Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дифференциация вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней на основе анализа генома

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Дифференциация вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней на основе анализа генома"

На правах рукописи УДК 619: 616.98:587.835.11:616-076

ЖИГАЛЕВА Ольга Николаевна

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ВИРУСА БОЛЕЗНИ ТЕШЕНА ОТ ЭНТЕРОВИРУСОВ СВИНЕЙ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ГЕНОМА

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1Г

X

Покров - 2005

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ГОСУДАРСТВЕННОМ НАУЧНОМ УЧРЕЖДЕНИИ ВСЕРОССИЙСКОМ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОМ ИНСТИТУТЕ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК (ГНУ

ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗ АКАДЕМИИ).

Научные руководители

доктор биологических наук, профессор

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Цыбанов Содном Жамьянович Балышев Владимир Михайлович

Рыбаков Сергей Сергеевич Пономарев Виктор Николаевич

Ведущее учреждение - Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности Россельхозакадемии.

Защита диссертации состоится « 23 » июня 2005 г. в «12 °» часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601120, Владимирская обл., Покров, ГНУ ВНИИВВиМ. Тел./ факс: (09243) 62125.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ.

Автореферат разослан

Ж

. 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность темы.

Болезнь Тешена (энтеровирусный энцефаломиелит свиней) - это болезнь, поражающая поросят и приносящая значительный ущерб свиноводству. Впервые она была описана в 1929 году в Чехословакии. В 1970 г. инфекция была занесена в СССР [Романенко В.В., 1974].

Эпизоотическая обстановка по болезни Тешена в России осложнилась в середине 90-х годов несмотря на проводимые ветеринарной службой мероприятия, направленные на ликвидацию очагов инфекции. Заболевание было зарегистрировано в Смоленской, Орловской, Воронежской и Брянской областях, а также в Белоруссии, Украине и Молдавии [Бузун А.И. 1998, Коломыцев А.А., 2000].

Возбудитель болезни относится к роду Teschovirus, семейства Picomaviridae [Dauber M.,2001].

Сложность борьбы с этой болезнью обусловлена тем, что вирус болезни Тешена (ВБТ) имеет тесное антигенное родство с энтеровирусами свиней и сходные клинические признаки течения болезни, что затрудняет дифференциацию этих возбудителей.

В частности, энцефаломиелиты у свиней, кроме вируса болезни Тешена, вызывают энтеровирусы свиней 8, 9 и 10 серотипов. В то же время ряд штаммов вируса болезни Тешена не вызывают характерных для данной болезни признаков, являясь слабовирулентными [Edington N.,1972].

Избирательная амплификация отдельных участков вирусного генома с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и их рестрикционный анализ, дополняя серологические методы диагностики ВБТ: вирусовыделение на чувствительной культуре клеток, реакция нейтрализации, иммунофлюоресцентный анализ и ИФА, открывает новые возможности для совершенствования методов идентификации и дифференциации вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней. Одним из перспективных

направлений диагностики заболевания является разработка набора препаратов, основанного на использовании ПЦР с последующим рестрикционным анализом и секвенированием ампликонов.

В связи с вышеизложенным, разработка методов дифференциации вируса болезни Тешена от полевых изолятов энтеровирусов свиней имеет важное эпизоотологическое и диагностическое значение, а поэтому является актуальной.

1.2. Цель и задачи исследования

Целью данной работы является дифференциация вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней на основе анализа генома.

В соответствии с поставленной целью необходимо решить следующие задачи:

- подобрать специфичные праймеры для амплификации различных участков генома энтеровирусов свиней и вируса болезни Тешена, оптимизировать условия проведения ПЦР;

- определить специфичность и чувствительность метода полимеразной цепной реакции для идентификации РНК вируса болезни Тешена и энтеровирусов свиней в пробах органов от инфицированных животных;

- провести типирование штаммов и изолятов методом ПЦР и реакцией нейтрализации;

- разработать способ дифференциации различных штаммов и полевых изолятов вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней на основе ПЦР и рестрикционного анализа ПЦР продуктов.

1.3. Научная новизна работы:

- на основе результатов рестрикционного анализа продуктов ПЦР, комплементарных участку гена РНК-полимеразы (3D), разработан метод дифференциации вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней;

метод ПЦР с применением праймеров, комплементарных гену УР1 позволяет дифференцировать вирус болезни Тешена от энтеровирусов

свиней;

- при проведении рестрикционного анализа продуктов ПЦР вариабельного участка гена VPI выявлены отличия в последовательностях нуклеотидов между штаммами «Talfan» и «Konratice», а также «Навля-96» и «Закарпатский» вируса болезни Тешена;

- показана гомология последовательностей нуклеотидов штамма «Навля-96» и полевых изолятов ВБТ, выделенных на территории РФ;

- проведена паспортизация штаммов «Молдавский» и «Смоленский» вируса болезни Тешена, которые депонированы в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИ.

1.4. Практическая значимость

«Набор препаратов для выявления РНК энтеровирусов методом ПЦР» и «Набор препаратов для выявления РНК вируса болезни Тешена методом ПЦР» позволяют обнаруживать РНК этих вирусов в инфицированных культурах клеток, пробах органов зараженных свиней и фекалий. Данный метод может быть включен в схему диагностики болезни.

Рестрикционный анализ ПЦР продукта амплификации консервативного участка гена РНК - полимеразы позволяет проводить дифференциацию вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней.

Рестрикционный анализ ПЦР продукта, комплементарного вариабельному участку гена VPI, позволяет дифференцировать референс-штамм «Talfan» вируса болезни Тешена.

Депонированные в коллекции микроорганизмов института штаммы «Молдавский» и «Смоленский» вируса болезни Тешена используют в ГНУ ВНИИВВиМ при проведении НИР и текущих диагностических исследований.

1.5. На защиту выносятся следующие положения:

- результаты испытания наборов препаратов на основе полимеразной цепной реакции для выявления РНК вируса болезни Тешена и энтеровирусов

свиней с использованием праймеров, комплементарных различным областям их геномов;

- специфичность ПЦР при идентификации различных штаммов энтеровирусов свиней и болезни Тешена, выделенных из патологических материалов;

- дифференциация различных штаммов и изолятов вируса болезни Тешена методами ПЦР и рестрикционного анализа.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 2001-2004 гг. в ГНУ ВНИИВВиМ в соответствии с плановыми заданиями НИР Россельхозакадемии (темы: 01.01.02., 01.01.03., 01.02.03.).

1.6. Личный вклад соискателя Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Раздел «Разработка набора препаратов для идентификации энтеровирусов свиней с помощью ПЦР» был выполнен совместно с к.б.н. Пантюшенко М.С., к.б.н. Балашовой Е.А., к.в.н. Андреевой О.Н.

1.7. Апробация диссертации и публикации

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на: заседаниях ученого совета ВНИИВВиМ, международной научно-практической конференции «Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов» (ВНИИВВиМ, г. Покров, 2003 г.), международной научно-практической конференции «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» (ВНИИЗЖ, г. Владимир, 2004 г.).

1.8. Публикации по работе

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ в материалах научно-практических конференций: ВНИИВВиМ (Покров, 2003, 2004 г.), ВНИИЗЖ (Владимир, 2004 г.), НИИ ФХМ МЗ РФ (Москва, 2002 г.), ВНИТИБП (Щелково, 2005 г.).

1.9. Объем и структура работы

Материалы диссертации изложены на 103 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы, содержащий 139 отечественных и зарубежных источников, приложения. Диссертация иллюстрирована 20 таблицами и 12 рисунками.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1.Материалы и методы

В работе использованы: культуральный вирус болезни Тешена (шт. «Закарпатский», «Навля-96», «Konratice», «Talfan», «T-80»), энтеровирусы свиней 9-го (шт. «V-13»), 10-го (шт. «А-1») серотипов, гетерогенные вирусы (вирус болезни Ауески шт. «БУК», вирус трансмиссивного гастроэнтерита, шт. «Горский 95», вирус классической чумы свиней шт. «ЛК-ВНИИВВиМ»), а также полученные из лаб. ««Диагностики» пробы органов инфицированных подсвинков и полевые изоляты, поступившие во ВНИИВВиМ в 1999 - 2003 гг.

Идентификацию вируса болезни Тешена проводили в реакции нейтрализации согласно «Временным методическим указаниям по лабораторной диагностике болезни Тешена». Дифференциацию изолятов ВБТ проводили с использованием сывороток на шт. «Закарпатский» и «Навля», которые получали из коллекции микроорганизмов ВНИИВВиМ.

Ферменты - AMV- и M-MLV обратная транскриптаза, Taq-полимераза фирм «Promega», США; «Fermentas», Литва; рестриктазы «Fermentas», Литва; «Сибэнзим», Россия. Выделение суммарной РНК осуществляли с помощью гуанидин-тиоцианата (Chromczynski et.all), а также с помощью наборов реактивов: фирм «Рибозоль», Россия, «RNA gents Total RNA Isolation System» (Promega, США),« Trizol reagents» (Gibco BRL, США).

Для синтеза кДНК и последующей ПЦР в качестве праймеров

использовали олигонуклеотиды длиной 19-30 нуклеотидов, комплементарные последовательностям различных участков генома вируса болезни Тешена.Вирусную РНК денатурировали нагреванием до 80°С и гибридизовали с 20 рМ каждого праймера, транскрибировали 40 мин при 37° С в 20 мкл, содержащих 10 единиц обратной транскриптазы M-MLV.

Раствор кДНК (5 мкл) амплифицировали в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 20 рМ каждого праймера, 2,5 mМ смеси dNTP, 10x буфер (10 шМ Трис НС1 рН 8.5, 50 mM KC1, 2,0 -3,0 тМ MgCl2 ), 2,5 ед. Taq-полимеразы. Амплификацию проводили в термоциклере «Touch Down» Hyhaid.PecTpHKHHOHHhm анализ ПЦР продуктов проводили с использованием различных ферментов рестрикции. Продукты расщепления ДНК разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле.

Компьютерный анализ и сравнение первичных нуклеотидных последовательностей, расчет олигонуклеотидов осуществляли с использованием пакетов прикладных программ «DNASIS». Расчет вероятных схем спаривания праймеров проводили по методу определения оптимальных вторичных структур нуклеиновых кислот с применением соответствующих энергетических правил по программе «OLIGO».

2.2.Результаты собственных исследований 2.2.1. Отработка метода выделения РНК вируса болезни Тешена

Для выделения РНК вируса болезни Тешена из лизата инфицированных клеток, проб фекалий и органных материалов использовали фенольно - детергентный метод, «Trizol reagents», а также денатурирующий буфер, содержащий 4М гуанидин-тиоционат (ГТЦ).

При сравнительной оценке методов получения суммарной РНК установлено, что оптимальными способами является выделение РНК из монослоя инфицированных клеток и органного материала при помощи «Trizol reagents» и денатурирующего буфера с ГТЦ. Показано существенное преимущество выделения РНК с использованием денатурирующего буфера с

ГТЦ, обеспечивающего больший выход вирусной РНК и отличающегося меньшей трудоемкостью. В дальнейшей работе мы использовали при выделении РНК этот метод.

2.2.2. Разработка «Набора препаратов для идентификации энтеровирусов свиней с помощью полимеразной цепной реакции» 2.2.2.1. Оптимизация постановки ПЦР Основными задачами этого этапа исследований являлись подбор специфических праймеров, оптимизация условий постановки ПЦР, оценка специфичности и чувствительности метода.

Для идентификации энтеровирусов свиней использовали 6 пар олигонуклеотидов, комплементарных гену неструктурного белка РНК-полимеразы (3D). ПЦР продукты имели размеры 300, 375, 441,478, 515, 552 п.о. В результате амплификации кДНК с этими праймерами были получены ПЦР продукты рассчитанных размеров.

В процессе оптимизации условий постановки ПЦР были опробованы различные режимы амплификации, буферные системы, концентрации ионов Mg и dNTP. Оптимальными параметрами амплификации РНК вируса болезни Тешена с различными праймерами являются следующие: концентрация ионов магния в реакционной смеси 3 mМ, рН буферного раствора 8,5. Режимы: 5 циклов (денатурация 95°С - 2 мин; отжиг 55°С - 1 мин, синтез при 72°С - 1 мин); следующие 30 циклов (денатурация 95°С - 45 сек, отжиг 50-55°С - 40 сек, синтез при 72°С - 40 сек); конечный цикл - 72°С - 5 мин.

В результате проведенных исследований с шестью парами праймеров, были выбраны две - наружная и внутренняя

фланкирующие ПЦР-продукты размерами 552 и 375 п.о. Показано, что в отличие от других олигонуклеотидов с этими праймерами получены более четкие ПЦР продукты на матрице РНК энтеровирусов свиней и вируса болезни Тешена при температуре отжига 55°С.

2.2.2.2. Определение специфичности метода ПЦР При проверке специфичности полимеразной цепной реакции с указанными праймерами в качестве матриц были использованы препараты РНК энтеровирусов свиней и ВБТ, а так же различных РНК- и ДНК-содержащих гетерологичных вирусов, выделенных из культурального вируссодержащего материала (вируса болезни Ауески, шт. «БУК»; классической чумы свиней, шт. «ЛК- ВНИИВВиМ»; трансмиссивного гастроэнтерита, шт. «Горский- 95»). табл.1.

Таблица 1

Результаты определения специфичности ПЦР с праймерами, комплементарными гену 3D

п=6

Образцы вирусного материала Праймеры d8 + dl2 Праймеры dl0+dl2 Выделение вируса в культуре клеток

Культуральный материал

ВБТ (шт. «Talfan») + + +

ВБТ )шт. «Konratice») + + +

ВБТ (шт.«Навля-96») + + +

ВБТ (шт. «Закарпатский») + + +

ВБТ (шт «Т-80») + + +

Энтеровирус свиней (шт. «А-1») + + +

Энтеровирус свиней (шт. «V-13») + + +

Органный материал

Поджелудочная железа (шт. «Навля-96») - + +

Головной мозг (шт. «Навля-96») - + -

Тостый отд. кишечника (шт. «Навля-96») - + +

Фекалии (шт. «Навля-96») - + -

Контрольные образцы

Головной мозг здорового подсвинка - - -

Поджелудочная железа здор. подсвинка - - -

Тостый отдел кишеч. здор. подсвинка - - -

Вирус КЧС - - -

Вирус ТГС - - -

Вирус болезни Ауески - - -

Клеточная культура ПТП - - -

Примечание: «+»-результат положительный,«-»- результат отрицательный

Результаты исследований показали, что использование наружных (<18+(112) и внутренних (сЛ0+(И2) праймеров позволяет специфически обнаруживать РНК энтеровирусов свиней и ВБТ в пробах культурального материала

После определения специфичности метода полимеразной цепной реакции в пробах культурального вируссодержащего материала были проведены исследования по выявлению РНК энтеровирусов свиней и ВБТ в пробах патологического материала. Показано, что продукты амплификации при использовании в качестве матриц препаратов РНК и ДНК других вирусов свиней (КЧС, ТГС, Ауески) не выявлены. Также не обнаружены продукты ПЦР при использовании РНК, экстрагированной как из проб органов здоровых подсвинков, так и из неинфицированных клеток ПТП.

По результатам выделения вируса от экспериментально зараженных подсвинков, было установлено, что метод выделения вируса болезни Тешена из проб органного материала в культуре клеток был менее чувствительным (3 последовательных пассажа) по сравнению с ПЦР. Из представленных в табл.1 результатов видно, что в культуре клеток энтеровирус обнаруживали только в пробах поджелудочной железы и толстом отделе кишечника.

Таким образом, рассчитанные нами праймеры, комплементарные гену неструктурного белка 3В, позволяют идентифицировать энтеровирусы свиней и ВБТ. В результате проведенных исследований по отработке режимов и условий проведения ПЦР нами разработан «Набор препаратов для выявления РНК энтеровирусов свиней методом ПЦР». Специфичность набора подтверждена межлабораторными комиссионными испытаниями (Акт от 10 июля 2003 г.). «Методические указания по выявлению РНК энтеровирусов свиней методом ПЦР» утверждены директором института.

2.23. Изучение культуральных свойств полевых изолятов вируса болезни Тешена

С 1999 г. по 2003 г. в ГНУ ВНИИВВиМ из хозяйств Смоленской,

Орловской, Тульской областей и Республики Молдова поступил патматериал

- пробы головного мозга, из которых в перевиваемой культуре клеток тестикул поросенка (ПТП) на уровне 3-го пассажа был выделен

и идентифицирован возбудитель болезни Тешена. ЦПД проявлялось через 96

- 120 часов после инфицирования, накопление вируса составляло 3,0 - 3,75

ТЦЦ 50/СМ3. Идентификацию возбудителя проводили в реакции нейтрализации. Выделенные изоляты получили условное обозначение «Смоленский», «Орловский», «Тульский» и «Молдавский». Были проведены исследования по адаптации этих изолятов и к другим перевиваемым культурам клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК), почки поросенка (ППК) для получения культурального вируса с высокой активностью.

Указанные полевые изоляты культивировали в течение 6-ти последовательных пассажей в культурах клеток ПСГК, ППК, ПТП, выращенных на чашках Карреля и клинских матрасах. Результаты этих опытов приведены в табл. 2.

Таблица 2

Накопление вируса БТ при пассажах в культурах клеток. _п=4

Титр вируса (1я ТЦЦ жш,) ПСГК ПТП

Изоляты, штам-№ мы ВБТ

1 «Молдавский»

2 «Смоленский»

3 «Орловский»

4 «Тульский»

5 «Закарпатский»

6 «Навля-96»

3 пас. 4 пас. 6 пас.

3,25 5,0 6,5

4,0 6,5 8,5

4,0 6,0 9,0

3,5 6,5 7,5

8,75 9,0 9,25

8,0 8,0 8,75

3 пас. 4 пас. 6 пас.

3,0 6,0 6,0

3,5 6,25 8,0

3,5 6,25 8,75

3,75 6,25 8,0

8,0 8,25 8,5

8,25 8,5 8,5

ППК

3 пас. 4 пас. 6 пас.

3,0 6,0 6,0

3,5 6,0 7,0

3,5 6,5 7,0

3,25 5,5 6,75

6,0 5,5 7,5

7,0 7,0 7,5

Примечание: в качестве исходных в опытах использовали штаммы «Закарпатский» и «Навля-96» 28-го и 10-го пассажей в культуре клеток ПСГК, соответственно.

Было показано, что в наиболее высоких титрах изученные изоляты размножались в культурах клеток ПСГК и ПТП. Изоляты «Смоленский» и «Орловский» обладали инфекционной активностью сопоставимой с накоплением в этих культурах штаммов «Закарпатский» и «Навля». Накопление вируса у изолятов «Молдавский» и «Тульский» в исследуемых культурах клеток составляло 6,0 - 7,5 При этом в культурах

клеток, зараженных изолятом «Молдавский», ЦПД проявлялось на 24 - 36 часов позднее.

Необходимо заметить, что в культуре клеток ППК изоляты, как и штаммы «Закарпатский» и «Навля-96» накапливались в более низких титрах - до 6,0-7,5 ^ТЦД 50/СМ3

2.2.5. Типизация изолятов ВБТ в реакции нейтрализации

Учитывая имеющиеся сведения об антигенных различиях штаммов «Закарпатский» и «Навля-96» в реакции нейтрализации (РН) [Середа А.Д. с соавт., 2000 г.], были проведены аналогичные исследования с изолятами «Молдавский», «Тульский», «Смоленский», «Орловский».

Реакцию нейтрализации ставили по общепринятой методике с постоянной дозой вируса (1000 и разведениями референс -

сывороток. Специфические вируснейтрализующие референс - сыворотки, на штаммы «Закарпатский» и «Навля-96», получали из музея микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ. Результаты опытов суммированы в табл. 3.

Данные, представленные в табл.3, показывают, что специфическая сыворотка, полученная на штамм «Навля-96», нейтрализовала все изоляты вируса, а так же референс - штаммы в разведении 1: 128. В то же время, специфическая сыворотка, полученная на штамм «Закарпатский», нейтрализовала гетерогеный вирус и изоляты «Смоленский», «Орловский», «Тульский», «Молдавский» в разведении 1 : 128, а гомологичный штамм «Закарпатский» в разведении 1 : 512. Полученные данные свидетельствуют о

серологическом соответствии изучаемых изолятов со штаммом «Навля-96» и их отличии от штамма «Закарпатский».

Таблица 3

Результат постановки РН с изучаемыми изолятами

п=5

Изоляты и шттаммы ВБТ

Разведения референс сывороток к ВБТ

на шт. «Закарпатский»

1/ 64 1/ 128 1/ 256 1/ 512 1/ 1024 1/ 2048 1/ 32 1/ 64 1/ 128 1/ 256 1/ 512 1/ 1024

1 «Смоленский» - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

2 «Орловский» - - - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

3 «Тульский» - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

4 «Молдавский» - • + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

5 «Навля-96» - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

6 «Закарпатский» + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

на шт. «Навля-96»

Примечание: (- -) - ЦПД отсутствовало; (+ +) - наличие ЦПД

С учетом полученных результатов были паспортизированы и заложены в музей микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ штаммы «Молдавский» и «Смоленский». В последующем эти и другие штаммы и изоляты были использованы при проведении дальнейшей работы по идентификации их методом ПЦР.

2.2.6. Разработка «Набора препаратов для выявления РНК вируса болезни Тешена методом полимеразной цепной реакции»

На основании анализа нуклеотидных последовательностей различных участков генома семейства Исогпауш(Зае в качестве мишени был выбран ген структурного белка УР1, который отвечает за синтез вируснейтрализующих антител и содержит как вариабельные, так и консервативные участки.

Были подобраны две пары праймеров (наружные- Е49+Е52 и внутренние- Е50+Е51), фланкирующие ПЦР продукты размерами 560 и 260 п.о., комплементарные нуклеотидным последовательностям штамма «Konratice».

В результате проведенных исследований установлено, что оптимальная концентрация ионов магния в реакционной среде составила 2,5 тМ, значение рН буферного раствора 8,5, а температура отжига обоих праймеров, специфичных для вируса болезни Тешена, составила 50°С.

Проверка специфичности метода ПЦР показала, что использованные в работе праймеры, комплементарные вариабельным областям гена VPI вируса болезни Тешена, гибридизировались с РНК всех исследованных штаммов и полевых изолятов вируса БТ, выделенной из культурального и органного материалов (табл.4).

Таблица 4

Результаты определения специфичности ПЦР с праймерами, комплементарными гену VPI

п=6

№ Образцы Наружные праймеры Внутренние праймеры Титр вируса ]g ТЦЦ50/СМ3

1 ВБТ шт. «Навля-96» + + 7,5

2 ВБТ шт. «Закарпатский» + + 8,5

3 ВБТ шт. «Копгайсе» + + 8,0

4 ВБТ шт. «ТаИап» + + 6,25

5 Изолят «Смоленский» + + 7,75

6 Изолят «Орловский» + + 6,5

7 Изолят «Тульский» + + 7,25

8 Изолят «Молдавский» + + 6,0

9 Подж. железа (шт. «Навля-96») + + 4,5

10 Головной мозг(шт. «Навля-96») - + 2,0

11 Толст.отд. кишечника(шт. «Навля-96> + + 3,75

12 Фекалии - + 3,5

13 Энтеровирус свиней шт. «А-1» - - 7,25

14 Энтеровирус свиней шт. «У-13» - - 8,0

Примечание:«+»-РНК обнаружена,«-»- РНК не обнаружена.

Полученные ПЦР продукты имели размеры 560 и 260 п.о. и соответствовали рассчитанным значениям. При этом различий в молекулярной массе ампликонов, полученных на матрицах разных препаратов вируса болезни Тешена, не выявлено. Отмечено, что данные праймеры не гибридизировались с РНК близкородственных энтеровирусов свиней.

Для определения порога чувствительности метода готовили 10-кратные разведения вируса БТ (штамм «Закарпатский»), полученного в перевиваемой культуре клеток тестикул поросенка, с исходным титром 8,5 ^ ТЦД5о/см3, и анализировали в ПЦР с наружными и внутренними праймерами. Разработанная нами методика позволила стабильно обнаруживать в пробах вируссодержащего материала РНК вируса БТ (штамм «Закарпатский») при концентрации возбудителя 10 ТЦЦ 5о/см3.

Разработанный набор препаратов для выявления РНК вируса болезни Тешена использовали для изучения персистенции вируса в органах и тканях экспериментально инфицированных крыс. С этой целью крыс заражали перорально, путём скармливания кусочков ободочной кишки от подсвинка, павшего с клиническими признаками болезни Тешена. Для инфицирования крыс использовали 2 грамма материала с активностью 5,75 ^ ТЦД so/см3. На протяжении всего срока наблюдения (60 суток) каких- либо отклонений от нормального клинического состояния у крыс не наблюдали. Через определенные интервалы времени крыс убивали, отбирали пробы различных органов и выявляли наличие вируса болезни Тешена в культуре клеток ПТП и методом ПЦР.

Результаты выделения вируса из проб внутренних органов крыс, заражённых вирусом БТ, а так же средние значения титров выделенного вируса представлены в табл. 5. Полученные данные свидетельствуют, что по данным вирусовыделения вирус БТ присутствует в организме экспериментально заражённых крыс на 2-е сутки после заражения в лёгких,

почках, тонком и толстом отделах кишечника, что также подтверждается и методом ПЦР.

Таблица 5

Результаты вирусовыделения из проб органов крыс, заражённых перорально вирусом болезни Тешена, в культуре клеток и ПЦР _п=4

Испытуемый материал Результаты вирусовыделения на культуре клеток ПТП и методом ПЦР

2-е сутки после заражения 14-е сутки после заражения 60-е сутки после заражения

В культуре клеток ПЦР В культуре клеток ПЦР В культуре клеток ПЦР

Лёгкие + (1,8±0,5) + - + - -

Почки + (2,7±0,1) + + (1,3±0,01) + - +

Селезёнка - - - - - -

Печень - - - - - -

Головной мозг - - - - - -

Тонкий отд. кишечника + (3,6±0,2) + - + - -

Толстый отд. кишечника + (4,2±0,1) + + (2,2±0,1) + - +

Примечание: «- »- отрицательный результат ; «+» - положительный результат.

На 14-е сутки после заражения крыс ВБТ обнаруживали в культурах клеток лишь в пробах почек и толстого отдела кишечника, а при помощи ПЦР вирусную РНК продолжали выявлять в лёгких и тонком отделе кишечника. На 60-е сутки после заражения вирус БТ в культуре клеток не обнаруживали ни в одном из исследованных органов, в то время как с помощью ПЦР вирусную РНК обнаруживали в почках и толстом отделе кишечника. В селезёнке, печени, головном мозге инфицированных крыс, а также в пробах органов интактных крыс ВБТ вирус болезни Тешена не обнаруживали методом ПЦР в культуре клеток.

Таким образом, в результате подбора режима и условий проведения ПЦР нами разработан «Набор препаратов для выявления РНК вируса болезни

Тешена методом ПЦР». Чувствительность и специфичность набора подтверждена межлабораторными комиссионными испытаниями (акт от 21 марта 2005 г.). Составлены методические указания по выявлению РНК вируса болезни Тешена методом ПЦР, которые утверждены директором института.

2.2.7. Дифференциация вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней методом рестрикционного анализа

Целью данного этапа работы явилась дифференциация ВБТ от энтеровирусов свиней посредством проведения рестрикционного анализа ПЦР продуктов (праймеры dlO+dl2, размер 375 п.о.), комплементарных гену РНК - полимеразы вируса БТ. Отбор ферментов рестрикции проводили на основании компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей гена РНК- полимеразы вируса БТ, выполненного при помощи пакета программ DNASIS. Было использовано несколько эндонуклеаз, имеющих сайты рестрикции в этом гене: Drall, Dral, EcoRV, EcoRII, Aval, Mspl, Seal, BamHI, Hindlll, Sail, Pstl.

В результате проведенных исследований нами были отобраны несколько рестриктаз, пригодных для дифференциации ВБТ от энтеровирусов свиней. При расщеплении ПЦР продуктов размером 375 п.о. эндонуклеазой Pstl было обнаружено, что фрагменты генома вируса БТ разделялись на два фрагмента размерами 75 и 300 п.о. в то время как у штаммов энтеровирусов свиней эти два фрагмента имели другие размеры - 175 и 200 п.о.

Таким образом, эндонуклеаза Pstl при расщеплении ПЦР продуктов размером 375 п.о., комплементарных гену РНК-полимеразы, полученных на матрице культуральных и органных материалов, позволяет дифференцировать вирус болезни Тешена от энтеровирусов свиней.

2.2.8. Дифференциация штаммов и полевых изолятов вируса болезни

Тешена

Для дифференциации различных штаммов вируса БТ нами использовано

два подхода: применение штаммоспецифической ПЦР, на основе праймеров, комплементарных вариабельному участку вируса БТ, и рестрикционный анализ ПЦР продуктов.

Для проведения штаммоспецифической ПЦР нами были взяты ранее рассчитанные праймеры (Е49-Е52), комплементарные нуклеотидным последовательностям гена VPI штаммов «Konratice», а также вновь рассчитанные две пары праймеров, комплементарные нуклеотидным последовательностям гена VPI штамма «Talfan», фланкирующие ПЦР продукты размером 796 и 327 п.о.

В результате электрофоретического анализа было установлено, что с помощью праймеров (Е49-Е52), фланкирующих ПЦР продукты размером 560 п.о., при температуре отжига 55°С, можно дифференцировать штаммы вируса болезни Тешена (табл. 6).

Таблица 6

Результаты дифференциации штаммов и полевых изолятов ВБТ при

различных температурах отжига праймеров (Е49-Е52) _._n=5

Название штаммов и изолятов Результаты ПЦР

№ 50° С 55° С

1 ВБТ шт. «Закарпатский» + -

2 ВБТ шт. «ТаИап» + -

3 ВБТ шт. «Навля-96» + +

4 ВБТ шт. «Копгайсе» + +

5 Полевой изолят «Смоленский» + +

6 Полевой изолят «Тульский» + +

7 Полевой изолят «Орловский» + +

8 Полевой изолят «Молдавский» + +

Примечание: «+»- положительный результат; «-» - отрицательный результат.

Эти праймеры гибридизовались с РНК штаммов «Навля-96», «КопгаИсе», а также с РНК полевых изолятов вируса болезни Тешена, но не взаимодействовали с РНК штаммов «Закарпатский и «ТаИап», что свидетельствует о различии нуклеотидных последовательностей у данных штаммов.

На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что полевые изоляты, циркулирующие в нашей стране в последние годы, имеют родство со штаммами «Навля-96» и «КопгаИсе».

При использовании праймеров (Е49-Е50), комплементарных последовательностям гена УР1 (шт. «КопгаИсе») при температуре отжига 50°С на матрице некоторых образцов получали ПЦР продукты разного размера, которые приведены в табл. 7.

Таблица 7

Результаты дифференциации штаммов с праймерами, комплементарными гену УР1 шт. «КопгаИсе»

п=3

№ Штаммы и изоляты ВБ Размеры ПЦР продуктов

1 Штамм «Закарпатский» 600 п.о.

2 Штамм «КопгаИсе» 804 п.о.

3 Полевой изолят «Смоленский» 700 п.о.

4 Полевой изолят «Тульский» 870 п.о.

5 Штамм «Навля-96» -

6 Штамм «ТаИап» -

7 Изолят «Орловский» -

8 Изолят «Молдавский» -

Примечание: «+»- положительный результат; «-» - отрицательный результат.

Из данных, представленных в табл.7, видно, что при данной температуре отжига с использованием этих праймеров ПЦР продукты не

были получены при амплификации штаммов «Навля-96», «ТаИап>> и полевых изолятов «Орловский», «Молдавский». Данные праймеры позволяют проводить дифференциацию штаммов по размеру их ПЦР продуктов.

При амплификации фрагментов генома разных штаммов и изолятов вируса болезни Тешена с праймерами (Е25-Е26 и Е27-Е28), комплементарных последовательностям гена УР1 (штамма «ТаКап») при температуре отжига 50°С были выявлены только два штамма «ТаКап» и «Закарпатский», (табл. 8).

Таблица 8

Результаты выявления РНК штаммов вируса болезни Тешена методом

ПЦР с праймерами, рассчитанными по шт. «ТаКап» _._._п=5

№ Штаммы и изоляты ВБТ Праймеры (Е25+Е26) (796 п.о.) Праймеры (Е27+Е28) (327 п.о.)

1 Шт. «Навля-96» - -

2 Шт. «Закарпатский» + +

3 Шт. «КопгаИсе» - -

4 Шт. «ТаКап» + +

5 Изолят «Смоленский» - -

6 Изолят «Орловский» - -

7 Изолят «Тульский» - -

8 Изолят «Молдавский» - -

Примечание: «+»-РНК определена, «-»- РНК не определена.

Таким образом, в процессе работы было показано, что праймеры, комплементарные вариабельным областям гена структурного белка УР1, при амплификации с температурой отжига праймеров 50° - 55° С позволяют

проводить дифференциацию штаммов «Навля-96» и «Закарпатский», а также штаммов «Konratice» «Talfan».

2.2.9. Рестрикционный анализ продуктов ПЦР вируса БТ

Целью данного этапа работы было проведение рестрикционного анализа ПЦР продуктов размером 560 п.о. (праймеры Е49+Е52) для дифференциации штаммов ВБТ.

В результате проведенных исследований было установлено, что из использованных нами ферментов Apyl, BamHI, Mval, BstI, Eco47III, Ddel, Hael эндонуклеаза BamHI расщепляла ПЦР продукты штаммов «Навля-96», «Закарпатский», «Konratice» и полевых изолятов на два фрагмента размерами 300 и 200 п.о., а участок гена VPI шт. «Talfan» на три фрагмента размерами 200,190,110 п.о.

При расщеплении ПЦР продуктов вышеуказанных штаммов рестриктазой Mval были выявлены по два фрагмента у тех же образцов, что и при работе с эндонуклеазой BamHI, но других размеров: 400 и 100 п.о. ПЦР продукт штамма «Talfan» расщеплялся на три фрагмента размерами 300,160, 100 п.о. Установлено, что наиболее подходящими ферментами рестрикции, позволяющими дифференцировать штамм «Talfan» от других штаммов ВБТ являются рестриктазы BamHI, Mval. Другие рестриктазы не имеют сайтов рестрикции у этих штаммов в данном участке гена VPI. Полученные данные свидетельствует о том, что рестрикционный анализ продуктов амплификации возбудителя болезни Тешена с помощью подобранных рестриктаз позволяет дифференцировать штамм «Talfan» от других штаммов вируса болезни Тешена.

Таким образом, в результате проведенных исследований нами разработаны наборы препаратов на основе полимеразной цепной реакции для выявления РНК вируса болезни Тешена и энтеровирусов свиней с использованием праймеров, комплементарных различным областям их геномов. Проведена оценка чувствительности и специфичности ПЦР при

идентификации различных штаммов энтеровирусов свиней и болезни Тешена, выделенных из проб органов инфицированных животных. Показана возможность дифференциации различных штаммов и изолятов вируса болезни Тешена методами ПЦР и рестрикционного анализа.

3. ВЫВОДЫ

1. На основании анализа нуклеотидных последовательностей различных участков генома вируса семейства Р1согпоауш(Зае в качестве мишени для ПЦР выбран участок гена неструктурного белка РНК-полимеразы (3Б). Отработаны оптимальные условия постановки полимеразной цепной реакции с использованием наружных и внутренних праймеров

позволяющие при температуре отжига 55° С выявлять РНК энтеровирусов свиней 9-го, 10-го серотипов и вируса болезни Тешена.

2. По результатам рестрикционнго анализа, эндонуклеазой рестрикции РвИ ПЦР продукта размером 375 п.о. участка гена РНК- полимеразы, можно дифференцировать вирус болезни Тешена от энтеровирусов свиней 9-го и 10-го серотипов.

3. Подобраны праймеры, комплементарные вариабельному участку гена УР1, фланкирующие ПЦР продукты размерами 560 и 260 п.о., которые позволяют проводить идентификацию возбудителя болезни Тешена.

4. Праймеры, комплементарные вариабельному участку гена УР1 вируса болезни Тешена, при температуре отжига 55° С взаимодействуют с нуклеотидными последовательностями штаммов «КопгаИсе», «Навля-96» и полевых изолятов вируса болезни Тешена, выделенных на территории Тульской, Смоленской и др. областях и не взаимодействуют со штаммами «ТаКап» и «Закарпатский».

5. Рестрикционный анализ ПЦР продукта, комплементарного вариабельному участку гена УР1,эндонуклеазами рестрикции БашИ1 и Муа1 позволяет проводить дифференциацию штамма «ТаКап» от других штаммов вируса болезни Тешена.

6. Проведенная типизация полевых изолятов - «Смоленский», «Орловский», Тульский», «Молдавский», выделенных в 1999-2003 гг. на территории России и Республики Молдова, методом ПЦР и в реакции нейтрализации свидетельствует об их серологическом соответствии штамму «Навля-96», относящемуся к 1-му подтипу вируса болезни Тешена.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. «Набор препаратов для выявления РНК энтеровирусов свиней методом ПЦР», «Набор препаратов для выявления РНК вируса болезни Тешена методом ПЦР» могут быть включены в схему лабораторных исследований при диагностике энтеровирусных инфекций свиней.

2. Метод рестрикционного анализа ПЦР продуктов, комплементарных участку гена РНК - полимеразы, с использованием эндонуклеазы РвИ, позволяет проводить дифференциацию вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней. Данный метод может быть включен в схему лабораторных исследований при диагностике вируса болезни Тешена.

3. ПЦР при повышенной температуре отжига праймеров, а также рестрикционного анализа ПЦР продуктов участка гена УР1 вируса болезни Тешена могут быть использованы для дифференциации штаммов «Навля», «Закарпатский», «Кошайсе» и «ТаНап».

4. Паспортизированные штаммы «Молдавский» (инв.№ 2454) и «Смоленский» (инв.№ 2524) 1-го подтипа ВБТ, депонированы в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ и могут быть использованы при проведении НИР и диагностических исследований.

5. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Андреева О.Н., Кадетов., Жигалева О.Н. Контроль полноты инактивации вируса при изготовлении инактивированной культуральной эмульгированной вакцины против болезни Тешена // Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов: Труды Междунар. Науч.- практ.

конф., посвящ. 45 - летию интитута, 24 - 26 сентября 2003 г. - Покров, 2003. -4.2.-С. 503-505.

2. Выявление РНК вируса болезни Тешена с помощью ПЦР / Пантюшенко М.С., Жигалева О.Н., Андреева О.Н., Цыбанова ВА, Стрижаков АА, Копытов В.О. // Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов: Труды Междунар. науч.- практ. конф., посвящ. 45 - летию интитута, 24 - 26 сентября 2003 г. - Покров, 2003. - Ч.2. - С. 454 - 457.

3. Вирусные болезни диких диких кабанов / Жигалева О.Н. // Болезни диких животных: Труды Междунар. науч.- практ. конф., 28 - 30 сентября 2004. -Покров, 2004.-С. 239-243.

4. Выявление и штаммовая дифференциация вируса болезни Тешена методом ПЦР / Жигалева О.Н., Андреева О.Н., Балашова ЕА // Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных: Материалы Междунар. науч.- практ. конф. Молодых ученых, 24 - 26 марта

2004. - Владимир, 2004. - С. 110 - 113.

5. Сравнительная оценка методов обнаружения вируса болезни Тешена в пробах патологического материала / Андреева О.Н., Пантюшенко М.С., Жигалева О.Н., Стрижаков АА, Цыбанова Л.Я. // Генодиагностика инфекционных заболеваний: Тез. Докл. 4-й Всерос. Науч. - практ. конф., 22 - 24 октября 2002 г. -М., - С. 316-318.

6. Дифференциация штаммов вируса болезни Тешена методом ПЦР. Жигалева О.Н., Балашова Е. А. , Цыбанов С.Ж., Балышев В.М.// «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», поев. 35- летию института, 26-27 мая 2005 г. - Щелково,

2005.-С. 216-219.

1 **L

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жигалева, Ольга Николаевна

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1 Цель и задачи исследований.

12. Научная новизна работы.

1.3.Практическая значимость.

1.4.Личный вклад соискателя.

1.5. Апробация результатов исследований.

1.6. Апробация результатов исследований.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Распространение болезни. И

2.2. Характеристика возбудителя.

2.2.1. Организация генома ТеБс1кмги8.

2.2.2. Полипептидный состав вириона.

2.2.3. Антигенные свойства вируса.

2.3. Патогенез и клинические проявления болезни.

2.4. Профилактика и меры борьбы.

2.5. Диагностика болезни Тешена.

2.5.1 Серологические методы диагностики

2.5.2. Методы ДНК-диагностики.

2.6. Филогенетический анализ генома тешевирусов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Дифференциация вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней на основе анализа генома"

Болезнь Тешена (энтеровирусный энцефаломиелит свиней) -инфекционная болезнь, поражающая поросят и приносящая значительный ущерб свиноводству. Впервые она была описана в 1929 году в Чехословакии. В бывшем СССР заболевание было диагностировано в 1972 году в Закарпатской области Украины. Эпизоотическая обстановка в России по болезни Тешена осложнилась в середине 90-х годов и, несмотря на значительные усилия, предпринимаемые ветеринарной службой России, заболевание было зарегистрировано в Брянской, Смоленской, Орловской, Воронежской и Тульской областях, а также в Белоруссии, Украине и Молдавии [9].

Возбудитель данной болезни относится к роду ТезсЬоу^Б, семейства Р1согпоушс1ае [123]

Сложность борьбы с этой инфекцией обусловлена тесным антигенным родством вируса болезни Тешена с энтеровирусами свиней и сходными клиническими признаками болезни, вызываемыми этими возбудителями, что затрудняет проведение диагностических исследований [76].

В частности, энцефаломиелиты у свиней, кроме вируса болезни Тешена, вызывают и энтеровирусы свиней, что создает дополнительные сложности при разработке мер борьбы с этой болезнью. Репродуктивные расстройства, также характерные для болезни Тешена, вызывают представители энтеровирусов 8 серотипа. В то же время ряд штаммов вируса болезни Тешена не вызывает характерных для данной болезни признаков, являясь слабовирулентными [82].

Используемые в настоящее время методы лабораторной диагностики болезни Тешена: выделение вируса в культуре клеток, реакция нейтрализации со специфическими сыворотками, а иммунофлюоресцентный анализ являются не всегда позволяет дифференцировать вирус болезни Тешена от энтеровирусов.

Избирательная амплификация отдельных участков вирусного генома с помощью полимеразной цепной реакции и их рестрикционный анализ, дополняя серологические методы, открывает новые возможности для совершенствования дифференциации вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней. Одним из перспективных направлений является разработка тест-системы, основанной на использовании ПЦР, с последующим рестрикционным анализом и секвенированием ампликонов участков РНК ВБТ и энтеровирусов свиней.

В связи с вышеизложенным, разработка методов дифференциации вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней имеет важное эпизоотологическое и диагностическое значение и является актуальной.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Жигалева, Ольга Николаевна

6. ВЫВОДЫ

1. На основании анализа нуклеотидных последовательностей различных участков генома вируса семейства Рюогпоаушёае в качестве мишени для ПНР выбран участок гена неструктурного белка РНК-полимеразы (ЗБ). Отработаны оптимальные условия постановки полимеразной цепной реакции с использованием наружных (с18-с112) и внутренних праймеров (с110-с112), позволяющие при температуре отжига 55° С выявлять РНК энтеровирусов свиней 9-го, 10-го серотипов и вируса болезни Тешена.

2. По результатам рестрикционнго анализа, эндонуклеазой рестрикции РбИ ПЦР продукта размером 375 п.о. участка гена РНК- полимеразы, можно дифференцировать вирус болезни Тешена от энтеровирусов свиней 9-го и 10-го серотипов.

3. Подобраны праймеры, комплементарные вариабельному участку гена УР1, фланкирующие ПЦР продукты размерами 560 и 260 п.о., которые позволяют проводить идентификацию возбудителя болезни Тешена.

4. Праймеры, комплементарные вариабельному участку гена УР1 вируса болезни Тешена, при температуре отжига 55° С взаимодействуют с нуклеотидными последовательностями штаммов «Копгайсе», «Навля-96» и полевых изолятов вируса болезни Тешена, выделенных на территории Тульской, Смоленской и др. областях и не взаимодействуют со штаммами «Та^ап» и «Закарпатский».

5. Рестрикционный анализ ПЦР продукта, комплементарного вариабельному участку гена УР1, эндонуклеазами рестрикции ВашН1 и Муа1 позволяет проводить дифференциацию штамма «Та1Гап» от других штаммов вируса болезни Тешена.

6. Проведенная типизация полевых изолятов - «Смоленский», «Орловский», Тульский», «Молдавский», выделенных в 1999-2003 гг. на территории России и Республики Молдова, методом ПЦР и в реакции нейтрализации свидетельствует об их серологическом соответствии штамму «Навля-96», относящемуся к 1-му подтипу вируса болезни Тешена.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. «Набор препаратов для выявления РНК энтеровирусов свиней методом ПЦР», «Набор препаратов для выявления РНК вируса болезни Тешена методом ПЦР» могут быть включены в схему лабораторных исследований при диагностике энтеровирусных инфекций свиней.

2. Метод рестрикционного анализа ПЦР продуктов, комплементарных участку гена РНК — полимеразы, с использованием эндонуклеазы РбЙ, позволяет проводить дифференциацию вируса болезни Тешена от энтеровирусов свиней. Данный метод может быть включен в схему лабораторных исследований при диагностике вируса болезни Тешена.

3. ПЦР при повышенной температуре отжига праймеров, а также рестрикционного анализа ПЦР продуктов участка гена УР1 вируса болезни Тешена могут быть использованы для дифференциации штаммов «Навля», «Закарпатский», «Копгайсе» и «Та1Гап».

4. Паспортизированные штаммы «Молдавский» (инв.№ 2454) и «Смоленский» (инв.№ 2524) 1-го подтипа ВБТ, депонированы в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ и могут быть использованы при проведении НИР и диагностических исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жигалева, Ольга Николаевна, Покров

1. Аксенов М.Ю., Гинцбург А.Л. Диагностика инфекционных заболеваний с помощью метода полимеразной цепной реакции // Молекулярнаяу- генетика микробиология и вирусология. 1993 - №4. - С. 3-7.

2. Аминев А. Г., Аминева С. П., Баборенко Е. П. и др. Обнаружение вируса болезни Ауески методом «гнездовой» полимеразной цепной реакции // Молекулярная биология. 1997 - Т. 31, №3. - С. 564-567.

3. Анджапаридзе О.Г., Богомолова H.H., Борискин Ю.С. Персистенция вирусов.-М., 1984.-253 с.

4. Андреева О.Н. Эпизоотологическое моделирование биологической передачи возбудителя болезни Тешена: дис. канд. вет. наук /16.00.03/ Андреева Ольга Николаевна. Покров, 2003. - 132 с.

5. Балышева В.И. Получение очищенного вируса болезни Тешена и изучение его физико-химических и биологических свойств: дис. . канд. биол. наук / 03.00.06. / Балышева Вера Ивановна. Покров, 1978.- 147с.

6. Биология вирусов животных/ Феннер Ф., Мак-Ослен Б., Миме С. и др.-М., 1977.- 186 с.

7. Болезнь Тешена / Козин А.И, Коломыцев A.A., Васильев А.Д. -,<" Ульяновск, 2002.-21 с.

8. Бондаренко В.И., Синяк K.M. Полиомиелит и другие энтеровирусные инфекции.- Киев: Здоровье, 1984.- 240 с.

9. Ветеринарное законодательство СССР. Т.4/Под общ. ред. А.Д. Третьякова.-М.: Агропромиздат, 1988.-671 с.г '

10. Вирусные болезни животных / Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьёв Б.В., Фомина Н.В.- М.: ВНИИТИБП, 1998.- 928 с.

11. Вирусология. / Филдс Б., Найп Д., Чунок Р. и др. М.: Мир, 1989. - С. 190-241.

12. Власов А.Н. Разработка и усовершенствование методов дифференциальной лабораторной диагностики болезни Тешена: дисс. канд. биол. Наук /16.00.03/ Власов Анатолий Николаевич. Покров, 2002.-136 с.

13. Временные Методические указания по лабораторной диагностике болезни Тешена: Утвержденная Департаментом ветеринарии 24 января 1996 г.

14. Выявление ДНК вируса болезни Ауески гибридизацией с биотипированными зондами./ Глотов А. Г., Орешкова С. Ф., Кувшинов В. Н. и др.// Ветеринария. 2001. - №2. - С. 21-24.

15. V-- 21. Голицина JI.H., Новикова H.A., Домбровская JI.K. Княгина О.Н.,

16. Новиков Д.В. Оценка разработанного «nested»- варианта полимеразной цепной реакции при выявлении энтеровирусов у больных // Вопросы вирусологии. -2002.- №5. -С. 41-43.

17. Гусева Е. В., Сатина Т. А. Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике инфекционных заболеваний животных. — Владимир, -1995. 44с.

18. Диагностика болезни Тешена/ Романенко В.Ф., Прусс О.Г., Полевик Е.И. и др. // Ветеринария.- 1988.-№ 11. С. 65.

19. Инструкция о мероприятиях по борьбе с энзоотическим энцефаломиелитом (болезнью Тешена) свиней: утверждена Главным управлением ветеринарии Мин.Сельхоз.хоз СССР 5 апреля 1978 г.

20. Карантинные и малоизвестные болезни животных / Архипов Н.И., Бакулов И.А., Балабанов В.А. и др. М.: Колос, 1983.-351с.

21. Кропотов B.C. Средства и методы повышения иммуногенности вакцины против болезни Тешена: дис. . канд. биол. наук: 03.00.06. / Кропытов Василий Сергеевич. Покров, 2001. - 136 с.

22. Мюллис К. Необычайная история о том, как родилась полимеразная цепная реакция // В мире науки .- 1990 г. №6 - С. 26-34.

23. Наумкина М.А. Разработка методов молекулярной гибридизации и ПЦР для идентификации вируса бешенства: автореф. дис. кан. биол. наук:

24. Т 03.00.06. / Наумкина Марина Алексеевна. Покров, 1999 г. - 24 с.

25. Непоклонов Е. А., Алипер Т. И., Ленева И. А. Применение моноклональных антител для изучения вируса КЧС//В опросы вирусологии. 1999. - №2. - С. 54-60.

26. Обухов И.Л., Панин А. Н. Применение полимеразной цепной реакции в ветеринарии // Аграрная Россия. 2002. - №2. — С. 62-64

27. Орешкова С. Ф. ДНК-технологии в диагностике и характеризации вирусных патогенов сельскохозяйственных животных // Молекулярная генетика микробиология и вирусология. 2002. - №2 - С. 3-8.

28. Пономарёв В.В., Коломыцев A.A., Жестерев В.И. Болезнь Тешенараспространение и иммунопрофилактика в Российской Федерации // Тез. Междунар. науч.- практ. конф.- Воронеж, 1999,- С. 4-8.

29. Пыльнов, В.А Разработка молекулярно-биологических методов обнаружения и штаммовой дифференциации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней: автореф. дис.биол. наук: 03.00.06. / Пыльнов Владимир Александрович.- Владимир, 2003. 19 с.

30. Романенко В.Ф. Эпизоотология энзоотического энцефаломиелита (болезни Тешена) свиней // Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных: тез. докл. конф., посвящ. 100-летию открытия вируса ящура.- Владимир, 1997.- С.133-135.

31. Сергеев В.А, Жестерев В.И., Коломыцев A.A. Авторское свидетельство №707327 от 04. 1981 г. Способ получения вакцины против энзоотического энцефаломиелита свиней.

32. Сергеев В.А. Карантинные и малоизвестные болезни животных. — М.: Колос, 1983.-351 с.

33. Сергеев В.А. Репродукция и выращивание вирусов животных.- М.: Колос, 1976,-ЗОЗс.

34. Сечбчль В. Б. Применение методов гибритизации in situ и ОТ-ПЦР для изучения инфекции, вызываемой вирусным гепатитом // Вопр. вирусол.2000. № 6. - С. 45— 47.

35. Снетков К.А. Идентификация возбудителя катаральной лихорадки овец с помощью полимеразной цепной реакции: автореф. дис. вет. наук: 03.00.06 /Снетков Константин Анатольевич.-Покров, 2003.- 21 с.

36. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Ветеринарная вирусология.-М.: Колос, 1984.-3 76с.

37. Урбанович П.П., Цымбалюк П.И. Энзоотический энцефаломиелит свиней (патогенез, патоморфология, диагностика) // Ветеринария.- 1991.-№ 9.- С. 36-39.

38. Хлебников B.C., Балышева В.И., Рахимов A.A., Полипептидный состав вируса болезни Тешена // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологиии эпизоотологии: сборник тезисов научной конференции /f ВНИИВВиМ.- Покров, 1980.-С. 129-130.

39. Чупин С.А Выявление ротавирусов КРС группы А с помощью ПЦР и их характеристика на основе анализа генома: дис. канд.биол. наук: 03.00.06 /Чупин Сергей Александрович.- Владимир, 2002. -21с.

40. Энзоотический энцефаломиелит свиней. / Романенко В.В., Катасопов Н.С., Петрице Ю.И. и др. // Ветеринария.- 1974.- № 2.- С. 61-62.

41. Эпизоотология и инфекционные болезни сельскохозяйственных животных/ A.A. Конопаткин, И.А. Бакулов, Я.В. Нуйкин и др. / Под ред. A.A. Конопаткина.- М.: Колос, 1984.- 544 с.

42. V 58. Abzug M. J., Levin M.J., Rotbart H.A. Profile of enterovirus disease in thefirst two weeks of life //J. Infect. Dis. -1993.- Vol. 12.- P. 820-824.

43. Ahlquist P., Kaesberg K. Determination of the length distribution of poly (A) at the 3'- terminus of the virion RNAS of EMS virus, poliovirus, rhinovirus, RAV-61 CPMV and of mous globin mRNA // Nucleic Acids Res. Vet. Sei. 1979.-Vol.7.-P. 1195- 1204.

44. Alexander T., Betts A. Futher studies on porcine enteroviruses isolated at Cambridge. 1 Infections in SPF pigs and the preparation of monospecific antisera// Res. Vet. Sei.- 1967.- № 8.-321-329

45. Alexander T.J.L., Betts A.O. Further studies on porcine enteroviruses isolated at Cambrige. II. Serological grouping // Res. Vet. Sei.- 1967.- Vol. 8.- P. 330337.

46. Atypical porcine enterovirus encephalomyelitis: possible interaction betweenenteroviruses and arsenicals / Pass D.A., Forman A.J.,Connaughton I.D. //

47. Aust. Vet. J.-1979.- Vol. 55, № 10.- P. 495-497.

48. Beld M., Minnaar R., Weel. J., Sol C. Highly sensitive asay for detection of enterovirus in clinical specimens by reverse transcription-PCR with an armored RNA internal control // J. Clin. Microbiol. -2004. -Vol. 42.- P. 30593064.

49. Betts A.O. Studies on enteroviruses of the pigs the recovery in tissue culture of two related strains of swine polioencephalomyelitis virus from the tonsils of "normal" pigs // Res. Vet. Sci.-1960.- Vol. 1.- P. 57-64.

50. Boom R., Sol J., Weel K., Gerrits Y. et. al. Detection and quantitation of human cytomegalovirus DNA in faces // J. Virol. Methods. -2000.- Vol. 84.-P. 1-14.

51. Boom R., Sol J., Weel K., Gerrits Y. et. al. A highly sensitive assay for detection fnd quantitation of human cytomegalovirus DNA in serum and plasma by PCR // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. - P. 1489-1497.

52. Brown F., Rowe T. E., Underwood L. W. et al. Comparison of swine vesicular disease virus and Coxsackie B5 virus by serological and RNA hybridization methods //J. Gen. Virol.-1976.- Vol. 31.- P. 231-237.

53. Clementi M., Menzo S., Manzin A. and Bagnarelli P. Quantitative molecular methods in virology // Arch, of Virol. 1995. - Vol. 140, № 9. - P. 15231539.

54. Dardiri A.H., Delay P.D. Plaque formation by Teschen disease virus and the ffect of certain associated factors // Canad. J. сотр. Med.- 1966.- Vol. 30, № 7.- P.183-189.

55. Dauber M. Identification of group I porcine enteroviruses by monoclonal antibodies in cell culture // Vet. Microbiol.- 1999. Vol.6. P. 1-12.

56. Derbyshire J.B. Porcine Enterovirus (Polioencephalomyelitis) // Virus ( infection of Vertebrates.- Vol. 2.- Amsterdam-Oxford-New York-Tokyo: T Elsevier science publisher B.V., 1989.- P. 1239-1302.

57. Derbyshire J.B. The effect of immunosuppression with cyclophosphamide on an experimental porcine enterovirus infection in piglets // Can. J. Сотр. Med.- 1983.- Vol. 47, № 2.- P. 235-237.

58. Derbyshire J.B., Arkell S. The activity of some chemical desinfectants against Talfan virus and porcine enterovirus types // Brit. Vet. J.- 1971.- Vol. 127, № 3.-P. 137-142.

59. Diseases of Swine. / Ed. By B.E. Staw, S. D'AUaire, W.L. Mengeling, D.A. Taylor// Iowa State, University Press, 1999.- 1209 p.

60. Doherty M. Detection jf porcine enteroviruses by RT-PCR: differentiation of

61. CPE groups I-III with specific primer sets // J. Virol. Methods. 2000.- Vol. 88.- P. 205-218.

62. Dunn D.C., Blair C.D., Ward D.C., Beaty B.J. Detection of bovine herpesvirus-specific nucleis acids by in situ hybridization with biotinylated DNA probes // Am. J. Vet. Res. 1986. -Vol. 47. - P. 740-746

63. Dunne H.W., Wang J.T., Ammerman E.H. Further studies on the classification of North American porcine enteroviruses: A comparison with European and Japanest strains // Infection and Immunity.- 1971.- Vol. 4,- P. 619-631.i

64. Edington N., Christofinis G.J., Betts A.O. Pathogenicity of Talfan and Konratice strains of Teschen virus in gnotobiotic pigs // J. Compr. Path.-1972.- Vol. 82.- P. 393-399.

65. Fenner F.J., Gibbs E.P., Murphy F.A., Rott R. Porcine enteroviruses // Veterinary Virology.- 1993.- P. 416-419.

66. Goens S. D., Botero S., Zemla A. et al. Bovine enterovirus 2: complet genomic sequence and molecular modeling of a reference strain and a wildtype isolate from endemically infected US csttle //J Gen. Virol. -2004.- Vol. 85.- P. 3195-3203.

67. Hafez S.M., Bruske R., Liess B. Prevalence of neutralizing antibody to porcine enterovirus serotype 2 strain BHZP/3 and its possible relation to atrophic rhinitis in pigs // Zentralbl Veterinarmed B.- 1980.- Vol. 27, № 5.-P. 374-381.

68. Hajek P., Mandel L., Smolova M. Neutralizing antibody formation in newborr colostrum deprived germ free piglets infected with Teschen disease virus // Acta Virol.- 1971.- Vol. 15, №5.- P. 430.

69. Harding J.D.J., Done J.T., Kershaw G.F. A transmissible polioencephalomyelitis of pigs (Talfan disease) // Veterinary Record.- 1957.-Vol. 69.- P. 824-832. 26

70. Hazlett D.T. A comparison of six methods for the concentration of a porcine enterovirus // Can. J. Microbiol.- 1977.- Vol. 23, № 8.- P. 1052-1058.

71. Hazlett D.T., Derbyshire J.B. Characterization of the local and systemic virus neutralizing activity in swine vaccinated with a porcine enterovirus // Can. J. Med.- 1977.- Vol. 41, № 3.- P. 257-263.

72. Holland J.J. Enterovirus entrance into specific host cells and subsequent alteration of cell protein and nucleic acid synthesis // Bact. Rev.-1964.- Vol. 28.- P.3-13.

73. Honda E., Hattori I., Oohara Y. et al. Sero and CPE types of porcine enteroviruses isolated from healthy and diarrheal pigs: possible association of CPE type II with diarrhea // Jap. J. Vet. Sci.- 1990.- Vol. 52.- P. 85-90.

74. Horstmann D.M. Experiments with Teschen disease (virus encephalomyelitis of swine) // J. Immunol. 1952.- Vol. 69.-P. 379-394.

75. Horstmann D.M., Manuelidis E., Sprinz H. Neuropathology of Teschen disease (virus encephalomyelitis of swine) // Proc. Soc. Exp. Biol Med.-1951.- Vol. 77.-P. 8-13.

76. Huck R.A. Encephalomyelitis of pigs studies of the relationships of the Teschen group of viruses and the identification of a third subtype F.S. 55 // VIII International Congress of Microbiology.- 1962.- P. 101.

77. Hyypia T., Hovi T., Knowles H.J., Stanway G. Classification of enteroviruses based on molecular and biological properties // J. Gen. Virol.-1997.- Vol. 78.-P.1-11.

78. Kaku Y., Sarai A., Murakami Y. Genetic reclassification of porcine enteroviruses // J. Gen. Virol.- 2001.- Vol. 82,- №. 2.- P. 417-424.

79. Kaku Y., Yamada S., Muracami Y. Sequence determination and phylogenetic analysis of RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) of the porcine enterovirus I (pev-1) Talfan strain // Arh. Virol.- 1999, Vol. 144.- P. 18451852.

80. Kelly D.F. Serologic studies of some porcine enteroviruses by means of neutralisation tests in tissue culture // Amer. J. Veter. Res.- 1964.- Vol. 25, № 105.- P. 403-407.

81. Kesseer H. H., Santner H., Rabenau A. et. al. Rapid diagnosis of enterovirus infection by a new one-step revers Transcription PCR assay // J. Clin. Microbiol.- 1997.- Vol. 35.- P. 976-977.

82. Kieno M., Kanno M., Hirasawa K., Watari T., Kato K. et al. Isolation of echovirus type 13 from patients of aseptic meningitis // Jpn. J. Infect. Dis. -200.- Vol. 54.- P. 249-250.

83. Killington R.A., Powell K.L. Monoclonal antibodies // J. Biol. Educ-1984.-Vol. 18.-P. 282-292.

84. Knowles N.J., Barnett I.T.R. A serological classification of porcine enteroviruses // Arch Virol.- 1985.- Vol. 83.- P. 141-155.

85. Knowles N.J., Buckley L.S., Pereira H.G. Classification of porcine enteroviruses by antigenic analysis and cytopathic effects in tissue culture: description of 3 new serotypes // Arch. Virol.- 1979.- Vol. 62, № 3.- P. 201208.

86. Krumbholz A., Dauber M., Henke A., Zell R., Knowles N.J. et. al. Sequencing of porcine enterovirus groups II and III reveals unique features of both virus groups // J. Virol.-2002.- Vol. 76.- P. 5811-5821.

87. Krumbholz A., Wurm R., Scheck O. Detection of porcine teschoviruses and enteroviruses by Light Cycler real-time PCR // J. Virol. Methods. 2003.- Vol. 113.-P. 51-63.

88. Lizandi P.M., Kramer E, R. et al. Exponential amplification of nucleic acids: new diagnjstics using DNA polimerase and RNA replicases.// Trends in Biotechnol. -1991,Vol.65. P.53-59.

89. Madr V. Pouzitelnost vaccine proti Kloboukove nemoci pripravenich z viru pomnozeneho na tkanovych kulturach. // Veterinarni medicina, Sbornik Ceskoslovenske Akademie Zemledelskych Ved, Praha, 1961, R.6, 1-2, S 107113.

90. Mayr A. Degress of variation of the virus of Teschen disease and relationship of other enteroviruses of swine // Bull. Off. Int. Epizoot. 1961. - Vol. 56. -P. 106.

91. McConnel S., Spertzel R.O., Shively J.N. Isolation, haracterization and serologic comparison of selected porcine enteroviruses by plaque reduction test // Am. J. Vet. Res.-1968.- Vol. 29.- P. 245-251.

92. Melnic J.L. Enteroviruses: polioviruses, coxsackievirus, echovirus and newer enterovirus I I Filds virology. -1996. P. 655-712.

93. Metianu T. La maladie de Teshen // Bull. Soc. Vet. De France.- 1979.- Vol. 63, №7.- P. 503-517.

94. Morimoto T., Fujiwara H., Watanabe M. Experimental infection of breast-fed piglets with porcine enteroviruses isolated in Japan // Nat. Inst. Animal HealthQuart.- 1965.- Vol. 5, № 1.- P. 1-12.

95. Newman J.F., Rowlands D.J., Brown F. A physicochemical subgrouping of the mammalian picoroviruses // J. Gen. Virol.- 1973.- Vol. 18.- P. 171-180.

96. Oberste M.S., Mäher K., Pallansch M.A. Molecular phylogeney of all human enterovirus serotypes based on comparison of sequences at the 5'- end of the region encoding VP2 // Virus. Res.- 1998.- Vol. 58.- P. 35-43.

97. Oberste M.S., Mäher K., Pallansch M.A. Specific detection of echoviruses 22 and 23 in cell culture supernatants by RT-PCR // J. Med. Virol.- 1999.-Vol.58.- P. 178-1812.

98. Oberste M.S., Mäher K. A., Pallansch M.A. et al. Improved molecular identification of enteroviruses by RT-PCR and amplicon sequencing //J. Clin.Virol. -2003.- Vol. 26.- P. 375- 380.

99. Oberste M.S., Mäher K., Kilpatrick D. R. Molecular evolution of the human enteroviruses: correlation of serotipe with VPI sequence and application to Picornavirus classification //J. Virol.-1999. Vol. 73. - P. 1941 - 1948.

100. Pasloske B.L., Walkerpeach C.R. Obermoeller R. D. et. al. Armored RNA Technology for production of ribonuclease-resistant viral RNA cjntrols and standarts // J. Clin. Microbiol.- 1998.- Vol. 36.- P.- 3590-3594.

101. Picornaviridae / King A.M., Brown Q.F., Christian P. et al.// Virus taxonomy./ Seven Report of the International Committee for the Taxonomy of Viruses.- New York: Academic Press, 2000.- P. 657-673.

102. Pilet E. La meningo-encephalomyelite enzootique du pore a Madagascar // Bull. Off. int. Epiz.- 1952.- Vol. 38.- P. 61-105.

103. Porcine reproductive failure associated with a newly identified "SMEDI" group of picornaviruses / Dunne H.W., Gobble J.L., Hokanson J.F. et al. // Am. J.Vet. Res.- 1965.- Vol. 26.- P. 1284-1297.

104. Pringie C.R. Virys taxonomy at the Xlth International Cjngress of Virology Sydney, Australia Archives of Virol. - 1999. - Vol. 144. - P. 2065 - 2070.

105. Relation of serological and CPE classification of porcine enteroviruses to the classification by immunoperoxidase (IP) staining, and observation of CPE by1. staining method / Honda E., Watanabe I., Okazaki K., Kumagai T. // Japan

106. J. Vet. Sci.- 1990.- Vol. 52.- P. 795-800.

107. Rico-Hesse R., Pallansch M., Nottay B. et. al. The diagnostic of viruses diseases //J. Amer. Med. Assoc.- 1987.- Vol. 257.- P. 1335-1340.

108. Rotbart H.A. Enteroviral infection of the central nervous system // J. Clin. Microbiol. 1995.- Vol. 20.- P.971-981.

109. Sangar D.V. The replication of picornoviruses // J.Gen. Virol. 1979.- Vol. 45.- P.l-11.

110. Savolainen C., Laine P., Mulderst M. N., Hovi T. Sequence analysis of human rhinoviruses in the RNA-dependent RNA polymerase codinq region reveals large within-species variation //J. Gen. Virol.- 2004.- Vol. 85.- P. 2271-2277.

111. Sero and CPE types of porcine enteroviruses isolated from healthy and diar-^ rheal pigs: possible association of CPE type II with diarrhea. / Honda E.,

112. Hattori I.,Oohara Y. et al. // Jap. J. Vet. Sci.- 1990. Vol. 52.- P. 85-90.

113. Siafakas N., Markoulatos P., Stanway G. Molecular classification of coxsackie A viruses on the basis of the 5'-UTR: structural and evolutionary aspects // J. Mol. Evol.- 2002.- Vol. 55. P. 638-652.

114. Stellrecht K. A., Harding F.M., Hussain N.G. et. al. A one-step RT-PCR assay -<"' using an enzyme-linked detection system for the diagnosis of enterovirusmeningitis //J. Clin. Virol. -2000.- Vol.17.- P. 143-149.

115. Sulochana S., Derbyshire J.B. Scanning electron microscopical observations on the cytopathology of porcine enteroviruses in PK-14 cells // J. Gen. Virol.-1977.-Vol. 37, №2.-P. 415-418.

116. Sulochana S., Derbyshire J.B. Use of indirect immunoperoxidase test for detection of porcine enteroviral antigens in infected PK15 cell cultures // Kerala Journal of Veterinary Science.- 1978.- Vol. 9.- P. 111-119.

117. Trefny L. Massive illness of swine in Teschen area // Zverolek. Obz.- 1930.-Vol. 23.- P. 235-236.

118. Warrington R.E. Biophysical studies of Teschen disease virus (Talfan strain) //Arch. Ges Virusforsch.- 1967.- Vol. 21, № 1.- P. 78-90.

119. Watanabe H. Fluorescent antibody technique in cultured cells infected with porcine enteroviruses // Jpn. J. Vet. Res.-1971.- Vol. 19.- P. 1-5.

120. Zell R., Dauber M., Krumbholz A., Henke A. Porcine Techoviruses comprise at least eleven distinct serotypes: molecular and evolutionary aspects // J.Virol. 2001.- Vol. 75.- P. 1620-1631.

121. Zell R., Krumbholz A., Henke A. et. al. Denection of porcine enteroviruses by nRT-PCR: differentiation of CPE groups I-III with specific primer sets // J. Virol. Methods. -2000. -Vol. 88. P. 205-218.