Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование детектора многоуглового лазерного светорассеяния для анализа состава и молекулярно-массового распределения в лекарственных средствах на основе полисахаридов и белков крови

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Использование детектора многоуглового лазерного светорассеяния для анализа состава и молекулярно-массового распределения в лекарственных средствах на основе полисахаридов и белков крови"

на правах рукописи

Флегонтов Павел Алексеевич

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЕТЕКТОРА МНОГОУГЛОВОГО ЛАЗЕРНОГО СВЕТОРАССЕЯНИЯ ДЛЯ АНАЛИЗА СОСТАВА И МОЛЕКУЛЯРНО-МАССОВОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВАХ НА ОСНОВЕ ПОЛИСАХАРИДОВ И БЕЛКОВ КРОВИ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

4 ДЕК 2014

005556259

Москва - 2014

005556259

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Гематологический научный центр» Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Карякин Александр Вадимович, профессор, доктор биологических наук, заведующий отделом экспертизы, контроля и изучения качества, эффективности, безопасности средств трансфузионной и инфузионной терапии Федерального государственного бюджетного учреждения «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Официальные оппоненты:

Мазуров Алексей Владимирович, профессор, доктор медицинских наук, заведующий лабораторией клеточной адгезии Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Брусов Олег Сергеевич, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией клинической биохимии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр психического здоровья» Российской академии медицинских наук

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича»

Защита диссертации состоится «25» декабря 2014 года в 15.00 на заседании диссертационного совета Д 208.135.02 при ФГБУ ГНЦ Минздрава России по адресу: 125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ ГНЦ Минздрава России

Автореферат разослан « ю

»

Ученый секретарь диссертационного со доктор медицинских

Буланов Андрей Юльевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Важной характеристикой биополимеров полипептидной и полисахаридной природы является молекулярная масса (ММ). В настоящее время приоритетным методом определения молекулярной массы биополимеров является эксклюзионная хроматография. Её используют в сочетании с ультрафиолетовым детектором для анализа растворов белков [J.S. Philo, 2006; J.Wen, T.Arakawa, 1996], а для полисахаридов - с рефрактометром [S. Podzimek, 2011]. При наличии стандартов с помощью этого метода удается с высокой точностью определить значение молекулярной массы молекул биополимеров.

В последние годы для определения молекулярно-массового распределения (ММР) биополимеров начинает применяться эксклюзионная хроматография с детектором многоуглового лазерного светорассеяния (МУЛС) [Gaborieau, P. Castignolles, 2011, S. Podzimek, 2011]. Данный метод не требует использования аттестованных стандартов полидисперсных молекул, кроме того, использование детектора МУЛС позволяет в любой точке хроматографической кривой рассчитывать среднюю ММ высокополидисперсных биомолекул (в том числе полисахаридной природы и их химически модифицированных продуктов), для которых установлено, что из-за особенностей состава положение максимума пика на хроматограмме не характеризует значение средней ММ биополимера [Е. Folta-Stogniew, R.K. Williams 1999; M. Gaborieau, P. Castignolles, 2011; S. Podzimek, 2011]. Данные преимущества метода эксклюзионной хроматографии с детектором МУЛС (ЭХ-МУЛС) обуславливают перспективность его применения и внедрения для изучения ММР молекул биополимеров. В то же время в Российской Федерации данный метод для контроля качества лекарственных средств белковой и полисахаридной природы не применяется, не смотря на то, что все биополимеры нормируются по показателям ММР (полисахариды и их химически модифицированные продукты) или молекулярного состава (белки). В случае белковых растворов не определены ММ и значения полидисперсности фракций полимеров и агрегатов, содержание которых нормируется и служит определяющим показателем качества препаратов на основе альбумина и иммуноглобулинов. В связи с этим разработка и внедрение современных методик определения ММ белков и характеристик ММР полисахаридов является актуальной задачей.

Цель исследования

Совершенствование методик определения молекулярной массы и характеристик молекулярно-массового распределения в лекарственных средствах на основе биополимеров с помощью эксклюзионной хроматографии с использованием детектора многоуглового лазерного светорассеяния.

Задачи исследования

1. Обоснование необходимости обязательного применения детектора многоуглового лазерного светорассеивания при анализе полидисперсных биополимеров на основании исследования молекулярно-массового распределения декстрана (полисахарид) и гидроксиэтилкрахмала (химически модифицированный полисахарид) с помощью эксклюзионной хроматографии.

2. Валидация методики определения молекулярно-массового распределения в препаратах на основе гидроксиэтилированного крахмала эксклюзионной хроматографией с детектором многоуглового лазерного светорассеяния.

3. Разработка методики определения молекулярной массы и характеристик молекулярно-массового распределения в белковых препаратах с помощью метода эксклюзионной хроматографии с детектором многоуглового лазерного светорассеяния.

4. Определение молекулярных параметров и коэффициентов полидисперсности белковых фракций препаратов Альбумина и Иммуноглобулинов с помощью разработанных методик.

5. Разработка проекта Общей Фармакопейной Статьи «Определение молекулярно-массового распределения в препаратах на основе гидроксиэтилированного крахмала» с целью включения метода в Государственную Фармакопею Российской Федерации.

Научная новизна

1. Экспериментально обоснована необходимость использования детектора многоуглового лазерного светорассеяния в эксклюзионной хроматографии для исследования молекулярно-массового распределения полидисперсных биополимеров.

2. Впервые показано, что высокомолекулярные фракции растворов альбумина (полимеры и агрегаты) обладают полидисперсностью, что затрудняет их количественное определение хроматографическим методом с

применением ультрафиолетового детектора. В растворах иммуноглобулинов выявлена полидисперсность у высокомолекулярных фракций.

3. Определены молекулярные массы и среднеквадратичные радиусы молекул высокомолекулярных фракций иммуноглобулинов и альбумина.

Практическое значение

1. Метод эксклюзионной хроматографии с использованием детектора многоуглового лазерного светорассеяния используется в Испытательной лаборатории ФГБУ Гематологического научного центра МЗ РФ для подтверждения соответствия субстанций и кровезаменителей на основе гидроксиэтилкрахмала.

2. Подготовлен и представлен в Министерство Здравоохранения Российской Федерации проект Общей Фармакопейной Статьи «Определение молекулярно-массового распределения в препаратах на основе гидроксиэтилированного крахмала» с целью включения метода в Государственную Фармакопею Российской Федерации.

3. Разработана методика количественного определения содержания полимеров и агрегатов в белковых препаратах, учитывающая светорассеивание полидисперсных высокомолекулярных фракций.

4. Данные по определению молекулярных масс и размеров олигомеров высокомолекулярных фракций препаратов альбумина можно использовать для разработки методов удаления полимеров и агрегатов из лекарственных форм с помощью нанофильтров.

Основные положения, выносимые па защиту

1. Влияние структуры применяемых калибровочных стандартов и полидисперсности анализируемых образцов на результаты хроматографического определения средней молекулярной массы (М„) и молекулярно-массового распределения гидроксиэтилированного крахмала с рефрактометрическим детектором;

2. Дополнение хроматографической системы детектором многоуглового лазерного рассеивания позволяет определять молекулярно-массовое распределение гидроксиэтилированного крахмала с надлежащей точностью;

3. Возможность прямого определения диапазонов варьирования молекулярных масс и среднеквадратичных радиусов молекул высокомолекулярных фракций препаратов альбумина и иммуноглобулина.

Апробация работы

Диссертационная работа апробирована 3 октября 2013 года на заседании проблемной комиссии «Проблемы донорства, производства и контроля качества компонентов и препаратов крови» в Федеральном государственном бюджетном учреждении Гематологический научный центр Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Основные результаты работы докладывались и обсуждались на следующих российских и международных конференциях:

1. 7-th International Meeting Plasma Product Biotechnology (Paphos, Cyprus, May 9-13, 2011);

2. 1-ая научно-практическая конференция «Технология и анализ косметических средств и фармацевтических препаратов (Москва, 2011);

3. Международная научно-практическая конференция «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 20-22 марта 2012);

4. Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых с международным участием «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Епифановские чтения) (Киров, 2-3 октября 2012);

5. 16-ый конгресс с международным участием «Парентеральное и энтеральное питание» (Москва, 14-15 ноября 2013).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 2 публикации в сборниках статей и 9 тезисов в материалах отечественных и международных конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы (195 наименования). Работа изложена на 128 страницах, включая 16 рисунков, 31 таблицу и одно приложение.

Материалы и методы исследования

В работе использовали коммерческие образцы отечественных и зарубежных производителей в пределах сроков годности: 12 серий субстанций и препаратов ГЭК производства ОАО Биосинтез, ООО Компания Вилана, Аджиномото Ко. Инк, Япония; Вухан Хуст Лайф Сайенс энд Текнолоджи Ко. Лтд, Китай, Зерумверк Бернбург АГ, Германия, Б. Браун Мельзунген АГ, Германия, Фрезениус Каби Дойчланд ГмбХ, Германия, 5 серий субстанций и препаратов декстрана производства ОАО «Биохимик», Фармакосмос А/С, Дания, Шанхай Хуамао Фармасьютикал Ко., Лтд, Китай,

29 серий препаратов альбумина производства Тамбовской, Липецкой ОСПК, СПК ДЗ г. Москвы, Бакстер АГ, Австрия, Биотест Фарма ГмбХ, Германия, Октафарма Фармацевтика Продуктионсгес мбХ, Австрия и 41 серию препаратов иммуноглобулинов производства ФГУП НПО «Микроген», ЗАО «Иммуно-Гем» Ивановской, Самарской ОСПК, Нижегородского ОЦК им. Н.Я. Климовой, Октафарма Фармацевтика Продуктионгес мбХ, Австрия, Октафарма Аб, Швеция, Камада Лтд., Израиль, Биотест Фарма ГмбХ, Германия.

Для разделения образцов использовали хроматографическую систему с изократическим насосом Smartline 1000, дегазатором и инжекторами с петлей объемом 20 и 100 мкл, Knauer, Германия.

Образец каждой серии субстанции и препарата анализировали не менее 3 раз. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Excel. Достоверность различий между группами оценивали с использованием t-критерия для двух независимых выборок. Результаты считали статистически значимыми при р <0,05. Все данные представлены в виде средних значений и величины стандартного отклонения.

Определение молекулярно-массового распределения в препаратах на основе полисахаридов

I. Определение ММР методом ЭХ-МУЛС.

Для анализа субстанций и препаратов ГЭК использовали хроматографическую систему с петлей инжектора объемом 100 мкл и последовательно соединенных колонок TSKgel 5000PW/5000PW/3000PW, Tosoh Bioscience, Япония, подвижная фаза 0,05 М раствор натрия нитрата с 3 мМ натрия азидом, скорость элюции 0,8 мл/мин и два детектора - МУЛС и дифференциальный рефрактометр (ДР). Нормализация детектора МУЛС по декстрану с ММ 5 кД.

Для построения кривой светорассеяния использовали координаты Зимма. Расчет средних значений ММ - среднечисловой (М„), среднемассовой (Mw) и молекулярной массы вершины пика (Мр) - осуществляли в автоматическом режиме с помощью программного обеспечения Astra 5.3.4.14 (Wyatt Technology, США). Определение ММ низко- и высокомолекулярных фракций осуществляли во вкладке «Анализ распределений» по точкам на кривой ММР, соответствующим 10% (м?низ) и 90% (м^ыс) образца и для фракций 0 - 10% (Mw вш) и 90 - 100% (Mw выс).

Вапидацию методики ЭХ-МУЛС проводили в соответствии с руководством по валидации аналитических методик Q2(R1) международной конференции по гармонизации по показателям: специфичность,

воспроизводимость, точность, линейность, диапазон применения, робастность.

II. Определение ММР методом эксклюзионной хроматографии с дифференциальным рефрактометром (ЭХ-ДР) по калибровке.

Для определения использовали хроматографическую систему и условия элюции аналогичные, описанные в методе ЭХ-МУЛС, с использованием только детектора ДР. Для сбора и обработки данных дополнительно использовали программу ClarityChrom с модулем для расчета результатов ЭХ.

Для построения полидисперсной калибровки методом ЭХ-ДР использовали субстанции ГЭК, произведенные из кукурузного крахмала фирмы «Аджиномото Ко. Инк» и из картофельного крахмала фирмы «Зерумверк Бернбург АГ», предварительно охарактеризованные методом ЭХ-МУЛС. Пик крахмала, был разделен на части соответствующие 3, 5, 10, 30, 50, 70, 90, 95, 97% его площади. По интегральной кривой распределения определяли ММ полученных фракций. Зависимость ММ от соответствующих этим процентам времен удерживания использовали для построения полидисперсной калибровки.

Все образцы для анализа разводили подвижной фазой до концентрации 5-10 мг/мл.

В расчетах использовали значения инкремента показателя преломления, описанные в литературе: для ГЭК — 0,144 мл/г [URL: http://www.chromatographyonline.com/lcgc/High-Resolution-Characterization-of-Hydroxyethyl-S/ArticleStandard/Article/detail/645119.], для декстрана - 0,147 мл/г [URL: http://www.ampolymer.eom/dndc.html.l.

Определение молекулярно-массового распределения в препаратах на основе белков

Для анализа препаратов белков крови использовали хроматографическую систему с петлей инжектора объемом 20 мкл, колонок ProteinPak 300SW 300 х 7,8 мм, Waters, США для препаратов альбумина и TSKgel G4000SWxl 600 х 7,5 мм, Tosoh Bioscience, Япония для препаратов иммуноглобулина, подвижная фаза 20 мМ натрий-калий фосфатный буфер рН 7,0 с 3 мМ натрия азидом, скорость элюции составляла 0,8 мл/мин, детекторы МУЛС и ультрафиолетового поглощения (УФ).

Для обсчета результатов использовали коэффициент экстинкции мономера альбумина человека 0,5 мл/(мг*см) [S.T. Gill, Р.Н. von Hippel, 1989] и мономера иммуноглобулина человека — 1,3 мл/(мг*см) [Instructions. Pierce Biotechnology, 2002], а также инкремент показателя преломления белков

0,186 мл/г [J. Wen, T. Arakavva, 1996]. Для фракции полимеров и агрегатов альбумина использовали коэффициент экстинкции 1,0 мл/(мг*см) [L.B. Jensen, J. Dam, 1994].

Молекулярную массу (ММ) рассчитывали с помощью программного обеспечения Astra 5.3.4.14 (Wyatt Technology, США) по методу Зимма на основании данных светорассеяния [Е. Folta-Stogniew, R.K. Williams, 1999; J. Wen, T. Arakawa, 1996].

Перед испытаниями все образцы альбумина и иммуноглобулинов разводили подвижной фазой до концентрации 5-10 мг/мл.

Для нормализации детектора МУЛС использовали человеческий альбумин, свободный от жирных кислот.

Расчет процентного содержания фракций осуществляли по данным УФ-детектора, принимая за сто процентов сумму площадей всех пиков, представленных на хроматограмме, за исключением пиков, соответствующих стабилизаторам. Процентное содержание фракции пика, определяли как долю площади соответствующего пика по отношению к 100%.

При расчете процентного содержания фракции по данным статического светорассеяния, на хроматограмме детектора МУЛС площади всех обсчитываемых пиков делили на соответствующие среднемассовые ММ. За сто процентов принимали сумму приведенных к единичной среднемассовой ММ площадей всех пиков представленных на хроматограмме МУЛС-детектора, за исключением пиков, соответствующих стабилизаторам. Процентное содержание каждой фракции определяли как процентную долю приведенной к единичной среднемассовой ММ площади соответствующего пика по отношению к 100%.

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Сопоставление методов определения молекулярно-массового распределения гидрокснэтилированного крахмала

Наличие большого количества применяемых методов и методик для определения ММР усложняет выбор одного оптимального. Статическое светорассеяние является методом абсолютного определения ММ [В.Е. Эскин, 1964], поэтому в качестве эталона при сопоставлении различных методик использовали ЭХ-МУЛС.

На результат определения ММ по калибровке влияет степень различия структуры (степень ветвления) молекул стандарта и образца, а также динамическая пространственная структура различных полимеров в используемой подвижной фазе [M. Gaborieau, P. Castignolles, 2011]. Влияние различия в структуре полимеров на время элюции наглядно

продемонстрировано на примере зависимости «ММ - время удерживания» (рис. 1).

Рисунок 1. Зависимость ММ от времени удерживания. ♦ - субстанция фирмы Зерумверк Бербург АГ; ■ - субстанция фирмы Аджиномото Ко.Инк; — субстанция фирмы Вухан Хуст Лайф Сайенс энд Текнолоджи Ко. Лтд;

-■•— стандарт декстрана с номинальной ММ 410 кД; —•----стандарт ГЭК

ЕФ.

Таким образом, любые различия между стандартом и анализируемым образцом приводят к значительной ошибке расчета по калибровке [ОаЬопеаи, Р. Сая^цпоИез, 2011]. Например для ГЭК с номинальной ММ 200 кД при использовании в качестве стандартов декстрана значение Мш было равно 116,9 кД [А. В. Душкин, Е. С. Метелева, 2012].

Одним из классических решений при анализе ММР гетерогенных полимеров является использование стандартов полностью идентичных по природе происхождения анализируемым образцам. Для такого аналитического решения используют полидисперсную калибровку (табл. 1).

Таблица 1.

Определение ММ по полидисперсным стандартам, охарактеризованными детектором МУЛС

Производитель Калибровка по препарату фирмы «Аджиномото Ко.Инк» Калибровка по препарату фирмы «Зерумверк Бернбург АГ» - -

М„, кД М„, кД М„, кД

Аджиномото Ко. Инк. Япония 190,6 0,4 - 205,1 1,3 7,1

Зерумверк Бернбург АГ, Германия - 165,1 6 188,6 2,3 12,5

Допустимое различие между результатами, полученными различными хроматографическими методиками для одной серии, составляет 5% [В. Варченко, И. Дидух, 2003; Европейская Фармакопея, 8-е издание, 2013; H.A. Эпштейн, 2004]. Как видно из таблицы 1, даже калибровка по веществу, выделенному из одного и того же растительного сырья, не позволяет получить результаты, неотличимые от рассчитанных по методу ЭХ-МУЛС. Данные различия связаны с неточностью определения ММ, обусловленной неполнотой фракционирования образца.

При расчете по калибровке невозможно учесть влияние разветвленности анализируемого биополимера, так как каждая фракция в таких расчетах позиционируется монодисперсной [Ю. Бёккер, 2009], то есть даже использование стандарта ГЭК с точно определенными характеристиками не позволяет учесть неоднородность состава данного полимера, варьирующую между образцами различного производства. Детектор МУЛС позволяет определять среднее значение ММ для каждой отдельной фракции, а не только для образца в целом, что позитивно сказывается на точности определения ММР ГЭК. Таким образом, можно сделать вывод, что метод ЭХ с калибровкой по стандарту/-ам нельзя использовать для анализа субстанций и препаратов на основе ГЭК. Для определения ММР ГЭК необходимо использовать метод ЭХ-МУЛС.

3.2. Валидация методики эксклюзионной хроматографии с детектором многоуглового лазерного светорассеяния

Суммарные результаты валидации методики ЭХ-МУЛС приведены в таблице 2.

Таблица 2.

Результаты валидации методики ЭХ-МУЛС

Раздел Результат

1 2

Специфичность Подтверждена хроматограммами подвижной фазы и образцов различных субстанций и препаратов

Воспроизводимость. Внутрилабораторная повторяемость Относительное стандартное отклонение определения м£вис - и 0,2% соответственно Погрешность определения М„, Л^'ВЬ1С - 0,8, 5,5 и 0,4% соответственно. Доверительный интервал для серии параллельных измерений Ми, ЛС,„„, Л/^выс - 1,1, 1,1 и 1,2 соответственно

Воспроизводимость. В нутрилабораторная прецизионность Доверительный интервал разности генеральных средних: для 0,4 - 2,9 и для Л^'ВЬ1С - 4,8 - 7,4. Для М£„ю средние двух выборок статистически достоверно не отличаются друг от друга

Продолжение таблицы 2.

1 2

Линейность Уравнение линейной регрессии имело вид «Эмулс / Эдр = 15,0хМи. + 6,6», коэффициент корреляции был равен 0,9997

Точность Открываемость для стандартов с М„. от 12 до 507,9 кД: 102,4 ±2,6. Систематическая ошибка отсутствует

Диапазон применения При определении Мл. от 25 до 507 кД, а для - от 5 кД

Робастность Результат анализа зависит от процедуры нормализации детектора МУЛС

Проверка пригодности хроматографической системы Экспериментально определенное значение М» стандарта не должно отличаться от паспортного значения более чем на 5%

Рабочая концентрация Образцы с концентрациями в диапазоне от 1 до 15 мг/мл

Результаты вапидации, проведенной по показателям специфичность, прецизионность, точность, линейность и диапазон применения подтверждают, что методика ЭХ-МУЛС позволяет корректно и с высокой точностью определять ММР лекарственных средств на основе ГЭК.

На основании сопоставления методов определения ММР ГЭК, а также проведенной вапидации был разработан проект общей фармакопейной статьи «Определение молекулярно-массового распределения в препаратах на основе гидроксиэтилированного крахмала» для включения метода ЭХ-МУЛС в Государственную Фармакопею Российской Федерации.

3.3. Характеристика молекулярно-массового распределения субстанций и препаратов на основе гидроксиэтилированного крахмала

Несовпадение значений М„, Мр и М,л. для субстанций и препаратов ГЭК позволяет говорить о полидисперсности образцов (рис. 2).

Рисунок 2. Полидисперсность препаратов на основе ГЭК.

Величина смещения М„. относительно Мр всех проанализированных препаратов находится в зависимости от величины номинальной ММ, поэтому показатели М„/М„ и М,Л. - Мр могут быть использованы для сравнительного анализа качества субстанций и лекарственных форм ГЭК.

Так как метод ЭХ-МУЛС позволяет проводить определение не только Mw, но и других характеристик ММР, то сравнение величин полидисперсности ГЭК не потребует проведения дополнительных испытаний.

Таким образом, применение метода ЭХ-МУЛС позволяет не только достоверно определять ММР ГЭК, но также позволит расширить способы оценки качества лекарственных средств.

3.4. Характеристика ММР субстанций и препаратов на основе декстрана

В ходе валидации методики ЭХ-МУЛС для определения ММР ГЭК был определен диапазон применения от 25 до 508 кД. В данный диапазон входят и нормируемые значения средней ММ (от 35 до 76 кД) для препаратов декстрана, что позволяет рекомендовать метод ЭХ-МУЛС для анализа субстанций и препаратов на основе декстрана.

Определенные с помощью детектора МУЛС значения коэффициента полидисперсности для субстанций и препаратов декстрана с номинальной ММ 40 - 70 кД оказались меньше (от 1,1 до 1,7), чем это ранее найдено для препаратов на основе ГЭК (2,0 - 2,6 для ГЭК с ММ 130 кД и 2,4 - 3,8 для ГЭК с ММ 200 кД), что подтверждает необходимость применения метода ЭХ-МУЛС для контроля качества субстанций и лекарственных форм декстранов по показателю ММР. Кроме того для препаратов декстрана было обнаружено отклонение Mw от Мр (от 5,9 до 11,1 кД). Таким образом, коэффициент полидисперсности можно использовать в качестве дополнительного показателя, характеризующего качество субстанции декстрана.

3.5. Определение молекулярных параметров методам эксклюзионной хроматографии с детектором многоуглового лазерного светорассеяния в препаратах «Альбумин, раствор для инфузий»

При проведении анализа характеристик ММР методом ЭХ-МУЛС на хроматограммах всех препаратов «Альбумин, раствор для инфузий» были выделены основные области: «1» - пик мономеров; «2» - пик димеров; «3» - пик белков, элюирующихся в мертвом объеме (рис. 3). В соответствии с монографией 0255 Европейской фармакопеи (ЕФ), белки, элюирующиеся в мертвом объеме относят к полимерам и агрегатам. У нескольких препаратов зарегистрировано разделение пика высокомолекулярных соединений на два пика, обозначенных как области «3» и «4» (рис. 3). Во всех исследованных препаратах альбумина между областями «2» и «3» не выявлено пиков, соответствующих тримеру, тетрамеру и другим олигомерам альбумина.

Рисунок 3. Типичная хроматограмма детектора МУЛС препарата альбумина с частичным разделением в области полимеров и агрегатов. Препарат фирмы Бакстер АГ, хроматографическая колонка - ProteinPak 300SW, 20 мМ фосфатный буфер с 3 мМ азидом натрия, pH 7,0, скорость элюции 0,8 мл/мин.

3.5.1. Мономеры и димеры альбумина

В отличие от препаратов полисахаридов, фракции мономеров и димеров альбумина характеризуются низким значением полидисперсности (1,02 - 1,08), что обусловлено генетической детерминированностью структуры полипептидной цепи белка в случае мономера и упорядоченным соединением двух мономеров дисульфидной связью при формировании димера альбумина [А. Brahma, С. Mandai, 2005].

3.5.2. Полимеры и агрегаты альбумина

Фракции полимеров и агрегатов выявляются вне зоны разделения хроматографической системы [Европейская Фармакопея, 8-е издание, 2013], поэтому рассчитать молекулярные параметры этих фракций при использовании традиционной хроматографической системы с УФ-детектором не представляется возможным. Однако использование метода ЭХ-МУЛС позволило рассчитать молекулярные параметры фракций «полимеров и агрегатов» препаратов альбумина в отдельных сериях различных производителей (табл. 3).

Таблица 3.

Молекулярные характеристики фракции полимеров и агрегатов в препаратах альбумина

№ серии Пик 3 Пик 4

М„, кД | М„, кД | М„ / Мп М0, кД | М„,кД | М„/Мп

Биотест

В234031 3247 ± 215 3683 ± 166 1,18 ±0,01 Фракция отсутствовала на хроматограммах

В234530 3557 ± 388 4294 ± 171 1,18 ±0,01

В234590 4316 ± 178 4675 ± 145 1,22 ±0,01

Октафарма

В030В6663 2529 ± 198 3273 ± 108 1,32 ±0,02 Фракция отсутствовала на хроматограммах

В049Э6662 3571 ± 295 4168 ± 96 1,18 ±0,01

В103В6662 3303 ± 282 4025 ± 245 1,19 ±0,00

Бакстер

УЫА1К148 2685 ± 93 2379 ± 70 1,03 ±0,01 2991 ± 95 5822 ± 323 1.39 ±0,06

УЫАЗГООб 4720 ± 136 4137 ± 204 1,03 ±0,00 5115 ± 306 11565 ± 833 1,55 ±0,02

СПК ДЗ Москвы

260807 2761 ± 40 2882 ± 246 1,01 ±0,01 2877 ± 237 4580 ± 326 1,35 ±0,02

561209 3020 ± 335 2693 ± 60 1,03 ±0,02 2627 ± 204 4182 ± 156 1,29 ±0,02

10111 2666 ± 208 2732 ± 140 1,01 ±0,00 3000 ± 42 5259 ± 3 1,33 ±0,03

40111 3111 ± 7 3120 ± 199 1,02 ±0,00 3144 ± 119 5432 ± 213 1,34 ±0,01

70909 2581 ± 155 2601 ± 70 1,02 ±0,00 2736 ± 75 4070 ± 81 1,30 ±0,02

Можно предположить, что высокомолекулярные фракции с низким значением полидисперсности (пик 3) скорее относятся к «полимерам», а фракции с высоким значением полидисперсности (пик 4) - к «агрегатам». Возможно, в случае «полимеров» комплекс белков представлен не денатурированными молекулами альбумина, а в случае «агрегатов» в состав комплекса входят денатурированные с измененной геометрией молекулы альбумина, что придает фракции «агрегатов» свойство полидисперсности.

В соответствии с ЕФ, одним из параметров, характеризующим качество препаратов альбумина, является процентное содержание «полимеров и агрегатов». Согласно ЕФ, предельное процентное содержание полимеров и агрегатов в препаратах альбумина принимается в два раза меньшим процентной доли пика высокомолекулярной фракции, рассчитанной по данным хроматографии [Европейская Фармакопея, 8-е издание, 2013]. Такие требования ЕФ были введены после переход от метода определения содержания фракции «полимеров и агрегатов» по азоту, определяемого методом Кьельдаля, к хроматографическому методу с прямым детектированием фракций с помощью УФ-детектора. Исследования показали не соответствие результатов анализа проведенных двумя методами [Европейская Фармакопея, 8-е издание, 2013]. Возможным объяснением таких различий могут стать полученные нами значения ММ и полидисперсности фракции «полимеров и агрегатов». Высокое значение ММ полимеров подразумевает увеличение вклада светорассеивания в УФ-детектирование высокомолекулярных фракций по сравнению с фракциями «мономеров» и «димеров» и, как следствие, завышение площади пика при хроматографическом определении содержания «полимеров и агрегатов». Полидисперсность высокомолекулярных фракций, по-видимому, также влияет на расчет содержания пика по данным УФ-детектора.

В таблице 4 представлены результаты сопоставления процентного содержания пиков полимеров и агрегатов, рассчитанных методом, описанном в монографии 0255 ЕФ, и на основании данных светорассеяния.

Таблица 4.

Содержание фракции полимеров и агрегатов в препаратах альбумина (пик 3 или сумма пиков 3 и 4), рассчитанное методом ЭХ-МУЛС и по

данным УФ-детектора.

Производитель Серия Содержание фракции, % УФ/ МУЛС

МУЛС УФ

1 2 3 4 5

спкдз Москвы 260807 0,4 ± 0,0 1,4 ±0,1" 3,4

561209 0,2 ± 0,0 0,7 ± 0,0' 3,8

10111 0,3 ± 0,0 0,9 ± 0,0" 3,1

40111 0,1 ±0,0 0,5 ± 0,0" 3,9

70909 0,7 ± 0,0 2,1 ±0,1* 3,2

Биотест В234031 1,1 ±0,0 3,7 ±0,1' 3,3

В234530 1,0 ±0,0 3,4 ±0,0* 3,3

В234590 1,2 ±0,1 4,2 ± 0,0 * 3,4

Продолжение таблицы 4.

1 2 3 4 5

Октафарма В030В6663 1,4 ±0,1 3,9 ±0,0* 2,9

В049Э6662 1,2 ±0,1 3,4 ± 0,0' 2,9

В103В6662 0,9 ±0,1 2,9 ±0,1 * 3,2

Бакстер УЫА1К148 1,0 ±0,0 3,9 ±0,Г 3,8

\^АЗ.Ю06 0,4 ± 0,1 1,6 ±0,2* 3,8

* - результат статистически достоверно отличался от значения, рассчитанного по данным детектора МУЛС, р < 0,001;

** - результат статистически достоверно отличался от значения, рассчитанного по данным детектора МУЛС, р < 0,05.

Как видно из таблицы 4, в большинстве случаев процентная доля пика «полимеров и агрегатов» по данным УФ-детектора статистически достоверно в 2,9 - 3,9 раз больше по сравнению с рассчитанным по данным светорассеяния. При расчете содержания «полимеров и агрегатов» альбумина можно использовать коэффициента пересчета, но данные, полученные на основании светорассеяния, указывают на определенную приблизительность таких расчетов. Дополнительная информация о возможности применения метода ЭХ-МУЛС может быть получена при сопоставлении с результатами, полученными по методу определения общего азота.

Результаты сопоставления рассчитанных среднеквадратичных радиусов (Яср) молекул фракций полимеров и агрегатов с их ММ в препаратах альбумина, рассчитанных методом ЭХ-МУЛС представлены в таблице 5.

Таблица 5.

Среднеквадратичные радиусы молекул фракций полимеров и агрегатов в

препаратах альбумина

Производитель Пик 3 Пик 4

Ясп. НМ М„, МД Ясо. НМ | М„., МД

Биотест 34,2 ±2,6 4,217 ±0,455 Фракция отсутствовала на хроматограмме

Октафарма 35,9 ±2,2 3,797 ± 0,454 Фракция отсутствовала на хроматограмме

Бакстер 49,8 ±9,9 3,258 ±0,972 56,0 ± 10,9 8,694 ±3,196

СПК ДЗ Москвы 31,7 ±7,8 2,779 ±0,216 38,7 ±8,2 4,608 ±0,591

Поскольку полученные значения среднеквадратичных радиусов молекул в пиках 3 и 4 лежат в диапазоне от 32 до 56 нм, можно рекомендовать использование нанофильтров для удаления фракции «полимеры и агрегаты» из препаратов альбумина. При этом детектор МУЛС может быть использован

для контроля наличия высокомолекулярных фракций, так как он обладает большей чувствительностью, чем ДР или УФ-детектор.

3.6. Определение молекулярных параметров методом эксклюзионной хроматографии с детектором многоуглового лазерного светорассеяния в препаратах «Иммуноглобулин, раствор для инфузий»

В отличие от препаратов альбумина, состоящих из белка одного типа, в состав лекарственных средств на основе иммуноглобулинов входят преимущественно иммуноглобулины класса G, характеризующиеся различной аминокислотной последовательностью вариабельных участков, обеспечивающих специфичность их взаимодействия с соответствующими антигенами. Гетерогенность белков увеличивается за счет того, что при производстве лекарственных средств на основе иммуноглобулинов используют пул плазмы, полученный не менее чем от 1000 доноров [Европейская Фармакопея, 8-е издание, 2013; Е.Б. Жибурт, Е. А. Клюева, 2010]. Препараты иммуноглобулинов различаются также по способу введения. При их характеристике нормируют фракционный состав и ММР хроматографических фракций после ЭХ с регистрацией УФ-детектором. В соответствии с монографией 0918 ЕФ, на хроматограмме УФ-детектора «основной пик соответствует мономеру иммуноглобулина G», пик димера имеет время элюции приблизительно в 0,85 меньше, чем пик мономера, а к «полимерам и агрегатам» относят любую фракцию со временем удерживания меньше чем у «димера» [Европейская Фармакопея, 8-е издание, 2013].

3.6.1. Мономеры и дгшеры иммуноглобулинов.

Типичная хроматограмма препарата иммуноглобулина представлена на рисунке 4. На хроматограммах всех препаратов иммуноглобулинов независимо от использованного для регистрации детектора присутствовали пики, элюирующиеся в диапазонах 12,00 - 13,50 и 11,30 - 12,00 минут, соответстветствующие фракциям мономеров и димеров.

Рассчитанные на основании данных детектора МУЛС значения Mvv мономеров (138,1 - 148,0 кД) и димеров (223,1 - 269,0 кД) соответствует данным других авторов [В. Demeule, M.J. Lawrence, 2007; А. Hawe, W. Friess, 2008]. Такие диапазоны ММ могут быть обусловлены вариабельностью аминокислотной последовательности молекул иммуноглобулинов, присутствием в препаратах иммуноглобулинов разных классов, а также комплексов антиген-антитело. Однако рассчитанное значение полидисперсности не превышало 1,02 для мономеров и 1,05 для димеров иммуноглобулинов. Такой же диапазон полидисперсности был характерен и для фракций мономеров и димеров альбумина (1,02 - 1,08), что позволяет

предположить, что вариабельность аминокислотной последовательности иммуноглобулинов не влияет на ММР хроматографических фракций мономеров и димеров.

Рисунок 4. Типичная хроматограмма препарата иммуноглобулина для внутримышечного введения. Сплошная линия - МУЛС-детектор, точки -УФ-детектор. 1 - мономеры иммуноглобулина; 2 - димеры иммуноглобулина; 3, 4, 5, 6 - высокомолекулярные фракции иммуноглобулина. Хроматографическая колонка - ТБКде! С40005\\^х1, 20 мМ фосфатный буфер с 3 мМ азидом натрия, рН 7,0, скорость элюции 0,8 мл/мин.

3.6.2. Полимеры и агрегаты иммуноглобулинов

При сравнении хроматограмм отечественных и импортных препаратов иммуноглобулинов, а также лекарственных средств, предназначенных для внутримышечного и внутривенного введений, МУЛС-детектором выявлены качественные различия ММР в зависимости от производителя препарата. На хроматограммах всех испытуемых препаратов «Иммуноглобулин, раствор для инфузий» для фракции «полимеров и агрегатов» были выделены области «3», «4», «5» - фракции со временами элюции 10,30 - 11,30, 9,45 - 10,30 и 7,00 - 9,45 минут соответственно, а также «6» - фракция, элюируюшаяся в «мертвом объеме» колонки (время элюции 6,00 - 7,00 минут) (рис. 5). УФ-детектор в области «мертвого объема» (6,00 - 7,00 минут) всех препаратов иммуноглобулинов фракции «полимеры и агрегаты» не выявлял (рис. 4). Для выделенных областей хроматограмм препаратов иммуноглобулинов были рассчитаны основные молекулярные характеристики (табл. 6).

Рисунок 5. Хроматограммы МУЛС-детектора различных препаратов иммуноглобулина для внутримышечного (А) и внутривенного (Б) введения. Хроматографическая колонка - Т8К£е1 С40008\Ух1,20 мМ фосфатный буфер с 3 мМ азидом натрия, рН 7,0, скорость элюции 0,8 мл/мин. А - Сплошная линия - Микроген (Томск), штриховая линия - Микроген (Пермь), пунктирная линия - КамРоу, точки - Резонатив. Б - Сплошная линия -Габриглобин (Иваново), пунктирная линия - Иммуноглобулин (Микроген), штрих-пунктирная - Иммуноглобулин (ГБУЗ им. Климовой), штрих-штрих-пунктирная линия — Октагам, точки — Интратект.

Таблица 6.

Молекулярные параметры высокомолекулярных фракций, содержащихся в препаратах иммуноглобулина

Препарат Область 3 Область 4 Область 5

Мт кД Мр, кД М„ Яср, "М М№, кД Мр, кД М„ 1*ср, нм М«, кД Мр, кД М„ нм

Внутримышечный Резонатив 355,7 ± 2,8 292,6 ± 3,5 1,02 ± 0,00 5,8 ± 1,0 805,8 ± 27,1 575,7 ± 12,8 1,04 ± 0,00 8,4 ± 1,1 2428,5 ±113,3 1466,8 ±67,1 1,19 ± 0,03 17,3 ±1,2

КамРоу Фракция отсутствовала на хроматограммах 1193,3 ± 40,1 1230,1 ±35,0 1,02 ± 0,01 25,6 ± 1,8 3477,4 ± 183,0 1708,9 ± 108,4 1,38 ± 0,06 31,1 ± 1,8

Микроген (Пермь) 340,0 ± 12,8 286,7 ± 5,3 1,02 ± 0,01 нет данных 682,3 ± 47,9 486,0 ± 19,4 1,05 ± 0,01 нет данных 2433,9 ± 204,0 1093,4 ± 100,9 1,37 ± 0,05 20,5 ±0,9

Микроген (Томск) 358,3 ± 9,2 291,4 ± 5,6 1,03 ± 0,00 10,9 ± 1,0 1365,7 ± 119,3 599,6 ± 34,4 1,31 ± 0,03 20,6 ± 2,0 Фракция отсутствовала на хроматограммах

Внутривенный Интратект 325,0 ± 8,7 294,2 ± 10,3 1,01 ± 0,00 нет данных 652,8 ± 29,5 415,6 ± 19,2 1,13 ± 0,03 нет данных 3018,1 ± 162,1 2424,6 ± 101,0 1,44 ± 0,08 40,2 ±0,6

Неоцитотект 332,1 ± 11,2 296,9 ± 5,6 1,01 ± 0,00 нет данных 714,0 ± 15,5 474,5 ± 6,7 1,05 ± 0,00 нет данных 1624,6 ± 130,9 1246,2 ± 19,0 1,16 ± 0,04 13,0 ± 1,3

Октагам 338,0 ± 13,5 290,3 ± 7,9 1,01 ± 0,00 нет данных 709,0 ± 58,4 472,6 ± 34,3 1,06 ± 0,02 нет данных 2464,2 ± 189,7 1126,9 ±54,5 1,30 ± 0,05 12,8 ±0,1

Габриглобин (Иваново) 328,9 ± 13,6 291,1 ± 26,0 1,03 ± 0,01 нет данных нет данных Фракция отсутствовала на хроматограммах

Габриглобин (Самара) 365,2 ± 28,5 314,9 ± 7,4 1,04 ± 0,01 24,8 ± 2,6 нет данных Фракция отсутствовала на хроматограммах

ГБУЗ им. Климовой 331,9 ± 6,9 299,8 ± 5,2 1,00 ± 0,00 10,1 ± 0,7 1008,3 ± 98,6 417,3 ± 6,0 1,35 ± 0,08 13,2 ± 1,2 Фракция отсутствовала на хроматограммах

Микроген 367,8 ± 3,6 301,7± 6,1 1,03 ± 0,01 12,9 ± 0,8 1061,6 ± 64,4 553,0 ± 32,3 1,23 ± 0,10 18,3 ± 1,4 Фракция отсутствовала на хроматограммах

Расчет полидисперстности показал, что если пик 4 не разрешается то, фракция характеризуется высоким значением полидисперсности (1,23 - 1,35). Кроме того обнаружены серии, где выявляется два пика: с низким (1,02—1,13 пик 4) и высоким (1,16-1,44 пик 5) значением полидисперсности.

Среднеквадратичный радиус молекул фракции «полимеры и агрегаты» иммуноглобулина лежит в диапазоне 5,8 - 40,2 нм. В научной литературе аналогичные данные по размерам среднеквадратичных радиусов высокомолекулярных соединений иммуноглобулина отсутствуют. Для удаления фракций белков со среднеквадратичным радиусом более 20 нм можно рекомендовать использование нанофильтров, однако содержание данных фракций в препаратах не превышает 0,3%.

Сопоставление результатов расчета процентного содержания фракции «полимеров и агрегатов» в препаратах иммуноглобулинов как отечественных, так и зарубежных производителей в соответствии с методикой ЕФ при использовании УФ-детектора и по данным детектора МУЛС не выявило статистически достоверных различий.

3.6.3. Влияние срока хранения препарата «Иммуноглобулин, раствор для инфузий», производства ГБУЗ им. Климовой на его молекулярный состав.

Одной из возможных причин образования высокомолекулярных комплексов в препаратах иммуноглобулинов может быть агрегация молекул белка при хранении лекарственных препаратов. Влияние длительности хранения препарата иммуноглобулина на его ММР исследовано на примере препаратов отечественного иммуноглобулина для внутривенного введения «Иммуноглобулин, раствор для инфузий» ГБУЗ им. Климовой. Согласно нормативной документации на препараты, срок их годности составляет 1 год. Для проведения анализа использовали серии препаратов с разным сроком хранения - как в пределах срока годности и при хранении 2 и 3 года после выпуска серии препарата.

На хроматограммах всех испытуемых препаратов на разных сроках хранения дополнительно была выделена область «0» - фракция, элюирующаяся после основного пика мономеров со временем элюции 13,50 -14,50 минут.

На рисунках 6-8 представлено влияние сроков хранения на молекулярные характеристики различных серий препаратов иммуноглобулинов, выпущенных ГБУЗ им. Климовой.

3 года Срок хранения

—■7

Рисунок 6. Содержание и ММ области иммуноглобулина на разных сроках хранения.

«О» в препаратах

Димеры Мономеры

е 1 года 2 года

Рисунок 7. Содержание и ММ фракций мономеров и димеров в препаратах иммуноглобулина на разных сроках хранения.

менее 1 года 2 года 3 года срок хранения

Рисунок 8. Содержание и ММ высокомолекулярных фракций в препаратах иммуноглобулина на разных сроках хранения.

Появление низкомолекулярной и снижение содержания высокомолекулярной фракции с увеличением её ММ может свидетельствовать об одновременном протекании как деградации, так и агрегации белка. В этом случае данные об изменении процентной доли фракции не являются полноценной характеристикой изменения ММР, более информативной формой изучения влияния срока хранения на ММР будет сопоставление изменения содержания и ММ фракций. Использование детектора МУЛС позволяет не только количественно оценить ММ и полидисперсность фракций, но и с большей достоверностью оценить характер и тип изменения ММР.

4. Заключение. Перспективы использования МУЛС детектора для определения ММР и молекулярных параметров биологических полимеров.

Для определения ММ таких макромолекул как белки и полисахариды могут быть использованы различные методы. Особенностью использования детектора МУЛС является возможность прямого быстрого и эффективного определения ММ и среднеквадратичных радиусов в независимости от калибровки хроматографической колонки по стандартам сравнения. В то же время применение детектора МУЛС позволяет исключить влияние конформации и формы макромолекул на определение ММ. Возможность применения данной техники в широком диапазоне ММ (200 Д — 1 ГД) и

среднеквадратичных радиусов (10 — 500 нм) позволила производителю детектора МУЛС Wyatt Technology Corporation рекомендовать более ста возможных вариантов применения данной техники. Среди основных направлений можно выделить определение гетерогенных биополимеров и синтетических полимеров, нативных белковых олигомеров, конъюгатов, пегилированных белков, а также изучение качества и чистоты белков.

В фармацевтической промышленности детектор МУЛС нашел применение при анализе ММР лекарственных средств на основе ГЭК [Европейская Фармакопея, 8-е издание, 2013]. Полученные нами результаты, показывающие неадекватность использования для определения средней ММ хроматографических методов с использованием ДР и построения калибровочных графиков по стандартам, обосновывают необходимость применения детектора МУЛС для характеристики молекулярных параметров субстанций и препаратов полисахаридов. В Российской Федерации детектор МУЛС практически не применяется. Для введения метода анализа ММР в отечественную практику контроля качества препаратов на основе ГЭК проведена вапидация данной методики, результаты которой позволяют рекомендовать метод ЭХ-МУЛС для введения в Государственную Фармакопею Российской Федерации.

По результатам исследовании линейности методики было установлено, что диапазон устойчивости метода позволяет рекомендовать его для определения средней ММ и препаратов на основе декстранов с номинальной ММ от 40 до 70 кД. Также как и в случае ГЭК, для декстранов обнаружено неравенство параметров Mw, Мр и Мп.

Теория расчета средней ММ синтетических полимеров, которую можно распространить и на природные полимеры полисахаридной природы (декстран и ГЭК), устанавливает различные понятия для ММ полимеров, обладающих полимолекулярностью и соединений с фиксированной структурой. Математически это различие выражается в виде значения полидисперсности, которое рассчитывается по соотношению М«УМ„. Общепринято, что белки не могут обладать полидисперсностью, так как имеют одинаковое строение и состав полимерной молекулы. В то же время белковые препараты на основе антител представляют собой смесь вариабельных по структуре молекул иммуноглобулинов класса G, полученных не менее чем от 1000 доноров [Европейская Фармакопея, 8-е издание, 2013]. Сравнение величин коэффициента полидисперсности основных хроматографических фракций препарата альбумин (мономерный белок со строго определенной аминокислотной последовательностью и ММ) и препарата иммуноглобулин нормальный, представляющий собой смесь

вариабельных молекул гликопротеинов класса имеющих разную

аминокислотную последовательность гипервариабельных доменов, отвечающих за иммунологические свойства, показало, что мономеры и димеры двух белков обладают низким значением коэффициента полидисперсности со значениями не более 1,1 (нижняя граница коэффициента полидисперсности [С.Р. Рафиков, С.А. Павлова, 1963]). Вариабельность молекул иммуноглобулина никак не сказывается на значении коэффициента полидисперсности основных фракций препарата «Иммуноглобулин человека, раствор для инфузий». Высокомолекулярные фракции, напротив, обладают полидисперсностью, а значение полидисперсности превышает 1,1.

Расчет среднеквадратичных радиусов молекул высокомолекулярных фракций альбумина и иммуноглобулина позволил оценить целесообразность использования нанофильтров для удаления высокомолекулярных соединений из препаратов на основе альбумина и иммуноглобулина.

При изучении данных определения содержания полимеров и агрегатов установлено, что метод, описанный в монографии 0955 ЕФ, дает более высокие значения содержания высокомолекулярных фракций в препаратах альбумина, чем метод ЭХ-МУЛС.

На основании проделанной работы можно заключить, что использование детектора МУЛС позволяет определить молекулярные параметры биопрепаратов и ММР хроматографических фракций с расчетом ММ и среднеквадратичных радиусов молекул. В отличие от ЭХ с концентрационными детекторами не требуется использования образцов с калиброванными ММ.

Выводы

1. Результаты хроматографического определения среднемассовой молекулярной массы (МЛ) и молекулярно-массового распределения полисахаридов с рефрактометрическим детектором зависят от химической структуры применяемых калибровочных стандартов. Дополнение хроматографической системы детектором многоуглового лазерного рассеивания позволяет рассчитать молекулярные характеристики полимеров без построения калибровочных кривых и применения стандартных образцов. Установлено, что среднемассовая молекулярная масса полидисперсных полимеров не соответствует значению, рассчитанному по положению максимума пика хроматограммы (Мр).

2. На основании данных по валидации установлено, что метод эксклюзионной хроматографии с детектором многоуглового лазерного светорассеяния характеризуется относительным стандартным отклонением определения среднемассовой молекулярной массы (М,л) равной 0,5% с погрешностью 0,8%, обладает достаточной точностью (102,4% ± 2,6%), воспроизводимостью (менее 5%) и робастностью для анализа молекулярно-массового распределения полидисперсных биополимеров в диапазоне молекулярных масс от 12 до 508 кД и рабочей концентрации от 1 до 15 мг/мл.

3. Разработанная методика эксклюзионной хроматографии в сочетании с детектором многоуглового лазерного светорассеяния позволяет напрямую рассчитать молекулярные массы и характеристики молекулярно-массового распределения препаратов альбумина и иммуноглобулинов.

4. Средняя молекулярная масса (М„) фракции полимеров и агрегатов альбумина, в зависимости от производителя, составляет от 2,4 МД до 11,6 МД, а среднеквадратичные радиусы (RcP) - от 32 до 56 нм. Аналогично М„. высокомолекулярных фракций (области 3, 4) иммуноглобулина составляют от 325 кД до 368 кД и от 653 кД до 1193 кД, соответственно. Rcp вышеуказанных областей хроматограммы составляют от 5,8 нм до 24,8 нм и от 8,4 нм до 25,6 нм, соответственно.

5. Подготовлен для представления в Министерство Здравоохранения Российской Федерации проект общей фармакопейной статьи «Определение молекулярно-массового распределения в гидроксиэтилированном крахмале» для включения в Государственную Фармакопею Российской Федерации.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Karyakin A.V., Michailova E.V., Skotselyas E.D., Flegontov P.A. Application of multi-angle laser light scattering for the plasma products quality control // 7th International Meeting Plasma Product Biotechnology: тез. докл. - Paphos, 2011. - p. 117.

2. Карякин A.B., Михайлова E.B., Скоцеляс Е.Д., Флегонтов П.А. Использование многоуглового лазерного рассеяния для контроля препаратов плазмы крови // 1 научно-практическая конференция «Технология и анализ косметических средств и фармацевтических препаратов»: тез.докл. - Москва, 2011.-с. 31-32.

3. Карякин A.B., Скоцеляс Е.Д., Флегонтов П.А. Перспективы использования метода многоуглового лазерного светорассеяния для контроля качества лекарственных средств // Международная научно-практическая конференция «фармацевтические и медицинские биотехнологии»: тез. докл. - Москва, 2012. - с. 341-342.

4. Бексаев С.Г., Карякин A.B., Скоцеляс Е.Д., Флегонтов П.А. Определение молекулярно-массового распределения в кровезаменителях на основе гидроксиэтилированного крахмала и декстрана //Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых с международным участием «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Епифановские чтения): тез. докл. - Киров, 2012. - с. 36-37.

5. Карякин A.B., Скоцеляс Е.Д., Флегонтов П.А. ВЭЖХ анализ молекулярно-массового распределения в препаратах альбумина методом многоуглового лазерного светорассеяния // Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых с международным участием «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Епифановские чтения): тез. докл. - Киров, 2012. - с. 38-39.

6. Карякин A.B., Скоцеляс Е.Д., Бексаев С.Г., Флегонтов П.А. Определение полимеров в препаратах альбумина детектором многоуглового лазерного светорассеяния // Гематология и трансфузиология - 2012. - №3. - с. 26-29.

7. Гринева Л.П., Долотова Т.А., Бексаев С.Г., Карякин A.B., Флегонтов П.А. Контроль качества гидроксиэтилированных крахмалов //15 конгресс с международным участием «Парентеральное и энтеральное питание»: тез. докл. - Москва, 2012. - с. 17.

8. Гринева Л.П., Долотова Т.А., Михайлова Е.В., Карякин A.B., Флегонтов П.А. Совершенствование методов анализа субстанции декстрана 40 //15 конгресс с международным участием «Парентеральное и энтеральное питание»: тез. докл. - Москва, 2012. - с. 20.

9. Бексаев С.Г., Скоцеляс Е.Д., Карякин A.B., Флегонтов П.А. Международные требования к контролю качества показателя «молекулярно-

массовое распределение» в субстанциях гидроксиэтилированного крахмала // 15 конгресс с международным участием «Парентеральное и энтеральное питание»: тез. докл. - Москва, 2012. - с. 66.

10. Karyakin A.V., Skotselyas E.D., Flegontov Р.А. Chapter 4: Perspectives of Application of Multi-Angle Laser Light Scattering Method for Quality Control of Medicines / edited by R. Orlicki, C. Cieñciala, L.P. Krylova, J. Pielichowski, G.E. Zaikov // Pharmaceutical and Medical Biotechnology: New Perspectives. Series: Recent Trends in Biotechnology. Biotechnology in Agriculture, Industry and Medicine. - 2013.-418 pp. ISBN: 978-1-62618-851-8

11. Karyakin A.V., Skotselyas E.D., Flegontov P.A. Chapter 18: Perspectives of Application Multi-Angle Laser Light Scattering Method for Quality Control of Medicines / edited by A. Jiménez, A. Pourhashemi, G.E. Zaikov, A.K. Haghi //Chemical Process in Liquid and Solid Phases. Properties, Performance and Applications. - 2013. - 562 pp. ISBN: 9781926895512

12. Карякин A.B., Бексаев С.Г., Флегонтов П.А. Использование детектора многоуглового лазерного светорассеяния для анализа молекулярно-массового распределения препаратов на основе гидроксиэтилированного крахмала. Почему нельзя пользоваться хроматографией с дифференциальным рефрактометром // 16 конгресс с международным участием «Парентеральное и энтеральное питание»: тез. докл. - Москва, 2013. - с. 24.

13. Карякин А.В., Бексаев С.Г., Флегонтов П.А. Использование детектора многоуглового лазерного светорассеяния для контроля качества молекулярно-массового распредления гидроксиэтилированных крахмалов // Химико-фармацевтический журнал - 2014, - №7. -с. 51-55.

Подписано в печать: 18.11.2014

Объем: 1,5 усл. печ. л. Тираж: 100 экз. Заказ № 142021 Отпечатано в «РПЦ Офорт» 105118, г. Москва, проспект Буденного, д.21А (495) 223-38-87 www.ofort2000.ru