Фенотипическая и генетическая вариабельность штаммов сибиреязвенного микроба

Цыганкова, Ольга Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фенотипическая и генетическая вариабельность штаммов сибиреязвенного микроба
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Фенотипическая и генетическая вариабельность штаммов сибиреязвенного микроба"

На правах рукописи

ЦЫГАНКОВА Ольга Ивановна

ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ШТАММОВ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА (ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ)

03 00 07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Ростов-на-Дону - 2007

003161829

Работа.выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант. доктор медицинских на} к, профессор

Еременко Евгений Иванович

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор

Васильева Галина Ивановна

доктор медицинских наук, профессор Липницкий Анатолий Васильевич

доктор медицинских наук Яговкин Эдуард Александрович

Ведущая организация — ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора (п Оболенск)

Защита состоится « iО» HOJKj/t-SI 2007 г в « JQ » часов на заседании диссертационного совета Д 208 082 01 при ГОУ ВПО Ростовском государственном медицинском университете (344022 г Ростов-на-Дону, Нахечиван-ский пер, 29)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Ростовского государственного медицинского университета

Автореферат разослан «Л »<MQBff/?<9.2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

НЯ Корганов

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Bacillus anthracis — возбудитель острою инфекционного заболевания животных и людей — на протяжении длительного периода вызывает у исследователей неизменный интерес, обострившийся после недавнего прецедента использования спор данного микроорганизма в качестве агента биотерроризма (Evans R G et al, 2002, Hoffmaster A R et al, 2002, Jeringan DB et al, 2002, Riedel S 2004) Серия террористических актов в США в 2001 г наглядно продемонстрировала неготовность хорошо оснащенной и регулярно финансируемой лабораторной системы этой страны к массовому исследованию проб от людей и из внешней среды на наличие возбудителя сибирской язвы Результатом этих актов биотерроризма явилась гибель людей, паника и гражданский хаос среди жителей страны, что, по мнению Г Г Онищенжо (2003), является еще одним поражающим воздействием По критериям оценки биологических агентов, представляющих потенциальную угрозу для населения, возбудитель сибирской язвы занимает второе место Легкость культивирования В anthracis и необычайная устойчивость его спор к неблагоприятным факторам внешней среды и дезинфицирующим средствам делают возбудителя сибирской язвы популярным агентом биотерроризма

Помимо возможности применения возбудителя сибирской язвы в качестве агента биотерроризма, существует постоянная угроза проявления активное™ многочисленных стойких почвенных очагов данной инфекции Примером могут служить небывалые по масштабам эпизоотии сибирской язвы летом и осенью 2006 г в Северной Америке За период с июля по сентябрь в трех провинциях Канады и четырех штатах США от сибирской язвы пало в общей сложности более 1000 голов домашнего скота и диких животных В Канаде эпизоотии отмечались в 153 хозяйствах, при этом заболело два человека (Nishi J S et al, 2007)

На территории России за период с 1900 по 2003 год зарегистрировано более 35 тысяч стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов и более 70 тысяч вспышек инфекции В каждом из таких пунктов имеется несколько почвенных очагов, причем по мере их рецидивирования и новых случаев падежа скота, как правило, возникают новые Эпидемиочогическая ситуация по сибирской язве в РФ остается напряженной (Онищенко Г Г, 2003)

Общность филогенетического происхождения представителей группы Bacillus cereus, почти полная гомология генома и схожесть некоторых фенотипических признаков, проявление которых подвержено внутривидовой вариабельности, - все это в некоторых случаях делает идентификацию В anthracis затруднительной даже при использовании самого современного арсенала бактериологических, биохимических и молекулярно-генетических методов исследования (Papaparaskevas J et al, 2004, Okmaka R et al, 2006)

Оценка надежности различных тестов идентификации сибиреязвенно! о микроба требует изучения вариабельности фенотипических признаков, лежащих в их основе не только на уровне штаммов, но и внутри их популяций Это диктует необходимость разработки более чувствительных методов определения различий в фенотипических свойствах отдельных составляющих популяции

Важным противоэпидемическим звеном в борьбе с сибирской язвой является иммунопрофилактика, в частности вакцинация (Бакулов И А с соавт, 2001, Пименов ЕВ с соавт, 2002, Ivms ЕВ et al, 1994, Tumbull Р et al, 2001) Штаммы, используемые в качестве вакцинных, должны обладать целым комплексом свойств авирулентностью, иммуногеннв'стью, продуктивностью спорообразования, стабильностью спор при хранении Существует немало свидетельств неоднородности популяций вакцинных штаммов по тем или иным свойствам в отдельных сериях вакцинных препаратов (Кожухов В В с соавт, 1997, Сероглазое В В , 1998) Отбор вариантов вакцинных штаммов В anthracis с наиболее оптимальным комплексом свойств на основе популяционного анализа широкого спектра фенстипических признаков может не только обеспечить наиболее эффективную защиту иммунизированных лиц от возможности заболевания сибирской язвой, но и снизить экономические затраты на производство вакцины

Сложность генетической идентификации В anthracis обусловлена значительной гомологией геномов представителей группы Bacillus cereus и наличием четырех различных вариантов плазмидного состава штаммов возбудителя сибирской язвы Объективная и достоверная молекулярно-генетическая идентификация сибиреязвенного микроба и его дифференциация от других представителей группы В cereus может осуществляться лишь при использовании праймеров как к плазмид-ным, так и к специфическим хромосомным локусам Отсутствие мультиплексной амшшфикационной тест системы, способной осуществлять детекцию штаммов сибиреязвенного микроба с любым плазмидным составом и надежно дифференцировать их от близкородственных сапрофитов, снижает роль быстрого и высокочувствительного метода ПЦР в исследовании проб материала от больных людей, животных и из объектов внешней среды на наличие В anthracis

Периодические проявления активности местных почвенных очагов и возникновение заболеваний животных или людей вследствие заноса инфекции с других территорий требуют разных подходов при проведении противоэпидемических мероприятий Существенную помощь в решении этих вопросов может оказать применение методов молекулярно-генетического типирования выделенных во время вспышки штаммов возбудителя сибирской язвы Получившая мировое признание схема молекулярно-генетического типирования штаммов В anthracis на основе анализа характеристик полиморфных локусов с вариабельным числом тандемных повторов (Keim Р et al, 2000), требует наличия дорогостоящей аппаратуры, мало доступной большинству отечественных лабораторий, и нуждается в модификации

Нет окончательной ясности и в вопросе о стабильности VNTR-маркеров в условиях воздействия различных селекционирующих факторов Отсутствие данных о генотипах штаммов возбудителя сибирской язвы, выделенных на обширной территории России, в работах, посвященных глобальному распределению MLVA-генотипов В anthracis (Van Ert MN et al, 2007) делает работу по их 1енотипиро-ванию актуальной, а ее результаты, несомненно, представят интерес, как для отечественных, так и для зарубежных ученых

Таким образом, актуальность изучения различных аспектов фенотипической и генетической вариабельности обусловлена тесной связью этих вопросов с проблемами индикации и идентификации В anthracis, оценкой вирулентности и им-муногенности, внутривидового типирования штаммов микроба с целью изучения филогенетических взаимоотношений штаммов различного происхождения и вариантов внутри групп, образованных производными исходного штамма

Целью исследования явилось изучение фенотипической и генетической вариабельности штаммов В апШгаа.? и разработка методических подходов для совершенствования диагностики сибиреязвенной инфекции и эпидемиоло! ического анализа заболеваемости

Учитывая сказанное выше, нами были поставлены следующие задачи! Разработать метод оценки состава клеточных популяций штаммов сибиреязвенного микроба по признаку гемолитической активности, о собрать варианты возбудителя с разной гемолитической активностью и изучить корреляцию между проявлением этого признака, морфологией колоний, лециггиназной активностью и устойчивостью к сибиреязвенным бактериофагам

2 Определить степень вариабельности и оценить влияние различий культураль-но-морфологических и биохимических свойств клеточной популяции вакцинных штаммов на их иммуногенность и продуктивные свойства

3 Оценить вклад различных экзопродуктов в проявление гемолитической активности В апЛгаси

4 Разработать метод оценки популяционного состава штаммов сибиреязвенного микроба по фагорезистентности и выделения фагорезистентных кульгур, изучить устойчивость клеточной популяции штаммов к бактериофагам, селекционировать фагорезистентные варианты В ашкгаст и определить спектр их фагорезистентности

5 Провести отбор штаммов В апИггасы и их вариантов, по признаку чувствительности к сибиреязвенным бактериофагам, оценить их продуктивность и селективные свойства при выращивании на них сибиреязвенных бактериофагов

6 Изучить фенотипическую вариабельность природных штаммов сибиреязвенного микроба по основным тестам идентификации и дополнительным признакам и сконструировать изогенную систему штаммов для экспериментального изучения генетической детерминации этих признаков

7 Разработать мультиплексную ПЦР тест-систему для идентификации возбудителя сибирской язвы с праймерами к специфическим плазмидным и хромосомному локусам и изучить диагностическую ценность разработанной тест-системы при исследовании клинического материала

8 Разработать модификацию метода МЬУА В агиНгасм, позволяющую анализировать ампликоны методом электрофореза в агарозном геле, оценить стабильность МЬУА-! енотипов, возможность и закономерность изменения их внутри популяций штаммов

9 Провести МЬУА штаммов из различных регионов СНГ и России

10 Изучить возможность использования молекулярно-генетического типирова-ния штаммов В апЛгааз методом МЬУА в сочетании с филогенетическим анализом для эпидемиологического анализа вспышек заболевания сибирской язвой среди людей и животных

Научная новизна результатов исследований

Разработаны новые эффективные методы оценки гемолитической активности В аШИгаая и резистентности к бактериофагам, позволяющие не только выявлять наличие этих свойств у штаммов в целом, но и количественно оценить клеточную популяцию по различиям в этих признаках Данные методы, наряду с модифицированным нами вариантом МЬУА, пополнили арсенал доступных по техническому оснащению методов изучения фенотипической и генетической вариа-

бельности сибиреязвенного микроба и позволили выявить ряд закономерностей в изменении этих свойств, определить новые подходы и экспериментально обосновать способ отбора вариантов вакцинных штаммов, основанный на первичном отборе из популяции штамма токсигенных колоний с последующим отбором из них вариантов определенного культурально-морфологического типа, обладающих, помимо более высокой иммуногенности, высокопродуктивным спорообразованием и повышенной резистентностью спор к условиям лиофилизации и повышенным температурам, а также определить оптимальные штаммы для размножения сибиреязвенных бактериофагов и индикаторные штаммы В аМИгаыя для определения специфической активности их препаратов

Впервые проведена комплексная оценка вклада лецитиназы, хлестерин-зависимого аитролизина О и протеаз сибиреязвенного микроба в их гемолитическую активность на примере производных вариантов одного штамма В апЛгаш с различным сочетанием активности указанных экзопродуктов и показана зависимость проявления гемолитической активности от условий и методов ее определения

Разработана амплификационная тест-система с использованием сконструированных новых праймеров к гену 8ар с хромосомной локализацией, что принципиально решило проблему детекции штаммов сибиреязвенного микроба с любым плазмидным составом, надежной дифференциации их от близкородственных са-профитов и одновременного определения их генетического потенциала патогенно-сти

Впервые на основе ретроспективного анализа МЬУА-генотипов штаммов В апЛиаск, выделенных во время четырех вспышек сибирской язвы в июле-августе ] 998 г на сопредельных территориях ЮФО из различного материала, убедительно доказана эффективность использования методов молекулярно-генетического типи-рования штаммов возбудителя в сочетании с филогенетическим анализом для оценки возможности наличия связей между вспышками данного заболевания на сопредельных территориях

Анализ комплексной характеристики фенотипических свойств, плазмидного состава, наличия в геноме последовательностей целого ряда функционально значимых генов, а также генотипов, определенных на основании характеристик полиморфных локусов генома с вариабельным числом тандемных повторов, выборки штаммов, выделенных из различного материала на территории России, Узбекистана, Туркмении, Азербайджана и Украины, выявил более выраженную фенотипиче-скую вариабельность среди штаммов В агиИгаш, изолированных из почвы с давним сроком обсеменения, приуроченность отдельных генотипов к определенным регионам, 13 новых МЬУА-генотипов и ранее неописанные аллельные размеры ампликонов по некоторым вариабельным локусам

Впервые при сопоставлении широкого спектра фенотипических свойств, данных о наличии большого набора структурных генов различной локализации и результатов филогенетического анализ на основе МЬУА-генотипирования по двум схемам на примере пяти групп производных штаммов В аЫНгаск в результате выполненных исследований обнаружена корреляция между характерными МЬУА-генотипами и фенотипическими свойствами, определяющими более высокую вирулентность штаммов, а также направленность изменений генотипа при селекции культур с такой вирулентностью в популяции штаммов с умеренной вирулентностью

Приоритетность научных разработок различных разделов исследований подтверждена шестью патентами РФ на изобретения

Теоретическая и практическая значимость работы Теоретический аспект исследований Обоснован популяционный подход не только к отбору штаммов и их вариантов, наиболее эффективных для использования в качестве вакцинных или для размножения бактериофагов и тестирования их специфической активности, но и к вопросам филогенетического анализа результатов молекулярно-генетического титрования штаммов на основе MLVA Проведение дальнейших исследований в этом направлении поможет оценить надежность генетического маркирования штаммов возбудителя сибирской язвы на протяжении отрезков времени, соизмеримых с длительностью существования почвенных очагов, для оценки их роли в возникновении вспышек сибирской язвы на их территории Определен вклад различных экзопродуктов сибиреязвенного микроба в проявление гемолитической активности и цитотоксического действия Продемонстрирована зависимость иммуногенных свойств вакцинных штаммов от состава клеточной популяции по совокупности признаков, включая морфологию колоний, гемолитическую, протеолитическую активности, токсинообразование m vitro

Практическим итогом исследований является разработка амплификацион-ной мультиплексной тест-системы, применение которой позволяет не только проводить ускоренную молекулярно-генетическую идентификацию культур, подозрительных на принадлежность к В anihracis, независимо от их плазмидного состава й одновременно оценивать их генетический потенциал патогенности, но и выявлять ДНК возбудителя в материале от людей с кожной формой заболевания сибирской язвой, традиционно трудной для микробиологической диагностики Использование результатов ПЦР в таком формате позволяет осуществлять быструю и точную диагностику этого опасного заболевания и индикацию ее возбудителя в пробах йз объектов внешней среды, что является решающими условиями своевременной помощи больным и служит основанием для организации необходимого комплекса противоэпидемических и противоэпизоотических мероприятий при вспышках данной инфекции природного характера или возможных актах биотерроризма, позволяет предотвратить гибель людей и сельскохозяйственных животных, уменьшить финансовые затраты на противоэпидемические и лечебные мероприятия Тест-система использовалась при экспериментальной работе в Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте Апробация работы тест-системы была проведена на различных пробах от людей, животных и из объектов внешней среды во время вспышки сибирской язвы в октябре 2004 г в Курском районе Ставропольского края и в г Моздоке осенью 2006 г и весной 2007 г, в результате чего была выявлена высокая эффективность ее применения не только для идентификации культур, но и для исследования на наличие ДНК В anihracis непосредственно материала от больных

Применение разработанной модификации молекулярно-генетического метода MLVA-генотипирования штаммов возбудителя сибирской язвы в сочетании с филогенетическим анализом является эффективным и объективным дополнительным методом эпидемиологического анализа для выявления путей распространения этой инфекции на сопредельных территориях в спорных случаях, что было выявлено на основании ретроспективного анализа четырех вспышек 1998 г и позднее подтверждено результатами применения этого методического подхода при анализе

случаев заболевания людей и КРС в г Моздоке и Курском районе Ставропольского края в 2006 и 2007 гг

По совокупности результатов проведенных исследований предложен способ выращивания бактериофага «Гамма А-26», упрощающий получения препарата бактериофага, сокращающий время на его получение и снижающий экономические затраты на его производство благодаря сокращению числа манипуляций и снижению расхода питательных сред при сохранении показателей его активности и специфичности Предложенный способ использовался при производстве экспериментальных серий сибиреязвенного бактериофага «Гамма А-26»

Разработанный методический подход к отбору наиболее перспективных вариантов сибиреязвенных вакцинных штаммов упрощает и систематизирует этот процесс Коррекция популяций вакцинных штаммов В anthracis позволит обеспечить повышение их протекгивных свойств и снижение экономических затрат на их производство вследствие более продуктивного спорообразования и повышения резистентности спор к условиям лиофилизации и воздействия повышенных температур

Материалы научных разработок легли в основу следующих методических документов методические указания «Основные требования оценки вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба для иммунизации людей» МУ 3,3 1 1112-02 (Минздрав России, М 2002 г), методические указания «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами 1-2 групп патогенности» МУ 4 2 -03 (Минздрав России, М 2003 г), методические рекомендации по экспресс-анализу атипичных штаммов возбудителей особо опасных инфекций бактериальной природы (утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол Xs 12 от 26 декабря 2000 г), методические рекомендации «Изучение популяци-онного состава сибиреязвенных штаммов по фагорезистентности и выделение фа-горезистентных субкультур» (утверждены даректором СтавНИПЧИ, протокол № 5 от 31мая 2000 г ), методические рекомендации «Использование полимеразной цепной реакции для идентификации Bacillus anthracis» (утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 5 от 31мая 2000 г), методические рекомендации «Использование многолокусной полимеразной цепной реакции для идентификации Bacillus anthracis и оценки их генетического потенциала патогенности» (утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 6 от 27 июня 2002 г ), методические рекомендации по комплексной оценке фенотипических признаков (гемолитической, протеолитической, лецитиназной и пигментсинтезирующей активностей, способности штаммами/изолятами продуцировать капсулу и токсин m vitro) культур Bacillus anthracis (рассмотрены и одобрены на заседании секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН и утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 11 от 3 ноября 2004 г), методические рекомендации по межвидовой и внутривидовой дифференциации групп бацилл, включающих В anthracis (утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 5 от 27 мая 2005 г ), методические рекомендации по филогенетическому анализу штаммов микроорганизмов на основе данных генетического типирования (утверждены директором СтавНИПЧИ, протокол № 5 от 27 мая 2005 г), учебно-методическое пособие «Теоретические основы и практические аспекты полимеразной цепной реакции» (утверждены даректором СтавНИПЧИ, протокол Ks 5 от 27 мая 2005 г)

Основные положения, выносимые на защиту

1 Расширение круга изучаемых фенотипических признаков и применение новых более чувствительных методов позволяет выявлять вариабельность этих свойств не только у различных штаммов В anthracis, но и внутри их клеточной популяции Вариабельности в различной степени выраженности и с различной частотой подвержены практически все биологические свойства микроба, включая патогенность Отклонения от типичных свойств чаще всего встречаются среди изолятов, выделенных из почвы с большой давностью обсеменения и штаммов с длительным сроком хранения в лабораторных условиях

2 Гемолитическая активность возбудителя сибирской язвы является полвдетер-минантным свойством и его проявление зависит от различных сочетаний у конкретных штаммов наличия лецитиназы, холестеринзависимого ангролизи-на О и активности протеаз Культуральные фильтраты В anthracis с высокой активностью протеаз или гемолизинов оказывают цитотоксическое действие на лейкоциты периферической крови in vitro

3 Определенные культурально-морфологические варианты различных штаммов имеют сходство в проявлении гемолитической, протеолитической и лецити-назной активности, чувствительности к бактериофагам и эффективности ток-синопродукции на иммунопреципитирующей среде Отбор и изучение свойств таких вариантов позволяют выявить среди них наиболее иммуногенные и продуктивные по спорообразованию и их стабильности варианты вакцинных штаммов, а также культуры для эффективного размножения диагностических сибиреязвенных бактериофагов, обеспечивающих лизис штаммов В anthracis различных культурально-морфологических типов, и высокочувствительные индикаторные штаммы дая определения активности фагов

4 Распределение по MLVA-veнотипам штаммов и их вариантов с различными фенотипическими признаками, принадлежащих к 5 группам производных, свидетельствует о корреляции направленности изменений ML VA-генотипов с селективным отбором культур по фенотипу, наиболее характерному для вирулентных штаммов

5 Обе существующие схемы MLVA-генотипирования штаммов В anthracis в сочетании с филогенетическим анализом являются эффективным методом внутривидовой дифференциации штаммов возбудителя сибирской язвы, не имеющих эпидемиологической связи

6 Применение мультиплексной амплификационной тест-системы с набором из трех пар праймеров к специфическим последовательностям гогазмидных локу-сов и хромосомного локуса sap позволяет надежно идентифицировать штаммы сибиреязвенного микроба с любым набором плазмид и определять их генетический потенциал патогенности, дифференцировать бесплазмидные штаммы В anthracis от других бацилл группы Bacillus cereus

Апробация материалов диссертация '

Материалы диссертации были представлены на Российской научной конференции «Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций» (Саратов, 1993), на научно-практической конференции «60 лет противочумной службе Кавказа» (Ставрополь, 1995), на юбилейной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 1998), на 3-ей международной конфе-

ренции по сибирской язве (Plymouth, England, 1998), на 2-ой международной конференции по молекулярной биологии бацилл (Taos New Mexico, USA, 1999), на 1-ой Европейской конференции по опасным инфекциям (Winchester, England, 1999), на 1-й Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций» (Саратов, 2000), на международной научно-практической конференции «Современный эпидемический потенциал природных очагов чумы», посвященной 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летия Талдыкорганской противочумной станции (Талдыкорган, 2001), на научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здраво-охренении» в рамках Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (Мосхва, 2002), на IV Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний», (Москва, 2002), на юбилейной научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе Итоги и перспективы», посвященной 50-летию Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (Ставрополь, 2002), на 5-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2004), на Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), на VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006), на научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологическо-10 надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России» (Ставрополь, 2007)

Материалы исследований были доложены на заседании «Общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов» (Ставрополь, 2002), а также используются при проведении практических семинаров по лабораторной диагностике сибирской язвы, и ПЦР-диагностике инфекционных заболеваний, при проведении лекций и практических занятий на курсах первичной специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах повышения квалификации «Современные бактериологические методы исследования» при Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте

Материалы диссертации обсуждены и одобрены на межлабораторной конференции СтавНИПЧИ 6 февраля 2007 г

Публикации

Основное содержание диссертации отражено в 82 опубликованных работах (в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций - 6 статей, раздел в руководстве «Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных заболеваний» - 1, патентов РФ — 6, депонировано - 4 работы, в сборниках научных трудов, материалах научных и научно-практических конференций - 65 статей, 10 из которых опубликованы за рубежом)

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы (Ш отечественных и 304 иностранных авторов) Работа изложена на 372 страницах компьютерного текста, содержит 56 рисунков и 38 таблиц

Содержание работы

Материалы

Объектом изучения были 76 штаммов В aníhracis, 49 вариантов штаммов В anthracis 1(СО), 12/16, 14/41, 140П, 228, а также 72 близкородственных сапрофитных представителя рода Bacillus (Bacillus cereus - 18, Bacillus thurmgiensis -14,Bacillus megatherium - 7, Bacillus subuhs - 15, Bacillus mesenterials -1, Bacillus ssp - 17) Были использованы бактериофаги «К» ВИЭВ, «Саратов», «Гамма», «ВА-9», 186

В работе использовали беспородных белых мышей массой 18-20 г, морских свинок массой 320-3 50г

Методы

Изучение основных биологических свойств культур В anthracis и их вирулентности проводили в соответствии с «Методическими указаниями по лабораторной диагностике сибирской язвы у животных и людей и обнаружению возбудителя сибирской язвы в сырье животного происхождения и объектах внешней среды» (Москва, 1986)

Способность к токсинопродукции изучали на среде «СОПЭК», наличие дополнительных питательных потребностей определяли на среде «9АТ» (Еременко Е И, 1997) Для изучения внутривидовых различий штаммов по гемолитической активности использовали метод диффузии в двухслойный агар с отмытыми эритроцитами барана (Цыганкова О И, Буравцева H П , 1998) Гемолитическую активность фильтратов определяли кочичественным методом со стандартными взвесями отмытых человеческих и бараньих эритроцитов (Ткаченко В В , 1963) Способность штаммов В anthracis к протеолизу изучали методом диффузии в двухслойный агар с различными субстратами (Бугоркрва Т В с соавт, 1983) Количественную оценку протеолитической активности проводили с использованием хромоген-ных субстратов азаказеина и азаальбумина

Штаммы В anthracis 1(СО), 12/16, 140П, 228, 14/41 и их производные варианты были охарактеризованы с применением метода полимеразной цепной реакции по наличию в их геноме последовательностей ряда генов с хромосомной локализацией sap (белок S-слоя В anthracis), plcA (фосфотидихолин-специфическая фос-фолипаза С В thurigiensis), piplC а и b (фосфагидилинозитол-специфическая фос-фолипаза Ca - В cereus и В thurmgiensis, b - В anthracis), тЛ (иммунный ингибитор В anthracis), entS (энтеротоксин S В cereus и В thurmgiensis), alo (антроли-зин О), gerYA, gerYB и gerYC (хромосомный оперон прорастания спор), dip 1, dip 2 (ферритин-подобные белки В anthracis), plcK (плейотропный транскрипционный регулятор экстрацеллюлярных факторов патогенности) и с плазмидной локализацией cap С, сарВСА, суа, pag, lef, gerX(нлазмидный оперон прорастания спор), ami (пептидогликан гидролаза-аутолизин В anthracis) (Цыганкова О И с соавт, 2002 а,б, Еременко Е И с соавт , 2004, Etienne-Foumehn I et al, 1995, Rmisse V et al, 1996, Papmutto E et al, 2002, Mesnage S , Fouet A, 2002, Shannon J G et al, 2003)

В работе применяли три системы генотипирования штаммов возбудителя сибирской язвы Первая из них по времени опубликования в печати (Jackson Р J et al, 1997) предусматривает анализ количества повторов в одном хромосомном ло-кусе vrrA Следующая-схема (Keim Р et al, 2000) позволяет определять значительное количество генотипов (в настоящее время их описано более ста), которые представляют собой различные сочетания аллельных величин ампликонов (числа повторов) по шести хромосомным локусам vrrA, vrrBl, vrrB2, vrrCl, vrrC2, CG3 и двум гшазмидным pXOlaat и рХ02 at

Третья схема дает возможность получить генетические характеристики культур В anthracis на основе особенностей 14 хромосомных локусов, из числа которых нами были выбраны 10 наиболее вариабельных по данным авторов (Le Fleche Р et al, 2001) локусов Ceb-Bams 1, 3, 5, 7, 13, 22, 23, 30 и 31 Праймеры для амплификации фрагментов всех анализировавшихся в работе локусов синтезировали в соответствии с нуклеотидными последовательностями, описанными авторами

В процессе выполнения работы нами был модифицирован метод ML VA по локусам vrrA, vrrBl, vrrB2, vrrCl, vrrC2, CG3, pXOlaat и pX02 at, а также разработаны новые методы, позволяющие оценить клеточный состав популяций штаммов В anthracis по гемолитической активности и по фагорезисгентности

Размеры ампликонов при выявлении вариабельности по лохусу vrrA и в ML VA определяли с применением компьютерной программы Kodak ID Image Analytic Software (Eastman Kodak Company, 2000)

Поиск новых последовательностей с тандемными повторами в геноме сибиреязвенного микроба проводили, используя ресурсы Gene Bank, с помощью программы Tandem Repeat Finder (TRF), Version 2 02 by Dr Gary Benson, 1999

Расчет и подбор праймеров осуществляли с помощью программы Gene Runner Version 3 00, Hastmgs Software, 1994

Основным методом статистической обработки результатов MLVA-генотипирования штаммов и вариантов В anthracis служил филогенетическии анализ Использовали пакет программ PHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 3 6 (alpha3) (Felsenstem J, 2002), позволяющих решать задачи филогенетического анализа с использованием математических методов

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Biostatd Version 3 03 Достоверность различий исследуемых показателей определяли по критерию Стьюдента Значения р < 0,05 расценивали как достоверные, р > 0,05 - как недостоверные при уровне вероятности 95%

Результаты и их обсуждение

Несмотря на многочисленность литературных данных о вариабельности многих из фенотипических свойств возбудителя сибирской язвы, они касаются лишь отдельных из них и, как правило, не сопровождаются комплексом генетических характеристик соответствующих штаммов В связи с этим мы изучили фено-типические свойства выборки из 76 штаммов, выделенных на 14 административных территориях бывшего СССР из материала от больных и трупов людей и животных, продуктов животноводства, объектов внешней среды, производных некоторых штаммов с целью последующего изучения части из них по различным генетическим характеристикам

Таким образом, анализ основных фенотипических свойсгв штаммов показал, что у 48 (63,2 %) они оказались характерными для сибиреязвенного микроба, однако, у 28 (36,8 %) штаммов В агйЬгаси бычи выявлены отличия от типичных культур по одному или нескольким признакам У 17 (22,4 %) штаммов имелись отличия только по культурально-морфологическим свойствам, шесть (7,9 %) штаммов не продуцировали капсулу на 1 % бикарбонатном агаре и были авирулентны для белых мышей, один (1,3 %) штамм образовывал капсулу независимо от концентрации С02 в атмосфере выращивания, был вирулентным для белых мышей, семь (9,2 %) штаммов обладали различным уровнем лецитиназной активности, при этом два из них были не способны к капсулообразованию

Клетки всех штаммов были неподвижны, лизировались сибиреязвенным бактериофагом «Гамма», давали отрицательный тест на щелочную фосфатазу, положительный тест «жемчужного ожерелья», не вызывали гемолиз эритроцитов барана при посеве на агар с 3-5 % дефибринированной крови

Использование дополнительных тестов для характеристики фенотипических свойств штаммов способности лизировать отмытые эритроциты барана, гидроли-зовать различные белковые субстраты, продуцировать токсин на среде «СОПЭК» и расти на минимальной синтетической среде «9АТ» позволило установить, что 14 штаммов (18,4 %) не обладали гемолитической активностью по отношению к эритроцитам барана Те же штаммы, за исключением В апАгаах 377/3, не давали зон лизиса с гемоглобином и альбумином В то же время все штаммы проявляли про-теолшическую активность по отношению к казеину и желатину

52 штамма В агйкгася (68,4 %) на синтетической среде «9АТ», содержащей 9 аминокислот, тиамин, глюкозу и необходимый набор солей, образовывали мелкие колонии через 24 ч, 24 штамма (31,6 %) в этот срок не формировали колоний, при этом у половины из них отсутствовала гемолитическая активность по отношению к отмытым эритроцитам барана и способность гидролизовать сывороточный альбумин и гемоглобин Из 14 штаммов, не обладавших гемолитической активностью 85,7 % не росли на синтетической среде «9АТ»

Штаммы В агйЬгаст 644/268 и 306/140-2, выделенные из почвы, имели целый комплекс атипичных свойств - были акапсульными, обладали активной леци-тиназой, не лизировали эритроциты барана, не гидролвзовали гемоглобин и сывороточный альбумин, не росли на синтетической среде «9АТ»

Из шести штаммов, не проявлявших фенотипических признаков токсино-продукцйи на среде «СОПЭК», только один не имел дополнительных отклонений от типичных свойств Этот штамм В агйЪгасп - 1190, выделенный из содержимого карбункула больной, отличался по этому единственному признаку от штамма В апЛгаск 1191, который был изолирован из крови этой же больной после генерализаций процесса

Из 76 изученных штаммов В апЛгаси отклонения от общепризнанных наиболее типичными проявлений свойств основных для идентификации сибиреязвенного микроба, а также тестов, служащих для более детальной характеристики штаммов данного микроба, имели 40 штаммов (52,6 %) ПоЛовина из них - 50,0 % имели вариабельность по одному признаку, в свою очередь более половины (55,0 %), которых имели отличия только по культурально-морфологическим свойствам По двум из фенотипических свойств имели нетипичные для В строем проявления 20 %, по трем - 7,5 %, по четырем и пяти - по 10,0 %, по шеста признакам -

2,5 % or общего числа штаммов с отклонениями фенотипических свойств от типичных (рис 1).

10,0% "2,5%

7,5%

10,0°,

50,0%

20,0%

Е-1 □ -2 0-3 И-4 fS-5

Рисунок 1. Соотношение штаммов В. anthracis с различным количеством атипичных фенотипических свойств

Доля штаммов В. anthracis, имеющих атипичный фенотип по: 1 - 1 признаку; 2-2 признакам; 3-3 признакам; 4-4 признакам; 5-5 признакам; 6-6 признакам

Анализ частоты атипичного проявления указанных свойств внутри трех наиболее многочисленных групп штаммов, выделенных из материала от людей, от животных и из почвы выявил, что штаммы с атипичным проявлением шести из семи свойств, по которым обнаруживалась вариабельность в данной выборке штаммов, составляли наиболее высокий процент среди культур, выделенных из почвы.

Диаграмма, представленная на рисунке 2, наглядно демонстрирует не только значительное преобладание типичного фенотипа среди штаммов В. anthracis, выделенных из материала от больных людей и животных по сравнению с изолятами из почвы, но и значительно более высокое процентное содержание среди последних, штаммов с атипичным проявлением целого комплекса фенотипических свойств. Вероятно, множественные отклонения от эволюционно выработанного оптимального для существования в различных условиях фенотипического комплекса В. anthracis, снижают шансы таких штаммов на успешное размножение в организме теплокровных животных

Определение вирулентности штаммов сибиреязвенного микроба в условиях in vitro методом, основанном на выявлении фенотипической экспрессии признаков капсуло- и токсинообразования (Еременко Е.И., 1997), дало возможность подтвердить полученное в опытах in vivo разделение штаммов на вирулентные и авиру-лентные и различить внутри группы вирулентных высоко-, умеренно- и слабовирулентные штаммы.

Комплексная оценка вирулентности штаммов возбудителя сибирской язвы с учетом таких основополагающих для патогенности В. anthracis свойств, как капсуло- и токсинообразование позволила выявить большую вариабельность вирулентности штаммов как в количественном отношении, так и в качественном по степени

снижения вирулентности, продемонстрировало более глубокое изменение в группе штаммов, выделенных из почвы.

источник выделении

100%

90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

И -1 В -2 Ш -3 □ -4 И -5 В -6 Ш -7

Рисунок 2. Доля штаммов, выделенных из материала от людей, животных н из почвы с различной вариабельностью фенотипических признаков

Соотношение штаммов В. ая/Лгаси: I - не имеющих отклонений ог типичных проявлений изученных фенотипических свойств и имеющих отклонения по: 2 - одному; 3 — двум; 4 - трем; 5 — четырем; 6 - пяти и 7 - шести из них

Для оценки популяционного состава штаммов культур, коллекционное хранение которых осуществляется в виде споровых взвесей, пригодны лишь те методы, которые позволяют выявлять различия в изучаемом свойстве непосредственно у колоний, сформированных взвесью спор без промежуточных пересевов, иска-жакнцих количественную характеристику, К таким методам можно отнести определение капсуло- и токсинообразования на среде «СОПЭК», способность к росту на среде «9А». Ценность таких методов обусловлена еще и возможностью отбора вариантов культур с различными проявлениями признака. Одной из задач данной работы было пополнение арсенала таких методов.

Нами разработана двухслойная плотная питательная среда на основе бульона Хопингера с добавлением дрожжевого экстракта и СаС12 Верхний индикаторный слой является менее плотным (0,7 % агара по сравнению с Ь% в нижнем слое), составляет пятую часть от толщины агаровой пластины и содержит 6 % высокочувствительных к лизирующему действию экзопродукгов В. атНгаш отмытых эритроцитов человека - все это делает метод чрезвычайно чувствительным и позволяет через 20-24 ч после посева взвеси спор, обеспечивающей формирование изолированных колоний, четко дифференцировать их по наличию зоны гемолиза и ее ширине (рис. 3).

Рисунок 3. Различия в гемолитической активности отдельных колоний I и II вариантов В. anthracis 14/41

Второй метод позволяет изучать популяционный состав штаммов по фагоре-зистентности, поскольку препаратом одного из сибиреязвенных бактериофагов обрабатываются посевы спор на питательных средах перед инкубацией, а контролем служат аналогичные посевы, не обработанные бактериофагами.

Использование обоих методов при изучении нескольких штаммов позволило не только выявить гетерогенность их состава по данным признакам, но и выделить варианты культур, обладающие целым комплексом фенотипических, а в некоторых случаях и генетических особенностей.

При выделении гемолитически активных вариантов нескольких, как вирулентных, так и вакцинных штаммов, были выявлены особенности морфологии колоний - маленькие размеры, выпуклая форма, гладкая, влажная блестящая поверхность (вариант II). В отличие от них колонии вариантов культур, не обладающих гемолитической акгивностью, выглядели значительно крупнее, были плоскими, имели сухую шероховатую поверхность и пологий край (вариант I) При изучении качественными и количественными методами гемолитической, протеолитической и лецитиназной активностей парных культур вариантов I и II нескольких штаммов была выявлена тенденция к наличию более высокой протеолитической активности у вариантов I. У вариантов II наличие гемолитической активности совпадало с активностью лецитиназы.

В опытах по сравнительной оценке количественных показателей совокупной гемолитической активности фильтратов штаммов В. anthracis 228 Prot (Prot*, Lee"), 228/8 (Prot", Lee") и варианта II штамма 228/8 (Prot", Lec+) было четко выявлено, что фильтраты с высокой протеолитической активностью практически не обладают способностью разрушать эритроциты, как человека, так и барана при кратковременном воздействии. В фильтрате штамма В. anthracis 228/8 (Prot", Lee") основным гемолитическим компонентом, вероятно, является холестеринзависимый тиолактивируемый антролизин О (Shannon J.G. et al., 2003), что подтверждается данными наших экспериментов по типичному влиянию на данный класс цитолизинов цистеина (активирующие) и холестерина (ингибирующее). Особенно наглядно это было продемонстрировано при использовании эритроцитов человека. Наибольшей суммарной гемолитической активностью обладал фильтрат варианта II штамма В. anthracis 228/8 (Prot", Lec+), в котором предположительно совместно с действием лецитиназы проявлял активность антролизин О. В этом случае несколько менялся характер влияния активатора и ингибитора антролизина О на гемолитическую активность фильтрата в отношении эритроцитов барана и человека Предварительная обработка фильтрата цистеином усиливала его способность лизиро-вать эритроциты барана, но снижала активность по отношению к эритроцитам че-

ловека Холестерин при добавлении в среду инкубации несколько снижал способность лизировать эритроциты человека и не ингибировал лизис эритроцитов барана, что демонстрирует изменение возможностей активаторов и ингибиторов на суммарную гемолитическую активность при сочетанном действии двух или более гемолизинов

Суммируя результаты этого опыта, а также параллельных определений про-теолитической активности по отношению к сывороточному альбумину и гемоглобину и способности лизировать отмытые эритроциты барана, можно сделать вывод о том, что основными гемолитически-активными компонентами фильтратов жидких культур В anthracis являются фосфолипазы (PC-PLC и SPH) и холестеринзави-симый антролизин О Последний из них, вероятно, синтезируется всеми или, по крайней мере, абсолютным большинством штаммов в определенных условиях in vitro (Shannon J G et al, 2003) Значительная степень активности лецитиназы, которая выявляется на питательных средах с желтком куриного яйца, отмечается лишь у небольшой части штаммов, но не является исключительной редкостью, и такие варианты в различной пропорции выявляются в популяции многих штаммов, а их гемолитическая активность значительно выше Данные наших исследований свидетельствуют о том, что все без исключения штаммы В anthracis способны лизировать отмытые эритроциты человека и только некоторые из них со значительно меньшей активностью вызывают гемолиз эритроцитов барана Изучение в условиях одного опыта гемолитических свойств фильтратов культур с различными сочетаниями и уровнями активности таких ферментов как протеаза и лецитиназа, позволяет сделать вывод о полидетерминированности данного свойства сибиреязвенного микроба По меньшей мере, 3 экзопродукта (протеазы, фосфолипазы, холесте-ринзависимый антролизин О) В anthracis участвуют в фенотипическом проявлении его гемолитической активности Фосфолипазы и антролизин О, бесспорно, являются непосредственными гемолитическими факторами возбудителя сибирской язвы Протеазы В anthracis, очевидно, вызывают деградацию фосфолипаз и антро-лизина О, о чем свидетельствует низкая гемолитическая активность фильтрата суточной культуры штамма 228 Prot (РгоЛ.есГ) и ее полное исчезновение через 48 ч вместе со значительным увеличением протеолитической активности на фоне значительного повышения за этот же промежуток времени гемолитической активности фильтратов штамма 228/8 (Prot- Lee") и варианта II типа 228/8 (Prot- Lec+) с очень низкой активностью протеаз

Было выявлено цитотоксическое действие фильтратов культур с высокой как гемолитической, так и протеолитической активностями на полиморфноядерные лейкоциты периферической крови m vitro Возросший в последние годы интерес к изучению гемолитических продуктов возбудителя сибирской язвы свидетельствует о возможном пересмотре их роли в патогенезе заболевания

Помимо различий в гемолитической, протеолитической и лецитиназной активности, описанные выше варианты культур сибиреязвенного микроба проявили различия в двух комплексах свойств имели отличающиеся характеристики по свойствам важным дом вакцинных штаммов и различались ho чувствительности к сибиреязвенным бактериофагам

Выявленная нами в опытах неоднородность клеточного состава по содержанию вариантов I и II различных экспериментальных серий сибиреязвенных вакцин СТИ-1 и 228/8 и различия в их иммуногенности побудили нас к сравнительному изучению иммуногенных свойств этих культурапьно-морфологических вариантов

вакцинного штамма СТИ-1 Индекс иммунитета у животных, вакцинированных спорами культуры варианта II, был на порядок выше, чем у животных, иммунизированных спорами варианта I Кроме того, вариант культуры II типа отличался более продуктивным спорообразованием, а его споры обладали большей терморезистентностью и стабильностью при лиофилыюм высушивании (табл 1)

Таблица 1 - Сравнительная характеристика двух вариантов вакцинного штамма СТИ-1

Показатели Значение показателей у вариантов

I II

Индекс иммуногенности 4,3 104 4,5 Ю3

LDsu для нелинейных белых мышей 2,4 103 спор 1,7 105 спор

Концентрация спор полученных при одинаковых условиях (М±т), р< 0,05 (1,8±0,6) 10* спор в 1мл (3 8±0,1) 10* спор в 1мл

Снижение концентрации жизнеспособных спор при лиофшшзации 8,5 % 6,6 %

Снижение доли жизнеспособных спор после прогревания при 80 °С - 20 мин (М±т), р< 0,05 37,6±6,5 % 6,6±2,3 %

При изучении способности к токсинопродукции на среде «СОПЭК» вариантов обоих типов нескольких штаммов в большинстве случаев способность к токси-нообразованию по наличию линий иммунопреципитации выявлялась у вариантов И, за исключением штамма В апЛгаси 12/16, оба варианта которого, как и исходный штамм, фенотипически не проявляли токсинопродуцирукяцих свойств

Можно предположить, что особенности клеточной стенки субкультур этого варианта позволяют с большей легкостью секретировать его во внешнюю среду при прочих равных условиях В тех случаях, когда нарушен процесс синтеза компонентов токсинов, линии иммунопреципитации отсутствуют вокруг колоний субкультур обеих типов Исходя из этого, нами был предложен метод отбора вариантов вакцинных штаммов с полезными производственными свойствами, основанный на последовательном выявлении колоний с выраженной иммунопреципитацией на среде «СОПЭК» и последующим отбором из них культур вариантов II

Интересными представляются и особенности взаимодействия двух тинов вариантов культур В аМкгаса с сибиреязвенными бактериофагами Варианты I различных штаммов были высокочувствительны к лизирующему действию сибиреязвенных бактериофагов «Гамма А-26», «ВА-9», «К» ВИЭВ, «Саратов» и 186 Варианты II, а также ветеринарный вакцинный штамм В апМгасм 55 не лизировались этими препаратами Последовательные пассажи на штамме В амкгасм 55 позволили получить препараты бактериофагов «Гамма А-26» и «ВА-9», способные дотировать оба типа культур Бактериофаги «К» ВИЭВ, «Саратов» и 186 эффективней размножались на культурах варианта I, но по-прежнему не лизировали культуры

вариантов II и штамм В. ап(Игас^ 55. Для их размножения оптимальным оказался вариант I штамма Ихтиман, который отличался наиболее высокой чувствительностью ко всем перечисленным бактериофагам. Это свойство позволяет рекомендовать его в качестве индикаторной культуры для определения титра бактериофагов.

Специфическое действие препарата бактериофага «Гамма А-26», полученного нами при выращивании на штамме размножения В. атИгасЫ 55 и имеющего концентрацию фаговых частиц 7-104 (индикаторная культура Ихтиман I), было проверено по отношению к 50 штаммам В. апМгаси. Штаммы различались по культурально-морфологическим свойствам, способности к капсулообразованию в различных условиях, токсинопродукции на среде «СОПЭК», гемолитической, про-теолитической и лецитиназной активности. Все они лизировались цельным препаратом бактериофага в классической пробе. Специфичность действия этой же серии препарата бактериофага проверена на 47 штаммах близкородственных спорообра-зующих сапрофитов В данной выборке сапрофитов лизирующиеся бактериофагом штаммы составили 10,6 %.

Изучение популяций двух типичных вирулентных штаммов В. ап/Игасм по резистентности к литическому действию сибиреязвенных бактериофагов «К» ВИЭВ, «ВА-9» и «Гамма А-26» выявило в их составе наличие вариантов, обладающих резистентностью к различному набору фагов (рис. 4)

91 П2 ЙЗ 0 4 £35

10%

В1 В4 06

Рисунок 4. Спектр чувствительности к бактериофагам К ВИЭВ, ВА 9 и «Гамма» субкультур штамма 1(СО)

Процентное содержание субкультур штамма В. апМгася 1(СО): 1 - К+ ВА9+ у+, 2 -К" ВА9" у, 3 - К*'' ВА9+ у+, 4 - К" В А9" у+, 5 - К+ В А9" у', 6 - К' В А9+ у+ из числа выделенных по признаку резистентности А - к бактериофагу К, Б - к бактериофагу ВА 9

Среди фагорезистентных вариантов штамма В. атИгааз 1(СО) отмечалась значительная вариабельность по капсуло- и токсинообразованшо, гемолитической, лецитиназной и протеолитической активности, способности расти на минимальной

синтетической среде «9А» и специальных средах для капсуло- и токсинопродукции в условиях атмосферы с повышенным содержанием С02 и размножаться в организме животных

Результаты исследований свидетельствует о необходимости учитывать куль-турально-морфологические особенности не только штаммов размножения бактериофагов и индикаторных штаммов для определения их специфической активности, но и при определении значимости результатов теста с бактериофагом для идентификации того или иного типа сибиреязвенных культур Наличие подозрительных на принадлежность к В anthracis культур, растущих в O-S-формах, в случае отрицательною или сомнительного результата пробы с бактериофагом, не должно служить поводом для исключения их из дальнейшего исследования

Выявленная значительная вариабельность целого ряда фенотипических свойств штаммов В anthracis побудила нас к изучению вариабельности наличия у них последовательностей комплекса их генетических детерминант Методом ПЦР у всех полевых штаммов В anthracis выявлялись последовательности генов суа, lef и pag, что свидетельствовало о наличии у них плазмиды pXOl Из шести штаммов с акапсульным фенотипом у пяти не выявлялась последовательность гена cap, а штамм В anthracis 940/16, вероятно, имел смешанный состав по этому признаку

Для получения генетической характеристики штаммов возбудителя сибирской по наличию различных физиологически значимых генов наиболее информативным является выявление методом ПЦР последовательностей генов cap С, сарВСА, ami, локализованных на плазмиде рХ02, и генов суа, pag, lef gerX, расположенных на плазмиде pXOl Синхронное отсутствие последовательностей той или иной группы генов с достаточной достоверностью свидетеяьствует об отсутствии соответствующей плазмиды

При выполнении исследований по выявлению наличия последовательностей различных структурных генов с хромосомной локализацией нами разработаны праймеры к гену sap, детерминирующему синтез компонента поверхностного S-слоя В anthracis белка Sap Сконструированная мультиплексная амплификацион-ная тест-система с набором из трех пар праймеров к специфическим последовательностям плазмидных локусов и хромосомного локуса sap позволила успешно идентифицировать штаммы сибиреязвенного микроба с любым набором плазмид и определять их генетический потенциал патогенности, дифференцировать бесплаз-мидные штаммы В anthracis от других бацшш группы Bacillus cereus (рис 5) Разработанная гест-система обеспечила также возможность диагностики сибирской язвы при исследовании материала от больных, лечившихся антибиотиками (рис 6)

Учитывая, что наиболее удобной моделью для изучения возможной корреляции отдельных фенотипических признаков с такими полидетерминированными свойствами, как вирулентность и иммуногенность, наличием различных структурных и регуляторных генов и ML VA-генотипами является комплексное изучение указанных характеристик на клональных вариантах штаммов, различающихся между собой по различному набору признаков, нами был выполнен следующий раздел работы

Были изучены фенотипические свойства и генетические характеристики штаммов В anthracis 1(СО), 228, 12/16, 140Пи 14/41 и их производных вариантов, представляющие собой пять изогенных групп В пределах каждой группы выявлена вариабельность таких признаков как капсуло- и токсинообразование, гемолити-

ческая, лецитиназная и протеолитическая ахтивность, способность к росту на нимальной синтетической питательной среде «9А».

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Рисунок 5. Электрофор«раммы продуктов амплификации штаммов В. anthracis с различным плазмидиым профилем и сапрофитов рода Bacillus при использовании разработанной гест-систем

1-8 дорожки - В. anthracis: 1-81/1 (рХОГ, рХ02+), 2 - 1(СО) (pXOl+, pX02f), 3 -228/8 (pXOl\ рХ02"), 4 — С'ГИ (pXOl\ рХ02"), 5 - 1(СО)-16 (рХОГ, рХ02+)', 61 (СО)-24 (рХ0ГрХ02+), 7 - 1(СО)-23 (рХОГ, рХ02"), 8-228/4 (рХОГ, рХ02"); 9, 10-В. cereus: 9-16, 10-2527; 11, 12-В. thunngiensis. 11 - Ser. 1, 12-Ser. 2, 13, 14 -В. subtilis. 13 -8236, 14 -6346, 15, 16 -В. megaterium. 15 - 1, 16- 3; 17, 18- В. spp.: 17-555, 18-449.

1 234 56789 10

Рисунок 6. Электрофореграмма продуктов амплификации проб больных в мультиплексной реакционной смеси с праймерами суа 25-26, сарС 57-58, sap 3-4

I -Ladder 100, 2 - К+ (ДНК В. anthracis 81/1), 3 - ОКО, 4 - сыворотка крови больного № 1,5— сыворотка крови больной №. 2 , 6- сыворотка крови больной № 3, 7— фрагмент струпа больного №1, 8- фрагмент струпа больной Ха 2, 9 - фрагмент струпа больной № _ содержимое везикулы больной Л» 3

Все 54 культуры, включая исходные штаммы и их варианты, были исследованы методом ПЦР на наличие некоторых генов, ассоциированных с экзофермен-тами, профагом, прорастанием спор и гена плейотропного транскрипционного регулятора Анализ не выявил специфической связи между амплификацией соответствующих фрагментов и особенностями фенотипа штаммов, однако позволил дифференцировать их между собой. Синхронное отсутствие выявления методом ПН? последовательностей генов сарС, сарВСЛ и ami свидетельствовало о наличии

в каждой из групп вариантов с отсутствием плазмиды рХ02 Отсутствие плазмиды pXOl было обнаружено у двух вариантов штамма 1(СО), у которых в ПЦР не ам-плифицировались фрагменты генов pag', lef, суа и gerX

Наиболее полной по наличию вариантов с различным плазмидным составом была изогенная группа штамма 1(СО), полученная в процессе выполнения данной работы, включающая набор из исходного штамма и четырех его изогенных вариантов, отличающихся по плазмидному составу, способности продуцировать капсулу и токсин, прорастать в атмосфере с 50% С02

1 1(СО) - рХО 1 (pag lef суа gerX") рХ02 (сарС сарЪСА* ami*) lWCap+Ger+

2 l(CO)S - Х01 (pag lef суа* gerX") рХ02*(сарС* сарВСК ami) Тох"

CapcYnt!Ger+

3 1 (CO)SCap"-pXO\(pag lef суа* gerX) Tox"Cap"Ger+

4 l(CO)RBA9-l -pX02*(capC* сарВСА*атГ) ToxCap+Ger+-

5 1 (CO)RBA9-4 - Tox'Cap'Ger"

В настоящее время генетическое типирование микроорганизмов широко используется в ряде основных областей микробиологических исследований Типирование штаммов по плазмидному составу является информативным методом характеристики их патогенных свойств, но плазмидаый состав не может быть достаточно индивидуальным генетическим маркером штаммов при анализе их филогенетических взаимоотношений или эпидемиологических связей отдельных заболеваний сибирской язвой

Наиболее результативными среди подходов к i енетическому типированию штаммов возбудителя сибирской язвы представляются метод выявления полиморфизма длины амплификационных фрагментов (AFLP) (Keim Р et al, 1997) и методы анализа регионов с вариабельным числом тандемных повторов (Andersen G L et al, 1996, Keim P et al, 2000, Le Fleche P , et al, 2001) Преимущество MLVA по схеме P Keim et al (2000), получившей наиболее широкое применение, состояло в возможности сравнивать свои результаты с результатами, полученными в ряде стран при исследовании национальных коллекций

Нами была разработана модификация метода MLVA-генотипирования штаммов В anthracis с целью исключения флуоресцентной метки, определения оптимальных групп праймеров в реакционной смеси и подборе условий электрофореза в агарозе, обеспечивающих необходимое разрешение фрагментов ДНК Изменение комбинаций праймеров в реакционных смесях позволило надежно с достаточной интенсивностью амплифицировать фрагменты всех хромосомных и плазмид-ных локусов, а также осуществлять анализ результатов методом электрофореза, что дало возможность проводить генотипирование штаммов В anthracis по данной схеме при отсутствии автоматического ееквенатора (рис 7 и 8)

Анализ представительной подборки штаммов из разных регионов СНГ показал высокую степень их молекулярного разнообразия, сопоставимую с таковой у мировой коллекции штаммов Среди 39 штаммов, выделенных в различное время на 13 территориях бывшего СССР, было выявлено 17 генотипов, которые имели отличия друг от друга по характеристике 1-7 вариабельных локусов Из них 4 генотипа 15 штаммов соответствовали генотипам, описанным ранее Р Keim et ai (2000) 13, 17, 35 и 45 Преобладающими по численности были генотипы 17 и 13, достаточно редкие в мировой коллекции штаммов В anthracis Остальные 13 набо-

ров ампликонов отличались от известных генотипов по одному или более локусам и ранее не были описаны.

Рисунок 7. Элекгрофорсграмма продуктов амплификация в одной реакционной смеси фрагментов локусов УггСг уггВ), С(73 штаммов В. anthraeis

Рисунок 8. Элсктрофореграмма продуктов амплификации ДНК штаммов В. шМИгасЫ но вариабельному локусу рХ02 а(

Расположение проб соответственно дорожкам: I, 8 и 15 -ЬасМег-20; 2-14 - В. атИгас15: 2,14 - 1191; 3,13 - 1182, 4,12-914/213; 5,11-331/214; 6,10-81/1; 7,914/41

Были выявлены не только новые комбинации аллельных величин размеров ампликонов по 8 вариабельным локусам, представляющие собой самостоятельные генотипы, но и не описанные ранее аллели по плазмидным локусам рХ01 аа1 и рХ02 а!.

Результаты филогенетического анализа полученных данных представлены на рисунке 9. Наиболее филогенетически отдаленным от основной группы штаммов был впервые выявленный генотип двух штаммов, выделенных в Республике Дагестан с интервалом в 6 лет, а также новый генотип, представленный единственным штаммом, выделенным из сырья животного происхождения из Эфиопии.

Сопоставление генотипов штаммов, происходящих с из различных регионов СНГ, между собой, а также с данными других авторов по штаммам из разных стран мира, свидетельствует в пользу тенденции к приуроченности отдельных МЬУА-генотипов не только к определенным крупным географическим регионам мира, но и к более мелким территориально-административным образованиям.

А4 веп чттА ТОМ твг игС1 итС1 ссз р\01 | рХ02 Гсогр региои Кол- 1 во 1 шт |

ЯЧ 3X3 229 1 162 1 538 Ш 158 126 137 Т>РКМ 1

1 8К 313 229 162 538 604 15$ 132 1 137 | ТУРКМ 1 1

Г ЯЧ 325 229 162 613 601 153 129 1 137 \ СТАВР КР,ЧВЧ Р 2

Ч « 325 12«' 162 613 604 153 135 137 СТАВР КГ 2 1

А1а 17 325 229' 162 613 604 153 132 137 АЗЕРВ..КАЛМ., УКР, СО-А К-Б Р, ВОЛГОГР, ВОРОН 8

_ Г[ г Ж 313 229 162 613 604 153 135 137 сад., СТАВР КР, КАЛМ 3 |

Ж 313 22» 162 613 532 153 135 137 УЗБЕКИСТАН 1 1

АЗс 13 313 22» 162 613 604 153 132 137 ВОЛГОГР, ВОРОН, СО-А., ТАТАРСТАН 4 1

1И 313 229 162 613 532 153 132 137 К-Б Р, ВОЛГОГР 2

Д1 45 313 229 162 613 532 158 129 141 ДАТ 1 1

А Г 35 313 229 162 613 532 158 132 141 А!ЕЕБ,ЧЕЧ Р 2 I

№< 313 229 162 613 «04 153 129 1 135 ЧЕЧ.Р 1 |

7N 313 229 162 613 532 158 Ш | 153 СТАВР КР 1 I

1НЧ 313 229 153 613 532 158 132 141 К-БР 1 |

В 1ШЧ 32"! 229 153 613 604 153 129 1 да А7.ЕРБ 1 1

ШЧ 325 229 171 «13 604 158 123 135 УКР (ЭФИОП ) 1 I

Ш 301 256 162 583 532 158 123 137 ДАТ 2

Рисунок 9. Филогенетические связи генотипов штаммов В апЛгасш, на

территории СНГ

Интересными оказались результаты сравнения MLVA-генотипов нескольких вариантов производных одного и того же штамма, выделенных в определенных селективных условиях

Основным итогом анализа характеристик генетических полиморфных локу-сов с вариабельным числом тандемных повторов по схемам Р Keim et al (2000) и Р Le Fleche et al (2001) 5 штаммов В anthracis и 49 их вариантов, относящихся к 5 группам, явилось обнаружение внутри каждой из них не только генетической гетерогенности, но и общей тенденции в распределении вариантов культур с определенными комплексами фенотипических свойств по генотипам Необходимо отметить, что все наиболее типичные по фенотипическим свойствам варианты (Тох+ Prot+ Trp+ Н1у+ Lee"), отобранные из популяций различных по генотипу исходных дламмов, имели в 4 группах один генотип, а в группе штамма В anthracis 14/41 генотип таких вариантов отличался только по одному локусу vrrA В нескольких случаях отбор культур по отдельным из этих признаков приводил к выделению вариантов не только с одинаковым комплексом фенотипических свойств, но и принадлежащих к одному генотипу Подобная картина наблюдалась и по отношению к вариантам, имеющим целый ряд атипичных для В anthracis свойств (Tox'Prof Тгр Му")

Наличие или отсутствие плазмид pXOl и рХ02 не приводило к изменению генотипа, определенного на основе характеристики хромосомных локусов В то же время, варианты с фено типическими нарушениями капсуло- и токсинопродукции при наличии генетических детерминант этих основных факторов патогенности относились к другому генотипу, даже в том случае, когда исходный штамм принадлежал к первому Так, все 4 варианта штаммов В anthracis, образующие капсулу при выращивании на обычном агаре Хоттингера в атмосфере воздуха (l(CO)-S, 12/16-S, 14/41aSM, 140П), имели один генотип, несмотря на то, что генотип типичного по основным свойствам штамма В anthracis 1(СО) отличался от остальных штаммов В anthracis 12/16, 14/41, 140П, популяции которых послужите исходными для выделения S-вариантов

Таким образом, обнаружена корреляция между характерными MLVA-генотипами и фенотипическими свойствами, определяющими более высокую вирулентность штаммов, а также направленность изменений генотипа при селекции культур с такой вирулентностью в популяции штаммов с умеренной вирулентностью (рис 10)

Следует отметить, что все штаммы и их варианты в этой выборке имели ранее не описанные генотипы, а два генотипа были новыми по отношению к генотипам 39 штаммов из различных регионов СНГ

К сожалению, в публикациях, посвященных MLVA-генотипированию штаммов В anthracis из национальных коллекций, не приводятся детальные характеристики фенотипических свойств, что не позволяет подтвердить или опровергнуть сделанные нами выводы на основании анализа взаимосвязи комплекса фенотипических свойств и ML VA-генотипа наших эндемичных штаммов

Оценка вирулентности и определение генотипов штаммов В anthracis могут быть произведены только после оценки однородности их популяций Особого внимания в этом плане требуют штаммы, выделенные из почвы с большим сроком давности обсеменения, и старые лабораторные штаммы, с которыми велась длительная работа с неоднократными пассажами на различных питательных средах и в

организме лабораторных животных с последующими переводами в споровую форму

1со

1со RK1 1со RK3 1coRK4 1со RK5 1со RK6 1со RK9 1со RK11 1eoRBA2 1C0RBA5 IcoRBAS 1со RBA7 1со RBA9 1со RBA10 1со RBA11 12-16 4р 14QP c-wrn 228prot 228BMSpr 1eoRG2-1 1co RG2 2 1co RG3 1 1co-1 1co RG3 e 223-8 228-8-1 228 8-2 1402 14-41-1 14-41-1aR 14-41Trp+ 1co-s 1co-s c-12-16 12-16 1 12-16 2p 12-18-s 12-16-swm

140P

140Pc-

14-41

14-41RBA9 14-412 14-41aSM 228

228 RK1 258-2 228-3 228-7 228-9 228-10

pXOl 135 n н

pXOl 135 п н

.уШи&ял«

pXOl 132 п н

pXOl 135 п н

pXOl 123 п »

Рисунок 10. Схема генетического родства штаммов В аМНгаа* и их вариантов на основе анализа полиморфных локусов с вариабельным числом тандемных повторов уггА, уггС1, уггС2, уггВ1, ССЗ и рХО! aat

С трудностями генотипирования штаммов с неоднородным составом популяции встретились при определении генотипов штаммов В anthracis 14/41 и 12/16 по схеме Р Keim et al (2000) Пробы ДНК указанных штаммов с праймерами к некоторым полиморфным локусам одновременно амплифицировали фрагменты различных размеров, соответствующих описанным аллелям Эти факты явились одной

из побудительных причин изучения генетической вариабельности пяти изогенных групп штаммов В апИпасгв и их вариантов

Приготовление проб ДНК для определения их характеристики по любым маркерным локусам должно проводиться с отбором культуры из изолированной колонии, морфология которой является если не единственной, то, по меньшей мере, доминирующей для данного штамма, что не дает гарантии генетической однородности культуры, но повышает достоверность полученной характеристики Наличие фенотипически выраженных различий в популяции требует выделения субкультур и их индивидуального генотишлрования и параллельного изучения комплекса фенотипических свойств Возможно, такой подход к изучению культур В апЖюса позволит выявить закономерности не только географического, но и попу-ляционного распределения генотипов сибиреязвенного микроба

В соответствии с одной из задач нашей работы был проведен анализ возможности использования УКГО-генотипирования и филогенетического анализа, выявляющих степень генетического родства изолятов В апМгасн, для эпидемиологического расследования вспышек сибирской язвы

Моделью для ретроспективного анализа посчужила эпидемиологическая ситуация по сибирской язве в июле-августе 1998 г, когда отмечались практически одновременные вспышки заболевания на территории трех сопредельных административных образований Южного федерального округа России Эпидемиологические осложнения, связанные с этими вспышками и сопутствующим им завозом инфицированного сырья животного происхождения на сопредельные территории, были зарегистрированы в двух районах Республики Калмыкия, двух районах Ставропольского края, Терском районе Кабардино-Балкарской Республики, а также в Краснодарском крае и Волгоградской области Такая ситуация могла предполагать различные варианты эпидемиологической связи между этими вспышками или их полную независимость

Объектом исследований явились 14 штаммов В ап1Игаа$, выделенных во время четырех вспышек в Ставропольском крае, Кабардино-Балкарской Республике и двух районах Республики Калмыкия из материала от больных, трупов людей и животных, а также из объектов внешней среды

Результаты проведенных исследований (Цыганкова О И с соавт, 2006) на-1 лядно продемонстрировали эффективность сочетаиного применения МЬУА и филогенетического анализа в молекулярно-эпидемиологическом мониторинге вспышек сибирской язвы В результате использования этого подхода удалось обнаружить генетические различия всех четырех групп штаммов (рис 8), что является достаточно обоснованным доказательством независимого характера вспышек сибирской язвы на сопредельных территориях ЮФО, происходивших в одно и то же время В пределах групп штаммов, выделенных в период отдельных вспышек, генотипы штаммов не менялись Только использование данных по вариабельности плазмчдных локусов позволило в обеих системах разделить штаммы из Ставропольского края и Кабардино-Балкарской Республики, имеющие одинаковые размеры амппиконов по всем хромосомным локусам

Вероятно, определение исторически сложившихся в данном регионе генотипов штаммов сибиреязвенного микроба за счет медленно эволюционирующих вариабельных локусов с относительно большими размерами тандемных повторов может осуществляться с использованием анализа нескольких таких локусов При этом важен выбор определенных локусов В то же время, при решении вопросов

генетической дифференциации культур, выделенных на сопредельных территориях в достаточно близкие промежутки времени, следует учитывать их характеристики по дополнительным полиморфным генетическим локусам с малыми размерами повторов, эволюционирующими быстрее, включая плазмидные

1182 11

1184

1185 .1198

1190

1191

1192

1193

1194

1186 1181 1188 1189

§,02

Кабардино-Балкарская Республ

Республ Калмыкия, Целинный район

Ставропольский край

Республ Калмыкия, Приютнемский район

Рисунок 11. Схема филогенетического родства 14 штаммов В. anihracis, выделенных во время 4-х вспышек сибирской язвы в ЮФО летом 1998 г на основе различий полиморфных локусов vrrA, vrrBl, vrrCl, vrrC2, CG3, pXOlaai, pX02at

Таким образом, в результате проведенных исследований и анализа полученных результатов разработаны новые методики исследования, методические приемы отбора более иммуногенных и продуктивных вариантов вакцинах штаммов В anihracis, а также штаммов, обладающих полезными свойствами для применения при производстве бактериофагов Теоретический интерес представляют данные анализа взаимосвязи проявления штаммами гемолитической, протеолитической и лецити-назной активностей с их цитотоксическим действием т vitro и впервые продемонстрированная вариабельность геномов у вариантов одних и тех же штаммов, отобранных в селективных условиях, наиболее характерные для типичных вирулентных штаммов MLVA-генотипы и направленность изменений генотипов при селек-

тивном отборе Практическое значение имеет разработанная мультиплексная ПЦР тест-система с праймерами к специфическим плазмидным и хромосомному локу-сам, позволяющая идентифицировать штаммы сибиреязвенного микроба с любым набором плазмид и оценивать их генетический потенциал патогенности Сочетан-ное применение MLVA и филогенетического анализа является эффективным и информативным методом молекулярно-эпидемиологического мониторинга сибирской язвы, который должен найти практическое применение в практике эпидемиологического расследования вспышек данного заболевания

ВЫВОДЫ

1 Разработанный метод определения гемолитической активности позволяет четко дифференцировать колонии сибиреязвенного микроба по наличию и размерам зоны гемолиза Отобранные на этой среде вариант I сибиреязвенного микроба, не обладающий гемолитической активностью, и вариант II с высоким ее уровнем, формировали колонии в R-форме и S-форме соответственно, что коррелировало с более высокой чувствительностью к сибиреязвенным бактериофагам у первых вариантов по сравнению со вторыми

2 Клеточные популяции вакцинных штаммов с отличающейся иммуногенно-стью представлены вариантами микроба I и II в разных количественных отношениях Индекс иммуногенности чистых культур варианта II, отличающихся более продуктивной споруляцией и темостабильностью спор, в опытах m vivo в 10 раз превышает таковой для культур варианта I, что дает возможность путем селекции отбирать вакцинные штаммы с высокими иммуногенными и продуктивными свойствами

3 Суммарное проявление гемолитической активности и различия фенотипи-ческих вариантов возбудителя по этому признаку определяются соотношением уровня экзопродукции фосфолипаз и холестеринзависимого антролизина О, обеспечивающих гемолиз, и протеаз, деградирующих эти ферменты

4 Метод дозированного высева спор на плотную питательную среду с последующей обработкой препаратом бактериофага позволяет определять доли фагоре-зистентных клонов в клеточных популяциях штаммов и проводить отбор фагорези-стентных вариантов сибиреязвенного микроба Клеточные популяции двух типичных штаммов В anthracis содержат от 2,9 до 17,3% резистентных к бактериофагам «ВА-9», «К ВИЭВ» КОЕ соответственно и не содержат устойчивых к бактериофагу «Гамма А-26», а в популяциях отобранных вариантов данных штаммов с устойчивостью к одному из этих фагов содержится от 8 до 33% КОЕ с устойчивостью ко всем трем фагам, включая фаг «Гамма А-26»

5 Фенотипические свойства штаммов размножения сибиреязвенных бактериофагов оказывают влияние на литический спектр и специфическую активность препаратов данных бактериофагов Экспериментально обоснован выбор штаммов В anthracis, оптимальных для использования в качестве культур размножения бактериофагов «Гамма А-26», «ВА-9», «К»-ВИЭВ, «Саратов», а также предложен новый способ выращивания бактериофага «Гамма А-26», упрощающий и сокращающий процесс получения его препарата при сохранении показателей активности, специфичности с более широким литическом спектром

6 Использование основных и дополнительных тестов позволяет выявить более высокую фенотипическую вариабельность штаммов возбудителя, чем позволяет

исследование по классической схеме Главные отличия природных изолятов касаются признаков капсуло-, токсинообразования, гемолитической, лецитиназной, протеолитической активности и вирулентности, встречаясь по отдельности и в совокупности

7 Полученная изогенная система из 5 вариантов штамма 1(СО) с разным набором плазмид и различающихся по способности продуцировать капсулу и токсин, гемолитической и протеолитической активности, питательным потребностям, представляет собой удобную модель для экспериментального изучения генетической детерминации этих свойств

8 Сконструированная мультиплексная амгшификациониая тест-сисгема с набором из трех пар праймеров к специфическим последовательностям плазмидных и нового хромосомного локусов обеспечивает идентификацию штаммов сибиреязвенного микроба с любым набором плазмид и диагностику сибирской язвы методом ПЦР у больных, включая лечившихся антибиотиками

9 Модификация метода МЬУА ДНК В ашИгаси-, основанная на подборе состава амплификационных смесей, режима амплификации и параметров электрофореза, позволяет проводить анализ продуктов амплификации методом электрофореза в агарозном геле с высоким разрешением, что делает методику доступной для более широкого практического применения

10 МГУА-генотипы субкультур штаммов остаются стабильными в отсутствие селективного отбора Впервые выявлена вариабельность МЬУА-генотипов, характер которой определялся селективным отбором более вирулентных или независимых от триптофана вариантов

11 МЬУА выявил среди исследованных штаммов, выделенных на территории СНГ, 17 различающихся генотипов Четыре генотипа принадлежали к известным ранее Остальные 13 генотипов описаны впервые Степень вариабельности данных штаммов сопоставима с таковой в пределах мировой коллекции

12 Генотипирование В апШгааз в сочетании с филогенетическим анализом дает возможность дифференцировать штаммы, выделенные во время вспышек сибирской язвы на сопредельных территориях в одно и то же время Полученные результаты впервые показывают пригодность М1,¥А для эпидемиологического анализа случаев заболевания сибирской язвой

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Еременко Е И, Цыганкова О И, Ярощук В А, Проскурина В А, Буравцева Н П Атипичные штаммы возбудителя сибирской язвы // Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций Тез докл науч конф - Ставрополь, 1991 -С 114-115

2 Ярощук В А, Еременко Б И, Цыганкова О И, Проскурина В А Характеристика штаммов сибиреязвенного микроба Европейской части СССР // Там же - С 132-133

3 Еременко Е И, Цыганкова О И, Буравцева Н П // Изменение фенотипа и плаз-мидного спектра штамма сибиреязвенного микроба с нарушенным капсулооб-разованием // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций Тез докл Российской науч конф -Волгоград, 1992 -С 38-39

4 Еременко Е И, Солодовников Б В , Цыганкова О И Изучение почвенных штаммов сибиреязвенного микроба // Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней Тез науч конф(Омск, октябрь 1993) -Ставрополь, 1993 -С 197-198

5 Еременко Е И , Цыганкова О И , Солодовников Б В К вопросу о вирулентности штаммов сибиреязвенного микроба // Там же - С 46-47

6 Ярощук В А, Еременко Е И, Цыганкова О И, Фунтикова Т Н , Проскурина В А Биологические свойства различных штаммов возбудителя сибирской язвы, выделенных в Карачаево-Черкесской республике // Там же - С 316-318

7 Цыганкова О И, Фунтикова Т Н, Буравцева Н П, Еременко Е И Изучение некоторых свойств субкультур сибиреязвенного вакцинного штамма СТИ-1 // Иммунология и специфическая профилактика ООИ Матер Российск науч конференции (21-23 сентября 1993) - Саратов, 1993 -С 192-193

8 Еременко Е И , Цыганкова О И , Солодовников Б В , Ярощук В А , Буравцева Н П Патогенность и экология возбудителя сибирской язвы // Материалы науч конф по проблемам зоонозных и других инфекционных болезней Ставрополь, 26 мая 1994 г -Деп в ВИНИТИ №22И-В94 -С 16-28

9 Еременко Е И , Цыганкова О И, Солодовников Б В , Абгарян А Г Изучение по-пуляционного состава штаммов сибиреязвенного микроба по признакам, связанным с патогенностью // Актуальные вопросы профилактики особо опасных и других инфекционных заболеваний Матер науч -практ конф «60 лет противочумной службе Кавказа» -Ставрополь, 1995 -С 145-146

10 Фунтикова ТН, Цыганкова ОИ, Буравцева НП, Еременко ЕИ Изменение клеточного состава популяции микробов в живых сибиреязвенных вакцинах в процессе длительного хранения//Там же — С 221-223

11 Цыганкова О И , Еременко Е И Изучение свойств субкультур различных штаммов сибиреязвенного микроба, резистентных к действию сибиреязвенного фага К//Там же - С 242-243

12 Цыганкова О И, Еременко Е И Применение синтетической Р-среды для изучения ферментативной активности сибиреязвенного микроба // Там же - С 243244

13 Цыганкова О И , Ярощук В А , Буравцева Н П , Солодовников Б В Определение оптимальных условий получения препарата сибиреязвенного диагностического бактериофага Гамма А-2 6//Там же — С 246-247

14 Буравцева Н П , Еременко Е И, Цыганкова О И Роль атипичных штаммов сибиреязвенного микроба в эпизоотологии и эпидемиологии сибирской язвы // Матер Межрегион рабочею совещ ВОЗ/ФАО по сибирской язве - Алматы, 1997 -С 38-39

35 Буравцева Н П , Еременко Е И, Цыганкова О И Роль атипичных штаммов сибиреязвенного микроба в эпизоотологии и эпидемиологии сибирской язвы // Доклады международного симпозиума «Особо опасные инфекционные заболевания эпидемиология, экспресс-диагностика и профилактика» (16-20 июня 1997) -Киров, 1997 - С 73-81

16 Еременко Е И, Буравцева Н П, Цыганкова О И , Солодовников Б В Клональ-ный анализ популяций штаммов Bacillus anthracis, выделенных из почвы // Деп в ВИНИТИ г Москва 19 06 1997 г X» 2037-В97 -21с

17 Буравцева НП, Фунтикова ТН, Цыганкова О И. Проскурина В А Сравнительная характеристика иммуногенности и безвредности живых сибиреязвенных вакцин // Материалы науч -практ конф, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (16-18 сентября 1997) —Саратов, 1997 - С 248

18 Еременко Е И, Цыганкова О И, Буравцева Н П Новые методы исследования штаммов Вас anthracis И Там же - С 43

19 Еременко Е И, Цыганкова О И , Тюменцева И С, Афанасьев Е Н, Жданова Е В Лабораторные исследования во время вспышки сибирской язвы // Там же -С 44

20 Солодовников Б В , Цыганкова О И, Тюменцева И С , Ефременко В И Оптимизация условий культивирования сибиреязвенного бактериофага // Там же - С 273

21 Солодовников Б В , Цыганкова О И, Тюменцева И С, Ефременко В И, Афанасьев Е Н О технологии получения сибиреязвенного диагностического бактериофага // Там же - С 274

22 Буравцева Н П, Еременко В И , Коготкова О И, Цыганкова О И Новый тест-заражающий штамм для оценки иммуногенности сибиреязвенных вакцин // Вторая международная конференция «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (24 сентября 1998) - Санкт-Перербург, 1998 -С 44

23 Буравцева Н П, Еременко Е И, Цыганкова О И, Коготкова О И Сибирская язва // Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней Т 1 - Саратов, 1998 -С 50-89

24 Патент РФ № 2102484 Способ восстановления вирулентности штаммов сибиреязвенного микроба / Еременко Е И , Цыганкова О И , Солодовников Б В - За-регистр в Гос реестре изобретений РФ 20 01 1998 Бюл №2

25 Патент РФ На 2121506 Способ определения гемолитической активности Bacillus anthracis /Цыганкова О И, Еременко Е И, Буравцева Н П - Зарегистрир в Гос реестре изобретений РФ 10 11 1998 Бюл №31

26 Патент РФ № 2123532 Способ отбора культур сибиреязвенных вакцинных штаммов и изготовленных из них вакцин /Фунтикова Т Н, Цыганкова О И, Еременко Е И, Буравцева Н П - Зарегистрир в Гос реестре изобретений РФ 20 12 1998 Бюл №35

27 Цыганкова О И Изучение популяционного состава сибиреязвенного штамма 1(СО) по чувствительности к сибиреязвенным фагам // Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний Биотехнология, ветеринария Материалы юбилейной науч конф, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МОРФ(30ноября-1 декабря 1998) -Киров, 1998 -С 258

28 Цыганкова О И Цитотоксическое действие фильтратов сибиреязвенных культур с различной ферментативной активностью // Там же - С 259

29 Eremenko Е I, Buravtseva N Р , Tsygankova ОI, Kogotkova ОI, Abgaryan A G , Sarkisova N V Study of atypical strains of Bacillus anthracis // 3rf International Conference on Anthrax, University of Plymouth (7-10л Septem 1998) -Plymouth, 1998 -P 46

30 Патент РФ № 2141522 1 ест-заражающая культура при определении иммуногенности сибиреязвенных вакцин, эффективности средствэкстренной профилактики и лечения сибирской язвы / Буравцева Н П, Коготкова Н П, Еременко

ЕИ, Цыганкова О И - Зарегистр в Гос реестре изобретений РФ 20 11 1999 Бюл № 32

31 Патент РФ № 2133273 Способ выращивания сибиреязвенного бактериофага Гамма/Цыганкова О И, Солодовников Б В -Зарегистр в Гос реестре изобретений РФ 20 07 1999 Бюл №20

32 Eieraenko Б I, Buravtseva N Р , Tsygankova О I, Proskunna V А , Efremenko V I, Sarkisova N V, Abgaryan A G , Tyumentseva I S Scheme for isolation and identification of Bacillus anthracis // Proceedings of the Iя European Conference on Dangerous Pathogens — Winchester, England, 1999 -P 43

33 Tsygankova ОI, Eremenko EI Variability of phage-resistant subcultures of the Bacillus anthracis strain l(SO) // Proceedings of the 1st European Conference on Dangerous Pathogens - Winchester, England, 1999 -P 35

34 Eremenko EI, Buravtseva N P, Urusmambetov Z К , Tsygankova О I, Sarkisova N V Isolation of Bacillus anthracis in the territory of Kabardino-Balkarian Republic //Эрдэмшинжилгээний бутээл -Уланбатор, 1999 -№7 -С 238-239

35 Eremenko ЕI, Tsygankova О I, Buravtseva N Р , Efremenko V Т, Sarkisova N V, Abgaryan A G, Urusmambetov Z Н Genetic variability among Вас Них anthacis // The 2nd International Workshop on the Molecular Biology of Bacillus anthracis and Bacillus thurmgiensis (August 11-13) -Taos,1999 -P 34

36 Еременко E И, Кейм П , Прайс Л Б, Клевитска А , Щуп Дж, ХьюДжонс М , Цыганкова О И, Брюханов А Ф, Саркисова Н В , Абгарян А Г Модификация многолокусного анализа области генома Bacillus anthacis с вариабельным числом тандемных повторов // Генная диагностика особо опасных инфекций Матер науч-практ конференции (21-22 ноября 2000) - Саратов, 2000 -С 33-36

37 Цыганкова О И, Еременко Е И Идентификация культур Bacillus anthracis с нарушением прорастания спор // Проблемы биологической и экологической безопасности Сборник материалов международной научной конференции (22-25 мая 2000) - Оболенск, 2000 -С 102-103

38 Буравцева Н П, Цыганкова О И, Еременко Е И, Лысогора Е В , Саркисова Н В Характеристика штаммов Bacillus anthracis, выделенных в очагах сибирской язвы в Ставропольском крае // Деп в ВИНИТИ г Москва, 12 07 2001 г, № 1646-В 2001 -27 с

39 Еременко БИ, Цыганкова ОИ, Брюханов АФ, Буравцева НП, Ефременко В И, Саркисова Н В , Абгарян А Г, Рязанова А Г Генетическая вариабельность штаммов Bacillus anthracis, выделенных на территории некоторых стран СНГ // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане / Материалы международной научно-практической конференции «Современный эпидемический потенциал природных очагов чумы», посвященной 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летию Талдыкорганской противочумной станции, г Талдыкорган, (1-2 августа2001) -Алматы- 2001 -В 3 -С 98-101

40 Коготкова О И, Буравцева Н П, Еременко Е И, Оверченко В В , Цыганкова ОИ, Саркисова НВ, Абгарян А Г Типичный тест-заражающий штамм 81/1 сибиреязвенного микроба // Там же - С 30-35

41 Цыганкова О И, Еременко Е И , Буравцева Н П Метод изучения популяцион-ного состава штаммов В anthracis по гемолитической активности // Природно-очаговые особо опасные инфекции на Юге России, их профилактика и лабораторная диагностика Сборник научных трудов — Астрахань, 2001 -С 212-214

42 Цыганкова О И, Еременко Е И, Буравцева Н П Оценка ферментативной активности Bacillus anthracis на желточной среде // Актуальные аспекты природ-ноочаговых болезней Мат науч -практ конф , посвященной 80-летию Омского НИИПИ(16-17 октября 2001) -Омск, 2001 -С 213-214

43 Eremenko ЕI, Afanasyev Е N , Efremenko VI, Abgaryan A G , Tsygankova О I, Zhdanova Е V, Sarkisova N V, Zharnikova IV Use of immune magnetic separation and PCR for Bacillus anthracis detection in soil samples // Abstracts of 4-th International Conference on Anthrax (June 10-13, 2001) -Annapolis, 2001 -B 23

44 Tsygankova ОI, Eremenko EI, Sarkisova N V Studies of conditions of spore germination and vegetation in vitro and m vivo of some subcultures of Bacillus anthracis l(CO) // Abstracts of 4-th International Conference on Anthrax (June 10-13, 2001) -Annapolis, 2001 -B 26

45 Цыганкова О И, Еременко Е И, Рязанова А Г Использование многолокусной ПЦР для идентификации штаммов Bacillus anthracis я оценки их эпидемической значимости // Сборник трудов науч -практ симпозиума «Технологии генодиагностики в практическом здравоохренении» в рамках Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (20-21 июня 2002) - Москва, 2002 - С 314-317

46 Рязанова А Г , Еременко Е И, Цыганкова О И , Абгарян А Г, Аксенова Л Ю Специфичность некоторых праймеров для обнаружения Bacillus anthracis методом ПЦР//Там же - С 312-314

47 Платонов М Е , Шишкова Н А, Мокриевич А Н, Светоч Т Э , Старицын Н А , Цыганкова О И, Брюханов А Ф , Еременко Е И, Абгарян А Г Исследование тандемных повторов В anthracis // Актуальные проблемы эпидемиологической безопасности Материалы юбилейной научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе Итоги и перспективы», посвященной 50-летию Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (15-16 октября 2002) - Ставрополь, 2002 - С 200-203

48 Цыганкова О И, Брюханов А Ф, Еременко Е И, Абгарян А Г, Рязанова А Г, Платонов М Е, Шишкова Н А, Мокриевич А Н, Светоч Т Э, Старицын Н А Генотипирование штаммов В anthracis, выделенных на территории России и стран СНГ//Там же - С 289-291

49 Цыганкова О И, Брюханов А Ф, Еременко Е И, Абгарян А Г, Рязанова А Г, Платонов М Е , Шишкова Н А, Мокриевич А Н, Светоч Т Э, Старицын Н А. Метод многолокусного анализа генома сибиреязвенного микроба с вариабельным числом тандемных повторов // Там же - С 292-295

50 Цыганкова О И, Еременко Е И , Рязанова А Г Новые праймеры к последовательности гена gerX и их применение для характеристики штаммов Bacillus anthracis И Там же - С 295-297

51 Рязанова А Г, Цыганкова О И, Саркисова Н В , Аксенова JIЮ , Еременко Е И Характеристика атипичных штаммов сибиреязвенного микроба // Там же - С 223-225

52 Солодовников Б В , Афанасьев Е Н, Тюменцева И С , Цыганкова О И Биотехнология производства диагностического сибиреязвенного бактериофага // Там же -С 251-253

53 Цыганкова О И, Брюханов А Ф , Еременко Е И, Абгарян А Г, Ефременко В И, Рязанова А Г, Платонов М Е, Шишкова Н А, Мокриевич А Н, Светоч Т Э ,

Старицин Н А Опыт генотипирования Bacillus anlhracis на основе анализа областей генома с вариабельным числом тандемных повторов // IV Всероссийская научно-практическая конференция «Генодиагностика инфекционных заболеваний» Сборник тезисов - Москва, 2002 - С 305-309

54 Буравцева Н П, Еременко Е И Коготкова О И Ефременко В И, Абгарян А Г, Цыганкова О И и др Эпидемиологическая обстановка по сибирской язве в регионах Южного Федерального округа в связи с наводнением в июне 2002 г // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 2003 - № б, Приложение - С 43-47

55 Цыганкова О И, Еременко Е И, Брюханов А Ф , Абгарян А Г, Ефременко В И , Рязанова А Г Генотипирование штаммов сибиреязвенного микроба, изолированных на территории стран СНГ // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии — 2003 -№ б, Приложение - С 51-56

56 Рязанова А Г , Еременко Е И, Цыганкова О И Дифференциация штаммов Bacillus anthracis от близкородственных бацилл при постановке ПЦР с праймерами к хромосомным генам // Сборник научных трудов, посвященный 75-летию НИИ Микробиологии МО РФ - Киров, 2003 - С 111-112

57 Цыганкова Е А, Еременко Е И , Цыганкова О И Разработка подхода к молеку-лярго-генетическому типированию Bacillus anthracis II Сборник научных трудов, посвященный 75-летию НИИ Микробиологии МО РФ - Киров, 2003 - С 128-130

58 Буравцева Н П, Цыганкова О И , Аксенова Л Ю, Коготкова О И, Еременко Е И, Абгарян А Г , Рязанова А Г, Жарникова И В , Проскурина В А Изучение экспериментально-производственных серий вакцины СТИ-ПР // Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекции Труды конф с международным участием (23-24 апреля 2004) -Санкт-Петербург, 2004 -С 147-148

59 Еременко Б И, Рязанова А Г, Цыганкова О И, Цыганкова Е А Геномика Bacillus anthracis I/ Генодиагностика инфекционных заболеваний Сборник тезисов 5-й Всероссийской научно-практической конференции — Москва, 2004 - Т № 2-С 172-175

60 Rya2anova A G, Tsygankova ОI, Eremenko Е I Comparative molecular characteristics of anthrax microbe atypical strain and close related Bacilli //Эрдэм шингжил-гээнийбуеээл -Уланбатор, 2004 -№ 12 -С 154-156

61 Коготкова ОИ, Буравцева НП, Еременко ЕИ, Ефременко ВИ, Цыганкова О И, Аксенова JIЮ, Рязанова А Г, Саркисова Н В Характеристика типичного тест-заражающего штамма 81/1 сибиреязвенного микроба // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии -2005 -№2 - С 100-104

62 Цыганкова О И Опыт применения метода MLVA для определения эпидемиологических связей вспышек сибирской язвы на сопредельных территориях // Естествознание и гуманизм сборн научных работ -Томск, 2005 -Т 2, №1 -С 49'

63 Цыганкова О И Фенотипическая и генетическая вариабельность субкультур штамма Bacillus anthracis 1(СО) // Там же -С 15-16

64 Цыганкова О И , Еременко Е И, Рязанова А Г , Цыганкова Е А Мультиплексная амплификационная тест-система для идентификации и дифференциации Bacillus anthracis // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии -2005 - № 3 - С 69-74

65 Пагент РФ Ka 2266963 Способ количественного определения резистентности популяционного состава штаммов Bacillus anthracis к сибиреязвенному бактериофагу /Цыганкова О И, Еременко Е И , Рязанова А Г , Цыганкова Е А - За-регистр в Гос реестре изобретений РФ 27 12 2007 Бюл №36

66 Цыганкова О И, Еременко Е И, Цыганкова Е А Обнаружение и характеристика новых аллелей VNTR-локусов генома Bacillus anthracis // Санитарная охрана территории государств участников содружества независимых государств проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях — Материалы VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ - Волгоград, 2005 —С 198-199

67 Цыганкова Е А , Еременко Е И , Цыганкова О И VNTR-анализ штаммов Bacillus anthracis с использованием нового локуса плазмиды рХ02 с вариабельным числом тандемных повторов//Там же -С 197-198

68 Цыганкова О И, Еременко Е И, Цыганкова Е А , Рязанова А Г Сравнительная характеристика субкучьтур штамма Baciltus anthracis 1(СО) методом анализа хромосомных полиморфных локусов с вариабельным числом тандемных повторов//Там же -С 199-201

69 Яцышина С Б , Цыганкова О И , Астахова Т С, Еременко Е И , Обухов И JI, Шипулин Г А , Цыганкова Е А, Рязанова А Г Разработка мультиплексной ПЦР-тест-системы для идентификации Bacillus anthracis Н Там же - С 305-307

70 Рязанова А Г , Цыганкова F А , Еременко Е И , Цыганкова О И , Изучение генетической вариабельности атипичных штаммов Bacillus anthracis II Там же - С 199-201

71 Еременко ЕИ, Цыганкова ОИ, Рязанова АГ, Цыганкова ЕА Прорастание спор возбудителя сибирской язвы // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 2006 - № 1 - С 72-74

72 Цыганкова О И, Еременко Е И , Рязанова А Г , Цыганкова Е А Перспективы применения генотипирования Bacillus anthracis в эпидемиологическом анализе // Эпидемиология и инфекционные болезни - 2006 - № 1 - С 24-28

73 Цыганкова О И Фенотигшческая вариабельность сибиреязвенного микроба и ее генетические основы И Н -и противочумн ин-т, Ставрополь, Деп в ВИНИТИ 17 07 2006 № 947-В 2006 - 88 с

74 Еременко Е И, Цыганкова О И, Брюханов А Ф , Рязанова А Г, Цыганкова Е А, Аксенова JIЮ Анализ молекулярного разнообразия Bacillus anthracis II Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территории государств-участников Содружество Независимых Государств Материалы VII Межгосударственной научно-практической конференции государств СНГ (3—5 октября 2006) - Оболенск, 2006 - С 100-101

75 Рязанова А Г, Еременко Е И, Цыганкова О И, Цыганкова Е А Использование метода многолокусного анализа генома с вариабельным числом тандемных повторов (MLVA) для идентификации атипичных штаммов сибиреязвенного микроба и дифференциации от близкородственных бацилл II Там же - С 121-122

76 Цыганкова Е А, Еременко Е И, Цыганкова О И Генетическое разнообразие локуса vrrA Bacillus anthracis, выделенных на территории СНГ // Там же - С 125-126

77 Цыганкова О И Гемолитическая активность фильтратов культур Bacillus ап-thracis с различными уровнями активности протеаз и лецитиназы // Там же - С 127-128

78 Цыганкова О И, Еременко Е И, Цыганкова О И, Рязанова А Г Особенности фенотипических свойств и генотипов вариантов Bacillus anthracis // Там же -С 128-129

79 Еременко Е И, Цыганкова О И , Цыганкова Е А , Рязанова А Г молекулярное разнообразие природных штаммов и лабораторных вариантов Bacillus anthracis //Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России Материалы научно-практической конференции (21-22 марта 2007) - Ставрополь, 2007 т 1,-С 119

80 Рязанова А Г , Еременко Е И, Цыганкова О И Использование мультиплексной ПЦР для дифференциации Bacillus anthiacis от близкородственных бацилл //Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России Материалы научно-практической конференции (21-22 марта 2007 г)-Ставрополь, 2007 т 2,-С 77-78

81 Цыганкова О И Еременко ЕИ, Цыганкова ЕА, Рязанова А Г Особенности фенотипических свойств и генотипов вариантов Bacillus anthracis // Там же — С 168-169

82 Цыганкова О И , Цыганкова Е А, Еременко Е И Видоспецифические праймеры к гену plcR Bacillus anthracis // Там же С 169-181

Подписано в печать 19 09 2007 г Формат 60x84 1Л6 Уел печ л - 2,5 Уч-изд л -1,6 Бумага офсетная Печать офсе шая Заказ 1269 Тираж 100 экз ГОУ ВПО «Ссзеро-Кавказский государственный технический университет» 355029, г Ставрополь, пр Кулакова, 2

Издательство Северо-Кавказского государственного технического университета Отпечатано в типографии СевКавГТУ

Информация о работе

Цыганкова, Ольга Ивановна
доктора медицинских наук
Ростов-на-Дону, 2007
ВАК 03.00.07

Автореферат

Похожие работы