Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование иммуномодулирующих свойств синтетических бактериальных гликопептидов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование иммуномодулирующих свойств синтетических бактериальных гликопептидов"

российская академия наук

ордена трудового красного знамени институт биоорганическои химии ИМ. м.м.шемякина И ю.а.овчинникова

На правах рукописи УДК 612.112.94.017.1.086.83 577.112.6.083.3

ГУРЬЯНОВА Светлана Владимировна

исследование иммуномодулирупцих свойств синтетических бактериальных гликопептидов

03.00.03' Молекулярная биология

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

москва - 1993

Работа выполнена в Институте Оиоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Научный руководитель :

кандидат химических наук Т.М. Андронова

Официальные оппоненты :

Доктор медицинских наук, профессор Е.Л.Насонов Доктор химических наук Л.М.Гинодман

Ведущая организация :Институт иммунологии МЗР

на заседании Специализированного совета Д 002.35.01 при

Институте Оиоорганической химии им. М.М.Шемякина и

Ю.А.Овчинникова РАН по адресу : 117871, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Оиоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Защита состоится

1993 г. в час.

Автореферат разослан

Ученый секретарь

специализированного совета ИБХ РАН кандидат химических наук

В.А.Несмеянов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблем. Современный уровень развития биотехнологии, генной инженерии, молекулярной и клеточной иммунологии позволяет модулировать иммунный ответ с помощью природных и синтетических молекул - биорегуляторов . Среди низкомолекулярных иммуномодуляторов н-ацетилглюкозаминил-(0 1-4)-н-ацетилмурамил-ь-аланил-о-изоглутамин (gmdp) привлекает особое внимание исследователей. С одной стороны, набор модифицированных производных gmdp является хорошим инструментом для изучения механизмов активации иммунокомпетентных клеток. С-другой стороны, использование гликопептидов, избирательно активирующих различные популяции иммунокомпетентных клеток (макрофаги, в- или т-клетки), позволяет решить ряд практических задач: I) коррекцию иммунопатологии, связанных с нарушением функций различных популяций иммунокомпетентных клеток, 2} выбор подходящих адьювантов в процедуре иммунизации in vitro. Процедура иммунизации in vitro еще не достаточно широко используется в иммунологии; обнаружение эффективных адьювантов с направленным биологическим действием позволит заметно расширить границы использования данной методики в медицинской практике. В связи с этим возникает необходимость исследовать иммуномодулирующую активность в ряду глкжозаминилмурамилдипептидов, 'а также попытаться приблизиться к пониманию механизма их действия.

Цели и задачи работы . Представляемая работа является составной частью широкой программы по получению модифицированных аналогов gmdp и изучению их биологическойй активности, проводимой в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинниква. Целью настоящей работы являлось исследование иммуномодулирующей активности в ряду глюкозаминилмурамилпептидов.

Работа состоит из трех частей. В первой части была поставлена задача оценки иммуностимулирующего действия гликопептидов в первичном скрининге и выявления корреляции активности гликопептидов в тестах in vitro и in vivo.

Вторая часть посвящена исследованию эффекторного действия gmdp в процессе активации в-клеток, а именно зависимости функциональной активности гликопептидов от наличия на клеточной поверхности рецепторов к липополисахариду (lps) и дифференцировочных маркеров в- лимфоцитов ьуъ 5, характеризующих степень их зрелости.

В третьей части изучается адыовантная активность gmdp и аналогов в процедуре иммунизации in vitro с целью получения моноклональных антител.

Научная новизна и практическая цэнность работы. В результате проделанной работы выявлены наиболее активные аналоги, обладающие максимальным адьювантным эффектом и низкой пирогенной активностью. Впервые показано, что модификация пептидной части гликопептидов позволяет получать соединения с направленным биологическим действием на определенные звенья иммунной системы;

Показано, что проявление иммуностимулирующей активности гликопептидов не зависит от наличия на клеточной поверхности рецепторов к lps и обнаруженный синергизм действия gmdp и lps является следствием стимуляции гликопептидом активированных в-лимфоцитов.в процессе изучения эффекторного влияния gmdp и аналогов на спленоциты xid- мышей, лишенные маркера Lyb 5, получены новые данные о зависимости иммунологической активности гликопептидов от наличия на клетках дифференцировочных антигенов, появляющихся на определенной стадии зрелости в-лимфоцитов.

Впервые продемонстрирована возможность использования gmdp и его липофильного аналога в качестве адыованта в иммунизации in vitro для получения моноклональных антител без предварительной иммунизации in vivo.

Апробация полученных данных. Результаты настоящего исследования были представлены на I Всесоюзном Иммунологическом Съезде (Сочи, 1989), на 7-ом СССР-ФРГ симпозиуме по химии пептидов и белков (Дилижан, 1989), на ucla -симпозиуме (Фриско, 1990).

Объел работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы из 132 наменований. Работа изложена на страницах, содержит рисунков и таблиц .

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Гликопептиды клеточных: стенок бактерий привлекают в последние года пристальное внимание исследователей как противоопухолевые средства и компоненты синтетических вакцин. Интенсивное развитие исследований гликопептидов клеточных стенок началось с синтеза н-ацетилмурамшг-ь-аланил-и-изоглутамина (mdp), который оказался минимальной структурной единицей пептвдогликанов клеточных стенок бактерий, обладающих такой же степенью адьювантной активности, что и целые микобактерии в полном адьюванте Фрейнда. mdp обладает широким спектром биологических эффектов : адыовантная активность, стимуляция неспецифической резистентности к бактериальным и вирусным антигенам, сомногенный эффект. Всеми перечисленными активностями обладают глюкозаминил-мурамилдипептида - дисахаридсодержащиа гликопептиды, отличающиеся от mdp наличием остатка n-ацетилглюкозамина, присоединенного к к-зцетилмурзмовой кислоте. Оказалось, что глюкозаминилмурамил-дашептид (gmdp) обладает рядом преимуществ по сравнению с mdp : он менее пирогенен, менее токсичен и проявляет большую противоопухолевую и адьювантную активность. Разработанный в ИБХ им М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова оригинальный, способ синтеза gmdp позволяет получить широкий набор его аналогов как с целью выяснения связи структуры и функции, так и разработки новых перспективных препаратов.

В связи с этим в настоящей работе исследованы иммуномодулиру-ющие свойства gmdp и ряда его производных с целью определения наиболее активных аналогов, преимущественно активирующих различные популяции иммунокомпетентных клеток, а также выявления возможной корреляции активности гликопептидов в тестах in vitro и адьювантным и пирогенным эффектом in vivo.

Для изучения механизма активации клеток гликопептидами исследовано их иммуностимулирующее влияние на клетки мышей, лишенных рецепторов к lps и дифференцировочных маркеров lyb 5.

Кроме того, показана возможность использования gmdp и его синтетического стероильного аналога gmdp—(Lya)-st. в качестве

адыованта в иммунизации in vitro с целью получения моноклональных антител.

Г. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНМУНОМОДУЛИРУЮЩЕИ АКТИВНОСТИ ТЛЮКОЗШИНИЛМУРМИЛПЕПтОВ В ТЕСТАХ in vivo И in vitro.

Для проведения работа по выявлению наиболее активных аналогов gmdp и установления связи между их структурой и функцией были использованы производные gmdp , синтезированные в лаборатории химии: пептидов ИБХ им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова.

На рис. г и в табл.1 представлены общие структурные формулы исследованных: гликопептидов и заместители боковой цепи.

GHz0H

R30

H3U'

-и

NHCOGH3

сн3

I

• CH-v

L

tt I

.N-

Л

■CH ^ I .

CHi-.

CH,

(1-16)

HO

CH,0H

«JH

СН/Ш1

H

NHCOCHj

IK

0

(J,

CHiOH CH-OH

' Л À^—K

он /ГХоДО Ьн.ои

NHCUCHj ^G-GHGO-AU-bîîiuir'J-R1

NHCOCH3

NHCOCH3

HjC-CHCO-Aïa-ïïGlu(R )-л

(17-19)

РИС. 1.

Таблща 1. Заместители боковых цепей синтетических гликопептидов. .

N Соединение »1 *2 «3

1. ГОР НН2 -он н

2. СМОР ИН2 -он С>1сНАс

3. МОР-ОВи ос4н9 -НН2 н

4. СМОР-ОВи 0С4Н9 -1,Н2 С1сНАс

5. СЬГОР-Ьуэ КН2 -Ьуэ С1сИАс

6. К0Р"Ьуз(31) кн2 -Ьуз(31) н

7. смор-ьуз(Бг) МН2 -ьус(31) С1сЫАс

8. СМОР(Ы.)* ш2 -он С1сНАс

9. СМОР—ЗЬ-18 он -ьуз(Бг) С1сНАс

10. СМОР-4Ь-18 он Iе Бг-ьуз-ш^ сгсИАс

11. СМОР-СерЬ. кн2 -Кефалин** С1сЫАс

12. СМОР-Ас1 НН2 -ИН-А(1 С1сЫАс

13. СМОР-С1и-Тгр нн2 -С1и-Тгр С1сИАс

14. СМ0Р-(0Вг1)2 ОВг1 —0Вг1 С1сЫАс

15. СМОР- АСЭР Ш2 -А1а-ОС3Н502(Ра1ш)2 С1СНАС

16. СМБР-ОН он - он С1сИАс

17. (СНОР-ЬуБ)2 нн2 - ЬуБ -

18. (СМБР-0Н)2 он - он -

19. (СМОР-Ьуз(31))2 НН2 - Ьуэ^) -

* Аналог СМОР С ЬА1а и Х.С1и-ЫН2 он

** -ЫН-СН2-СН2-0-Р-0-СН2-СН-С!^ ОСОС^д Н21 ° °С0С15Н21

Для изучения биологической активности гликопептидов проведен ряд тестов in vivo (адыэвантный и пирогенный эффект) и in vitro (тесты клеточно-опосредованных реакций). Результаты исследований представлены в таблице 2. Необходимо отметить, что целью настоящего исследования являлся первичный скрининг активности гликопептидов в узком диапазоне доз для обнаружения соединений, избирательно активирующих различные популяции иммунокомпетентных клеток, а также выявления возможной корреляции активности гликопептидов в тестах in vivo и in vitro. Значения индексов стимуляции, указанные в таблице 2, были получены в ходе экспериментов, в которых каздая концентрация гликопептидов была представлена в трех повторностях с ошибкой эксперимента р < о.об.

Адьювантная активность оценивалась по способности анализируемых соединений повышать титр антител к овальбумину в сыворотке крови мышей линии balb/c. Грушу мышей из 5 животных иммунизировали внутрибрюшинно, вводя по 25 мкг овальбумина в 0.2 мл физиологического раствора одновременно с различными дозами гликопептида. Повторную иммунизацию на 28-е сутки проводили внутрибрюшинно половинной дозой антигена в физ. растворе. Антисыворотку получали через 7 суток после последней иммунизации и тестировали методом твердофазного иммуноферментного анализа (Elisa). Согласно полученным данным (табл.2), наибольшей адьювантной активностью в указанном диапазоне доз обладали следующие соединения: (gmdp-lys)2 (17), gmdp-3l-is (э), gmdp-oh (16).

Пирогенность изучаемых гликопептидов исследовали на кроликах породы шиншилла весом 2.0 - 2.5 кг. Пептиды вводили внутривенно, измерение температуры проводили ректально с интервалом I час. Пирогенным считали препарат, повышающий температару тела кролика более 0.4°с. Результаты представлены в таблице 2, пирогенные дозы обозначены знаком +. Апирогенными при дозах 0.1 - 5.0 мг/кг оказались соединения: mdp-obu (3), gmdp-obu (4), gmdp-ll (8), ghdp-Ceph. (11), gmdp-Ad (12), gmdp-oh (16).

Известно, что активация антигеном иммунной системы, приводящая к синтезу антител, является сложным, многостадийным процессом и включает в себя взаимодействие антигена с

Таблица 2. Адьювантное действие гликопептидов in vivo и in vitro.

N Соединение Стимуляция гуморального ответа на овальбумин Пирогенность Влияние гликопептидов в РБТЛ Продукция макрофагами IL-1

Доза мг/кг Индекс Доза мг/кг Эффект Доза мг/кг Индекс Доза мкг/мл Индекс

Без мито гена В присутствии

LPS Con А

1 MDP 0.005 0.05 0.5 5.0 50 0.7 2.7 1.8 3.4 2.5 0.01 0.1 0.2 + + + 0.5 5.0 50 500 1.0 1.2 1.2 1.0 1.0 1.2 1.5 0.9 0.8 1.0 1.1 1.0 0.5 5.0 50 .2.0 2.7 1.6

2 GMDP 0. 005 0.05 0.5 5.0 50 1.3 2.7 3.6 5.1 1.9 0.01 0.02 0.1 + 0.5 5.0 50 500 1.4 1.5 1.5 1.2 1.2 1.4 1.6 0.8 0.9 1.0 1.1 1.1 0.5 5.0 50 3.2 2.9 1.6

3 MDP-OBU 0.05 0.5 5.0 1.4 3.2 3.5 1.0 5.0 - 0.5 5.0 50 1.1 1.6 1.8 1.2 1.4 1.5 1.0 1.0 1.1 0.5 5.0 50 1.0 1.0 7.2

4 GMDP-OBu 0.05 0.5 5.0 2.6 3.0 3.7 1.0 5.0 - 0.5 5.0 50 1.3 1.7 1.1 1.5 1.4 1.2 1.4 1.1 1.0 0.5 5.0 50 7.6 4.3 1.3

5 GMDP-Lys 0.05 0.5 5.0 6.3 2.3 4.8 0.01 5.0 + + 0.5 5.0 50 1.6 1.9 1.3 1.4 1.6 1.9 1.0 1.1 1.1 0.5 5.0 50 2.1 8.9 1.5

Продолжение Таблицы 2.

6 МПР-Ьуэ(ЭЬ) 0.05 .0.5 5.0 4.4 4.5 4.7 N0 0.5 5.0 50 1.8 1.6 2.0 1.5 2.1 1.3 1.2 1.1 1.2 0.5 5.0 50 3.1 5.2 4.6

7 СМОР-Ьуэ (БО 0.05 0.5 . 5.0 4.5 4.5 5.0 0.01 0.1 1..0 + + 0.5 5.0 50 1.6 1.8 2.4 2.1 2.0 2.1 1.3 1.2 1.2 0.5 5.0 50 3.0 7.3 •7.1

8 С№ЭР(Ы.) 0.05 0.5 5.0 1.0 1.0 1.1 1.0 5.0 - 0.5 5.0 50 1.0 1.0 1.0 1.0 1.1 1.1 0.9 1.0 1.0 0.5 5.0 50 1.4 1.5 0.9

9 СМОР-ЗЬ-18 0.05 0.5 5.0 1.0 9.0 4.8 0.1 1.0 2.0 + + 0.5 5.0 50 1.2 2.0 0.8 1.1 1.5 1.1 1.1 1.0 1.0 0.5 5.0 50 7.2 6,2 *

10 СМОР-4Ь-18 0.05 0.5 5.0 3.0 1.0 1.0 0:1 1.0 + 0.5 5.0 50 1.1 1.1 0.9 0.9 1.0 * 1.0 1.0 0.8 0.5 5.0 50 2.3 1.2 *

11 СМБР-СерЬ. 0.05 0.5 5.0 4.0 6.5 1.7 0.1 - 0.5 5.0 50 1.0 1.0 0.9 1.2 1.5 0.8 0.9 1.0 0.7 0.5 5.0 50 1.0 1.5 1.6

12 вМОР-Ас! 0.05 0.5 5.0 2.0 1.8 0.6 0.1 5.0 - 0.5 5.0 50 1.8 1.3 1.0 1.2 1.3 0.9 1.0 1.1 1.0 0.5 5.0 50 1.2 3.0 2.1

13 СМОР-С1и--Тгр 0.05 0.5 5.0 1.6 3.9 0.9 0.01 0.1 1.0 + 0.5 5.0 50 1.0 1.1 1.1 1.1 1.0 1.2 1.0 1.4 2.0 0.5 5.0 50 1.9 1.3 1.3

14 смбр-(0в21) 0.05 0.5 5.0 1.1 2.3 3.4 0.2 1.0 + 0.5 5.0 50 1.2 2.0 1.5 2.4 1.8 0.9 1.1 1.2 1.1 0.5 5.0 50 6.2 9.0 2.1

15 игор-асср 0. 05 0.5 5.0 1.0 4.2 4.2 0.1 + 0.5 5.0 50 1.9 2.2 1.4 1.5 1.4 0.9 1.0 1.1 1.2 0.5 5.0 50 4.0 2.2 3.1

16 смбр-он 0.05 0.5 5.0 2.0 3.5 8.0 0. 01 0.1 4.0 0.5 5.0 50 1.6 1.4 1.0 1.6 1.7 1.2 1.2 1.2 0.9 0.5 5.0 50 3.3 3.1 1.4

17 (СМБР-ОН) 0.05 0.5 5.0 2.1 2.3 4.0 1.0 5.0 - 0.5 5.0 50 1.3 1.2 1.3 1.8 2.7 2.0 1.1 1.1 1.1 0.5 5.0 50 3.6 1.0 0.8

18 (смор-ьуэ) 0.05 0.5 5.0 2.0' 10.5 1.3 0. 02 0.2 + 0.5 ' 5.0 50 1.1 0.9 0.8 1.7 1.5 1.1 0.8 0.9 1.0 0.5 5.0 50 5.3 3.0 1.7

19 (смор-ьуз(бь)) 0. 05 0.5 5.0 3.5 : 3.5 3.0 0.02 0.2 + + 0.5 5.0 50 1.0 0.9 0.9 1.3 1.3 0.9 1.1 1.0 0.9 0.5 5.0 50 3.4 1.6 0.9

20 01и-Тгр 0.005 0.05 0.5 1.3 3.0 1.0 n0 0.5 5.0 50 1.1 1.2 1.5 1.0 0.9 1.3 1.0 1.2. 2.4 0.5 5.0 50 2.0 1.1 1.2

* Наблюдалось токсическое воздействие на клетки.

макрофагами, дальнейшую презентацию процессированного . антигена макрофагами и продукцию цитокинов, активирующих различные популяции т- и в-клеток, их кооперативное взаимодействие, секрецию лимфокинов. Для того, чтобы можно было охарактеризовать гликопептиды по их иммуномодулирующей активности в первичном скрининге, а именно показать, какое из звеньев иммунной системы может оказаться основной мишенью для проявления активности гликопептидов мы выбрали следующие тесты: i) реакция бласттранс-формации (РБТ) спленоцитов мышей линии balb/c в присутствии в-клеточного митогена lps и активатора т-клеток сопА; 2) индукция перитонеальными макрофагами мыши секретируемого il-i.

Для проведения реакции бласттрансформации спленоциты мышей линии balb/c иинкубировали 48 часов в присутствии гликопептидов и митогенов: липополисахарида (lps), активирующего популяцию в-клеток, и конканавалина A (con а), обладающего в низких концентрациях митогенной активностью по отношению к т-лимфоцитам. Диапазон концентраций, в котором ожидалось максимальное проявление активности гликопептидов, был определен заранее путем тестирования небольшого количества аналогов и составил 0.5; 5.0; 50 мкг/мл. Митогены были взяты в субоптимальных количествах, выявленных в результате предварительных исследований; конечная концентрация для lps е. coli 055-в5 (Difco) составила 5 мкг/мл и для con a (sigma) - 2 мкг/мл. О характере воздействия гликопептидов судили по их способности оказывать модулирующее действие на включение клетками меченного тритием [Зн]-тимидина. Из результатов, представленных в таблице 2, следует, что максимальным комитогенным эффектом с lps обладают соединения:

(GMDP-0H)2 (17), GMDP-(OBzl)2 (14), GMDP-Lys(St) (7), MDP-Lys(St) (6), причем, соединения GMDP-(OBz1)2, GMDP-Lys(St) И MDP-Lys(St)

имеют ярко выраженную собственную митогенную ативность; тогда, как, (ghdp-oh)2 не проявляет в отсутствие митогена значительного стимулирующего влияния. Выраженную комитогенную активность с сопа имеет единственный гликопептид - gmdp-giu-тгр (хз). Необходимо отметить, что гликопептид gmdp-giu-тгр не имеет собственного митогенного эффекта, не проявляет активности в тесте РБТ в присутствии lps и имеет незначительный индекс активации

перитонеальных макрофагов. Таким образом, можно сделать предположение о возможной: специфичности действия gmdp-giu-тгр на т-клеточную популяцию.

Влияние препаратов на макрофагальное звено иммунной системы определяли по способности ■ гликопептидов индуцировать секрецию il-i перитонеальными макрофагами мшей линии balb/c. Интенсивность секреции растворимого il-i оценивали по количеству включения меченного [Зн]-тимидина тимоцитами, предварительно инкубированными с супернатантами активированных макрофагов, содержащими il-i. Максимальной активностью в индукции макрофагами секретируемого il-i обладали соединения: gmdp-(obzí)2 (14),

GMDP-Lys (5), GMDP-Lys(St) (7), GMDP-OBu (4), GMDP-3L-18 (9),

mdp-obu (3), причем первые три аналога характеризуются также высокой активностью в РБТ в присутствии в-клеточного митогена -

lps.

На основании полученных данных можно сделать заключение, что модификация пептидной и углеводной части gmdp позволяет получать гликопептиды, обладающие активностью в БЕГ только в присутствии т-клеточного митогена (gmdp-giu-тгр), проявляющие максимальное действие на активированные в-клеточным митогеном лимфоциты ((gmdp-oh)2, mdp-Lys(st)) и преимущественно активирующие макрофаги (gmdp-3l-18, . gmdf-obu, mdp-obu). Причем следует подчеркнуть, что практически все гликопептиды (за исключением

GMDP-LL, GMDP-4L—18 И GMDP-Gln-Trp) В ТОЙ ИЛИ ИНОЙ СТвПвНИ

обладают активностью во всех избранных тестах; тогда как только гликопептид gmdp-giu-тгр претендует на избирательное действие на т-клеточную популяцию, что требует дальнейшего исследования. Таким образом, первичный скрининг позволяет дифференцировать гликопептиды по направленности их иммуностимулирующего действия на определенные популяции иммунокомпетентных клеток.

Изучение иммуномодулирупцего действия серии гликопептидов показывает отсутствие количественной корреляции между адьювантным эффектом in vivo и индукцией il-i макрофагами in vitro, точно так же отсутствует связь между величинами комитогенного эффекта гликопептидов с lps на клетки селезенки in vitro и стимуляцией гуморального ответа in vivo. Пирогенный эффект, обнаруженный'для

некоторых гликопептйдов, также невозможно связать ни с продукцией iL-i, ни с опосредованным влиянием препаратов на в- и т-клетки. Необходима отметить, что соединения, не обладающие адьювантным эффектом in vivo, характеризуются также низкими индексами стимуляции и в тестах in vitro.

Таким образом, наличие большого набора модифицированных производных gmdp, среди: которых одни могут обладать специфическим действием, другие обладают широким спектром биологической активности,. является уникальным инструментом для изучения механизмов и: способов активации иммунокомпетентных клеток.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗАВИСИМОСТИ АКТИВИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ГЛИКОПЕПТИДОВ ОТ НАЛИЧИЯ НА КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ РЕЦЕПТОРОВ К lps И МШРЕНЦИРОВОЧННХ МАРКЕРОВ lyb5.

В первой части было показано, что максимальный эффект gmdp и большинства его аналогов в тесте РБТ наблюдается на спленоцитах взрослых мышей при совместном введении с липополисахаридом (lps). Поскольку lps считается в-клеточным митогеном, можно -полагать, что; как и в случае mdp

(V.Souvannavong, et al., 1988), ДЛЯ gmdp В-КЛеТКИ ЯВЛЯЮТСЯ

кандидатами: на клетки - мишени, хотя не исключено опосредованное влияние активированных макрофагов на в-клетки.

Из множества гипотез, объясняющих причину комитогенного эффекта gmdp с lps, me решили рассмотреть возможность проникновения gmdp в клетку с помощью рецептора к липополисахари-ду. Известны случаи, когда низкомолекулярные соединения, значительно отличающиеся по химической структуре от компонентов, составляющих липополисахарид, проникают в клетку, связывась с рецептором к lps. Например, дитерпен таксол, выделяемый из Taxus Brevifoiia, обладает иммуностимулирующим действием лишь на те клетки, на которых имеется рецептор к lps (Manthey c.l. et ai.,i992), т.е. реактивность на данный стимулятор связана со способностью клеток отвечать на lps. Таким образом, в случае отсутствия эффекторного действия gmdp на клетки, лишенные

15

10

♦10 ерш

\ v/ ВАЬВ/С

1

щ

+ЬРЭ +РгоЫп А

□контроль е~3оьшр-и. помор езомор-^»(51)

•10 ерш

20 15 10 5 0

□ Контроль ЕШаМПР-Ч. ЕЛ ОИОР Ш\ ОЫПР-^рДО)

СЗН/Не1

+Рго1е!п А

Рис. 2. Иммуностимулирующее действие гликопептидов в тесте РБТ спленоцитов мьшей.

рецептора к lps, можно будет предполагать, что один: из способов проникновения gmdp в в-клетки: осуществляется с помощью рецептора к LPSr как- это наблюдается с таксолом.

Поэтому, с целью изучения возможной зависимости иммуностимулирующего влияния гликопептидов от процесса активации спленоцитов липополисахаридом мы. решили: проверить, действие гликопептидов на клетки: мышей:, лишенных., рецептора к lps. у мышей линии сзн/нел всдедствик мутации в 4-й хромосоме отсутствует рецептор к lps на макрофагах: к в-лимфоцитах. В низких концентрациях lps спленоциты * к макрофаги, этой: линии, мышей: не связывают липополисахарид» В качества, активатора в-клеток, лишенных: рецепторов к lps использовался Protein, а, который, как известно, связывается с поверхностными igG. На рисунке z представлены результаты исследования иммуностимулирующего действия гликопептидов в тесте РШТ на спленоциты мышей линии balb/c и сзн/нел в присутствии lps

(5 мкг/мл) и Protein А (25 мкг/мл).

Полученные данные показывают, что gmdp и его липофильный аналог gmdp—st обладают ко стимулирующим эффектом с Protein а в тесте РШТ спленоцитов мышей линий balb/c и сзи/HeJ и с lps только для мышей линии balb/c, что доказывает независимость проявления действия гликопептидов на в-клетки от наличия на них рецепторов к

lps.

Следующим этапом в определении природы активирующего действия gmdf на в-клетки явилось исследование обнаруженного комитогенного эффекта gmdp с lps методом конкурентного ингибирования с оптимальной дозой lps. Полученные данные представлены в таблице з.

Сущность метода заключается в том, что оптимальная доза lps в РБТ спленоцитов обеспечивает максимальное включение [Зн]-тимидина культурой клеток и превышение этой дозы приводит уже к уменьшению включения меченого тимидина. Если добавление gmdp вызывает такой же эффект, это означает, что в системе происходит конкурентное влияние gmdp и lps на одни и те же центры клеточной поверхности и как следствие этого ингибирование действия lps» В таком случае (т.е. в случае конкурентного взаимодействия) величина к в таблице з должна быть меньше 100%.

Как видно из полученных данных, значение к для исследованных доз gmdp больше 100%, т.е. отсутствует и простое аддитивное сложение эффектов влияния lps и gmdp. Следовательно, в данном случае существует синергизм в действии lps и гликопептида на клетки селезенки. Необходимо отметить, что представленные - в таблице з

Таблица з. Зависимость интенсивности реакции бласттрансфор-мации спленоцитов от концентрации gmdp в присутствии оптимальной

дозы lps*.

Доза gmdp,мкг/мл „ 3 ** Включение [ н ]тимидина , имп/мин к ,н

0 10 027+195 а

50 1 722+24 В

13 440+298 С 114

100 1 314+117 В

13 987+284 с 123

500 1 132+81 в

16 045+1130 с 144

Оптимальная доза lps для клеток селезенки 50 мкг/мл

Приведены данные, полученные в присутствии lps (а),

с

gmdp(в) и при их совместном присутствии (с). к = + *100%

результаты подтверждают вывод о независимости проявления активности гликопептидов на в-клетки от наличия на них рецепторов к lps, полученный во время первого этапа исследований. Не удивительно, что PET под воздействием гликопептидов заметно стимулируется в присутствии lps, поскольку, как было показано

ранее (v.souvannavong, et ai., 1988), mdp преимущественно стимулирует активированные в-клетки, и б нашем случае можно рассматривать lps в качестве активатора в-клеток.

Выявленный синергизм действия lps и gmdp, отсутствие аддитивного эффекта и конкурентного взаимодействия позволили сделать предположение о взаимосвязи процессов активации клеток липополисахаридом и гликопептидами. Известно, например, что lps является активатором многочисленных биохимических процессов в клетке, а также стимулирует экспрессию различных поверхностных белков, в том числе маркеров дифференцировки в-лимфоцитов группы в-22о (к.s.Hatchcock,et ai., 1992), обеспечивающих взаимодействие лимфоцитов в процессе созревания с экзогенными лигандами. Поэтому, не исключено, что взаимодействие гликопептидов осущест вляется с поверхностными структурами, появляющимися на клеточной мембране вследствие активации клеток липополисахаридом.

Ранее (Adam A., Lederer Е. , 1981) бЫЛО ВЫСКаЗЭНО предположение, что mdp, обнаруживаемый в крови как продукт распада кишечной микрофлоры, выполняет роль витамина, воздействуя на иммунекомпетентные клетки. Известно, также, что в созревании в-клеток решающую роль играют экзогенные лиганды, тогда как появление т- клеточных маркеров обусловлено, в основном, воздействием эндогенных антигенов (vos q., et ai., 1992). Таким образом, разнообразие в-клеточных маркеров зависит не только от стадии зрелости в-лимфоцитов, но и от характера экзогенных лигандов, появляющихся в крови организма после его рождения. Так, например, было показано, что в-лимфоциты мышей, содержащихся в стерильных условиях, лишены многих функций, свойственных лимфоцитам нормальных мышей и по своим свойствам соответствуют лимфоцитам неонатальных мышей (vos q., et ai., 1992). Учитывая, что действие гликопептидов проявляется в большей степени на клетках, подвергнутых предварительной активации (v.souvannavong, et ai., 1988), мы решили проверить, зависит ли процесс активации в-клеток гликопептидами от экспрессии дифференцировочных аллоантигенов, появляющихся в процессе созревания в-клеток в результате контакта с экзогенными лигандами.

Одним из основных дифференцировочных антигенов, который

появляется у части в-лимфоцитов мышей, содержащихся в нормальных условиях, является маркер Lyb s. в-лимфоциты, несущие маркер Lyb5, активируются иначе, чем лимфоциты. Lyb 5—. в-клетки Lyb 5* могут взаимодействовать с т-клетками~ не ' рестриктированным по мне способом, 'они: восприимчивы; к помощи со стороны макрофагов и фактора, замещающего т-клетки: (Купер М., Карни Д., Шер И., 1987). Клетки Lyb 5— ни одним из пречисленных свойств не обладают и требуют для их активации непосредственного контакта с т-клеткой. У нормальных мышей клетки, ьуъ з* появляются в процессе развития позднее (через 4-8 недель после, рождения), чем клетки Lyb 5-. У мышей свА/N с иммунным дефектом xid они вообще не появлятся. Наши предыдущие эксперименты по исследованию комитогенного эффекта гликопептидов и lps были поставлены на мышах, в-клетки которых относятся преимущественно к Lyb 5+ популяции, поэтому представляло интерес оценить влияние гликопептидов и lps на в-клетки Lyb 5~, характерные для в-лимфоцитов раннего этапа развития.

Реакция бласттрансформации спленоцитов мышей линии сва/н, проведенная в присутствии липополисахарида, показала отсутствие комитогенного эффекта у gmdp с lps h слабый эффект у GMDP-Lys(st) с вышеупомянутым митогеном (рис.з). Отсутствие влияния gmdp на спленоциты мышей сва/н нельзя объяснить толерантностью данной линии мышей к действию гликопептида, поскольку фагоцитоз макрофагами этой линии стимулируется так же, как и у мышей линии balb/c (табл.4). Следовательно, gmdp является стимулятором Lyb 5+ - субпопуляции в-клеток, характерных для нормальных, взрослых мышей. Слабый комитогенный эффект gmdp—Lys(st) с lps на спленоцитах xid-мышей можно объяснить наличием дополнительного взаимодействия гликопептида с клеточной мембраной за счет стероильного остатка.

Таким образом, изучение комитогенного эффекта gmdp с lps на мышиные спленоциты позволяет сделать два вывода.

Во-первых, было показано наличие активирующего действия гликопептидов на клетки мышей линии сзн/Hej, лишенные рецепторов к lps. Следовательно, проявление эффзкторного действия гликопептидов не зависит от наличия на клеточной поверхности рецепторов к

СИ контроль. Си амюр-н. ЕЗ омпр

ШШ ОМОР-1у1(81) ЁИ ОЬЮР-ОН (ОМОР-ОН)

2500 2000 1500 1000 500

о

ерш

СВА/Ы

1

^ЙДГ!

I 1 Контроль И ОМОР-^СЭ!)

ЕЕ] ОМОР-Ы.

^ ОЬШР-ОН

I ОНБР

3 (омор-оц)

Рис. 3. Иммуностимулирующее действие гликопептидов в тесте РБТ спленоцитов мышей.

Таблица 4. Влияние гликопептидов на изменение фагоцитарной активности макрофагов мышей .

Соединенние Доза, мкМ/мышь об20/юсклеток Индекс фагоцитарной * активности .

BALB/C CBA/N BALB/C СВА/Н

GMDP 1.44*10~2 0.85+0.04 1.98+0.06 2.9 3.0

GMDP-Lys(St) 1.44*10~3 1.07+0.07 2.49+0.08 3.7 3.9

GMDP-LL 1.44*10~2 0.61+0.05 1.42+0.06 2.1 2. 0

Контроль 0.29+0.03 0.65+0.02

*

Индекс фагоцитарной активности рассчитывался по формуле : с в присутствии стимулятора

d контроля

lps.

Во-вторых, результаты опытов с мышами balb/c и cba/n продемонстрировали отсутствие влияния gmdp на в-лимфоциты субпопуляции Lyb 5~, характерных для незрелых особей нормальных мышей и взрослых особей с мутацией xid (мыши. линии cba/n). Полученные данные свидетельствуют о том, что для проявления эффекторного влияния gmdp на в-лимфоцитах, последние должны пройти определенную стадию созревания, характеризующуюся наличием маркера Lyb 5. Таким образом, можно сделать вывод, "что процесс

активации клеток гликопептидами зависит от экспрессии даФФеренци-ровочных антигенов ьуь 5. Необходимо отметить, что детальное изучение зависимости процесса активации иммунокомпетентных клеток гликопептидами от степени зрелости в-лимфоцитов требует дальнейших исследований. '

3. ИЗУЧЕНИЕ АДЬЮВАНТНОИ АКТИВНОСТИ gmdp И АНАЛОГОВ В ПРОЦЕДУРЕ ИММУНИЗАЦИИ in vitro .

Метод получения моноклональных антител приобретает все большую популярность в различных отраслях иммунологии, медицины, экспериментальной биологии. В связи с этим становятся очевидными границы применения стандартной методики, основанной на иммунизации in vivo. Например, иногда не желательно применение адыовантов Фрейнда, кроме того, не всегда возможно получение ответа на антиген, который оказывает на организм животного специфическое (активирующее, токсическое) действие. Поэтому представляет особый интерес возможность проведения иммунизации клеток лимфоидной системы вне организма - in vitro. Кроме заманчивой перспективы получения антител к антигену, на который при иммунизации in vivo ответ получить затруднительно, изложенный способ иммунизации позволит приблизиться к пониманию процессов активации и стимуляции лимфоцитов к образованию антител. Направленно воздействуя на ту или иную популяцию клеток в системе in vitro, можно изучать характер взаимодействия между ними, учитывая ограниченное число компонентов системы.

В настоящей работе в качестве адыованта в иммунизации in vitro использовался gmdp и его синтетические аналоги-. gmdp—Lys(st) и mdp. Известно, что gmdp активирует в гораздо большей степени те клетки, которые предварительно подверглись действию какого-либо антигена; кроме того, gmdp не обладает поликлональной активностью. Именно это воздействие на активированные клетки и отсутствие поликлональной активности является основным преимуществом gmdp перед другими стимуляторами (такими, как липополисахарид, конканавалин а, фитогемагглютинин,

митогек из лаконоса американского), используемыми обычно в ИММуНИЗаЦИИ in vitro.

Для исследования влияния гликопептидов на процесс иммунизации клеток селезенки мышей in vitro с последующей гибридизацией с целью получения моноклонов к пептиду il-i 3 (16з-171) использовали три группы мышей. Первой группе мышей дважды внутрибрюшинно вводили антиген с полным адьювантом Фрейнда с интервалом ч недель. Вторую группу мышей иммунизировали один раз антигеном в полном адьюванте Фрейнда и через is дней выделяли селезенку. Третью группу мышей не иммунизировали .

После выделения селезенки суспензию спленоцитов разделяли на три части. С первой частью проводили гибридизацию без предварительной иммунизации in vitro; вторую часть спленоцитов иммунизировали in vitro антигеном в отсутствии гликопептидов; третью часть иммунизировали in vitro антигеном в присутствии гликопептидов. Гибридизацию иммунизированных in vitro спленоцитов с миеломными ¡слетками проводили через трое суток. Результаты исследований представлены в таблице 5.

Из приведенных в таблице данных можно сделать следующие выводы.

Во-первых, инкубирование лимфоцитов иммунизированных животных в среде, содержащей антиген и гликопептиды, перед гибридизацией повышает процент положительных клонов в несколько раз (i и 2 гр. мышей), причем, решающую роль оказывает не сам антиген, а сочетание его с адьювантом. Эти результаты согласуются с данными, согласно которым gmdp в несколько раз повышает уровень антителообразующих клеток как in vivo, так и in vitro при использовании в качестве антигена эритроцитов барана (Дозморов И.М. и др., неопублик. данные).

Во-вторых, из приведенных в таблице данных видно, что добавление н-ацетилглюкозаминила к молекуле mdp способствует значительному увеличению адьювантных свойств, присоединение остатка стеариновой кислоты также улучшает адьювантные свойства гликопептидов.

В-третьих, использование гликопептидов позволяет осуществить иммунизацию in vitro без предварительной иммунизации in vivo (з

Таблица 5. Количество положителыгл >,о;:.оз по результатам пврвЕЧнего скрининга.

irp.мышей ггр.мышей згр.мышей

Без иммунизации in vitro 24 % 8 % *

ИММуНИЗаЦИЯ in vitro- в

присутствии только антигена 27 % 7 % о %

Иммуьлзация in vitro в при-

сутствии антигена и аналогов:

HDP 40 % 19 % 6 %

GMDP 76 % 64 % 17 %

GMDP—Lys(St) 87 % 72 % 17 %

JL

Гибридизацию лимфоцитов неиммунизированных мышей: с миеломны-ми клетками не проводили .

гр. мышей). Процедура иммунизации in vitro с использованием gmdp заметно облегчает задачи экспериментатора так как: а) для иммунизации достаточно lug антигена ; ь) заметно сокращаются сроки эксперимента: вместо 2-9 недель, необходимых для иммунизации in vivo, достаточно 4 суток взаимодействия лимфоцитов с антигеном и gmdp перед слиянием; с) иммунизация in vitro позволяет защитить антиген от агрессивной физиологической среды организма. Кроме того, иммунизация in vitro с использованием gmdp может открыть новые перспективы в получении моноклональных антител человека без иммунизации всего организма. Молекулярный принцип действия gmdp остается еще невыясненным, но использование его как адьюванта в иммунизации in vitro позволит исследователям открыть новые возможности гибридомной технологии .

выводы

Первичный скрининг in vitro gmdp и его синтетических аналогов воляет дифференцировать гликопептиды по направленности их [уностимулирувдего действия на определенные популяции иммуно-петентных клеток.

На основе первичного скрининга in vitro выявлен гликопептид p-Giu-тгр, обладающий избирательным действием на т-клеточную уляцию.

Показано, что комитогенная активность гликопептидов является на клетках мышей, лишенных рецепторов к lps, и эруженный синергизм действия gmdp и lps является следствием 1дуляции гликопептидом активированных в-лимфоцитов.

Установлено, что процесс активации в-клеток глнжозаминил-змилдипептидом (gmdp) зависит от стадии созревания шфоцитов, характеризующейся наличием дифференцировочного сера Lyb 5.

!ыявлена возможность использования адьювантной активности gmdp по липофильного аналога gmdp—Lys(st) в процедуре иммунизации /itro без предварительной иммунизации in vivo для получения ислональных антител.

Основные результаты диссертационной работы изложены следующих публикациях:

1. Гурьянова С.В., Макаров Е.А., Мещерякова Е.А.. Иммуност мулирувдие свойства ГМДП и его аналогов . - Тезисы доклад Первого Всесоюзного Иммунологического Съезда, Сочи, 1989., t.i, стр. 297. .

2.Andronova Т.М.,Ivanov В.В., Heshcherykova Е.А., Guryanova S.V Ivanov V.T. Development of immunopotentiating systems f B-epitope of Plasmodium falciparum CS-protein. Abstracts of t UCLA Sumposia on Molecular and Cellular Biology. Frisco 199 p.233.

3. Мещерякова E.A., Гурьянова С.В., Макаров Е.А., Андронова Т.М Иванов В.Т.. Структурно-функциональное исследование глюкозамини. мурамоилпептидов. Влияние химической модификации л-ацетилглюкоз. минил-ы-ацетилмурамоилдипептида на его иммуномодулирукхщ свойства in vivo И in vitro. - ЕИООрг.ХИМИЯ , 1991, т.17, N. 9, стр. 1157-1165.

4. Гурьянова С.В., Андронова Т.М., Сафонова Н.Г.. Использоваш ы-ацетилглюкозамиши-ы-ацетлмурамил-ь-аланил-п-изоглутамина (D в качестве адьюванта в иммунизации in vitro с целью получею моноклональных антител к пептиду il-i р i (16з-171). Биотехнология. 1991, n. 12, стр.23-26.