Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение свойств иммуноглобулинов человека с помощью мышиных моноклональных тел

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение свойств иммуноглобулинов человека с помощью мышиных моноклональных тел"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ" РОССИЙСКОЙ" ФЕДЕРАЦИИ БАШКИРСКИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

КНЯЗЕВА Ольга Александровна

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ МЫШИНЫХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

УФА — 1994

, * !

Работа выполнена в Крымском медицинском институте.

Научные руководители: доктор биологических паук,

член-корреспондент АН Украины, заслуженный деятель пауки Украины, профессор | Г. В. ТРОИЦКИЙ, |

кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник К. А. ЕФЕ'ГОВ.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

академик АН республики Башкортостан, профессор В. А. ВАХИТОВ; доктор биологических наук, заслуженный деятель науки республики Башкортостан, профессор Т. Г. НИГМАТУЛЛИИ.

Ведущее учреждение — Санкт-Петербургский государственный

университет.

Защита диссертации состоится « , . » . . . . 1994 г. в , . „ ь часов на заседании специализированного совета К 084.35.02 при Башкирском государственном медицинском институте (450000, г. Уфа, центр, ул. Ленина, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « . . » . . . . 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук, профессор

Э. Г. ДАБЛЕТОВ

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблем. Для изучения свойств иммуноглобулинов человека, являющихся центральным звеном гуморального иммунитета, большое значение имеет методы иммунохимического анализа, в основе которого лежит реакция антиген-антитело. Однако исключительная неоднородность антител по физико-химическим свойствам и специфичности взаимодействия во многих случаях является непреодолимым препятствием в исследованиях. Монсклональные антителз, являющиеся ; продуктом гибридных клеток - гибридом, полученных в результате ' слияния лимфоцитов иммунизированных животных с культивируемыми в питательной среде клетками миеломных штаммов, значительно расширяют возможности таких методов, т.к. являются химически гомоген-. ными, имеют одинаковую специфичность, аффинность, направлены к ■ одной антигенной детерминанте.

В литературе имеются .данные об использовании моноклональных антител для изучения антигенной структур« иммуноглобулинов человека (КиЬагаиа et al., 1982; Арсеньева и др., 1990), аффинного выделения подклассов IgG (Harada et al., 1989), диагностики некоторых заболеваний (Могадо et al., 1985; Mercier et al., 1989; Ци-биногина и др., 1992). Однако далеко не все возможности использования моноклональных антител исчерпаны, остаются открытыми много вопросов, которые могут быть решены с их помощью. Так, например, до настоящего времени не решена дроблеыа аффинного выделения отдельны* подклассов иа поликлональной фракции IgG при физиологических значениях рН. и ионной силе раствора. При патологических состояниях организма часто нарушается реализация эффекторной функции IgG - связывания комплемента, которая играет одну из ключевых ролей в поддержании иммунного гомеостаза. В доступной нам литературе мы не нашли информации о попытках решать эту проблему с помощью моноклональных антител. Также нет сведении об использовании моноклональных антител в реакциях иммунопреципитации для диагностики парапротеинемии и определения типа легкой цепи IgG. -Поэтому мы посчитали актуальным проведение исследования, направленного на решение этих проблем с помощью мышиных моноклональных антител.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось использование уникальных свойств . моноклональных антител против

иммуноглобулинов" человека в различных иммунохимических методах для изучения свойств иммуноглобулинов, а также исследование с помощью моноклональных антител к мелиттину (пептиду из яда пчелы) эффекторной функции иммуноглобулинов G - связывания комплемента.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Получить штаммы гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., продуцирующие моноклональные антитела к различным антигенным детерминантам иммуноглобулинов человека; изучить свойства полученных моноклональных антител: специфичность взаимодействия, субклассовую принадлежность, аффинность, способность к иммунопреципитации.

2. Моноклональные антитела, обладающие способностью образовывать с антигеном, прецгаштационную решетку, использовать в реакциях иммунопреципитации для диагностики ларапротеинемии G, M и определения типа легкой цепи иммуноглобулинов G.

3. На основе отобранных моноклональных антител получить имму-носорбенты для аффинного выделения при физиологичесгагазначениях рН (рН 7,4) и ионной силе .раствора IgGl, IgG2 и lgG3 из полигональной фракции IgG. ' , '

4. Получить штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., продуцирующий моноклональные антитела к мелиттину , (пептиду из яда .пчелы), с помощью которых разработать способ определения комплементфиксирупцей активности иммуноглобулинов G.

• 5. Изучить с помощью разработанного метода комплеыентфикеиру-ющую . активность сывороточных иммуноглобулинов G здоровых и больных хроническим лимфолейкозом лодей, .

Научная новизна. В работе получены 12 яовых штаммов гибридных культивируемых клеток животных Mus ..musculus L.- продуцентов моноклональных антител к иммуноглобулинам человека.

Выявлены моноклональные антитела,, обладающие способностью образовывать преципитационную решетку с антигеном. Обнаруженные свойства использованы • в реакциях иммунопреципитащш для диагностики парапротеинемии G, M и определения, типа легкой цепи иммуноглобулинов G.

Созданы иммуносорбенты для аффинного выделения второго, третьего и четвертого подклассов IgG при физиологических значениях рН (рН 7,4) и ионной силе раствора.

Аффинно выделен и охарактеризован моноклональныи lgG4 из сы-

• ^ -

воротки крови больного с паралротеинемией, сопутствующей злокачественной опухоли желудка (при отсутствии миеломной болезни).

Получек новый штамм гибридных культивируемых клеток животных Маз шизси1иЗ Ь.- продуцег г моноклональных антител к мелиттину, с помощью которых разработан,способ определения комплементфиксирую-щей активности ■

С помощью разработанного метода определены константы диссоциации комплекса ' с первым фактором системы комплемента (С1ч) в норме и прп хроническом лимфолейкозе.

Практическая ценность. По материалам диссертации" получены 12 патентов.Российской Федерации. Созданные в работе моноклональные антитела могут быть использованы в различных биохимических, имму-. нологических и клинических исследованиях. В ходе работы был сделан ряд методи^вких рекомендаций. Предложено использовать моноклональные антитела в реациях иммунопреципитации для диагностики паралротеинемии Б, Ы и определения типа легкой цепи Получены иммуносорбенты для аффинного выделения при физиологических значениях рНи ионной силе раствора второго, третьего и четвертого подклассов I ев человека.

Разработан способ, позволяющий определять комплементфиксирую-щую активность;' 186. человека с помощью мышиных мококлоналъвых антител.1 Моноклональные антитела к мелиттину были использованы в Институте^ биохимии АН .Украины им.А.В.Палладина (Костржевская и др.,1992) для изучения взаимодействия ыелиттина с липидной мембраной (акт внедрения от 17.03.93).

Работа.проводилась.в рамках программы 0.74.05 ГКНТ и АН СССР "Исследование межмоле^лярных взаимодействий в иммунной системе в норме и патологии" (задание 17Н2) и в соответствии с заданием ГКНТ Украины (капр.б, N 5/321):."Получение монрклональных антител и использование их как иммунодиагноспп^мов при патологии и в* . экологически неблагоприятных условиях". .

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 10 Международном симпозиуме "Структура, биосинтез к функции макромолекул иммунной системы" (Краков, 1989), на VI Украинском биохимическом съезде (Киев,- 1992), на 57 молодежной научной конференции (Уфа; 1992), а тагосе на заседаниях Крымского отделения Украинского биохимического общества и научных конференциях кафедры биохи--мии Крымского медицинского института (Симферополь).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 научных

работ. '

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста, Еклсчая 12 таблиц и 15 рисунков. Работа состоит из введения, тести глав, выводов и списка литературы.! Список литературы содержит 218 ссылок на работы отечественных! и зарубежных авторов.

; СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ . :

\ ь5

В работе использовали препараты IeG. выделенные из сыворотки крови здоровых людей, больных хроническим лимфолейко?ом, миелом- . ной болезнью, аденокарциномой,желудка; IgA из сыворотки крови ми-еломных бальных, а также IgM из сыворотки крови больного болезнью Вальденстрема. Препараты выделенного из яда пчелы и искусственно синтезированного иелиттина Сьци предоставлены Институтом биохишга АН Украины им. А.В.Палладина (Киев). Препарат Ciq (первый компонент системы комплемента) - Научно-исследовательским институтом ос:fэ чистых биопрепаратов Главмикробиопрома РФ (Санкт-Петербург).

IgG выделяли путем высаливания сыворотки, крови 17,5Z серно-. кислым аммонием с последующей ионообменной хроматографией на ДЭ-АЭ-Трисакриле М ("LKB", Швеция) в 0,025 If трис-HCl буферном растворе,, содержащем 0,035 U NaCI, рН 8,8. Fab- и Fc-фрагменты IgG получали палаиновыы гидролизом IgG с последующей очисткой методами гель-фильтрации на Сефадексе- G-100 ("Sigma", США) к ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-Целлюлозе ("Sigma", . США). IgU получали путем переосаждения сыворотки крови больного болезнью Вальденстрема бидистиллированной водой с последующей гель-ф:ш>трацией на Ультрагеле АсА 22 ("LKB", Швеция). (Fc)5ji -фрагменты 1е« получали гель-фильтрацией трипсинового гидролизата IgM на Ультрагеле АсА 22 ("LKB", Швеция); IgA бил получен в НИИ эпидемиологии и-микробиологи! им.■Г.Н.Габричевского КЗ РФ (Москва).

Гибрид омы, продуцируащиз моноклональные антитела (монА7-) к1 иммуноглобулинам человека, получали, шшунизируя линейных мышей BALB/c путем внутрибрншшого введения 100 мкг препарата иммуноглобулинов. Для получения гибридомы, продуцирующей монАт к мелит-

тину, дозу иммуногена уменьшали до 50 мкг. Препараты белков вводили в 0,005 Ы фосфатном буферном растворе с 0,15 Ы NaCl, pH 7,4 (ЗФР) с полным адгювантом Фрейнда. Иммунизацию повторяли через 4 недели таким, же образом, но без адъиванта. Еще через 4 недели мышей бустировали путем внутривенного введения 100 мкг белка в ЗФР. Для получения антимелиттиновой гибридомы мышей не бустировали. Через 3 дня после последнего введения иммуногена проводили гибридизацию путем слияния 10® клеток селезенки иммунной мыши с 4*107 клеток миеломы Sp 2/0 Agl4 в присутствии 50Z раствора полиэти-ленгликоля 4000 ("Merck", Германия), высевая клетки (по 105 на лунку) в 96-ти луночные планшеты ("Flow",Великобритания) на слой перитонеальных макрофагов. Через 7- 10 суток проводили скрининг гибридом методом непрямого твердофазного кммуноферментного анализа (тИФА). Позитивные клоны клонировали методом лимитирующего разведения. Культивирование гибридом In vitro осуществляли в 9б-ти, 24-х, 12-ти луночных планиетах и пластиковых флаконах на 50-250 мл ("Flow",Великобритания) при 37° С, в. атмосфере 5Z СОг, в питательной среде RPMI-1640, содержащей 10-20 Х-ную фетальную бьг&ю сыворотку. В первые 3 недели после гибридизации в культу-радьную среду добавляли раствор среды ГАТ (гипоксантин, аминопте-рин, тимидин). Для культивирования In vivo суспензию гибридомкых клеток вводили в брюшную полость ишей BALB/c. Через 1-4 недели отбирали асцитическую жидкость, содержащую монАт, которые выделяли путем высаливания 40Х. от насыщения сернокислым ашонием. На всех стадиях получения гибридом клетки замораживали в фетальной бычьей сыворотке с добавлением 10Х дкметилсульфоксида по общепринятому режиму криоконсервирования клеток (Цуцаева, Петренко, 1988).

Конъюгаты монАт с пероксидазой получали перйодатным методом (Егоров и др. ,1991). . "-

Аффинную хроматографию осуществляли на сорбентах, приготов-• ленных перйодатным методом (Hoffman et al.1988) на CL 4В сефарозе ("Pharmacia", Швеция).

тИФА проводили на 96-ти луночных планшетах ("Flow",Великобритания) трем* способами: 1 -. непрямым, 2 - конкурентным и 3 -"сэн-депч"-м&тодом (Егоров и др., 1991).

Двойную радиальную иммунодиффузию, .'■ иыыуноэлектрофорез и диск-электрофорез проводили по общепринятым 1 методикам (Фри-мзль, 1987; Маурер:, lSTtJ. ;-'Y

Температурно-пертурбационные дифференциальные спектры (ТЦЦС) регистрировали на спектрофотометре "Specord М 40" ("Carl Zeiss", ГДР) в интервале длин волн 250-333 км при оптическом пути 1 см и концентрации белка 0,58 мг/мл, в интервале изменений температур (9-45)° С. Расчет доли пертурбируемых температурой тирозиновых и триптофановых остатков производили по разработанному методу (Троицкий и др.,1984), учитывая взаимный вклад тирозинового и трипто-фанового максимумов при длинах волн 288 и 295 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ СЕСУЖЦЕНИЕ

ПОЛУЧЕНИЕ ЫШОКЛОНМЬНЫХ 'АНТИТЕЛ К ИММУНОГЛОБУЛИНАМ ' .

ЧЕЛОВЕКА И ИЗУЧЕНИЕ ИХ СВОЙСТВ ;

Нами была получена панель гибридом, из которой после тщательного анализа были отобраны 12 штаммов, секретирующих монАт к различным антигенным детерминантам ' тяжелых цепей иммуноглобулинов человека классов Q и М, а также легких цепей иммуноглобулинов человека.

Гибридомные штаммы были условно названы: А5В8, 2G11, Л2Н2, H11G5, 2F11E11, 2H11F9, 1А4, В2, ВЗ, В5, Е5, 3H2D2.

Полученные монАт мы разделили на три.группы. К первой группе отнесли монАт, взаимодействующие с различными антигенными детерминантами IgG, ко второй - IgM, к третьей - специфичные к легким цепям иммуноглобулинов человека. Специфичность монАт исследовали в непрямом тИФА на препаратах .иммуноглобулинов человека и их фрагментов.

Обобщенные результаты этого исследования отражены в таблицах

1-3.

Большой интерзс в I группе вызывают монАт 2G11, Л2Н2, H11G5 и 2H11F9, вырабатывающие монАт, взаимодействующие лишь с цельными молекулами IgG . Отсутствие взаимодействия с Fab- и Fc- фрагментами позволило сделать вывод о расположении антигенных детерминант, распознаваемых данными монАт, в шарнирной области. Последняя у различных подклассов IgG является наиболее изменчивой по аминокислотной последовательности,, количеству межцепочечных ди-сульфидных связей и аминокислотных остатков (Завьялов, 1984), поэтому монАт, специфичные к антигещшм детерминантам, расположен-

Таблица 1

Специфичность взаимодействия I группы моноклиналь тлг антител

Антигены (иммуноглобулины е человека).

1еИ : 1бС2 : 1в63 : 1е31 :РаЬ-фраг-:Гс-фраг-: : : : менты менты

А5Е8 1еи - + + + +

2С11 1гш + + - + - -

Л2Н2 1ЕШ + + + ■ - - : -

Н11Б5 1еС2а + + + + - -

2И1Е11 да + + + + +

гниге 1801 + + + + ■ -

Таблица 2

Специфичность взаимодействия II группы мсноклональных антител

: Антигены

Субкласс : (иммуноглобулины человека)

монАт :------------------■—---------------------

: 1еА . : : ДО : (Гс)5ц

: : : : фрагменты

1А4 1861 + . +

В2 1еС2ь +- +

ВЗ 1вШ - +

В5 18<31 ^ +■ +

Примечание: - взаимодействие с антигеном, - отсутствие взаимодействия.

Мышиные монАт

Субкласс монАт

Мышиные монАт

Таблица 3

Специфичность взаимодействия III группы моноклональных антител .

Мышиные : Субкласс монАт : монАт

Антигены (иммуноглобулины человека)

IgGa

IgAX : IgM*

Е5 3H2D2

IgGl IgGl

+

+

+

+

Примечание: "+"

- взаимодействие с антигеном,

- отсутствие взаимодействия..

ным в этой."области, имеют большую научную ценность. Исследование также показало, что монАт H11G5 и 2H11F9 специфичны к общим антигенным детерминантам всех субклассов IgG, 2G11 - к антигенной детерминанте, имеющейся во всех субклассах IgG кроме IgG3, Л2Н2 -кроме IgG4. Было обнаружено, что монАт А5В8 и 2F11E11 специфичны к антигенным детерминантам, расположенным в Fab- и Fe- фрагментах, причем антигенная детерминанта, распознаваемая А5В8, отсуте-твовует в IgG2.

Из II группы монАт особый интерес, с точки зрения специфичности, вызывают монАт ВЗ из-за их взаимодействия с (Fc)5ji "фрагментами и отсутствия взаимодействия с цельными молекулами IgM. Это видимо, сеяззно с тем, что антигенная детерминанта, распознаваемая ВЗ, становится доступной лишь после фрагментирования IgM.

Также вызывают интерес с научной и практической точки зрения монАт III группы, специфичные к ж- и \ - легким цепям иммуноглобулинов, которые могут быть использованы в различных исследованиях по изучению структуры и функций иммуноглобулинов, создании им-мунохимических тест-систем для клинической диагностики ряда патологических состояний, связанных с моноклональной протеинемией и протеинурией. . "

Еще одно из свойств монАт, которое мы исследовали, это способность при взаимодействии с антигеном в гелевом носителе образовывать преципитационную решетку. Методы иммунопреципитации широко используют для анализа антигенов. Особенно большое значение они

. . g _

имеют в клинической практике для диагностики патологических состояний, сопровождал;.,г.;ся парапротеинеыкей и другими изменениями количественного и качг ственнсго состава иммуноглобулинов (Андреева, Чернохвостова, 1S35). Применение в этих методах монАт (по сравнению с обычно применяемыми полшслональпыми антителами) является более перспективным из-зз возко.-лности стандартизации исследований, отсутствия перекрестных реакций и большей технологичности. Однако отдельные монАт очень редко способны формировать с антигенами преципитационную решетку, т.к. спещфгчкы лишь к одной антигенной детерминанте. Способность к имнунопреттитации появляется в том случае, если на антигене имеются хотя бы две одинаковые антигенные детерминанты, или используют смесь из двух и более монАт, специфичных к разным антигенным детерминантам на одном антигене. Отбор таких монАт мы вели с помощью метода двойной радиальной иммунодиффузии. Исследованию подвергали асцитическую жидкость каждого гибридного.клона, а также смеси асцитических жидкостей разных гибридом. В результате были обнаружены монАт (продуцируемые гибридсмой В2), 'способные образовывать преципитационную решетку с IgM и (Fc)5»i - фрагментом, и три монАт (продуцируемых гибрйдомами 2H11F9, 2F11E11, 3H2D2), способных прештитиро-вать IgG в парных смесях, причем смеси монАт с 3H2D2 птоцишггиро-зали IgG ляль с легкими цепями калпа this а. НонЛг с оЗкарггоккол способностью к гаисунопрецкпитацкн били использованы ламп д.ся диагностики парапротеинемии G, Н и определения типа хэгкой цепи IgG. С помоцью названных монАт в иш<уноздектро4ор<>зе Оылк выявлены М-градиенты в сыворотке кропи трех баяьных. В результате исследования с помощыэ парных смесей нонАт 12 паралрстеиясз IgG человека было обнаружено, что сеаь ¡га них ссщзгтат: лег:ше цепи каппа типа.

. " ИСПОЛЬЗОВАШЗ ПОЛУЧЕННЫХ кенешгешишш АНТИТЕЛ ДЛЯ АФ'ЗШНСГО ЕЫдЕЛКПЯ П0ДШСС03 1^3

Шэггзгеся в литературе сведения об иммуЕосспЗеитах па осноеэ млАт к отдельнны подклассай'1в6 (Harada et al.,iS89) не решалт по-зостыо проблему их выделения из , Екдазадэкашгой фракции IgG, т.г..- я силу: особенностей техника айглшой хражт-огрзфя?, ввделяе-tr:.Z га так:« сорбзктал белек аигаруот буферггз^ рагтпором с рН

2,0-3,0, что приводит к необратимым конформационным перестройкам в (Часовникова и др., 1580; Ефетов, 1986) и является препятствием для последующих высокочувствительных спектралыггх исследований. Поэтому для получения иммуносорбентов для аффшпрго выдёления подклассов при физиологических значениях рН (рН 7,4) и ионной силе раствора были отобраны монАт спзцифмчные к трем из четырех подклассов (А5В8- к 1г61,3,4; 2011- 1е61,2,4 и Л2Н2- к 1еС1,2,3). На их основе были получены иммуносорбенты для аффинного выделения второго, третьего и четвертого подклассов из пула

Имыуносорбенты получали по двум различным схемам, применяемом в Научно- проигводствекном центре медицинской биотехнологии ЫВ РФ (Москва). Процедура приготовления иммуносорбентов на основе монАт А5В8 и 2611 заключалась в следующем:

1. Осадок монАт растворяли в ЗФР, определяли количество белка микробиуретоЕЫм методом (получилось 36,5 мг монАт А5В8 и 32,4 мг монАт 2611) и диализовали в течение суток против ЗФР.

2. 7 г (для А5В8) и 6 г (для 2611) отжатой С1 4В сефарозы (БрЬ) отмывали дистиллированной водой на стеклянном пористом фильтре и окисляли в темноте в течение одного часа при комнатной температуре на шейкере в 10 ил 0,1 М раствора перйодата натрия.

3. БрЬ многократно отмывали дистиллированной водой на стеклянном фильтре, добавляли 1 моль гидразин гидрата в 20 ил 0,1 и натрий-ацетатного буфера ({Я 4,5) и инкубировали на иейкере в течение 15 часов при комнатной температуре.

4. МонАт после диализа окисляли в темноте в течение одного часа на вейкере порйодатса натрия (конечная концентрация 0,008 Ю-

5. Окисленный белок диализовали в течение суток против 0,1 II натрий-ацетатного буфера, рН 4,5.

6. Окисленную 5рЬ тщательно отмытая« дистиллированной водой,

катргзЬаг.эта'Пй^ буферов и смэесгли с огс-слешзи болкоу в •гочеиле суток прн гемнатисй тйдсратуре на пейкаре.

7. Полученные шцуносорбеиш от*21£али 3£Р от нс-срязаххогося белка и ю^гэря^и коицэетршрэ шнАт по ьнкробиу! етовоа рг-акцян. Е^ео определено, что в БрЬ-А5В8 с ьзтрицзй связалось около 50% , в БрЬ-2Ш1 - около 40X коаАт.

8. Для восстановления оснований Ииффа в готовые имыуноесрЗен-ты добавляли 0,05 Я (з половшие?.; сбгеге от об-:/1!« Sph ЗФР) раствор боргидрвда натр:« и инкубировали на до&мре в течение двух часов при комнатной температуре.

Получение иммуноссрСента Sp.VJi£K2 по зтей схеме оказалось неудачным, т.к. после имкобшшзашт ¡;з матрице мснАт теряли спссоб-ность связывать антиген. Поэ?а<у бита использована вторая .методика, являющаяся более ездящей для антител и отличающаяся от первой тем, что перйодатсм окисляли только сефарозу, »¡мобилизацию антител на матрице проводили при pH 9,5 и без гпдрязин гидрата.

Полученные иммуносорбенты были опробованы при выделении подклассов IgG. Для этого на колонку с иммуносорбентом (предварительно промытым ЗФР, содержащим 1 М NaCl, и 0,1 Ы натрий-цитратным буфером, pH 3,00, и уравновепенным ЗФР) вносили 10 мг полккло-нального IgG.(выделенного из сыворотки кроЕИ 12 здоровых доноров методом ионообменной хроматографии) в 2 мл ЗФР, перемешивали и оставляли на 15 минут при комнатной температуре. Затем несвязах.-шийся бедок ашоировали ЗФР аликвотами по 1 мл и тестировали с помощью "сэндвич"-варианта тИФА, используя мышиные монАт против IgGl (Центральный научно- ксслэдовательсккй рентгеяорадиологи-ческий институт Ю РФ, Санкт-Петербург), против IgG2, IgG3, IgG4 человека ("Signa", США) и полученный нами конъюгат монАт 2F11E11 с пероисидазой хрена. В таблице 4 приведены результаты тестирования.

Таблица 4

Результаты тИФА для аффинно выделенных IgG2, IgG3 и IgG4 из пула IgG

Иимуносорбент Sph-монАт Мышиные монАт

анти IgGl анти IgG2 : анти IgG3 : анти IgG4

SpH-A5B8 0,067 0,856 0,059 ■ 0,045

SpH-2Gll 0,079 0,053 0,835 0,03В

SpH-JEH2 0,103 0,049 0 0,890

Примечание: полученные дзлные вырадены в единицах зкетинкции при длхше волны 405 нм и длине оптического пути 3 мм.

Таким образом, результаты тИФА показали, что с имыуносорбен-тов А583-5рЬ и 2011-5рЬ злшрованы соответственно к 1бБЗ.

Еыделение 1^64 из поликлональной фракции здороЕСго человека. сопряжено с трудностями, сьяззнныш с очень низкой концентрацией этого белка п нормальной сыворотке крови. Поэтому иммуно-сорбент Л2Н2-5р!ч бш: применен для Еьделения 1^04 при парапротеи-немии, когда его концентрация ре? ко повышена по сравнению с нормой.

В скг,/ редкой встречаемости парапротеинемии, сопутствующей злокачественным новообразованиям келимфоидного происхождения при отсутствии миелсмнок болезни (Андреева, Чернохвостова, 1985) особый интерес представлял 1еО Сш, выделенный из сыворотки крови больного раком желудка, и содержащий в иммуноглобулиновой фракции около ЗОХ парапротегсча 1вв4 (Ефетов, 1991). Выделение такого белка из фракции 1ц6 и изучение его свойств имело большой научный интерес. С помоп&ю полученного на основе монАт Л2Н2 имиуносорбэн-та эта задача была выполнена. Процедура выделения представляла ссйой сер;® щпста а&фшшой хроматографии, каждый из которых заключался в двухчасовой инкубации на Л2Н2-БрЬ 1 иг с последую-азь гшлсх.ЗФР. /¿Фикнп выделенный, чистый по результатам тИФА (таблица 4) 1в24 Оад исследован с помоа&ю дохода. ТПДС в ЗФР и ЗФ?, содержащем 21! цо-:евкну. Результаты ТЦЦС пула Смк и аф-шятло выделенного- кз наго 1еВ4 предсташЕнь' 'в таблица 5.

Таблица 5

Число оертурбгруешх тешсратурой ткрозиаойьи (Т»р) к тркдш; ,(Трп) ос^аткоз в 1еи Сш;

и <44ла;о выделскнси кз него' 1234

: Г35Р : ВС? с 2 И изчс-ШЮЙ:

Наследуемый :...............................—-------: х/у

оЗргззц 1вЗ : Тир ' ■: Три .: Тир : . Тра .: - : (£) : ' . (У) : :

123 П7Л £3,9 10,4 24,9 9,7 1,55

1се-1 гад ил 22,3 и,9 1,75

й- ^¡гсратурныс даььл:. кзейсхко, что велхчкаа х/у, хгьрект^ри-

зуюшзя степень устойчивости белка к воздействию на наго 2 У. мочевины у больных со злокачественными опухолями различных локализаций, составляет в средней 1,29 ± 0,04 (варьирует в пределах от 1,0 до 1,6), а у здоровых людей имеет значение 2,15 ± 0,28 (Ефэ-тов, Троицкий, .1990; Ефетов. и др., £1991; Ефетов, Троицкий, 1991). Результаты данного спектрального исследования,:- представление в таблице 5, показали, что выделенный да1 обладаем меньшей степенью устойчивости к воздействуя 2 М ыочетшы по сравнению с исходным да (более высокое значоуие .геличины ::/у, соизмаргаюе с таковым для да здоровых ллдей)- 3 то га? время пул да Смк оказался более устойчив к зоздейств'зз иочевшш, что характерно для да при новообразованиях.' , . .

МОНОКЛОНАЛШЫЕ АНТИТЕЛА К МЕЛИТТИНУ - "ИНСТРУМЕНТ" ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОМПЛЕМЕНТ ."КСИРУЩЯ АКТИВНОСТИ да

Одной из важнейших эффекторных-функций да является- связывание комплемента. Представляет интерес изучение, этой функции з норме и при хроническом лимфолейкозе - заболевании, сопровождающемся нарушением гуморального иммунитета (Тзтин и др., 1988).

Известно, что при хроническом лимфолейкозе в сыворотке . крови обнаруживаются модифицированные да, отличасщизся от да здоровых доноров устойчивостью конформации (Ефетов и др., 1985). Исходя из этого нам представлялось актуальным исследовать при данной патологии комплемёнтфиксируюшую активность да. •

Для этой цели мы разработали -способ определения константы диссоциации комплекса 1о^З-С1а, основанный на методе конкурентного тИФА, позволяющий следить за изменением активности С1ч при конкуренции за связывание с ним двух да: исследуемого да человека и моноклональных да мыши меченых пероксидазой. Необходимым условием разработанного метода было взаимодействие монАт мыши с 01ч и отсутствие взаимодействия их с да человека. Поэтому в задачу исследования входило получение монАт, специфично взаимодействующих не с да человека, а с каким-либо другим антигеном. С этой целью были получены монАт к ыэлиттину (Князева и др., 1993).

Полученные монАт конъюгировали с пероксидазой и использовали —для исследования констант диссоциации комплекса в тИФА,

который проводили по следующей схеме (концентрации С1д и да были

- 14 - •

подобраныв результате предварительных экспериментов):

1 - сенсибилизация 96-луночных планшетов раствором Clq в кон-

центрации 6,7 х ю-7 И. по 50 ыкл в лунку. В контрольные лунки вносили в таком же объеме 1Z раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA). Для лучшего связывания белков с поверхностью лунок планпета сенсибилизации проводили в 0,05 К Ка-карбонатном буфере, pH 9,2;

2 -' блокировка оставшихся свободными после первого зтала цен-

тров связывания поверхности лунок яланшета IX раствором BSA по 100 мил в лунку;

3 - внесение смеси двух îgG, конкурирующих за связывание с

Clq: исследуемого JgG человека и мышиного монокхональвого IgG против мелиттина, меченого пероксвдазои.(MAB - mouse antl bee); по 100 мкл в лунку. IgG человека титровали, концентрация его в опыте составляла: 6,70 х 10~7 II (100 ИКГ/мл), 5,36 х Ю-7 U (80 мкг/мл), 4,02 х Ю"7 Ы (60 мкг/мл), 2,68 х Ю"7 M (40 мкг/мл), 1,34 X 1P"7U (20 мкг/мл), 0.67 х 10-7 к (10 мкг/мл), в последотз j^HKy IgG человека не вносили. Призтом концентрация UAB qq^^Bauacb неизменной (рабочее разведение 1 : 300)'- ^едки на этом этапе были растворены в 0,005 Ii фосф^тнм» буфере 'с 0.15 Ii NaCl,.pH7,4 (3®); ' ■ • ' . '

4 - внесение субстрата - p,g mV раствора ABTS (£,2'-азино-

ди-СЗ-зтилбензтиазолин су,р>фдот (6))) в 0,05 M щгпщном буфере, pH 4,0, содержащем 0,01Х перекись водорода,, по 100 мкл в лунку.

Учитывая возможность агрегации IgG, приводящей к усилению фиксации комплемента, препараты IgG перед опытом центрифугировали при 15000 g в течение 30 минут.

Каждый этап (за исключением 4) проводили при 37° С в течение 1 часа. После 2 и 3 этапов планшеты последовательно отмывали холодной водой и 3ŒP е 0.05Z твином. После внесения субстрата планшеты инкубировали на шейкере в течение 5 минут при комнатной температуре. Сразу после этого регистрировали результате на спектрофотометре "Multlskan" в единицах экстинкщш при длине волны 405 ни, оптическом пути 3 мм.

Расчет константы диссоциации комплекса IgG-Olq производили по аналогии с методикой, основанной на конкуренции за связывание с Clq исследуемых IgG и эритроцитов, сенсибилизированных антите-

хами (Козлов и др., 1983). Величину, отражающую.долю молекул Cîq, связавшихся с МАВ, обозначили буквой Z. Показатель Z определяли по формуле: ' ' '

Z - In (Eut - Eb)/(Em - E)> где" Em - экстинкция в контроле на полную активность МАВ (на первых трех этапах енссилп ЗФР, на четвертом - вносили 50 мкл МАВ в рабочем разведении и сразу после этого - 100 мкл субстрата)

ЕЬ - '. экстинкция в контроле с BSA (на первом этапе вносили ;ЗФР, на втором - 1Z BSA, на третьем - МАВ в рабочем разведении); Е - экстинкция, регистрируемая в опыте. В случае конкурентного связывания IgG с Clq величина Z зависела от концентрации исследуемого IgG согласно уравнению: 1/Z1 - CI)/Zo l/Kl + 1/Zo, где ZI - доля молекул Clq, связавшихся с МАВ в опыте; Zo - доля молекул Clq, связавшихся с МАВ в отсутствие

исследуемого IgG, Kl - константа диссоциации комплекса IgG-Clq,

СП - концентрация исследуемого IgG в опыте в моль/л. Расчет К1 производили математически по уравнению линейной регрессии с помощью микрокалькулятора МК-61.

По описанной методике была определена комплементфиксирующая активность 20 препаратов IgG, выделенных из сыворотки крови 10 здоровых людей и 10 больных хроническим лимфолейкозом. Полученные результаты приведены в таблицах 6 и 7.

Таблица 6

Константы диссоциации комплекса IgG-Clq (Kl х ю~7 м) для IgG здоровых людей

: 1 : 2 : 3 : 4 : 5 : 6 : 7 : 8 : 9 : 10

-К1:2,01 2,18 2,57 2,15 2,43 1,99 2,17 2,76 2,30 2,22 г :0,970 О",973 0,934 0,967 0,974 0,970 0,963 0,974 0,983 0,983

Примечание: 1-10 - препараты IgG здоровых людей, г - коэффициент корреляции.

Тайлица 7

Константы диссоциации комплекса 1г&-С1ч (К1 х ю~7 М) для людей, больных хроническим лимфолейкозом

: Бер : Выс : Дом .: Коз : Лыс : Там : Тре : Чен : Чум : Шев

К1:10,62 2,67 10,91 2,58 2,39 2,13 19,02 13,18 2,70 7,21 Г :0,995 0,986 0,942 0,965 0,983 0.974 0,988 0,979 0,976 0,963

Пришадаиа: Бэр-Шзв - препараты. больных людей, Г - коэффициент корреляции.

Значения К1 для всех 10 препаратов здоровых людей оказались примерно одинаковыми и составили в среднем (2,28 ± 0,08)х Ю-7 М. Иммуноглобулины С больных хроническим лимфолейкозом оказались более гетерогенными по исследуемому параметру, и их можно разделит! ка дбэ группы. Если для 1е6 Выс,. Коз, Лыс, Там, Чум Ее-личиаа Ш оказалась сосзмлримой с К1 1еЗ адорозиг людей и в среднем численно раввн. (2,45 ¿г ОД1> х ш~7 м, то остальные пять 1ев (Бэр, Дом, Тре, Чёк, Швв) обладали, пониженной комплементфиксирую-г.ой активность». Сроднее значение К1 для этих белков составило (12,19 ± 1,96) х ю М~7, что достоверно отличается от К1 ¡ей здоровых людей (разйссть показателей достоверна с вероагйсстыо более 99Х, Ь- 5,05). Полученный данные :.ороц.о коррелирую? с имеющимися ь литературе (Тэтш. и г р., 1988).

Следует отметить, что определенны- данные м^юдои .жздоння .чоногешт .диссоциациг кале,, чв» шввд^ся к лкгературе к расечи-'»атчыг'ка основе других жда (З&шаког е1. а!., 1976; Тэтин и др., 1335; 1988). Это моггш ойьясшт особенностями данной мето-■Агаи: ^мобилизация ка плзгп"с планшзта (1 згап) С1сг приводит к то1о*» что облегчгэтея сва2ывуни& последнего с по сравнению с теми случаями, когда оба зги бэлка взаимодействуют, находясь • в растворе (Тэтин и др. ,1985; 1938). Поэтому ушзанный метод можно применять только для сравнительной оценки комплементфиксирующей активности разных препаратов или любых других комплементсвя-е^ззащгх белков.

Пи.'.ученЕЬ» результаты моею объяснить, используя имеющиеся »;-.ткс- о ыодкф'лкацкп при различных новообразованиях (Ефетов и ■ . ТрОКЦКйЛ.,. 1990), которая пз всок видимости яв-

ляется следствием лигандирования метаболитами (различными ам-фифильными соединениями), возникающими при деструкции опухолевой ткани. Было показано (Троицкий и др.., 1991;, Ефетов, Троицкий,. 1993), что основным местом связывания модельных иизкомолекулярных амфифильных соединений (дифильных пептидов, липидов, детергентов) с является Рс-фрагмент.

Известно, что реализация зффекторных функций антител в организме происходит при одновременном присутствии в среде различных лигандов. Так как центры фиксации С1р и сайты, с которыми связываются амфифильные метаболиты, находятся в Рс-фрагменте молекулы это может приводить к стерическому экранированию такими веществами центра связывания С1д и являться причиной того, что в отдельных случаях константа диссоциации комплекса !е<3-С1ч при хроническом лимфолейкозе значительно Еыше аналогичной константы в норме. В тех же случаях, когда К1 не отличались от значений К1 для 1г6 здоровых людей, центры связывания для С1ц и, метаболитов видимо были пространственно разобщены и не влияли на взаимодействие с С1ч.

Ослабление гуморального иммунитета при хроническом лимфолейкозе хорошо известно. Причем склонность к инфекционным осложнениям при этом заболевании часто сочетается с нормальным уровнем иммуноглобулинов в сыворотке крови. Наличие в ряде случаев при хроническом лимфолейкозе качественно измененных с ослабленной комплементфиксирующей функцией может быть причиной наблюдаемого феномена.

ВЫВОДЫ

1. Получены 12 штаммов гибридных культивируемых, мышиных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к иммуноглобулинам человека. Шесть моноклональных антител (А5В8, 2G11, JI2H2, Н1165, 2F11E11, 2H11F9) специфично зсшогодействуют с различными антигенными детерминантами иммуноглобулинов G; четыре моисклональных антитела (1А-1, В2, ВЗ, В5) - иммуноглобулинов М; два моноклональных антитела (Е5 и 3H2D2) - соответственно лямбда- и каппа- легких _цепе;\ иммуноглобулинов. Моноклональные антитела В2 и парные смеси мбноклональных антител 2F11.E11, 2H11F9, 3H2D2 при взаимодействии с антигеном в гелевом носителе образуют преципитационную решетку.

Обнаруженные свойства полученных ионоклональных антител позволяют использовать их в различных методах иммунохимического анализа для . изучения свойств иммуноглобулинов человека.

2. Моноклональные антитела В2 и смесь моноклональнш антител 2Р11Е11 и 2Н11Р9 использованы . в иммунозлектрофорезе для диагностики парапротеинеьши М, в . ¡¿оноюгональк1;е антитела 2Г11ЕИ и 2Н11Р9 в парных смесях с ЗН202 испальаовани в методе двойной радиальной имцунодкффузии для определения типа легкой да пи монокло-.. нальныг да человека.

' 3."На основе мо^оклональных антител А5В8, 2011 и Л2Н2, специфично взаимодействующих с-да1,3,4 , да1,2,4. и да1,2,3, получены иммуносорбенты для аффинного выделения второго, третьего и четвертого подклассов из поликлональной фракции да при физиологических 'значениях рН (рН 7,4) и ионной .силе раствора. На имму-: носорбенте Л2Н2 из пула да больного со злокачественной опухолью желудка выделен парапротеин 1£04. Выделенный 1034 по данным тем-пературно-пертурбационной дифференциальной спектрофотометрии обладает меньшей степенью устойчивости к воздействию 2 М мочевины по сравнению с исходным пулом да, что выражается в больших по амплитуде изменений в температурно-пертурбационных * дифференци- • альных спектрах при добавлении в раствор мочевины. - :

. 4. Получен штамп гибридных культивируемых мышиных , клеток, продуцирующий моноклонзльнье» антитела к мелиттину - пептиду из яда пчелы. С помощью этих моноклональных антител разработан, способ определения кошиементфиксирующей активности да в твердофазном иммуноферментном анализе, основанный на конкуренции за связывание с С1ч: исследуемого да человека и монсклокального да мьши против ыелиттияа, меченого пероксидазой.

5. При хроническом лимфолейкозе у 50Х обследованных больных обнаружено достоверное снижение комплекентфиксирующэй активности да, выражающейся в увеличении констант диссоциацкй комплекса да-С1ч, что дает возможность в этих случаях предполагать о существовании экранирования эффекторных центров да.

- 19 - .

СПИСОК РАБОТ, опубликовании по теме диссертации

1. The primary steps of cfcnaturtlon and complement binding activity of IgG at norm and pathology.- 10 th Workshop and symposium "Structure, biosynthesis, and functions of the molecular elements of the Immune- system, Cracow, June, 1589, P. 22 (co-auth. Tetln S.Yu., Efetov K.A., At. amas S.P., Neverodsky P.E., Trolts-ky G.V.).

2. Получение и свойства мышиных моноклоналъных антител к иммуноглобулинам человека // VI Украинский биохимический съезд (Киев, май, 1992): Тезисы докладов. Киев: Издательство УСГА, 1992.- Ч. III.- С. 99 (соавт. Ефетов К. А. .Тэтин С.Ю. ).

3. Моноклональные антитела к мелиттину-пептиду из яда пчелы // В сб.:"Вопросы теоретической и практической медицины", Уфа, 1992, с.29-30 (соавт. Ефетов К.А.).

4. Патент РФ N 2002803, МКИ5 С12 N 5/00, С12 Р 21/08. Штамм ' гибридных культивируемых кл?ток животных Mus musculus ^. . используемый для получения моноклоналъных антител к IgG 1,3,4 .человека //Бюл."Изобретения".- 1993.- N 42 (соавт.Ефетов К.А..,Тэтин С.Ю.).

5. Патент РФ N 2003679, МКИ5 С12 N 5/00, Cl2 Р 21/08. Штамм гибридных культивируемых клеток Mus Musculus L. .используемый для получения моноклоналъных антител к IgG 1,2,3 человека // Eos. "Изобретения".- 1993.- N 44 (соавт.Ефетов К.А.', Тэтин С.Ю., Троицкий Г.В.).

6. Патент РФ N 2003680, МКИ5 С12 N 5/00, С12 Р 21/08. Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L., используемый для получения преципитирующих моноклоналъных антител к IgM человека //Бюл."Изобретения".- 1993.- N 44 (соавт. Ефетов К.А.,Тэтин С.Ю., Троицкий Г.В.). ,

7. Патент РФ N 2003681, МКИ5 С12 N 5/00, 012 Р 21/08. Штамм Гибридных культивируемых клеток Mus musculus L., используемый для .получения моноклональных антител к х -цепям Ig человека // Бюл. Изобретения".- 1993.- N 44 (соавт. Ефетов К.А., Тэтин С.Ю., Троицкий Г.В. ).

8. Патент РФ N 2003682, МКИ5 С12 N 5/00. Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L.-продуцент моноклональных антител к Х-легким цепям иммуноглобулинов человека // Бюл. "Изо-

.b»L£ • -

бретения". - 1993.- N 44 (соавт. Ефетов К.А., Тэтин С.Ю., Троицкий Г.В.).

9. Патент РФ N 2003683, МКИ5 С12 N 5/00, С12 Р 21/08. Штамм гибридных культивируемых кдеток :лшотных Mus musculus L. -продуцент моноклональных антител к мелиттину из яда пчелы (Apis riellifera) //Вол."Изобретения".- 1993.- N 44 (соавт. Ефетов К.А., Тэтин С.Ю.).

10. Патент РФ N 2003684, МКИ5 Cl2 N 5/00. Штамм гибридных культивируешг клеток животных Mus musculus L. -продуцент моноклональных антител к (Fc)Six -фрагменту IgM человека // Бюл. "Изобретения".- 1993.- N 44 (соавт. Ефетов К.А., Тзтии С.Ю.).

11. Патент РФ N 2003685, МКИ5 Cl2 N 5/00, С12 Р 21/08. Штамм гибридных-' культивируемых клеток животных Mus musculus L. -продуцент моноклональных аатител к IgM человека // Бюл."Изобретения".--1993:- N 44 (соавт. Ефетов К.А., Тэтин С.Ю., Троицкий Г.В.).

12. Патент РФ N 2003686, МКИ5 С12 N 5/00, С12 N 5/16, Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L.-продуцент моноклональных антител к IgG человека // Бюл."Изобретения".--1993.- N 44 (соавт. Ефетов К.А., Тэтин С.Ю., Троицкий Г.В.).

13. Патент РФ N 2003687, МКИ5 С12 N 5/00, С12 Р 21/00. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., используемый для получения моноклональных антител к IgM человека // Бюл."Изобретения";-1993.- N 44 (соавт. Ефетов К.А., Тэтин С.Ю.).

14. Патент РФ N 2008350, МКИ5 С12 N 5/00, С12 Р 21/08. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., используемый для получения моноклональных антител к IgG человека.// Оол. "Изобретения".- 1994.- N 4 (соавт. Ефетов К.А., Тэтин С.Ю.).

15. Патент РФ N 2010856, МКИ5 С12 N 5/00,' С12 Р 21/08. Штамм . гибридных культивируемых клеток Mus musculus L., используемый для . получения прецшштирующих моноклональных антител к IgG человека //Бюл."Изобретения".- 1994.- N 7 (соавт. Ефетов К.А..', Тэтин С.Ю., Троицкий Г.В.).