Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние глюкозаминилмурамоилдипептида на биологическую активность цисплатина и фактора некроза опухолей-α
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Влияние глюкозаминилмурамоилдипептида на биологическую активность цисплатина и фактора некроза опухолей-α"
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК
ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова
На правах рукописи 4 Б О 2 Э
Симонова Мария Александровна
ВЛИЯНИЕ ГЛЮКОЗАМИНИЛМУРАМОИЛДИПЕПТИДА НА БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ЦИСПЛАТИНА И ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ-а
03 00 04 - Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва-2008
1 8 ^и2%г
003446029
Работа выполнена в лаборатории иммунохимии Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и 10 Л Овчинникова РАН
Научные руководители:
Доктор химических наук, профессор Владимир Андреевич Несмеянов
Кандидат биологических наук Татьяна Ивановна Валякина
Официальные оппоненты:
Член-корреспондент РАН, доктор химических наук Александр Габибович Габибов Доктор биологических наук Елена Владимировна Михальчик
Ведущая организация:
Российский Университет Дружбы Народов
Защита диссертации состоится 15 октября 2008 года в 10 00 на заседании Диссертационного Совета Д002 019 01 при Институте биоорганической химии им академиков ММ Шемякина и ЮА Овчинникова РАН по адресу 117997, ГСП-7, г Москва, В-437, ул Миклухо-Маклая, 16/10
С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН
Автореферат разослан /ее^'сг^се 2008 г
Ученый секретарь Специализированного совета, доктор физ -мат наук
ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Несмотря на безусловные достижения современной онкологии проблема повышения эффективности методов лечения злокачественных новообразований по-прежнему важна Приоритетными задачами являются поиск и разработка принципиально новых подходов, а также усовершенствование традиционных способов терапии онкологических заболеваний В настоящее время для лечения злокачественных новообразований применяется широкий спектр противоопухолевых химиопрепаратов и цитокинов В силу того, что химиопрепараты высоко токсичны для организма, наиболее перспективно их использование в сочетании с иммуномодуляторами Данный подход позволяет уменьшить дозы химиопрепаратов без снижения эффективности их действия К числу успешно применяемых иммуномодулируюших агентов относятся мурамоилпептиды (МП) - фрагменты клеточных стенок бактерий и их производные, полученные путем химического синтеза Они стимулируют цитотоксическую активность эффекторных клеток иммунной системы макрофагов, NK-клеток, лимфоцитов, и индуцируют продукцию цитокина фактора некроза опухолей а (ФНОа), проявляющего токсическое действие в отношении опухолевых клеток (Andronova and Ivanov, Sov Med Rew D Immunol 1991, Pabst et al, Neuroimmunomodulation 1999) В ИБХ РАН проводится изучение ГМДП - N-ацетил-глюкозаминил-ßl—>4-К-ацетилмурамоил-аланил-0-изоглутамина, - обладающего иммуномодули-рующей и противоопухолевой активностью Было показана биологическая активность ГМДП непосредственно на опухолевые клетки различных линий ГМДП был способен вызывать изменения в экспрессии мембранных антигенов опухолевых клеток, а именно опухоле-ассоциированных антигенов (ОАА), молекул адгезии, антигенов главного комплекса гистосовместимости II класса и др Одним из результатов изменений спектра антигенов явилось силение цитолиза опухолевых клеток аллогенными мононуклеарными клетками крови in vitro (Valyakma et al, Int J Oncol 1996) Кроме того, ГМДП усиливал цитотоксическое действие ФНОа и итостатиков на опухолевые клетки ряда линий in vitro (Petrova et al, Int Immunopharmacol 2006, етрова и др, БЭБиМ 2007)
В связи с перечисленными выше фактами представилось нужными и интересным оценить лияние ГМДП на противоопухолевую активность цисплатина и цитокина ФНОа, а также их омбинации, на моделях мышиных перевиваемых опухолей Изучение механизма отенцирующего действия ГМДП на опухолевые клетки в системе in vitro, где нет ммуномодулирующей составляющей его биологической активности, представляется также очень ажным для оптимизации и подбора цито- и химиопрепаратов при комплексном применении их с П в терапии злокачественных новообразований
Пе ш и задачи работы
Целями данной работы явились оценка эффективности использования ГМДП совместно с хичиотерапевтическим препаратом цисплатином (ЦП) и цитокином ФНОа в противоопухолевой терапии, а также выяснение возможных механизмов усиления под действием ГМДП цитотоксичности ФНОа в отношении опухолевых клеток
В ходе данной работы были решены следующие задачи
1 Оценена противоопухолевая эффективность комбинации ГМДП с ЦП и ФНОа на моделях перевиваемых мышиных опухолей аденокарциномы Эрлиха, меланомы В-16 и лимфолейкоза Р-388
2 Определена токсичность комбинации препаратов ГМДП, ЦП и ФНОа in vivo, а также оценено ее влияние на гематологические показатели мышей
3 На модели трансформированных мышиных фибробластов L-929 т vitro определено влияние ГМДП на тип гибели клеток под действием ФНОа
4 Изучена способность клеток L-929 продуцировать ФНОа под действием ГМДП
5 Изучено влияние ГМДП на уровень рецепторов к ФНОа на клетках L-929
6 Изучено влияние ГМДП на структуру хроматина клеток L-929
7 Изучено влияние ГМДП на продукцию активных форм кислорода (АФК) в клетках L-929 в присутствии и отсутствии ФНОа
Научная новизна и практическая значимость работы
Показана возможность и эффективность применения ГМДП совместно с цитостатиками и цитокинами в терапии онкологических заболеваний В ходе данной работы было впервые показано, что ГМДП вызывает секрецию ФНОа у трансформированных мышиных фибробластов L-929, а также влияет на структуру их хроматина Кроме того, впервые была продемонстрирована способность ГМДП индуцировать и усиливать продукцию супероксид-аниона в клетках L-929 Полученные результаты вносят существенный вклад в изучение механизма действия мурамоилпептидов, а разработанные терапевтические подходы могут стать полезным инструментом в лечении онкологических заболеваний
Публикация работы
По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ
Апробация работы
Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях VII Всероссийский научный форум с международным участием имени академика В И Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003), XVI Зимняя молодежная школа «Перспективные направления в физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004), DAAD Summeг School on Current Trends m Comparative Immunology" (Санкт-Петербург, 2005), 7th John Humphrey Advanced Summer Programme m Immunology "The Interface Between Immunology
and Medicine" (Москва, 2005), VIII чтения, посвященные памяти академика Ю А Овчинникова (Москва-Пущино, 2006), II Съезд Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007)
Структура работы Диссертационная работа изложена на 114 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, основных выводов и списка литературы из 287 наименований Диссертация содержит 11 таблиц и 16 рисунков
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Изучение противоопухолевого действия комбинации ЦГОФНОа/ГМДП на модели аденокарциномы Эрлиха. Дня исследования противоопухолевого действия комбинации ГМДП/ФНОа/ЦП на асцитную ФНОа-чувствительную карциному Эрлиха (АКЭ) мышам линии Balb/c внутрибрюшинно вводили опухолевые клетки в различных количествах 1 млн, 2 млн и 10 млн клеток на мышь Через 2 суток после введения опухолевых клеток проводили инъекции препаратов и их комбинаций В экспериментах использовали две контрольные группы мышей животным одной группы вводили физиологический раствор, другой - ЦП в дозе, которую использовали в составе комбинаций Противоопухолевую активность препаратов и их комбинаций оценивали по выживаемости мышей в течение 90 суток с момента имплантации опухолевых клеток В таблице 1 приведены результаты по оценке противоопухолевой активности ЦП, ФНОа и ГМДП, a также их комбинаций, на мышах с АКЭ при дозе опухолевых клеток 1 млн на мышь и однократном внутрибрюшинном введении препаратов
Таблица 1. Противоопухолевая активность ЦП, ФНОа и ГМДП и их комбинаций при инъекции мышам клеток АКЭ в количестве 1 млн_
—_________ СУТКИ ПРЕПАРАТЫ---- 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Контроль 100* 100 100 20 20 20 20 0 0 0
ГМДП 100 100 100 40 30 20 20 20 10 10
ФНОа 100 100 100 80 40 40 20 10 0 0
ФНОа+ГМДП 100 100 100 100 80 70 50 40 30 30
ЦП 100 100 100 30 20 20 20 20 20 20
ЦП+ФНОа 100 100 100 80 70 55 55 55 55 55
ЦП+ГМДП 100 100 100 100 100 100 100 100 80 80
ЦП+ФНОа+ГМДП 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Мышам-опухоленосителям внутрибрюшинно вводили препараты ГМДП (160 мкг на мышь), ФНОа (5000 ед на мышь) и ЦП (40 мкг на мышь)
* - процент выживших животных в опытной группе Каждая группа насчитывала 8-10 животных
Из этих данных видно, что ГМДП обладал слабой противоопухолевой активностью ФНОа в используемой дозе не обладал противоопухолевым эффектом, однако комбинация ФНОа с ГМДП обеспечивала выживаемость мышей-опухоленосителей, большую, чем в группах животных, которым вводили эти препараты по отдельности Один ЦП обеспечивал выживаемость мышей с АКЭ, составившую в конце срока наблюдения (90 дней) 20% В комбинации с ФНОа противоопухолевая активность ЦП значительно повышалась, однако еще большего эффекта
3
удалось добиться при испочьзовании комбинации ЦП с ГМДП Стопроцентной выживаемости мышей в течение всего срока наблюдения удалось добиться только при использовании тройной комбинации
В следующей серии экспериментов оценивали выживаемость мышей, которым вводили клетки АКЭ в количестве 2 млн Использовали те же дозы ЦП, ФНОа и ГМДП, что и в предыдущей серии Данные приведены в таблице 2
Таблица 2. Противоопухолевая активность ЦП, ФНОа и ГМДП и их комбинаций при инъекции мышам клеток АКЭ в количестве 2 млн._____
-___________ СУТКИ ПРЕПАРАТЫ ---—__ 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Коптроль 100* 100 100 0 0 0 0 0 0 0
ГМДП 100 100 100 60 40 0 0 0 0 0
ФНОа 100 100 100 50 20 10 10 0 0 0
ФНОа+ГМДП 100 100 100 80 50 20 10 10 0 0
ЦП 100 100 100 20 20 20 20 20 20 20
ЦП+ФНОа 100 100 100 60 60 40 40 40 40 40
ЦП+ГМДП 100 100 100 90 80 70 70 70 70 70
ЦП+ФНОа+ГМДП 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Мышам-опухоленосителям внутрибрюшинно вводили препараты ГМДП (160 мкг на мышь), ФНОа (5000 ед на мышь) и ЦП (40 мкг на мышь)
* - процент выживших животных в опытной группе Каждая группа насчитывала 10 животных
Как следует из этих данных, ГМДП значительно усиливал противоопухолевое действие ЦП, однако сам не обладал противоопухолевой активностью Следует отметить, что комбинация ЦП/ГМДП обеспечивала более высокую выживаемость мышей-опухоленосителей, чем комбинация ЦП/ФНОа Выживаемость, равную 100%, наблюдали точько в группе животных, которым вводили ЦП и ФНОа совместно с ГМДП
При увеличении количества вводимых мышам клеток АКЭ до 10 млн (см таблицы 3 и 4) эффективное противоопухолевое действие оказывали комбинации с другими дозами составляющих препаратов Препарата ЦП, ФНОа и ГМДП в дозах 40 мкг, 5000 ед и 160 мкг, соответственно, по отдельности и в различных комбинациях не обеспечивали 100% выживаемости мышей-опухоленосителей (данные не приводятся) Поэтому в следующей серии опытов (таблица 3) мышам вводили ГМДП в дозе 160 мкг, дозу ЦП повышали в два раза - 80 мкг, а дозы ФНОа варьировали от 50 до 5000 ед В сериях предварительных экспериментов нами было установлено, что ГМДП и ФНОа при всех исследуемых дозах, а также их парные сочетания, не повышали жизнеспособности экспериментальных животных по сравнению с контролем (данные не приводятся) Из данных, представленных в табтице 3, следует, что ГМДП существенно повышал противоопухолевую активность ЦП Также обращает на себя внимание на тот факт, что введение ЦП с ФНОа в дозе 5000 ед приводило к снижению выживаемости животных-опухоленосителей по сравнению с мышами контрольной группы, которым вводили физиологический раствор, что, вероятно, являлось следствием высокой токсичности этой комбинации при данных дозах
составляющих ее препаратов При введении ЦП и ФНОа в тех же дозах совместно с ГМДП выживаемость животных увеличивалась, как по сравнению с контрольной группой, так и по сравнению с группой мышей, которым вводили ЦГОФНОа, на всех сроках наблюдения, что, по-видимому, указывало на проявление детоксицирующего действия ГМДП Уменьшение дозы ФНОа до 500 ед в составе тройной комбинации обеспечивало стопроцентную выживаемость в соответствующих группах мышей Дальнейшее уменьшение дозы ФНОа до 50 ед приводило к снижению противоопухолевой активности комбинации
Таблица 3 Влияние различных доз ФНОа на противоопухолевый эффект ЦП и комбинации ГМДГОЦП при инъекции мышам клеток АКЭ в количестве 10 млн _____
" СУТКИ ПРЕПАРАТЫ 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Контроль 100* 70 60 0 0 0 0 0 0 0
цп 100 80 70 20 10 10 10 0 0 0
ЦП+ГМДП 100 100 100 100 80 80 80 80 80 80
ЦП+ФНОа 5000 ед 100 20 0 0 0 0 0 0 0 0
ЦП+ГМДП+ФНОа 5000 ед. 100 100 100 100 80 20 20 20 20 20
ЦП+ФНОа 500 ед 100 100 100 40 30 30 30 0 0 0
ЦП+ГМДП+ФНОа 500 ед 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
ЦП+ФНОа 50 ед 100 100 100 30 20 20 20 0 0 0
ЦП+ГМДП+ФНОа 50 ед 100 100 юо 100 100 100 100 100 100 80
Мышам-опухоленосителям внутрибрюшинно вводили препараты ГМДП (160 мкг на мышь), ФНОа (50, 500 и 5000 ед на мышь) и ЦП (80 мкг на мышь)
* - процент выживших животных в опытной группе Каждая группа насчитывала 10 животных
Согласно ранее полученным данным, пирогенная доза ГМДП для кроликов составляет 1x10 ' мг/кг (Andronova and Ivanov, Sov Med Rew D Immunol 1991), что в пересчете на одну мышь примерно соответствует 2 мкг Поэтому мы провели эксперименты, в которых оценивали влияние ГМДП в диапазоне более низких доз на противоопухолевую активность ЦП/ФНОа на мышах, которым вводили клетки АКЭ в количестве 10 млн Соответствующие данные представлены в таблице 4
Из представленных в таблице данных видно, что величина противоопухолевого эффекта комбинаций препаратов зависела от дозы ГМДП не пропорционально комбинация препаратов с ГМДП в наименьшей исследуемой дозе 0,05 мкг оказывала больший противоопухолевый эффект, чем комбинации препаратов, содержащие ГМДП в больших дозах (0,15-15 мкг) Следует отметить, что аналогичная закономерность в зависимости биологического эффекта ГМДП от дозы наблюдалась при изучении его влияния на протективную активность бесклеточной коклюшной вакцины (Семенов и др, ЖМЭИ 2004) К сожалению, при использовании ГМДП в сниженном диапазоне доз не удалось добиться стопроцентной выживаемости экспериментальных животных, которая наблюдалась при использовании высокой пирогенной дозы этого иммуномодулятора
Таблица 4. Влияние ГМДП в разчичных дозах на противоопухолевый эффект комбинации ФНОа/ЦП при инъекции мышам клеток АКЭ в количестве 10 млн.
СУТКИ ПРЕПАРАТЫ^ 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Контроль 100* 70 60 0 0 0 0 0 0 0
цп 100 80 70 20 10 10 10 0 0 0
ЦП+ФНОа 100 40 40 0 0 0 0 0 0 0
ЦП+ГМДП 0,05 мкг+ФНОа 100 100 100 100 100 100 80 80 80 80
ЦП+ГМДП 0,15 мкг+ФНОа 100 80 80 60 40 40 40 40 40 40
ЦП+ГМДП 1,5 мкг+ФНОа 100 60 60 40 40 40 40 40 40 40
ЦП+ГМДП 15 мкг+ФНОа 100 80 80 60 60 60 60 60 60 60
ЦП+ГМДП 160 мкг+ФНОа 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Мышам-опухоленосителям внутрибрюшинно вводили препараты ГМДП (0, 0,05, 0,15, 1,5, 15 и 160 мкг на мышь), ФНОа (500 ед на мышь) и ЦП (80 мкг на мышь)
* - процент выживших животных в опытной группе Каждая группа насчитывала 10 животных
Таким образом, количество имплантированных мышам клеток АКЭ определяло количественный состав компонентов в комбинации ЦП/ФНОа/ГМДП, обеспечивающей 100% выживаемость мышей-олухоленосителей Следует подчеркнуть, что все приведенные выше данные были получены в экспериментах при однократном введении препаратов
С целью снижения доз ЦП (80 мкг) и ГМДП (160 мкг), и, тем самым, уменьшения токсичности и пирогенности комбинации без потери ее противоопухолевой эффективности, нами была разработана схема многократного введения В данной схеме применяли дозы ФНОа и ГМДП, которые в экспериментах при однократном введении комбинаций мышам с АКЭ (доза опухолевых клеток 10 млн) показали свою эффективность - 500 ед и 0,05 мкг, соответственно Дозу ЦП при этом снизили в два раза (40 мкг) Комбинацию препаратов вводили 1 раз в неделю в течение 1 месяца Соответствующие данные представлены в таблице 5
Таблица 5. Влияние ГМДП на противоопухолевый эффект комбинации ЦП/ФНОа при ее многократном введении мышам, которым инъецировали клетки АКЭ в количестве 10 млн.
—-—СУТКИ ПРЕПАРАТЫ ——___ 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Контроль 100* 70 60 0 0 0 0 0 0 0
ГМДП 100 100 90 0 0 0 0 0 0 0
ЦП 100 100 100 80 60 50 50 50 50 50
ЦП+ГМДП 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
ФНОа 100 100 100 0 0 0 0 0 0 0
ГМДП+ФНОа 100 100 100 0 0 0 0 0 0 0
ЦП+ФНОа 100 100 100 90 80 70 70 70 70 70
ЦП+ГМДП+ФНОа 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Мышам-опухоленосителям внутрибрюшинно вводили препараты ГМДП (0,05 мкг на мышь), ФНОа (500 ед на мышь) и ЦП (40 мкг на мышь) внутрибрюшинно 1 раз в неделю в течение 1 месяца
* - процент выживших животных в опытной группе Каждая группа насчитывала 10 животных
Из данных таблицы видно, что при такой схеме введения ЦП обеспечив&т 50%-ную выживаемость животных, в то время как при этом же количестве имплантированных опухолевых клеток однократное введение ЦП в два раза большей дозе не обеспечивало значимой выживаемости мышей (см таблицы 3 и 4) Совместное введение ЦП с ГМДП, а также тройной комбинации обеспечивало стопроцентную выживаемость Следует отметить, что в выборе срока наблюдения за экспериментальными животными мы руководствовались методическими рекомендациями по изучению противоопухолевой активности фармакологических веществ (Трещалина и др, 1992), согласно которым этот срок должен составлять 90 суток Возможно, тройная комбинация обеспечивает большую выживаемость мышей-опухоленосителей по сравнению с двойной комбинацией ЦП/ГМДП на более длительных сроках наблюдения
Была также исследована эффективность опережающего введения ГМДП (0,05 мкг) - через 24 ч после введения клеток АКЭ (10 млн ) и за 24 ч до введения комбинации препаратов ЦП (40 мкг), ФНОа (500 ед) и ГМДП (0,05 мкг) На данной экспериментальной модели не было выявлено достоверных различий выживаемости между группами мышей, которым производили и не производили опережающее введение ГМДП
При сравнении противоопухолевой эффективности трех различных способов введения -внутрибрюшинного, подкожного и внутривенного - комбинации препаратов ЦП (40 мкг) ФНОа (500 ед) и ГМДП (0,05 мкг) при дозе клеток АКЭ 10 млн было показано, что подкожное и внутривенное введение не оказывали большего противоопухолевого действия по сравнению с действием одного ЦП (данные не приводятся) Противоопухолевое действие комбинация ЦП/ФНОа/ГМДП оказывала только при внутрибрюшинном введении, что дает основание предположить непосредственное токсическое воздействие компонентов комбинации на опухолевые клетки с одной стороны, а с другой стороны, на активацию элементов местного иммунитета, которые, в свою очередь, также могут оказывать противоопухолевое действие
Изучение противоопухолевого действия комбинации ЦП/ФНОа/ГМДП на модели меланомы В-16 При изучении противоопухолевого действия комбинации ЦП/ФНОа/ГМДП на солидную ФНОа-чувствительную меланому В-16 мышам линии С57В1^ имплантировали опухолевые клетки подкожно в область холки Через 2 суток после введения клеток проводили инъекции препаратов Контрольным мышам вводили физиологический раствор Также как и в случае АКЭ, были опробованы различные способы введения препаратов - внутрибрюшинный, внутривенный и подкожный (в область роста опухоли) Основываясь на данных о дозах и эффективности многократного введения комбинации препаратов мышам с АКЭ (см выше), и, также учитывая то обстоятельство, что меланома В-16, в отличие от АКЭ, является метастазирующей, препараты ЦП (40 мкг), ФНОа (500 ед) и ГМДП (0,05 мкг) и их комбинации вводили многократно 1 раз в неделю в течение всего срока наблюдения Противоопухолевую активность препаратов и их комбинаций оценивали по средней продолжительности жизни мышей
Внутрибрюшинное и внутривенное введение существенным образом не сказывалось на средней продолжительности жизни (СПЖ) мышей по сравнению с таковой у животных, которым вводили ЦП Результаты по изучению противоопухолевой эффективности комбинации препаратов при подкожном способе введения представлены в таблице б
Таблица 6. Противоопухолевые эффекты препаратов ЦП, ФНОа и ГМДП и их комбинаций при их многократном введении мышам с меланомой В-16. ________
—--__ СУТКИ препараты" --- 0 10 15 20 30 40 50 60 90 спж±с( сутки
Контроль 100* 80 80 40 0 0 0 0 0 2б±2
ГМДП 100 100 70 20 20 0 0 0 0 27±3
ФНОа 100 90 80 50 0 0 0 0 0 27±1
ГМДП+ФНОа 100 80 60 30 10 0 0 0 0 27 ±3
ЦП 100 100 80 80 40 20 0 0 0 40±3
ЦП+ФНОа 100 100 100 50 40 10 0 0 0 37 ±3
ЦП+ГМДП 100 100 100 40 20 20 0 0 0 37±4
Без предварительного введения ГМДП
ЦП+ГМДП +ФНОа 100 100 100 80 80 40 I 20 0 0 50±3
Предварительное введение ГМДП
ЦП+ГМДП +ФНОа 100 100 100 100 100 100 80 40 40 >65
Мышам-опухоленосителям вводили препараты ГМДП (0,05 мкг на мышь), ФНОа (500 ед на мышь) и ЦП (40 мкг на мышь) подкожно в область опухоли 1 раз в неделю в течение всего срока наблюдения * - процент выживших животных в опытной группе Величины СПЖ (средняя продолжительность жизни), были вычислены по методу Каплана-Мейера СО - стандартное отклонение Каждая группа насчитывала 10 животных
Из этих дачных видно, что введение комбинации ЦП/ФНОа/ГМДП приводило к увеличению СПЖ мышей по сравнению с СПЖ животных, которым вводили только ЦП При этом ФНОа и ГМДП, а также их комбинация не проявляли сколь либо значимого противоопухолевого эффекта по сравнению с контролем, а комбинации ЦП/ГМДП и ЦП/ФНОа не проявляли большего противоопухолевого действия по сравнению с ЦП Мы также оценивали влияние предварительного однократного введения ГМДП в дозе 0,05 мкг на эффективность противоопухолевого действия тройной комбинации препаратов в отношении меланомы В-16 ГМДП вводили через 1 сутки после имплантации опухолевых клеток и за 1 сутки до введения комбинации ЦП/ФНОа/ГМДП Из представленных данных (таблица 6) следует, что предварительное введение ГМДП обеспечивало к концу срока наблюдения выживаемость животных, равную 40%, в то время как в группе мышей, которым вводили тройную комбинацию без предварительного введения ГМДП, наблюдалась полная гибель в течение 50-60 суток СПЖ животных при этом возрастала с 50 до более чем 65 суток
Таким образом, при изучении на мышах с меланомой В-16 противоопухолевой активности
комбинации ЦП/ФНОа/ГМДП была установлена эффективность локального введения препаратов
Эти данные согласуются с результатами, представленными выше, об эффективности
противоопухолевой комбинации в отношении модели АКЭ Положительный эффект
предварительного введения мышам-опухоленосителям ГМДП подчеркивает важность процесса
8
стимуляции мурамоилпептидом местного иммунитета в реализации противоопухолевой активности комбинации ЦП/ФНОа/ГМДП Как уже было отмечено выше, в случае АКЭ повышения эффективности комбинации при предварительном введении ГМДП показано не было Следует отметить, что АКЭ является асцитной, а меланома В-16 - солидной опухолью Можно предположить, что во втором случае проникновение компонентов комбинации к опухолевым клеткам более затруднено, и предварительное введение ГМДП дает в данном случае преимущества, заключающиеся, во-первых, во введении дополнительной дозы препарата, а во-вторых, в предварительной стимуляции локального иммунитета мышей-опухоленосителей Нельзя исключить прямого влияния ГМДП на опухолевые клетки, поскольку ранее на клетках меланомы был показан эффект ГМДП, заключающийся в изменении экспрессии опухолеассоциированных антигенов, что влияло на чувствительность этих клеток к цитотоксическому действию со стороны ЛАК-клеток В случае асцитной АКЭ единовременного введения ГМДП в составе комбинации может быть вполне достаточным, поскольку доставка препаратов к опухолевым клеткам менее затруднена
Изучение противоопухолевого действия комбинации ЦП/ФНОа/ГМДП на модели лимфолейкоза Р-388. Далее мы изучали противоопухолевое действие комбинации ЦП/ФНОа/ГМДП на модели асцитного лимфолейкоза Р-388 Следует отметить, что данные опухолевые клетки резистентны к ФНОа Мы использовали комбинации с ФНОа, поскольку имеются данные, что этот цитокин на модели лимфолейкоза Р-388 способен усиливать противоопухолевое действие некоторых химиопрепаратов Предположительно, ФНОа в указанных случаях играл роль иммуномодулятора Мышам линии БВА/2 внутрибрюшинно вводили опухолевые клетки в количестве 1 млн Препараты и их комбинации вводили внутрибрюшинно через 1 сутки после введения опухолевых клеток 1 раз в неделю в течение всего срока наблюдения Результаты по изучению противоопухолевого действия комбинаций препаратов ЦП, ФНОа и ГМДП на данной модели представлены в таблице 7
Таблица 7. Влияние комбинации ЦП/ФНОа/ГМДП на выживаемость и среднюю
----- СУТКИ ПРЕПАРАТЫ""- 0 10 15 20 30 40 СПЖ±СО, сутки
Контроль 100* 40 0 0 0 0 13±1
цп 100 80 80 60 20 0 30±2
ЦП+ФНОа 100 80 60 40 40 0 31±2
ЦП+ГМДП 100 100 100 100 40 0 Зб±2
ЦП+ГМДП+ФНОа 100 100 100 100 80 0 39±2
Мышам-опухоленосителям вводили препараты ГМДП (0,15 мкг на мышь), ФНОа (500 ед на мышь) и ЦП (80 мкг на мышь) внутрибрюшинно 1 раз в неделю в течение всего срока наблюдения * - процент выживших животных в опытной группе Величины СПЖ (средняя продолжительность жизни), были вычислены по методу Каплана-Мейера СО - стандартное отклонение Каждая группа насчитывала 10 животных
Следует отметить, что схемы многократного введения комбинации ЦП/ФНОа/ГМДП, обеспечивающие значительных противоопухолевый эффект в случаях ФНОа-чувствительных аденокарциномы Эрлиха и меланомы В-16 (ЦП 40 мкг, ФНОа 500 ед, ГМДП 0,05 мкг в область развития опухоли 1 раз в неделю), в данном случае оказались неэффективными Значимого противоопухолевого эффекта удалось достигнуть при увеличении доз ЦП до 80 мкг и ГМДП до 0,15 мкг При данных дозах ЦП и ГМДП введение комбинаций ЦП/ГМДП и ЦП/ФНОа/ГМДП приводило к увеличению СПЖ мышей (36 и 39 сут, соответственно) по сравнению с СПЖ животных, которым вводили ЦП (30 сут ) СПЖ контрольных животных при этом составила 13 сут ГМДП, ФНОа и их комбинация не проявляли сколь либо значимого противоопухолевого эффекта (данные не приводятся)
Таким образом, в ходе данной работы было показано, что тройная комбинация ЦП/ФНОа/ГМДП с определенными дозами составляющих ее препаратов в целом оказалась более эффективной при лечении мышей с аденокарциномой Эрлиха и меланомой В-16, чем составляющие ее препараты в тех же дозах по отдельности или парные сочетания препаратов Введение мышам с лимфолейкозом Р-388 ЦП совместно с ГМДП существенно увеличивало противоопухолевый эффект ЦП На данной модели также было показано, что ФНОа в составе тройной комбинации не обеспечивал большего противоопухолевого эффекта по сравнению с комбинацией ЦП/ГМДП (см таблицу 7) Следует отметить, что для моделей АКЭ (при дозе опухолевых клеток 10 млн) и меланомы В-16 эффективными оказались комбинации, содержащие одни и те же дозы препаратов при их многократном введении Достижения положительного противоопухолевого эффекта в случае лимфолейкоза Р-388 удалось добиться при введении комбинаций, содержащих более высокие дозы ЦП и ГМДП
Определение токсичности комбинации препаратов ЦП/ФНОа/ГМДП. Известно, что цисплатин оказывает на организм различные токсические эффекты В первую очередь, он поражает почки, эпителий кишечника, кроветворную систему Кроме того, имеются данные о мутагенной и канцерогенной активности ЦП ФНОа также в ряде случаев оказывает на организм млекопитающих токсическое действие Поэтому мы сочли целесообразным оценить, во-первых, токсичность комбинации ЦП/ФНОа на интактных мышах и, во-вторых, изучить влияние ГМДП на токсичность комбинации препаратов
Токсичность проверяли в трех традиционных тестах по изменению массы мышей (подострой токсичности), острой и хронической токсичности Исследования проводили на мышах-гибридах Р1[СВАхС57В1Лу] В соответствии с методическими рекомендациями по изучению общетоксического действия фармакологических средств (Арзамасцев и др, 1997) препарат считается нетоксичным, если прирост массы мышей опьггаых групп за 7 дней наблюдения составляет 60 и более процентов по отношению к животным в контрольной группе Использованные в тесте по изменению массы мышей комбинации ЦП/ФНОа и ЦП/ФНОа/ГМДП
не проявляли токсических свойств и не обладали токсичностью в тесте хронической токсичности (данные не приводятся) Результаты выживаемости мышей, полученные в тесте острой токсичности представлены в таблице 8
Таблица 8. Острая токсичность комбинаций препаратов ЦП/ФНОа и ЦП/ФНОа/ГМДП
Препарат, доза на мышь Гибель, %
ЦП, мкг ФНОа, ед. ГМДП, мкг
40 500 0,05 0
80 1000 0,1 0
160 2000 0,2 0
320 4000 0,4 100
ЛДч, 225±6 2825±10 0,29±0,05
40 500 - 0
80 1000 - 0
160 2000 - 40
320 4000 - 100
ДДчо 170±15 2140±200 -
Контроль - физиологический раствор 0
Комбинации ЦП/ФНОа и ЦП/ФНОа/ГМДП вводили внутрибрюшинно мышам в однократных, двукратных, четырехкратных и восьмикратных дозах ЦП 40, 80, 160 и 320 мкг на мышь, ФНОа 500, 1000, 2000 и 4000 ед на мышь и ГМДП 0,05, 0,1, 0,2 и 0,4 мкг на мышь Каждая экспериментальная группа включала 10 мышей Учитывали гибель мышей в течение 7 дней Оценку результатов производили по проценту гибели животных Среднелетальные дозы (ЛД5о) были рассчитаны по методу Ван дер Вардена. Значения ЛДм представлены в виде среднего значения±стандартное отклонение
При введении мышам комбинации препаратов ЦП/ФНОа и ЦП/ФНОа/ГМДП в дозах, превышающих в 8 раз исходные (ЦП 320 мкг, ФНОа 4000 ед, ГМДП 0,4 мкг), происходила гибель 100% животных При введении мышам комбинации препаратов ЦП/ФНОа в дозах, превышающих исходные в 4 раза (ЦП 160 мкг на мышь и ФНОа 2000 ед на мышь), наблюдалась гибель 40% животных Привнесение в данную комбинацию ГМДП дозе 0,2 мкг (4x0,05 мкг) приводило к предотвращению гибели мышей ЛД50 ЦП и ФНОа в комбинации без ГМДП в 4,25 раз превышали первоначальные дозы, а именно 170±15 мкг и 2140±200 ед, соответственно ЛД50 ЦП и ФНОа в комбинации с ГМДП в 5,65 раз превышали первоначальные, а именно 225±6 мкг и 2825±10 ед, соответственно Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что ЛД5о отдельных компонентов комбинаций препаратов с ГМДП и без ГМДП статистически значимо отличались (р<0,05) Можно заключить, что комбинация ЦП/ФНОа/ГМДП не обладает подострой и хронической токсичностью, а ГМДП предотвращает проявление острой токсичности комбинации препаратов ЦП/ФНОа
С целью выявления возможного корригирующего действия ГМДП на гематологические нарушения, вызванные введением мышам ЦП/ФНОа, мы оценивали содержание основных клеток (лимфоцитов, нейтрофилов и моноцитов) в крови мышей Р1[СВАхС57В176з] через 7 суток после внутрибрюшинного введения комбинаций препаратов ЦП/ФНОа с и без ГМДП Контролем
служили мыши, которым вводили физиологический раствор Полученные данные представлены в таблице 9
Таблица 9. Влияние комбинаций препаратов ЦП/ФНОа и ЦП/ФНОа/ГМДП на гематологические показатели мышей._
-—--КЛЕТКИ ПРЕПАРАТЫ ~---- Нейтрофилы Лимфоциты Моноциты
Контроль 19±3 76±4 4±2
ЦП+ФНОа 33±3 59±6 7±2
ЦП+ФНОа+ГМДП 0,05 мкг 18±2 79±3 3±1
7 дней после введения комбинаций препаратов ЦП (40 мкг на мышь), ФНОа (500 ед на мышь) и ГМДП (0,05 мкг на мышь) Представлены средние величины содержания форменных элементов крови в мазках крови 5 мышей каждой группы±стандартное отклонение
Как видно из этих данных, в группах мышей, которым вводили ЦП/ФНОа, по сравнению с контрольными мышами существенно снижалось содержание лимфоцитов и увеличивалось содержание сегментоядерных нейтрофилов и моноцитов В то же время, в крови мышей после введения им ЦП/ФНОа с ГМДП содержание лимфоцитов, сегментоядерных нейтрофилов и моноцитов приближалось к содержанию этих клеток в крови контрольных животных Следовательно, ГМДП нормализует гематологические изменения, вызванные введением комбинации препаратов ЦП/ФНОа
Влияние ГМДП ня ФНОа-индуцированлую гибель клеток Ь-929 Противоопухолевое
действие комбинации препаратов ЦП/ФНОа/ГМДП может быть обусловлено как
иммуномодулирующей активностью, так и прямым воздействием препаратов на опухолевые
клетки Ранее нами было показано, что ГМДП усиливает цитотоксическое действие ФНОа на ряд
трансформированных клеточных линий В настоящей работе на модели ФНОа-чувствительных
клеток Ь-929 были предприняты попытки выяснить механизм, с помощью которого может быть
осуществлена эта активность ГМДП Был охарактеризован тип гибели клеток Ь-929 под действием
ФНОа в присутствии или отсутствии ГМДП Оценивали содержание живых, некротических и
апоггготических клеток в культурах, которые обрабатывали препаратами ГМДП и ФНОа и их
комбинацией в течение 16 часов Для этого использовали тест количественного определения
апоптотических и не!фотических клеток с использованием аннексина V, меченого ФЛИТЦ, и
йодистого пропидия (Р1), в котором оцениваются характерные признаки апоптоза и некроза
Переход фосфатидилсерина из внутреннего листка плазматической мембраны в наружный
является отличительной чертой апоптоза, а нарушение целостности мембраны - некроза
Результаты проведенных тестов представлены на рис 1 В контрольной культуре и культуре,
обработанной ГМДП, наблюдалось около 80% живых клеток (рис 1-А, В, квадранты АЗ)
Остальные клетки в этих культурах окрашивались преимущественно ФЛИТЦ, то есть наблюдался
спонтанный апоптоз (квадранты А4) Инкубация клеток с ФНОа приводила к увеличению
содержания апоптотических клеток (рис 1-С, квадрант А4) При обработке клеток ФНОа
совместно с ГМДП наблюдалось еще большее увеличение содержания апоптотических клеток в
12
культуре (рис. 1 -Б, квадрант А4). Кроме того, в культуре клеток, обработанной ФНОа совместно с ГМДП, наблюдалось также существенное увеличение числа клеток на поздних стадиях алоптоза, которые окрашивались одновременно и ФЛИТЦ, и Р1 (рис. 1-Б, квадрант А2). Таким образом, можно заключить, что ГМДП усиливает ФНОа-индуцированный апоптоз клеток Ь-929 и способствует их более раннему переходу в поздние стадии апоптоза, на которых происходит нарушение целостности плазматической мембраны.
02% U А 26% "
1« ЙЯЙ
А1
0,2%
«Iя-,;
1.4%
В
м
15,8%
1й' АштхШНТС
м 1.0% 42 n
,:•.;: A4
Рис 1. Эффект ГМДП на содержание живых, апоптотичееких и некротических клеток в культурах, обработанных ФНОа. А - контрольные (необработанные) клетки, В - клетки, обработанные ГМДП (1 мкг/мл), С - клетки, обработанные ФНОа (20 ед./мл), D - клетки, обработанные ГМДП и ФНОа в указанных выше концентрациях.
Исследование влияния ГМДП на секрецию ФНОа клетками L-929. ГМДП способен вызывать продукцию ФНОа опухолевыми клетками (Valyakina et al, FEBS Lett 1998). Нами проводилось исследование влияния ГМДП на продукцию ФНОа клетками L-929, поскольку не исключалось, что потенцирующая активность ГМДП может осуществляться за счет накопления в культуральной среде эндогенного ФНОа. Использовали функциональный тест - цитолиз клеток L-929. Культуры клеток L-929 обрабатывали ГМДП в течение 3-21 ч. По окончании инкубации отбирали культуральные супернатанты и диализовали их против фосфатно-солевого буфера для удаления остаточного ГМДП. Цитолитическая активность культуральных супернатантов тестировалась на клетках L-929 в присутствии актиномицина Д. Для определения жизнеспособности клеток использовали МТТ-тест. Данные эксперимента представлены на рис. 2.
18
о 4
Рис. 2. Цитотоксический эффект культуральных супернатантов от клеток Ь-929, инкубировавшихся с ГМДП, на интактные клетки Ь-929. МТТ-тест.
0 3 А 5 6 18 21 Время инкубации ч
Без антител
♦ - - С антителами
Из приведенного графика видно, что супернатанты клеток Ь-929, обработанных ГМДП в течение промежутка времени от 3 до 6 ч, проявляли цитотоксическую активность Максимальная токсичность наблюдалась у супернатантов клеток, подвергавшихся инкубации с ГМДП в течение 5 ч Доказательством того, что наблюдаемый лизис клеток индуцирован эндогенным ФНОа, явилась нейтрализация цитотоксической активности супернатантов специфическими нейтрализующими антителами к мышиному ФНОа Супернатанты клеток, подвергавшихся обработке ГМДП в течение 18-21, также как и супернатанты контрольных клеток, не были токсичны Концентрация ФНОа, оцененная по калибровочной кривой, полученной в результате титрования рекомбинантного ФНОа на клетках Ь-929, составила 0,4±0,1 ед /мл
Таким образом, было показано, что в культуральной среде клеток Ь-929 под действием ГМДП накапливается эндогенный ФНОа Однако зарегистрированного количества цитокина было недостаточно, чтобы обеспечить наблюдаемый для ГМДП потенцирующий эффект по отношению к экзогенному ФНОа Следовательно, обусловленное ГМДП накопление ФНОа не может являться основным механизмом, посредством которого происходит усиление цитотоксичности ФНОа
Изучение влияния ГМДП на экспрессию рецепторов к ФНОа на поверхности клеток Ь-
929. Чувствительность клеток к ФНОа определяется, в первую очередь, наличием рецепторов к нему и их количеством Известно, что ГМДП способен вызывать изменения уровня мембранных антигенов Поэтому нами было проведено исследование, в котором предполагалось определить влияние ГМДП на уровень рецепторов "ШИН (СШ20а) на клетках мышиной фибросаркомы Ь-929 Исследования проводились методом проточной цитометрии с использованием специфических фикоэритрин-меченых антител против мышиного рецептора С0120а Было показано, что ГМДП
не оказывал существенного влияния на уровень TNFR1 на клетках L-929 при различных сроках инкубации (0,5-6 ч) клеток с мурамоилпептидом.
Изучение влияния ГМДП на структуру хроматина клеток L-929. Ранее было показано, что ГМДП способен специфически взаимодействовать с гистонами HI и НЗ (Golovina et al, FEBS Lett, 1999) и конкурировать с ДНК за связывание с гистоном HI. Взаимодействие ГМДП с гистонами может приводить к ослаблению связи последних с ДНК, в результате чего регуляторные участки ДНК могут становиться доступными для факторов транскрипции и ферментов, в том числе, нуклеаз. Это, в свою очередь, может определять чувствительность клеток к цитотоксическому действию ФНОа. Было проведено электронно-микроскопическое исследование хроматина клеток линии L-929. Хроматин выделяли из клеток, обработанных ГМДП при 37°С в течение 2 ч, и ядер, предварительно выделенных из клеток, а затем обработанных ГМДП при 4°С в течение 1,5 ч. Ядра выделяли, инкубируя клетки с лизирующим буфером, содержащим тритон-ХЮО, а затем лизировали гипотоническим шоком и приготовляли препараты для электронной микроскопии. Данные электронно-микроскопического анализа представлены на рис. 3-5.
Были визуализированы хроматиновые нити различной длины и размеров - в основном, надяуклеосомального строения, - а также конгломераты хроматина, представленные на микрофотографиях в виде электронно-плотных областей. При этом конгломераты в препаратах хроматина ядер, выделенных из обработанных ГМДП клеток, были значительно меньших размеров по сравнению с таковыми в препаратах хроматина контрольных ядер (см. рис. 3).
Рис. 3. Электронные микрофотографии хроматина из ядер клеток Ь-929, не обработанных (А) и обработанных (В) ГМДП (10 мкг/мл) в течение 2 ч. Контрастирование 1% раствором уранилацетата. Метки соответствуют длине 0,5 микрона.
Кроме того, для препаратов хроматина ядер, выделенных из обработанных ГМДП клеток отмечалась значительная декомпактизация нуклеосом по сравнению с контролем (см. рис. 4).
Рис. 4. Электронные микрофотографии хроматина из ядер клеток Ь-929, не обработанных (А1) и обработанных (В1) ГМДП (10 мкг/мл) в течение 2 ч. Контрастирование 1% раствором уранилацетата. Метки соответствуют длине 0,5 микрона. Стрелками отмечены нуклеоеомы.
С целью визуализации гистона Н1 проводилось электронно-микроскопическое исследование препаратов хроматина, обработанных специфическими к гистону Н1 антителами, меченными коллоидным золотом (см. рис. 5). Из представленных рисунков видно, что в образцах хроматина из ядер клеток, обработанных ГМДП, содержится меньше частиц коллоидного золота (рис. 5-В) по сравнению с образцами хроматина из ядер контрольных клеток (рис. 5-А). Снижение числа частиц коллоидного золота наблюдалось как на нитях хроматина, так и в хроматиновых агрегатах. Еще большее уменьшение содержания частиц коллоидного золота наблюдалось в образцах хроматина из ядер, непосредственно подвергавшихся обработке ГМДП (см. рис. 5-С). Следует отметить, что обработка клеток и изолированных ядер биологически неактивным стереоизомером ЬЬ-ГМДП не приводила к существенным изменениям в структуре хроматина. Полученные данные свидетельствуют о том, что ГМДП способен декомпактизировать хроматин клеток за счет
взаимодействия с гистоном Н1, в результате чего связь последнего с ДНК ослабляется.
16
! !
Рис. 5. Электронные микрофотографии хроматина из ядер клеток Ь-929. Окраска антителами к гистону Н1, мечеными коллоидным золотом, контрастирование 1% раствором уранилацетата. А хроматин из ядер контрольных клеток, В - хроматин из ядер клеток, инкубировавшихся с ГМДП (10 мкг/мл) в течение 2 ч, С - хроматин из ядер, инкубировавшихся с ГМДП в той же концентрации в течение 1,5 ч. Метки соответствуют длине 0,5 микрона. Стрелками отмечены частицы коллоидного золота.
Исследование влияния ГМДП на прохождение клеток L-929 по клеточному циклу.
Известно, что агенты, усиливающие пролиферацию клеток (простагландин Е, холерный токсин), повышают цитотоксичность ФНОа, вещества, замедляющие рост клеточных популяций (ИЛ-lß, ИЛ-6, ТФРр), напротив, ее ослабляют (Belizario et al, Cancer Res 1991). Поэтому, учитывая тот факт, что ГМДП оказывает прямой эффект на хроматин клеток L-929, в рамках настоящей работы было изучено его влияние на прохождение этих клеток по клеточному циклу. Использовали метод проточной цитометрии. При подготовке образцов клетки фиксировали в этаноле и окрашивали йодистым пропидием в присутствии РНКазы А. Результаты эксперимента показали, что ГМДП существенным образом не влияет на продвижение клеток L-929 по клеточному циклу при различных сроках инкубации клеток с ГМДП (3-24 ч).
Изучение влияния ГМДП, ФНОа и их комбинации на мембранный электрический потенциал митохондрий клеток L-929. Известно, ранняя потеря целостности плазматической мембраны в процессе программируемой гибели клеток может происходить, если в последних возникает недостаток макроэргических соединений, в первую очередь АТР. Митохондрии являются основным источником АТР в клетках. Один из показателей активности митохондрий -это величина их мембранного потенциала.
1,2 1
1
£ 0,8 о
2 0,6
"ь
л
О 0,4
0,2
ЩГ.
"у ■ /' шшщ&г J
ЯНаЯ У ¡¡¡¡■л
■ /
["' Контроль а ГМДП
г; ФНОа Рис. 6. Влияние ГМДП (10 мкг/мл), ФНОа (500 Я ФНОа+гмдп ед./мл) и их комбинации на потенциал митохондрий клеток 1,-929.
Данные проточной цитометрии. Отображены относительные величины флуоресценции родамина 123, вычисленные как соотношения значения средней флуоресценции в опытном образце к значению средней величины флуоресценции в контрольном образце.
Учитывая, что при ФНОа-зависимой гибели в присутствии ГМДП происходит увеличение содержания клеток с поврежденной плазматической мембраной, в данной работе нами был оценен эффект, который оказывают ГМДП, ФНОа и их комбинация на функциональное состояние митохондрий клеток Ь-929. Исследования проводили методом проточной цитометрии с использованием потенциал-чувствительного флуоресцентного красителя родамина 123, который избирательно накапливается в активных митохондриях. Клетки Ь-929 инкубировали с ГМДП, ФНОа и их сочетанием в течение 2, 4, б и 9 ч, а затем за 1 ч до окончания инкубации добавляли к ним родамин 123 и анализировали на проточном цитометре, В результате проведенных экспериментов было установлено, что при инкубации с препаратами в течение 2-6 ч не
18
наблюдалось сколь либо значимых изменений в средних значениях флуоресценции родамина 123 в клетках. Данные, полученные в результате инкубации клеток с препаратами в течение 9 ч, представлены на рис. 6. Из этих данных видно, что ГМДП и ФНОа по отдельности не оказывали сколь либо значимого эффекта на мембранный потенциал митохондрий клеток Ь-929, однако инкубация клеток с ФНОа совместно с ГМДП приводила к значительному снижению потенциала, что выражалось в снижении значения величины относительной флуоресценции родамина 123 в клетках.
Данный эффект комбинации ГМДП и ФНОа может быть обусловлен усилением продукции активных форм кислорода, индуцированной ФНОсс. С другой стороны, это может являться результатом истощения клеток энергетическими эквивалентами, которое могло возникнуть из-за усиления репарации фрагментированной ДНК. Учитывая тот факт, что ГМДП вызывает разрыхление хроматина, вполне вероятно, что в его присутствии в процессе ФНОа-зависимой гибели участков ядерной ДНК, подвергающихся фрагментации, становится больше, и, соответственно, система репарации работает более активно.
Изучение влияния ГМДП на фрагментацию ДНК в процессе ФНОа-зависимой гибели клеток Ь-929. Принимая во внимание тот факт, что ГМДП вызывал изменения в структуре хроматина, выражающиеся в его разрыхлении, представилось интересным выяснить, не происходит ли в присутствии ГМДП усиления фрагментации ДНК в клетках 1.-929 в процессе их ФНОа-зависимой гибели. Клетки инкубировали с ГМДП, ФНОа или их комбинацией в течение 48 ч. По окончании инкубации из клеток выделяли геномную ДНК и анализировали ее с помощью электрофореза в агарозном геле. Данные анализа представлены на рис. 7.
М 1 2 з 4
Рис. 7. Электрофореграмма ДНК, выделенной из клеток Ь-929: 1 - контрольные клетки, 2 -обработанные ГМДП (10 мкг/мл), 3 обработанные ФНОа (500 ед./мл), 4 обработанные ФНОа и ГМДП. На анализ образцов контрольных клеток и клеток, обработанных ГМДП, ДНК выделяли из прикрепленных клеток, а образцы ДНК клеток, обработанных ФНОа и его комбинацией с ГМДП, приготовляли из клеток, открепившихся от подложки.
М - маркеры длины ДНК.
10 000 8000 6000 5000
4000
Из этих данных видно, что в процессе ФНОа-зависимой гибели клеток Ь-929 происходила межнуклеосомальная фрагментация ДНК, что характерно для апоптоза В присутствии ГМДП этот процесс усиливался исчезали высокомолекулярные фрагменты
Таким образом, нами было показано, что в присутствии ГМДП в клетках Ь-929 под действием ФНОа идет более сильная фрагментация ДНК Увеличение степени фрагментированности ДНК в процессе клеточной гибели может приводить к усилению работы системы репарации ДНК, и, как следствие, к быстрому расходу макроэргических соединений и восстановительных эквивалентов В результате этих событий в клеточной культуре может усиливаться их некротическая гибель, происходить переключение морфологического типа гибели клеток с апоптотического на некротический, а также более быстрый переход клеток на поздние стадии апоптоза, при которых происходит нарушение целостности плазматической мембраны Поэтому нельзя исключить, что потенцирующая активность ГМДП может быть обусловлена его декомпактизирующим действием на хроматин клеток Ь-929
Изучение влияния ГМДП на ФНОа-индуцированиую продукцию супероксид-аниона в клетках Ь-929. Известно, что ФНОа-зависимая клеточная гибель сопровождается повышением продукции активных форм кислорода в клетках-мишенях, в частности, в клетках Ь-929 Поэтому нами была изучена возможность ГМДП влиять на продукцию активных форм кислорода в клетках Ь-929, как интактных, так и обработанных ФНОа Исследования проводили методом измерения люцигенин-зависимой хемилкминесценции клеток Клетки Ь-929 распластывали в кюветах люминометра, добавляли препараты ГМДП, ФНОа и люцигенина, а затем проводили измерение уровня хемилюминесценции в разные промежутки времени Полученные данные представлены на рис 8
—♦—Фон
Коетроль, -*- ГМДП —X—ФНОа -*- ФНОо+ГМДП
15 30 45 Время, мин
Рис. 8. Величины люцигенин-зависимой хемилюминесценции клеток Ь-929 в присутствии ГМДП (10 мкг/мл), ФНОа (500 ед /мл) и их комбинации. Эксперименты были проведены минимум три раза. В работе отображены наиболее типичные результаты
Видно, что контрольные клетки не продуцировали заметных количеств акт;.' ■ форм кислорода. Для обработанных ГМДП клеток было зарегистрировано повышение люцигенин-зависимой хемилюминесценции во временном интервале от 5 до 75 мин. максимум ответа наблюдали на 30 минуте после добавления ГМДП. ФНОа также повышал уровень хемилюминесценции люцигенина в образцах клеток Ь-929, однако максимум ответа приходился на 60 мин после добавления ФНОа, и значение максимума было ниже, чем значение, наблюдавшееся для клеток, обработанных ГМДП. Наибольший уровень люцигенин-зависимой хемилюминесценции был зарегистрирован для клеток, обработанных комбинацией ГМДП и ФНОа. Максимум ответа для этого образца наблюдался, как и в случае клеток, обработанных ФНОа, на 60 минуте с момента добавления препаратов. Таким образом, ГМДП не только усиливал продукцию супероксидного анион-радикала клетками Г-929 под действием ФНОа, но и сам обладай способностью индуцировать продукцию О2" в этих клетках.
„ 8 , А
- Контроль Контроль+ротенон
I 4|
¡з-
£ 1 ■ V
а
о
-ГМДП ГМДП+ротенон
/А
.а'7
15 30 45 60 Время, мин
75
15 30 45 Бремя, мин
7 6 5 4 3 2 1 1 \ 0 '
-ФНО
~ ФНО+ротенон
......
15 30 45 Время, мин
60 75
8 5
X
5
I 4
I 31 %
5 2
I 1 ®
из
0 ---
-*-ФНО+ГМДП
♦ ФНО+ГМДП+ротенон ж '
15 30 45 60 Время, мин
75
Рис. 9. Величины люцигенин-зависимой хемилюминесценции клеток 1,-929 в присутствии ГМДП (10 мкг/мл), ФНОа (500 ед./мл), ротенона (0,2 цМ) и их комбинаций.
С целью выяснения, являются ли в данных случаях источником продукции активных форм кислорода митохондрии, мы измеряли уровни люцигенин-зависимой хемилюминесценции клеток Ь-929, обработанных выше указанными препаратами, в присутствии ротенона - ингибитора электрон-транспортной цепи Данные представлены на рис 9 Во всех образцах, за исключением клеток, обработанных комбинацией ГМДП с ФНОа, происходило повышение уровней хемилюминесценции В образце клеток, обработанных ФНОа совместно с ГМДП, происходило значительное снижение уровня люцигенин-зависимой хемилюминесценции Ротенон ингибирует перенос электронов в электрон-транспортной цепи митохондрий на уровне комплекса I (ЫАОН-убихинонредуктазы) Он неховалентно связывается с одной из субъединиц Ь'АВН-убихинонредуктазы, и, вероятно, вытесняя убихинон, предотвращает его восстановление Ингибирование восстановления убихинона может приводить к тому, что электроны с комплекса I могут идти на восстановление кислорода, и таким образом, к генерации суиероксид-аниона Этим явлением можно объяснить наблюдаемое повышение продукции супероксид-аниона в образцах контрольных клеток, а также в образцах клеток, обработанных ФНОа и ГМДП по отдельности В целом, полученные данные свидетельствует об участии электрон-транспортной цепи в зарегистрированных повышениях продукции супероксид-анионов
выводы
1 Установлено, что ГМДП усиливает противоопухолевое действие цнсплатина, ФНОа и их комбинации на моделях мышиных перевиваемых опухолей Подобраны дозы ЦП, ФНОа и ГМДП, а также условия введения комбинаций, обеспечивающие 100%-ную выживаемость мышей с аденокарциномой Эрлиха
2 Показано, что ГМДП снижает токсические проявления комбинации ЦП/ФНОа, введенной интактным мышам, а также нормализует у этих мышей изменения гематологических показателей
3 Установлено, что ГМДП усиливает ФНОа-индуцированную гибель трансформированных мышиных фибробластов Ь-929, что сопровождается усилением фрагментации клеточной ДНК по апоптотическому тичу, снижением митохондриального потенциала клеток и накоплением в среде культивирования эндогенного ФНОа
4 Продемонстрирована способность ГМДП оказывать декомпактизирующее действие на структуру хроматина клеток Ь-929
5 Показано, что ГМДП индуцирует продукцию активных форм кислорода (АФК) в клетках Ь-929, а также усиливает ФНОа-индуцированную продукцию АФК
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ
ПУБЛИКАЦИЯХ
Статьи.
1 Е Е Petrova, ТI Valyakina, М A Simonova. R L Komaleva, S V Khaidukov, E A Makarov, D Y Blokhin, P К Ivanov, T M Andronova, V A Nesmeyanov Muramyl peptides augment cytotoxic effect of tumor necrosis factor-alpha in combination with cytotoxic drugs on tumor cells Int Immunopharmacol 2006,6: 1377-1386
2 E Э Петрова, T И Валякина, P JI Комалева, M А Симонова. В А Несмеянов Глюкозаминилмурамоилдипептид потенцирует действие ФНО-а и цисплатина на трансформированные клеточные линии т vitro Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2007, 143 251-254
Тезисы конференций:
3 ТИ Валякина, ЕЭ Петрова, М А Симонова, РЛ Комалева, С В Хайдуков, В А Несмеянов Комбинация ГМДП, цисплатина и TNF-a обладает противоопухолевым действием и влияет па иммунный статус мьппей-опухоленосителей Медицинская иммунология 2003, 5 350-351
4 МА Симонова. Е Э Петрова, Т И Валякина, С В Хайдуков, В А Несмеянов Влияние комбинации препаратов ГМДП, цисплатина и ФНОа на апоптоз опухолевых клеток ш vivo и соотношение основных субпопуляций лимфоцитов в крови и перитонеальном экссудате мьппей-опухоленосителей XVI зимняя молодежная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва 2004, сборник тезисов докладов и стендовых сообщений, стр 16
5 М Simonova Direct Effects of Glucosammyl Muramyl Dipeptide on Tumor Cells DAAD Summer School on Current Trends in Comparative Immunology", St Petersburg May 22-June 5, 2005 Abstract book, p 25
6 MA Simonova. EE Petrova, RL Komaleva, TI Valyakina, SV Khaidukov, VA, Nesmeyanov Direct Effects of Glucosammyl Muramyl Dipeptide on Tumor Cells 7th John Humphrey Advanced Summer Programme m Immunology "The interface Between Immunology and Medicine" Moscow 2005 Abstract book, p 43
7 M А Симонова. E Э Петрова, P Л Комалева, T И Валякина, В А Несмеянов ГМДП индуцирует у опухолевых клеток секрецию эндогенных факторов, усиливающих цитотоксичность фактора некроза опухолей VII чтения, посвященные памяти академика Ю А Овчинникова Москва-Пущино 2006, сборник тезисов докладов и стендовых сообщений, стр 69
8 Т И Валякина, М А Симонова. Т Н Головина, Е Э Петрова, В А Кадыков, В А Несмеянов Глюкозаминилмурамоилдипептид влияет на структуру хроматина Цитология 2007,49 723-724
Подписано в печать 12 08 2008 г Печать трафаретная
Заказ № 622 Тираж 100экз
Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (499) 788-78-56 аиКигеГега! ги
Содержание диссертации, кандидата химических наук, Симонова, Мария Александровна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.
1.1 Программируемая клеточная гибель и фактор некроза опухолей
1.1.1 Пути реализации апоптоза.
1.1.2 Виды клеточной гибели, отличные от апоптоза.
1.1.3 ФНОа, история открытия, общая характеристика.
1.1.4 Механизм действия ФНОа и его общие биологические эффекты.
1.1.5 Механизм действия ФНОа на клетки L-929.
1.2 Мурамоилпептиды.
1.2.1 Особенности химической структуры мурамоилпептидов.
1.2.2 Биологическая активность мурамоилпептидов.
1.2.3 Клетки-мишени мурамоилпептидов.
1.2.4 Молекулярные механизмы биологического действия мурамоилпептидов.
1.2.5 Использование мурамоилпептидов в противоопухолевой терапии.
1.2.6 Совместные эффекты мурамоилпептидов с различными веществами.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние глюкозаминилмурамоилдипептида на биологическую активность цисплатина и фактора некроза опухолей-α"
Несмотря на безусловные достижения современной онкологии проблема повышения эффективности методов лечения злокачественных новообразований по-прежнему важна. Приоритетными задачами являются поиск и разработка принципиально новых подходов, а также усовершенствование традиционных способов лечения онкологических заболеваний. Неотъемлемой частью терапии злокачественных опухолей остается применение широкого спектра противоопухолевых химиопрепаратов и цитокинов. В связи с тем, что химиопрепараты высоко токсичны для организма, наиболее перспективно их использование в сочетании с иммуномодуляторами. Данный подход позволяет снижать дозу химиопрепаратов без снижения эффективности терапии. К числу успешно применяемых иммуномодулирующих агентов относятся мурамоилпептиды (МП) -фрагменты клеточных стенок бактерий и их производные, полученные путем химического синтеза. Они стимулируют цитотоксическую активность эффекторных клеток иммунной системы: макрофагов, NK-клеток, лимфоцитов, и индуцируют продукцию ряда цитокинов, в том числе фактора некроза опухолей-а (ФНОа), проявляющего токсическое действие в отношении опухолевых клеток. В ИБХ РАН проводится изучение ГМДП - N-ацетилглюкозаминил-р 1 —>4-М-ацетилмурамоил-аланил-Б-изоглутамина, обладающего иммуномодулирующей и противоопухолевой активностью. Было показано непосредственное действие ГМДП на опухолевые клетки различных линий. ГМДП вызывал изменения в экспрессии мембранных антигенов опухолевых клеток, а именно опухолеассоциированных антигенов (ОАА), молекул адгезии, антигенов главного комплекса гистосовместимости II класса и др. Одним из последствий изменений спектра экспрессируемых антигенов явилось усиление цитолиза опухолевых клеток аллогенными мононуклеарными клетками крови in vitro. Кроме того, ГМДП усиливал цитотоксическое действие ФНОа и цитостатиков на опухолевые клетки. Данный эффект ГМДП наблюдался на клетках как постоянных линий, так и полученных от онкологических больных. Следует подчеркнуть, что ГМДП не усиливал цитотоксического действия цисплатина и ФНОа на нормальных клетках.
В связи с выше сказанным нам представилось важным и интересным оценить перспективу использования ГМДП совместно с цитостатиками и цитокинами в противоопухолевой терапии. С этой целью изучалось влияние ГМДП на противоопухолевую активность химиопрепарата цисплатина (ЦП) и ФНОа, а также их комбинации, на моделях мышиных перевиваемых опухолей — аденокарциномы Эрлиха, меланомы В-16 и лимфолейкоза Р-388. Важно также было выяснить механизм потенцирующей активности ГМДП в отношении цитотоксического эффекта ФНОа на модели ФНОа-чувствительных клеток, поскольку его знание могло бы сыграть существенную роль в оптимизации подбора препаратов при их комплексном применении с МП в терапии онкологических заболеваний. Поэтому в данной работе более подробно изучалось влияние ГМДП на проявления активности ФНОа на модели ФНОа-чувствительных клеток линии Ь-929.
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Симонова, Мария Александровна
выводы
1. Установлено, что ГМДП усиливает противоопухолевое действие цисплатина, ФНОа и их комбинации на моделях мышиных перевиваемых опухолей. Подобраны дозы ЦП, ФНОа и ГМДП, а также условия введения комбинаций, обеспечивающие 100%-ную выживаемость мышей с аденокарциномой Эрлиха.
2. Показано, что ГМДП снижает токсические проявления комбинации ЦП/ФНОа, введенной интактным мышам, а также нормализует у этих мышей изменения гематологических показателей.
3. Установлено, что ГМДП усиливает ФНОа-индуцированную гибель трансформированных мышиных фибробластов Ь-929, что сопровождается усилением фрагментации клеточной ДНК по апоптотическому типу, снижением митохондриального потенциала клеток и накоплением в среде культивирования эндогенного ФНОа.
4. Продемонстрирована способность ГМДП оказывать декомпактизирующее действие на структуру хроматина клеток Ь-929.
5. Показано, что ГМДП индуцирует продукцию активных форм кислорода (АФК) в клетках Ь-929, а также усиливает ФНОа-индуцированную продукцию АФК.
2.3 Заключение
На первом этапе данной работы оценивалась возможность использования ГМДП в противоопухолевой терапии мышей-носителей опухолей различной этиологии: аденокарциномы Эрлиха, меланомы В-16 и лимфолейкоза Р-388. Было показано, что ГМДП на данных моделях не обладал значимой противоопухолевой активностью, однако его выраженные иммуномодулирующие свойства позволяли надеяться на успешное применение данного мурамоилпептида в комбинации с химиопрепаратами и цитокинами. В настоящем исследовании в качестве основного химиопрепарата использовали цисплатин, препарат, широко применяемый для химиотерапии ряда злокачественных новообразований. Клетки выше указанных опухолей чувствительны к цисплатину. В качестве цитокина использовали ФНОа, который кроме цитотоксического обладает иммуномодулирующим действием. Аденокарцинома Эрлиха и меланома В-16 чувствительны к цитотоксическому действию ФНОа, клетки лимфолейкоза Р-388 резистентны к данному цитокину.
Было показано, что ГМДП на моделях выше перечисленных опухолей усиливал противоопухолевое действие цисплатина. В случаях ФНОа-чувствительпых меланомы file и аденокарциномы Эрлиха, ГМДП также усиливал противоопухолевое действие ФНОа, что согласуется с данными, полученными для этих клеток в системах in vitro. Основной задачей данного этапа работы явилось подробное изучение действия тройной комбинации ЦП/ФНОа/ГМДП на исследуемых моделях. Впервые показано, что данная комбинация с определенными дозами составляющих ее препаратов оказалась более эффективной при лечении мышей с аденокарциномой Эрлиха и меланомой В-16, чем составляющие ее препараты в тех же дозах по отдельности или парные сочетания препаратов.
В случае аденокарциномы Эрлиха стопроцентной выживаемости мышей-опухоленосителей удалось добиться как при единовременном, так и при многократном введении комбинации. Следует отметить, что обе дозы ЦП (40 и 80 мкг на мышь), входящие в состав комбинаций, обеспечивающих стопроцентную выживаемость мышей с аденокарциномой Эрлиха, были значительно ниже, чем его полулетальная доза (ЛД50), которая для мышей при внутрибрюшинном введении составляет 250 мг на мышь [282] Также следует подчеркнуть, что предлагаемая доза ФНОа (500 ед. на мышь, что соответствует концентрации в кровотоке менее 10"9 М) находится в диапазоне доз, безвредных для организма [22]. Кроме того, для ГМДП показана детоксицирующая активность, выражающаяся в предотвращении проявления острой токсичности комбинации ЦП/ФНОа.
На следующем этапе работы на модели ФНОа-чувствительпых клеток L-929 изучали влияние ГМДП на различные стадии реализации цитотоксического действия ФНОа. Следует отметить, что ГМДП не проявлял токсической активности в отношении данных клеток. Было показано, что ГМДП усиливал ФНОа-индуцированную гибель клеток L-929. При этом увеличивалось содержание клеток, находящихся на поздних стадиях апоптоза. В клетках, обработанных комбинацией ГМДП с ФНОа, отмечалось значительное снижение мембранного митохондриального потенциала как по сравнению с контрольными (необработанными) клетками, так и по сравнению с клетками, обработанными препаратами ГМДП или ФНОа по отдельности. Кроме того, нами было показано, что в клетках, погибших в результате действия ФНОа в присутствии ГМДП, ДНК была фрагментирована в большей степени, чем в клетках, обработанных одним ФНОа. Последний факт может быть объяснен влиянием ГМДП на нуклеосомальную структуру хроматина, что было показано методом электронной микроскопии. Хроматин клеток, обработанных ГМДП, отличался большей декомпактизацией нуклеосом по сравнению с контрольными клетками. Кроме того, для хроматина, выделенного из обработанных ГМДП клеток было отмечено меньшее содержание гистона HI. Следует отметить, что ГМДП вызывал выше означенные изменения в структуре хроматина не только при инкубации с ним интактных клеток, но и предварительно выделенных ядер. Поэтому молено предположить, что обработка клеток L-929 ГМДП приводит к тому, что их ДНК из-за общего ослабления связи с ней гистона HI становится более доступной для ферментов - эндонуклеаз, активизирующихся в процессе ФНОа-зависимой сигнализации, ведущей к гибели этих клеток. Это предположение подкрепляется ранее полученными данными о способности ГМДП конкурировать с ДНК за связывание с гистоном Н5 цыпленка (аналог гистона HI млекопитающих) и усиливать межнуклеосомальную деградацию ДНК под действием микрококковой нуклеазы [276]. Расщепление ДНК приводит к усилению активности системы ее репарации и большему расходу энергетических эквивалентов (нуклеозидтрифосфатов) в клетках. В результате происходят нарушения в работе митохондрий, и, как следствие, падение их мембранного электрохимического потенциала. Изменение степени ассоциации гистона HI с ДНК также может приводить к изменению экспрессии генов в обработанных ГМДП клетках. Однако в нашем случае, даже если такие изменения имеют место, они не важны для реализации потенцирующего эффекта ГМДП, поскольку этот эффект наблюдается в присутствии ингибитора транскрипции актиномицина Д [29].
Было также показано, что ГМДП индуцирует в клетках L-929 секрецию в культуральную среду эндогенного ФНОа. Однако его количества невелики и не могут обеспечить наблюдаемый для ГМДП потенцирующий эффект по отношению к цитотоксичности экзогенного ФНОа. Индукция секреции ФНОа клетками под действием ГМДП может, с одной стороны, зависеть от синтеза ФНОа de novo, и это может быть связано с прямым влиянием ГМДП на структуру клеточного хроматина. С другой стороны, для клеток L-929 было показано, что в них конститутивно присутствует мРНК, кодирующая ФНОа [41]. Возможно, что ГМДП индуцирует транскрипцию этой мРНК и дальнейшую секрецию ФНОа. У
Продемонстрирована способность ГМДП индуцировать продукцию О " в клетках L-929, а также усиливал ее под действием ФНОа. Данный эффект ГМДП может быть вызван его влиянием на структуру хроматина, поскольку известно, что при модификациях ДНК в клетках может усиливаться продукция активных форм кислорода [2, 7]. Генерация супероксид-радикала под действием ГМДП может быть не связана с митохондриями. В частности, было показано, что ГМДП напрямую активизирует систему окисления цитохрома р450 в мембранной фракции печени [266], и известно, что данная система также может быть источником активных форм кислорода [283].
Итак, в данной работе были изучены некоторые аспекты влияния ГМДП на биологическую активность ФНОа. Однако вопрос о механизме действия данного мурамоилпептида остается открытым. Для окончательного выяснения механизма действия ГМДП на опухолевых клетках необходимо дальнейшее проведение экспериментов. В частности, учитывая то, что в индукции ФНОа-зависимой гибели клеток Ь-929 в качестве вторичного мессенджера участвует церамид, представляется нужным и интересным определить влияние ГМДП на цитотоксическое действие церамида на этих клетках. Несмотря на то, что потенцирующее действие ГМДП не зависит от синтеза белка, необходимо проверить, экспрессируется ли белок N002 в клетках Ь-929, и, в конечном счете, не изменяется ли профиль экспрессии генов в данных клетках под действием ГМДП.
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали культуральную среду и другие составляющие ростовой среды фирмы «Gibco» (Европа), растворы 0,25% трипсина и Версена - «ПанЭко» (РФ), пластиковую культуральную посуду - «Nunc» (Дания).
Диметилсульфоксид (ДМСО) был получен от фирмы «Мегск» (Германия), 0,4% раствор трипанового синего — от «Gibco» (Европа), актиномицин Д, 7-ААД, бромистый этидий, йодистый пропидий, люцигенин, МТТ, смесь фенол:хлороформ:изопропиловый спирт (25:24:1), родамин 123, РНКаза А, ротенон - от «Sigma» (США), набор реактивов «Annexin V-FITC Kit» — от «Immunotech» (Франция), протеиназа К - от «BRL» (США), маркеры молекулярного веса ДНК - от «СибЭпзим» (РФ).
М-ацетилглюкозаминил-(р 1 -4)-М-ацетилмурамоил-аланил-Э-изоглутамин (ГМДП) и М-ацетилглюкозаминил-(р 1 -4)-М-ацетилмурамоил-аланил-Ь-изоглутамин (LL-ГМДП), были синтезированы в лаборатории химии пептидов ИБХ РАН согласно ранее описанной методике [60]. п
Рекомбинантный человеческий ФНОа (активность 5x10 ед. на 1 мг белка) был получен от НИКТИ БАВ «Вектор» (РФ), цисплатин (готовый лекарственный препарат) -от фирмы «Эбеве» (Швеция).
Антитела к рецептору TNFR1 были получены от фирмы «BioLegend» (США), антитела к гистону HI — от «Biomeda» (США), нейтрализующие антитела к ФНОа - от «Caltag» (США). Конъюгат антител против гистона HI с частицами коллоидного золота был синтезирован И.А. Любавиной (лаборатория биотехнологии ИБХ РАН) по ранее описанной методике [284]. Размер частиц коллоидного золота составил 16 нм.
Клетки мышиной фибросаркомы L-929 были получены из Американской типовой коллекции клеточных культур (США), клетки аденокарциномы Эрлиха, меланомы В-16 и лимфолейкоза Р-388 были получены из коллекции клеточных культур ОНЦ РАМН.
Культивирование клеток. Клетки L-929 культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% ЭТС и 10 мкг/мл гентамицина. Клетки росли в культуральных флаконах
9 П площадью 25 см в СОг-инкубаторе (37 С, 5% СОг). С поверхности флаконов клетки снимали инкубацией в течение 3 минут с растворами трипсина (0,25%) и Версена (1:1). После центрифугирования на 300 g при комнатной температуре в течение 10 мин клеточный осадок ресуспендировали в полной ростовой среде. Отбирали из образца аликвоту и с помощи камеры Горяева определяли концентрацию клеток. Плотность клеточной суспензии доводили до нужной величины и клетки использовали для экспериментов или дальнейшего культивирования.
Модели экспериментальных опухолей и схемы введения препаратов
Мыши линий Ва1Ь/С, С57В1/6), Р1[СВАхС57В1/б]] и БВА/2 были получены из питомника «Столбовая» Московской области (РФ).
Аденокарцинома Эрлиха
Клетки асцитной карциномы Эрлиха поддерживали на мышах Ва1Ь/С. Развитый асцит (10 дней после имплантации опухолевых клеток) центрифугировали 10 мин на 300§ при комнатной температуре, суспендировали в физиологическом растворе, доводили до концентрации 5, 10 или 50 млн. клеток в 1 мл и вводили внутрибрюшинно мышам линии Ва1Ь/С в количестве 1, 2 или 10 млн. клеток на мышь в объеме 0,2 мл.
Через 2 суток после введения клеток внутрибрюшинно, подкожно или внутривенно вводили растворы препаратов ЦП, ФНОа и ГМДП в физиологическом растворе в разных шприцах (0,2 мл на мышь). При однократном введении использовали дозы: ЦП - 40 или 80 мкг на мышь, ФНОа - 5000, 2000, 500, 250 или 50 ед. на мышь и ГМДП - 160, 150, 80, 45, 40, 20, 15, 10, 1,5 0,15 и 0,05 мкг на мышь. Контрольным животным вводили физиологический раствор. В качестве стандартного препарата использовали ЦП в дозе 40 или 80 мкг на мышь. £.
В экспериментах с многократным введением препаратов комбинация состояла из
ЦП (40 мкг на мышь), ФНОа (500 ед. на мышь) и ГМДП (0,05 мкг на мышь). Комбинацию
Г- ' препаратов заданного состава и ЦП, используемый в качестве стандартного препарата, вводили мышам-опухоленосителям, которым имплантировали клетки аденокарциномы Эрлиха в количестве 10 млн., 1 раз в неделю в течение 1 месяца.
В экспериментах с разновременным введением препаратов мышам-опухоленосителям, которым имплантировали опухолевые клетки в дозе 10 млн. на мышь, через 2 дня после имплантации клеток внутрибрюшинно вводили ГМДП в дозе 0,05 мкг на мышь, а затем через 1 сутки внутрибрюшинно вводили ЦП (40 мкг на мышь) и ФНОа (500 ед. на мышь).
Выживаемость животных оценивали в течение 90 суток со дня введения опухолевых клеток с интервалом наблюдения 10 дней.
Меланома В-16
Клетки меланомы В-16 поддерживали на мышах линии С57В1/6]. Развитую солидную опухоль (10 дней после имплантации), освобождали от соединительной ткани, взвешивали, измельчали в гомогенизаторе Поттера, центрифугировали 10 мин на 300g при комнатной температуре, суспендировали в физиологическом растворе из расчета 200 мкг опухоли на 1 мл и вводили подкожно в область спины мышам Р1[СВАхС57В1Лу] в дозе 50 мкг на мышь.
Через 2 суток вводили подкожно, внутрибрюшинно или внутривенно в физиологическом растворе препараты ЦП (40 мкг на мышь), ФНОа (500 ед. на мышь) и ГМДП (0,05 мкг на мышь) или их комбинации в объеме 0,2 мл в разных шприцах. Препараты и их комбинации вводили 1 раз в неделю в течение всего срока наблюдения (2 месяца). Контролем служили мыши-опухоленосители, которым вводили физиологический раствор. В качестве стандартного препарата вводили ЦП (40 мкг на мышь). Группа животных, которым вводили одинаковую комбинацию препаратов, включала 10 особей.
В экспериментах по изучению влияния предварительного введения мурамоилпептида на эффективность лечения инъекцию ГМДП (0,05 мкг на мышь) производили через 1 сутки после имплантации опухолевых клеток и за 1 сутки до введения комбинации препаратов. Для лечения использовали комбинацию препаратов ЦП (40 мкг на мышь), ФНОа (500 ед. на мышь) и ГМДП (0,05 мкг на мышь), которую вводили мышам-опухоленосителям 1 раза в неделю в течение всего срока наблюдения.
В течение 90 суток со дня введения опухолевых клеток с интервалом 10 дней оценивали выживаемость мышей, а по окончании срока наблюдения вычисляли их среднюю продолжительность жизни.
Лимфолейкоз Р-388
Клетки асцитного лимфолейкоза Р-388 поддерживали на мышах БВА/2. Развитый асцит (10 дней после имплантации опухолевых клеток) центрифугировали 10 мин на 300§ при комнатной температуре, суспендировали в физиологическом растворе, доводили до концентрации 5 млн. клеток на 1 мл и вводили внутрибрюшинно мышам линии БВА/2 в количестве 1 млн. клеток на мышь в объеме 0,2 мл.
Через 1 сутки мышам вводили внутрибрюшинно в физиологическом растворе в объеме 0,2 мл препараты ЦП (160 мкг на мышь), ФНОа (500 ед. на мышь) и ГМДП (0, 015, 0,15, 1,5, 15 и 150 мкг на мышь) или их комбинации в одном шприце. Инъекцию производили однократно. Контрольным мышам вводили физиологический раствор.
В экспериментах с многократным введением препаратов комбинация состояла из ЦП (40 и 80 мкг на мышь), ФНОа (500 ед. на мышь) и ГМДП (0,05 и 0,15 мкг на мышь). Контролем служили мыши-опухоленосители, которым вводили физиологический раствор. В качестве стандартного препарата вводили ЦП (40 и 80 мкг на мышь). Группа животных, которым вводили одинаковую комбинацию препаратов, включала 10 особей.
В течение 40 суток со дня введения опухолевых клеток с интервалом 10 дней оценивали выживаемость мышей, а по окончании срока наблюдения вычисляли их среднюю продолжительность жизни.
Определение выживаемости и средней продолжительности жизни экспериментальных животных
Выживаемость определяли по формуле: S=(A/B)xlOO%, где А - число живых мышей на данный срок наблюдения после прививки опухоли, В - исходное число мышей в группе. Среднюю продолжительность жизни в сутках определяли по методу Каплана-Мейера [285].
Тестирование токсичности комбинации препаратов ЦП/ФНОа/ГМДП на мышах
Тестирование токсичности исследуемых комбинаций препаратов проводили на мышах Fl [CBAxC57Bl/6j].
Для проведения теста по изменению массы мышей (подосторая токсичность) под влиянием исследуемых комбинаций препаратов ЦП/ФНОа и ЦП/ФНОа/ГМДП использовали 3 группы мышей. Мышам из первой группы вводили ЦП (40 мкг на мышь) и ФНОа (500 ед. на мышь), мышам из второй группы - ЦП (40 мкг на мышь), ФНОа (500 ед. на мышь) и ГМДП (0,05 мкг на мышь), мышам из третьей группы - физиологический раствор. Препараты вводили мышам внутрибрюшинно однократно. Каждая экспериментальная группа включала 10 мышей. Мышей взвешивали до введения
Г/ ч препаратов и на 1, 3 и 7 сутки после введения препаратов и высчитывали процент прироста массы мышей по отношению к контрольной группе, в которой прирост был принят за 100%.
Для определения острой токсичности комбинаций ЦП/ФНОа и ЦП/ФНОа/ГМДП вводили внутрибрюшинно в однократных, двукратных, четырехкратных и восьмикратных дозах: ЦП 40, 80, 160 и 320 мкг на мышь; ФНО 500, 1000, 2000 и 4000 ед. на мышь и ГМДП 0,05, 0,1, 0,2 и 0,4 мкг на мышь. Каждая экспериментальная группа включала 10 мышей. Учитывали гибель мышей в течение 7 дней. Оценку результатов производили по проценту гибели животных. Среднелетальная доза была рассчитана по методу Ван дер Вардена [286].
Для определения хронической токсичности, вызываемой исследуемыми нами комбинациями препаратов ЦП/ФНОа и ЦП/ФНОа/ГМДП, мышам внутрибрюшинно вводили 1/10 части дозы каждого из препаратов, составляющих комбинацию, в равных аликвотах в течение 10 дней. Единовременно мышам вводили: первой группе - ЦП (4 мкг на мышь), ФНОа (50 ед. на мышь) и ГМДП (0,005 мкг на мышь); второй - ЦП (4 мкг на мышь) и ФНОа (50 ед. на мышь); третьей - физиологический раствор. Каждая экспериментальная группа включала 10 мышей. Перед каждым введением препаратов мышей взвешивали. После последней инъекции препаратов мышей взвешивали еще в течение 7 дней и определяли процент прироста массы животных по отношению к контрольной группе, в которой прирост был принят за 100%.
Тестирование влияния комбинации ЦП/ФНОа/ГМДП на гематологические показатели мышей
Для определения влияния исследуемых комбинаций на гематологические показатели мышам внутрибрюшинно вводили ЦП (40 мкг на мышь) и ФНОа (500 ед. на мышь) или ЦП (40 мкг на мышь), ФНОа (500 ед. на мышь) и ГМДП (0,05 мкг на мышь). Контролем служили мыши, которым вводили физиологический раствор. Каждая группа животных включала 10 особей. Через 7 суток после введения препаратов у мышей из глазного синуса забирали кровь, делали мазки, окрашивали их по методу Романовского-Гимза и под микроскопом определяли количество сегментоядерных нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов.
Определение содержания апоптотических и некротических клеток L-929 в культурах проводили при помощи набора реактивов «Annexin V-FITC Kit» по стандартной методике, описанной ниже (все процедуры проводились при температуре 4°С). Клетки снимали с подложки с помощью трипсина и промывали два раза ФСБ (рН 7,4) центрифугированием на 300 g в течение 10 мин. Полученные осадки клеток ресуспендировали в связывающем буфере (плотность клеток 5x10б кл./мл). К суспензиям клеток объемами по 100 мкл добавили по 5 мкл раствора аннексина V-ФЛИТЦ и по 2,5 мкл раствора йодистого пропидия и перемешивали на миксере. Образцы инкубировали 10 мин на льду в темноте. По окончании инкубации к каждому из образцов клеток добавили по 150 мкл связывающего буфера. Образцы анализировали на проточном цитометре «Epics Elite» (Beckman Coulter, США).
Оценка жизнеспособности клеток в тесте с МТТ [287]
Клетки (2x105 клеток в мл) в объеме 100 мкл полной ростовой среды помещали в лунки 96-луночного культурального плоскодонного планшета. Клетки инкубировали в СОг-инкубаторе (37°С, 5% СОг) в течение ночи, затем к ним добавляли тестируемые препараты, растворенные в ФСБ (рН 7,4), в объемах 20 мкл на лунку. Объем жидкости в каждой лунке планшета доводился ФСБ (рН 7,4) до 200 мкл. Затем проводили инкубацию в течение 24-48 часов в СОг-инкубаторе (см. выше). По окончании инкубации в каждую лунку планшета вносили по 20 мкл раствора МТТ в ФСБ (2,5 мг/мл) и инкубировали клетки в СОг-инкубаторе в течение 2 ч. По окончании инкубации из лунок планшета удаляли среду и добавляли по 100 мкл ДМСО. После полного растворения образовавшихся кристаллов проводили измерение оптической плотности в каждой лунке планшета с помощью планшетного спектрофотометра «Spectra Count» (Packard, США) при длине волны 540 нм. Цитотоксичность, выраженную в процентах, определяли по формуле С=Вх100%/А, где А — значение оптической плотности в контроле (клетки, к которым вместо препаратов добавляли ФСБ), В — значение оптической плотности в лунке с клетками, обработанными теми или иными препаратами, С - цитотоксичность.
Анализ рецепторов к ФНОа на поверхности клеток L-929
Суспензии клеток L-929 (5x105 клеток на лунку) в объеме 0,5 мл полной ростовой среды помещали в лунки 24-луночного плоскодонного планшета. Клетки инкубировали в СОг-инкубаторе в течение ночи, затем к ним добавляли препарат ГМДП в конечной концентрации 10 мкг/мл. Объем жидкости в каждой лунке планшета доводился средой без ЭТС до 1 мл. Затем проводили инкубацию в течение 0,5, 1, 4 и 6 часов в СОг-инкубаторе. По окончании инкубации клетки снимали пипетированием, промывали ФСБ (рН 7,4), центрифугируя их в течение 10 мин на 300 g при температуре 4°С. Клеточные осадки ресуспендировали в 100 мкл холодного ФСБ (рН 7,4) с 2% ЭТС и 0,02% азида натрия, к ним добавляли по 3 мкл раствора антител против мышиного TNFR1 (aHTH-CD120a), меченых фикоэритрином и перемешивали на миксере. Образцы инкубировали, при 4°С в течение 20 мин на льду, после чего к ним добавляли по 3 мкл 0,005% раствора 7-А АД, перемешивали на миксере и инкубировали еще 10 мин на льду. По окончании инкубации клетки промывали ФСБ (рН 7,4) с ЭТС и азидом натрия центрифугированием в течение 10 мин на 300 g при температуре 4°С, осадки ресуспендировали в 0,5 мл ФСБ (рН7,4) с ЭТС и азидом натрия. Образцы анализировали на проточном цитометре «Cytomics FC500» (Beckman Coulter, США). С целью исключения из анализа мертвых клеток детектировали только 7-ААД-негативные события.
Выделение ядер из клеток L-929
Клетки промывали дважды холодным ФСБ (рН 7,4) и снимали с подложки пипетированием, после чего осаждали центрифугированием при 300 g и 4°С в течение 10 мин. Супернатант отбирали, а осадок клеток ресуспендировали в холодном буфере для экстракции ядер (10 mM HEPES, (рН 7,4) 320 гаМ сахарозы, 5 шМ MgCh, 1% тритон-XI00) из расчета 1 мл на 1 млн клеток, осторожно перемешивали на миксере и инкубировали 10 мин на льду. Эффективность выделения ядер контролировали в световой микроскоп с использованием красителя трипанового синего. По окончании инкубации ядра осаждали центрифугированием на 2000 g при 4°С в течение 10 мин. Осадок промывали дважды в буфере для ядер (10 шМ HEPES (рН 7,4) 320 шМ сахарозы, 5 шМ
MgCb) центрифугированием (см. выше), и ресуспендировали в 100 мкл того же буфера. Полученную суспензию ядер использовали для выделения хроматина.
Приготовление образцов для электронной микроскопии
Выделенные ядра лизировали гипотоническим шоком. Образцы хроматина объемом 7 мкл помещали на медные сеточки для электронной микроскопии, покрытые пленкой из пиелоформа, и инкубировали в течение 1 мин при комнатной температуре. Избыточную жидкость отбирали, сеточки инкубировали с антителами к гистону HI, мечеными коллоидным золотом в течение 30 мин при комнатной температуре. По окончании инкубации образцы высушивали и проводили их контрастирование 1% раствором уранилацетата в течение 50 сек. Образцы на сеточках высушивали и анализировали на трансмиссионном электронном микроскопе «JEM 100СХ» (Jeol, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.
Анализ прохождения клеток по клеточному циклу
Суспензии клеток L-929 (6x104 клеток на лунку) в объеме 0,5 мл полной ростовой среды помещали в лунки 24-луночного плоскодонного планшета. Клетки инкубировали в СОг-инкубаторе в течение ночи, затем к ним добавляли препарат ГМДП в конечной концентрации 10 мкг/мл. Объем жидкости в каждой лунке планшета доводился средой без ЭТС до 1 мл. Затем проводили инкубацию в течение 3, 6, 12 и 24 часов в СОг-инкубаторе. По окончании инкубации клетки снимали раствором Версена, промывали два раза ФСБ (рН 7,4), центрифугируя их в течение 10 мин на 300 g при температуре 4°С. Клеточные осадки ресуспендировали в 1 мл ФСБ (рН 7,4), к ним добавляли по 2 мл холодного 96% I этанола и перемешивали на миксере. Образцы инкубировали при 4°С в течение 2 ч, после чего промывали 2 раза ФСБ (рН 7,4) центрифугированием в течение 10 мин на 1000 g при температуре 4°С. К осадкам клеток добавляли 0,5 мл раствора РНКазы, не содержащей ДНКазы (0,5 мг/мл), в ФСБ (рН 7,4) и 40 мкл водного раствора йодистого пропидия (1 мг/мл) и инкубировали 30 мин при комнатной температуре в темноте. Образцы анализировали на проточном цитометре «Epics Elite» (Beckman Coulter, США).
Оценка величины мембранного потенциала митохондрий в клетках L-929
Суспензии клеток L-929 (1x105 клеток на лунку) в объеме 0,5 мл полной ростовой среды помещали в лунки 24-луночного плоскодонного планшета. Клетки инкубировали в СОг-инкубаторе в течение ночи, затем к ним добавляли препараты ГМДП и ФНОа в конечных концентрациях 10 мкг/мл и 500 ед./мл, соответственно. Объем жидкости в каждой лунке планшета доводился средой без ЭТС до 1 мл. Затем проводили инкубацию в течение 2, 4, 6 и 9 часов в СОг-инкубаторе. За час до окончания инкубации к клеткам добавляли раствор родамина 123 в ДМСО в конечной концентрации 1|аМ. По окончании инкубации клетки снимали пипетированием, промывали ФСБ (рН 7,4), центрифугируя их в течение 10 мин на 300 g при комнатной температуре. Клеточные осадки ресуспендировали в 0,5 мл ФСБ (рН 7,4). Образцы анализировали на проточном цитометре «Cytomics FC500» (Beckman Coulter, США). Детекцию флуоресценции осуществляли на ФЭУ1. Оценивали величины средней флуоресценции клеток, относительную величину флуоресценции вычисляли по формуле: ОФ=СО/СК, где ОФ -относительная величина флуоресценции, СО - средняя величина флуоресценции обработанных клеток, СК - средняя величина флуоресценции контрольных клеток.
Анализ фрагментации ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле
Суспензии клеток L-929 (2x10б клеток на флакон) в объеме 5 мл полной ростовой о , среды помещали в культуральные флаконы площадью 25 см . Клетки инкубировали в СОг-инкубаторе в течение ночи, затем к ним добавляли препараты ГМДП и ФНОа в конечной концентрации 10 мкг/мл и 500 ед./мл, соответственно. Далее проводили инкубацию в течение 48 часов в СОг-инкубаторе. По окончании инкубации клетки снимали с поверхности флаконов пипетированием и промывали 2 раза холодным ФСБ (рН 7,4), центрифугируя их в течение 10 мин на 300 g при температуре 4°С. К образцам клеток (по 2х10б клеток на образец) добавляли по 300 мкл лизирующего буфера (10 шМ tris-HCl, рН 8,0, 3 шМ MgCl2, 10 шМ NaCl, 0,5% NP-40), перемешивали на миксере и инкубировали 10 мин во льду. По окончании инкубации к образцам добавляли по 12,5 мкл 10% раствора додецилсульфата натрия и по 2 мкл раствора протеиназы К (20 мг/мл) и инкубировали образцы при 50°С в течение 1 ч. Далее к образцам добавляли по 2 мкл раствора РНКазы А (10 мг/мл) и проводили инкубацию образцов при 37°С в течение 1 ч. По окончании инкубации производили экстракцию ДНК, добавляя к образцам по 1 объему смеси фенол:хлороформ:изопропиловый спирт (25:24:1) с интенсивным перемешиванием. Образцы центрифугировали при 13 000 g в течение 10 мин при 4°С. Образовавшиеся водные фазы переносили в новые пробирки и производили осаждение ДНК добавлением по 0,1 объема 3 М ацетата натрия и 2 объемов 96% этанола и последующей инкубацией при -18°С в течение 1 ч. По окончании инкубации образцы центрифугировали на 13 000 g в течение 10 мин при 40С. Удаляли супернатант, а осадок высушивали и растворяли в 10 мкл буфера ТЕ (10 шМ tris-HCl, 1 шМ ЭДТА, рН 8,0). К полученным растворам добавляли 10х буфер нанесения (ТЕ, 0,1% ксиленцианол, 0,1% бромфеноловый синий, 50% глицерин). Образцы анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия. В качестве электродного буфера использовали ТАЕ (40 шМ tris-CH3COOH, 1 шМ ЭДТА, рН 8,0), электрофорез проводили при постоянном напряжении 60 В.
Оценка продукции супероксид-аниона клетками L-929
Суспензии клеток L-929 (4x106 клеток на кювету) в объеме 3 мл полной ростовой среды помещали в полистирольные кюветы хемилюминометра. Клетки инкубировали в течение ночи в роллерном инкубаторе, затем культуральную среду в кюветах заменяли на раствор Хэнкса, содержащий 5% ЭТС и добавляли препараты ГМДП (10 мкг/мл), ФНОа (500 ед./мл), люцигенина (100 цМ), ротенона (0,2 цМ). Образцы помещали в хемилюминометр «LUMINOMETER» 1251 (LKB, Швеция) и в течение 75 мин измеряли хемилюминесценцию образцов при 37°С. Эксперименты были проведены минимум три раза. В работе отображены наиболее типичные результаты.
Статистическая обработка данных
Статистическую обработку проводили с помощью встроенного статистического пакета программы «MS Excel». Для оценки достоверности различий использовали t-критерий Стьюдента.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Симонова, Мария Александровна, Москва
1. Ярилин А. Апоптоз: природа феномена и его роль в норме и при патологии, в кн. Актуальные проблемы патофизиологии, под ред. Б. Мороза. Медицина: Москва, 2001. С. 13-56.
2. Самуилов В., Олескин А., Лагунова Е. Программируемая клеточная смерть. (2000) Биохимия. 65(8), 1029-1046.
3. Kerr J., Wyllie A., Currie A. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wideranging implications in tissue kinetics. (1972) Br J Cancer. 26(4), 239-257.
4. Guimaraes C., Linden R. Programmed cell deaths. Apoptosis and alternative deathstyles. (2004) Eur J Biochem. 271(9), 1638-1650.
5. Okada H., Mak T. Pathways of apoptotic and non-apoptotic death in tumour cells. (2004) Nat Rev Cancer. 4(8), 592-603.
6. Барышников А., Шишкин Ю. Иммунологические проблемы апоптоза. Москва: Эдиториал УРСС, 2002. С. 11-14.
7. Adams J. Ways of dying: multiple pathways to apoptosis. (2003) Genes Dev. 17(20), 2481-2495.
8. Cohen G. Caspases: the executioners of apoptosis. (1997) Biochem J. 326(Pt 1), 1-16.
9. Riedl S., Shi Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. (2004) Nat Rev Mol Cell Biol. 5(11), 897-907.
10. Ashkenazi A., Dixit V. Death receptors: signaling and modulatioa (1998) Science. 281(28), 1305-1308.
11. Shu K., Li В., Wu L. The p53 network: p53 and its downstream genes. (2007) Colloids Surf В Biointerfaces. 55(1), 10-18.
12. Lleo A., Invernizzi P., Selmi C., Coppel R., Alpini G., Podda M., Mackay I., Gershwin M. Autophagy: Highlighting a novel player in the autoimmunity scenario. (2007) J Autoimmunity. 29, 61-68.
13. Han S., Kim Y.-S., Kim T.-H. Role of apoptotic and necrotic cell death under physiologic conditions. (2008) BMB Reports. 41(1), 1-10.
14. Carswell E., Old L., Kassel R., Green S., Fiore N., Williamson B. An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors. (1975) Proc Natl Acad Sci USA. 72(9), 3666-3670.
15. Ярилин А. Основы иммунологии. Москва: Медицина, 1999. С. 259-262.
16. Kriegler M., Perezb С., DeFaya К., Alberta I., Lu S. A novel form of TNF/cachectin is a cell surface cytotoxic transmembrane protein: Ramifications for the complex physiology of TNF. (1988) Cell. 53(1), 45-53.
17. Tang P., Hung M.-C., Klostergaard J. Human pro-tumor necrosis factor is a homotrimer. (1996) Biochemistry. 35(25), 8216-8225.
18. Locksley R., Killeen N., Lenardo M. The TNF and TNF receptor superfamilies: integrating mammalian biology. (2001) Cell. 104(4), 487-501.
19. Nagata S. Apoptosis by death factor. (1997) Cell. 88(3), 355-365.
20. Wajant H., Pfizenmaier K., Scheurich P. Tumor necrosis factor signaling. (2003) Cell Death Differ. 10, 45-65.
21. Hehlgans Т., Pfeffer K. The intriguing biology of the tumour necrosis factor/tumour necrosis factor receptor superfamily: players, rules and the games. (2005) Immunology. 115, 120.
22. Несмеянов В. (1997) Цитокины иммунной системы, в кн. Белки иммунной системы, под ред. В. Иванова. ИБХ РАН: Москва, 1997. С. 79-120.
23. Ковальчук Л., Ганковская Л., Рубакова Э. Система цитокинов. РГМУ: Москва. 2000. С. 21-23.
24. Earle W. Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. (1943) J Natn Cancer Inst. 4, 165-212.
25. Sanford K., Earle W., Likely G. The growth in vitro of single isolated tissue cells. (1948) J Natl Cancer Inst. 9(3), 229-246.
26. Sugarman В., Aggarwal В., Hass P., Figari I., Jr M.P., Shepard H. Recombinant human tumor necrosis factor-alpha: effects on proliferation of normal and transformed cells in vitro. (1985) Science. 230(4728), 943-945.
27. Ruff M., Gifford G. Rabbit tumor necrosis factor: mechanism of actioa (1981) Infect Immun. 31(1), 380-385.
28. Humphreys D., Wilson M. Modes of L929 cell death induced by TNF-alpha and other cytotoxic agents. (1999) Cytokine. 11(10), 773-782.
29. Мошникова А., Кротова К., Галат В., Афанасьев В., Садовников В., Белецкий И. Апоптоз клеток L-929 под действием фактора некроза опухолей. (2000) Цитология. 42(6), 561-567.
30. Lagarkova M., Iarovaia O., Razin S. Large-scale fragmentation of mammalian DNA in the course of apoptosis proceeds via excision of chomosomal DNA loops and their oligomers. (1995) J Biol Chem. 270(35), 20239-20241.
31. Kouroku Y., Fujita E., Jimbo A., Mukasa T., Tsuru T., Momoi M., Momoi T. Localization of active form of caspase-8 in mouse L929 cells induced by TNF treatment and polyglutamine aggregates. (2000) Biochem Biophys Res Commun. 270(3), 972-977.
32. Tafani M., Schneider T., Pastorino J., Farber J. Cytochrome c-dependent activation of caspase-3 by tumor necrosis factor requires induction of the mitochondrial permeability transition. (2000) Am J Pathol. 156(6), 2111-2121.
33. Piret J., Arnould T., Fuks B., Chatelain P., Remacle J., Michiels C. Caspase activation precedes PTP opening in TNF-alpha-induced apoptosis in L929 cells. (2004) Mitochondrion. 3(5), 261-278.
34. Hennet T., Richter C., Peterhans E. Tumour necrosis factor-alpha induces superoxide anion generation in mitochondria of L929 cells. (1993) Biochem J. 289(Pt2), 587-592.
35. Powell C., Herzog T., Scott J., Collins J. Evidence for a protein synthesis-dependent and -independent TNF alpha cytolytic mechanism. (1995) Gynecol Oncol. 58(3), 327-335.
36. Hehner S., Hofmann Т., Ratter F., Dumont A., Droge W., Schmitz M. Tumor necrosis factor-alpha-induced cell killing and activation of transcription factor NF-kappaB are uncoupled in L929 cells. (1998) J Biol Chem. 273(29), 18117-18121.
37. Jayadev S., Hayter H., Andrieu N., Gamard C., Liu В., Balu R., Hayakawa M., Ito F., Hannun Y. Phospholipase A2 is necessary for tumor necrosis factor alpha-induced ceramide generation in L929 cells. (1997) J Biol Chem. 272(27), 17169-17203.
38. Thon L., Mohlig H., Mathieu S., Lange A., Bulanova E., Winoto-Morbach S., Schütze S., Bulfone-Paus S., Adam D. Ceramide mediates caspase-independent programmed cell death. (2005) FASEB J. 19(14), 1945-1956.
39. Strelow A., Bernardo K., Adam-Klages S., Linke Т., Sandhoff K., Kronke M., Adam D. Overexpression of acid ceramidase protects from tumor necrosis factor-induced cell death. (2000) J Exp Med. 5(4), 601-611.
40. Lavelle E., McGuirk P., Mills K. Molecules of infectious agents as immunomodulatory drugs. (2004) Curr Top Med Chem. 2004(4), 5.
41. Hamann L., El-Samalouti V., Ulmer A., Fiad H., Rietschel E. Components of gut bacteria as immunomodulators. (1998) Int J Food Microbiol. 41(2), 141-154.
42. Гусев M., Минеева JI. Микробиология, 4-е изд. Москва: Издательский центр "Академия", 2003.
43. Pabst М., Beranova-Giorgianni S., Krueger J. Effects of muramyl peptides on macrophages, monokines, and sleep. (1999) Neuroimmunomodulation. 6(4), 261-283.
44. Andronova Т., Ivanov V. (1991) The structure and immunomodulating function of glucosaminylmuramyl peptides, in Sov Medical Review D Immunology. Harwood Academic Publishers, pp. 1-63.
45. Adam A., Ciorbaru R., Petit J.-F., Lederer E. Isolation and properties of a macromolecular, water-soluble, immuno-adjuvant fraction from the cell wall of Mycobacterium smegmatis. (1972) Proc Natl Acad Sci USA. 69(4), 851-854.
46. Ellouz F., Adam A., Ciorbaru R., Lederer E. Minimal structural requirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglycan derivatives. (1974) Biochem Biophys Res Commun. 59(4), 1317-1325.
47. Kotani S., Watanabe Y., Kinoshita F., Shimono Т., Morisaki I. Immunoadjuvant activities of synthetic N-acetyl-muramyl-peptides or -amino acids. (1975) Biken J. 18(2), 105111.
48. Богданов И., Величков В., Гуревич А., Далев П., Колосов М. Антиопухолевые эффекты гликопептидов клеточной стенки Lactobacillus bulgaricus. (1977) Бюлллетень Экспериментальной Биологии и Медицины. 84(12), 709-712.
49. Bogdanov I., Dalev P., Gurevich A., Kolosov M., Mal'kova V., Plemyannikova L., Sorokina I. Antitumour glycopeptides from Lactobacillus bulgaricus cell wall. (1975) FEBS Lett. 57(3), 259-261.
50. Андронова Т., Ростовцева Л., Добрушкина Е., Гаврилов Ю., Дешко Т., Иванов В. О структуре противоопухолевого гликопептида из клеточной стенки Lactobacillus bulgaricus. (1980) Биоорганическая Химия. 6(12), 1830-1840.
51. Ростовцева Л., Андронова Т., Малькова В., Сорокина И., Иванов В. Синтез и противоопухолевое действие гликопептидов, содержащих N-ацетилглюкозаминил-ф 1 -4)-N-ацетилмурамил-дисахаридное звено. (1981) Биоорганическая химия. 7(12), 1843-1858.
52. Lefrancier P., Lederer E. Muramyl-peptides. (1987) Pure Appl Chem. 59(3), 449-454.
53. Tandon P., Utsugi Т., Sone S. Lack of production of interleukin 1 by human blood monocytes activated to the antitumor state by liposome-encapsulated muramyl tripeptide. (1986) Cancer Res. 46(10), 5039-5044.
54. Sone S., Mutsuura S., Ogawara M., Tsubura E. Potentiating effect of muramyl dipeptide and its lipophilic analog encapsulated in liposomes on tumor cell killing by human monocytes. (1984) J Immunol. 132(4), 2105-2110.
55. Akasaki M., Takashi T., Kita Y., Tsukada W. Augmentation of immune responses by a muramyl dipeptide analog, MDP-Lys(L18). (1987) Agents Actions. 22(1-2), 144-150.
56. Karnovsky M.L. Muramyl peptides in mammalian tissues and their effects at the cellular level. (1986) Fed Proc. 45(11), 2556-2560.
57. Johannsen L. Biological properties of bacterial peptidoglycan. (1993) APMIS. 101(5), 337-44.
58. Shockman G., Daneo-Moore L., Kariyama R., Massidda. O. Bacterial walls, peptidoglycan hydrolases, autolysins, and autolysis. (1996) Microb Drug Resist. 2(1), 95-98.
59. Vermeulen M., Gray G. Processing of Bacillus subtilis peptidoglycan by a mouse macrophage cell line. (1984) Infect Immun. 46(2), 476-483.
60. Johannsen L., Wecke J., Jr F.O., Krueger J. Macrophages produce somnogenic and pyrogenic muramyl peptides during digestion of staphylococci. (1991) Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 260(1), R126-R133.
61. Fincher E., Johannsen L., Kapas L., Takahashi S., Krueger J. Microglia digest Staphylococcus aureus into low molecular weight biologically active compounds. (1996) Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 271, 149 156.
62. Khaitov R., Kulakov A., Pinegin В., Makarov E., Ledger P. The study of serum level and immunochemical properties of natural antibodies to N-acetylglucosaminyl-N-acetylmurarnyl dipeptide in healthy donors. (1996) Russ J Immunol. 1(1), 5-8.
63. Иванов В., Андронова Т., Несмеянов В., Пинегин Б., Ledger P., Bomford R., Хаитов Р. Механизм действия и клиническая эффективность иммуномодулятора глюкозаминилмурамил дипептида (ликопида). (1997) Клиническая медицина. 3,11-15.
64. Fox A., Fox К. Rapid elimination of a synthetic adjuvant peptide from the circulation after systemic administration and absence of detectable natural muramyl peptides in normal serum at current analytical limits. (1991) Ifect Immun. 59(3), 1202-1205.
65. Harrison J., Fox A. Degradation of muramyl dipeptide by mammalian serum. (1985) Infect Immun. 50(1), 320-321.
66. Ganley J., Redens Т., Kooragayala L., Welbourne Т., Langford M. Serum muramyl dipeptidase activity against synthetic bacterial cell wall peptidoglycans. (2003) Invest Ophthalmol Vis Sci. 44, E-abstract 1443.
67. Fogler W., Wade R., Brundish D., Fidler I. Distribution and fate of free and liposome-encapsulated 3H.nor-muramyl dipeptide and [3H]muramyl tripeptide phosphatidylethanolamine in mice. (1985) J Immunol. 135(2), 1372-1377.
68. Shi F., Kurzman I., MacEwen E. In vitro and in vivo production of interleukin-6 induced by muramyl peptides and lipopolysaccharide in normal dogs. (1995) Cancer Biother. 10(4), 317-325.
69. Adeleye Т., Moreno C., Ivanyi J., Aston R. The modulation of tumour necrosis factor-alpha, interleukin-1 alpha and glucose levels with GMDP and other analogues of muramyl dipeptide. (1994) APMIS. 102(2), 145-152.
70. Fukuyama R., Takeda H., Fushiki S., Yamamoto T. Muramyl dipeptide injected into crushed sciatic nerve, activates macrophages and promotes recovery of walking locomotion in rats. (1998) Restor Neurol Neurosci. 13(3-4), 213-219.
71. Sugawara Т., Takada S., Miyamoto M., Nomura M., Kato M. Inflammatory cytokine production induced by an analogue of muramyl dipeptide MDP-Lys(L18) in rat macrophage cultures and dog synovial fluid. (1996) Inflammation. 20(1), 43-56.
72. Galelli A., Chariot В., Phillips N., Chedid L. Induction of colony-stimulating activity in mice by injection of liposomes containing lipophilic muramyl peptide derivatives. (1989) Cancer Res. 49(4), 810-815.
73. Broudy V., Kaushansky K., Shoemaker S., Aggarwal В., Adamson J. Muramyl dipeptide induces production of hemopoietic growth factors in vivo by a mechanism independent of tumor necrosis factor. (1990) J Immunol. 144(10), 3789-3794.
74. Tavares E., Maldonado R., Ojeda M., Minano F. Circulating inflammatory mediators during start of fever in differential diagnosis of gram-negative and gram-positive infections in leukopenic rats. (2005) Clin Diagn Lab Immunol. 12(9), 1085-1093.
75. Пименов А., Рахмилевич А., Деев В., Кириллова И., Мигдаль Т., Андронова Т., Фукс В. Активация клеточного иммунитета у мышей в норме и при опухолевом росте под действием глюкозаминилмурамилдипептида (1990) Вопросы Медицинской Химии. 36(1), 58-60.
76. Cummings N., Pabst M., Jr R.J. Activation of macrophages for enhanced release of superoxide anion and greater killing of Candida albicans by injection of muramyl dipeptide. (1980) J Exp Med. 152, 1659-1669.
77. Fidler I., Sone S., Fogler W., Barnes Z. Eradication of spontaneous metastases and activation of alveolar macrophages by intravenous injection of liposomes containing muramyl dipeptide. (1981) Proc Natl Acad Sci USA. 78(3), 1680-1684.
78. Garrec Y.L., Morin A. Modulation of natural killer activity by muramyl peptides: relationship with adjuvant and anti-infectious properties. (1987) Nat Immun Cell Growth Regul. 6(2), 65-76.
79. Talmadge J., Schneider M., Collins M., Phillips H., Herberman R., Wiltrout R. Augmentation of NK cell activity in tissue specific sites by liposomes incorporating MTP-PE. (1985) J Immunol. 135(2), 1477-1483.
80. Chedid L., Audibert F., Lefrancier P., Choay J., Lederer E. Modulation of the immune response by a synthetic adjuvant and analogs. (1976) Proc Natl Acad Sci USA. 73(7), 24722475.
81. Specter S., Cimprich R., Friedman H., Chedid L. Stimulation of an enhanced in vitro immune response by a synthetic adjuvant, muramyl dipeptide. (1978) J Immunol. 120(2), 487491.
82. Reese R., Trager W., Jensen J., Miller D., Tantravahi R. Immunization against malaria with antigen from Plasmodium falciparum cultivated in vitro. (1978) Proc Natl Acad Sci USA. 75(11), 5665-5668.
83. Lôwy I., Bona C., Chedid L. Target cells for the activity of a synthetic adjuvant: Muramyl dipeptide. (1977) Cell Immunol. 29(1), 195-199.
84. Pietersz G., Li W., Popovski V., Caruana J., Apostolopoulos V., McKenzie I. Parameters for using mannan-MUCl fusion protein to induce cellular immunity. (1998) Cancer Immunol Immunother. 45(6), 321-326.
85. Fast D., Vosika G. The muramyl dipeptide analog GMTP-N-DPG preferentially induces cellular immunity to soluble antigens. (1997) Vaccine. 15(16), 1748-1752.
86. Vogel F., Powell M. A compendium of vaccine adjuvants and excipients. (1995) Pharm Biotechnol. 6, 141-228.
87. Pap В., Макаров E., Юровский В., Мещерякова Е., Андронова Т., Иванов В. Синтетические иммуногенные комплексы на основе пептида поверхностного белка вируса ящура (1990) Биоорганическая Химия. 16(7), 904-915.
88. Иванов В., Мещерякова Е., Андронова Т., Иванов В. Использование синтетических носителей и адъювантов для повышения иммуногенности синтетического пептида CS-белка Plasmodium falciparum. (1991) Биоорганическая Химия. 17(6), 732-746.
89. Stills H. Adjuvants and antibody production: dispelling the myths associated with freund's complete and other adjuvants. (2005) ILAR Journal. 46(3), 281-293.
90. Passlick В., Labeta M., Izbicki J., Ostertag P., Loffler Т., Siebeck M., Pichlmeier U., Schweiberer L., Ziegler-Heitbrock H. Prevention of experimental endotoxin shock by a monocyte activator. (1995) Antimicrob Agents Chemother. 39(11), 2535-2540.
91. Пинегин Б., Андронова Т., Карсонова М. Препараты мурамилдипептидного ряда иммунотропные лекарственные средства нового поколения. (1997) International Journal on Immunorehabilitation. 6(27-33).
92. Azuma I. Development of the cytokine inducer romurtide: experimental studies and clinical applicatioa (1992) Trends Pharmacol Sci. 13(12), 425-428.
93. Семенова И. Принципы коррекции вторичных иммунодефицитов путем использования двух иммуномодуляторов различной природы очищенного стафилококкового анатоксина и ликопида (1998) Журнал Микробиологии, Эпидемиологии и Иммунобиологии. 1,100-104. ;
94. Баранова И., Молотинов В., Симонова А. Клинико-иммунологическая эффективность применения иммуномодуляторов в лечении больных фурункулёзом. (1998) Иммунология. 4, 63-64.
95. Свистунова А., Аршинова С., Климова С., Симонова А., Мазуров Д., Голубева Н., Андронова Т. Клиническая и иммунологическая эффективность иммуномодулятора ликопида при туберкулезе легких. (2000) Иммунология. 5, 59-62.
96. Riveau G., Masek K., Parant M., Chedid L. Central pyrogenic activity of muramyl dipeptide. (1980) J Exp Med. 152(4), 869-877.
97. Johannsen L., Obal F., Kapas L., Kovalzon V., Krueger J. Somnogenic activity of muramyl peptide-derived immune adjuvants. (1994) Int J Immunopharmacol. 16(2), 109-116.
98. Lederer E. (1988) Natural and synthetic immunomodulators derived from the mycobacterial cell wall, in Advanses in Immunomodulation, B. Bizzini, E. Bonmassar, Editors. Pythagora Press: Roma-Milan, pp. 9-36.
99. Balitsky K., Umansky V., Tarakhovsky A., Andronova T., Ivanov V. Glucosaminylmuramyl dipeptide-induced changes in murine macrophage metabolism. (1989) Int J Immunopharmacol. 11(5), 429-434.
100. Darcissac E., Bahr G., Parant M., Chedid L., Riveau G. Selective induction, of CD1 la,b,c/CD18 and CD54 expression at the cell surface of human leukocytes by muramyl peptides. (1996) Cell Immunol. 169(2), 294-301.
101. Nesmeyanov V., Khaidukov S., Komaleva R., Andronova T., Ivanov V. Muramylpeptides augment expression of la-antigens on mouse macrophages. (1990) Biomed Sci. 1(2), 151-154.
102. Khaidukov S., Komaleva R., Nesmeyanov V. N-acetylglucosamine-containing muramyl peptides directly affect macrophages. (1995) Int J Immunopharmacol. 17(11), 903-911.
103. Todd R., Alvarez P., Brott D., Liu D. Bacterial lipopolysaccharide, phorbol myristate acetate, and muramyl dipeptide stimulate the expression of a human monocyte surface antigen, Mo3e. (1985) J Immunol. 135(6), 3869-3877.
104. Cohen L., Courtois G., Parant M. Differentiation of murine pre-B cell line by an adjuvant muramyl peptide viaNF-KB activation. (1995) Immunobiology. 193(5), 363-377.
105. Todate A., Suda T., Kuwata H., Chida K., Nakamura H. Muramyl dipeptide-Lys stimulates the function of human dendritic cells. (2001) J Leukoc Biol. 70(5), 273-279.
106. Riveau G., Brunel-Riveau В., Audibert F., Chedid L. Influence of a muramyl dipeptide on human blood leukocyte functions and their membrane antigens. (1991) Cell Immunol. 134(1), 147-156.
107. Валякина Т., Макаров E., Малахов А., Андронова Т., Ревазова Е., Несмеянов В., Иванов В. Мурамилпептиды повышают экспрессию опухолеассоциированных антигенов. (1993) Иммунология. 4, 32-36.
108. Valyakina Т., Komaleva R., Petrova Е., Malakhov A., Shamborant О., Andronova Т., Nesmeyanov V. Endogenous tumour necrosis factor-alpha sensitise melanoma cells to glucosaminylmuramyl dipeptide. (1998) FEBS Lett. 426(3), 373-376.
109. Langford М., Chen D., Welboume Т., Redens Т., Ganley J. Stereo-isomer specific induction of renal cell apoptosis by synthetic muramyl dipeptide (N-acetylmuramyl-:L-alanyl-D-isoglutamine). (2002) Mol Cell Biochem. 236(1-2), 63-73.
110. Srur L., Langford M. Caspase mediated apoptosis of conjunctival cells associated with muramyl dipeptide induced conjunctivitis. (2007) Inves Ophtalmol Vis Sci. 48, E-abstract 1925.
111. Galelli A., Dosne A., Morin A., Dubor F., Chedid L. Stimulation of human endothelial cells by synthetic muramyl peptides: production of colony-stimulating activity (CSA). (1985) Exp Hematol. 13(11), 1157-1163.
112. Li C., Kumar S., Ledger P., Ponting J., Carette M., Allan E. Glucosaminylmuramyl dipeptide (GMDP) modulates endothelial cell activities in vitro but has no effect on angiogenesis in vivo. (1997) Inflamm Res. 46(9), 348-353.
113. Silverman D., Wu H., Karnovsky M. Muramyl peptides and serotonin interact at specific binding sites on macrophages and enhance superoxide release. (1985) Biochem Biophys Res Commun. 131(3), 1160-1167.
114. Polanski M., Karnovsky M. Serotonergic aspects of the response of human platelets to immune-adjuvant muramyl dipeptide. (1992) J Neuroimmunol. 37(1-2), 149-160.
115. Polanski M., Vermeulen M., Wu J., Karnovsky M. Muramyl dipeptide mimicry in the regulation of murine macrophage activation by serotonin (1995) Int J Immunopharmacol. 17(3), 225-232.
116. Silverman D., Krueger J., Karnovsky M. Specific binding sites for muramyl peptides on murine macrophages. (1986) J Immunol. 136(6), 2195-2201.
117. Root-Bernstein R., Westall F. Serotonin binding sites. II. Muramyl dipeptide binds to serotonin binding sites on myelin basic protein, LHRH, and MSH-ACTH 4-10. (1990) Brain Res Bull. 25(6), 827-841.
118. Мещерякова E., Алексеева JI. Поиск гликопептид- и серотонин-связывающих пептидов из рецептора серотонииа. (1996) Информационный Бюллетень РФФИ. 4(3), 314.
119. Мещерякова Е. Поиск гликопептид- и серотонин-связывающих пептидов из рецептора серотонина (1998) Информационный Бюллетень РФФИ. 5(3), 237.
120. Kaydalov A., Utkin Y., Andronova Т., Tsetlin V., Ivanov V. Muramyl peptides bind specifically to rat brain membranes. (1989) FEBS Lett. 248(1-2), 78-82.
121. Кайдалов А., Уткин Ю., Андронова Т., Цетлин В., Иванов В. Специфическое связывание мурамоилпептидов с мембранами мозга крысы. (1987) Биоорганическая Химия. 13(11), 1523-1529.
122. Tenu J., Adam A., Souvannavong V., Yapo A., Petit J., Douglas K. Photoafflnity• 1") ^ labeling of macrophages and B-lymphocytes using I-labeled aryl-azide derivatives ofmuramyldipeptide. (1989) Int J Immunopharmacol. 11(6), 653-661.
123. Sumaroka M., Litvinov I., Khaidukov S., Golovina Т., Kamraz M., Komaleva R., Andronova Т., Makarov E., Nesmeyanov V., et al. Muramyl peptide-binding sites are located inside target cells. (1991) FEBS Lett. 295(1-3), 48-50.
124. Golovina Т., Sumaroka M., Samokhvalova L., Shebzukhov Y., Andronova Т., Nesmeyanov V. Biochemical characterization of glucosaminylmuramyldipeptide binding sites of murine macrophages. (1994) FEBS Lett. 365, 9-12.
125. Головина Т., Сумарока M., Самохвалова Л., Шебзухов Ю., Макаров Е., Несмеянов В. Полипептиды из мышиных перитонеальных макрофагов, распознающие глюкозаминилмурамоилдипептид. (1995) Биоорганическая Химия. 21(4), 268-274.
126. Golovina Т., Fattakhovaa G., Swiderekb К., Makarov Е., Bovina N., Shivelyb J., Nesmeyanov V. Specific binding of glucosaminylmuramyl peptides to histones. (1999) FEBS Lett. 454,152-156.
127. Ohe Y., Hayashi H., Iwai K. Human spleen histone HI. Isolation and amino acid sequence of a main variant, Hlb. (1986) J Biochem (Tokyo). 100(2), 359-368.
128. Dziarski R. Recognition of bacterial peptidoglycan by the innate immune system. (2003) Cell Mol Life Sci. 60, 1793-1804.
129. Chen D., Texada D., Duggan C., Liang C., Reden Т., Kooragayala L., Langford M. Surface calreticulin mediates muramyl dipeptide-induced apoptosis in RK13 cells. (2005) J Biol Chem. 280(23), 22425-2236.
130. Dziarski R., Tapping R., Tobias P. Binding of bacterial peptidoglycan to CD 14. (1998) J Biol Chem. 273(15), 8680-8690.
131. Inamura S., Fujimoto Y., Kawasaki A., Shiokawa Z., Woelk E., Heine H., Lindner В., Inohara N., Kusumotoa S., et al. Synthesis of peptidoglycan fragments and evaluation of their biological activity. (2006) Org Biomol Chem. 4, 232-242.
132. Girardin S., Boneca I., Viala J., Chamaillard M., Labigne A., Thomas G., Philpott D., Sansonetti P. Nod2 is a general sensor of peptidoglycan through muramyl dipeptide (MDP) detectioa (2003) J Biol Chem. 278(11), 8869-8872.
133. Chamaillard M., Hashimoto M., Horie Y., Masumoto J., Qiu S., Saab L., Ogura Y., Kawasaki A., Fukase K., et al. An essential role for NODI in host recognition of bacterial peptidoglycan containing diaminopimelic acid. (2003) Nat Immunol. 4(7), 702-707.
134. Pauleau A.-L., Murray P. Role of Nod2 in the response of macrophages to toll-like receptor agonists. (2003) Mol Cell Biol. 23(21), 7531-7539.
135. Kobayashi K., Chamaillard M., Ogura Y., Henegariu O., Inohara N., Nunez G., Flavell R. Nod2-dependent regulation of innate and adaptive immunity in the intestinal tract. (2005) Science. 307(4), 731-734.
136. Girardin S., Travassos L., Herve M., Blanot D., Boneca I., Philpott D., Sansonetti P., Mengin-Lecreulx D. Peptidoglycan molecular requirements allowing detection by Nodi and Nod2. (2003) J Biol Chem. 278(43), 41702-41708.
137. Inohara N., Nunez G. NODS: intracellular proteins involved in inflammation and apoptosis. (2003) Nat Rew Immunol. 3, 371-382.
138. Tanabe T., Chamaillard M., Ogura Y., Zhu L., Qiu S., Masumoto J., Ghosh P., Moran A., Predergast M., et al. Regulatory regions and critical residues of NOD2 involved in muramyl dipeptide recognitioa (2004) EMBO J. 23(7), 1587-1597.
139. Leung E., Honga J., Fraser A., Krissansen G. Splicing of NOD2 (CARD 15) RNA transcripts. (2007) Moll Immunol. 44, 284-294.
140. Murray P. NOD proteins: an intracellular pathogen-recognition system or signal transduction modifiers? (2005) Curr Opin Immunol. 17, 352-358.
141. Windheim M., Lang C., Peggie M., Plater L., Cohen P. Molecular mechanisms involved in the regulation of cytokine production by muramyl dipeptide. (2007) Biochem J. 404(2), 179-190.
142. Yang Y., Yin C., Pandey A., Abbott D., Sassetti C., Kelliher M. NOD2 pathway activation by MDP or Mycobacterium tuberculosis infection involves the stable polyubiquitination of Rip2. (2007) J Biol Chem. 282(50), 36223-36229.
143. Kim J.-Y., Omori E., Matsumoto K., Nunez G., Ninomiya-Tsuji J. TAK1 is a central mediator of NOD2 signaling in epidermal cells. (2007) J Biol Chem. 283(1), 137-144.
144. Pan Q., Kravchenko V., Katz A., Huang S., Ii M., Mathison J., Kobayashi K., Flavell R., Schreiber R., et al. NF-KB-Inducing Kinase Regulates Selected Gene Expressionin the Nod2 Signaling Pathway. (2006) Infect Immun. 74(4), 2121-2127.
145. Kufer T., Kremmer E., Banks D., Philpott D. Role for erbin in bacterial activation of Nod2. (2006) Infect Immun. 74(6), 3115-3124.
146. McDonald C., Chen F., Ollendorff V., Ogura Y., Marchetto S., Lecine P., Borg J.-P., Nunez G. A role for erbin in the regulation of Nod2-dependent NF-kB signaling. (2005) J Biol Chem. 280(48), 40301-40309.
147. Yamamoto-Furusho J., Barnich N., Xavier R., Hisamatsu T., Podolsky D. Centaurin pi down-regulates nucleotide-binding oligomerization domains 1- and 2-dependent NF-kB activation. (2006) J Biol Chem. 281(47), 36060-36070.
148. Barnich N., Aguirre J., Reinecker H.-C., Xavier R., Podolsky D. Membrane recruitment of NOD2 in intestinal epithelial cells is essential for nuclear factor-kb activation in muramyl dipeptide recognition. (2005) J Cell Biol. 170(1), 21-26.
149. Lecine P., Esmiol S., Metais J.-Y., Nicoletti C., Nourry C., McDonald C., Nunez G., Hugot J.-P., Borg J.-P., et al. The NOD2-RICK complex signals from the plasma membrane. (2007) J Biol Chem. 282(20), 15197-15207.
150. Oh H., Lee H., Seo G., Choi E., Kweon S., Chun C., Han W., Lee K., Lee M., et al. Induction and localization of NOD2 protein in human endothelial cells. (2005) Cell Immunol. 237(1), 37-44.
151. Hisamatsu T., Suzuki M., Reinecker H., Nadeau W., McCormick B., Podolsky D. CARD15/NOD2 functions as an antibacterial factor in human intestinal epithelial cells. (2003) Gastroenterology. 124(4), 993-1000.
152. Ogura Y., Inohara N., Benito A., Chen F., Yamaoka S., Nunez G. Nod2, a Nodl/Apaf-1 family member that is restricted to monocytes and activates NF-kB. (2001) J Biol Chem. 276(7), 4812-4818.
153. Gutierrez O., Pipaon K., Inohara N., Fontalba A., Ogura Y., Prosper F., Nunez G., Fernandez-Luna J. Induction of Nod2 in myelomonocytic and intestinal epithelial cells via nuclear factor-kB activation (2002) J Biol Chem. 277(44), 41701-41705.
154. D Sterka J., Marriott I. Characterization of nucleotide-binding oligomerization domain (NOD) protein expression in primary murine microglia (2006) J Neuroimmunol. 179(1-2), 6575.
155. Costello M., Joyce S., Abrahams V. NOD protein expression and function in first trimester trophoblast cells. (2007) Am J Reprod Immunol. 57, 67-80.
156. Davey M., Martin T., Planck S., Lee J., Zamora D., Rosenbaum J. Human endothelial cells express NOD2/CARD15 and increase IL-6 secretion in response to muramyl dipeptide. (2006) Microvasc Res. 71(2), 103-107.
157. Rosenstiel P., Fantini M., Brautigam K., Kuhbacher T., Waetzig G., Seegert D., Schreiber S. TNF-a and IFN-y regulate the expression of the NOD2 (CARD 15) gene in human intestinal epithelial cells. (2003) Gastroenterology. 124(4), 1001-1009.
158. Li J., Moran T., Swanson E., Julian C., Harris J., Bonen D., Hedl M., Nicolae D., Abraham C., et al. Regulation of IL-8 and IL-ip expression in Crohn's disease associated NOD2/CARD15 mutations. (2004) Hum Mol Genet. 13(16), 1715-1725.
159. Voss E., Wehkamp J., Wehkamp K., Stange E., Schroder J., Harder J. NOD2/CARD15 mediates induction of the antimicrobial peptide human p-defensin-2. (2006) J Biol Chem. 281(4), 2005-2011.
160. Rosenzweig H., Davey M., Planck S., Sawkar H., Pengshung M., Jensen J., Goodwin K., Rosenbaum J.T., Martin T.M. Characterization of a novel model of NOD2-dependent ocular inflammatioa (2007) Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, E-abstract 3628.
161. Weichart D., Gobom J., Klopfleisch S., Hasler R., Gustavsson N., Billmann S., Lehrach H., Seegert D., Schreiber S., et al. Analysis of NOD2-mediated proteome response to muramyl dipeptide in HEK293 cells. (2006) J Biol Chem. 281(4), 2380-2389.
162. Chamaillard M., Girardin S., Viala J., Philpott D. Nods, Nalps and Naip: intracellular regulators of bacterial-induced inflammatioa (2003) Cell Microbiol. 5(9), 581-592.
163. Martinon F., Agostini L., Meylan E., Tschopp J. Identification of bacterial muramyl dipeptide as activator of the NALP3/cryopyrin inflammasome. (2004) Curr Biol. 14(9), 19291934.
164. Faustin B., Lartigue L., Bruey J., Luciano F., Sergienko E., Bailly-Maitre B., Volkmann N., Hanein D., Rouiller I., et al. Reconstituted NALP1 inflammasome reveals two-step mechanism of caspase-1 activation. (2007) Mol Cell. 25(5), 713-724. i
165. Pan Q., Mathison J., Fearns C., Kravchenko V., Correia J., Hoffman H., Kobayashi K., Bertin J., Grant E., et al. MDP-induced interleukin-ip processing requires Nod2 and CIAS1/NALP3. (2007) J Leukoc Biol. 82(1), 177-183.
166. Dong W., Liu Y., Peng J., Chen L., Zou T., Xiao H., Liu Z., Li W., Bu Y., et al. The IRAK-1 -BCL10-MALT1-TRAF6-TAK1 cascade mediates signaling to NF-B from toll-like receptor 4. (2006) J Biol Chem. 281(36), 26029-26040.
167. Lenz L., Mohammadi S., Geissler A., Portnoy D. SecA2-dependent secretion of autolytic enzymes promotes Listeria monocytogenes pathogenesis. (2003) Proc Natl Acad Sci U S A. 100(21), 12432-12437.
168. Chen D., Duggan C., Reden T., Kooragayala L., Texada D., Langford M. Calreticulin is a binding protein for muramyl dipeptide for muramyl dipeptide and peptidoglycan in RK13 cells. (2004) Biochemistry. 43, 11796-11801.
169. Michalak M., Mesaeli E.C.N., Nakamura К., Opas M. Calreticulin: one protein, one gene, many functions. (1999) Biochem J. 344(2), 281-292.
170. Groenendyk J., Lynch J., Michalak M. Calreticulin, Ca2+, and calcineurin signaling from the endoplasmic reticulum. (2004) Mol Cells. 17(3), 383-389.
171. Elliott Т., Williams A. The optimization of peptide cargo bound to MHC class I molecules by the peptide-loading complex. (2005) Immunol Rev. 207, 89-99.
172. Brownbill A., Braun D., Dukor P., Schumann G. Induction of tumouricidal leucocytes by the intranasal application of MTP-PE, a lipophilic muramyl peptide. (1985) Cancer Immunol Immunother. 20( 1), 11 -17.
173. Jarowenko D., Sigler S., Pellis N. Muramyl tripeptide: an effective immunotherapy in the surgical setting for pediatric abdominal neoplasms. (1987) J Pediatr Surg. 22(6), 497-500.
174. Malik S., Martin D., Hart I., Balkwill F. Therapy of human ovarian cancer xenografts with intraperitoneal liposome encapsulated muramyl-tripeptide phosphoethanolamine (MTP-PE) and recombinant GM-CSF. (1991) Br J Cancer. 63(3), 399-403.
175. Уманский В., Стефанов А., Бондарь О., Балицкий К., Пинчук В. Антиметастатический эффект заключенного в липосомы аналога мурамоилпептида. (1988) Вопросы Онкологии. 34(4), 433-438.
176. Phillips N., Tsao M. Inhibition of experimental liver tumor growth in mice by liposomes containing a lipophilic muramyl dipeptide derivative. (1989) Cancer Res. 49(4), 936939.
177. Nitta Y., Sugita Т., Ikuta Y., Murakami T. Inhibitory effect of liposomal MDP-Lys on lung metastasis of transplantable osteosarcoma in hamster. (2000) Oncol Res. 12(1), 25-31.
178. Yoo Y., Saiki I., Sato K., Azuma I. MDP-Lys(L18), a lipophilic derivative of muramyl dipeptide, inhibits the metastasis of haematogenous and non-haematogenous tumours in mice. (1994) Vaccine. 12(2), 175-160.
179. Nardin A., Lefebvre M.-L., Labroquere K., Faure O., Abastado J.-P. Liposomal muramyl tripeptide phosphatidylethanolamine: Targeting and activating macrophages for adjuvant treatment of osteosarcoma (2006) Curr Cancer Drug Targets. 6(2), 123-133.
180. Talmadge J., Lenz B., Klabansky R., Simon R., Riggs C., Guo S., Oldham R., Fidler I. Therapy of autochthonous skin cancers in mice with intravenously injected liposomes containing muramyltripeptide. (1986) Cancer Res. 46(3), 1160-1163.
181. Karpoff H., Jarnagin W., Delman K., Fong Y. Regional muramyl tripeptide phosphatidylethanolamine administration enhances hepatic immune function and tumor surveillance. (2000) Surgery. 128(2), 213-218.
182. Thomas K., Nijenhuis A., Dontje B., Daernen T., Scherphof G. Antitumor reactivity induced by liposomal MTP-PE in a liver metastasis model of colon cancer in the rat. (1995) Clin Exp Metastasis. 13(5), 328-336.
183. Dinney C., Tanguay S., Bucana C., Eve B., Fidler I. Intravesical liposomal muramyl tripeptide phosphatidylethanolamine treatment of human bladder carcinoma growing in nude mice. (1995) J Interferon Cytokine Res. 15(6), 585-592.
184. Murray J., Kleinerman E., Cunningham J., Tatom J., Andrejcio K., Lepe-Zuniga J., Lamki L., Rosenblum M., Frost H., et al. Phase I trial of liposomal muramyl tripeptide phosphatidylethanolamine in cancer patients. (1989) J Clin Oncol. 7(12), 1915-1925.
185. Urba W., Hartmann L., Longo D., Steis R., II J.S., Kedar I., Creekmore S., Sznol M., Gonion K., et al. Phase I and immunomodulatory study of a muramyl peptide, muramyl tripeptide phosphatidylethanolamine. (1990) Cancer Res. 50(10), 2979-2986.
186. Gianan M., Kleinerman E. Liposomal muramyl tripeptide (CGP 19835A lipid) therapy for resectable melanoma in patients who were at high risk for relapse: an update. (1998) Cancer Biother Radiopharm. 13(5), 363-368.
187. Kleinerman E., Gano J., Johnston D., Benjamin R., Jaffe N. Efficacy of liposomal muramyl tripeptide (CGP 19835A) in the treatment of relapsed osteosarcoma (1995) Am J Clin Oncol. 18(2), 93-99.
188. Ullrich S., Fidler I. Liposomes containing muramyl .tripeptide phosphatidylethanolamine (MTP-PE) are excellent adjuvants for induction of ah immune response to protein and tumor antigens. (1992) J Leukoc Biol. 52(5), 489-494.
189. Yoo Y., Saiki I., Sato K., Azuma I. B30-MDP, a synthetic muramyl" dipeptide derivative for tumour vaccination to enhance antitumour immunity and antimetastatic effect in mice. (1992) Vaccine. 10(11), 792-797.
190. Asao T., Shibata H., Batist G., Brodt P. Eradication of hepatic metastases of carcinoma H-59 by combination chemoimmunotherapy with liposomal muramyl tripeptide, 5-fluorouracil, and leucovoria (1992) Cancer Res. 52(22), 6254-6257.
191. Lowy I., Leclerc C., Bourgeois E., Chedid L. Inhibition of mitogen-induced polyclonal activation by by a synthetic adjuvant, muramyl dipeptide (MDP). (1980) J Immunol. 124(1), 320-325.
192. Traub S., Aulock S.v., Hartung T., Hermann C. MDP and other muropeptides-direct and synergistic effects on the immune system. (2006) J Endotox Res. 12(2), 69-85.
193. Galelli A., Chedid L. Induction of colony-stimulating activity (CSA) by a synthetic muramyl peptide (MDP): synergism with LPS and activity in C3H/HeJ mice and in endotoxin-tolerized mice. (1986) J Immunol. 137(10), 3211-3215.
194. Parant M., Parant F., Vinit M., Jupin C., Noso Y., Chedid L. Priming effect of muramyl peptides for induction by lipopolysaccharide of tumor necrosis factor production in mice. (1990) J Leukoc Biol. 47(2), 164-169.
195. Parant M., Pouillart P., Contel C.L., Parant F., Chedid L., Bahr G. Selective modulation of lipopolysaccharide-induced death and cytokine production by various muramyl peptides. (1995) Infect Immun. 63(1), 110-115.
196. Meshcheryakova E., Guryanova S., Makarov E., Alekseeva L., Andronova T., Ivanov V. Prevention of experimental septic shock by pretreatment of mice with muramyl peptides. (2001) Int Immunopharmacol. 1(9-10), 1857-1865.
197. Langhans W., Balkowski G., Savoldelli D. Differential feeding responses to bacterial lipopolysaccharide and muramyl dipeptide. (1991) Am J Physiol Regul Integr Conip Physiol. 261(3), R659-R664.
198. Roth J., Asian T., Storr B., Zeisberger. E. Lack of cross tolerance between LPS and muramyl dipeptide in induction of circulating TNF-a and IL-6 in guinea pigs. (1997) Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 273(4 Pt 2), R1529-R1533.
199. Wolfert M., Murray T., Boons G.-J., Moore J. The origin of the synergistic effect of muramyl dipeptide with endotoxin and peptidoglycaa (2002) J Biol Chem. 277(42), 3917939186.
200. Traub S., Kubasch N., Morath S., Kresse M., Hartung T., Schmidt R., Hermann C. Structural requirements of synthetic muropeptides to synergize with lipopolysaccharide in cytokine inductioa (2004) J Biol Chem. 279(10), 8694-8700.
201. Kim H., Yang J., Woo S., Kim S., Yun C.-H., Kim K., Han S. Lipoteichoic acid and muramyl dipeptide synergistically induce maturation of human dendritic cells and concurrent expression of proinflammatory cytokines. (2007) J Leukoc Biol. 81, 983-989.
202. Slesarev V., Ellithorpe R., Dimitroff T. Inhibition of systemic TNF-a cytotoxicity in cancer patients by D-peptidoglycaa (1998) Med Oncol. 15(1), 73-43.
203. Dubois С., Bissonnette E., Rola-Pleszczynski M. Platelet-activating factor (PAF) enhances tumor necrosis factor production by alveolar macrophages. Prevention by PAF receptor antagonists and lipoxygenase inhibitors. (1989) J Immunol. 143(3), 964-970.
204. Salem P., Deryckx S., Dulioust A., Vivier E., Denizot Y., Damais C., Dinarello C., Thomas Y. Immunoregulatory functions of paf-acether. IV. Enhancement of IL-1 production by muramyl dipeptide-stimulated monocytes. (1990) J Immunol. 144(4), 1338-1344.
205. Szlosarek P., Balkwill F. Tumour necrosis factor alpha: a potential target for the therapy of solid tumours. (2003) Lancet Oncol. 4(9), 565-573.
206. Yao X., Panichpisal K., Kurtzman N., Nugent K. Cisplatin nephrotoxicity: a review. (2007) Am J Med Sci. 334(2), 115-124.
207. Sacchi A., Gasparri A., Gallo-Stampino C., Toma S., Curnis F., Corti A. Synergistic antitumor activity of cisplatin, paclitaxel, and gemcitabine with tumor vasculature-targeted tumor necrosis factor-alpha (2006) Clin Cancer Res. 12(1), 175-182.
208. Петрова E. Изучение функциональной активности глюкозаминил-мурамоилдиггептида на опухолевых клетках. Автореферат дисс. на соискание уч. степени канд. биол. наук, Москва, 2002.
209. Terlikowski S., Sulkowska М., Nowak Н. The effect of recombinant human tumor necrosis factor-alpha on Ehrlich ascites tumor growth. (2002) J Environ Pathol Toxicol Oncol. 21(1), 87-92.
210. Трещалина E., Жукова О., Герасимова Г., Гарин А., Смирнова А. Методические рекомендации по изучению противоопухолевой активности фармакологических веществ, 1992, С. 319-325.
211. Sosnowska D., Mysliwski A., Dzierzbicka K., Kolodziejczyk A. The in vitro effect of new muramyl peptide derivatives on cytotoxic activity of NK (natural killer) cells from hamsters bearing Ab Bomirski melanoma (1997) Biotherapy. 10(2), 161-168.
212. Warzocha K., Robak T. Antileukemic effects of recombinant human tumor necrosis factor alpha (rh-TNF alpha) with cyclophosphamide or methotrexate on leukemia L1210 and leukemia P388 in mice. (1992) Acta Haematol Pol. 23(1), 55-62.
213. Maranda E., Robak T. Interactions of 2',2'-diflurodeoxycytidine (gemcitabine) with tumor necrosis factor alpha or its mutein VI in murine leukemias L1210 and P388. (1998) Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 46(2), 113-119.
214. Wang D., Lippard S. Cellular processing of platinum anticancer drugs. (2005) Nat Rev Drug Duscovery. 4, 307-320.
215. Арзамасцев E.B., Гуськова T.A., Либерман C.C., Любимов Б.И., Рудаков А.Г., Верстакова О.Л. Методические рекомендации по изучению общетоксического действия фармакологических средств, 1997.
216. Aston R., Kovalev I. Muramyl peptide for the treatment of toxicity. Vol. PCT/GB93/00408. USA: Peptech (UK) Limited (London, GB), 2003.
217. Correia J.d.S., Miranda Y., Austin-Brown N., Hsu J., Mathison J., Xiang R., Zhou H., Li Q., Han J., et al. Nodi-dependent control of tumor growth. (2006) Proc Natl Acad Sci USA. 103(6), 1840-1845.
218. Vermes I., Haanen C., Reutelingsperger C. Flow cytometry of apoptotic cell death. (2000) J Immunol Methods. 243(1-2), 167-190.
219. Meers P., Mealy T. Calcium-dependent annexin V binding to phospholipids: stoichiometry, specificity, and the role of negative charge. (1993) Biochemistry. 32(43), 1171111721.
220. Rubin В., Anderson S., Sullivan S., Williamson В., Carswell E., Old L. Nonhematopoietic cells selected for resistance to tumor necrosis factor produce tumor necrosis factor. (1986) J Exp Med. 164(4), 1350-1355.
221. Ченцов Ю. Введение в клеточную биологию, 4-е изд. Москва: Академкнига, 2004. С. 117-121.
222. Lever М., Th'ng J., Sun X., Hendzel M. Rapid exchange of histone Hl.l on chromatin in living human cells. (2000) Nature. 408, 873-876.
223. Bustin M., Catez F., Lim J.-H. The dynamics of histone HI function in chromatia (2005) Mol Cell. 17, 617-620.
224. Woodcock C., Skoultchi A., Fan Y. Role of linker histone in chromatin structure and function: HI stoichiometry and nucleosome repeat length. (2006) Chromosome Res. 14(1), 1725.
225. Головина Т. Локализация и характеристика мурамилпептидсвязывающих молекул клеток иммуной системы. Автореферат дисс. на соискание уч. степени канд. биол. наук, Москва, 1996.
226. Johnson L., Walsh M., Chen L. Localization of mitochondria in living cells with rhodamine 123. (1980) Proc Natl Acad Sci USA. 77(2), 990-994.
227. Faulkner K., Fridovich I. Luminol and lucigenin as detectors for O2". (1993) Free Radic Biol Med. 15(4), 447-451.
228. Самуилов В., Олескин А. Технологическая биоэнергетика. Москва: Издательство Московского университета, 1994. С. 44.
229. Grivennikova V., Vinogradov A. Generation of superoxide by the mitochondrial Complex I. (2006) Biochim Biophys Acta. 1757(5-6), 553-561.
230. National Drug Information Service. NDIS Profile on Cisplatin. Commonwealth Department of Human Services and Health, Canberra. 1985.
231. Гулак П., Дудченко А., Зайцев В., Лукьянова Л., Новиков К., Орлов С., Покудин Н., Попова О., Уголев А. Гепатоцит: функционально-метаболические свойства. Москва: Наука, 1985. С. 125-145.
232. Kaplan Е., Meier P. Non-parametric estimation from incomplete observations. (1958) J Am Stat Assoc 53,457-481.
233. Ван дер Варден Б. Математическая статистика. Москва: Издательство иностранной литературы, 1960. С. 434.
234. Mosmann Т. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. (1983) J Immunol Methods. 65(1-2), 55-63.
235. Bustin M., Catez F., Lim J.-H. The dynamics of histone HI function in chromatia (2005) Mol Cell. 17,617-620.
236. Woodcock C., Skoultchi A., Fan Y. Role of linker histone in chromatin structure and function: HI stoichiometry and nucleosome repeat length. (2006) Chromosome Res. 14(1), 1725.
237. Головина Т. Локализация и характеристика мурамилпептидсвязывающих молекул клеток иммуной системы. Автореферат дисс. на соискание уч. степени канд. биол. наук, Москва, 1996.
238. Johnson L., Walsh M., Chen L. Localization of mitochondria in living cells with rhodamine 123. (1980) Proc Natl Acad Sci USA. 77(2), 990-994.• • "J
239. Faulkner K., Fridovich I. Luminol and lucigenin as detectors for О (1993) Free Radic Biol Med. 15(4), 447-451.
240. Самуилов В., Олескин А. Технологическая биоэнергетика. Москва: Издательство Московского университета, 1994. С. 44.
241. Grivennikova V., Vinogradov A. Generation of superoxide by the mitochondrial Complex I. (2006) Biochim Biophys Acta. 1757(5-6), 553-561.
242. National Drug Information Service. NDIS Profile on Cisplatin. Commonwealth Department of Human Services and Health, Canberra. 1985.
243. Гулак П., Дудченко А., Зайцев В., Лукьянова Л., Новиков К., Орлов С., Покудин Н., Попова О., Уголев А. Гепатоцит: функционально-метаболические свойства. Москва: Наука, 1985. С. 125-145.
244. Kaplan Е., Meier P. Non-parametric estimation from incomplete observations. (1958) J Am Stat Assoc 53,457-481.
245. Ван дер Варден Б. Математическая статистика. Москва: Издательство иностранной литературы, 1960. С. 434.
246. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. (1983) J Immunol Methods. 65(1-2), 55-63.
-
Симонова, Мария Александровна
-
кандидата химических наук
-
Москва, 2008
-
ВАК 03.00.04
- Изучение функциональной активности глюкозаминилмурамоилдипептида на опухолевых клетках
- Молекулярно-клеточные и патоморфологические особенности в злокачественных лимфомах при проявлении опухолевой прогрессии в условиях полихимиотерапии
- Влияние ионизирующих излучений и противоопухолевых препаратов на клетки SP линии B16 меланомы и линии MCF-7 аденокарциномы молочной железы
- Синергизм и восстановление клеток после комбинированного действия химических агентов с ионизирующим излучением или гипертермией
- Влияние озонированного физиологического раствора на прооксидантную и антиоксидантную системы у крыс с саркомой-45
