Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии получения нового поколения иммуноглобулинов для терапии инфекционных и аутоиммунных заболеваний человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии получения нового поколения иммуноглобулинов для терапии инфекционных и аутоиммунных заболеваний человека"

РГ6 од

_ 9 ИЮЛ 1?07

На правах рукописи

АНАСТАСИЕВ Валентин Васильевич

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ

НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ДЛЯ ТЕРАПИИ ИНФЕКЦИОННЫХ Й АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва .1997

Работа выполнена на Нижегородском государственном предприятии по производству бактерийных препаратов - фирме " ИмБио' " Минздрава- Российской Федерации

Научный консультант: . ,

доктор медицинских наук . В. Н. Мигуков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук М. А. Ажигирова

. доктор ыедицинских наук, профессор В. Б. Хватов

доктор химических наук, профессор Б. Б. Дгантиев

Ведущая организация*. Государственный научно-исследова-

на заседании диссертационного совета Д 001.45.02. в Гематологическом научном центре Российской Академии медицинских наук (125167, г. Москва Новозыковский проезд, 4 а)

С диссертацией ыожно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра РАМН

Автореферат разослан " И " _-Л< _1997 г':

тедьскж институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасе-вича Ю РФ

Ученый секретарь диссертационного совета ; кандидат биологических наук старший научный сотрудник

В. Д. Реук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Опыт клинического применения иммуноглобулинов позволил определить наиболее вероятные причины побочных реакций при их'внутривенном введении. Большинство исследователей полагают, что факторами непереносимости является присутствие в препаратах полимеров, некоторых белков, изоагглютининов и биологически активных примесей.

Обсуждается механизм действия этих примесей. Полагают, что полимеры по своему биологическому действию подобны комплексу антиген-антитело. Они активируют комплемент и способны вызывать высвобождение из иммунокомпетентных клеток гранул й других веществ, включая вазоактивные амины. Вероятно, такое же действие, как комплекс антиген-антитело могут оказывать и гомологичные белки Ig-A, бета-линопротеины. Эти белки, ведут себя как антигены и при введении IgA, бета-липопротеинов с препаратом могут образовываться антитела; причем к IgA, наряду с антителами IgG класса, синтезируются IgE антитела. Повторное введение препаратов .с примесями, таких .белков в исключительных случаях приводило к анафилактическим реакциям, индуцируемым иммунными комплексами ( Е. Branigan et al.,1983, N. Day et al., 1984, S.Barandun, H. Isliker, 1986 et al., G. Lucas et al., 1987).

Ответственными за тяжелые анемии, а в отдельных случаях и гемолиз, считают изогеммагглютинины. Среди биологически активных примесей препаратов гипотензивный эффект оказывал активатор прекадликреина, действие которого через систему биохимических реакций могло приводить к формированию вещества понижающего кровяное давление - брадикинина (В. Alving et al., 1979, 1980, А. Burks, -1985). Проводятся исследования по очистке от этих примесей для получения ареактогенных иммуноглобулинов при внутривенном введении.

В,России исследования по получении иммуноглобулинов для •внутривенного ^введения были начаты в конце 60-х, начале 70-х годов одновременно в трех научно-исследовательских, центрах: в Нижегородском НИИШ нод руководством И.Н. Блохиной и И.А. Кисе-

левой, в Московском НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского - Н.В. Холче-вым, в ЦНИИ гематологии и переливания крови-под руководством А. А. Фрома. Экспериментальные научные работы в .этих учреждениях объединил принцип использования пепсина, предложенный S. Barun-dun et al. (1962) и Н. Schuitze and Н. Sdwick (1962), для получения . не обладающих спонтанной антикомплементзрной активностью дезагрегированных иммуноглобулинов. В середине 70-х годов исследования завершились созданием лабораторных методов. Особенности технологических схем заключались в количествах вносимого пепсина для кислотно-ферментативного гидролиза, его форме (растворимый или иммобилизованный фермент) и методах удаления фермента.

По технологической схеме, предложенной Нижегородским НИНЭЛ было организовано производство препарата на Нижегородском предприятии по производству бактерийных препаратов. На иммуноглобулин для внутривенного введения били разработаны технические условия и регламент производства. Новый препарат хорош переносился больными и позволил значительно повысить эффективность .лечения тяжелых форм бактериально-токсических и вирусных инфекций.

Вместе с тем, внедренный в производство технологический вариант кислотно-ферментативного гидролиза был рассчитан только на приготовление небольших объемов препарата. Производство иммуноглобулина для внутривенного введения имело длительный технологический цикл и сопровождалось большими потерями основного белка.

Полученные по данной технологии препараты были частично расцеплены до F(ab*)2 - фрагментов. Отсутствие Fc-участга в молекуле IgG лишало эти фрагменты возможности выполнять необходимые эффекторвне функции, сокращало время, циркуляции иммуноглобулинов в организме и снижало эффективность препарата при заместительной терапии и ряде аутоиммунных заболеваний. Все это потребовало усовершенствования существующего ,и разработки принципиально новых методов получения внутривенных иммуноглобулинов. Минздрав га, Российская Академия медицинских наук в программе научных разработок до 2005 года признали эти исследования

приоритетными.

Для лечения целого ряда инфекционных заболеваний признано необходимым создание специфических внутривенных '.иммуноглобулинов (Материалы ВОЗ, 1982, 1983, 1988, 1992). Цель исследования. Теоретическое и экспериментальное обоснование путей повышения эффективности, специфичности и снижения реактогенносги препаратов иммуноглобулинов, разработка принципов и методов получения препаратов нового поколения для профилактики и лечения инфекционных и аутоиммунных заболевании. ... * -• В ходе исследования предстояло решить следуйте задачи:

1. Исследовать, состав препаратов иммуноглобулинов.

2. Изучить взаимодействие белков сыворотки крови в процессе фракционирования.

3. Разработать новый вариант кислотно-ферментатиЕной технологии получения иммуноглобулинов для внутривенного введения.

4. Создать ряд иммуноглобулинов для внутривенного введения направленного действия.

5. Разработать методы получения высокоочищенной мономерной формы иммуноглобулинов" для внутривенного введения' и' установить требования к препарату.

Научная новизна. На основании комплексного изучения состава известных препаратов обоснованы пути повышения эффективности новых лекарственных форм иммуноглобулинов. Разработаны новые принципы конструирования мономерной формы препарат тов иммуноглобулинов.

Впервые показано м-олекулярное взаимодействие белков в процессе фракционирования плазмы (сыворотки) крови человека.

Разработаны оригинальные технологические приемы удаления нестабильных крупноыолекулярнии комплексов, полимеров, димеров и биологически, активных примесей, позволяющие дифференцированно проводить очистку иммуноглобулинов из различных видов сырья. Получены авторские "свидетельства N 1381774 " Способ' получения иммуноглобулина" "15 ноября 1987 г.; N 1403414 " Способ получения иммуноглобулина из сывороток плацентарной и абортной крови", 15 февраля 1988 г:

- б -

Разработан новый вариант кислотно-ферментативного метода получения иммуноглобулинов для внутривенного введения. .

Впервые разработаны иммуноглобулины для внутривенного ввет дения противоботулинический и антистафмококковый. Получено авторское свгдетельство М 1510156 на "Способ получения противобо-" тулинического иммуноглобулина человека" 22 мая 1989 г. Установлены и сформулированы требования к препаратам.

Получены новые данные об уровнях антител в исходном сырье и препаратах иммуноглобулинов, позволяющие дифференцировать подходы к создании специфических иммуноглобулинов для внутривенного введения. Показана возможность" формирования серий специфических иммуноглобулинов = для внутривенного введения против вирусов краснухи и простого герпеса посредством целенаправленного отбора' сырья.

Практическая значимость.

Результаты исследований легли в основу 9 утвержденных фармакопейных статей, регламентов, дополнений к регламентам и методических рекомендаций. Разработаны диа метода получения мономерной формы иммуноглобулинов для внутривенного введения из •центрифугата Б1 и пасты фракции 11; позволяющие-полностью сохранить иктактность и функциональную активность антител. Определены требования к препарату. Усовершенствован кислотно-ферментативный метод получения иммуноглобулинов для внутривенного введения: оформлена и утверждена нормативно-техническая документация на производство препарата: фармакопейная статья ФС 42-3153-95 от 3.10.95г.; регламент производства от 28.12.94 г.; изменение N 1 к регламенту производства иммуноглобулша человека нормального для внутривенного введения "Дополнительная очистка иммуноглобулинов от денатурированных белков, полимеров и нестабильных примесей. Удаление остаточного спирта ультрафильтрацией" от 12.03.97 г.

Применение препарата ;в медицинской практике показало его ..высокую эффективность, при лечении тяжелых бактериально-токсических и вирусных инфекций, послеоперационных осложнений, сопровождающихся бактериемией и септическим состоянием. Производственный выпуск иммуноглобулинов для внутривенного, введения осу-

ществдяется на Нижегородском и Хабаровском предприятиях по производству бактерийных препаратов и в Нижегородском областном гематологическом центре.

Совместно с НПО "Вирион" (г.Томск) разработан иммуноглобулин для внутривенного введения противоботулинический. Определены требования к препарату и производству во временной фармакопейной статье BOG 42-284 ВС-91 от 2.04.91 г. и экспериментально-производственном регламенте N 310-91 от 27.04.90 г.

Препарат предназначен для экстренного лечения средне-тяже-лкх и тяжелых форм ботулизма у детей и взрослых. Выпуск препарата организован в НПО "Вирион";

Для лечения заболевании стафилококковой этиологии совместно с Кировским НЖ гематологии и переливания крови, разработан иммуноглобулин человека для внутривенного введения антистафилококковый. На препарат утверждена временная Фармакопейная статья БФС 42-2854-97 от 11.03.97 г..и дополнение к регламенту. Препарат выпускается Кировской станцией переливания крови.

' Разработаны требования, технология получения, . завершены доклинические испытания иммуноглобулинов для внутривенного введения против вируса, краснухи и вируса простого герпеса. . Иммуноглобулин человека для внутривенного введения противокраснуш-ный предполагается использовать для профш&ктики и лечения инфекций, вызванных вирусом краснухи, особенно у детей и взрослых с дефицитом протизокраонунных антител. Иммуноглобулин человека для внутривенного введения протнвогерпетический предназначен для лечения заболевании детей и взрослых, "вызванных вирусом простого герпеса, особенно полости рта, половых органов и герпетических инфекций глаз. . -

. Для повышения качества исходного иммуноглобулина при производстве внутривенного препарата разработан и внедрен в производство метод очистки иммуноглобулина от денатурированных белков, полимеров и нестабильных примесей. Метод утверждал как изменение N 4 к регламенту производства гаслуноглобулкна человека нормального 12.03.97 г.

Результаты работы вошли в методические рекомендации по определению штиксшлементарной активности препаратов ишуногло-

булинов (1988 г.), разработанные совместно с Нижегородским . НИИШ и ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Апробация работы. Основные результаты и положения работы доложены на рабочем совещании начальников и технологов гамма-глобулиновых цехов предприятий бакпрепаратов (г. Казань, 1983 г.), на проблемной комиссии "Научные основц вакцинно-сывороточного дела, генетика и молекулярная биология бактерий." (г. Горький 1985 г.), на заседании Научно-Технического Совета при Управлении НИМШ и ПВС МЗ России (г. Ростов на Дону, 1986 г.) на Всесоюзном совещании специалистов службы крови по вопросам производства препаратов плазмы донорской крови (г. Москва, 1990 г.), на Пленуме проблемной комиссии " Стандартизация медицинских биологических препаратов для профилактики и диагностики инфекционных болезней человека" (Н. Новгород, 1990 г.). на межрегиональном симпозиуме "Актуальные проблемы практической аллергологии и клинической иммунологии" (г. Москва, 1995 г.), на научно-практической конференции "Препараты крови и кровезаменители - производство, контроль и клиническое применение" (г. Киров, 1995), на 1У Российском Национальном конгрессе "Человек и лекарство" (г. Ыосква, 1997), на П Биохимическом съезде (г. Москва, 1997).

Основные по,ложения выносимые на ~ защиту

1. Охарактеризован состав препаратов иммуноглобулинов.

2. Разработана технология удаления агрегированных форм иммуноглобулинов, белковых и биологически активных примесей.

3. Разработаны условия получения нового поколения "иммуноглобулинов для внутривенного введения с интактной структурой и сохранением функциональных характеристик антител. •

4. Усовершенствована технология кислотно-ферментативного метода и разработаны требования к внутривенным иммуноглобулинам направленного, действия: прртивоботулиническому» азтистафидокок-ковому, • противокраснушному,- -против вируса простого герпеса', а также к нормальному иммуноглобулину человека.

Структурам объем работы . Диссертация изложена на 278 страницах и состоит из введе-

' ния, обзора литературы, собственных исследований, в1Ш5чающих материалы и методы, результаты исследовании и их обсуждение, заключения, выводов, списка цитируемой литератур«. Текст иллюстрирован 32' таблицами и 13 рисунками. В списке литературы приведен перечень 378 работ, в том.числе 90 отечественных и 288 зарубежных..

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы Материалом для исследований служила сыворотка и плазма крови доноров. Кроме того проводился отбор материалов и исследовались смеси, отдельные фракции и. им' муноглобулины, полученные при фракционировании этанолом на холоде по варианту Б в фирме "ИмБио".

Изучались отдельные стадии кислотно-ферментативного метода получения иммуноглобулинов для внутривенного введения, разработанного И.Н. Влохиной, И.А. Киселевой и др. (Нижегородский НИ-ИЭЛ) с наш™ участием.

Молекулярный состав иммуноглобулинов и фракций плазмы определяли с помощью колоночной хроматографии на сефадексе Б-150, 5-200 и ультрагеле АсА-34. Идентификацию белковых примесей проводили методами электрофореза на ацетате целлюлозы и иммуноэ-лектрофореза с использованием антисыворо'гок к бедках" сыворотки крови человека, моноспецифических сывороток к иммуноглобулинам человека Б, А, ]£ М, альбумину, трансферрину, липопротеи-дам. Определение классов иммуноглобулинов проводили методом радиальной ишунодиффузии. Для идентификации биологически активных примесей использовали специальные методы. Антикомплементарную активность иммуноглобулинов определяли в соответствии с методическими рекомендациями, (И.А. Киселева с созет., 1988). Содержание хорконкческого гонадотропина и групповых антигенов крови А и В определяли в реакции торможения гемаглштинации (РТГА) (В.Н. Мигунов с соавт., 1978, 1981). Определение изоге-магглютинннов проводили модифицированным нами методом непрямой .гемагглютинации., Активатор прекалликреина определяли по способности превращать чпрекалликреин плазмы крови в калликреин. Уровень калликреина измеряли по степени расщепления синтетического пептида Ь-пролин-Ь-фенилаланин-Ь-аргинин-Р-нитроанилина (В. а1-

Ving et al. ,1979,1980). Определение содержания белка в образцах сыворотки крови и иммуноглобулинов, а также показателей цветности и прозрачности препаратов проводили в соответствие с требованиями фармакопейной статьи "Физико-химические, клинические и иммунологические методы контроля медицинских биологических препаратов" (ФС 42-344 ВС-90). Постановка биологических проб на животных осуществлялась согласно ГФ XI.

Иммунизации доноров и отбор порций плазмы с повышенными титрами к анти-альфа-стафилолизину проводили B.C. Сапожникова, С.Л. Шарыгин и др. (Кировский НИИ гематологии и переливания крови); к ботулиническому анатотоксину - Н.Б. Альбицкая, Л.Г. Щипкова и др. (НПО-"Вирион",- г. Томск). Диагоностикумы для определения антител к вирусу простого герпеса и краснухи были любезно предоставлены H.H. Мальцевой и Р.Г. Десятсковой (НИИ вирусных препаратов, г. Москва).

Содержание антител к анти-альфа-стафилолизину определяли в реакции нейтрализации, к вирусу кори - в реакции пассивной гем-агглютинации, вирусу простого герпеса - методом иммунофермент-ного анализа, вирусу краснухи и гриппа - в реакции торможения гемагглютикации. Наличие щютивоботулкнических антител устанавливали в реакции биологической нейтрализации на белых мышах (РБН).

Статистическую обработку данных проводили общепринятыми методами с помощью персонального компьютера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

• 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЙ СОСТАВ ПРЕПАРАТОВ ЖЩОГЛОЕУЛШОВ ДЛЯ.. ВНУТ-РИМШЕЧНОГО ВВЕДЕНИЯ И ВЛИЯНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ СТАДИЙ СПИРТОВОГО, ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ НА СОДЕРНАНИЕ БЕЛКОВЫХ ПРИМЕСЕЙ И ПОЛИМЕРИЗАЦИЮ " ■ КОНЕЧНОГО ПРЕПАРАТА . 1. 1. СОСТАВ ПРЕПАРАТОВ. ИШУНОГЛОБУЖНОВ ДЛЯ ВНУТРИШ11ЕЧН0Г0 ВВЦЦЕНИЯ' ,;' ; "

В основу разработки технологии получения иммуноглобулинов . для внутривенного введения был положен спиртовый метод. На пер-

бом этапе исследований стояла задача изучения молекулярного состава препаратов иммуноглобулинов для внутримышечного введения. Материалом для исследований, служили иммуноглобулины полученные из донорской и плацентарной сыворотки. Изучен молекулярный состав иммуноглобулинов 200 серий. Из них 177 серий донорских и 23 серий плацентарных. В состав препаратов, полученных из этих видов.сырья, входили различные молекулярные формы 1в<3 (мономеры, димеры, полимеры и фрагменты), нестабильные крупномолекулярные комплексы (включающие липопротеиды, ЛеС, 1дА, 1£М), различные примеси других белков (альбумин, трансферрин, 1§М), в следовых количествах обнаруживался активатор прекаоккреина. Кроме того, в препаратах из донорского сырья присутствовали изо-агглютинины; иммуноглобулины из плацентарной сыворотки содержали групповые вещества крови и хорионическнй гонадотропин. Молекулярные форш ¡{¿Б и примеси были подразделены на две группы. В первую группу были включены молекулярные Форш составляющие основу биологического действия препаратов (таблица 1).

Таблица 1

Состав препаратов иммуноглобулинов для внутримышечного введения- - молекулярные- Формы, обеспечивающие нормальную биологическую защиту организма

1 ■ ......-......"т™ ........ (Молекулярные формы! Состав 1 1 г 1 ¡Содержание! | (М+т) X 1 1 |

1 Мономеры 1 | Отдельные молекулы 1 1ев 1 1 ¡74,04+3,5 { 1 ' 1

1 Димеры -1 ¡Комплексы белков, состоя- 1 I (18,1+1,0 |

I г |щие из двух молекул | ..... 1е<з ! 1 т 1

Эта группа состояла из мономеров и димеров. Количество мономеров, как наиболее полноценной части препарата, составляло .' (74,4+3,5)2.' К,этой группе отнесены и димеры. Их содержалось более 18%.

Вторую группу составили молекулярные формы и примеси, являющиеся возможной причиной побочных реакций при внутривенном

введении иммуноглобулинов, бедки и фрагменты, снижающие качество препарата (таблица 2).

Таблица 2

Состав препаратов иммуноглобулинов для внутримышечного введения - примеси, ухудшаощие качество препаратов и являющиеся возможной причиной побочных реакций

1 ¡Молекулярные формы Состав ....... 1 Содержание!

1 и примеси 1 (М+т) 1 i

1 ¡Полимеры (агрега- Комплексы белков, в состав 1 (5,8+0,6)%]'

|ты) которых-' входят тримеры, I

1 тетрамеры и другие 1(^3 1

¡Продукты расщепле- Г(аЬ')г, Р аЬ-, Гс - фраг- (2,08+0,1)%

¡ния менты, пептиды i

(Нестабильные круп- Содержат 1еА, (0,1+0,02)1

1номсшекулярные ко- липопротенды, с преимущес- г в 100 г |

¡мплексы твенным содержанием лилид- белка 1

1- ного. компонента. 1

¡УстойчиЕые примеси Альбумин, трансферрин, (2,2+0,3)7.1

¡других белков 1£А, и др. белки !

¡Активатор прекали- (7,5+0,1) |

1 креина ■ МЕ/мд 1

| Изоагглятининн* альфа - 4-16'обр. ¡

1 титры ]

1 бета - 4-16 обр. ¡

1 титры 1

¡Групповые, антигены А - 120+3,4 1

¡крови ** В 101+0,7 J

1 обр.титры 1

¡Хоршнический гона 2á,3+l,6. 1

¡дотропин** 1 1 ' .....................;_________.... ■ ... Ш/ил \| i - i

* - присутствовали в препаратах из донорской плазмы

** присутствовали в препаратах, из плацентарной сыворотки . В нее воили: растворимые полимеры 1е6, ¡фушше агрегаты -

нестабильные крупномолекулярные комплексы, примеси других-белков, фрагменты, изоагглютинины, хорионичёский гонадотропин. Это примеси, от которых необходимо было очистить препарат.

'Количество растворимых полимеров в препаратах составляло (5,8+0,6)2. По данным1 гельхроматографии на сефадексе G-200, молекулярная масса растворимых полимеров была более 300 кД. Связь между отдельными 'молекулами белков, входящими в полимеры, не являлась прочной, так как в трис-буфере рН 7,2-7,4, содержащем 5 М мочевину, полимеры диссоциировали и при гельхроматографии выходили одним пиком в области 150-160 кД. _ Анализ состава белков фракции в иммуяоэлектрофорезе указал на присутствие в ней IgG, IgA, IgM.

Другая группа полимеров, нерастворимые крупномолекулярные комплексы, составляла (0,10+0,02) г на 100 г белка иммуноглобулинов. Крупномолекулярные комплексы плохо растворялись в водных растворах, включая буферные растворы, содержащие мочевину. Результаты химического анализа свидетельствовали, что они состояли на (60,3+2,0)% из липидов и на (20,8+1,3)1 из белков. Результаты иммуноэлектрофореза показали, что в их состав входили IgG, IgA, IgM и липопротееты. _ . .

Наряду с полимерами, препараты содержали (2,06+0,1)% F(ab*)2> Fab-, Fc-фрагментов и пептидов. Расщепление IgG, было, по-видимому, обусловлено неполной очисткой препаратов от протео-литических ферментов.

Препараты иммуноглобулинов содержали также устойчивые в растворе примеси других белков, их количество не превышало 3%. Наиболее часто встречающимися примесями являлись альбумин, трансферрин, IgM, IgA.

Отечественный вариант спиртового метода обеспечивал хорошую очистку препаратов от активатора прекалликреина. Уровень активатора прекалликреина составлял (7,5+0,1) Ж/мл, что было значительно ниже содержания его в плазме и в препаратах, полученных рядом зарубежных, фирм (В. Alving et.al., 1979, 1980).

В пределах требований Европейской фармакопеи (допустимые титры 1:32) находилось содержание альфа- и бета-изоагглютини-ное. В препаратах из донорской крови их титры не превышали

1:16, а в иммуноглобулинах, полученных из плацентарной крови, они вообще не обнаруживались. Очевидно, это было связано с.наличием в препаратах из данного сырья групповых веществ крови. Кзоагглютинины, взаимодействуя с групповыми веществами крови, формировали комплексы антиген-антитело, которые, возможно, удалялись из препаратов на первых этапах фракционирования. Однако, значительное количество групповых веществ крови в плацентарной сыворотке приводило к тому, что они контаминировали конечные препараты. Иммуноглобулины, полученные из плацентарной сыворотки, содержали также хорионический гонадотрошш.

Таким образом, . проведенные исследования позволили установить молекулярные формы ДО, белковые и биологически активные примеси препаратов иммуноглобулинов. Основные компоненты препаратов были представлены деумя фракциями - мономерами и димерами 1с*3. Существующий вариант метода обеспечивал достаточную очистку иммуноглобулинов от активатора прекалликреина и изоагглюти-нинов. В то же время, препараты из плацентарной сыворотки были контаминированы групповыми веществами крови и хориоякческим го-надотропином. Кроме того, иммуноглобулины, полученные.из .различного сырья, содержали примеси других белков, фрагментирован-ный материал. Основную часть реактогенных примесей составляли растворимые полимеры и нестабильные крупномолекулярные комплексы. Полученные результаты определили путь дальнейших исследований, заключающийся в необходимости определения стадий технологического процесса спиртового метода фракционирования, елияющих на степень ¡--онтаминации конечного препарата полимеризированными белками и примесями.

1. 2. ВЛИЯНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ СТАДИЙ СПИРТОВОГО ФРАЩК0Ш1Р0ВАНИЯ НА\ ПОЛИМЕРИЗАЦИЮ КОНЕЧНОГО ПРОДУКТА И СОДЕРЖАНИЕ БОКОВЫХ ПРИМЕСЕЙ\

Данное литературы (Н.В.: Холчев, 1980) свидетельствуют, что процесс агрегации иммуноглобулинов, ¡обусловлен особенностями спиртового метода фракционирования. Этот процесс можно ограничить уменьшением скорости добавления спирта, снижением температуры, осадителя и белковых смесей близких к точке замерзания, а

также устранением вспенивания при центрифугировании. Был проведен комплекс технологических мероприятии по изменению условий фракционирования. Введение новых технологических приемов (сни-' жение температуры осадитедя и белковых смесей, глубинная капиллярная подача спирта н введение пеногасителей) улучшило качество препарата, ко оказалось лишь частью решения этой задачи. Основные причины полимеризации были, по-видимому, заключены в процессах фракционирования.

Дня изучения состава белков и их взаимодействия в процессе осаждения отбирались пробы исходной плазмы, центрифугата А8, центркфугата А; осадка А, осадка А1, центрифугата Б и конечной фракции иммуноглобулинов. Состав белков и их взаимодействие в процессе выделения были изучены методом гельхроматографии на сефадексе &-150, под контролем электрофореза на ацетате целлюлозы. Исследованы фракции 30 производственных серий (таблица 3).

Таблица 3

Изменение молекулярного состава белков в процессе фракционирования плазмы спиртовым методом (п=30)

1 ................. 1 Фракции при ...... -....... 1 • 1 1 Фракция 1( Фракция П(Фракция III!

(Фрак- гельхро- М > 160 кД(М - 160 кД|М - 70 кД |

I ции матогра 1 1 1

|плазмы фии 1 1 | 1 I I

в процентах (2) 1 1 1

[ Плазма 11,5 + 1 * 1,3| 35,1 + 1,7| 1 53,1 ± 3;2|

(Центрифугат А8 15,5 + 2,1|31,6 + 4,3 ( 52,9 + 3,6(

(Центрифугат А 23,0 + 4,1| 9,6 ± 1,4 1 67,4 + 4,1(

| Осадок А 26,3 + 3,8|65,4 + 3,1 | 8,3 ± 1,61

1 Осадок А1 26,5 + 2,3(71,1 + 4,1 | 2,4 + 0,2(

(Раствор осадка 67,8 + 3,2|29,9 + 2,6 ( 2,3 + 0,2|

I А1, рН 5,2-. \ ■ !■ - - 1

(Центрифугат Б 10,1 + 1,2|89,9 + 1,3 ( следы (

|Иммуноглобулий 16,3 2,4183,7 + 2,4 | 1 | следы | I

При гельхроматографии установлены три молекулярные группы белков. Первую фракцию составляли полимеры и белки с молекулярной ыассой более 160 кД, вторую фракцию иммуноглобулины и белки с молекулярной массой 160 кД и третью фракцию составляли белки с молекулярной массой 70 кД ( в основном альбумин):

Гельхроматографический анализ центрифугата А8 показал, что несмотря на удаление из плааш фибриногена (М - 400 кД), входящего в первую фракцию, содержание высокомолекулярных белков не только не уменьшилось, а иыело тенденцию к нарастанию, очевидно, за счет полимеризации белков других'фракций с молекулярной массой 70 и 160 кД. •

При добавлении в плагыу этанола до концентрации 25%, при нейтральном рН и снижении температуры до -10 0 С на стадии А происходило разделение белков. Основная часть альбумина, небольшая часть альфа-2- и бета-глобулинов оставались в растворенном состоянии в центрифугате А. Осадок А включал лишь небольшую часть альбумина, а также содержал альфа-1-, альфа-2-, бетаглобулины и гаммаглобулияы. На этой стадии происходил процесс полимеризации белков. В центрифугате А их обнаруживалось в два раза, а в растворенном осадке А в 2, 3 раза больше по сравнения с исходной плазмой. Измененный количественный состав фракций II и III был, вероятно связан, не только с концентрированием белков этих фракций, но к о возможной полимеризацией низкомолекулярных белков фракции I и переходу их во фракцию II. Сопоставление содержания фракции II в осадке А, на (65,+3,1)2 состоящей из фракции гадааглобулина, определенной методом электрофореза (44,7+4,3)2,. подтверждает это положение. ..

Повторное переосаждение осадка А приводило к частичному или полному удалению альб^шша. \

Рассмотренные выше изменения белкового и молекулярного состава происходили на первых стадиях технологического процесса: на этих'стадиях разделение белков осуществлялось за счет; изменеши трех параметров - концентрации этанола, содержания белка и температуры осаждения.

. Дальнейшая очистка на стадии Б происходила при снижении рН

до 5,2 и ионной силы до 0,01. Установление этих показателей приводило к тому, что все белки, за исключением части гаммагло-булина к альбумина, теряли злектрофоретическую подвижность. По данным гельхроматографки свыше 60% белков полимеризовалось и переходило во фракцию I (молекулярная масса больше 160 кД). Полимеризация проходила за счет белков фракции II, при этом количественное содержание белков фракции III с молекулярной массой 70 кД практически не изменялось.' Следует допустить, что такое взаимодействие белков было обусловлено приведением их к изоэ-лектрической точке, что согласуется с Р. Скоупс (1985). Действительно, большинство белков альфа- и бета- 'фракций (трансферрин, церулоплазмин, плазминоген, гаптоглобин) имеют изоэлектрическую точку близкую к рН 5,2. Однако при этом отсутствовала избирательность полимеризации. Вместе с белками, имеющими близкие изоэлектрические точки, полимеризовались и иммуноглобулины, изозлектрическая точка которых значительно отличалась от этих значений рН.

Заметное влияние, по-видимому, оказывала и низкая ионная сила, особенно на белки, содержащие большое количество гидрофобных остатков. По нашим данным фракция А1 содержала две трети лишвдов, входящих в" состав альфа- й бега- липопротейдов плазмы. Очевидно, происходило слияние гидрофобных областей и липидного компонента одних белков с аналогичными участками других белков и формирование растворимых крупномолекулярных комплексов. В результате повышения концентрации этанола до 13Х происходила дальнейшая агрегация молекул и формирование осадка. Надосадоч-ная жидкость по данным электрофореза на ацетате целлшозы содержала фракцию гаммаглобулина и в следовых количествах низкомолекулярные белки, включая альбумин. Гельхроматографическии анализ показал, что фильтраты состояли на 90Х из белков с молекулярной массой 160 кД, то есть мономерной формы и на ЮЛ из белков с. молекулярной массой более 160 кД. неполное осаждение высокомолекулярных белков являлось по нашему мнению, результатом присутствия липопротеидов низкой плотности.

Стадия Б практически завершала окончательную очистку иммуноглобулинов . .

Эпектрофоретический анализ полученных препаратов показал, что они на (98,7+0,1) % состояли из фракции гаммаглобулина и на (1,3+0,1)2 бета-глобулинов. В следовых количествах также присутствовал альбумин. Количественное соотношение белков полностью соответствовало составу центрифугата Б ^ Вместе с тем молекулярный состав препаратов на этих стадиях имел значительные отличия. В конечных препаратах наблюдалось резкое увеличение молекулярных форм с массой более 160 кД.

Подученные данные свидетельствовали, что заключительный, этап фракционирования и условия растворения осадка гамма-глобулина влияют на его молекулярный состав.'

Таким образом, в результате оценки белкового и молекулярного состава по стадиям фракционирования впервые установлено, что осаждение белков может происходить по меньшей мере двумя путями. Первый путь заключается в формировании круп'яомолекулярных комплексов непосредственно из ыономершх форм белков о'-последующим формированием осадка. Второй путь более слокный, он приводит к появлении растворимых полимеров, которые при изменении условий фракционирования образуют крупномолекулярные комплексы и формируют осадок. Осаждение полимеров ке всегда бывает полным, и на заключительных стадиях они могут попадать в конечный препарат.

Нами впервые показало, что наличие в препаратах полимеров обусловлено, не только денатурацией белков, но и недостаточным отделением полиыеризованных белков от мономеров на стадии Б.

2. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННЫХ ДЕЗАГРЕГИРОВАННЫХ Ш,{УН0ГЛ0ЕУЖН0В С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЕПСИНА

Следующий этап исследовании был посвящен изучении возможности разрушения нестабильных крупно-молекулярных комплексов полимеров и биологически активных прюгесей с помощью фер-

ментативного гидролиза пепсином. • • • ' '. 1 ■' ■'■'.••

В процессе разработки условий дезагрегации был проведен сравнительный анализ молекулярного состава и функциональной активности (антикоыпдементарной активности, специфической актив-

ности антител) иммуноглобулинов при различных значениях рН, температуры, концентрации фермента и времени гидролиза.

Установлено, что изменение рН от неотрального значения к 4,0 приводило к диссоциации полимерных и димерных форм иммуноглобулинов. При закислеяиш среды ниже 3,5 наблюдали полимеризацию иммуноглобулинов. С помощью теста определения антикомплементарной активности на . наличие специфических агрегированных молекул установлено влияние температуры на снижение агрегатов в препаратах иммуноглобулинов. Проведение гидролиза при комнатной температуре не приводило к изменению антикомплементарной активности, в то время как в условиях 37 0 С наблюдалось резкое снижение антикомплементарной активности в присутствии пепсина.

Концентрация пепсина и время гидролиза являлись определяющими для сохранения функциональной полноценности молекул. Антикомплементарная активность снижалась при концентрации фермента от 5 до 250 мг пепсина на 100 г белка и времени гидролиза от 1 до 24 часов. Однако, при протеолизе иммуноглобулинов в присутствии 100-250 мг фермента имела место значительная фрагментация иммуноглобулинов и снижение активности антител, что не наблюдаг лось при использовании 5-50 мг. фермента. . Концентрация фермента 25-50 мг и время гидролиза 20 часов явились оптимальными, так как позволяли снизить антикомплементарную активность, уменьшить количество агрегированных молекул и полностью сохранить активность антител.

Нами впервые показано, что в процессе гидролиза пепсином происходит разрушение белковых примесей, таких как lgA, IgM, альбумин, трансферрин. Проведенные исследования позволили разработать оптимальные параметры режима очистки иммуноглобулинов. Метод состоял из нескольких этапов и включал получение раствора иммуноглобулин из лиофилиэированного порошка с концентрацией белка 13,0-15,QZ, с последущими операциями:- установление рН раствора 3,9-4,0; добавление пепсина из расчета 25-50 мг фермента на 100 г белка, гидролиз при 37 0 С, в течение .18-20 . ча- . сов, удаление пепсина ' гидроокисью алюминия, коррекцию рН к нейтральному значению, удаление нестабильных примесей.

Препараты, полученные в лабораторных условиях из донорской

плазмы не содержали крупномолекулярных комплексов, полимеров, примесей других белков, изоагглютининов (таблица 4).

Таблица 4 .

Содержание примесей в препаратах иммуноглобулинов после обработки пепсином (25 мг пепсина на 100 г бедка)

I | N Молекулярные Ед. 1 Содержание (М+ш) |

1 п/п 1 1 Форш и примеси измер.

1 Без обработки | После обработки!

1 1 1 Нестабильные г/100г

1 крупнономолекуляр- белка' 0,1 + 0,02 | не обнаружены |

! ные комплексы

1 2 1 Хорнонический гонадотропин* МЕ/мл 24,3 + 1,6 | 26,3 + 2,2 |

1 з 1 Групповые вещества крови* обр. тигры

1 А 120 + 3,4 | 36+1,67 |

1 В 101 + 0,7 | 24 + 1,2 |

! 4 I Содержание фрагментов % " 3,1 +0,1 | 10,3+1,2 |

1 5 ! б Активатор прекал-лнкреина йзоагглютинины**: МЕ/мл 7,5 + 0,1 | 7,6 + 0,2 |

1 альфа обр. 4-16 ! 1-1 1.

1 Сета титры 4. - 16 | 1-1 !

1 ? Полимеры 1ви % 5,8 + 0,6 | 0,0 |

1 8 Примеси других % 2,2 + 0,3 | отсутствуют ]

1 белков

1 9 Антикомилементар- мг белка 0,1 + 0,03 | 25,0 ~ }

1 1... ная активность 1 1 1 1 '

* - присутствовали - только в препаратах'из плацентарной сыворотки ** - присутствовали только в препаратах из донорской плазмы

Иммуноглобулины имели низкую антикомплементарную актив-

ность, и только небольшую примесь активатора прекалликреина. Однако, по сравнению с -исходными иммуноглобулином возрастало количество фрагментов.

Иммуноглобулины из плацентарной сыворотки имели близкие к донорским показатели, однако, наличие в них групповых веществ крови и хорионического гонадотропина явилось основанием исключения этого " сырья из производства иммуноглобулина для внутривенного введения.

Дальнейшие исследования были направлены на масштабирование лабораторного метода в условиях производства.

3. УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ККСЛОТНО-ФЕРКЕНТАТИВНОЙ ТЕХНОЛОГИИ

ПОЛУЧЕНИЯ ШМЮГЛОВУШЮВ ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ

Воспроизведение в производственных условиях лабораторного регламента получения внутривенного иммуноглобулина встретило ряд непреодолимых технологических трудностей, что потребовало проведения дополнительных исследовании по созданию современного масштабного производства препарата. Основным недостатком при увеличении объемов обрабатываемых смесей явилась полимеризация нестабильных белков-в процессе-гидролиза (таблица 5),- что неблагоприятно сказалось на сроках реализации технологического цикла и качестве препарата.

Внесение стабилизаторов в растворы иммуноглобулинов и изменение режимов суши не привели к желаемым результатам. Формирование полимеров удалось ускорить прогреванием растворов при 37° С в течение 2-3 суток с -последующим выстаиванием при 4-8° С в течение 7-10 суток. Осадок полшеризованных белков удаляли на центрифугах. Этот вариант был рассчитан на обработку небольших объемов иммуноглобулинов. Лимитирующими факторами являлись: ли-офильная суша и центрифугирование.

Замена лисфильной сушки на ультрафягьтрацшо позволила сократить на порядок . время удаления этанола из производственной серии обьемом 15-20 литров.Нами были обоснованы режимы освобождения растворов иммуноглобулинов от коллоидно-нестабильных компонентов с помощью осветляющей и стерилизующей фильтраций.

Таблица 5

Изменение молекулярного состава в процессе получения-иммуноглобулинов для внутривенного введения

1 1 N (П/П Стадии обработки .................... 1 Молекулярный состав в % !

1 1 I ! Полимеры|Димеры | Мономеры|Фрагменты| [ 1+ Р(аЬ')2| | 1 » * 1

| 1 Исходный ИГ 1,0+0,2 1111 |18,3+1,1|80,7+2,3 | - |

1 2 После добавления 1111

кислоты до рН 4,0 1,0+0,2 | 7,3+1,4|88,5+3,0 (3,2 + 0,3|

1 з После гидролиза 3,5+0,4 I 6,2+0,9)80,7+3,1 |9,6 + 1,0|

1 4 После коррекции рН 8,2+0,3 110,6+0,8(72,1+2,3 (9,1 + 1,1!

6,5 - 7,0 11(1

1 5 После центрифугиро- 1111

вания и стерилизую- 1111

щей фильтрации следы 110,7+1,1(79,9+2,6 |9,4+0,9|

1 6 1 Готовый препарат- следы ! 110,1+1,3(80,6+2,8 |9,-3+ 1,2| I , ,1, ., , . I . ........ 1

Научно-обоснованное решение очистки иммуноглобулина было найдено на основании изучения физико-химических свойств 1ёМ и лисопротеидов. Как показали исследования, отделение эуглобули-иов достигается растворением пасты в' растворах с низкой ионной силой. Разработанный нами способ был внедрен в технологический процесс получения иммуноглобулинов для внутривенного введения для стабилизации препарата.

Иымунохимический анализ белкового состава нерастворимых в растворах с низкой ионной силой осадков выявил в основном присутствие 1&А, 1вЫ, липопротеидов.

Удаление этого комплекса балластных белков привело к тому, •что на всех промежуточных стадиях технологического процесса и в конечном препарате отсутствовали высокомолекулярные белки.

Анализ молекулярного состава образцов, отобранных на стадиях технологического процесса подтвердил факт освобождения от

полимеров при растворении пасты, диссоциации димерсв при кислом значении рН и частичную полимеризацию мономеров при коррекции рН к нейтральному значению (таблица 6).

Таблица б

Молекулярный состав белков в процессе получения иммуноглобулинов для внутривенного введения (п=57)

1 1 N Молекулярный состав в 1 1 (М+т) 1

|п/п Стадии

1 1 !

обработки Псшшеры|Дммэрн Мономеры|Фрагменты|

1в6 1 1В6 1 1е<3+Р(аЬ) 2 ДО 1 I |

1 1 Растворение пасты иммуноглобулинов 2,1+0,2 1 110,3+1,6 1 85,5+3,6 1 I |2,1 + 0,3! 1 !

1 2 Удаление нестабиль- 1 ! I

ных примесей следы 1. 9,8+0,8 89,0+2,6 ¡1,2 + 0,11

1 з Ультрзфшзьтрация с коррекцией рН — | 3,0+0,3 1 96,5+2,1 10,5 + 0,11 1 1

1 4 Гидролиз при 37° 18 часов — 12,1+0,3 1 84,6+3,1 113,3+1,2 | 1 1

1 5 Адсорбция пепсина' - 1 2,1+1,4 85,8+2;7 (12,1+ 0,9|

гидроокисью алюминия 1 1 | 1 1

1 б 1 Готовый препарат' - | 4,2+0,5 1 84,2+1,8 111,6+ 1,2! 1 •

Эти процессы, наряду с фрагментацией, влияли на уровень юшжерннх форм. На заключительных стадиях процесса в результате гидролиза увеличивалось количество фрагментированного материала, но в конечно;,1 препарате оно не превышало 12%. Особенно значимым был факт отделения полимеров и высокомолекулярных белков на стадии удаления нестабильных примесей.

Были изменены и технологические этапы, на которых проводили добавление стабилизаторов и натрия хлорида: стабилизаторы вносили в ,раствор после ультра^ильтрации, •перед,добавлением пепсина. Коррекцию изотонии иммуноглоб'улиной осуществляли перед заключительной стерилизующей фильтрацией.

В итоге проведенной научной работы по масштабированию оп-

> . г

тнмальной технологической схемы получения иммуноглобулинов для внутривенного введения была предложена следующая производственная схема:

1) растворение пасты иммуноглобулинов, удаление нестабильных примесей осветляющей и стерилизующей фильтрацией;

2) удаление'остаточного этанола, ультрафияьтрациен, концентрирование белка до 7,0 - 7,5Х с одновременным снижением рН раствора до 3,9 - 4,0;

3) добавление глюкозы до 21, глицина до 11, пепсина 25 мг на 100 г белка, стерилизующая фильтрация, гидролиз при 37°С в течение.18 часов;

4) адсорбция пепсина гидроокись» аллюмикия, удаление комплекса гидроокись-пепсин осветляющей фильтрацией;

5) доведение рН раствора до 6,5-7,5, добавление натрия хлорида до 0,8-0,9%, стерилизующая фильтрация;

6) розлив препарата.

Полученные препараты соответствовали требованиям фармакопейной статьи ФС 42-3159-95 (таблица 7).

Таблица"7.

Характеристика производственных серий иммуноглобулина для внутривенного введения подученного по новому варианту технологии I-г

1 | Физические свойства: | прозрачность

1 цветность

2 I рН

3 ! Содержание белка,

4 1 Зяектрбфоретическая I однородность

ед.-опт. плотное-|0,01 - 0,03| ти |0,02 -0,04| I 6,5-7,1| . X. I 4,5 - 5,5| % 1100 1 гамма) ! фракции

0,00 - 0,05; 0,00 -0,08 6,5 - 7,5 4,5 -..5,5 100% гамма-фракции

Продолжение таблицы на странице 25

1 1 1 2 3 . ¡ 4 | | 1 5 (

( 1 5 | Фракционный состав 1 г дуга прец. 1-2 | 1-2 |

1 б |Молекулярные параметры % 1 1

| дныеры 1 8,1 + 1,8 | не более 102 |

| мономеры | 76,1 + 5,9| не менее 601 (

| фрагменты | 15,8 + 3,4 не более 302 |

1 7 ! Стерильность | стерилен | стерилен |

1 8 | Пирогенность | апирогенен| апирогенен |

1 9 | Токсичность |не токсичен! . не токсичен |

|10 !Антиадьфастафилолиаин КЕ/Ш | 4-6 | не менее 2 (

¡11 ¡Аитигала к вирусу кори МЕ/мл ! 40 -50 ' 1 не менее 25 (

112 | Неспецифические примеси ед. Ан- ! 1

1 (пепсин)' ' сона (отсутствует! отсутствует !

! 13 | АКА мг белка Г 10 -25 | 10 (

|14 (Контроль на отсутствие 1 , I

| НВ5 - антигена [отсутствует) отсутствует |

115 (Контроль на отсутствие ! I

! антител к ВИЧ 1 отсутствуют I отсутствуют |

|16 | Натрия хлорид I 0,8-0,9. ¡. 0,9 (

|17 ( Глюкоза ! 0,8-1,2 ( 0,8-1,2 |

¡18 I. | ГЛКЦИН | ■ I 0,3-0,7 1 1 1 0,3-0,7 | I

Таким образом, был научно обоснован и реализован в современном нромьшшеннда технояогшеском варианте новый режим изготовления ишуноглобуликов для внутривенного введения.

4. РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ПОЛУЧЕНИЯ ЖШНОГЛОБУЛЙЮЗ НАПРАВЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ

В настоядее время многоплановыми научными исследованиями (Ь. Натаи51;гап, С. ЗсЬпи, 1986; Г. ЗкчагП, 1586) установлено, что ■протективные' антитела класса представлены ■ различными

субклассами, которые избирательно синтезируются клоками плазматических клеток в зависимости от вида антигена (бактерии, вирусы, вакцина, анатоксины", белки, полисахариды и т.д.), от путей

и условий иммунизации, от времени контакта с антигеном, от состояния здоровья и возраста человека. Например, вирус герпеса I вызывает синтез защитных антител, а вирус краснухи - 1^1 и 1ё63. Напротив, стафилококковый альфа-токсин индуцирует синтез и 1(т<з4 антител, а анатоксины (дифтерийный, столбнячный и др.) в равной мере все четыре субкласса' иммуноглобулина 6. Дефицит секреторного и сывороточного 1£А у длительно и часто болеюшдх ОРВИ пациентов ассоциирован с дефицитом сывороточного

В свете современных данных сложилось мнение, что период полужизни в три раза короче 1д052, 12134, так как

именно этот субкласс высокочувствителен к воздействию как плазмива, так и пепсина. Именно этот субкласс отличает склонность к агрегации и сравнительно высокая активность в реакции связывания комплемента.- Изоэлектрические точки "субклассов к 1дБЗ (рН 8,3-9,0) не совпадают с иаоэлектрическими точками 12132 и 1дС4 (рН 6,8-8,0). Международные нормативы, которые установлены для препаратов внутривенного иммуноглобулина в начале 90-х годов, требуют представительства всех четырех субклассов в- той концетрации, в которой они содержатся в плазме (сыворотке) крови здоровых взрослых людей..

Принимая во внимание эти современные научные данные нами были разработаны варианты технологических режимов получения внутривенных препаратов иммуноглобулина, направленных против:

1 - вируса герпеса,

2 - вируса краснухи

3 - ботулинических токсинов типа А, В, Е

4 - анти-альфа-стафилояизмна. - .

В ходе научного обоснования 'режимов опытно-промышленного производства специфических иммуноглобулинов были учтены доступные опубликованные данные о физико-химических и биологических свойствах антител, интересующей нас направленности.

. Успех практического-решения проблемы создания, технологии производства противогерпетического внутривенного иммуноглобулина в значительной степени определили уровень специфических антител б исходном сырье и их сохранность на этапах очистки.

Герпетическая инфекция, как правило, сочетаетсяр хроническим бронхитом, воспалительными заболеваниями ЛОР-органов, дисбактериозом кишечника, что расценивается специалиста»® как проявление иммунологической недостаточности (В.Л- Прокопенко, 1997). Показано, что заместительная терапия интерферонами приводит к ремиссии сопутствующих заболеваний и нормализации показателей иммунного статуса, причем краткосрочные курсы иммунотерапии - малоэффективны.

8 связи с этими клиническими данными было признано целесообразным контролировать 'сохранность в противогернетических им-, муноглобулинах уровня противовирусных"и антибактериальных анти- . тел широкого спектра действия.

Проведенная с помощью ИФА оценка уровня противогерпетичес-ких - антител в индивидуальных пробах плазмы выявила следующее распределение:

титр менее 1:270 - 20,3 % проб плазмы . до 1:810 - 53,7 1 до 1:2430 - 22,4 1 до 1:7290 - 3,6 X ' 'Аналогичная оценка коммерческих серий внутримышечного "Иммуноглобулина человека нормального" таете свидетельствовала о" малоперспективной сырьевой базе для производства противогерпе-тического внутривенного иммуноглобулина: .

титр менее 1:2700 - 16,6 1 серий препарата

до 1:8100 - 62,9 £ ■ >

до 1:24300 - 16,6 7, до 1:72400 - 3,9 % Принимая во внимание рекомендации клинических вирусологов, полагающих, что содержание противогернетических антител в крови пациента для обеспечения их протективного эффекта должно быть по крайней мерз 1:500 - 1:1000, то для приготовления внутривенного иммуноглобулина были использованы пулы плазмы и серии .внутримышечного иммуноглобулина с максимальным "титром антител. ' 4 Оптишльный режим фракционирования позволил получить внутривенный лротивогерпетичесютй'шмуноглобулин с титром антител. 1:30000. Отсутствие большего концентрирующего эффекта мы склон-

ны объяснить особенностями физико-химических свойств субкласса иммуноглобулина 1е63, отвечающего за защиту против этой вирусной инфекции.- Для достижения.требуемой лечебной дозы противо-герпетических антител нами был увеличен объем внутривенного препарата до 50 мл.

Таким образом, бала решена задача создания внутривенного иммуноглобулина, против вируса простого герпеса.

Научная разработка способа получения внутривенного иммуноглобулина против вируса краснухи.была существенно осложнена тем, что ни в одной серии-поливалентного иммуноглобулина для внутримышечного введения не были выявлены титры специфических антител, представляющие интерес для клиники. В связи с этим сырьевая база была определена скринингом индивидуальных порций плазмы, который выявил следующее распределение: менее 1:40 - 62,8 % до 1:80 - 15,3 X до 1:160 - 12,8 Ъ 1:320 - 1:640 - 9,1 I Сбор в производственный пуд. высокотитралшых (не менее 1:500) образцов плазмы проводили в течение трех месяцев, сохраняя пробы при температуре не выше минус 20°" С. 'Достоверного снижения активности противокраснушных антител в указанные.сроки хранения и накопления сырья не было отмечено. Разработанная технология фракционирования внутривенного иммуноглобулина против вируса краснухи обеспечивала 5-7 кратное концентрирование специфических антител. Полученные, данные свидетельствуют в пользу того, что специфические антитела-против вируса краснухи представлены в основном резистентными к ферментативным воздействиям и долгоживущми иммуноглобулинами субкласса Для обеспечения лечебной дозировки препарата его фасовали по 50 ил.

В отлкчие от двух предыдущих технологических научных разработок, где сырьевая база была представлена естественными противовирусными антитела,®, поиск производственных, решений изгог товления антитоксических иммуноглобулинов (противоботулиничес-ких и алтистафилоиокковых) проводили с использованием плазмы доноров иммунизированных соответствующими анатоксинами. Выход в

иммуноактивные доноры составил более 80 Z.

Антитоксические противоботулинические антитела получали из плазмы крови доноров, которые были предварительно иммунизированы секстаанатоксином, а' спустя 12 месяцев - ревакцинизированы трианатоксином (типы А, В, Е). Производственные смеси плазмы перед фракционирование тлели титры антител: к типу А - 3 МЕ/мл К типу В - 2 МЕ/ил к типу Е - 2 МЕ/ш Разработанный способ фракционирования позволил получить производственные, серии антитоксического противоботулинического внутривенного иммуноглобулина, содержащего антитела к токсину: к типу А - 18 МЕ/ыл к типу В - 12 Ш/ш к типу Е - 10 МЕ/шг Способ получения препарата запатентован (N 1510155 от 22.05.89). '

Антитоксические противостафилококковые антитела получали, иммунизируя доноров стафилококковым анатоксином. Содержание антител к альфа-стафидолизину .в производственных .загрузках плазмы было ке менее 3 ME/мл, а во внутривенном иммуноглобулине - 20 ME/мл, в результате семикратного концентрирования антител субкласса leGl и IgS4.

По нашему мнению, предварительное исследование субклассового и классового представительства антител направленного действия в исходном сырье позволяет определить тактику технологического подхода получения внутривенных иммуноглобулинов как противовирусной, так и антибактериальной антитоксической направленности.

Выражаю глубокую признательность сотруднику Томского НИИВС НПО "Вирион" Л.Г. Щипковой, сотрудникам КироЕского НИИ гематологии и переливания крови С.Л. Шарыгину, P.A. Матвееву, благодаря которым был создан первый, в Российской-Федерации, арсенал внутривенных иммуноглобулинов направленного действия.

5. ПОЛУЧЕНИЕ МОНОМЕРНОЙ <ЮРМЫ ИШУНОГЛОБУЛИНОВ 5.1. ИМЕНИЕ НЕСТАБИЛЬНЫХ КРУПНШОДЕКУЛЯРНЫХ КШШЕКСОВ, ПОЛИМЕРОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПРШ-СЕЙ

Исследования молекулярного состава показали, что спиртовый метод не обеспечивает в полной мере разделения комплексов белков с липвдами, полимерами, биологически активными примесями, что влияет на качественные показатели конечного препарата иммуноглобулина.

В'"Связи с необходимостью создания комбинированной технологии очистки основное внимание было уделено разработке операций отделения крупномолекулярных комплексов и полимеров от мояоыер-ной фракции иммуноглобулина. Параллельно решали проблему очистки препаратов от биологически активных примесей из плацентарного сырья.

' Результаты исследований привели к разработке трех вариантов технологии. В первом варианте предусмотрено удаление нестабильных крупномолекулярных агрегатов и полимеров из полуфабриката иммуноглобулина. Метод основан на различиях в растворимости нативного крупномолекулярных комплексов и полимеров в спиртовых растворах с низкой'ионной силой при изозлёктрическбй точке белков, составляющих крупноысшекулярные комплексы. Он включает 2 этапа:

1 - осаждение крупномолекуляряых комплексов;

2 - концентрирование иммуноглобулинов осаждением этанолом.

На первом этапе для осаждения крупномояекулярных комплексов и полимеров раствор или пасту иммуноглобулинов разводили до содержания белка 1,0+0,2 X. Ацетатным буфером устанавливали рН раствора 5,9-6,0. Проводили осаждение этанолом до концентрации его в растворе 5,0 2, конечная температура -3 0 С.

Низкая ионная сиза, незначительное присутствие этанола позволяли формировать осадок, который удаляли центрифугированием. Он состоял .из Б, 1[г А, 1£,М, липопротеидов, гемпигментов и других белков.

На втором этапе в фильтрате устанавливали рН 6,9 - 7,0, концентрацию этанола 25 температуру раствора снижали до -10°

С. Смесь центрифугировали и получали осадок очищенных иммуноглобулинов. Получены 23 серии иммуноглобулинов. Препарат содержал менее 1% (0,63+0,02)%. крупномолекулярных комплексов, включая полимеры.

Второй и третий варианты предусматривали удаление нестабильных комплексов и полимеров при проведении основного процесса фракционирования.

На начальном этапе исследований была предпринята попытка осаждения крупномолекулярных комплексов и полимеров непосредственно из раствора А1, при рН 5,5-5,7, вместо регламентированного рН 5,0-5,1. Однако, изменение этого параметра па этом этапе приводило к потерям до 30 % мономерной фракция иммуноглобулинов, поэтому последующие опыты проводили с очищенным от бета-глобулинов центрнфугатом Б. Отбирались.пробы центрифугата-Б и в лабораторных условиях в пробах устанавливали рН 5,3-5,7: 5,8-6,0. Образовавшийся в процессе изменения рН осадок отделяли центрифугированием. В надосадочной жидкости определяли содержание белка и молекулярный состав методом гель-хроматографии на сефадексе Б-150. Состав белков осадка исследовали в иммуноэ-лектрофорезе. Результаты исследований-представлены в таблице 8.

Таблица 8

Изменение содержания крупно?голекулярных белковых комплексов полимеров и потерь иммуноглобулинов в зависимости от рН на стадии центрифугата Б

1 Г ' ■ ■ I |Содержание крупяо- 1 1

1 рН центрифугата|молекулярных комп- (Потери иммуногло-(

i Б |лексов, полимеров, (булинов в Z (

| 1 высокомолекулярных 1 1

1 1 белков 1 t

1 1 (Исходный центри-1

(фугатрН 5,0-5,21 10,3 + 2,1 . 1 . . 1

1 рН 5,5-5,7| 3,1 '+ 0,5 1 10,7 |

I рН 5,8-6,0| 2,1 + 0,6 ( 1 1 21,3 ( 1 1

Как свидетельствуют данные таблицы 8 при изменении рН среды до 5,5 - 5,7 уровень крупномолекулярных белковых комплексов снижался в 3,3 раза, а при рН 5,8-6,0 в 4,9 раз. При этом наблюдали такую закономерность, чем выше' рН; центрифугата, тем больше удалялось крушоыолекулярных белковых комплексов и полимеров, но возрастали потери конечного продукта. Анализ иымуноэ-лектрофореграым осадков иммуноглобулинов подтвердил, что часть 1£а соосаздалась с другими белками. В осадке также присутствовали денатурированные белки, потерявшие злектрофоретическую подвижность, липопротеины, 1дА, альбумин, белки, входившие

в крупномолекулярные комплексы, а также от одного до 7 других белков плазмы крови, обнаруженных в разных сериях опытов. Производственные опыты подтвердили возможность очистки больших объемов. Препараты, полученные со стадией удаления крупномолекулярных комплексов и полимеров в интервале рН 5,5-6,0, были стабильна: Поэтому, для сокращения потерь иммуноглобулинов их отделение проводили при рН 5,5-5,7. Вариант Еторой предусматривал очистку препаратов полученных только из донорской плазмы.

Анализ молекулярного состава цэнтрифугатов до (Б) и после очистки (Б1) методом хроматографии на сефадекое <5-200 показал, что в результате обработки в центрифугате Б1 остается-менее 1% крупномолекулярных агрегатов (таблица 9), -удалось в 9,7 раза снизить содержание липицов.

Таблица 9

Содержание крупномолекулярных комплексов полимеров и димдов в центрифугате Б и Б1

! ; I 1

! 1 Единицы | Содержание (М+т) |

I Показатель | измерения |-1-1

| | ¡До обработки¡После обработки) '

Крупноыолеку-| | [

лярные комп- 1 % .. I 11,2 + 1,3 | 0,9..+ 0,1 лексы, поли- II | меры 1 | . |

Липиды ' ¡мг/г белка 12,6 + 1,7 1 1,3 + 0,4

Метод рекомендован для использования в производстве при фракционировании донорской плазмы крови человека. Данным методом получено 1257 серий иммуноглобулинов. Существенно улучшилась стабильность физических свойств препаратов.

Третий вариант предусматривал очистку иммуноглобулинов из плацентарной сыЕоротки бентонитом. Была установлена возможность совмещения этапов удаления крупномолекуляргшх комплексов и хо-рионического гонадотропина на стадии центрифугата Б. Отработаны количества добавляемого бентонита на 1 л очищаемого центрифугата Б, позволяющие полностью удалить из препарата хорионический гояадотропин.

Шесте с тем обработка бентонитом не освобождала препараты от групповых веществ крови. Дополнительную очистку от групповых веществ крови проводили на ДЭАЭ-целлюлозе. Установлено, что существенное снижение примесей групповых веществ крови наблюдалось при .добавлении ДЗАЗ-целлюлозы в количестве 3-4 г на 1 г бедка, рН растворов 6,5-7,0.

Результаты проведенной работы позволили разработать двухэ-тапный метод удаления биологически активных веществ из препаратов иммуноглобулинов. Первый этап- заключался в добавлении различных количеств активированного бентонита созместно с гидроокисью алюминия на стации спиртового фракционирования (центри-фугат Б). Второй этап предусматривал очистку препаратов ионообменной хроматографией на стадии полуфабриката иммуноглобулинов.

Методы очистки внедрены в производство. Результаты сравнительного изучения представлены в таблице 10.

Как свидетельствуют данные таблицы 10 включение методов очистки позволило удалить из препаратов нестабильные крупномо-1 лекулярные комплексы, хорионический гонадотропин и групповые вещества крови, снизить содержание протеолитических ферментов. По этим показателям препараты, полученные из плацентарной сыворотки, приблизились к иммуноглобулинам, полученным из плазмы доноров. Исследование уровней активатора прекалликреина и изо-, агглютининов выявило, что содержание этих примесей не изменилось . Стадии очистки достоверно снижали содержание полимеров, они составляли (1,2+0,8) 7.. Несмотря на то, что по данным имму-

нозлектрофореза число белковых примесей имело тенденцию- к сокращения, это уменьшение носкло недостоверный характер (р>0,05).

Таблица 10

Содержание приыеоей в препаратах иммуноглобулинов. подученных спиртовым методом без очистки и со стадиями удаления крупномолекулярных комплексов и полимеров (п-57)

1 1 N |п/п 1 ■'-■'■- ■ — ■ Молекулярные формы и примеси 1 Ед- 1 тгоиап 1 ■ ■ ■ -............... 1 Содержание (М+га) |

ИоМс?р.} До обработки После обработки]

\ 1 Нестабильные г/100г|

кругогсномодекуляр- белка | 0,1 + 0,02 не обнаружены |

ные примеси

1 2 Хориокнческий МЕ/мл| 24,3 +1,6 1,2 + 0,2 |

гонад отрсшин*

1 з Групповые вещества обр. |

крови* титры |

А н 120 + 3,4 4,9 + 0,67 I

в 101 +0,7. . .1,2 + 0,2

I 4 Протеолитические мМ ти-| 0,07 + 0,22 0,03 + 0,02 " |

ферменты рогина)

I 5 Активатор МЕ/мл | 7,5 + 0,1 7,6 +0,2 . |

прекалликреина

1 7 Игоагглютинины**

альфа обр. | .4-16 4 - 16 1

бета титры ! 4-16 4-16

1 8 Полимеры % 1 5,8 + 0,6 1,2 + 0,8

1 9 Примеси других * 1 2,2 + 0,3 2,0 + 0,3 1

1 .._. белков 1-................... 1 , ". . 1 .......— ->

* - присутствовал в препаратах из плацентарной сыворотки

.** - присутствовали в, препаратах из донорской плазмы . •. Таким образом, решение этих задач позволило перейти к следующему этапу работа - очистке иммуноглобулинов от оставшихся полимеров и белковых примесей.

5.2. ПОЛУЧЕНИЕ МОНОМЕРНОЙ ФЭРМЫ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ДЛЯ

ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ ИЗ ФИЛЬТРАТА Б1

Согласно полученным данным, процесс очистки иммуноглобулинов спиртовым методом завершался на стадии фильтрата Б1. За этой стадией следовало концентрирование белка 26Х этанолом, получение пасты иммуноглобулинов и ее растворение.

По данным электрофореза на ацетате целлюлозы очищенная фракция содержала (97,3+0,6) % иммуноглобулинов (IgG) и около (2,7+0,6) 7. примесей других белков. Имкг/ноэдектрсфорез фильтрата В1 показал, что основными примесяш были IgA, IgM, альбумин и 1-2 неидентифицированных белка.

По зт1ш показателям фильтрат Б1 шел характеристики готового препарата иммуноглобулина. В то же время по молекулярному составу он выгодно отличался от готового препарата: количество димеров не превышало 5,07., (97,0+0,2)1 белков являлось мономерной фракцией IgG. Фильтрат содержал (0,5Я),1)% белка и 13% этанола.

Для сохранения в составе фильтрата.,мономерной. формы IgG необходимо было разработать условия очистки и подобрать технологические приемы, не приводящие к полимеризации молекул, что привело к необходимости решения следующих задач:

- 1) очистке мономерной фракции от белковых примесей;

2) разработке "мягких" условий концентрирования мономерной формы IgG; ,

3) изучению полученного препарата в соответствии с национальными требования»! и требованиями ВОЗ,

На первом этапе работы была исследована возможность глубокой счистки IgG непосредственно в содержащем спирт фильтрате. Предварительные опыты по изучению влияния различных фракционирующих агентов и коносбиенников на молекулярный состав препаратов при обработке цельной плазмы позволили установить, что наи. меньшее повреждающее действие' на; иммуноглобулин оказывает анио-нсобменник DEAE-сефадекс, который позволял проводить очистку IgG в спиртовых растворах при низких температурах.

На основе теоретических предпосылок (Л.А. Остерман, 1985),

были подобраны условия избирательного связывания с анионообмен-ником, а именно рН среды - 5,9-6,0, при котором различие в зарядах позволяло IgA, ]gM сорбироваться на DEAE-сефадексе , в то Еремя как IgG оставался в растворе. Степень очистки препарата от IgA IgM и потери основного белка IgG были связаны , к с количеством добавленного DEAE-сефадекса.

Оптимальными условиями очистки было добавление 0,3-0,5 г DEAE-сефадекса на 1 л фильтрата. Снижение содержания белка при этом не превышало 10Х, IgA и другие примеси не обнаруживались.

Таким образом, введение в спиртовым метод ионообменной хроматографии позволило получить IgS, очищенный от примесей •других белков.

"Бри разработке условий ультрафкльтрации фильтрата Б1 учитывалась номинальная молекулярная масса IgG, величина пор ультрафильтрационного половолококного аппарата, давление, при котором проводилась ультрафильтрация, скорость перемешивания, стабильность молекулярных форм IgG при кислом рН, ионная сила раствора. Ультрафильтрация позволила решить несколько задач: удалить из фильтрата Б1 этанол; освободить препараты от"солей и фрагментов; провести . концентрирование IgG. Ультрафильтрация проводилась в два этапа - диафильтрация и концентрирование белка до содержания 5,5-6,ОХ.

Удаление этанола и концентрирование IgG на стадии фильтра/ та Б1 ультрафильтрацией было апробировано в условиях производс-■• тва. Получено 12 серий препаратов иммуноглобулинов. Установлено, что данный способ не изменяет молекулярный состав препара-"J тов, по результатам хроматографии на сефадексе G-200 иммувогло-булины состояли на (94,2+1,4)1 из мономервой формы IgG, коли-5 чество дммеров (2,9+0,8)2 и фрагментов (2,9+0,7)7., полимерные / формы отсутствуют. В дальнейшем этот способ удаления этанола и концентрирования был включен в технологический процесс, как одна из стадий получения мономерной формы препарата.

. • ■< Для повышения вирусологической безопасности препарат прогревали при 27 0 С при рН 4,0-4,5 в течение месяца. Как показано ранее (G. Mitra et al.,1986), этот прием вызывает снижение ин-фекционности вируса иммунодефицита человека в 10000 раз. При

завершении инактивации в растворы добавляли стабилизаторы и хранили в холодильной камере при 4 0 С.

Таким образом, были разработаны основные этапы метода получения мономервой фермы иммуноглобулинов. Метод включает введение в классическую технологию фракционирования этанолом, очистку ионообменной хроматографией 1б6 от 1еА, и примесей белков неиммунной природы на стадии фильтрата Б1, удаление этанола и концентрирование мономерной формы ультрафильтрацией при кислых значениях рН. В процесс введена стадия инактивации вирусов и стабилизация иммуноглобулинов глюкозой. Препарат хранился при кислом значении рН для предотвращения агрегации. Метод отличался хорошей воспроизводимостью результатов, прост, технологичен. и не требовал особых дополнительных обработок препарата.

о. 3. ПОЛУЧЕНИЕ МОНОМЕРНОЙ ФОРШ Ш.ШНОГЛОБУЛШОВ ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ 113 ПАСТЫ ФРАКЦИИ II

Нами также разработан метод получения иммуноглобулинов для внутривенного введения из пасты фракции II. Метод включал проведение стадий спиртового фракционирования" по"варианту Б"до стадии центрифугата Б1очистку от белковых примесей иммуноглобулинов центрифугата Б1 с помощью ДЕАЕ-сефадекса, получение пасты иммуноглобулинов, удаление полимеров и денатурированных белков при растворении пасты иммуноглобулинов в водных растворах с низкой ионной силой, диссоциацию димерных форм при слабокислом значении " рН, удалении этанола и концентрирования белка иммуноглобулинов ультрафильтрацией.

В отличие от метода получения мономерной формы непосредственно из центрифугата Б1, получение препарата такого состава, не было гарантировано при наличии этапа осаждения 26% . ! этанолом. В связи с этим была введена стадия дополнительной очистки иммуноглобулинов. Метод основан на низкой растворимости денатурированных, белков- в. водных, растворах с низкой ионной силой. Пасту иммуноглобулинов растворяли в водном растворе с ионной силой 0,01-0,05, при рН 6,8-7,2. 1 кг пасты суспендировали не менее чем в 5 литрах-растворителя. Содержание белка при этом'

- за -

устанавливалось не более.5,01. Нерастворивишеся белки отделяли от раствора иммуноглобулинов осветляющей и стерилизующей фильтрацией. Осадок денатурированных белков вновь удаляли фильтрацией. Очищенный раствор иммуноглобулинов использовали для приготовления иммуноглобулинов для внутривенного или внутримышечного введения. .

Иммуноглобулины для внутривенного введения получали в три этапа. На первом этапе иммуноглобулины разводили восьмикратным ■ обьемом воды. Диссоциацию димеров на мономеры проводили измене- . нием рН среды до 4,25. Затем остаточный этанол удаляли ультра--, фильтрацией. Белок концентрировали 'до содержания 5,5 - 6,01,, полученный раствор подвергали стерилизующей фильтрации. На втором-этапе раствор прогревали при 27° С в течение одного месяца. На третьем этапе в раствор иммуноглобулинов в качестве стабилизатора вносили глюкозу до содержания 7,0 подвергали стерилизующей фильтрации и разливали препарат в бутылки.

5.4. ПОКАЗАТЕЛИ КАЧЕСТВА ИММУНОГЛОБУЛИНОВ И ОСНОВНЫЕ КРИТЕРИИ ДОПУСКА ИХ К ПРИМЕНЕНИЮ

В условиях производства получено 12 экспериментальных серий мономерной формы иммуноглобулинов из фильтрата Б1 и 47 из пасты фракции II. -

Иммуноглобулины были подвергнуты анализу по тестам, принятым для внутривенных препаратов ВОЗ (Материалы ВОЗ, 1992), Российским фармакопейным комитетом (ФС 42-3159-95), а также для препаратов ряда зарубежных фирм.

Детально изучался состав препарата, его активность, безопасность in vitro. Согласно полученным данным иммуноглобулины представляли растворы с содержанием, белка (5,1 + 0,1), были электрофоретически однородны, по данным иммуноэлектрофореза они не содержали примесей других белков.

- При крнструировании препаратов учитывалась возможность их введения больным с дефицитом IgA, которые чувствительны к присутствию данного белка. Препараты не содержали IgA. Для стабилизации молекулярного состава иммуноглобулин хранился в раство-

ре при значении рН 4,3, что позволило исключить из препарата различные "белковые стабилизаторы, такие как альбумин (J. Romer et al., 1982).

Опыт' применения препаратов с кислым рН, изложенный в работе (R. Schwartz, 1987), позволил сделать вывод о возможности введения препаратов с кислым рН непосредственно в кровяное русло. Полагают, что основную роль при внутривенном введении иммуноглобулинов играет не рН раствора, а буферная емкость, которую можно определить титрованием растворов (J.McCue et al.,1986). По нашил данным иммуноглобулин'для внутривенного введения имел небольшую буферную емкость. Нудно также отметить, что существует многолетняя практика введения больших объемов глюкозы с рН 3,0 без побочных реакций.

В препаратах, полученных из фильтрата Б1, свыше (94+1,4)X, а из. пасты фракции II более (98+0,1) Z, составляли мономеры IgG и от 0" до 6% - димеры.

Препараты полностью соответствовали требованиям ВОЗ и России к иммуноглобулинам для внутривенного введения по молекулярному составу, они не содержали полимеров В то время, как иммуноглобулины, Полученные одновременно из "тех же пулов плазмы классическим спиртовым методом, содержали: (1,3+0,4) 7. полимеров, (21.9+3,9) % димеров, (75,4+4,6) Z мономеров, и (1,4 +0,4) I фрагментов, то есть существенно отличались от препаратов, полученных разработанным нами методом.

Для стабилизации иммуноглобулинов для внутривенного введения использовали глюкозу. Ее содержание в препарате составляло около 7,0 %. Это количество позволяло, даже'при хранении растворов при комнатной температуре в течение нескольких месяцев, поддерживать стабильность молекулярного состава и физико-химических свойств кгмуног.тобудинов для внутривенного введения. Препараты представляли прозрачные, бесцветные растворы.

Иммуноглобулины для внутривенного введения являлись поли-антительныш концентратами. . Широкий спектр антител и стандартность обеспечивалась тем, что исходным материалом служила "плазма, получаемая не менее чем от 2000 доноров. Благодаря щадящему способу фракционирования" антитела оставались нативныш, с прей-

мужественным содержанием в составе препаратов мономерной .формы IgG. Иммуноглобулины для внутривенного введения содержали антитела против вирусов и бактериальных токсинов. Согласно рекомендациям BOG и национальным требованиям препараты подлежали обязательной проверке на содержание одного противовирусного и одного антибактериального антитела. Критерием допуска к применению препаратов является показатель 8-кратной концентрации антител по сравнению с плазмой. Российские требования устанавливают также минимально допустимый уровень антител к антиальфастафило-лизину не менее 2 ME/мл, кори 25 МЕ/мл. Этим показателям полностью- отвечали иммуноглобулины для внутривенного введения по- . лученные двумя методами. Кроме того, экспертами ВОЗ рекомендовано определять уровень антител к HBs-антигену. Препараты по уровню HBs-аатйтел отвечали требованиям ВОЗ (1,0 МЕ/г белка).

Наряду с этим испольаовались и три специальных метода контроля оценки переносимости иммуноглобулинов для внутривенного введения in vitro: определение гипотензивной и антикомплементарной активности, установление уровня содержания изоагглю-тининов. Показателем гипотензивной активности является установление в препаратах^ содержания активатора прекалликреина. Эксперты ВОЗ (Материалы ВОЗ, 1992) сочли целесообразными включить этот показатель, в качестве одного ив основных критериев оценки реактогенности иммуноглобулинов для внутривенного введения. В препаратах полученных обоими методами уровень активатора прекалликреина был незначителен и составлял не более 4,0 МЕ/иж. Это в несколько раз ниже его содержания в. плазме. По этому показателю полученный препарат был близок к иммуноглобулинам для внутривенного введения, выпускаемым рядом зарубежных фирм (М. Eibl, et al., 1984).

Известен факт, что нежелательное , воздействие агрегатов igG вызывает у больных активацию комплемента. Корреляция уровня ан-тикомплементарнои активности и клинической безопасности является предметом обсуждения (S. Mankarious, I.. Hooper 1988) и может быть оценена в дальнейшем. Часть исследователей полагает, что уровень антикомплементарной активности иммуноглобулинов in vitro будет иметь эначение, как прогностический параметр побочного

действия in vivo. Конкретные показатели антикомплементарной активности не установлены (Материалы ВОЗ, 1992), но у различных препаратов, производимых в мире, они существенно отличаются (J. Raner et al., 1982). Эти различия могут достигать более одного порядка. Критерием допуска к применению препаратов служат клинические показатели. Антикомплементарная активность полученных нами иммуноглобулинов, составляла от 5 до 10 мг. Все полученные нами нативные препараты соответствовали требованиям Европейской фармакопеи.

Иммуноглобулины были очищенны от изоагглютининов, их титры не превышали 1:16. Согласно требованиям Европейской фармакопеи допустимый уровень изоагглютининов А и В должен быть не более 1:32. :

Проверка стерильности иммуноглобулинов яа анаэробные и аэробные микроорганизмы подтвердили, что все espira препаратов были стерильны. Биологическое тестирование на .тавотных, пироген-ности на кроликах, токсичности на морских свинках и белых мышах показало, что иммуноглобулин апирогенен и нетоксичен.

, Методом КФА показано, что в них отсутствует HBs-аятиген и антитела к вирусу иммунодефицита человека.

Таким образом, комплексная проверка показала, что препараты соответствуют требованиям предъявляемым - к иммуноглобулинам для внутривенного введения. Они представляли злектрофоретически однородные 5%-нне растворы IgG с рН 4,3; свызе 94% которых составляли мономеры IgG. Прозрачные и бесцветные растворы препаратов содержали в качестве стабилизатора глюкозу, сохранены защитные свойства препаратов - антитела против вирусов и бактерий. Проверка безопасности препаратов позволила установить, что иммуноглобулины ямеля низкое содержание активатора прекалликре-ина, изоагглштиников. Антакошиементарная активность соответствовала уровпз для маломерных форд иммуноглобулинов. Препараты были апирогеннн, безвредны, не токсичны и безопасны в отношении передачи траксызтссившх инфекций.. ' • ......

Разработанные метода получения и очистки иммуноглобулинов вошли в:

1. Экспериментальна?- производственный регламент. на иммуно-

глобулин протнвоботудинический для внутривенного введения N 310-91, утвержден 27.04.1991 г.( К.Б. Адъбицкая и др.)

2. Регламент производства иммуноглобулинов для внутримышечного введения человека нормального, утвержден 11.07.1995 г. (¡O.K. Пискарева и др.)

3. Регламент производства на иммуноглобулин для внутривенного введения человека нормальный, утвержден 3.02.1995 г.

4. Изменения N 4 к регламенту производства иммуноглобулина для внутримышечного введения человека нормального " Дополнительная очистка иммуноглобулина от денатурированных белков, по^ лимеров и нестабильных примесей". Утвержден 12.03.1997 г. (Е.И. ~ Кузьмина, Ю.К. Пискарева).

5. .Изменения N 1 к регламенту производства иммуноглобулинов для внутривенного введения "Дополнительная очистка иммуноглобулинов от денатурированных белкоЕ, полимеров и нестабильных примесей. Удаление остаточного этанола ультрафильтрацией, утвержден 24.03.1997 г.(Е.И. Кузьмина и др.)

Разработанные методы контроля и показатели качества препаратов иммуноглобулинов вошли - в:

. . 1. Методически? рекомендации "Определение антикомплемент тарной активности препаратов иммуноглобулинов"/ г. Горький.-1988.- (И.А. Киселева и др.).

2. Временную фармакопейную статью ВФС 42-284 ВС-91 от 2.04. 1991 г. На иммуноглобулин противоботулинический человека для внутривенного введения (Н.Б. Альбвдкая н др.)

. 3. Временную фармакопейную стать» BSC 42-2854-97 от 11.03.1997 г. на иммуноглобулин человека антистафилококковый для внутривенного введения (С.Л: Шарыгин, Г.А. Матвеев)..

4. Фармакопейную статью ФС 42-31-59 от 3.10.1995 г. на • иммуноглобулин для внутривенного введения человека нормальный

Таким образом, в результате проведенных исследований разработан новый регламент кислотно-ферментативной технологии производства антибактериальных, антитоксических и противовирусных иммуноглобулинов для внутривенного введения как направленного действия, так и полиспецифических.

Завершены доклинические испытания новой лекарственной формы

иммуноглобулинов для внутривенного введения. .........ВЫВОДЫ.

1. Комплексные исследования препаратов иммуноглобулинов, полученных спиртовым методом по варианту Б позволили установить молекулярный состав и идентифицировать белковые и биологически активные примеси. По биологическому действию и влиянию на физико-химические свойства белки и примеси подразделены на две группы. К цервой группе отнесены мономеры и димеры -молекулярные формы являющиеся основой иммунологического действия

' препарата. Вторую группу составляли примеси, ухудшающие качество препаратов и являющиеся причиной побочных реакций - это нестабильные крупяошаекулярные комплексы, полимеры устойчивые в растворе примеси других белков, биологически активные соединения и продукты расщепления иммуноглобулинов.

2. Мзучен механизм взаимодействия белков в процессе фрак. цгакирования. Установлены стадии спиртового метода фракционирования влияющие на содержание в конечном препарате нестабильных крупномолекулярньк комплексов,, полимеров, димеров и белковых примесей.

3. Определены условия разрушения белковых примесей, полимеров пепсином - рН, темлературз, время и концентрация фермента, позволяющие проводить очистку с сохранением биологической активности иммуноглобулинов.

4. Разработан нобый производственный вариант кислотно-ферментативного метода получения иммуноглобулина для внутривенного введения. В технологическую схему введена стадия предварительной очистки иммуноглобулинов от полимеров и нестабильных бел-, ков, позволившая исключить влияние этих примесей на физико-химические'свойства препарата на последующих стадиях. Стадия удаления остаточного этанола лиофидизацией заменена на ультрафйль-

- трацют.. Условия ущ>трафильтрации позволили совместить процесс удаления этанола с одновременной корректировкой рН и исключить из технологической схемы ряд операций. Усовершенствование технологии сократило технологический цикл производства и снизило

потери конечного продукта (регламент производства от 28. 12. 94 г., изменения N 1 к регламенту от 12.03.97 г.).

5. Введены дополнительные методы контроля и расширены показатели качества иммуноглобулинов для внутривенного введения, в части допустимого содержания антител, вирусологической безопасности сырья и препарата, физических свойств, содержания стабилизаторов (ФС 423159-95).

6. Разработаны условия получения и требования к иммуноглобулинам для внутривенного введения противоботулиническому (Авт. св. К 1510156, ВФС 42-284 ВС-91 от 2.04.91 Г., регламент N 310 -91 от .27.04.90 г.), антистафилскокковому (BSC 42-2854-97 ■ "от 11.03.97 г.), противогерпегическому и против вируса-краснухи.

7. Разработаны три варианта технологии, позволяющие удалять нестабильные крупншояекулярныэ комплексы полимеры и биологически активные примеси из препаратов иммуноглобулинов: во-первых, посредством перевода основного компонента комплекса - липопротеидов в агрегированную - форму в условиях близкой к изоэлектрической точке, добавлением этанола на стадии полуфабриката иммуноглобулина; во-вторых, включение в процесс основного фракционирования донорской плазмы дополнительной стадии отделения крупномолекулярных - комплексов от иммуноглобулина в условиях изоэлектрической точки липопротеидов; в-третьих, для сырья контаминированного хорионнческим гонадотропином, проведение стадии удаления крупномолекулярных комплексов в сочетании с адсорбцией биологически активных веществ (регламент производства от 11.07.95 г., изменения К 4 от 12.03.97 г., авт. св.

N 1381774, N 1403414).

8. Разработаны два варианта метода получения мономерной формы иммуноглобулинов, из фильтрата Б1 и пасты фракции II, включающие очистку от денатурированных белков, полимеров и других примесей ионообменной хроматографией в процессе спиртового фракционирования плазмы крови доноров, дополнительную обработку полуфабриката иммуноглобулинов в водных., растворах с .низкой жи-

' ной силой с последующем концентрированием белка в слабокислой среде ультрафияьтрацией. -

9. Комплексная проверка препаратов нового поколения по

тестам принятым Российским Фармакопейным Комитетом, рекомендациям ВСй позволила установить, что они полностью соответствуют требованиям, предъявляемым к иммуноглобулинам для внутривенного введения. Препараты иммуноглобулинов представляли электрофоре-тически однородне 5 % растворы с рН 4,3+0,1, свыше 94 X белка составляли мономеры. Препарат содержал в качестве стабилизатора глюкозу. Сохранялись -защитные свойства препаратов -антитела против вирусов и бактерий. Проверка безопасности в соответствии с принятыми критериями показала, что иммуноглобулины имели низкое содержание активатора прекадликреяна, изогемагглю-тининов. Антиксмплементариая активность соответствовала уровню характерному для шномёрной формы иммуноглобулинов. Лекарственные формы препаратов при проверке на животных были апирогенны, безвредны, не токсичны.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТШЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Альбицкая Н.В., Синельникова Г.Е., ЩипковаЛ.Г., Анастасией В.В. и др. В сб. Актуальные вопросы медицинской биотехнологии й прикладной иммунологии.-Томск.-1990.-С.-66-69.

2. Анастасиев В.В. Зависимость антикомплементарной активности и структурных изменений иммуноглобулинов от методов их получения. В сб. Иммуноглобулины и другие препараты крови.-Л.-1976.-С.55-61.

3. Анастасиев В. В., Киселева И.А., Новикова Л.П. и др. Получение из плазмы крови доноров иммуноглобулина для внутривенного введения. Гематология и трансфузиопогия.-1985.-10.-С.-46-48.

4. Анастасиев В.В..Киселева И.А., Сергеева И.В. и др. Очистка иммунбглобулша для внутривенного введения от геыпиг-мента и хорионического гонадотропина.-Гематология и трансфузио-логия.-1985.-М б.-С.-60-62. •

, ; -'5. Анастасиев В.В:, Киселева И.А., Ногичева М.А.■ и др.- • Получение иммуноглобулинов для внутривенного введения свободных от биологически активных примесей. В сб. Иммуноглобулины и другие препараты крови.-Горький.-198б.-С.-10-15.

6. Анастасиев B.B., Асгващтрян А.З., Х<оаодовская Э:В. и др. Стабилизация структуры препаратов иммуноглобулинов, В сб. Научно-производственные проблемы повышения качества вакцинн-но-сывороточных препаратов.-Ташкент.-1987 -С.-101-102.

7. Анастасиев В.В.. Зубов C.B., Маслова Г.А.и др. Уровень антител к иммуноглобулину гепатита В и наличие HBs-антигена в технологических растворах на разных - стадиях производства иммуноглобулинов. В сб. Препараты крови для лечения профилактики заболеваний человека.-М.-1989.- С.-17-19.

8. Анастаскев В.В., Ногичева М.А., Маслова Г.А. и др. Иммунологическая характеристика'препаратов иммуноглобулинов, полученных промышленными способами фракционирования. В сб. Регуляция биологических систем. -Горький.-1990.- С. 58-63.

9. Анастасиев В.В., Киселева И. А., Немов В. В. Зависимость функциональных особенностей иммуноглобулина от молекулярного состава. В сб. Тезисы докладов 3 съезда иммунологов России.- Новосибирск.-1992.-С.- 23-24.

10. Анастасиев В. В. Разработка молекулярных моделей процесса фракционирования иммуноглобулинов. В сб. Иммуноглобулины. -Н.Новгород.-1993.-С.-45-50. ... . . J

11. Анастасиев В.В. Применение иммуноглобулинов.-Н.Новгород. т1993.- 26 С.

12. Анастасиев В.В., Десяткова Р.Г., Маслова Г.А. и др. Получение иммуноглобулина против вируса "краснухи. В сб. Имьсуног-лобулины.-Н. Новгород.-1993. -С. -95-98.

13. Анастасиев В.В., Мальцева И.Н., Маслова Г. А. и др. Получение, физико-химические и биологические свойства иммуноглобулина против вируса простого герпеса. В сб. Иммуноглобулины.-Н.Новгород.-1993.-С. 92-95.

14. Анастасиев В.В., Наумова O.K., Квасова Н.К. и др. Новые подходы к созданию внутривенных препаратов иммуноглобулинов. В сб. Предараты крови и кровезаменители - производство, контроль, клиническое применение.-Киров.-КНИИПК.-1995.-С.' 18-19.- •

15. Анастасиев В.В., Кузьмина Е.К., Крайнова Т.А. к др.Соз-. дание нового поколения препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения. Тезисы докгадов IY Российского национального

конгресса "Человек и лекарство", 8-12 апреля 1997. -М.- РЦ Фарме-динфо.- 1997.-С. 244.

16.. Блохина И.Н., Киселева И.А., .Анастасиев. В.В. и др. Удаление биологически активных примесей из препаратов иммуноглобулинов,- 2МЭИ.-1985.-2.-С.65-68.

17. Воробьева В.А., Шиленок Й.Г., Азова" Е.А., Анастасиев

B.В. и др. Иммуноглобулин человеческий для внутривенного введения при лечении инфекционно-воспалительных заболеваний у де-тей.-Педиатрия.-1990.-N.8.- С.-74-78.

18. Воронин А.И., Нёлюбин A.C., АвастасиевВ.В. Исследование спектрально-люминесцентных характеристик препаратов IgG. В сб. Биохимия и биофизика микроорганизмов.-Горький.-1977.-С. 106110;

19. Киселева И.А'., Анастасиев В.В..Толок А.Я. Биохимические аспекты получения иммуноглобулина для внутривенного введения. В сб. III Всесоюзного биохимического съезда.-Рига.-1974.-N. 2-

C. 287

20. Киселева И.А., Пикин Н.И., Анастасиев В.В. Первый опыт применения антистафилококкового иммуноглобулина для внутривенного введения в глазной хирургии."В сб. тезисы научной сессии' НИИ им Склифосовского.-М.-1975.- С.

21. Киселева И.А., Анастасиев В.В., Чадаев В.А. и др. Производственный метод получения препаратов ; -:>длу коп лоб удина для внутривенного введения, разработанный в Горькозскш НИЗ?-,'. В сб. Препараты нормальных и специфических иммуноглобулинов человека.-М. -1976.-С.-44-49.

22. Киселева И.А., Анастасиев В.В., Чадаев В.А. и др. Особенности получения иммуноглобулина для внутривенного введения. В сб. Иммуноглобулины и другие препараты крови.-Л.-1976.-С.-47-54. ' ...

23. Киселева И.А., Анастасиев В.В., Чадаев В.А. и др. Иммуноглобулин нормальный человеческий для внутривенного введения.-. 8. сб. Руководство по- вакцинному-, и .■ сывороточному делу. -М.-1978.-С. -349-353. '. ' "

24. Киселева И.А., Анастасиев В.В. Сравнительное изучение молекулярного составами иммунологических свойств иммуноглобули-

ков.- В сб. Тезисы научных сообщений Всесоюзного биохимического съезда.-М.-1979.-Т. 3.-С.120.

25..Киселева К.А., Анастасиев 8.В. Изменение структуры н функциональной^ активности а в зависимости от интенсивности гидролиза пепсином. В сб. Очистка и стандартизация препаратов крови человека.-М.-1979.-С.-55-60. ^

26. Киселева И.А., Анастасиев В.В. Изучение биологически активных примесей в иммуноглобулинах и возможности их очистки. В сб. Биохимия и биофизика микроорганизмов.-Горь-кий.-1981.-С.-96-101.

27. Киселева И.А., Анастасиев В.В. Иммуноглобулин для внутривенного введения и возможность его клинического применения. В сб. Современные вопросы Трансфузиологии.-Горький.-1981.-С.-48-49.

28. Киселева И.А., Анастасиев В.В,, Немов В.В. Структура и свойства иммуноглобулина для внутривенного введения. В сб. Препараты крови.-Горький.-1981.-С.17-23.

29. Киселева И.А., Анастасиев В.В. Получение и характеристика иммуноглобулина для внутривенного введения. В сб. Лечебные

.препараты белков плазмы крови.-М,-1981.^С.-115-121. -■ ■

30. Киселева И.А., Толок А.Я., Анастасиев В.В. Обоснование и разработка методов получения различных препаратов иммуноглобулина. В сб. Фракционирование крови. Тезисы докладов на Всесо-юзн. совещ;-М.-1981.-С. 127.

31. Киселева И. А., Савкина М.А., Анастасиев В.В.и др. Разработка технологии получения очищенных препаратов иммуноглобулинов. В сб. Актуальные вопросы биотехнологии: Материалы Всесо-юзн. конф.-М.- 1987.-е.- 67.

32. Киселева И.А., Анастасиев В.В., Савкина М.А. и др. Рациональное использование иммунного .потенциала сыворотки при создании технологий получения ареактогенных препаратов иммуноглобулинов. В сб. Препараты крови для лечения и профилактики заболеваний человека. -М.-1989. -С 51-57. '• - - • ■

33. Кульберг А.Я., Бартова Л.М.,. Анстасиев В.В. и др. Отсутствие активности К-белков в препаратах коммерческого иммуноглобулина. - Иммунология.-1990.-К.2.-С.-24-25.

34. Никифоров В. H., Перельман М.И., Киселева И. А., Анастасов В.В. Результаты испытания терапевтической эффективности иммуноглобулина для внутривенного введения. В сб. Иммуноглобулины и другие препараты крови.-Л.-1976.-С.-62-65.

35. Никифоров В.Н., Киселева Л.А., Анастасиев В.В. и др. Опыт применения антистафилококкового иммуноглобулина при лечении тяжелых форм раневой инфекции.В сб. I Всесоюзя. конф. по ранам и раневым инфекциям.-М.-1977.-С.-276-277.

36. Определение антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулинов. Методические рекомендации. - Киселева И.А., Анастасиев В.В., Мипакова Л. В., Лаптева Л. К.'- Горький,-1988.-12 С.

.. 37. Савкина М.А., Киселева И.А., Анастасиев В.В. Использование методов хроматографии для очистки иммуноглобулина от биологически активных примесей. В сб. Хроматография в биологии и медицине.-М.-1983.-С.34.

38. Савкина М. А., Анастасиев В.В., Киселева И. А. и др. Усовершенствование технологии получения иммуноглобулинов. В сб. Научно-производственные проблемы повышения качества вакцин-но-сывороточных препаратов.-Ташкент.-19S7.-С.74- 75.

39. Киселева И.А., Савкина М.А., Анастасиев В.В. Способ получения иммуноглобулина. Авторское свидетельство N 1381774.-15. И. 1987.

40. Киселева И.А., Анастасиев В.В., Савкина М.А. Способ получения иммуноглобулина из сывороток плацентарной и абортной Авторское свидетельство N 1403414.-15. 02. 1988.

41. Альбицкая Н.В., Синельников Г.Е., Никифоров-В. Н., Щип-коваЛ.Г., Анастасиев В.В., Вешкурцева C.B. Способ получения противоботулинкческого иммуноглобулина человека. Авторское свидетельство N 1510156.-22. 05. 1989.