Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Уровень цитокинов у цыплят при воздействии патогенного и вакцинного вируса болезни Марека в сочетании с иммуномодулятором беталейкином

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Уровень цитокинов у цыплят при воздействии патогенного и вакцинного вируса болезни Марека в сочетании с иммуномодулятором беталейкином"

005049792

СЕМИНА АННА НИКОЛАЕВНА

УРОВЕНЬ ЦИТОКИНОВ У ЦЫПЛЯТ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ПАТОГЕННОГО И ВАКЦИННОГО ВИРУСА БОЛЕЗНИ МАРЕКА В СОЧЕТАНИИ С ИММУНОМОДУЛЯТОРОМ БЕТАЛЕЙКИНОМ

06.02.02 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

1 4 ФЬВ 2013

Санкт-Петербург - 2013

005049792

Работа выполнена в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно - исследовательский ветеринарный институт птицеводства» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ «ВНИВИП» Россельхозакадемии)

Научный руководитель:

Придыбайло Николай Дмитриевич, доктор ветеринарных наук, профессор, научный консультант в ООО Научно-производственном предприятии «Авивак».

Официальные оппоненты:

Данко Юрий Юрьевич, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры эпизоотологии инфекционных болезней им. В.П. Урбана ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

Смоленский Владимир Иванович, доктор биологических наук, профессор ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов».

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина»

Защита диссертации состоится «01» марта 2013 года в 13.00 на заседании диссертационного совета Д 220.059.03 при ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 196084, Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

Автореферат разослан «29» января 2013 г. и размещен на сайте ВАК Минобрнауки РФ и Ырр: // spbgavm.ru.

Ученый секретарь диссертационного совета

Белова Лариса Михайловна

1.Общая характеристика работы

Актуальность темы. Болезнь Марека (БМ) — широко распространенное лимфопролиферативное заболевание кур, возбудителем которого является онкогенный ДНК-содержащий герпес вирус болезни Марека (ВБМ) 1-го серотипа. По принятой Всемирной организацией здоровья животных (ВОЗЖ) классификации инфекционных болезней БМ относится к списку В, включающему «заразные болезни, которые имеют существенное значение в области общественной экономики в пределах отдельных стран, а также в международной торговле животными и продуктами животноводства» (Макаров В.В., 2003).

В комплексе мер борьбы с БМ важнейшее место занимает специфическая профилактика. Для этого в мировой практике используют живые вакцины на основе аттенуированных штаммов 1 серотипа, апатогенных 2 и 3 серотипов, а также комбинаций 1-3 серотипов вируса ВБМ. Аналогичные вакцины созданы и в нашей cipane (Коровин Р.Н. и др., 1973; Коровин Р.Н., 1974; КуляшбековаШ.К. и др., 1999; Баррос-Паллома Е.В. и др., 2003).

Однако с появлением высоковирулентных со знаком плюс (w+) и «гипервирулентных» штаммов ВБМ эффективность созданных вакцин стала заметно снижаться. Такие штаммы вызывают цитолитический процесс в главных лимфоидных органах тимусе и бурсе и раннюю смертность птицы, при этом не успевая образовывать опухоли во внутренних органах (Witter R.L., 1997; Witter R.L. et al., 1999; Witter R.L., Kreager K.S., 2004).

Аналогичная ситуация по БМ, хотя и несколько позже, сложилась в РФ. Так, по данным Росптицесоюза её удельный уровень в инфекционной патологии птиц в 2003 г. составил 7,61%, 2005 г. -6,93% и в 2006 г.-3,0%, в то же время в хозяйствах с высокими экономическими показателями он не превышал 0,05-0,02 % от привитого поголовья.

Стало очевидным, что образование высоковирулентных штаммов обусловлено генетической адаптацией ВБМ на фоне иммунизированной птицы и селекция новых штаммов для разработки вакцин не поспевает за эволюцией вируса в природе. Затраты такого поиска могут быть доступны не многим производителям биопрепаратов (Witter R.L., 2007).

Следовательно, для контроля болезни Марека требуется применение альтернативных стратегий, к которым можно отнести применение с вакцинами иммуномодулирующих препаратов нового класса -рекомбинантных форм эндогенных цитокинов (Rachman М.М., Ео S.K., 2012).

До недавнего времени роль цитокинов в патогенности и иммунном ответе при БМ были слабо изучены. Разработка полноценной панели реагентов

увеличение м-РНК ИНФ-у в спленоцитах инфицированных цыплят между 3 и 10 днем цитолитической фазы как у чувствительных, так и резистентных линий цыплят. У чувствительных линий отмечена экспрессия транскриптов ИЛ-6 и ИЛ-18. Изменений уровня цитокинов ИЛ-2 и ИЛ-lß не выявлено (Kaiser Р. et al., 2003). После вакцинации ВГИ получены противоречивые результаты выработки ИНФ-у (Djeraba, А. et al., 2002а).

Цитокин миеломоноцитарный ростовой фактор (МРФ), используемый в качестве адъюванта векторной вакцины ВГИ на основе вируса оспы птиц, предотвращал гибель и снижал развитие опухолей у зараженных патогенным ВБМ цыплят (Djeraba, А. et al., 20026).

В РФ для повышения иммуногенности вакцин против БМ с положительным результатом испытан ронколейкин - полный структурный и функциональный аналог эндогенного ИЛ-2 человека (Егорова В.Н., Островский М.В., 2005).

Особенно стоит остановиться на ИЛ-Iß. В механизме иммунитета при БМ ему принадлежит важная роль (Davison F., Nair V., 2004). Следовательно, возможно применение его рекомбинантной формы одновременно с вакциной против этой болезни.

В ФГУП «ГосНИИ ОЧБ» ФМБА разработан иммуномодулирующий препарат - рекомбинантный ИЛ-lß млекопитающих (беталейкин), усиливающий дифференцировку предшественников Т-лимфоцитов с преимущественной стимуляцией образования Т-хелперов 1 типа (Патент РФ №2142958, 1999; Симбирцев A.C., 2004) и созданы наборы ИФА для определения наиболее важных цитокинов (ИЛ-1а, ИЛ-lß, ИЛ-2 и ИНФ-у). Поэтому представляется своевременным и обоснованным изучить роль цитокинов в патологии БМ, а с учетом гомологии между рекомбинантным ИЛ-lß у птиц и млекопитающих ( Kaiser Р. et al., 1998, 2004; Weining К.С. et al., 1998) и беталейкин в качестве адъюванта при её специфической профилактике.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы являлось изучение цитокинового уровня у цыплят раннего постнатального периода при воздействии патогенным и вакцинным ВБМ в сочетании с беталейкином и обоснование применения этого препарата для повышения эффективности вакцинации кур против болезни Марека. В связи с этим необходимо было решить следующие задачи:

- определить вирулентность двух патогенных штаммов ВБМ для цыплят;

- изучить в динамике цитокиновый уровень (ИЛ-1а, ИЛ-lß, ИЛ-2 и ИНФ-у) в сыворотке крови интактных цыплят раннего постнатального периода и при воздействии патогенными штаммами ВБМ;

- выяснить взаимосвязь между показателями цитокинового уровня и вирулентностью ВБМ для цыплят;

- изучить влияние беталейкина на показатели клеточного иммунитета у цыплят раннего возраста;

- исследовать влияние сочетанного применения беталейкина с сухой вакциной из штамма «ФС-126» против БМ на показатели естественной резистентности (уровень цитокинов, лизосомально-катионный тест и др.) у цыплят раннего возраста;

разработать Методические положения по применению иммуномодулятора беталейкина для повышения естественной резистентности и специфической профилактики болезни Марека.

Научная новизна работы. Методом твердофазного ИФА изучен уровень цитокинов (ИЛ-1а, И Л-Iß, ИЛ-2 и ИНФ-у) у цыплят раннего возраста в норме и при заражении патогенными штаммами вируса болезни Марека.

Впервые установлены дозы, кратность и иммуномодулирующие свойства беталейкина на состояние естественной резистентности организма в ранний период выращивания цыплят.

Впервые экспериментально установлено иммуномодулирующее действие беталейкина при сочетанием применении с сухой вакциной из штамма «ФС-126» против болезни Марека.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований для практического использования в птицеводческих хозяйствах предложен иммуномодулирующий препарат беталейкин, который повышает показатели естественной резистентности (уровень цитокинов, митогенной стимуляции лимфоцитов, фагоцитоза, лизосомально-катионных белков) организма цыплят.

Разработаны Методические положения «Применение иммуномодулятора беталейкина для повышения естественной резистентности и специфической профилактики болезни Марека», утвержденные Координационным Советом по животноводству и ветеринарии ГНУ Северо - Западного регионального научного центра Россельхозакадемии, протокол №1 от 22 января 2013г.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

- определение уровня провоспалительных цитокинов (ИЛ-1а, ИЛ-lß, ИЛ-2 и ИНФ-у) у интактных цыплят раннего возраста;

- результаты изучения уровня цитокинов у цыплят, зараженных вирулентными вирусами БМ;

- данные влияния беталейкина на показатели клеточного иммунитета у цыплят раннего возраста;

- результаты испытаний сочетанного применения иммуномодулятора беталейкина и сухой вакцины из штамма «ФС-126» против болезни Марека на показатели естественной резистентности у цыплят раннего возраста;

- разработка Методических положений по сочетанному применению беталейкина и сухой вакцины против болезни Марека.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на 15-ом Конгрессе - выставке Всемирной птицеводческой научной ассоциации, Пекин, 2007; Научно-практической конференции «Новое в диагностике и профилактике болезней птиц», СПб, 2008; Международной научно-практической конференции «Новые подходы к решению актуальных ветеринарно-санитарных и зоотехнических проблем в птицеводстве на современном этапе», СПб, 2011; И-ом Международном конгрессе ветеринарных фармакологов и токсикологов, посвященного восьмидесятилетию засл. деят. науки РФ, проф. Соколова В.Д. « Эффективные и безопасные лекарственные средства в ветеринарии», СПб, 2012.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе одна в журнале, входящем в список ВАК.

Личный вклад. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 8 рисунками. Список литературы включает 205 источников, из которых 125 зарубежных.

2. Собственные исследования

Диссертационная работа выполнена в 2007-2012 гг. в лаборатории фармакологии ГНУ «ВНИВИП» Россельхозакадемии в соответствии с планом НИР и ОКР на тему: «Изучение циркуляции патогенных штаммов вируса болезни Марека и разработка рекомендаций по профилактике заболевания в птицеводческих хозяйствах Ленинградской области» (20062007 гг.), теме 08.07.12 «Изучить профилактические свойства интерлейкинов при заражении цыплят вирулентным вирусом БМ» (2008-2010гг.), аспирантской теме: «Уровень цитокинов у цыплят раннего поетнатального периода при воздействии патогенного и вакцинного вируса болезни Марека в сочетании с иммуномодулятором» (2010 — 2012 гг.).

2.1. Материалы и методы исследовании

Экспериментальные исследования провели на 536 цыплятах яичного направления 1- 105 сут возраста, которых инкубировали из СПФ-яиц фирмы «Lohmann Tierzucht» (Германия) в условиях ГНУ «ВНИВИП» Россельхозакадемии (50голов), и получали из ЗАО «Птицефабрика «Лаголово» (кросс «Хайсекс коричневый») и ЗАО «Птицефабрика «Синявинская» (кросс «Хайсекс белый») Ленинградской области.

Патогенные вирусы БМ и специфические иммунные сыворотки. В экспериментальных условиях для заражения цыплят использовали штаммы «GM» и «11/85» ВБМ, а для выявления их антигенов в биологическом материале - специфические иммунные сыворотки, любезно предоставленные докт. биол. наук Ярыгиной Е.И. из ГНУ «ВНИТИБП» Россельхозакадемии.

Вакцинный вирус. В экспериментах использовали производственные серии сухой вакцины из штамма «ФС-126» ВГИ, изготовленные в ФГУП «Щелковский биокомбинат».

Вируссодержащий материал. У цыплят 1-105-сут. возраста, экспериментально инфицированных в виварии ГНУ «ВНИВИП» Россельхозакадемии патогенными ВБМ, иммунизированных ВГИ и интактных, в разное время получали пробы перьевых фолликулов, крови цыплят и селезенки.

Д иагностикум ы. Наборы реактивов для твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) ИЛ-1а, ИЛ-Iß и ИФН-у, производство ООО «Цитокин», СПб; ИЛ-2, производство ООО «Протеиновый контур», СПб. Чувствительность метода для ИЛ-1а составила 20 пг/мл, ИЛ-lß - 10 пг/мл, ИЛ-2 - 10 пг/мл и ИНФ-у - 30 пг/мл.

Иммуномодулятор. В качестве иммуномодулятора использовали рекомбинантный бетапейкин человека (рчИЛ-lß), производство ФГУП «ГосНИИ ОЧБ» ФМБА

Питательные среды, сыворотки, растворы и реактивы. Использовали агар «Дифко»; питательную среду Игла MEM, жидкую; раствор глюкозы 15%-ный; раствор трис-буфера 0,2М; раствор 0,1 Н соляной кислоты; метанол; 96° этиловый спирт; 0,25%-ный водный раствор азура А; натрий хлористый (NaCI), х. ч., ГОСТ 4233, производство ОАО «Реактив»; дистиллированную воду.

Получение проб сывороток крови и селезенки. Для исследования показателей неспецифической резистентности у птиц пробы цельной венозной крови отбирали утром до кормления. Сыворотку крови получали методом центрифугирования. Селезенки цыплят забирали в асептических условиях. Гомогенизировали в среде RPMI-1640 (Sigma) и фильтровали через два слоя стерильной марли. Гомогенат центрифугировали и затем лизировали

эритроциты. Спленоциты дважды отмывали средой. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева. Концентрацию клеток доводили до 1,0х 107 в одном миллилитре средой RPMI-1640.

Определение антигена (АГ) ВБМ в фолликулах очинов пера в реакции диффузной преципитации. От экспериментально инфицированных ВБМ цыплят получали эпиляцией с наружной поверхности бедра и крыльев 10-12 перьев с хорошо выраженными очинами. Часть пера, входящую в кожу (фолликулы), измельчали ножницами и заливали физиологическим раствором с 0,5% фенолом в соотношении 1:10. Экстрагирование вируса проводили при температуре +4°С в течение суток, после чего для получения клеточно-свободного вируса в фолликулах очинов пера перед исследованием 3-кратно замораживали - оттаивали. Отстоявшийся верхний слой жидкости исследовали в реакции диффузионной преципитации (РДП) в агаровом геле с положительными сыворотками по общепринятой методике.

Антитела к ВБМ и ВГИ в сыворотке крови исследовали аналогично предыдущей методике, для чего к испытуемой сыворотке добавляли антиген с известным титром.

Сравнительную оценку вирулентных свойств штаммов «GM» и «11/85» ВБМ проводили комплексно, включая патологоанатомические изменения во внутренних органах цыплят, характерные для болезни Марека.

Исследования вдтокинов ИЛ-1а, ИЛ-ip, ИЛ-2 и ИНФ-у в сыворотке крови (по 7 проб) интактных цыплят разного возраста, а также зараженных патогенными штаммами «GM» и «11/85» ВБМ и привитых вакцинным штаммом «ФС-126» ВГИ проводили наборами реагентов для твердофазного ИФА. Результат анализа вычисляли по калибровочному графику после измерения оптической плотности.

Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) селезенки. Для стимуляции пролиферации лимфоцитов, взятых у суточных цыплят, которым водили беталейкин в дозе 200, 20 и 2 нг и интактных цыплят, к ним добавляли раствор митогена конканавалин А (Кон A, Sigma) в концентрации 10 мкг/мл, нетоксичной для клеток, но способной вызывать бласттрансформацию. Культуру клеток инкубировали в среде СОг при 37 °С. За 16 часов до окончания периода культивирования во все лунки планшета вносили изотоп 3Н-тимидина. По окончании культивирования подсчитывали количество клеток, трансформировавшихся в бласты, используя для этого автоматический сцинтилляционный счетчик (Rackbeta 1217). Соотношение количества импульсов/мин без добавления КонА к аналогичному показателю с добавлением Кон А выражает индекс стимуляции (ИС) [Фримель Г.,1987].

Реакцию фагоцитоза с опсоно-дрожжами ставили по методу В.М. Бермана и Е.М. Славской (1982). Для этого использовали дрожжевую суспензию 10э

клеток/см'1 в 0,15 М NaCI. В планшет вносили 180 мкл гепаринизированной крови и 20 мкл дрожжей, после чего инкубировали в термостате с углекислым газом (С02) в течение 30 минут. После окончания инкубации мазки окрашивали по Романовскому - Гимзе и под микроскопом подсчитывали процент активных фагоцитов на 100 лейкоцитов (псевдоэозинофилов). Фагоцитарный индекс (ФИ) вычисляли делением числа фагоцитированных дрожжевых клеток на число активных псевдоэозинофилов, а фагоцитарное число (ФЧ) - путем делением числа фагоцитированных дрожжей на общее число подсчитанных псевдоэозинофилов.

Содержание неферментных катионных белков в лизосомах нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитов птиц определяли по методу Л.С. Колабской и др. (1985).

Количественное содержание эритроцитов и лейкоцитов, гемоглобина, реакции оседания эритроцитов (РОЭ) в пробах крови птиц проводили общепринятыми методами в описании В.М. Митюшникова (1985).

Статистическая обработка. Полученные результаты исследований с нормальным распределением выражали в виде средней арифметической (М) и её ошибки (М±ш), оценку различий между сравниваемыми показателями осуществляли с помощью парного f-критерия Стьюдента, а при непараметрическом распределении средние величины сравнивали ранговым Х- критерием Ван-дер-Вардена. Значимыми считали различия не менее Р<0,05 (Лакин Г.Ф., 1990).

2.2, Результаты собственных исследований 2.2.1. Определение вирулентности штаммов вируса болезни марека (ВБМ) для цыплят.

Вирулентность - это степень патогенности конкретного микроорганизма. Он считается вирулентным, если при внедрении в организм даже в исключительно малых дозах приводит к развитию инфекционного процесса. С учетом этого был проведен опыт по комплексной оценке вирулентных свойств штаммов «GM» и «11/85» ВБМ.

В первом опыте были взяты цыплята суточного возраста, которых разделили на 3 группы по 100 голов в каждой. Цыплята 1- и 2-ой группы в 3-сут. возрасте были заражены штаммами «GM» и «11/85», соответственно, в количестве 500 ФОЕ и объеме 0,2 см3, внутрибрюшинно, а цыплята 3-й группы служили интактным контролем. Во время проведения опыта, продолжительность которого составила 105 дней, цыплята всех групп содержались изолированно.

В фолликулах очинов пера цыплят всех групп определяли наличие антигена в РДП на 17, 56, 66, 91 и 99 сут (%), антител - аналогично на 56 сут, сроки

появления первого случая БМ, общее количество павших цыплят, в т.ч. от БМ, в период опыта и после убоя по окончанию опыта. Уровень наиболее важных цитокинов - ИЛ-1а, ИЛ-1Р, ИЛ-2 и ИНФ-у исследовали наборами ИФА соответствии с инструкцией по их применению в пробах сывороток крови интактных цыплят в 1, 17 и 56 сут и зараженных ВБМ в 17 и 56 сут возрасте. Первый срок исследований определялся появлением ВБМ в фолликулах очинов пера, второй - наличием антител в сыворотке крови.

Результаты сравнительных исследований заражения цыплят вирулентными штаммами ВБМ представлены в табл. 1.

Таблица 1.

Сравнительная вирулентность штаммов ВБМ для цыплят

Проводимые исследования Группы цыплят

1 2 3

Количество цыплят на начало опыта 100 100 100

Заражение вирусом, объём в см3 0,2 0,2 -

Продолжительность опыта, сут 05 105 105

Первый случай БМ, сут 64 87

Пало голов 19 10 6

в т.ч. от БМ 13 4 -

Убито голов для исследования

цитокинов:- в суточном возрасте - - 10

- в 17 сут 6 6 6

Исследовано проб очинов пера: 56 56 10

- положительных 33 20 -

- % положительных 58,9 35,7 -

Исследовано проб сывороток крови: 25 25 -

- положительных 5 2 -

- % положительных 20,0 8

Убито в конце опыта, голов 75 84 78

Выявлено БМ на вскрытии, голов 27 4 -

Всего случаев БМ, голов 40 8 -

Удельный вес БМ,% 42,5 9,5 -

Данные табл. 1 показывают, что при заражении цыплят штаммами «ЄМ» и «11/85» инфицированность фолликулов очинов пера составила 58,9 и 35,7%, при этом антиген обнаружен в первом случае на 17 сут, во втором - на 56 сут. Наличие антител в пробах сывороток крови цыплят, зараженных штаммом «ЄМ» и «11/85», выявлено на 56 сут опыта в 5 и 2 пробах из 25 исследованных (20% и 8%, соответственно). Первый случай болезни Марека при

ю

инфицировании штаммом «СМ» установлен на 64 сут, а штаммом «11/85» значительно позже - 87 сут. В ходе опыта от БМ в этих группах пало 13 и 4 цыпленка, а при патологоанатомическом вскрытии выявлено дополнительно 27 и 4 случая. Всего от БМ за время опыта пало 40 и 8 цыплят или 42,5% и 9,5%, соответственно.

В интактной группе цыплят случаев инфицирования очинов пера, положительных проб на антитела в сыворотках крови и смертности цыплят от БМ не выявлено.

Результаты исследования цитокинов ИЛ-1а, ИЛ-1р, ИЛ-2 и ИНФ-у в сыворотке крови цыплят подопытных и интактной групп приведены в табл. 2.

Таблица 2.

Уровень цитокинов в сыворотке крови заражённых ВБМ и интактных

цыплят (пг/мл).

Цитоки Воз- Группы цыплят

-ны раст, сут

1 2 3

Пределы колебаний Сред, знач. Пределы колебаний Сред, знач. Пределы колебаний Сред, знач.

ИЛ-1а 1 - - - - 24 - 430 159

17 0-122 86 39-462 178** 0-280 112

56 54 - 342 175** 73 - 257 124 39-342 100

ИЛ-ф 1 - - - - 0-24 7,3

17 6,3 -10,5 8,4 0-25 9,3 0-23 7,8

56 5,2 -15,7 11,6* 3,4-8,2 6,4 2,60-18 5,9

ИЛ-2 1 - - - - 30 - 238 115

17 18-1100 253* 30 -1050 269* 10 -140 79

56 236 -1000 773 120 -1000 570 560 - 840 657

ИНФ-у 1 - - - - 37-702 131

17 34-50 46* 31-135 104 31-197 79*

56 48-300 106 26-218 94 30-400 132

*Р<0,05 и ** Р<0,01 - уровень достоверности по отношению к контролю.

Из представленных данных табл.2 видно, что уровень всех исследованных цитокинов методом ИФА в сыворотке крови интактных и зараженных ВБМ цыплят подвержен значительным колебаниям. Тем не менее, их средние величины превышают чувствительность используемых наборов ИФА.

Например, у интактных цыплят разного возраста количество ИНФ-у равно 79132 пг/мл, а чувствительность его определения 30 пг/мл. Полученный результат соответствует аналогичным данным, определенным в лимфоцитах селезенки вакцинированных против ньюкаслской болезни и интактных цыплят (113,8±1,6 и 23,3±1,1 пг/мл) с применением в непрямом «сэндвич-варианте» ИФА детекторных антител к куриному ИНФ-у (Ирза A.B. и др., 2009).

Статистическая обработка результатов исследований цитокинов, проведенная непараметрическим Х-критерием Ван-дер-Вардена, выявила, что в сыворотке крови цыплят, заражённых штаммом «GM» ВБМ, уровень ИФН-у на 17-е сут был достоверно ниже (Р<0,05), а ИЛ-2 в этом же возрасте, ИЛ-1-a и ИЛ -lß на 56-е сут - выше (Р<0,01; Р<0,01 и Р<0,05, соответственно) по сравнению с контрольной группой. Штамм «11/85», обладающий более низкой вирулентностью, вызывал на 17-е сут только достоверное повышение уровня ИЛ-la (Р<0,01) и ИЛ-2 (Р<0,05).

О снижении уровня ИФН-у в сыворотке крови цыплят после инфицирования БМ ранее сообщали Xing Z., Schat К.А.,2000, a, b; Kaiser Р. et al., 2003.

В следующем опыте 50 сут цыплят, полученных из СПФ-яиц, заражали в суточном возрасте более вирулентным штаммом «GM» ВБМ в дозе 500 ФОЭ в объеме 0,2 см3, внутрибрюшинно. До заражения, на 3, 8, 11 (пик кратковременной цитолитической фазы инфицирования по данным Buscaglia С. et al., 1988; Schat К.A., Xing Z., 2000), 15 и 20 сут после заражения была получена сыворотка крови (по 6 проб) и исследована на содержание цитокинов. Результаты исследования представлены на рис. 1.

400 350 300 250 200 150 100 50 0

336

11 сутки

I

щ

Зж. • Шк S

|ИНФ-гамма ЕИЛ-1альфа ИИЛ-2 нИЛ-1бета

Рис.1. Уровень цитокинов в динамики при заражении вирулентным штаммом ВБМ

На рис. 1 видно, что в сыворотке крови цыплят до заражения уровень ИНФ-у составил 34 (пг/мл); ИЛ-1а - 167; ИЛ-2 - 20; ИЛ-1|3 - 7. Группе цыплят заражённых штаммом «ОМ», уровень ИЛ -1а на 3-е сут опыта равнялся 336 пг/мл, но в дальнейшем он снижался на протяжении всего периода исследования, особенно с 8-х по 15-е сут. ИФН -у определен только на 11 сут в количестве 31пг/мл, ИЛ -2 - на 3-е сут в количестве 24 пг/мл, но на 8-е сут его уже не обнаруживали. Уровень ИЛ-1Р составил на 8-е сут исследований 6 пг/мл, 11 сут - 8 пг/мл, 15 и 20-е сут - 10 пг/мл.

Таким образом, результаты изучения уровня цитокинов методом ИФА в сыворотке крови инфицированных ВБМ цыплят, показали, что этот тест является важным дополнением к характеристике патогенности штаммов ВБМ 2.2.2. Влияние имуномодулятора бсталейкина на иммунологические показатели у цыплят раннего возраста.

Актуальность проблемы восстановления иммунологических нарушений с помощью иммунокорригирующих препаратов нового поколения в настоящее время несомненна. Для этих целей нами выбран препарат беталейкин (рекомбинантный ИЛ - 1Р млекопитающих). Иммуностимулирующее действие препарата, разрешенного в медицинской практике, реализуется путем повышения функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов, индукции дифференцировки предшественников иммунокомпетентных клеток, усиления пролиферации лимфоцитов, активации продукции цитокинов и увеличения антителообразования (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С.,2008).

Для изучения влияния беталейкина на иммунологические показатели у цыплят суточного возраста кросса «Хайсекс коричневый» избрали РБТЛ и реакцию фагоцитоза. Было сформировано 4 группы цыплят по 24 головы в каждой. В тот же день цыплятам 1 - 3-й группы внутримышечно вводили беталейкин в дозе 200, 20 и 2 нг в объеме 0,2 см3, соответственно, а 4-я группа была интактным контролем. У цыплят в суточном, а затем в 3, 7, 10 и 16- сут возрасте были отобраны пробы крови и селезенки (по 6 на каждое исследование). Пробы селезенки доставляли в лабораторию иммунофармакологии ФГУП «ГосНИИ ОЧБ» ФМБА, где по общепринятой методике из них получали лимфоциты. РБТЛ ставили с митогеном КонА, который вносили в лимфоциты всех групп в дозе 10 мкг/мл. Результаты исследований ИС представлены в табл. 3.

Влияние беталейкина на ИС лимфоцитов селезенки в РБТЛ

Группы цыплят Отбор проб, сут Доза беталейкина, нг Индекс стимуляции

Кон А, 10 мкг/мл

До заражения 1 - 0,3

1 3 200 0

- « - 3 20 3,3

- « - 3 2 3,0

- « - 3 - 0,5

2 7 200 1,7

- « - 7 20 8,3

- « - 7 2 8,1

- « - 7 - 4,5

3 10 200 5,3

-«- 10 20 8,5

-«- 10 2 2,8

-«- 10 - 18,8

Анализ данных табл. 3 показал, что в пробах селезенки без беталейкина, но с добавлением Кон А, ИС составил 0,3. С увеличением возраста цыплят ИС во много раз возрастал, особенно на 10 сут, когда он составил 18,8.

Беталейкин при введении цыплятам в дозе 20 нг с добавлением Кон А увеличивал ИС в сравнении с контрольной группой цыплят соответствующего возраста на 3 и 7-е сут в 5,5 и 1,8 раза, при дозе 2 нг - только на 7-е сутки в 1,8 раза. Доза препарата 200 нг не приводила к увеличению ИС в сравнении с контрольной группой.

Полученные результаты в РБТЛ показывают, что беталейкин в дозе 20 нг оказывает стимулирующее влияние на Т-клеточное звено иммунитета.

Пробы крови цыплят в аналогичные промежутки времени, что и пробы селезенки, были исследованы в реакции фагоцитоза с опсоно-дрожжами.

Результаты исследования влияния беталейкина на показатели фагоцитоза -фагоцитарный индекс (ФИ) и фагоцитарное число(ФЧ) представлены в табл. 4.

Влияние беталейкина на показатели ФИ и ФЧ у цыплят раннего возраста

Группы Доза, нг Сроки исследования, сут

цыплят 7 10 16

ФИ ФЧ ФИ ФЧ ФИ ФЧ

1 200 11,5+ 1,5** 2,7+ 0,27 16,8+ 2,0** 2,44+ 0,23 26,2+ 2,8 2,28+ 0,24

2 20 8,3+ 2,1 2,4± 0,39 13,3± 2,3* 2,32± 0,19 22,7± 3,3 2,38+ 0,2

3 2 3,8+ 0,6 2,23+ 0,3 10,8+ 2,3 2,37± 0,7 19,0± 4Д 2,58± 0,1

4 - 5,7+ 0,6 2,78+ 0,2 7,5 + 1,2 2,36+ 0,54 22,1+ 1,0 2,02± 0,37

*- Р<0,05; **- Р<0,01; уровень достоверности по отношению к контролю.

Данные, полученные в реакции фагоцитоза (табл. 4), показывают, что при введении цыплятам беталейкина в дозе 200 нг происходит увеличение ФИ на 7-е и 10-е сут (Р<0,01), а при дозе 20 нг - на 10-е сут (Р<0,05) по сравнению с этим показателем в контрольной группе. Значения ФИ и ФЧ между первой и второй группами цыплят во все исследуемые сроки достоверно не различаются (Р<0,05). Препарат в дозе 2 нг не изменял уровни ФИ и ФЧ.

Можно констатировать, что беталейкин в дозах 200 и 20 нг оказывает стимулирующее действие на показатель фагоцитоза у цыплят раннего возраста.

2.2.3. Изучение сочетанного введения беталейкина с вакциной против болезни Марека на показатели естественной резистентности у цыплят раннего возраста.

Создавшаяся обстановка по БМ вызывает необходимость изыскания новых препаратов для повышения естественной резистентности и стимуляции иммунной системы птицы на проведенную вакцинацию. Исходя из этого, дальнейшей целью наших исследований явилось изучение эффективности введения беталейкина в дозе 20 нг при сочетанном его применении с вакциной из штамма «ФС-126» против болезни Марека на показатели естественной резистентности, прирост живой массы и морфологический состав крови. Выбор данной вакцины обусловлен её широким применением в практике, в связи с относительно невысокой стоимостью и отсутствием необходимости использования жидкого азота при хранении.

2.2.3.1. Определение уровня цитокинов в сыворотке крови цыплят.

Опыт проводили на 90 цыплятах суточного возраста кросса «Хайсекс

коричневый». Было сформировано 3 группы по 30 голов в каждой. В тот же день цыплятам 1-й группы вводили беталейкин на физиологическом растворе в дозе 20 нг в 0,2 см3 подкожно и вакцину сухую из штамма «ФС - 126» в дозе 2 тыс ФОЕ и объеме 0,2 см3 внутримышечно, цыплят 2-й группы - привили только вакциной «ФС-126», аналогично 1-й группе и цыплята 3-й группы были интактным контролем.

Результаты исследования уровня цитокинов ИНФ-у и ИЛ-1(3 в сыворотке крови цыплят методом ИФА на 4, 7, 10 и 14-й день после вакцинации представлены в табл.5.

В результате проведенных исследований было установлено (табл. 5), что уровень цитокинов в сыворотке крови цыплят до начала исследований был следующим: среднее значение ИНФ-у составило 69 пг/мл и ИЛ-1р - 13,7 пг/мл, соответственно.

В 1-й группе цыплят, которым вводили препарат беталейкин и вакцину, уровень ИНФ-у значительно повысился; на 4-е сут составил 385,2 пг/мл, 7-е — 188.8 пг/мл, 10-е - 132,4 пг/мл, и только на 14-е сут он имел исходный уровень (82,0пг/мл).

г;Во 2-й группе цыплят, привитых только вакциной, увеличение уровня ИНФ-у на 4, 7 и 10-е сут было менее значительным (116,2; 107,2; 115,4 пг/мл) по сравнению с введением беталейкина и вакцины.

Таблица 5.

Уровень цитокинов в сыворотке крови цыплят.__

Группы цыплят и сроки исследования Цитокины, пг/мл

ИНФ -г ИЛ-1Р

Пределы колебаний Среднее знамени е Пределы колебаний Среднее значение

1-е сутки (фоновое значение) 49 -100 69 12,5 -16,6 13,7

4-е сутки 1-я гр. (беталейкин) 2-я гр.(контр. вакцины) 3-я гр. (чистый контроль) 220-510 77-152 22-47 385,2* 116,2* 31,2 26-43 6,3-13,2 5,8 -11 33,5* 11,4 9,4

7-е сутки 1-я гр. (беталейкин) 2-я гр.(контр. вакцины) 3-я гр. (чистый контроль) 146 - 230* 62-72 20 - 44 188,8* 68 31,2 9,8 -14,8* 9,4 -13,5 4 -15,6 12,1* 11,7 7,03

10-е сутки

1-я гр. (беталейкин) 100 -198 132,4* 21,5- -27,9* 25,8*

2-я гр. (контр, вакцины) 86 152* 115,4 13,5 -28,4 22,0

3-я ф. (чистый контр.) 50 -98 75,4 11- 17,6 14,3

14-е сутки

1-я гр. (беталейкин) 70- -88* 82 10,5 -14,0 12,4

2-я гр. (контр.вакцины) 49- -97 70,8 9,2- 13,7 11,6

3-я гр. (чистый контр.) 50- 75 63,6 7,4- 10,0 9,2

*- Р< 0,05 достоверно по отношению к контролю

У цыплят 1-й и 2-й групп на 4-е и 7-е сут выявлено достоверное повышение уровня ИНФ-у (Р<0,05).

Уровень ИЛ-1Р в 1-й группе цыплят на 4-е сут составил 33,5 пг/мл по сравнению с аналогичным показателем во 2-й и 3-й группах - 11,4 и 9,4 пг/мл. Так же на 7-е сутки и 10-е сутки отмечается достоверное повышение данного цитокина в 1-й группе цыплят (Р<0,05).

2.2.3.2. Показатели лизосомально-катионного теста, прироста живой массы и морфологического состава крови у цыплят.

В качестве второго показателя неспецифической резистентности при назначении беталейкина и вакцины против болезни Марека нами был выбран лизосомально - катионный тест. До начала и на 14 сутки опыта у цыплят были взяты пробы крови по 6 голов из каждой группы. Данные исследований представлены в табл. 6.

Таблица 6.

Показатель лизосомально-катионного теста у цыплят.

Группа цыплят Ед. %

до опыта 1,50±0,07 -

Беталейкин + вакцина 0,78±0,06* 152,94

вакцина 0,60+0,07 117,64

контроль 0,51+0,08 100,00

*- Р<0,05 достоверны по отношению контролю

Как показывают полученные данные теста (табл.6), количество неферментных катионных белков в лизосомах гранулоцитов крови цыплят, которым вводили беталейкин и вакцину, составило 0,78 Ед. (152,94 %), одну вакцину - 0,60 Ед. (117,64 %) и в контроле - 0,51 Ед. (100,0%). Следовательно, группа цыплят, получавших препарат беталейкин и вакцину, имела изучаемые показатели достоверно выше (Р<0,05), чем остальные группы. Тем самым, усиливается бактерицидная способность данных клеток, что может составлять благоприятный прогностический признак и свидетельствует о повышении уровня естественной резистентности организма цыплят.

К дополнительным исследованиям уровня естественной резистентности птицы относятся определение форменных элементов крови, гемоглобина, СОЕ, лейкоцитарной формулы и прирост живой массы, которые позволяют судить об иммунном статусе в разные сроки онтогенетического развития, а также при воздействии на организм биологических и химиотерапевтических препаратов.

С учетом этого были отобраны образцы проб крови от цыплят 1-3 групп до начала и на 14-е сутки опыта.

Результаты исследования представлены в табл. 7.

Таблица 7.

Морфологические показатели крови цыплят после назначения беталейкина

Показатели До опыта 1-я группа 2-я группа 3-я группа

Эритроциты, 1012/л 2,2±0,1 2,9+0,1 3,0+0,3 2,8±0,1

Гемоглобин, г/л 101,5+7,9 163,1+18,1 171,8±22,2 133,3+20,2

СОЭ, мм/час 2,5+0,2 0,5±0,0 1,2±0,2 1,0±0,0

Лейкоциты, 109/л 20,2±1,7 24,0+0,8 25,8+5,1 24,6±1,6

Базофилы, % 0,4±0,4 0±0 1,3+0,7* 0±0

Эозинофилы, % 5,8±1,5 6,5+1,5 6,7+0,7 6,7+1,0

Псевдоэозинофилы п/я,% 6,0±1,3 3,5+0,5 1,7±0,8 3,3+0,3

Сегментоядерные, % 23,2+1,6 22,5+3,5 18,0±1,0 19,7±2,2

Лимфоциты, % 60,6+3,3 62,0±6,0 69,7±0,9 66,2±3,3

Моноциты, % 4,0±0,9 5,5+0,5 2,7±0,7 4,2+0,5

* - Р< 0,05 достоверно по отношению к контролю

Данные габл. 7 показывают, что существенных изменений в картине крови цыплят под действием препарата беталейкина и вакцины из штамма «ФС —126» по сравнению с контролем не отмечено. Тем самым они не влияет на естественное течение физиологических процессов в организме цыплят в ранний постнатальный период.

Взвешивание подопытных и контрольных цыплят проводилось в первые две недели ежедневно.

Данные, среднесуточных привесов показали, что у цыплят 1 и 2-й группы, начиная с 6 и 8-х суток, соответственно, происходит достоверное увеличение привесов (Р<0,05 и Р<0,01) по сравнению с аналогичным показателем у цыплят контрольной группы. Комбинированное введение беталейкина и вакцины еще больше увеличивает показатель прироста живой массы цыплят.

Выводы

1. Уровень провоспалительных цитокинов ИЛ-1а, ИЛ-2, ИЛ-10 и ИНФ-у, определенный в сыворотке крови интактных и зараженных ВБМ цыплят наборами твердофазного ИФА для млекопитающих, подвержен широким колебаниям. Их средние величины соответствуют аналогичным показателям у человека и значительно превышают минимальную пороговую чувствительность используемых наборов.

2. В сыворотке крови цыплят, заражённых штаммом «ОМ» ВБМ, уровень ИФН-у на 17-е сут был достоверно ниже (Р<0,05), а ИЛ-2 в этом же возрасте и ИЛ-1а и ИЛ -1р на 56-е сут - выше (Р<0,05 - Р<0,01) по сравнению с контрольной группой. Штамм «11/85», обладающий более низкой вирулентностью, вызывал на 17-е сут только достоверное повышение уровня ИЛ-1а (Р<0,01) и ИЛ-2 (Р<0,05).

3. Уровень цитокинов в сыворотке крови цыплят, наряду с показателями инфицирования антигеном фолликулов очинов пера, наличием антител в сыворотке крови, появлением первых случаев заболевания и процентом смертности, является показателем патогенности штаммов вируса болезни Марека (ВБМ).

4. Иммуномодулятор беталейкин, введенный суточным цыплятам в дозе 20 нг однократно подкожно в объеме 0,2 см3 максимально увеличивает индекс стимуляции в реакции бласттрансформации лимфоцитов селезенки и реакции фагоцитоза.

5. Совместное введение препарата беталейкина в дозе 20 нг и вакцины «ФС -126» против болезни Марека повышает показатели естественной резистентности цыплят: уровень провоспалительных цитокинов в сыворотке крови - ИНФ-у - с 4-х по 7-е сутки и ИЛ-1р на 4-е сутки (Р< 0,05); содержание катионных белков в гранулоцитах; увеличивает прирост средней живой массы и не оказывает отрицательного действия на морфологический состав крови цыплят.

6. Беталейкин может использоваться в практике птицеводства для повышения эффективности специфической профилактики болезни Марека.

Практические предложения.

1 .Разработана доза и схема применения иммуномодулятора беталейкина для повышения естественной резистентности у цыплят раннего возраста.

2. Для практических работников птице хозяйств разработаны методические положения по «Применение иммуномодулятора беталейкина для повышения естественной резистентности и специфической профилактики болезни Марека» (утверждены на Координационном Совете по животноводству и ветеринарии ГНУ Северо - Западного регионального научного центра Россельхозакадемии, протокол №1 от 22 января 2013 г.).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Статья в журнале из списка, рекомендованного ВАК Минобразования и науки РФ:

1. Семина А.Н. Влияние беталейкина на иммунологические показатели у цыплят раннего возраста / А.Н. Семина, A.C. Симбирцев, A.B. Петров, Н.Д. Придыбайло // Ветеринарная Практика.-2012.-№ 1 (56).-С.28-30.

Работы, опубликованы в сборниках научных трудов и материалов конференций:

2. Придыбайло Н.Д. Цитокины - возможный путь повышения эффективности вакцинации против болезни Марека / Н.Д. Придыбайло, Э.Д. Джавадов, А.Н. Семина и др. // БИО.-2007.-июль,- С.4-7.

3. Семина А.Н. Уровень цитокинов в сыворотке крови цыплят после введения иммуномодулятора беталейкина и вакцины против болезни Марека / A.IL Семина, Н.Д. Придыбайло, A.C. Симбирцев и др. // Эффективные и безопасные лекарственные средства в ветеринарии: матер. II Межд. конгр. вет. фармак. и токсик., поев, восьмидесятилетию засл. деят. науки РФ, проф. Соколова В. Д.- СПб,2012.-С.238-240.

4. Семина А.Н. Влияние беталейкина и бестима на иммунную и антиоксидантную систему организма птицы / А.Н. Семина, A.B. Святковский, П.С. Рябцев II Эффективные и безопасные лекарственные средства в ветеринарии: матер. II Межд. конгр. вет. фармак. и токсик., поев, восьмидесятилетию засл. деят. науки РФ, проф. Соколова В. Д.- СПб,2012,-С.240-241.

5. Семина А.Н. Влияние некоторых антиоксидантов на неспецифическую резистентность организма цыплят / А.Н. Семина, A.B. Святковский, П.С. Рябцев // Новые подходы к решению актуальных ветеринарно-санитарных и зоотехнических проблем в птицеводстве на современном этапе: матер, межд. научн.-практ. конф. 7-8 июня 2011 г.-СПб., 2011.-С.107-110.

Тиражирование и брошюровка выполнены в учреждении «Университетские телекоммуникации» 197101, Санкт-Петербург, Саблинская ул., 14 Тел. (812) 233 46 69. Объем 1,0 у.п.я. Тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Семина, Анна Николаевна, Санкт-Петербург

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО - ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ ПТИЦЕВОДСТВА

УРОВЕНЬ ЦИТОКИНОВ У ЦЫПЛЯТ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ПАТОГЕННОГО И ВАКЦИННОГО ВИРУСА БОЛЕЗНИ МАРЕКА В СОЧЕТАНИИ С ИММУНОМОДУЛЯТОРОМ БЕТАЛЕЙКИНОМ.

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

СЕМИНА АННА НИКОЛаькиа

СО 00

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор Придыбайло Н.Д.

Санкт-Петербург - 2013 г.

Содержание

Введение.................................................................................5стр

. Обзор литературы.................................................................Юстр

.¡.Характеристика болезни Марека..............................................Юстр

.1.1. Таксономия, морфология, серотипирование, антигенный состав и

геномное картирование вируса болезни Марека................................Юстр

.1.2. Эпизоотологические данные................................................Метр

.1.3. Течение и симптомы, резистентность болезни Марека................15стр

.1.4. Выделение вируса болезни Марека и дифференциальная

диагностика.............................................................................17стр

.1.5. Иммунитет при болезни Марека и эволюция вируса..................19стр

.1.6. Специфическая профилактика болезни Марека..............................21стр

.2. Применение иммуномодуляторов в птицеводстве.........................28стр

.3. Роль цитокинов при болезни Марека........................................31стр

.4. Характеристика беталейкина..................................................Збстр

.5. Заключение........................................................................39стр

2. Собственные исследования.......................................................40стр

2.1. Материалы и методы исследования..........................................40стр

2.1.1. Материалы исследований.....................................................40стр

2.1.2. Методы исследований.........................................................42стр

2.2. Результаты собственных исследований.......................................48стр

2.2.1. Определение вирулентности штаммов вируса болезни Марека (ВБМ) для цыплят.............................................................................48стр

2.2.2. Влияние иммуномодулятора беталейкина на иммунологические показатели у цыплят раннего возраста............................................61стр

2.2.3. Изучение влияния сочетанного введения беталейкина с вакциной против болезни Марека на повышение естественной резистентности и

специфической профилактики......................................................65стр

2.2.3.1. Определение уровня цитокинов в сыворотке крови цыплят........ббетр

2.2.3.2. Показатели лизосомально-катионного теста, прироста живой массы и

крови у цыплят........................................................................70стр

3. Обсуждение результатов исследований......................................75стр

4. Выводы................................................................................83стр

5. Практические предложения......................................................84стр

6. Список литературы.................................................................85стр

7. Приложение........................................................................1 Обстр

Список сокращений

АГ - антиген

АТ - антитела

БМ - болезнь Марека

ВБМ - вирус болезни Марека

ВГИ - вирус герпеса индеек

ВЛЛ - вирус лимфоидного лейкоза

ВОЗЖ - Всемирная организация здоровья животных

ВРЭ - вирусом ретикулоэндотелиоза

ГКГ - главный комплекс гистосовместимости

ИЛ-1(3 - интерлейкин - 1 бета

ИЛ-1а - интерлейкин - 1 альфа

ИЛ-2 - интерлейкин - 2

ИЛ-6 - интерлейкин - 6

ИЛ-18 - интерлейкин - 18

ИФА - иммуноферментный анализ

ИНФ-у - интерферон - гамма

КонА - конканавалин А

мол.м. - молекулярная масса

РДП - реакция диффузной преципитации

РБТЛ - реакция бласттрансформации лимфоцитов

ФОБ - фокусообразующих единиц

ФИ - фагоцитарный индекс

ФЧ - фагоцитарное число

ЦТЛ - цитолитическиеТ- лимфоциты

Введение

Актуальность темы. Болезнь Марека (БМ) - широко распространенное лимфопролиферативное заболевание кур, возбудителем которого является онкогенный ДНК-содержащий герпес вирус болезни Марека (ВБМ) 1-го серотипа. По принятой Всемирной организацией здоровья животных (ВОЗЖ) классификации инфекционных болезней БМ относится к списку В, включающему «заразные болезни, которые имеют существенное значение в области общественной экономики в пределах отдельных стран, а также в международной торговле животными и продуктами животноводства» (Макаров В.В., 2003).

В комплексе мер борьбы с БМ важнейшее место занимает специфическая профилактика. Для этого в мировой практике используют живые вакцины на основе аттенуированных штаммов 1 серотипа, апатогенных 2 и 3 серотипов, а также комбинаций 1-3 серотипов вируса ВБМ. Аналогичные вакцины созданы и в нашей стране (Коровин Р.Н. и др., 1973; Коровин Р.Н., 1974; Куляшбекова Ш.К. и др., 1999; Баррос-Паллома Е.В. и др., 2003).

Однако с появлением высоковирулентных со знаком плюс (w+) и «гипервирулентных» штаммов ВБМ эффективность созданных вакцин стала заметно снижаться. Такие штаммы вызывают цитолитический процесс в главных лимфоидных органах тимусе и бурсе и раннюю смертность птицы, при этом не успевая образовывать опухоли во внутренних органах (Witter R.L., 1997; Witter R.L. et al., 1999; Witter R.L., Kreager K.S., 2004).

Аналогичная ситуация по БМ, хотя и несколько позже, сложилась в РФ. Так, по данным Росптицесоюза её удельный уровень в инфекционной патологии птиц в 2003 г. составил 7,61%, 2005 г. - 6,93% и в 2006 г.- 3,0%, в то же время в хозяйствах с высокими экономическими показателями он не превышал 0,05-0,02 % от привитого поголовья.

Стало очевидным, что образование высоковирулентных штаммов обусловлено генетической адаптацией ВБМ на фоне иммунизированной

птицы и селекция новых штаммов для разработки вакцин не поспевает за эволюцией вируса в природе. Затраты такого поиска могут быть доступны не многим производителям биопрепаратов (Witter R.L., 2007).

Следовательно, для контроля болезни Марека требуется применение альтернативных стратегий, к которым можно отнести применение с вакцинами иммуномодулирующих препаратов нового класса -рекомбинантных форм эндогенных цитокинов (Rachman М.М., Ео S.K., 2012).

До недавнего времени роль цитокинов в патогенности и иммунном ответе при БМ были слабо изучены. Разработка полноценной панели реагентов куриных цитокинов (ОТ-ПЦР) в реальном времени позволила выявить увеличение м-РНК ИНФ-у в спленоцитах инфицированных цыплят между 3 и 10 днем цитолитической фазы как у чувствительных, так и резистентных линий цыплят. У чувствительных линий отмечена экспрессия транскриптов ИЛ-6 и ИЛ-18. Изменений уровня цитокинов ИЛ-2 и ИЛ-lß не выявлено (Kaiser Р. et al., 2003). После вакцинации ВГИ получены противоречивые результаты выработки ИНФ-у (Djeraba, А. et al., 2002, а).

Цитокин миеломоноцитарный ростовой фактор (МРФ), используемый в качестве адъюванта векторной вакцины ВГИ на основе вируса оспы птиц, предотвращал гибель и снижал развитие опухолей у зараженных патогенным ВБМ цыплят (Djeraba, А. et al., 2002, б).

В РФ для повышения иммуногенности вакцин против БМ с положительным результатом испытан ронколейкин - полный структурный и функциональный аналог эндогенного ИЛ-2 человека (Егорова В.Н., Островский М.В., 2005).

Особенно стоит остановиться на ИЛ-lß. В механизме иммунитета при БМ ему принадлежит важная роль (Davison F., Nair V., 2004). Следовательно, возможно применение его рекомбинантной формы одновременно с вакциной против этой болезни.

В Федеральном медико-биологическом агенстве «Государственном научно-исследовательском институте особо чистых биопрепаратов» федеральное государственное унитарное предприятие (ФГУП «ГосНИИ ОЧБ» ФМБА) разработан иммуномодулирующий препарат -рекомбинантный ИЛ-lß млекопитающих (беталейкин), усиливающий дифференцировку предшественников Т-лимфоцитов с преимущественной стимуляцией образования Т-хелперов 1 типа (Патент РФ №2142958, 1999; Симбирцев A.C., 2004) и созданы наборы ИФА для определения наиболее важных цитокинов (ИЛ- 1а, ИЛ-lß, ИЛ-2 и ИНФ-у). Поэтому представляется своевременным и обоснованным изучить роль цитокинов в патологии БМ, а с учетом гомологии между рекомбинантным ИЛ-lß у птиц и млекопитающих (Kaiser Р. et al, 1998, 2004; Weining К.С. et al., 1998) и беталейкин в качестве адъюванта при её специфической профилактике.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы являлось изучение цитокинового уровня у цыплят раннего постнатального периода при воздействии патогенным и вакцинным ВБМ в сочетании с беталейкином и обоснование применения этого препарата для повышения эффективности вакцинации кур против болезни Марека. В связи с этим необходимо было решить следующие задачи:

- определить вирулентность двух патогенных штаммов ВБМ для цыплят;

- изучить в динамике цитокиновый уровень (ИЛ-1а, ИЛ-lß, ИЛ-2 и ИНФ-у) в сыворотке крови интактных цыплят раннего постнатального периода и при воздействии патогенными штаммами ВБМ;

- выяснить взаимосвязь между показателями цитокинового уровня и вирулентностью ВБМ для цыплят;

- изучить влияние беталейкина на показатели клеточного иммунитета у цыплят раннего возраста;

- исследовать влияние сочетанного применения беталейкина с сухой вакциной из штамма «ФС-126» против БМ на показатели естественной

резистентности (уровень цитокинов, лизосомально-катионный тест и др.) у цыплят раннего возраста;

- разработать Методические положения по применению иммуномодулятора беталейкина для повышения естественной резистентности и специфической профилактики болезни Марека.

Научная новизна работы. Методом твердофазного ИФА изучен уровень цитокинов (ИЛ-1а, ИЛ-1р, ИЛ-2 и ИНФ-у) у цыплят раннего возраста в норме и при заражении патогенными штаммами вируса болезни Марека.

Впервые установлены дозы, кратность и иммуномодулирующие свойства беталейкина на состояние естественной резистентности организма в ранний период выращивания цыплят.

Впервые экспериментально установлено иммуномодулирующее действие беталейкина при сочетанном применении с сухой вакциной из штамма «ФС-126» против болезни Марека.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований для практического использования в птицеводческих хозяйствах предложен иммуномодулирующий препарат беталейкин, который, повышает показатели естественной резистентности (уровень цитокинов, митогенной стимуляции лимфоцитов, фагоцитоза, лизосомально-катионных белков) организма цыплят.

Разработаны Методические положения «Применение иммуномодулятора беталейкина для повышения естественной резистентности и специфической профилактики болезни Марека», утвержденные Координационным Советом по животноводству и ветеринарии ГНУ Северо - Западного регионального научного центра Россельхозакадемии, протокол №1 от 22 января 2013г.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

- определение уровня провоспалительных цитокинов (ИЛ- 1а, ИЛ-1(3, ИЛ-2 и ИНФ-у) у интактных цыплят раннего возраста;

- результаты изучения уровня цитокинов у цыплят, зараженных вирулентными вирусами БМ;

- данные влияния беталейкина на показатели клеточного иммунитета у цыплят раннего возраста;

- результаты испытаний сочетанного применения иммуномодулятора беталейкина и сухой вакцины из штамма «ФС-126» против болезни Марека на показатели естественной резистентности у цыплят раннего возраста;

- разработка Методических положений по сочетанному применению беталейкина и сухой вакцины против болезни Марека.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: 15-ом Конгрессе - выставке Всемирной птицеводческой научной ассоциации, Пекин, 2007; Научно-практической конференции «Новое в диагностике и профилактике болезней птиц», СПб, 2008; Международной научно-практической конференции «Новые подходы к решению актуальных ветеринарно-санитарных и зоотехнических проблем в птицеводстве на современном этапе», СПб, 2011; Н-ом Международном конгрессе ветеринарных фармакологов и токсикологов, посвященного восьмидесятилетию засл. деят. науки РФ, проф. Соколова В.Д. «Эффективные и безопасные лекарственные средства в ветеринарии», СПб, 2012.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе одна в журнале, входящем в список ВАК.

Личный вклад. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. Диссертация

иллюстрирована 13 таблицами и 8 рисунками. Список литературы включает 205 источников, из которых 125 зарубежных.

1. Обзор литературы

1.1. Характеристика болезни Марека.

1.1.1. Таксономия, морфология, серотипирование, антигенный состав и геномное картирование вируса болезни Марека.

Болезнь Марека (БМ, нейролимфоматоз птиц, паралич птиц, энзоотический нейроэнцефаломиелит птиц) - высоко контагиозная вирусная болезнь кур и индеек, проявляющаяся в виде неоплазии, параличей и иммуносупрессии у чувствительных генотипов цыплят. Впервые оно было описано Дж. Мареком, который в 1907году наблюдал у петухов параличи ног и крыльев.

В 1961 году на конференции Всемирной Ветеринарной Птицеводческой Ассоциации (WVPA) Campbell J.G. и Biggs P.M. предложили использовать термин болезнь Марека, чтобы провести четкое различие между этим и другими этиологически отличимыми вирусными лимфопролиферативными заболеваниями.

Экономический ущерб от заболевания обусловлен повышенным отходом птиц, снижением их продуктивности. Считается, что от больной курицы в период яйцекладки недополучают 10-15 яиц. Дополнительные расходы затрачиваются на проведение ветеринарно-санитарных мероприятий.

Ежегодные затраты птицеводческой индустрии США на борьбу с онкогенными вирусными болезнями птиц (в основном это БМ и лейкоз) оцениваются по меньшей мере в 150 млн. долларов (Фэдли Э.М., 2004)

Возбудитель - вирус болезни Марека (ВБМ), клеточно-ассоциированный онкогенный а-герпесвирус первого серотипа, принадлежащий к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesvirinae, роду Mardivirus. Исследования зараженных ВБМ культур клеток почки цыплят или фибробластов утиных эмбрионов под электронным микроскопом показали,

/' ' /

что в ядрах инфицированных клеток были обнаружены неполные герпесвирусные частицы. Они является сложной структурой, которая состоит из сердцевины - нуклеоид, размером 60-90 нм, включающего вирусную ДНК, окруженную капсидом, тегумента, содержащего липиды, и оболочки (Nazerian К., Burmester B.R., 1968; Solomon J.J. et al., 1968).

Зрелые вирионы, которые образуются в клетках эпителия перьевых фолликулов, состоят из электронно-плотного нуклеоида, имеющего кубический тип симметрии и форму икосаэдра, состоящего из 162 капсомеров, размером около 100 нм. На оболочке вириона расположены шипы, которые представляют собой полые цилиндры длиной приблизительно 9-12 нм и шириной 8 нм. Синтез вирусной ДНК обнаруживается в инфицированных клетках через 6-9 ч и завершается через 15 ч после инфицирования. Репродукция вируса начинается в ядре пораженной клетки, где он достигает величины 160-180 нм и завершается приобретением белковой оболочки при переходе в цитоплазму. Здесь размеры вирусных частиц увеличиваются до 200-250 нм (Бакулин В.А. и др., 1999; OkadaK. et al., 1979).

Все выделенные к тому времени изоляты ВБМ было предложено разделить на три серотипа. Серотип 1 включает онкогенные вирусы, от высоковирулентных до апатогенных изолятов (RB1B, MD5, GA, CVI988), серотип 2 - неонкогенные, авирулентные полевые штаммы (HPRS24), серотип 3 - антигенно-родственный вирус герпеса индеек (ВГИ). Несмотря на происхождение от индеек, третий серотип вируса имеет общие антигены с другими серотипами, что позволяет использовать его для профилактики болезни Марека (Biggs P.M., 1972; Von Bulov V., Biggs P.M., 1975).

Важным оказался установленный факт, что инфицированные ВБМ, но не заболевшие цыплята являются носителями вируса и специфических антител в течение всей жизни. Высокие уровни материнских антител передаются вылупившимся цыплятам через желточный мешок. Наличие материнских антител не гарантирует защиту от БМ (Calnek B.W., 1972).

Механизм формирования иммунитета при естественном заражении ВБМ и вакцинации привел к поиску общих для всех трех серотипов антигенов (АГ) и антигенных детерминант. В их составе выявлено шесть АГ, из которых наиболее важными являются А, В и С. Антиген А, состоящий из гликопротеинов с молекулярной массой 57-65 КДА (gp57-65),содержится во всех патогенных штаммах первого серотипа, а также выявлен при репродукции 2 и 3 серотипов ВБМ. Он не вызывает защиту у цыплят от БМ, не является протективным в репликации вируса в культуре клеток, однако может иметь большое значение в поддержании циркуляции вируса в организме птицы. Он обнаружен в культуральной жидкости и экстрактах зараженных клеток (Niikura М. et al., 1991).

АГ В представляет мембранный комплекс, состоящий из gplOO, gp60 и gp48, который выявляется при репродукции всех 3 серотипов ВБМ и участвует в в