиоактивной метки в ДНК, Саузерн- и Нозёрн-гибридиза-. ции, - определение нуклеотадной последовательности по Сэнджеру проводили по стандартным методикам (Sambrook et al.. 1989).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Клонирование протяженного фрагмента генома, включающего ген аннексина X и та?дем"о амплифиштоованные гомологичные последовательности. -

Исходный для последующего исследования геномный фрагмент был получен в целях изучения районов локализации рётротранспозона дрозофилы МДГ1 при скрининге М.Д.Балакиревой космидной библиоте-1 кл D. melanogastsr на МДГ1 зонд. Отобранная космида с36 была до-кализовЕча гибридизацией in situ с политенными хромосомами в сайте 193. Определение нуклеотидной последовательности произвольных фрагментов из космиды с36 показало, что Styl фрагмент (зонд 1 на Рис. 1В) содержит области гомологии с кДНК аннексина X, клонированной ранее (Johnston et al.,1990).

На Рис. 1А представлена р'естриктная карта геномного Фрагмента, клоштрзвавного в с36. Периодичная картина расположения сайтов рестрикции EcoRI. Hindi II,' BamHI. Kpnl и др. с интервалом около 7.8 т.п.н. показывает наличие повторяющихся единиц. Косища c3S содержит три полных единицы размером 7.8 т.п.н., в одну из которых инсерткровал МДГ1. Секвенирование единицы псвто-

Рис.1. Структурная организация кластера повторов anxX D.me-icmogaster. _ А. Рестриктная карта района кластера, большая часть которого клонирована в космиде с36. Вверху показаны геномные фрагменты рекомбинантного фага и космиды. Схематически представлены последовательности гена апхХ и его 3'-фрагмента алхХЗ' (зигзаги), участок, гомологичный интермедиатной цепи цзтоплазмати-ческого динеина (Die, заштрихованная стрелка; и единицы повтора (стрелки в направлении транскрипции гена апхХ). Полноразмерный ген апхХ показан слева от повторяющихся единиц. В космиде с36 ген апхХ прерывается сайтом клонирования. Вектор рНС79, на основе которого была создана космидная библиотека, пока;.-"« заштрихо-

ft

Б

Pi-lb

сЗб шшА

апхУ

Sic ШПШШШФ

i t) ( н тпн апхХЗ' вАДа

ванными прямоугольниками. МДГ1 инсертировал в направлении, противоположном транскрипции апхХ, в третью единицу кластера. Отрезками показаны субклонированные фрагменты. Б. Молекулярная структура гена апхХ. Экзоны представлены толстыми линиями. В. Структура единицы кластера. Выделены последовательности 3'-Фрагмента гена алхХЗ' и ОРС Die. Указаны сайты рестрикции, выявляющие повторы размером 7.8 т.п. н. и фрагменты, использованные в' качестве зондов: H-Hindlll. R-£coRI, B-BcorJII. K-Kpnl, S-Styl, SI- SalGI. 1. 2. 3 - зонды для гибридизации. Направления транскрипции указаны стрелками. Координаты в т. п.н. отложены по шкалам.

ра показало, что она содержит лишь 3' фрагмент гена аннексина X. который обозначен как апхХЗ'. Была выявлена экзон-интронная ■ структура 3'-фрагмента гена аннексина X при сравнении геномной последовательности с последовательностью кДНК. Впоследствии был клон'фовгн полноразмерный ген атХ (см. нияе). При гибридизации коемкды с36 с 5'-фрагментом гена апхХ (зонд 2 на Рис, 1Б), оказалось что ген апхХ не входит в состав повторяющейся единицы, а фланкирует кластер с одного из концов. В космиде к36 ген апхХ прерывается сайтом клонирования.

Гибридизация по Саузерну ЕсоЫ-рестриктов геномной ДНК дрозофилы с 3'- фрагментом гена алхХ (зонд 1) выявляет, помимо мажорного фрагмента повтора размером 7.8 т.п.н., дополнительный фрагмент размером 2.6 т.п.н., Количество копий повтора 7.8 т. п. н.. судя по соотношению количества радиоактивности полосы , 7.8 т.п.н. и уникального фрагмента, в большинстве линий достигает 12-16. В то же время в линии ёг к? количество копий приблизительно в два раза меньше. Чтобы клонировать все элементы кластера, которые содержатся в геноме, был проведен скрининг библиотеки, созданной на основе фага Р1, позволяющего изолировать несравненно более протяженные участки ДНК. чем космиды. При скрининге библиотеки на зонд 1 было выделено два. клона. Р1-16 и Р1-37. Оба фага содержат геномные фрагменты, гибрвдизующиеся с зондом 1.- размером 2.6 и 7.8- т.п.н, - в том-ае количестве-копии, что и в геномной ДНК.

1.1.Анализ экзон-кнтронной структуры гена аннексина X.

ЕсоЫ-фрагкент длиной 2.6 т.п.н. (Рис. 1Б) был субклониро-ван из фага Р1-16. Нуклеотидная последовательность этого фраг-' мента (Ас.Г Х78323) определена по двум цепям. Сравнение последовательности с кДНК алхХ показало, что клонированный геномный фрагмент содержит полную последовательность кДНК. прерванную интронами, но не содержит 5'-регуляторной области гена. Ген олхХ О.те1ало£02{ег состоит из 4 экзонов и 3 интронов (Рис. 1Б и 2). ПерЕЫй к третий нитроны алхХ (330 и 400 п. н. соответственно), относятся 1С классу больших интронов, .мало представленных в геноме дрозофилы. Длина третьего интрона (80 п.н.) соответствует размеру большинства интронов дрозофилы.

При сравнении 'последовательностей гена и 1сДНК было обнаружено несколько-различий '(Рис. 2): дополнительные нуклеотиды рядом

- - 8 -

с сайтом клонирования (нуклеотиды 7,9 и 10) , синонимичная замена C-»G (Leu256) в 3 экзоне и, наконец, потеря Asp303 на границе 3 и 4 экзонов. Последний район соответствует повороту между соседними а-спиралями полипептидной цепи аннексинов (Barton et al., 1991). Отсутствие Asp303 позволяет устранить сбой при выравнивании апхХ дрозофилы с консервативной структурой аннексинов позвоночных. Возможно, что структурные характеристики данного генного варианта апхХ закрепились в процессе эволюции аннексинов у позвоночных.

1.2. -Гипотетическая схема эволюции аннексинов.

Полученные результаты можно обсуждать с точки зрения эволюционной динамики экзон-интронных структур генов аннексинов. ^Все ранее описанные.аннексины имеют' консервативную генную структуру из 13 экзонов. экзоны 3-13 кодируют четыре консервативных белковых повтора (коровый домен). Экзон-интронная структура N-конце-вого домена, который, как считается, определяет специфические функции аннексинов, отличается у разных генов аннексинов. ,У апх X Drosophila 1 экзон кодирует первые четыре аминокислоты, 2 эк-зон составляет остальную часть Ы-концевого домена и три консервативных повтора, -3 экзон вместе с 4 экзоном кодируют- четвертый повтор. Положение 2 и 3 интронов Drosophila при сравнении с 10 и 12 нитронами позвоночных строго консервативно как в отношении положения аминокислотного остатка, так и фазы-кодона^ Это позволяет предполагать, что. оба интрона присутствовали и у общего предка насекомых и млекопитающих (Рис. 3). Если эти интроны при-

Рис.2. Нуклеотидная последовательность гена апхХ и соответствующая аминокислотная последовательность белка, полученная при трансляции последовательности кДНК алхХ (Jotoston et al., 1990). Последовательность амплифицированного фрагмента гена (алхХЗ') приведена под последовательностью гена, нуклеотидные отличия в кДНК указаны стрелками. Нуклеотиды экзонов - прошеные . буквы, некодирующих районов - строчные буквы. Первый нуклеотид соответствуют началу кДНК. Два предположительных сигнала нолиадени-лирования подчеркнуты. Четыре консервативных белковых повтора обозначены сплошной линией под последовательностью; остатки, участвующие в связывании' Са2*(Concha • et al., 1993) отмечены звездочками. .

t

l II

¡XX GAATTCGCAAAAAAGTCCCAGGAGAAAGACTGATTCGTGTGAAGTCGTCTACTGAAGAGC 50

íxX CACAAGGAACCCAAGGAATCTTCCAGCTGCATAATGGAATACAAAgtgagtggattggat 120

M E Y К 4

íxX . tgccaggctagagstgatr.ccattattgcactaatgcctgttattgattcgccacg^gca 180

íxA' tgcgtcîictcgctacacgggaagaaaaatgcatatggcttaatgatttgagtttgaatgt 240

ix X attaactttccaaaatattagtttctatcgaaaacagagagttaccataggaagttcaat 300

ixX cctcattgtatgcagctactttctgatatttgaaatgttatatgtgtaaatgaatgattt 360

:xX gaatatgaccataai:atttgttaatttttttttttgctaaaatatat;ttatatacaacta 420

IxX aattttactgtgcagCCCGTGCCCACGGTTAAGGACGCAGCTCCCTTCGACGCCTCCCAG 430.

PVPTVKDAAPFDAS Q 19

i

•xX CACGCCCAGGTGCTGCGGGCGGCGATGAAGGGATTCGGCACCGACGAGCAGGAAATCATC 540

DAQVLRA AMKGFGTDEQEII 39

ixX GACGTGCTCGTCGGCAGGAGCAACCAGCAGAGGCAGACGATCAAGGCGGTÏTACGAAGCG 600

DVLVG.R S N Q QRQ T I К A V Y EA 59

rxX GAGTTCGACCGCGACCTGGTGGACGATCTTAAGGACGAGCTGGGAGGCAAGTTCGAGGAC 660

EFERDLVD.DLKDE LGGKFED 79

4

IXX GTGATCGTGGGTCTAATGATGCCACCAGTGGAGTACCTGTGCAAGCAACTGCACGCCGCC 720

VIVGLKMPPVEYLCKQLHAA 99

OCX . ATGGCGGGCATCGGAACCGAGGAGGCCACGC^.CGTCGAGATCCTGTGCACCAAGACCAAC 780

MAGXGTEEATLVEILCTKTH 119

íxX GAGGAGATGGCCCAGATCGTGGCCGTCTACGAGGAGCGCTACCAGCGCCCGCTGGCCGAG 840

EE. MAQIVAVY. EERYQ'RPLAE 139

¡xX CAGATGTGCAGCGAGACCTCCGGCTTTTTCCGCCGCCTGCTCACGCTGATCGTGACC-GG 899

IXX3• ATGTTATAT---TAAA---------T-T--

QKCSETS.GF FRRLLTLIVT G 159

IXX AGTACGTGACGGACTGGAGACGCCCGTCGACGTCGGTCAGGCCAAGGAGCAGGCCGCCCA 959

IXX3'---G--------------------------------------------------------

VRDGL DT PVDVGQAKEQAAQ 179

xX GCTCTACTCGGCCGGCGAGGCCAAGCTGGGAACGGACGAGGAGGTCTTCAACCGGATCAT 1019

ixX3»----------------------------------------------------------—

L YSAGEAKLGT DEEVFHR IM 199

XX CTCGCACGCCAGCTTCCCGCAGCTGCGACTTGTCTTCGAGGAGTACAAGGTGCTCTCCGG 1079

[ХЛ'Г*-----------------—-----------С-------------------А---------

S í' A S F P ' Q L R - L V F E E Y К V L S G 219

/

anxX GCAGACGATCGAGCAGGCCATCAAGCACGAGATGTCCGACGACCTCCACGAGGCCATGAT 1139

апхХЗ1--------------------------------------------------г-------

Q T I E' Q A I К H E H S D E L H E A M M 239

a nxX GGCCATACgtcagtatatatttaactgttccgttataagtaattgttgtaacagacactt 1199

апхХЗ'----------------------------------------------------------

AI 241

anxX ggttaaatgacacacttcttaaccttttagTTGAGTGCGTCCAGTCACCGGCGGCCTTCT 1259

апХХЗ'--------------------------------------------------;--------

i VE CjVQSPAAF 252

С

anxX TCGCCAACCGCCTGTACAAGGCCATGAATGGCGCCGGCACCGATGACGCCACGCTCATCC 1319

апхХЗ•----------------------------------------------------------

FANRLYKAMNGAGTDD A T L I 272

anXX GCATCATCGTCAGCCGCTCGGAGATCGACCrGGAGACCATTAAGCAGGAGTrCGAGCGGA 1379

апхХЗ'-----------------------------------------------------------

RIIVSRSEIDL ETIKQEFER 292

III

gac

anxX TCTACAACCGTACGCTGCACAGCGCCGTGGTG§taagtggatctcgaagaatcgcgagtg 1439

апхХЗ'----------------------------------------------------------

IYNRTLHSAVV

anxX cttcgcacatggttaacgcacccctttccccttctcttcacgtacttctcggc-atttgt 14 98 anxX3 • ----------------------------------------------g---*-t------

anxX tgcggtgtttgtgttgtcctaggacgtaagtattggccacgcattggtgaaacggatgta 1558 апхХЗ'-----------------------------:---------------------------c-

anxX ttcctggtcttggttactccacgctatcaagtgttcottttacgctacatatgctgccaa 1618 апхХЗ*-----------------t---------------с--------------------------

anxX aatccccaicaaattatttçtaagaacgccgaagcaaactggttcttgggcatttttcga 1678 апхХЗ'-------------------------------------------:---------------

anxX tatctcattattggcttgccaaaaaagtattttcgggcaaagtagtaattgtagtgtaga 1738 апхХЗ'-----------------------------------------------------------

anxX gggcatagccaaaaaagcaagaacttggatctcgcttcaatacgttcctttctttacttt 1798 апхХЗ '—*------------------------------------------------------

anxX ccagGCGGACACCTCTGGTGACTACAAGCGGGCCCTGACAGCCCTACTTGGATCCGCCTA 1858

апхХЗ'----------------------------------------------------------

AETSGDYKRA L.TA LL'GSA* 320

anxX GGCCCGAGGATGTGGCAGCTGGTCCGCCCAATATTTTATTCGTGTTAATAGCTTTGATCG 1918 апхХЗ '-------—:-----------------------------------t-------.--------

anxX TAGTGTGCCTTrrAGGAAAATCGCTTTTAATGTCGTCTGCGCATGCACACTGTTGGCMI 1978 апхХЗ'--------C-GG—G—■—ТСГС—GG—TÇ-CC

anxX ^¿¿TAAACGcatatgcagcagttgtaaccaatgcgacgacagacataaaacctagagatc 2038

- и -

СИ

предок с ддлии левторок

~Т5-ГГ

НЕ

потеря нитронов

-=-препок с четмрым зовто--1-1 рани (3 нитрон«?)

Б^д^еПая

кет интрекоа

лагеря метровое

2 чнтрок»

>Н!|рЫ11

2 нитрона

приобретение трскгв

чеМеЪии иного интрэков мнтронк ннсертдощт > яегонолагичике ввлсхе-

НиЯ Ю1МК1ШРО|&ННКХ

повторе«

I

Рис. 3. Схема эволюции аннексинов. Повторы порового домена представлены прямоугольниками. Положения интронов обозначены треугольника:®, черными треугольниками указаны инвариантные положения интронов у дрозофилы и позвоночных. Знаки вопросов стоят в положениях гипотетичных интронов. '

сутствогали и в структуре, дуплицированной в ходе эволюции ан-

• нексинов, затем должна была идти потеря интронов. причем начиная с 5' конца дуплицированной структуры, поскольку у дрозофилы инт-роны сохраняются только в 3' концевом повторе. Крайний случай -потеря всех интронов в районе, кодирующем повторы - наблюдается у слизевиков. Приобретение новых интронов, по-видииому, происходило у предков позвоночных. Подобная модель приобретения и потери интронов была предложена для эволюции семейств Са2*-связывающих белков ЕТ-руки.

1.3. Трансклиппия гена

- 12 -

anxX в линиях

и культурах клеток

Drosopfiilg metanogoster.

Аннексии X активно транскрибируется в имаго с образованием мРНК размером 1.4 т.п.н. {Johnston et al. ,1990). Обнаружение транскрипта в ранних эмбрионах ранее объясняли материнским эффектом. Мы обнаружили высокий уровень транскрипции' сшхХ в длительно пересеваемых эмбриональных культурах -клеток. Транскрипция сшхХ в gt и в эмбриональных культурах клеток линии Schneider IKSL-2) и 67J25D сравнима, а в культуре Кс приблизительно в 2 раза выше (Рис. 4А). Поскольку экспрессия аннексинов позвоночных регулируется гормонами различной природы, была исследована транскрипция апхХ в трех различных.культурах клеток, пролиферация которых специфически подалялась гормоном насекомых экдисте-роном. Оказалось, что добавление экдистерона не оказывает замет-

ного влияния на транскрипцию апхК (Рис. 4Б).

1 4 7

А

□

ш (М У

•4J ц Р

п : i 1. 2 а ' Ш ю

Б

+экдизон

гтт

13 J Iii

2.3,

w

• -у* ITA

Рис. 4. Транскрипция алх X Drosophi la. А, Норзерн-аналйз тотальной РЖ из мух gt ly8 (дорожка 1) и пересеваемых культур клеток Кс (дорожка 2), 67J25D (дорожка 3) and SL-2 (дорожка 4). Б,-Норзерн-анализ образцов РНК из клеток Кс (1й, 4й и 7й дни культивации), растущих без экдистерона и с экдистероном. Количество РНК на дорожках уравнивалось по гибридизации с рРНК. Показаны положения (в т.п.н.) молекулярных маркеров (актин 5С):

1.4. Нуклеотидная последовательность единицы повтора в кластере .включает 3'-фрагмент гена аннексина X и обнаруживает протяженную гомологию с рамкой трансляции гена интермедиатной цепи цитоплаз-матического динеина крысы.

Полиморфизм длин рестриктных фрагментов в космиде с36 выявлялся только по сайгу Bglll, который находится в клонированной копии. Остальной обнаруживаемый полиморфизм обусловлен инсерцией МДГ1. Иг кос?;иды с36 был получен ряд субклонов (Рис. 1), с помощью которых была определена полная нуклеотидная последовательность единицы повтора. 3' фрагмент гена аннексина X (нуклеотиды с 886 по 1928), содержащийся в единице кластера, охватывает последовательности, кодирующие коровые повторы 3 и 4. На 3' конце гомология обрывается после стоп-кодона перед предположительным сайтом полиаденилирования апхХ -(Рис. 2). При сравнении с после-" довательностью кДНК. как'и в полном гене, в 3'фрагменте гена anj-ХЗ' обнаруживаются синонимичная замена C->G и потеря триплета аспартата. Это показывает, что дупликация и амплификация секве-кированной нами копии апхХ привела к образованию последовательности апхХЗ' в составечтандемного повтора, тогда как кДНК, вероятно, соответствует другому (аллельному) варианту апхХ.

При поиске гомологий последовательности единицы повтора с нуклеотидным (EMBL) .и белковым .(Swlssprot) Ланками данных, а также при трансляции в шести рамках нуклеотидной базы данных GeneBanK., достоверных гомологий обнаружено не было, кроме гомологии самой протяженной открытой рамки считывания (Рис. 5) с интермедиатной цепью цитоплазматического динеина крысы.

Множественное выравнивание полипептида, кодируемого данной ОРС. с двумя известными на сегодняшний день последовательностями интермедиатных цепей динеина выявило гомологию с консервативным С-концевым доменом (Рис. 6). Интермедиатную цепь цитоплазматического .динеина дрозофилы мы сокращенно обозначили Die (dynein Intermediate chain). Выявленный фрагмент Die (48 кДа) обнаруживает 51% идентичности и 83% гомологии с субьединицей динеина крысы, и 18% идентичности и 55% гомологии с субьединицей динеина

TAAGCAAGAAGCTATTCACAAATArrCCTCCrCTCCATCTTTCCTCCAGTCAACGíiGCTG 60

*ARSYSQIFLLSIFPPVNEL 19

TCCGAGGAGCAGAAGCAGATGATCATACTGTCGGAGAACTTCCAGCGGTTCGTGGTGCGl' 120

SEEQK.QMIILSENFQRF^VVR 39

GCCGGCCGCGTttTCGAACGGGCCCTCTCGGAGAATGTGGACATAT^CACGGACrACATC 180

AG RVX ERAL S ENVD I Y T D Y I 59

GGCGGCGGCX^CAGCGAGGAGGCGAACGACGAGCGATCGAGCATGCGGCTCTCXJCTGAAC 240

GGGDSEEANDERSSM-.GLáLN 79

CGCGTCTTCTACGACGAGaXrrGGTCGAAGAACCGCTGCATCACCAGqvT^ 300

RVFYDERWSKNRCITSMDWS 99

! ACCCACXTCCCCGAGCTGGTGGTGGGCTCGTACCACAACAACGAG3AGAGTCCGAACGAG 360

THFPELVVG S YHN'N'ESS P N E 119

CCGGACGGGGTGGTGATGCTGireAACACCAAGTTCARGAAGAGCACGCCCGAGGACGTC 420

¡ PD GVVMVWN. TKFKKSTPEDV 139

i TTCCACTCCCAGA£KXK33GTEATCTCCXCCTGCrTTC 480

| FHCQSAVMSTCPAKFNPN'LI 159

CTCGGCGGCACCTATTCXX3GCCAGATTGTGCTCTGGGACAATCGCGTGCAGAAGCGCACG 540

X.GGTYSG QIVLWDNRVQKRT 179

CCCATAOU3CGCACGCCCXTCAGTGCCGGGGCGCACACGCATCCCGTCTACTGCCTCCAA 600

PI.QRTPLSAAAHTHPVYCLQ 199

ATGGTGGGCACKCAGAATGCIXaCAACGTCATCTCGATATCCTCGGACC^CAAGCTGTGC 660

^ MVGTQNAHNVISISSDGKLC 219

TCCTGGTCGCTGGACATGCTGTCGCAACCACAGGACACGCTGGAGCTGCAGCAGCGCCAG 720

SWSLDMLSQPQDTLELQQRQ 239

TCTAAGGCCATTGCCATTACATCGATGGCCTTCCCGGCCAACGAGATCAATAGCCTGGTG 780

SK AIAITSMAF P ANE INS LV 259

ATGGGC^GTGAGGACGGCTACGTCTACTCCGCCTCGCGCCACGGCCreCGCTCCGGGGTC 840

MGSE DGYVYS ASRBGLRSGV 279

AACGAGGTTTACXMCGCCATCTTGGCCCTATCACTCGCATATCCACGCACTACAAACa'i 900

NEVYERHLGP ITGISTHYKP 299

j CTX3TCGCCGGACTTTGGCCACCTCTTCCTAACCTCGTCCATCAAGATCTGCT ■ 960

'! LSP DFGHLF-LTSSIKIWSLX 319

; CTACCCATTTCMGTTCCCAGTTCTCTGTCGTCTCCGGAAT^ 1020

LPISSCQFSVVSGINSNKPL 339

TACTCCTTTCAGGACAACnXXGACTACGTGATGGACGTCGCCTGGTCGCCCGTGCATCCC 1080

Y S FEDNSDYVMDVAW S PVHP 359

GCACTCTTCGC(XX;CGTCGACX3CCAGCGGCCX3CCTGGACnGTGGAACCTCAACOVAG^ 1140

ALFAAVDASGRL DLWNLNQD 379

¡ ACGAAGGTGCCGAACCGCCTCGATTGTCGTGGCGGGAGCACC^GCCCTTA^CCGCGTCTC 1200

T KVPTAS I VV. AGAPALNRV S" 399

TTGGACCCCATCCXMTCTGCACGTGTGCATCGGCGACGAGGCCGGCAAGCAGTACGTGTA 1260

WTPSG LHV C I GDEAGKQYVY 419

CGACGTGGCCGAGAACCTGGCGCAGCCATCGCGCGACGAGATCAAGATGAACCAGAGCGT 1320

DV AENbAQP SR DEIKMNQSV 439 I GAGGTCTAfeGACGATATA _ .1338

R SRTI*. "" 444

Рис. 5. Открытая рамка считывания Die (dyneln intermediate chain) в последовательности единицы кластера. Звездочками показаны стоп-кодоны.

Dm

краса Chi •

Dm

крыса Chi

Dm

крыса Chi

Dm

крыса Chi

Dm

крыса Chi

VMELSEEQKQHIILSEÜFQRFWRAGRVIERALSENVDIYTDYXGGGDSE 65

PR. -Т. .E. .Q.LH. .E.LI.FD.TI.......A.DS. - FF: .S.RELE. 260

----------------------------------------QE.FTNVTMD 140

EAKDERSSMGLSLNRVFyDERWSKNRCX-TSHDWSTH—FPELWGSYHNN , 113

KDG.VQAGAN..F. .Q____H.-. .H.W.С----LQ—Y. . .M.A. -S. . 308'

HTSEAPHVKTVTV---.К.PUNI.-.SASYVH.HPDGSV.KV. .A-.SIL 185

EESPNEPDGWM---VWNTKFKKSTPEDVFHCQSAVMSTCFAKFN---PN 157

■ DA.H.....AL—. . .M____T. . -Y......S. . .V. . .R.H---. . 352

Q-FQQQ.А.MPLSSYI.DVN-NPN... YEHVPT.QI---.C----LKDN. 230

LILGGTYSGQIVLWDNRVCKRTPIQRTPLSAAAHTHPVYCLQHVGTQNAH 207

• W..............SHR...V................VNV.......■ 402

■VGA.Q.N. .LAYF.V.-KGNG.VEA.. IDIS-.RD. I .DFAWLQSKTGT 278

NVISISEDGKLCSWSLDMLSQPQDTLELQQRQSKA-IAITSHAFPAN-EI 255

• L.TV.T. . .M. ........T. .ESM. .VYNK. .P-V.V.G----TG-DV 450

ECMTV.T. .NVLW. D. RK.NECVENHP.KEKN.ETTVGGVCLEYDT.AGP 328

Dm

крыса Chi

Dm

крыса Chi

Dm

крыса ■Chi

Dm

крыса Chi

Dm -

крыса

Chi

крыса Chi

NSLVMGSEDGYVYSASRHGLRSG—VNEVYERHLGPITGISTHYKPLSPD 303

■ NF.V. . .E.T. .Т.е. . .SKA."IG. .F.G.Q. .V. . .NC.MAVGP1. 498

TNFMV.T.Q.QIF.CN.KAKNPVDR.KY.LSG.H. .. Y.L-RRNPFN.KY 377

FGHLFLTSSIKIWSLKLPISSCQFSWSGINSNKPLYSFEDNSDYVMDVA 353

.S. . .V. . .-FD.TV..----------WTTKH..........А---Y..M 537

----.. — ..GD. TARyWVE--------DTAVKT. ILTTKYHPT. LTGGT 413

WSPVHPALFAAVDASGRLDLWNLNQDTKVPTASIWAGAPALNRVSWTPS 403

..........C. .GM.........S..E.....VAIE..Y.....R.A\5G 587

.. -SR.GV.FTIKMD. .M.V.D'.YYKHNE. .LTVQ.SDL-. .TAFAVQE. 462

GLHVCIGDEAGKQYVYDVAENLAQPSRDE---------------------' 432

-KE.AV. .SE.RIVJI.. .GE-. .V.HN. .W----TRFARTL------------------623

. GT. AV. TSD. CTS. LQLSTG. SEA. PA. KANINAMFERETTREKNLEKA 512

-------IKMNQSVRSRTI* 444

-----VE.RA.RADSEE----------------------------EGAVE 640

IKEAKVKARKE. GR. DEVKDNVTEEQLKALEDEFFKTTDPAVGGGYGAGE 562

LAA* 643

GAAAE* 567

Рис. 6. Выравнивание аминокислотных последовательностей С-концевого домена интермедиатной цепи цитоплазматического дине-ина дрозофилы (Dm) и крысы, а также аксонемного динеина Chlcmyäomoms (Chi). Идентичные позиции с последовательностью Dm указаны точками, делеции указаны черточками.- Звездочками показаны стоп-кодоны'.

из жгутика Cklamydomonas. Наиболее протяженные блоки гомологии Die расположены в районах аминокислотных остатков 271-423 и 520-582 субъединицы крысы. Гомологий К-концевому домену крысы • обнаружить не удалось при поиске по .всем трем рамкам (при программной поддержке GeneBee). На 5' конце перед районом гомологии во всех трех рамках встречаются стоп-кодоны (А/Т-богатый район). Вероятно, этот район является интроном. Кроме того, и в самой области гомологии с 321 по 330 а. о. (Рис. 6) может быть небольшой интрон. На 3' конце Dtc обнаруживаются два предположительных перекрывающихся сигнала полиаденилирования. Положение стоп-кодо-на на З'-конце делает Die на .16 а.о. короче по сравнению с дкне-ином крысы.

1.5. ВидоспецкФичность и хромосомная локализация кластера.

Гибридизация in situ политенных хромосом слюнных желез D. melanogaster с рекомбинантными фагами, содержащими кластер ан-нексинов X и динеинов, наблюдается в районе 19В. Уникальный сайт гибридизации 19В выявляется и на хромосомах D. simulcms

Сравнение Саузерн-блотов геномных ДНК D. mslcnogaster. D. simians и .их гибридов позволило показать, что во-перзых. обнаруженный нами 7.8-т. п. н. повтор отсутствует у D. siimlans, а во-вторых, последовательности, гомологичные аннексину X и Dtc, отсутствуют в других хромосомах у D-. • melanogaster.- Саузерк-ана- * лиз геномной. ДНК D. melanogaster с 3'фрагментом апхХ (зонд 1) выявляет 7.8 т. п. к. Фрагмент единицы'кластера и фрагмент 2.6 т.п.н., включающий весь ген апхХ. Саузерч-анализ ДНК D. simians выявляет уникальную полосу гибридизации размером 2.4 т.п.н. (Рис. 7А), что указывает на межвидовой рестрикционный полиморфизм. Сравнение этих результатов с блот-гибридизациями гибридных геномов самцов, несущих Х-хромосому D. simians, У-хромосому D. melanogaster к гибридные аутосонные наборы, показало, что у гибридов выявляется_единственная полоса гибридизации, характерная для D. simians. Это позволяет заключить, что последовательности, гомологичные аннексину X, присутствуют в -геноме D.

ме1.51н.

ГИБРИДЫ

О*

9

1 2 3 4 5 6 7 0

7.8 6.0 ^

2.6_, 2.4-

Б

ГИБРИДЫ

о> 9

Л 2 3 4 5 В 1_0_

\ 7.3

6.0-^Г

4.7 _! —

2.0

Рис. 7. Саузерн-анализ' ДНК межвидовых • гибридов Б. те1апояаз1ег/0. з1ш1апэ после рестрикции ЕсоЫ. Гибридизация с зондами: А. зонд 1; Б, зонд 3. 1. и. п!elanogasteг; 2. Б. з1ши1апз: 3-5. варианты генотипов гибридов Хз1т/Уте1; 6-7. варианты генотипов гибридов Хз1т/Хше1; 8 - гибрид Хз1т/Хте1. у которого Х-хромосома несет инсерцию МДГ1 в районе -19В. Указаны размеры фрагментов в т. п.н.

melanogaster только в Х-хромосоме. У гибридных самок, несущих Х-хромосомы обоих видов, в дополнение к общим с D. melanogaster фрагментам .(7.8 и 2.6 т.-п.н.) выявляется дополнительная полоса размером около 2.4 т. п. н., которая может быть привнесена только хромосомами D. simians. На дорожке 8 виден рестрикт размером 6 т. п.н., характерный для линии с инсерцией МДГ1, .поскольку 193 выявляется как" горячая точка локализации МДГ1 в случайно взятых лабораторных линиях (Belyaeva et al., 1984). На Рис. 7Б приведены результаты' гибридизации того же блота с фрагментом Die (зонд 3), которые выявляют у D. melanogaster фрагмент 2:0 т.п.н., возможно представляющий район, соседствующий с аннексиновыы кластером. а также полосу 7.8 т.п.н. У D. simians у. гибридных са.миоз выявляется фрагмент 4.7 т.п.н., у гибридных самок - три соответствующих фрагмента. При анализе геномной ДНК трех других линий подгруппы Drosophila также выявляется едикствзнная полоса гибридизации с зондом 1. геномный Фрагмент D. mauritiana имеет размер 2.6 тпн., как и D. melanogaster.

Таким образом, последовательности aпхХ имеются по меньшей мере у близнецовых видов D. melanogaster, однако, у этих видов они не амплифицированы. Как уже отмечалось, при сравнении последовательности апхХЗ' с полным геном апхХ обнаруживается ряд нук-лзотидных различий: четыре замены и годна инсерция во втором эк-зоне;. три .замены, одна инсерция.и две делецпи з третьем интроне.. Формальное определение возраста кластера на основании дивергенции последовательности апхХЗ', рассматриваемой как псевдоген. от сшХ дает значение 375 тыс. лет. что является недавним событием по сравнению с возрастом вида D. melanogaster, оцениваемое как 2.5 кпн. лет. Таким образом, амшшкон образовался в процессе эволюции вида D. melanogaster. ." - -

Нельзя исключить, что апхХЗ' и Die представляют собой фраг-' кенты функциональных генов, а амшшкон отражает этап возникновения мультигенвого семейства аннексии в X и Die. Скорее же всего можно предполагать происхождение повтора из образованных путе;.; незаконной рекомбинации псевдогенов, которые затем были амплифи-цированы. Ампликон сохранился в самых _разных линиях D. melanogaster. вероятно, в результате неравного кроссинговера осуществлялась гомогенизация повторов и изменялось число копий повторов, которое варьирует в исследованных линиях. Подобные вариации, обусловленные неравным кроссикговером, отаечэны в геноме

дрозофилы и для копий рДНК.

Монно привести косвенные указания в пользу функционирования в ' районе 1GB гена'интермедиатной цепи динеина Die. Описан ряд летальных аллелей локуса Glued Drosophila melanogaster, продуцирующих мутантный полипептид 150>кДа (pl50clned).цитоплазматичес- ■ кого динеинового комплекса. Доминантный супрессор мутантного генотипа Su(GL)27 локализуется в районе 19А-Е (Harte & Kankel, 1982). Локализация супрессорной мутации гена р150С1аеа в районе кластера указывает на возможность того, что Su(Gl)27 является аллелем Die.' Интермедитная цепь непосредственно контактирует с ' полипептидсм 150 кДа в комплексе цитоплазматического динеина. -Можно предполагать; что мутация Su(Gl)27 повышает аффинность ин-термедиатной цепи динеина Die к pl50clued, частично восстанавливая функциональность динеинового комплекса.

2. Клонирование и анализ нуклеотидной последовательности варианта 18S рДНК.

Считается, что копии повторов, кодирующих рРНК, достаточно сходны, если не идентичны внутри вида. Предполагается, что такая согласованная эволюция повторов обеспечивается процессом неравного, кроссинговера или генной конверсией, однако на молекулярном уровне рекомбинации по Щеткам'генов, кодирующих* рРНК] показано не было. Возможность образования рекомбинантных копий в тандемно повторяющихся элементах гетерохроматина была ранее показана на молекулярном уровне на примере копий Su.(St) повторов в У-хромо-. соме (Balakireva et al. 1992). Их образование может быть обусловлено меяхройатидным неравным кроссинговером, предположительно, имеющим место в гетерохроматине, где, как известно, запрещен ме-йотический кроссинговер. В настоящей -работе рекомбинантные структуры генов рРНК были выявлены-при исследовании псевдогена 18S рРНК.

Фрагмент рДНК был субклонирован из участка гетерохроматина. клонированного в составе искусственной хромосомы дрожжей (Коган и др..1991). Исследуемый фрагмент был локализован Г.Л.Коган в Х-хромосоме. вне кластера рДНК. дистальнее ядрышкового организатора.

Была определена нуклеотидная последовательность- основной части (1566 п.н.) гена 18S PHK (Ac.N Х70692) (Рис.8).а также прилегающих к нему фрагментов последовательности 28S рДНК и ри-

255 A

DMRG tCtagataaCATGCAGAtcgtAtggtCTTGTaccgacgaCAgatctTTCaaatgtctgCC 314 PS18------------------------------------------------------------

DMRG CtatcaactTTTGatggtagtATCTAGGactaccatggttGCAACGggtaAcggggaatC 374 PS18--------------------------------------------------------.----

DMRG AGGgttcGATtccggagAgggagccTGAGAAACggctaccAcatcTAAGGaagGCAgcag 434 PS18------------------------------------------------------------

DMRG goGCGTAAattaccCACtcccAGCTCggggAgg-agtgacgAAAAATAAcaatacagg',c 494 PS18 -------------------------------------;-----------------------

DMRG tcATATCCgagGCcctgtaAttgGAATG^GTACACTttaaaTCCtttaaCAAGGATCAat 554 PS18----T------------------------------------------------1-------

DMRG tggagGGCAAGTctggtgccAGCAGCCGCggtaATTccagctccaatagcgtatattaAA 614 P518 -------------------------------------------------------------

DMRG GTTGttgcggttaaaACGTtcgtAGttgaACTTGTgcttcatACGggtagtacAacttac 674 PS18-------------------------------------------------------------

DMRG aATtgtggtTAGTactataCCTTTAtgtatgtAAGCgtatt.accGgtggagtTCTTatat 734 PS18------------------------------------------------------------

DMRG gtgaTTaaataCTTGtatttTTtcatatgtTCCTCCTATttAAAAAcctgcattacftgct 794 PS18 -------------------------------------------------------------

DMRG cTTAAACgagtgttattgtgggCCggTACTATtactttgaACAAAttagagtgcttaAAg 854

PS18--------------------------------------.----------------------

DMRG cAggCTTCAaatgCCTGAAtattctGtgcAtgggAtaatgaaatcLAGAcctctgttctgC 914

PS18------------------------------------------------------------"

. C A \. E - • - r DMRG tttcattgGTTTTCAgatcAagaggTAATGAttaatagaagcagtttGGGggcattagtA 974 P518 _-----------------------------T------------------A----y******

DMRG ttacgacgcgagagGTGAAAttcttgGACcgtcgtaagactaaCTTAAgcGAAAgcATTt 1034 PS18 **********************************--------------------------

DMRG gccAaagatgttttcattaatcaaGAacgaAAgttagagGTTCGAAggcgATCAGATACc 10S4 PS13---------------------------------------------C--------------

DMRG gccCTAGttctaacCATAAACGATGCCagctagcaattgggTgtagctaCTTTTAtggct 1154 PS18-----T---------tG--------------------------------------------

DMRG ctctcagtcgctTCCggGAAAccAAagctTtttggGctccggGGGaagtAtggttGCAAa 1214

DMRG gctgAAacttAAaggaATtgacGgaagggcaCCacCAggagtGGagcctgcggcTTAAtt 1274

PS18------------------------------------------------------------

VARI ---------------------------

DMRG tgACTCAACAcgggAAAACTTAccaggtc*GAAcataAGTgtGtAAgaCagaTTGATAGC 1331,

PS18-----------------------------C------------------------------

VARI-----------------------------C------------------------------

DÍ5RG tctTTCtcGaatctatgGGtggtggtgcatggccgttcttAgttcgtggaGTGAtttgtc 1393

FS18--------------------------------g—'-------------------------

VARI -

DMRG tggTTAATTccgATAACGaacGAGActcAAAtatAttaaATagatatcttCAGGattatg 1453 PS13--------------------------'-----------------------------------

DMRG gTgctgaaGcttatgtagcctteatteatgttggcagtAaaatgcTTATTgtgtttGAat 1513 PS18------------------------------------------------------------'

DMRG gtGtttatgtaagtggagccGtacctgTTggtttgtcccattataaggACACtagctTCt 1573

PS18------------------------------------------------------------

Б \ В

DMRG taaatgGACAAattgcGTCTAgcaatAATGAGATTgagCaataacAggtcTgtgAtgccc 1633 PS 18--------T-----------T---------------ga--------------------a-

DKKG ttaGATgtcctggGCTgcAcgcgcgctACAAtgaaagtAtcaacgTGta * ***tttCCTA 1689 PS18------------7-----Gt—aG-------------------------cacg----* —

DMRG gaccGAGAggtccgggtaAACcgctgaACCactttcaTGCTTGGGATtgtgaacTGAAAC 1749 PS18-----------------:---A--------------------С—A---------------

DMRG TgttcacgATGAACTTGGAattccCAgtAagtgtgagtCATTAactcgcattGATTACGT 1809

PS18-------*--------------1---1---c-cgc-t------eg—с—**********

VAR2 —g---:--------------------:-------------

DMRG CCCfgccctttgtAcaCACCGCCCGTCGCtactaccGAttgaattatttagtGAggtcTC 1869

PS18 ****-----g---------T---*--------------------------------с---

VAR2-------————--------------**********------——----------------

В 1873 DMRG CGGAcgtgat PS18----******

VAR2 Рйс7 8. Нуклеотидная" последовательность псевдогена 18S РНК (PS18J в сравнении с последовательностью гена 18S рДНК (DMRG). Нумерация нуклеотидов 18S DMRG приведены по Taùtz.. et al.','1988/ ' '

Заглавными буквами обозначены нуклеотиды петель, строчными -нуклеотиды шпилек, выделяемые согласий модели вторичной структуры РНК: " курсивом выделены замены на границах предполагаемых одно- и двунитевых структур. Звездочки указывают делеции. Обозначены границы условно 'выделенных участков А, Б и В псевдогена 18S; -приведены последовательности фрагментов 18S рДНК по данным Youvan & Hearst, 1981 (VARI), и Jordan et al.,1980 (VAR2).

босомной инсерции II типа. Протяженная - делеция (2397 п.н. ), включающая 3'-конец 18S рДНК, 5,8S рДНК и начало гена 28S РНК, приводит к слиянию последовательности 18S и 28S рДНК (Рис. 9).

Сравнение клонированного фрагмента с последовательностью полноценного фрагмента кластера рДНК (Tautz et al.. 1988) показывает, что в последовательности 28S рДНК. наряду с нуклеотидными заменами, обнаруживаются четыре делеции, располагающиеся на расстоянии 20-70 нуклеотидов друг за другом. -

(

- 22 -

18S 2SS M

<-A-И-S-H—s->

Рис. 9. Схема распределения нуклзотидных замен и поврездь-ний в составе фрагмента 18S рДНК. Условно выделены участки А. Б и В псевдогена 18S РНК. слитого с- последовательностью 28S РНК, прерванной инсерцией II типа. Треугольники, обращенные к последовательности вершиной или основанием, обозначают соответственно инсерции и делеции. Цифры, сопровождающие треугольники, указывают число инсертированных (делетированных) нуклеотидов. Малые треугольники обозначают однонуклеотидные инсерции и делеции.Вертикальные столбики указывают нуклеотидаые замены, кружки - замены двух соседних нуклеотидов. столбики с головкой - несколько замен на протяжении 5-7 нуклеотидов. Замены и повреждения в участках петлей и шпилек показаны столбиками вверх и вниз соответственно. Для фрагмента 28S рДНК-показаны только делеции.

1 В последовательности 18S рДНК обнаруживается две . делеции (14

.| и 40 нуклеотидов),инсерция четырех нуклеотидов, а также ряд нук-

j леотидных замен, делеций отдельных нуклеотидов и одна инсерция j нуклзотида. Такие множественные нарушения позволяют считать эту

J последовательность псевдогеном.

I Исходя из характера распределения нуклеотидных замен и пов-

реждений по длине псевдогена, можно выделить в нем три участка (Рис. S). Замены и повреждения можно соотнести с участками, соответствующими однонитевым или спаренным районам молекулы 18S РНК. выделяемым согласно принятой модели вторичной структуры. На участке А (5'-район) обнаружена всего одна замена, что соответствует дивергенции между копиями рДНК D.meUmogaster по данным других авторов (0Л7Х). На участке Б частота дивергентных сайтов достигает 2.0% на нуклезтид. Число замен в районе петель в рас-

чете на единицу длины последовательности превосходит в 7 раз число нуклеотидных замен в районе спаренных участков. Делеция 40 нуклеотидов удаляет шпильку с петлей. Согласно ряду данных, петли являются наиболее вариабильными участками, в которых скорость эеолюции выше, чем в спаренных районах молекулы. Нельзя исклю-' чить, что участок Б представляет собой фрагмент существующего в геноме D. melanogaster варианта гена 18S РНК, кодирующего молекулу РНК с измененными петлями.

В пользу представлений о существовании вариантов 18S РНК могут также служить следующие наблюдения. Замена А на Т в районе А. а также делеция одного из пяти Т и инсерция С в районе Б (Рис. 8) приближают последовательность D. melanogaster к таковой у многих других исследованных эукариот.

В районе В на 3'-конце псевдогена наряду с единичными нукле-отидными заменами обнаруживаются^ замены одновременно двух соседних нуклеотидов. а также множество замен на двух участках протяженностью 5 и 7 нуклеотидов. так что общее число нуклеотидных замен достигает 30 и дивергенция равна 7.5%. Делеция 14ти нуклеотидов затрагивает участок высококонсервативного в эволюции эукариот района 18S РНК. Повреждения распределяются равномерно по шпилькам и петлям. Участок В можно рассматривать скорее как район погибшего, не подвергающегося селекции -'гена, накопившего достаточно много замен, т.е. район собственно псевдогена. Его возраст согласно грубой оценке составляет около 2 млн. лет, т. е. близок времени существования вида. '

Таким образом, не-только общее количество замен, но и их положения в районах, соответствующих шпилькам и петлям, распреде- • ляются крайне неравномерно по длине псевдогена. Неравномерность распределения нуклеотидных замен и повреждений по длине псевдогена (по крайней мере 50-кратные различия для А и В участков) скорее всего объясняются рекомбинатной природой исследуемой последовательности, образовавшейся в результате обменов генными сегментами между испорченной копией рДНК вне рибосомного кластера и нормальными копиями рДНК в составе- рибосомального кластера. Вероятно, наряду с согласованной эволюцией генов рДНК в-рибосом-ном кластере происходит дивергенция последовательностей, сопровождающаяся отбором преимущественно тех вариантов, которые не приводят к нарушению вторичной структуры РНК.

-

ВЫВОДЫ.

1. В фаге PI клонирован протяженный фрагыс-нт (70-100 г.п.к.; генома из района 19В Х-хромосомы D. melanogaster, вклачаздий ге;. аннексина X (2 т.п.н. ) и несколько тандемно повторявшихся единиц размером 7.8 т.п.н. Определение нуклзотадной последовательности одной из единиц тандемного повтора показало, что она содержит 3'-фрагмент гена аннексина X и участок с протяженной открытой рамкой трансляции с 83% аминокислотной гомологией ннтермедиатной цепи цитоплазматического динеина крыси. Тандемн^л повтор 7.3 т.п.н.. выявленный у D. melanogaster. отсутствует в-остальных видах зт'ой подгруппы, что указывает на его недавнее зволюциогжос происхождение. Совпадение района локализации кластера и супрес-сора гена Glued, кодирующего псяипептид 150 кДа динеинового комплекса, может указывать на наличие в исследуемом кластере ло крайней мере одной копии гена цнтермедиатных цепей динеина.

2. Ген аннексина"'X состоит из 4 зкзонов, 1 экзон кодирует четыре Н-концевых аминокислоты. 2 экзон - остальную часть вариабельного н-концевого домена к 3 консервативных повтора анноне;: -нов. 3 и 4 зкзоны кодируют четвертый повтор. Полокения 2 и 3 :штронов аннексина X дрозофилы совпадают с положениями'10 и 12 нитронов генов акнексинов позвоночных, что указывает на существование аналогичных интронов в аннсксине у общего предка насекомых и млекопитающих.

3. Обнаружена экспрессия гена аннексина X в эмбриональных клеточных линиях D. melanogaster. Количество транскрипта ке меняется при добавлении экдистерона к культурам клеток, чувствительных к гормону.

4. Определена нуклеотидная последовательность псевдогена 18S рРКК, расположенного в гетерохроматине Х-хромосомы вне .кластера рДНК. Резкая "неравномерность распределения нуклеоткдных замен, шеерций и делеций по длше. псевдогена расматркзается как результат последовательных актов рекомбинации между функциональными вариантами генов рРНК. находящимися в кластере и псевдогеном. расположенным вне кластера рДНК. Наблюдаемое явление является экспериментальным свидетельством коррекции последовательностей рДНК. которая, как цюдполагается. определяет "согласованную эволюцию" генов рРНК. • • . .

Список работ, опубликованных по теме диссертаций; р

1. Е.В.Беневоленская, Г.Л.Коган, Д.Филипп, И.П:Арман. В. А. Гвоздев. Изменчивость 'генов .рДНК, обнаруживаемая в результате анализа нуклеотидной последовательности псевдогена у Drosophiia melanogaster. Генетика, 1994, т.30, N 3, с.25-32.

2. Е.В.Беневоленская. Кластер генов аннексина X Drosophiia melanogaster.' Генетика, 1994, т.30 (приложение), с. 15.•

3. Е.V.Benevolenskaya, D.I. Nurmlnsky, V.A.Gvozdev.Structure . of the Drosophiia melanogaster annexin X gene. DNA & Cell Biol., 1995', v. 14, N 4, p. 349-356.

4.- G.L.Kogan, E.V. Benevolenskaya and V.A. Gvozdev. HeterochfomaUc\ region In Drosopfitla melanogaster genome carrying Stellate genes and rRNA pseudogene. 13th European Drosophiia Research Conference. Crete, Greece, 1993, Abstract book.

• 5. V.Gvozdev, E.Benevolenskaya, • G.Kogan, D.Iiurmlnsky, Y.Shevelyov. Heterochromatic region in D.melanogaster X-chromosome carrying Stellate genes, mobile elements and rRNA ■ pseudogene,- 35th-Annual -Droscphi la Research Conference. ChiGago,-1994, Program and Abstract Volume,-p.338.

6. .E.V. Benevolenskaya and . V.A. Gvozdev. Molecular organization of the annexin X gene cluster in Drosophiia melanogaster. XXIe Forum des Jeunes Chercheurs Reims. .Reims, 1994, Abstract book.- 7. E.Benevolenskaya, D. Nurmlnsky, V. Gvozdev. The annexin X gene is localized adjacent to species specific amplified dynein subunit gene in Drosophiia melanogaster. 36th Annual Drosophiia Research Conference. Atlanta, 1995, Program and Abstract Volume.

Подписано к печати .199 5 г.

Отпечатано на ротапринте в Формат (ргмаги 30x42/4 Производственном комбинате ОбьемЗ(Ь п.>. ; Литературного фонда - Зак. ^^.Тир. 100 :