Разработка и усовершенствование средств и методов иммунодиагностики аденовирусной инфекции

Амосова, Ирина Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и усовершенствование средств и методов иммунодиагностики аденовирусной инфекции
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и усовершенствование средств и методов иммунодиагностики аденовирусной инфекции"

I л ¿и иуих.

ииз483201

АМОСОВА Ирина Викторовна

На правах рукописи

РАЗРАБОТКА И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СРЕДСТВ И МЕТОДОВ ИММУНОДИАГНОСТИКИ АДЕНОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 0

Санкт-Петербург

2009

003483201

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт гриппа Северо-Западного отделения РАМН.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Соминина Анна Адольфовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Соколова Екатерина Дмитриевна

доктор биологических наук Киселева Ирина Васильевна

Ведущая организация:

НИИ вирусологии

им. Д.И.Ивановского РАМН

Защита диссертации состоится «Е^» декабря 2009 г. в ¿Г часов на заседании диссертационного совета Д.001.043.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт гриппа Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, г. Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт гриппа Северо-Западного отделения РАМН

Автореферат разослан <«*./ »

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Ж, /О

2009 г.

Суховецкая Вера Федотовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Аденовирусы представляют собой обширное семейство вирусов (Adenoviridae), патогенных для человека, млекопитающих и птиц. Аденовирусы человека циркулируют повсеместно, по своей распространенности они занимают третье место после гриппа и респираторно-синцитиальной инфекции. Их удельный вес в структуре ОРВИ составляет около 9% (Колобухина Л.В. и др., 2001; Соминина A.A. и др., 2007; Echavarria М, 2008).

В отличие от эпидемий гриппа, имеющих выраженную сезонность, аденовирусные инфекции регистрируются на протяжении всего года с наибольшим поражением детских групп населения (Echavarria М., 2008; Kuypers J., 2006; Levent F., 2009). Аденовирусы, как и вирусы гриппа, способны вызывать тяжелые поражения не только верхних, но и нижних отделов дыхательного тракта в виде пневмоний, бронхитов и бронхиолитов (Борисов Л.Б., 2001; Leung A.Y., 2005; Raboni S.M., 2003; Spenser К-А., 2007), а также других систем и органов (Ozbay Hosnut F., 2008; Walls Т., 2003). Известно, что аденовирусы являются причиной эпидемических вспышек фарингоконъюнктивальной лихорадки среди детей и новобранцев и возбудителями нозокомиальных заболеваний, в том числе, в офтальмологических отделениях. Аденовирусы вызывают также лимфоаденопатии, острые и хронические тонзиллиты, отиты, фарингиты, протекающие с явлениями интоксикации и гипертермии, поражения печени и миокарда (Казанцев А.П. и др., 1986; Raboni S.M., 2003; Ozbay Hosnut F., 2008). Отдельные серотипы аденовирусов (12, 18, 31, 40, 41) вызывают обширные вспышки гастроэнтеритов (Pang X.L., 2000; Saderi Н., 2002), а серотипы 12, 18 и 31 обладают повышенными онкогенными потенциями (Борисов Л.Б., 2001; Дяченко Н.С. и др., 1988). Появляется все больше данных о тяжелом генерализованном течении аденовирусных инфекций у пациентов с иммуносупрессией, которым -осуществляется трансплантация органов или костного мозга (van Kraaij M.G.J., 2005; KangG., 2002; Miura-Ochiai R., 2007), а также у онкологических больных при проведении химиотерапии (Gavin P.G., 2002; Walls Т., 2003). Подчеркивается также

важность распознавания аденовирусных инфекций у доноров органов в предоперационном периоде во избежание тяжелых осложнений, способных приводить к летальным исходам у реципиентов (Zheng X., 2008). Отмечен рост заболеваемости аденовирусной этиологии среди детей, проживающих на территориях, загрязненных радионуклидами в результате аварии на Чернобыльской АЭС (Соминина A.A. и др., 2007; Цыбалова Л.М. и др., 1997).

Эффективность надзора за аденовирусной инфекцией и ее терапии зависит от раннего диагностирования инфекции с ее дифференциацией от других вирусных заболеваний со сходными симптомами (Andreoletti L., 2000; Kang G., 2002), что определяет важность применения строго специфичных и высоко чувствительных методов дифференциальной лабораторной диагностики (Cicek С., 2007; Gavin P.G., 2003; Henrickson K.J., 2007). Разработка современных диагностических подходов осуществляется по двум основным направлениям, первое из которых связано с совершенствованием иммунологических тестов детекции вирусных антигенов или антител, а другое - с выявлением специфических последовательностей вирусного генома в материалах от больных (Kinchington P.R., 2005; Kuypers J., 2006; Marinheiro J.C., 2009).

Для ранней дифференциальной диагностики ОРВИ, определяющей саму возможность своевременного проведения этиотропной противовирусной терапии, необходимо создание простых, быстрых и недорогих тестов, к числу которых относятся усовершенствованные варианты иммуноферментного (Егоров A.M. и др., 1991; PuppeW., 2004; Spencer К-А., 2007) и иммунофлуоресцентного анализа (Соминина A.A. и др., 2006; Cicek С., 2006; Kuypers J., 2006; Landry M.L., 2000). Целесообразность их использования обоснована не только медицинскими показаниями, но и существенной экономической выгодой, достигаемой, главным образом, за счет отмены антибиотиков при острых респираторных инфекциях вирусной природы и сокращения сроков госпитализации как результат применения специфической противовирусной терапии (Percivalle Е., 2003; Takimoto S., 1991). Одним из ведущих направлений в области совершенствования

диагностических иммунотестов является введение в их состав моноклональных антител к возбудителям ОРВИ, обеспечивающих наиболее высокую чувствительность, специфичность и необходимый уровень стандартизации препаратов (Соминина A.A. и др., 2007; Rovida F., 2005).

Цель исследования. Целью настоящей работы явилось создание усовершенствованных тест-систем для диагностики аденовирусной инфекции.

Задачи исследования:

- разработка методики получения высокоочищенного гексонного антигена аденовируса;

- разработка технологии производства коньюгатов поликлонального типа с флуоресцеинизотиоцианатом для быстрой диагностики аденовирусной инфекции;

- получение и скрининг моноклональных антител к различным сайтам в составе гексона аденовируса, общим для разных семейств аденовирусов;

- разработка технологии получения коньюгатов моноклональных антител с флуоресцеинизотиоцианатом;

- дизайн новых моноклональных иммуноферментных тест-систем для ранней диагностики аденовирусной инфекции;

- клинико-лабораторная апробация разработанных препаратов с оценкой их диагностических параметров в сравнении с другими методами (электронная микроскопия, ПЦР, выделение аденовирусов в культуре клеток, серологический анализ).

Научная новизна работы. Научно обоснована целесообразность получения для диагностических целей моноклональных антител направленных к консервативным детерминантам в составе гексонного белка аденовируса.

Впервые в России детально отработана методика получения высокоочищенного (до кристаллического состояния) гексонного белка аденовирусов.

Впервые в России получена панель моноклональных антител к гексонному антигену аденовируса 6 серотипа. Дана характеристика

биологических и диагностических свойств полученных моноклональных антител в различных иммунологических реакциях.

Экспериментально обосновано, что разработанные моноклональные антитела позволяют диагностировать заболевания, вызываемые аденовирусами, принадлежащими к различным группам (В, С, Е и Г) семейства А<1епоут(1ае.

Практическая значимость работы. Разработаны новые тест-системы для ранней диагностики аденовирусной инфекции на основе иммунофлуоресцентного и иммуноферментного анализа. В клинико-лабораторных исследованиях обоснована перспективность их применения в условиях практического здравоохранения как для индивидуальной диагностики в госпитальных условиях, так и для расшифровки природы эпидемических вспышек неясной этиологии, в т.ч. в отдаленных точках страны.

Впервые в России коньюгированы моноклональные антитела к гексонному антигену аденовируса 6 серотипа с флуоресцеинизотиацианатом и пероксидазой хрена без снижения специфической активности препаратов.

Высокие показатели чувствительности и специфичности разработанной ИФТС «АДЕНОВИР» в сравнении с данными, полученными в ПЦР и при электронной микроскопии, позволяют рекомендовать ее для использования в лабораторной практике при диагностике аденовирусных инфекций.

Положения, выносимые на защиту:

1. Полученные моноклональные антитела # 6 (МКА#6)к гексонному антигену аденовируса 6 серотипа являются перспективными иммунореагентами и могут быть использованы в различных иммунологических тестах детекции аденовирусных антигенов.

2. Применение МКА # 6 к гексонному антигену аденовируса 6 серотипа повышает чувствительность и специфичность ранее разработанных диагностических тестов.

3. Использование ФИТЦ-коньюгатов моноклональных антител позволяет выявлять аденовирусы, принадлежащие к различным группам (В,

С, Е) семейства аденовирусов и облегчает интерпретацию результатов за счет большей яркости специфической флуоресценции.

4. Разработанная иммуноферментная тест-система «Аденовир» характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью и может быть рекомендована для диагностики аденовирусной инфекции, как при респираторных, так и при кишечных формах заболевания.

Внедрение результатов в практику. Разработана научно-технологическая документация (НТД) на препарат «Иммуноглобулин диагностический флуоресцирующий антигексоновый аденовирусный» («ИДФАГ»), Регламент производства № 4429427-001-09 и технические условия № 93 8837-001-4429427-2008 на препарат «ИДФАГ» согласованы с ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора, Инструкция по применению № 01-11/131-08 от 15.08.2008г. утверждена Главным государственным санитарным врачом РФ. Препарат «ИДФАГ» зарегистрирован на территории России (Регистрационное удостоверение № ФСР 2008/03940), внедрен в производство на базе ООО «Предприятие по производству диагностических препаратов» и используется в различных организациях практического здравоохранения (ФГУЗ ЦГЭ, глазные клиники, инфекционные стационары), включая сеть базовых лабораторий по мониторингу за гриппом и ОРВИ в составе Референс-центра при НИИ гриппа СЗО РАМН.

Материалы исследования используются в учебном процессе в курсе тематического усовершенствования, профессиональной переподготовки и сертификационном курсе по специальности «Вирусология» на базе ПДО СПб ГОУВ Государственной Медицинской академии им. И.И. Мечникова совместно с НИИ гриппа СЗО РАМН.

Апробация работы. Материалы исследования были доложены на Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» (Республика Беларусь, Минск, 2007), на заседании Санкт-Петербургского научного общества микробиологов и эпидемиологов (Россия, Санкт-Петербург, 2008) и на XXXI Итоговой научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционных

заболеваний у детей» (Россия, Санкт-Петербург, 2009), а также представлены на международной конференции «Options for the control of Influenza VI» (Канада, Торонто, 2007).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 20 работ, из них - 6 статей в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация представлена на 120 печатных листах, иллюстрирована 15 таблицами и 19 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 113 источников, из них 14 отечественных и 99 иностранных авторов, 5 приложений.

Личный вклад автора. Автор участвовала в разработке технологии производства препарата «Иммуноглобулин диагностический флуоресцирующий антигексоновый аденовирусный», широко внедренного в практику здравоохранения. При участии автора получены и полностью им охарактеризованы моноклональные антитела к гексонному антигену аденовируса. Лично автором изготовлены экспериментальные серии ФИТЦ-коньюгатов моноклональных антител и изучена их специфическая активность в лабораторных и клинических условиях. Осуществлено конструирование и проведены испытания новой иммуноферментной тест-системы «АДЕНОВИР» моноклонального типа, предназначенной для индикации аденовирусных антигенов в матеиалах от больных. Проведен анализ и статистическая обработка полученных результатов.

Диссертационное исследование выполнено в соответствии с плановой темой НИР НИИ гриппа СЗО РАМН № 012 «Дизайн, клинико-лабораторная апробация и внедрение новых диагностических тест-систем в практику этиологического надзора за гриппом и ОРЗ на территории России».

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы.

Вирусы и клетки. В работе использовали монослойные перевиваемые клеточные культуры HeLa, МА-104 (Коллекция клеточных культур при институте цитологии РАН); аденовирусы серотипов 3, 4, 6 (штамм Tonsill-99), 7, 21, респираторно-синцитиальный (PC) вирус (штамм Long) (музей ОРВИ НИИ гриппа СЗО РАМН).

Моноклональные антитела 7F1 к гексонному антигену аденовируса 1 серогипа (Всесоюзный центр молекулярной диагностики и лечения (ВЦМДЛ)). В качестве экспериментальных животных использовали кроликов (питомник лабораторных животных «Рапполово») и гибридных мышей линии SJL/J (Российский научный центр радиологии и хирургических технологий Росмедтехнологий).

Методы. Использованы различные методы работы с клеточными культурами, вирусологические, серологические, биохимические, молекулярно-биологические и электронно-микроскопические методы исследования, методы гибридомной технологии, очистки и концентрирования вирусных белков, очистки моноклональных антител с помощью аффинной хроматографии, а также статистические приемы обработки и анализа полученных результатов. В работе использовали пакет прикладных программ Statistika-5,0 для непараметрических выборок. Для расчета показателей диагностической эффективности препарата рассчитывали суммарный показатель совпадения результатов с референтной системой и средний квадрат сопряженности phi2.

Клинико-лабораторные исследования. Оценка диагностических свойств новых тест-систем для определения аденовирусной инфекции проведена на материалах от 574 больных ОРВИ. Методами сравнения служили: иммунофлуоресцентный анализ детекции аденовирусных антигенов в эпителиальных клетках носоглоточного эпителия, иммуноферментный анализ для выявления антител к аденовирусу класса IgG (ИФТС-AB-IgG), выделение аденовирусов в культуре клеток, а также выявление ДНК аденовирусов при помощи полимеразной цепной реакции.

л с>

С'

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Получение и изучение специфической активности коньюгатов поликлональных антител к гексонному антигену аденовируса с флуоресцеинизотиоцианатом.

Одним из важнейших показателей диагностических тест-систем

является их специфичность в отношении искомого возбудителя в сочетании с широким спектром реагирования, т.е. их способность выявлять серотипы аденовирусов, принадлежащие к различным группам этого семейства. Расширение спектра реагирования было нашей целью при разработке препаратов поликлонального типа для чего, при получении иммунных сывороток, использовали высокоочищенный (до кристаллического состояния) гексонный антиген аденовируса 6 серотипа (рис. 1).

Кроликов иммунизировали очищенным гексонным антигеном 4-х кратно, общее

' ^ количество вводимого антигена составило 0,6 -

у. . '

О 0,9 мг на цикл иммунизации. Специфическую

- ^ ^

V ^у^. Л " активность поликлональных антител (ПКА) в

^ Т^';.- •• составе гипериммунных аденовирусных

Рис. 1. Кристаллы очи- сывороток изучали непрямым

щенного гексона адено- иммунофлуоресцентным методом с использо-вируса 6 серотипа, использованного для им- ванием «Иммуноглобулинов диагностических

мунизации при получе- флуоресцирующих антивидовых против

нии антител поликло- с

иммуноглобулинов кролика» (ГУ НИИЭМ им.

нального и монокло-

нального типа. Ув. х100. Н.Ф.Гамалеи РАМН, г. Москва).

Специфические антитела выявляли аденовирусный антиген, локализованный в основном в ядрах зараженной клеточной культуры НеЬа, в виде ярко-зеленых светящихся гранул разной величины. За период выполнения работы было получено 50 серий очищенных поликлональных антител, коньюгированных с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ-коньюгат ПКА).

При тестировании активности ФИТЦ-коньюгатов ПКА было установлено, что препараты не были узко специфичными и реагировали с

аденовирусами ряда серотипов (6, 3 и 21) при отсутствии взаимодействия с гетерологичными вирусами (гриппа А, В, респираторно-синцитиальным (РС) вирусом) и хозяйскими антигенами. При этом наиболее яркую гранулярную флуоресценцию при окрашивании ФИТЦ-коньюгатами ПКА наблюдали в клетках, зараженных гомологичным аденовирусом (6 серотип). Отчетливая флуоресценция умеренной интенсивности наблюдалась в отношении аденовируса 3 серотипа, при выявлении аденовируса 21 серотипа интенсивность флуоресценции и титры коньюгата были несколько ниже. Титры ФИТЦ-коньюгатов ПКА варьировали в пределах от 1:16 до 1:32.

Для внедрения в практику здравоохранения серии препарата вместе с НТД были представлены в ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора для контроля, где проведены его государственные испытания в сравнении с одним из лучших зарубежных аналогов -препаратом «IMAGEN» фирмы «DAKO» (Дания) для прямой иммунофлуоресцентной диагностики аденовирусной инфекции. Оценку диагностической эффективности ФИТЦ-коньюгатов ПКА проводили путем сопоставления полученных при их использовании результатов с данными референтной системы «IMAGEN» (в опытной и двух контрольных группах). Всего было обследовано 200 мазков (100 дубликатов), приготовленных из материалов, взятых у одних и тех же больных. Чувствительность и специфичность ФИТЦ-коньюгатов ПКА в сравнении с «IMAGEN» по данным ФГУН ГИСК им. ЛА.Тарасевича Роспотребнадзора составили 85% и 92%, соответственно.

Разработанные ФИТЦ-коньюгаты ПКА зарегистрированы на территории России как препарат «Иммуноглобулин диагностический флуоресцирующий аденовирусный антигексоновый сухой» («ИДФАГ»). «ИДФАГ» внедрен в производство на базе ООО «Предприятие по производству диагностических препаратов» и широко используется для диагностики аденовирусной инфекции в клинических условиях и в опорных базах Федерального центра по гриппу (ФЦГ) и Центра экологии и эпидемиологии гриппа. По полученным данным удельный вес аденовирусов в общей структуре респираторных заболеваний за последние 4 года

составляет около 7 - 9% (рис.2).

пг (1,2,з тип, 2005-06 гг.

суммарно) 8,60%

гргаш А

5.60%

РС

5.50%

гртптп В

2.10%

пг (1,2,3 тип, 2007-08 гг. суммарно) 11,70%

Ад 7.80%

РС 4.60%

грипп В

2.50%

гршт А

7.60%

"с^марноГ 2006-07 ГГ.

9.80% Ая

8.90%

РС 4.60°»

ГрПППВ 2.10%

гргаш А

б%

пг (1,2,3 тип. 2008-09 гг.

суммарно)

Рис. 2. Удельный вес аденовирусной инфекции в структуре ОРВИ в России по результатам иммунофлуоресцентного анализа с использованием препарата «ИДФАГ».

В этих исследованиях установлено, что аденовирусные инфекции регистрируются постоянно на протяжении всего года, вызывая заболеваемость среди всех возрастных групп, но в основном, среди детей.

Разработка моноклональных антител к гексоиному антигену аденовируса.

Вместе с тем, необходимо отметить, что технология производства препарата «ИДФАГ» достаточно сложна и трудоемка, а иммунный ответ экспериментальных животных может варьировать в зависимости от продуцента. В этой связи создание препаратов моноклонального типа, характеризующихся стабильностью свойств, определенным спектром реагирования, известным аффинитетом, высокой специфичностью, которые могут быть наработаны практически в неограниченном количестве с учетом криоконсервации гибридом и отвечающих заданным диагностическим параметрам является весьма привлекательным решением, освобождающим от необходимости постоянной наработки, очистки и концентрации аденовирусов, получения очищенного гексона и других технологически сложных операций.

Для решения этой задачи мышей линии 8ЛЛ иммунизировали очищенным гексонным антигеном аденовируса 6 серотипа из расчета 40 мкг на мышь. Цикл иммунизации мышей состоял из 2 инъекций антигена с интервалом 6 недель.

В результате слияния клеток миеломы мышей Px8Ag.653 с иммунными спленоцитами и их последующего клонирования было получено 7 стабильных клонов гибридом (№№ 2, 3, 6, 9, 10, 11, 14), секретирующих антитела к гексонному антигену аденовируса 6 серотипа, которые затем были подвергнуты криоконсервированию в жидком азоте. По показателям специфической активности в иммуноферментном анализе (ИФА) и при иммунофлуоресцентном исследовании (ИФЛ) для последующих работ по конструированию диагностических тест-систем были отобраны МКА#6, которые выгодно отличались от других МКА более широким спектром реагирования в ИФА и ИФЛ в отношении различных серотипов аденовирусов (3, 6, 14, 19, 21), достаточно высоким уровнем специфической активности в ИФА (титр -10"6) и при ИФЛ (титр в непрямом ИФЛ - 10~3). МКА#6 выдерживали процедуры конъюгации с пероксидазой хрена и ФИТЦ, а также лиофилизации без утраты специфической активности. Указанные МКА не обладали перекрестной реактивностью с другими возбудителями ОРВИ (вирусами гриппа А и В, РС- вирусом) и антигенами клеток хозяина.

Получение и изучение диагностических свойств коньюгатов моноклональных антител к гексонному антигену .аденовируса с флуоресцеинизотиоцианатом.

С учетом характеристик полученных МКА, был выполнен следующий этап работ по получению опытных серий ФИТЦ-коньюгатов МКА#6. На модели клеточных культур показана их более высокая активность в отношении различных серотипов аденовирусов (6, 3 и 21 серотип), а также при исследовании материалов от больных в сравнении с препаратом «ИДФАГ» (рис. 3).

Для уточнения спектра реагирования ФИТЦ-коньюгатов МКА#6 проведены дополнительные исследования на клеточных культурах, инфицированных материалами от больных, среди которых оказались

Рис. 3. Специфическое свечение в клеточной культуре НеЬа, инфицированной аденовирусом б серотипа через 48 часов после заражения, окрашенной препаратом «ИДФАГ» (А) и ФИТЦ-коньюгатом МКА#6 (Б) при использовании прямого метода иммунофлуоресценции. Ув. х900.

аденовирусы 2, 3, 4 и 7 серотипов, принадлежащие к различным таксономическим группам аденовирусов (В, С и Е). Все перечисленные серотипы аденовирусов выявлялись при окраске ФИТЦ-коньюгатом МКА#6, при этом интенсивность флуоресценции была значительно выше, чем при использовании препарата «ИДФАГ» поликлонального типа (табл. I).

Таблица 1

Сравнительные результаты выделения вирусов и иммунофлуоресцентного анализа с использованием препаратов «ИДФАГ» и ФИТЦ-коньюгата моноклональных антител#6

№ истории болезни Выделенный тип вируса Результаты иммунофлуоресцентного анализа материалов от больных при использовании препаратов Группа аденовирусов, к которому принадлежит выделенный вирус

«ИДФАГ» ФИТЦ-коньюгат МКА#6

5307 аденовирус 3 серотипа ++ ++/+++ В

5308 аденовирус 4 серотипа + ++ Б

5310 аденовирус 4 серотипа ++ +++ Е

5311 аденовирус 2 серотипа + +++ С

5315 аденовирус 3 серотипа + ++ В

5309 аденовирус 7 серотипа + ++ В

5306 вирус герпеса - - -

5312 Не выделен - - -

5313 Не выделен - - -

5314 Не выделен - - -

Сравнительное клинико-лабораторное исследование ФИТЦ-коньюгата МКА#6 и сертифицированного препарата «ИДФАГ» было проведено на материалах от 121 детей, госпитализированных в ДГБ № 4 г. Санкт-Петербурга по поводу ОРВИ. Чувствительность и специфичность иммунофлуоресцентного анализа при использовании ФИТЦ-МКА#6 в сравнении с препаратом «ИДФАГ» составили 96,7% и 90%, соответственно, общее совпадение результатов - 95%. Вместе с тем использование ФИТЦ-МКА#6 значительно облегчало интерпретацию результатов ИФЛ за счет более яркой специфической флуоресценции и полного отсутствия фоновых реакций. Это определяет правомерность использования обоих препаратов, изготовленных по разной технологии, при клинико-лабораторной диагностике аденовирусной инфекции (рис. 4).

Рис. 4. Специфическое свечение в материалах от больных, окрашенных ФИТЦ-коньюгатом МКА#6 (А, Б) и препаратом «ИДФАГ» (В. Г) при использовании прямого метода иммунофлуоресценции. Ув. х900.

Определенный интерес представили исследования по оценке свойств МКА#6 в непрямом варианте иммунофлуоресцентного анализа в сравнении с зарубежным аналогом - моноклональными антителами к аденовирусам в составе коммерческого набора «Respiratory Panel 1 Viral Screening and Identification IFA Kit» («Chemicon», США)

Исследованиями показана равноценность разработанных нами препаратов МКА и зарубежных аналогов как по титрам, так и по уровню специфического свечения при тестировании в клеточных культурах, инфицированных аденовирусом 6 серотипа.

В настоящее время препараты подобного рода выпускаются рядом зарубежных фирм, однако все они отличаются высокой стоимостью и, как следствие, их доступность весьма ограничена. В этой связи создание отечественного препарата для ранней диагностики аденовирусной инфекции на моноклональной основе можно оценить как важный вклад в развитие направлений диагностики и надзора за ОРВИ в России.

Конструирование и лабораторная характеристика иммуноферментной тест-системы для индикации аденовирусной инфекции.

Иммуноферментный анализ относится к числу современных методов иммунодиагностики вирусных инфекций, который позволяет устранить субъективизм в интерпретации результатов и позволяет проводить одновременно большое количество анализов с количественной регистрацией данных, а также выявлять аденовирусы, локализованные не только внутри клеток, но и в секретах дыхательного тракта. Первые тест-системы создавались в России на основе ПКА, однако они обладали, как правило, известным уровнем неспецифических реакций, что побудило нас к созданию качеситвенно новых тест-систем на основе полученных МКА. К началу наших исследований в России во Всероссийском центре молекулярной диагностики и лечения (Москва) был разработан препарат МКА 7Р1, направленных к гексонному антигену аденовируса 1 серотипа, однако спектр их реагирования и возможность использования в диагностических тест-системах изучены не были.

В целях конструирования иммуноферментной тест-системы (ИФТС) для детекции аденовирусных антигенов непосредственно в материалах от больных нами были изготовлены пероксидазные коньюгаты из МКА#6 и МКА 7Р1 (ПХ-МКА). Определены оптимальные разведения иммунореагентов, обеспечивающие получение наибольшего специфического

сигнала при отсутствии фоновых реакций. Манипулируя различными комбинациями МКА и ПХ-МКА, сформировано несколько вариантов ИФТС. Оказалось, что наилучшие результаты по специфичности и спектру реагирования с разными серотипами аденовирусов достигаются при использовании комбинации разнонаправленных антител: МКА#6 на стадии захвата (5 мкг/мл) и ПХ-МКА 7Р1 (1:800) на стадии детекции. Чувствительность разработанной ИФТС составила 20 нг/мл вирусного белка (рис. 5).

А)

В)

Б)

ОП450

1,6 --

4800 1200 300 75 20 концентрация (нг*ьш)

1200 300 75 20 концентрация (нг/мл)

ОП450

4800 1200 300 75 20

концентрация (нг/мт)

■Ад б тип «бНГексон •Ад 21 тип ««»РС-впрус

■Ад 3 тип

Рис. 5. Особенности реагирования различных вариантов иммуноферментной тест-системы, отличающихся по композиции, при детекции аденовирусов разных серотипов.

Примечание: А - МКА 7Р1 на стадии захвата и ПХ-МКА 6 на стадии детекции; Б - МКА 7Р1 на стадии захвата и ПХ-МКА 7Р1 на стадии детекции; В - МКА 6 на стадии захвата и ПХ-МКА 6 на стадии детекции; Г - МКА 6 на стадии захвата и ПХ-МКА 7Р1 на стадии детекции.

Специфичность ИФТС была доказана по отсутствию взаимодействия с гетерологичными вирусами (гриппа А, В, РС-вирусом), а также с антигенами клеток хозяина. Разработанной тест-системе было присвоено название «АДЕНОВИР».

Клинико-лабораторные исследования диагностических параметров иммуноферментной тест-системы «Аденовир» при детекции аденовирусных антигенов в клинических материалах от больных.

Поскольку к настоящему времени существует ряд методов

диагностики аденовирусной инфекции, включая электронную микроскопию, выделение вируса в культуре клеток, иммунофлуоресцентный анализ (ИФЛ), полимеразную цепную реакцию (ПЦР), а также серологические методы выявления приростов специфических антител в парных сыворотках от больных, представляло интерес оценить диагностические возможности ИФТС «АДЕНОВИР» с другими тестами. При оценке чувствительности и специфичности тест-системы проводили исследование клинических материалов при параллельном использовании одного или ряда из перечисленных выше методов. В целом были проанализированы клинические материалы от 216 больных с респираторными и кишечными формами заболеваний, в т.ч. смывы от 88 детей (ДИБ № 4), 71 взрослого (инфекционная б-ца им. С.П.Боткина), 22 материала от курсантов ВМедА им. С.М.Кирова (расшифровка вспышки неясной этиологии), а также от 35 детей, госпитализированных с симптомами острых гастроэнтеритов (НИИ детских инфекций).

В первой серии экспериментов методом сравнения служил иммунофлуоресцентный анализ с использованием препарата «ИДФАГ». Для подтверждения этиологии определяли также приросты специфических антител класса к аденовирусам в сыворотках переболевших людей, с помощью ИФТС-АД-^в. Проведенный анализ показал, что у детей частота детекции аденовирусных антигенов с использованием ИФТС «АДЕНОВИР» и препарата «ИДФАГ» была практически одинаковой. В то же время у взрослых аденовирусная инфекция чаще диагностировалась при использовании ИФТС «АДЕНОВИР», чем при иммунофлуоресцентном

анализе. В пользу специфичности полученных с помощью ИФА результатов свидетельствовало серологическое подтверждение диагностики (в 70 % случаев). Для выяснения чувствительности ИФТС проведено ее дополнительное исследование в сравнении с ПЦР. Было исследовано 22 материала из ВМедА им. С.М.Кирова и 30 парных смывов от взрослых из больницы им. С.П.Боткина. Результаты диагностики обоими методами совпали в 94 % случаев (табл. 2).

Таблица 2

Сравнительные данные выявления аденовирусов в клинических материалах (носоглоточные смывы) с использованием иммуноферментной тест-системы «АДЕНОВИР» и полимеразной цепной реакции

ИФТС «АДЕНОВИР» ПЦР

+ -

+ 23 1

- 2 26

Чувствительность 92%

Специфичность 96%

Общее совпадение результатов 94%

Подключение ПЦР к числу ранее использованных методов свело количество регистрируемых в ИФА ложноположительных результатов к минимуму - 4,5%. Сравнение результатов ИФА-диагностики с выделением вирусов в культуре клеток в этих экспериментах подтвердило, что разработанная ИФТС позволяет диагностировать случаи аденовирусной инфекции, вызванной 3, 5, 7 и 21 серотипами аденовирусов. Эти результаты имеют практическое значение, поскольку аденовирусы 3 и 7 серотипов часто являются причиной эпидемических вспышек в коллективах. Однако, в ряде случаев при положительных результатах диагностики с помощью ИФТС «АДЕНОВИР» и ПЦР вирусы выделить не удавалось, что может быть результатом их неспособности вызывать отчетливое цитопатогенное действие в используемых клеточных культурах или низким уровнем репродукции в них.

Специфичность и чувствительность ИФТС «АДЕНОВИР» проявилась также при анализе качественно иных материалов (копрофильтратов) при

обследовании 35 детей, госпитализированных в НИИ детских инфекций, с острыми гастроэнтеритами. Исследование было проведено параллельно с ПЦР и электронной микроскопией. Совпадение результатов, полученных при использовании ИФТС «АДЕНОВИР» и электронной микроскопии было зарегистрировано в 86% случаев. Показатели чувствительности и специфичности ИФТС «АДЕНОВИР», рассчитанные по отношению к ПЦР составили 87% и 95%, соответственно (табл.3).

Таблица 3

Сравнительные данные выявления аденовирусов в клинических материалах (копрофильтраты) с использованием иммуноферментной тест-системы «АДЕНОВИР», полимеразной цепной реакции и электронной микроскопии

ИФТС «АДЕНОВИР» ПЦР Электронная микроскопия

+ - + -

+ 13 1 13 1

- 2 19 4 17

Чувствительность 87% 76%

Специфичность 95% 95%

Общее совпадение результатов 91,4% 86%

Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать ИФТС «АДЕНОВИР» для использования в диагностике аденовирусных инфекций, как при респираторных, так и при кишечных формах заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Разработан и внедрен в производство препарат поликлонального типа «Иммуноглобулин диагностический флуоресцирующий аденовирусный антигексоновый сухой» («ИДФАГ») для ранней диагностики аденовирусной инфекции по детекции вирусных антигенов в клинических материалах. Препарат зарегистрирован на территории РФ.

2. В Государственных испытаниях установлено, что препарат «ИДФАГ» по показателям качества не уступает одному из лучших зарубежных аналогов («IMAGEN» фирмы «DAKO», Дания).

3. Получена и криоконсервирована в Государственной коллекции клеточных культур при НИИ гриппа СЗО РАМН панель гибридом, продуцирующих МКА к различным сайтам в составе гексонного антигена аденовируса, в т. ч. моноклональные антитела # 6, обладающие наиболее широким спектром активности в отношении различных серотипов аденовирусов.

4. Установлено по результатам клинико-лабораторных исследований, что коньюгаты моноклональных антител # 6 с флуоресцеинизотиоцианатом в сравнении с «ИДФАГ» дают равноценные показатели чувствительности и специфичности при более яркой специфической флуоресценции, что значительно облегчает интерпретацию результатов анализа.

5. Впервые в России осуществлен дизайн иммуноферментной тест-системы «АДЕНОВИР» на основе моноклональных антител # 6 и 7F1. Определена оптимальная композиция всех составляющих тест-системы с итоговым лимитом чувствительности 20 нг/мл по белку (2 нг в пробе).

6. Показана высокая чувствительность и специфичность разработанной ИФТС «АДЕНОВИР» (96% и 93%, соответственно), при диагностике аденовирусных инфекций в сравнительных клинико-лабораторных исследованиях с наиболее чувствительным тестом -полимеразной цепной реакцией.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю -доктору медицинских наук, профессору Сомининой Анне Адольфовне, кандидату биологических наук Смирновой Татьяне Дмитриевне, сотрудникам лаборатории биотехнологии диагностических препаратов и других подразделений НИИ гриппа СЗО РАМН за сотрудничество в проведении исследований.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФЛ - иммунофлуоресценция

ИФТС - иммуноферментная тест-система

МКА - моноклональные антитела

ОКИ - острая кишечная инфекция

ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция

ПК А - поликлональные антитела

ПХ-МКА - пероксидазный коньюгат моноклональных антител

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РС-вирус - респираторно-синцитиальный вирус

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. И.В.Амосова Изучение свойств моноклональных антител к гексонному антигену аденовируса человека 1 типа при иммуноферментном и иммунофлуоресцентном анализе / И.В.Амосова, А.А.Соминина, А.О.Монаенков, В.К.Сологуб, Т.В.Бунаргина, Н.ВЛипина // Материалы Всероссийской научной конф. «Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций ».-СП6.-2001,- С. 54.

2. Амосова И.В. Спектр реагирования моноклональных антител к гексонному антигену аденовируса человека 1 типа при иммуноферментном и иммунофлуоресцентном анализе / И.В.Амосова, А.А.Соминина, А.О.Монаенков, В.К.Сологуб, Т.В.Бунаргина, Н.В.Липина // Материалы VIII Съезда всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов.-М.-2002.-С.220-221.

3. Амосова И.В. Разработка и клиническая апробация новых иммуноферментных тест-систем для диагностики РС- и аденовирусной инфекции / И.В.Амосова, В.Ф.Суховецкая, А.О.Монаенков, К.К.Милькинт,

A.А.Соминина // Сб. «Новые препараты в профилактике, терапии и диагностике вирусных инфекций».-СПб.-2002.-С.91-93.

4. Амосова И.В. Разработка и клинико-лабораторная апробация новых средств быстрой диагностики аденовирусной инфекции / И.В.Амосова // Сб. тезисов 11 Российский национальный конгресс «Человек и лекарство».-М.-2004.-С.173.

5. Амосова И.В. Изучение диагностических параметров иммуноферментной тест-системы «РС-виротест» при выявлении вирусных антигенов у детей, госпитализированных с ОРВИ» / И.В.Амосова,

B.Ф.Суховецкая, А.А.Соминина, М.П.Самойлович, В.П.Дриневский // Материалы 7 Российской медико-биологической конференции молодых ученых «Человек и его здоровье».-СПб.-2004.-С.34.

6. Амосова И.В. Быстрая иммунофлуоресцентная диагностика аденовирусной инфекции с использованием моноклональных антител / И.В.Амосова, Т.Д.Смирнова, А.К.Голованова, А.А.Соминина // Материалы Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней»,- Белоруссия, Минск.-2007.-С. 19.

7. Амосова И.В. Сравнительный анализ результатов диагностики гастроэнтеритов аденовирусной этиологии с использованием методов электронной микроскопии, иммуноферментного анализа и ПЦР /

И.В.Амосова, А.К.Сироткин, Т.Д.Смирнова, А.А.Соминина // Материалы Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней».-Белоруссия, Минск.-2007.-С.158.

8. Амосова И.В. Диагностические параметры иммуноферментной тест-системы «Аденовир» в сравнении с ПЦР и электронной микроскопией при диагностике аденовирусных инфекций / И.В.Амосова, Ж.В.Бузицкая,

A.К.Сироткин, Т.Д.Смирнова, А.А.Соминина // Сборник трудов VI Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика 2007».-М.-2007.-С. 354-355.

9. Амосова И.В. Характеристика моноклональных антител к аденовирусу в иммуноферментных и иммунофлуоресцентных реакциях / И.В.Амосова, Н.ВЛипина, В.К.Сологуб, А.А.Соминина // Тез. доклад симпозиума «Новые подходы к целенаправленному конструированию противовирусных препаратов».-СПб.-1994.-С. 64.

10. Суховецкая В.Ф. Клиника и диагностика острых стенозирующих ларинготрахеобронхитов у детей при ОРВИ различной этиологии /

B.Ф.Суховецкая, А.А.Соминина, В.П.Дриневский, К.К.Милькинт, Л.В.Осидак, О.И.Афанасьева, А.О.Монаенков, И.В.Амосова,

A.К.Голованова, Т.Р.Царева, Т.Д.Смирнова // Журнал «Детские инфекции ».-2004.-№.-С.10-15.

11. Львов Н.И. Этиология ОРЗ в организованном коллективе в 2005-06 гг. / Н.ИЛьвов, Е.М.Войцеховская, А.К.Голованова, В.С.Вакин, Е.А.Брянцева, И.В.Амосова, Н.Л.Вартанян, В.Г.Пешкова, Н. И.Бурмистрова //Вестник Российской ВМА.-2006.-№1(15).-С. 121-124.

12. Соминина A.A. Быстрая диагностика гриппа и других ОРВИ иммунофлуоресцентным методом: /А.А.Соминина, К.К.Милькинт, И.В.Амосова, В.Г.Майорова, Т.Р.Царева, Е.В.Сорокин// Методические рекомендации,- СПб: ГУ НИИ гриппа РАМН- 2006.-10с.

13. Львов Н.И.Острые респираторные заболевания у привитых гриппозной вакциной: особенности этиологии и клиники / Н.И.Львов, Е.М.Войцеховская, А.К.Голованова, В.С.Вакин, Е.А.Брянцева, И.В.Амосова, Н. И.Бурмистрова//Вестник Российской ВМА.-2008 .-№2(22).-С.И4.

14. Особенности этиологии и клиники гриппа у детей в эпидемические сезоны 2005 - 06 гг. / О.И.Афанасьева, Е.Г.Королева, К.К.Милькинт, Е.Г.Головачева, М.Ю.Еропкин, И.В.Амосова,

B.П.Дриневский // Журнал «Детские инфекции»,- 2008.-№ 2.-С. 14-16.

15. Дондурей Е.А. Острые вирусные инфекции с сочетанным поражением респираторного и желудочно-кишечного трактов у детей. Интерферонотерапия / Е.А.Дондурей, Л.В.Осидак, Е.Г. Головачева,

A.К.Голованова, И.В.Амосова, Л.Н.Гладченко // «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины». Приложение.-2009.-№8.-С.31-35.

16. Монаенков А.О. Получение и характеристика моноклональных антител к аденовирусу в иммуноферментных и иммунофлуоресцентных реакциях / А.О. Монаенков, В.К.Сологуб, А.А.Соминина, Л.Б.Потапенко, И.В.Амосова, Н.В.Липина, Э.А.Зибина, А.К.Голованова // Журнал «Вопросы вирусологии».-2000.-№ 5.-С.30-33.

17. Sominina A.A.Laboratory surveillance in Russia at phase 3 of influenza pandemic / A.A. Sominina, T.R. Tsareva, E.V. Sorokin, I.V. Amosova, V.Z. Krivitskaya, M.M. Pisareva, N.V. Tretjakova // Proceeding of International Conference " Options for the control of influenza VI".-Toronto, Ontario, Canada.-2007.- Abst.P308.-P.129.

18. Monaenkov A.O. Comparison of diagnostic properties of FITC-conjugates of monoclonal and polyclonal conjugates in diagnosis of influenza A,

B, RSV and adenovirus infections / A.O.Monaenkov, A.A.Sominina, E.A.Zibina, K.K.Milkint, G.G.Turitcheva, N.V.Lipina, N.A.Medvedeva, I.V.Amosova // Options for the control of influenza IV, Hersonissos, Crete.- Greece.- 2000,-Vol.23.-P.99-100.

19. Львов Н.И. Этиологическая структура ОРВИ у военнослужащих в эпидсезон 2003-04 гг. по результатам выделения вирусов, иммунофлуоресценции и серологических исследований / Н.ИЛьвов, Е.М.Войцеховская, И.В.Амосова, А.К.Голованова, В.З.Кривицкая, Н. И.Бурмистрова // Материалы Международной научной конференции «Актуальные вирусные инфекции - теоретические и практические аспекты».-СП6.-2004.-С.20-21.

20. Монаенков А.О. Дифференциальная диагностика гриппа, РС-вирусной и аденовирусной инфекции в иммуноферментных реакциях на основе моноклональных антител / А.О.Монаенков, И.А.Иванова, Н.А.Медведева, И.В.Амосова, Н.В.Липина, А.А.Соминина, Л.М.Цыбалова, И.Н.Бухаловский, А.В.Веселкова // Тез. доклад научной конф. «Вирусные инфекции на пороге XXI века: эпидемиология и профилактика».-СПб.-1999.-

с./3.

Отпечатано: ООО «Сан-Принт» Санкт-Петербург, Каменноостовский д. 54, тел. 234-22-22 Бумага офсетная. Формат 60x84 1/16. Заказ от 27 октября 2009г. Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Амосова, Ирина Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. АДЕНОВИРУСЫ, ИХ ОБЩАЯ И АНТИГЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА, ЭПИДЕМИОЛОГИЯ. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ. ПРОТИВОАДЕНОВИРУСНЫЕ ПРЕПАРАТЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Строение вирионов АВ.

1.2. Структурные белки аденовирусов.

1.3. Неструктурные (ранние) белки.

1.4. Репликация аденовирусов.

1.5. Классификация АВ.

1.6. Клинико-эпидемиологическая характеристика и патогенез АВ-инфекции.

1.7. Современные методы диагностики аденовирусной инфекции.

1.7.1. Выделение вируса в культуре клеток.

1.7.2. Иммунофлуоресцентный метод.

1.7.3. Иммуноферментный анализ (ИФА).

1.7.4. Моноклональные антитела.

1.7.5. Иммунохроматографический анализ.

1.7.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

1.8. Противоаденовирусные препараты.

1.8.1. Основные направления получения противоаденовирусных препаратов.

1.8.2. Эффективность и недостатки препаратов, используемых для лечения и профилактики аденовирусных инфекций.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Клеточные культуры.

2.1.2. Вирусы.

2.1.3. Моноклональные антитела.

2.2. Методы.

2.2.1. Вирусологические методы.

2.2.2. Методы гибридомной технологии.

2.2.3. Электронно-микроскопический анализ.

2.2.4. Взятие и подготовка клинических образцов.

2.2.5. Биохимические методы.

2.2.6. Иммунохимические методы.

2.2.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.2.8.Статистическая обработка.

ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИ- И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К АДЕНОВИРУСУ.

3.1. Оценка специфической активности гипериммунных аденовирусных сывороток кролика в непрямом методе флуоресцирующих антител.

3.2. Первичное тестирование полученных МКА.

3.2.1. Изучение специфической активности в ИФА.

3.2.2. Изучение специфической активности МКА с помощью Н-МФА.

3.3. Определение эпитопной направленности МКА#6.

ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФИТЦ-КОНЬЮГАТОВ ПОЛИ- И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ.

4.1. Получение и изучение активности ФИТЦ-коньюгатов ПКА.

4.2. Лабораторная апробация МКА#6 при дифференциальной диагностике аденовирусной инфекции непрямым иммунофлуоресцентным методом.

4.3. Получение и изучение активности ФИТЦ-коньюгатов МКА#6.

4.4. Клинико-лабораторная апробация ФИТЦ-коньюгатов МКА#6 при дифференциальной диагностике аденовирусной инфекции прямым иммунофлуоресцентным методом.

ГЛАВА 5. КОНСТРУИРОВАНИЕ И ЛАБОРАТОРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ АДЕНОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ.

5.1. Изучение специфической активности МКА#6 и 7F1.

5.2. Получение и изучение специфической активности пероксидазных коньюгатов МКА#6 и МКА 7F1.

5.3. Конструирование иммуноферментных тест-систем, предназначенных для детекции аденовирусных антигенов в клеточных культурах и клинических материалах.

ГЛАВА 6. ДИЗАЙН И КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ «АДЕНОВИР» ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ АДЕНОВИРУСНЫХ АНТИГЕНОВ В КЛИНИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛАХ ОТ БОЛЬНЫХ.

6.1. Клинико-лабораторная апробация ИФТС «АДЕНОВИР».

6.1.1. Возможности выявление аденовирусного антигена в носоглоточных смывах при использовании ИФТС «АДЕНОВИР».

6.1.2. Изучение возможности индикации аденовирусных антигенов в копрофильтратах.

6.2. Дизайн ИФТС «АДЕНОВИР».

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и усовершенствование средств и методов иммунодиагностики аденовирусной инфекции"

Актуальность исследования. Аденовирусы (АВ) представляют собой обширное семейство вирусов (Adenoviridae), патогенных для человека, млекопитающих и птиц. АВ человека циркулируют повсеместно и во всех частях мира. По своей распространенности они занимают третье место после гриппа и респираторно-синцитиальной инфекции. Их удельный вес в структуре ОРЗ составляет около 9% [8, 9, 34, 44].

ОРЗ негриппозной (в том числе аденовирусной) этиологии вносят важный вклад в структуру общей инфекционной патологии. В отличие от эпидемий гриппа, имеющих выраженную сезонность, они регистрируются на протяжении всего года, вызывая подъемы заболеваемости, в основном, среди детских групп населения [52, 53, 54, 56, 59, 67, 108].

АВ, как и вирусы гриппа, способны вызывать тяжелые поражения не только верхних, но и нижних отделов дыхательного тракта в виде пневмоний, бронхитов и бронхиолитов [1, 4, 18, 57, 79, 88], а также других систем и органов [43, 71, 106].

Известно, что АВ являются причиной вспышек фарингоконъюнктивальной лихорадки среди детей и новобранцев и нозокомиальных заболеваний, в том числе в офтальмологических отделениях. АВ вызывают также лимфоаденопатии, острые и хронические тонзиллиты, отиты, фарингиты, протекающие с явлениями интоксикации и гипертермии, поражения печени и миокарда [6, 44, 71, 79]. Отдельные серотипы АВ (12, 18, 31, 40, 41) вызывают обширные вспышки гастроэнтеритов, а серотипы 12, 18 и 31 обладают повышенными онкогенными потенциями [1, 4, 73, 84].

Появляется все больше данных о тяжелом генерализованном течении АВ инфекций у пациентов с иммуносупрессией, которым осуществляется трансплантация органов или костного мозга [32, 47, 61, 63, 82, 101], а также у онкологических больных при проведении химиотерапии [37, 41, 106]. Подчеркивается важность распознавания АВ инфекции у доноров органов в предоперационном периоде во избежание тяжелых осложнений, способных приводить к летальным исходам у иммуносупрессированных реципиентов [67, 113].

Рост заболеваемости аденовирусой этиологии регистрировался в детских группах населения, проживающих на территориях, загрязненных радионуклидами в результате аварии на Чернобыльской АЭС в 1986 г. [11, 14].

Эффективность надзора за аденовирусной инфекцией и ее терапии зависит от раннего диагностирования инфекции с ее дифференциацией от других вирусных заболеваний со сходными симптомами [18, 47], что определяет важность применения строго специфичных и высоко чувствительных методов дифференциальной лабораторной диагностики [24, 38, 40]. Разработка современных диагностических подходов осуществляется по двум основным направлениям, первое из которых связано с совершенствованием иммунологических тестов детекции вирусных антигенов или антител, а другое - с выявлением специфических последовательностей вирусного генома в материалах от больных [49, 52, 60].

Разработка современных диагностических подходов осуществляется по двум основным направлениям, первое из которых связано с совершенствованием иммунологических тестов детекции вирусных антигенов или антител, а другое - с выявлением специфических последовательностей вирусного генома в материале от больных [25, 42, 52, 60].

Для ранней дифференциальной диагностики ОРВИ необходимо создание простых, быстрых и недорогих тестов, к числу которых относятся усовершенствованные варианты иммуноферментного (ИФА) [5, 78, 79, 88] и иммунофлуоресцентного анализа [24, 52, 55, 68, 110]. Целесообразность их использования обоснована не только медицинскими показаниями, но и существенной экономической выгодой, достигаемой, главным образом, за счет отмены антибиотиков при острых респираторных инфекциях вирусной природы (ОРВИ) и сокращения сроков госпитализации [75, 92].

Одним из ведущих направлений в области совершенствования диагностических иммунотестов является введение в их состав моноклональных антител (МКА) к возбудителям ОРВИ, обеспечивающих наиболее высокую чувствительность, специфичность и необходимый уровень стандартизации препаратов [3, 10, 46, 83].

Целью настоящей работы явилось создание усовершенствованных тест-систем для диагностики аденовирусной инфекции.

Задачи исследования: • - разработка методики получения высокоочищенного гексонного антигена аденовируса;

- разработка технологии получения коньюгатов моноклональных антител с флуоресцеинизотиоцианатом;

- дизайн новых моноклональных иммуноферментных тест-систем для" ранней диагностики аденовирусной инфекции;

Впервые в России получена панель моноклональных антител к гексонному антигену аденовируса 6 серотипа. Дана характеристика биологических и диагностических свойств полученных моноклональных антител в различных иммунологических реакциях.

Впервые в России получены коньюгаты моноклональных антител к гексонному антигену аденовируса 6 серотипа с флуоресцеинизотиацианатом и пероксидазой хрена без снижения специфической активности препаратов.

Положения, выносимые на защиту:

2. Применение МКА #6 к гексонному антигену аденовируса 6 серотипа повышает чувствительность и специфичность ранее разработанных диагностических тестов.

3. Использование ФИТЦ-коньюгатов моноклональных антител позволяет выявлять аденовирусы, принадлежащие к различным группам (В, С, Е) семейства аденовирусов и облегчает интерпретацию результатов за счет большей яркости специфической флуоресценции.

Методы исследования. Использованы различные методы работы с клеточными культурами, вирусологические, серологические, биохимические, молекулярно-биологические и электронно-микроскопические методы исследования, методы гибридомной технологии, очистки и концентрирования вирусных белков, очистки моноклональных антител с помощью аффинной хроматографии, а также статистические приемы обработки и анализа полученных результатов. В работе использовали пакет прикладных программ

Statistika-5,0 для непараметрических выборок. Для расчета показателей диагностической эффективности препарата рассчитывали суммарный показатель совпадения результатов с референтной системой и средний квадрат

12 сопряженности phi .

Оценка диагностических свойств новых тест-систем для определения аденовирусной инфекции проведена на материалах от 574 больных ОРВИ. Методами сравнения служили: иммунофлуоресцентный анализ детекции аденовирусных антигенов в эпителиальных клетках носоглоточного эпителия,-иммуноферментный анализ для выявления аденовирусных антител класса IgG (ИФТС-AB-IgG), выделение аденовирусов в культуре клеток, а также выявление ДНК аденовирусов при помощи полимеразной цепной реакции.

Внедрение результатов в практику. Разработана научно-технологическая документация (НТД) на препарат «Иммуноглобулин диагностический флуоресцирующий антигексоновый аденовирусный» («ИДФАГ»). Регламент производства № 4429427-001-09 и технические условия № 93 8837-001-4429427-2008 на препарат «ИДФАГ» согласованы с ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора, Инструкция по применению № 01-11/131-08 от 15.08.2008г. утверждена Главным государственным санитарным врачом РФ. Препарат «ИДФАГ» зарегистрирован на территории России (Регистрационное удостоверение № ФСР 2008/03940), внедрен в производство на базе ООО «Предприятие по производству диагностических препаратов» и используется в различных организациях практического здравоохранения (ФГУЗ ЦГЭ, глазные клиники, инфекционные стационары), включая сеть базовых лабораторий по мониторингу за гриппом и ОРВИ в составе Референс-центра при НИИ гриппа СЗО РАМН.

Публикации. По материалам исследований опубликовано 20 работ, из-них - 6 статей в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК и Методические рекомендации «Быстрая диагностика гриппа и других ОРВИ иммунофлуоресцентным методом».

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Амосова, Ирина Викторовна

ВЫВОДЫ

3. Получена и криоконсервирована в Государственной коллекции клеточных культур при НИИ гриппа СЗО РАМН панель гибридом, продуцирующих МКА к различным сайтам в составе гексонного антигена аденовируса, в т. ч. моноклональные антитела 6, обладающие наиболее широким спектром активности в отношении различных серотипов аденовирусов.

4. Установлено по результатам клинико-лабораторных исследований, что коньюгаты моноклональных антител#6 с флуоресцеинизотиоцианатом в сравнении с «ИДФАГ» дают равноценные показатели чувствительности и специфичности при более яркой специфической флуоресценции, что значительно облегчает интерпретацию результатов анализа.

5. Впервые в России осуществлен дизайн иммуноферментной тест-системы «АДЕНОВИР» на основе моноклональных антител#6 и 7F1. Определена оптимальная композиция всех составляющих тест-системы с итоговым лимитом чувствительности 20 нг/мл по белку (2 нг в пробе).

6. Показана высокая чувствительность и специфичность разработанной ИФТС «АДЕНОВИР» (96% и 93%, соответственно), при диагностике аденовирусных инфекций в сравнительных клинико-лабораторных исследованиях с наиболее чувствительным тестом - полимеразной цепной реакцией.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Амосова, Ирина Викторовна, Санкт-Петербург

1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2001.-736 с.

2. Вирусология: в 3-х т.: Пер. с англ. / Под ред. Б. Филдса, Д. Найпа и др. -М.: Мир,1989.- 456с.

3. Вопросы общей вирусологии: учебное пособие / Под ред. Киселева О.И., Жилинской И.Н. СПб: СПбГМА им. И.И.Мечникова, 2007 г.-374 с.

4. Дяченко Н.С. Аденовирус, клетка, организм.-Киев: Наукова Думка, 1988.-232с.

5. Егоров A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа.- М.: Высш. шк.,1991 г.-288с.

6. Казанцев А.П. Справочник по инфекционным болезням: 3 изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 1986.-320с.

7. Карпович Л.Г. Изучение диагностической эффективности препарата «Иммуноглобулина диагностического флуоресцирующего аденовирусного антигексонового сухого» // Сб. «Проблемы инфекционных болезней», ч. 2- М.,2000.-С. 146-149.

8. Колобухина Л.В. Клиника и лечение гриппа // Русский медицинский журнал.-2001.-Т.9.-710с.

9. Малеев В.В. Птичий грипп: эпидемиология, клиника и лечение / В «Грипп птиц: происхождение инфекционных биокатастроф»: Сб. статей / Под ред. В.И.Покровского.- СПб.: Росток, 2006.-С.103-130.

10. Монаенков А.О. Получение и характеристика моноклональных антител к аденовирусу в иммуноферментных и иммунофлюоресцентных реакциях // Вопросы вирусологии.-2000.-№5.-С.30-33.

11. Попова Т.Л. Изменение структуры циркулирующих вирусных популяций в условиях воздействия неблагоприятных экологических факторов // Материалы VII съезда всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов.- М.,1997.-т. 1.-С.499-500.

12. Соминина А.А. Анализ этиологической структуры гриппоподобнойзаболеваемости и мониторинг эпидемии гриппа 1998 — 1999 г.г. с использованием методов лабораторной диагностики // Вестник РАМН-2001.-№3.-С.8-12.

13. Соминина А. А. Быстрая диагностика гриппа и других ОРВИ иммунофлуоресцентным методом: методические рекомендации. СПб: ГУ НИИ гриппа РАМН, 2006.-1 Ос.

14. Цыбалова JI.M. Острые и хронические заболевания у лиц, подвергшихся воздействию радиации // Тезисы юбилейной международной научной конференции «Грипп 21 век».- СПб.,1997.-С.41.

15. Adenoviruses: Basic Biology to Gene Therapy / Ed: by Prem Seth, 1999.- 30p.

16. Adrian T. DNA restriction analysis of adenovirus prototrype 1 to 41 // Arch. Virol.-1986.-Vol.91 .-P.277-290.

17. Andreasi M.S.A. Adenovirus, calicivirus and astrovirus detection in fecal samples of hospitalized children with acute gastroenteritis from» Campo, Grande, MS, Brazil //Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro.-2008.-Vol. 103.-P.741-744.

18. Avellon A. Rapid and sensitive diagnosis of human adenovirus infections by a generic polymerase chain reaction / A. Avellon, P. Perez, J.C. Aquilar // J. Virol, Methods—2001 .-Vol.92.-P. 113-120.

19. Baum S.G. Adenoviruses // In: Mandell G.L., Bennet J.I., Dolin R., eds. Principles and practice of infectious diseases.- N.Y.,2000.-P. 1624-1630.

20. Bellau-Pujol S. Development of three multiplex RT-PCR assays for the detection of 12 respiratory viruses // J. Virol. Methods.-2005.-Vol.126.-P.53-63.

21. Blyn L.B. Rapid Detection and Molecular Serotyping of Adenovirus by Use of PCR Followed by Electrospray Ionization Mass Spectrometry // J. Clin.

22. Microbiol.-2008.-№2.-P.644-651.

23. Chakrabarti S. Adenovirus infections in stem cell transplant recipients: Recent developments in understanding of pathogenesis, diagnosis and // Leukemia and Lymphoma-2004.-Vol.45.-P.873-885.

24. Qi<?ek C. Comparison of the assay with the combination of shell vial cell culture and immunofluorescence antibody test for the detection of respiratory viruses // J. of Virological Methods.-2007.-Vol.l43.-P.161-168.

25. Cockerill, F. R. Application of rapid-cycle real-time polymerase chain reaction for diagnostic testing in the clinical microbiology laboratory // Arch. Pathol. Lab. Med.-2003.-Vol. 127.-P. 1112-1120.

26. Coiras M.T. Simultaneous detection of influenza А, В, С viruses, respiratory syncytial virus, and adenoviruses in clinical samples by multiplex reverse transcription nested-PCR assay // J. Med. Virol.-2003.- Vol. 69.-P. 132-144.

27. Dagher H. Rhinovirus detection: comparison of real-time and conventional-PCR // J. Virol. Methods-2004.-Vol.l 17.-P.113-121.

28. Damen M. Real-Time PCR with an Internal Control for Detection of All Known Human Adenovirus Serotypes //J. of clinical microbiology.-2008.-№12.-P.3997-4003.

29. Doane F.W. Electron microscopy for the detection of gastroenteritis viruses // In A.Z. Kapikian (ed), Viral infections of the gastrointestinal tract, 2nd ed. Marcel Dekker, Inc.- N.Y.,1994.-P.101-130.

30. Erdman D.D. GeneScan reverse transcription-PCR assay for detection of six common respiratory viruses in young children hospitalized with acute respiratory illness //J. Clin. Microbiol.-2003.-Vol.41.-P.4298-43 03.

31. Echavarria M. PCR method for detection of adenovirus in urine of healthy and human immunodeficiency virus infected individuals // J. Clin. Microbiol.-1998.-Vol.36.-P.3323-3326.

32. Echavarria M.S. PCR detection of adenovirus in a bone morrow transplant recipient: hemorrhagic cystitis as a presenting manifestation of disseminated disease//J. Clin. Microbiol.-1999.-Vol.37.-P.686-689.

33. Echavarria M. Rapid detection of Adenovirus in throat swab specimens by PCR during respiratory disease outbreaks among military recruits // J. of Clinical Microbiology.-2003.-Vol.41.-P.810-812.

34. Echavarria M. Adenoviruses in immunocompromised hosts // Clin. Microbiol. Rev.-2008.-Vol.21.- P.704-715.

35. Epstein S.P. Topical cobalt chelate CTC-96 for the treatment of adenovirus conjunctivitis in a rabbit model // Investigative Ophthalmology and Visual Science.-2003.-Vol.44.-E-abstract 4650.

36. Everitt E. Structural proteins of adenoviruses. XII. Location and neighbor relationship among proteins of adenovirion type 2 as revealed by enzymatic iodination, immunoprecipitation and chemical cross-linking // Virology.-1975.-V.67.-P. 197-208.

37. Gavin P.J. Intravenous ribavirin treatment for severe adenovirus disease in immunocompromised children // Paediatrics.-2002.-Vol.110.-P.9.

38. Gavin P.J. Review of rapid diagnostic tests for influenza // Clinical and applied immunology reviews-2003 -Vol.4.-P. 151 -172.

39. Gruteke P. Practical implementation of a multiplex PCR for acute respiratory tract infections in children // J. Clin. Microbiol.-2004.-Vol.42.-P.5596-5603.

40. Henrickson K.J. Diagnostic assays for respiratory syncytial virus disease // J. The pediatric infectious diseas.-2007.-Vol.26.-P.36-40.

41. Hierholzer J.C. Adenoviruses in the immunocompromized host // Clinical Microbiology Reviews.-1992.-Vol.5.-P.262-274.

42. Hijazi Z. Laboratory diagnosis of acute lower respiratory tract viral infections in children // J. Trop. Pediatr.-1996.-Vol.42.-P.276-280.

43. Hillenkamp J. The effects of cidofovir 1% with and without cyclosporin A 1% as a topical treatment of acute adenoviral keratoconjunctivitis—a controlled clinical pilot study // Ophthalmology.-2002.-Vol.l09.-P.845-850.

44. Irmen K.E. Use of monoclonal antibodies for rapid diagnosis of respiratory viruses in a community hospital // Clin. Diagn. Lab. Immunol.-2000.-Vol.7-P.396-403.

45. Kang G. Etiology of diarrhea in patients undergoing allogeneic bone marrow transplantation in South India// Transplantation.-2002.-Vol.73.-P.1247-1251.

46. Kim S.R. Rapid detection and identification of 12 respiratory viruses using a dual priming oligonucleotide system-based multiplex PCR assay // J. of Virological methods.-2009.-Vol. 156.- P.l 11-116.

47. Kinchington P.R. Sequence changes in the human adenovirus type 5 DNA polymerase associated with resistance to the broad spectrum antiviral cidofovir // Antiviral Research.-2002.-Vol.56.- P.73-84.

48. Kinchington P. R. Prospects for adenovirus antivirals // Journal of Antimicrobial Chemotherapy: Review.-2005.-Vol.55.-P.424-429.

49. Kuroiwa Y. Comparison of an Immunochromatography Test with Multiplex Reverse Transcription-PCR for Rapid Diagnosis of Respiratory Syncytial Virus Infections // J. Clin. Microbiol.-2004.-Vol.42.-P.4812-4814.

50. Kuypers J. Evaluation of quantitative and type-specific real-time PCR assays for detection of RSV in respiratory specimens from children // J. Clin. Virol.-2004.-Vol.31.-P. 123-129.

51. Kuypers J. Comparison of Real-Time PCR Assays with Fluorescent-Antibody Assays for Diagnosis of Respiratory Virus Infections in Children // J. Clin. Microbiol.-2006.-Vol.44.- P.2382-2388.

52. Lagos R. Systematic surveillance of influenza, syncytial respiratory, parainfluenza and adenovirus in children with acute respiratory infections // Rev. Med. Chil.-1999.-Vol.127.-P.1063 1072.

53. Landry M.L. SimulFluor respiratory screen for rapid detection of multiple respiratory viruses in clinical specimens by immunofluorescence staining // J.

54. Clin. Microbiol.-2000.-Vol.38.-P.708-711.

55. Levent F. Performance of a new immunochromatographic assay for detection of adenoviruses in children // J. of Clinical Virology.-2009.-Vol.44.-P.173-175.

56. Leung A.Y. Quantification of adenovirus in the lower respiratory tract of patients without clinical adenovirus-related respiratory disease // Clin. Infect. Dis.-2005 .-Vol.40.-P. 1541 -1544.

57. Mahony J. Development of a Respiratory Virus Panel Test for Detection of Twenty Human Respiratory Viruses by Use of Multiplex PCR and a Fluid Microbead-Based Assay // J. Clin. Microbiol.-2007.-Vol.45.-P.2965-2970.

58. Maitreyi R.S. Rapid detection of respiratory viruses by centrifugation enhanced cultures from children with acute lower respiratory tract infections // J. Clin. Virol.-2000.-Vol.l6.-P.41-47.

59. Marinheiro J.C. Duplex-PCR assay for the detection of adenovirus and respiratory syncytial virus in nasopharyngeal samples // Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro.-2009.-Vol.l04.-P.l 18-120.

60. Matar L.D. Respiratory viral infections in lung transplant recipients: radiologic findings with clinical correlation // Radiology.-1999.-Vol.213.-P.735-742.

61. Mentel R. Inhibition of adenovirus DNA polymerase by modified nucleoside triphosphate analogs correlate with their antiviral effects on cellular level // Medical Microbiology & Immunology.- 2000.-Vol.l89.-P.91-95.

62. Miura-Ochiai R. Quantitative detection and rapid identification of human adenoviruses // J. Clin. Microbiol.-2007.-Vol.45.-P.958-967.

63. Moore P.L. Relevance of commercial diagnostic tests to detection of enteric adenovirus infections in South Africa // J. Clin. Microbiol.-2000.-V.38.-P.1661-1663.

64. Monto A. S. Epidemiology of viral respiratory infections //Am. J. Med.- 2002.-Vol.112.-P.4-12.

65. Morfin F. Differential susceptibility of adenovirus clinical isolates to cidofovir and ribavirin is not related to species alone // Antivir. Ther.- 2009.-Vol.14.-P.55-61.

66. Newton D.W. Clinical and laboratory diagnosis of influenza virus infections // The American journal of managed care.-2000:-Vol.6.-P.265-275.

67. Ozbay Ho§nut F. Adenovirus infection as possible: cause of acute liver failure in a healthy child: A case report//Turk. J. Gastroenterol.-2008.-Vol.19.-P.281-283. v

68. Perkins S.M. Comparison of a Real-Time Reverse Transcriptase PCR Assay and a Culture Technique for Quantitative Assessment of Viral Load in Children Naturally Infected with Respiratory Syncytial Virus // J. Clin. Microbiol.-2005.-Vol.43.-P.2356-2362.

69. Poon L.L. Detection of SARS coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome by conventional and real-time quantitative reversetranscription-PCR assays // Clin. Chem.-2004.-Vol.50.-P.67-72.

70. Puppe W. Evaluation of a multiplex reverse transcriptase PCR ELISA for the detection of nine respiratory tract pathogens // J. Clin. Virol. -2004.-Vol.30.-P.165-174.

71. Raboni S.M. Comparison of PCR, enzyme immunoassay and conventional culture for adenovirus detection in bone marrow transplant patients with hemorragic cystitis //J. of Clin. Virology -2003 .-Vol.27.-P.270-275.

72. Romanowski E.G. Antiviral prophylaxis with twice daily topical cidofovir protects against challenge in the adenovirus type 5/New Zealand rabbit ocular model // Antiviral Research.- 2001.-Vol.52.-P.275-280.

73. Romanowski E.G. Beyond cidofovir: the in vitro evaluation of newer potential antiviral agents against ocular isolates of adenovirus // Investigative Ophthalmology and Visual Science.-2001.-Vol.42.-P.579.

74. La Rosa A. M. Adenovirus infections in adult recipients of blood and marrow transplants // Clinical Infectious Diseases.-2001.-Vol.32.-P.871-876.

75. Rovida F. Monoclonal antibodies versus reverse transcription-PCR. for detection of respiratory viruses in a patient population with respiratory tract infections admitted to hospital // J. Med. Virol.-2005.-Vol.75.-P.336-347.

76. Saderi H. Incidence of enteric adenovirus gastroenteritis in Iranian children // J. Clin. Virol.-2002.-Vol.24.-P.l-5.

77. Samransamruajkit R. Prevalence, clinical presentations and complications among hospitalized children with influenza pneumonia // Jpn. J. Infect. Dis.-2008.-Vol.61.-P.446-449.

78. Selvaraj G. Molecular Epidemiology of Adenovirus Isolates from Patients Diagnosed with Intussusception in Melbourne, Australia // J. Clin. Microbiol.-2006.-Vol.44.-P.3371-3373.

79. Smith R.M. Monoclonal antibodies: Harnessing the potential / R.M. Smith, P.J. Fairchild // Sci. Progress Oxford.-1992.-P.323-343.

80. Suga T. Analysis of adenoviruses isolated in Cobe City, Japan, from 2000 to 2007 // Jpn. J. Infect. Dis.-2008.-Vol.61.-P.503-504.

81. Syrmis M. W. A sensitive, specific, and cost-effective multiplex reverse transcriptase-PCR assay for the detection of seven common respiratory viruses in respiratory samples // J. Mol. Diagn.-2004.~Vol.6.-P.125-131.

82. Takimoto S. Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay, indirect immunofluorescence assay and virus isolation for detection of respiratory viruses in nasopharyngeal secretions // J. Clin. Microbiol.-1991.-Vol.29.-P.470-474.

83. Templeton К. E. Improved diagnosis of the etiology of community-acquired pneumonia with real-time polymerase chain reaction // Clin. Infect. Dis.-2005.-Vol.41.-P.345-351.

84. Tijssen P. Practice and Theory- of Enzyme Immunoassay // In: Laboratory. Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. (Ed. By R.H.Burdon, P.H.Knippenberg): Amsterdam; New York; Oxford; Elsevier.-1985. -Vol.15 -549p.

85. Tsutsumi H. Imunochromatography test for rapid diagnosis of adenovirus respiratory tract infections: comparison with virus isolation in tissue culture // J. Clin. Microbiol.-1999.-Vol. 37.-P.2007-2009.

86. Tuteja U. Generation and characterization of monoclonal antibodies to adenovirus // Indian. J. Exp. Biol.-2000.-Vol.38.-P.1259-1262.

87. Family Adenoviridae / In: Virus taxonomy: classification and nomenclature of viruses. Seventh report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ed. by M.H.V. van Regenmortel et al.).- San Diego:Academic Press., 1999.-P.227-23 7.

88. Wadell G. Molecular epidemiology of human adenoviruses // Curr. Top. Microbiol. Immunol.-1984.-Vol. 110.-P. 191 -220.

89. Wadell G. Enteric adenoviruses / In: Viral Infections of the Gastrointestinal Tract, (ed. by Kapikian A.Z. N.Y.),1994.- P.519-548.

90. Wadell G. Adenoviruses // In: Principles and Practice of Clinical Virology. 4th Edition, (ed. by Zuckeman A.E. et al.), 2000.-P.307-327.

91. Walls T. Adenovirus: an increasingly important pathogen in pediatric bone marrow transplant patients // Lancet Infectious Diseases.-2003.-Vol.3.-P.79-86.

92. Waters V. Etiology of community-acquired pediatric viral diarrhea: a prospective longitudinal study // Pediatr. Infect. Dis. J.-2000.-V.19.-P.843-848.

93. Weinberg G.A. Superiority of reverse-transcription polymerase chain reaction to conventional viral culture in the diagnosis of acute respiratory tract infections in children // J. Infect. Dis.-2004-Vol.l89.-P.706-710.

94. Weitzel T. Field Evaluation of a Rota- and Adenovirus Immunochromatographic Assay Using Stool Samples from Children with

95. Acute Diarrhea in Ghana // J. Clin. Microbiol.-2007.-Vol.45.-P.2695-2697.

96. Wood S.R. Rapid detection and serotyping of adenovirus by direct immunofluorescence//J. Med .Virol.-1997.-Vol. 51.-P. 198-201.

97. Yeung R. Characterization of culture-positive adenovirus serotypes from respiratory specimens in Toronto, Ontario, Canada: September 2007-June 2008 // Virology Journal.-2009.-VoL6.-P.6-l 1.

98. Zarubaev V.V. Effect of 6-azacytidine to experimental adenoviral infection // Antiviral Research.-2000.-Vol.46.-P.66.

99. Zheng X. Identification of Adenoviruses in Specimens from High-Risk Pediatric Stem Cell Transplant Recipients and Controls // J. Clin. Microbiol.-2008.-Vol.46.-P.317-320.шетаШййве

Информация о работе

Амосова, Ирина Викторовна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.06

Диссертация

Разработка и усовершенствование средств и методов иммунодиагностики аденовирусной инфекции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы