Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гуморальный поствакциональный иммунитет у кур, привитых моноби- и поливалентными вакцинами против болезни Марека

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Гуморальный поствакциональный иммунитет у кур, привитых моноби- и поливалентными вакцинами против болезни Марека"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

На правах рукописи

ЯРЫГИНА Елена Игоревна

ГУМОРАЛЬНЫЙ ПОСТВАКЦИНАЛЬНЫЙ ИММУНИТЕТ У КУР, ПРИВИТЫХ MOHO-, БИ- И ПОЛИВАЛЕНТНЫМИ ВАКЦИНАМИ ПРОТИВ БОЛЕЗНИ МАРЕКА

03.00.23 - БИОТЕХНОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА -1998

Работа выполнена в лаборатории иммунологии и лаборатории по разработке и производству противоопухолевых биопрепаратов Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности

Научные руководители:

- доктор биологических наук В. А.Лукина

- доктор ветеринарных наук, профессор, член-корреспондент РАСХН А-Я-Самушенко

Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук С. В.Кузнецова

- кандидат биологических наук А_Рукавишников

Ведущее учреждение - Московская государственная академия вен ринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина

Защита диссертации состоится 1998 гада ъ{0маса\

на заседании специализированного совета К 120.17.01 по защите ди< сертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Всеросси! ском научно-исследовательском и технологическом институте биолоп ческой промышленности по адресу: 141142, Московская обл., Еёлш скии район, п/о Кашиндаво, ВНШШ1.

С диссертацией" можно ознакомиться в библиотеке ВНШШГ Автореферат разослан »¡М&Л 1ддя года.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук И Д. Фролов

Отпечатано ЩФПМП. Тираж 100 экз.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Промышленному птицеводству значительный экономический ущерб наносят вирусные заболевания. Особое место в списке этих заболеваний занимает болезнь Марека СБЮ -злокачественный лимфоматоз, возбудителем которого является ДНК-содержащий вирус болезни Марека СВБМ). отнесенный к семейству герпесвирусов.

БМ регистрируется практически во веек странах мира с развитым промышленным птицеводством, характерным для болезни является быстрое распространение инфекции среди восприимчивого поголовья. Заболевшие птицы теряют в весе, задерживается их рост, нередко происходит падеж от БМ. что приносит огромный экономический ущерб.

ВБМ имеет серо варианты трех типов. ' Серотип 1 включает все вирусы, способные вызывать лимфомы У птиц, и аттенуированныа его варианты. К серо типу 2 ВБМ относят все неонко генные вирусы герпеса кур СВГЮ, а к серотипу 3 - антигенно родственные ВБМ апатоге-ные, неонко генные вирусы герпеса индеек СВГЮ.

Ведущим звеном в системе организации профилактических мероприятий при БМ является эпизоотическая характеристика птицехо-зяйств С Коровин Р.Н.. 1989), основанная на точной и своевременной диагностике заболевания. Плавильный выбор подходящей по своим иммунизируицим свойствам вакцины для данного птицехозяиства способен исключить вспышки БМ.

Долгие годы превалирующее значение в профилактике болезни Марека имела вакцина на основе ВГИ. Первая отечественная вакцина против БМ также создавалась из третьего серотипа ВБМ - штамма FC 12S. Существенной вклад в разработку нативной и сухой вирус-вакцины внесли ученые ВНИТИБП Лукина В.А. с сотр., Токарик. Э.Ф. с сотр., Слепенко Т.Б., Блехерман Б.Е., марыгина А.Ф. и др.

вакшна на основе вги обладала высокой эффективностью в первое десятилетие после внедрения С1970-80 г.г.}, но в последующие годы во многих регионах мира отмечено снижение ее протективной активности CCalnek B.W., 1992). После проведения дополнительных исследований американскими учеными С Witter R.L. et al., 1982. 1988. 1995) показано, что эффективность серотипа 3 ВБМ значительно усиливается даже против особо вирулентных ВБМ, если применять его в комбинации с вирусами серотипа 2. Определенные различия между антигенными детерминантами серотипов ВБМ позволяет определять в сыворотке крови кур наличие или отсутствие специфических антител к вакцинному или полевому ВБМ. что дает возможность судить и о качестве поствакцинального процесса с Cato s. and Hi raí К.. 1985: Calnek B.W. and Witter R.L.. 1991: Ono M. et al.. 1995).

Прогнозирование поствакцинального гуморального иммунитета у привитой птицы, а также создание и применение поливалентных вакцин. в составе которых имеются актуальные штаммы ВТК. дают возможность надежно проФилактировать БМ за счет ингибирования патогенных штамшв ВБМ.

С этих точек зрения изучение гуморального поствакцинального иммунитета у кур, привитых юно-, би- и поливалентными вакцинами против болезни Марека представляется своевременным и обоснованным.

Цель и задачи исследования. Цель работы - изучить особенности поствакцинального иммунитета у кур, привитых moho-, би- и поливалентными вакцинами против БМ. по динамике антител класса igG, реагирующих с различными антигенными детерминантами серотипов ВБМ

В соответствии с целью работы поставлены следующие задачи:

1. Синтезировать высокостабильный иммунопероксидазный конъкь гат анти-lgG желтка яиц кур, обладающий антивидовой активностью.

2. разработать варианты ифа с использованием вги, стабилизированного в безбелковой среде, для оценки биологической активное-

ти вакцины против БМ.

3. Разработать модификации ИФА для идентификации антигенных детерминант и серовариантов ВБМ. диФФиренциадаи антител к ним.

4. Изучить с помощью ИФА развитие поствакцинального гуморального иммунитета у кур, привитая moho-, б и- и поливалентными вакцинами против БМ по динамике иммуноглобулинов класса G и дать оценку эффективности вакцинных штаммов и вирусвакшн.

Научная новизна работы. Разработан способ выделения иммуно-химически чистого препарата IgG желтаа яиц кур с авторское свидетельство N 14978113. на базе IgG синтезирован активный иммунопе-роксидазный антивидовой конъюгат санти-IgG кур), пригодный для разработки и проведения различных модификаций ИФА.

разработан способ стабилизации вируса герпеса индеек, на который получено положительное решение с приоритетная справка N 5015791).

разработаны методы выделения ВГК от невакцинированньм птиц благополучного по БМ птицехозяйства, идентификации и поддержания вируса в культуре клеток эмбрионов SPF-кур.

Впервые в России выделены и идентифицированы штаммы вируса герпеса кур. Два из них, под номерами "42" и "50". депонированы в ВГНКИ как производственные вакцинные штаммы и используются для изготовления поливалентной вакцины против ЕМ С патенты N 2085582» N 2085583).

Разработана методика оценки эффективности вакцинации по определению серологического статуса птицы, привитой против БМ.

Практическая значимость работа, в результате проведенных исследований разработаны и утверждены:

- Методические рекомендации для количественного определения морфологически зрелых иммунохммически активных вирионов методом твердофазного ИФА (утверждены директором ВНИТИБП в 1991 г.):

- Методика количественного определения антигенно-активньс клеток в жидкой вакцине против ЕМ на основе шт. FC-128 ВГИ методом ИФА С утверждена директором ВНИТИБП в 1932 г.Э:

- Методика определения серологического статуса вакцинированной против БМ птицы с целью оценки качества сукой вакцины методом ИФА с утверждена директором ВНИТИБП в 1992 г.):

- Методические рекомендации по оценке эффективности сухой i жидкой вакцины против БМ и определению серологического статусг вакцинированной птицы Сутверждены директором ВНИТШБП в 1993 г.):

- Методические рекомендации по выделению и поддержанию ana-тогенных вариантов вируса герпеса кур Сутверждены директоров ВНИТИБП в 1997 г.).

Разработанные Методические рекомендации легли в основу Временной инструкции по изготовлению и контролю набора для оценю* биологической активности вакцин против ЕМ иммуноферментным методом. Технических условий на набор. Временного наставления по применению набора. НТД на набор согласована директорами ВНИТИБП v ВГНКИ и утверждена Ветеринарном департаментом РФ 23 июня 1997 г.

Разработанные наборы прошли с положительным эффектом испытания на ГЩБК, курской биофабрике, во вгнки и птицефабриках.

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ. Получено 1 Св соавторстве) автор ское свидетельство, 2 патента и 1 положительное решение по заявке

Апробация роботы, материалы работы и ее отдельные разделы доложены: на 5-той конференции молодых ученых и специалистов сельского хозяйства СМосква, 1986 г.): Всесоюзной научной конференции молодых ученых СМосква, 1988 г.): научно-теоретической конференции молодых ученых "Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии" С Владимир, 1990 г. 3: всероссийской научно-практической конференции (Владимир, 1995 г.): 5 Всероссийской конференции

"Научныэ основы промышленного производства ветеринарный биологических препаратов" (Щелково. 19963: Всероссийской научной конференции "Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных" СМосква, 1996), 2-ой Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции" СМосква, 1997).

Структура и объем диссертации, материалы диссертации изложены на 194 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результаты исследования и их обсуждение, заключают работу выводы и практические предложения. Список цитированной литературы содержит 257 источников, в том числе 81 на русском языке. Диссертация иллюстрирована 27 таблицами и 26 рисунками. В приложении с15 стр.) представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную и практическую значимость.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

- 2. 1. материалы и мэтоды

Работа выполнена в 1986-1997 гг. в лаборатории иммунологии и лаборатории по разработке и производству противоопухолевых биопрепаратов ВНЮТЗП в соответствии с планом НИР и ОКР ВНИТИБП отраслевых научных програм и Федеральной целевой научно-технической программы "Ветеринарное благополучие" С1996-2000 гг.), является составной частью комплексных исследований по проблеме им-муноФерментной оценки биологических пгепапятпп с прсцсссз промышленного изготовления, разработки диагностикумов заразных болезней животных на основе современных методов, в том числе и тест-системы ИФА для индикации и количественного определения ан-

тигенов ВБМ и антител к ним.

2.1.1. Вирус. В работе использовали: промышленные серии на-тивной и сукой вакцины против ЕМ на основе штаммов ВГИ ГС-126 и ГС-126М; штамм Лт ВБМ серотипа 1. полученный из ВГНКИ в виде инактивированного Формалином лиофилизированного препарата: изоля-ты ВТК С ВБМ серотипа 2), условно обозначенные как "игг. 42" и "шт. 50". выделенные наш от кур-несушек.

В качестве контрольный препаратов использовали: культу-ральную жидкость, собранную с неинфицированных клеток: УЗ лизаты ! неинфицированных культур ККЗ и КПЗ: живые неинФицированные клетки.

2.1.2. Культуры клеток и среды. Для размножения и титрования вируса использовали первичные культуры клеток 10-12-дневных эмбрионов сгкмсур, приготовленные по общепринятым методам С Саш В.Н. и др., 1991), а также методам, разработанным во вниитивп С Лукина в. А., 1992: Слепенко Т. Б., 1987).

Для ростовой и поддерживавшей среды применяли среды Игла, ГЛАЗ, 199 или их смеси и сыворотку крс в концентрации 10 % и 2 X. Для трипсинизации тканей эмбрионов использовали раствор Хенкса и 0,25 % раствор трипсина С'ДиФко", США), а для дезагрегации клеточных культур - 0,125 X раствор. В состав криозащитной среды для консервирования инфицированных ВГК клеток входили: среда Игла -40 X. ГЛАЗ - 40 х, сывортка крс - 10 X. диметапсульФоксид - 10 X.

2.1.3. Экспериментальные животные. В опытах по получению ан-ти-1ес желтка яиц кур использовали кроликов массой 1,5-2.0 кг. В опытах по выделению изолятов ВГК использовали здоровых кур 150-180-дневного возраста из благополучного по ЕМ птицехозяйства, а также суточных БРБ-цыплят.

2.1.4. Лейкоциты из крови кур получали по методике А. Воушп С1968). ■

2.1.5. Размножение и пассирование ВГК в культуре клеток.

Инокуляцию материала, содержащего вгк, производили непосредственно в суспензию клеток или на монослой по общепринятым методам. Через 4-7 суток культивирования проводили съем инфицированных клеток, которые частично использовали для изучения в ИФА. частично для заражения свежеприготовленных культур: оставшиеся клетки консервировали замораживанием в криозащитной среде.

2.1.6. Определение инфекционной активности клеточно-ассоции-рованного вируса проводили по методике ССлепенко Т.Б.. 1987).

2.1.7. Иммуногенность образцов нативного или лиоФилизирован-ного вги. а также клеточно-ассоциированного вгк определяли на цыплятах по методу, разработанному во внивип. Цыплят вакцинировали в суточном возрасте Свгк использовали в качестве компонента би- и поливалентной вакцины, а также каждый изолят отдельно), а через 1-2 недели привитых цыплят и цыплят контрольной группы заражали вирулентным вирусом БМ однократно внутрибршинно в дозе 1000-2000 <юе с вги), 300 фое (вгк) в объеме 0.2-0,5 ему. За птицей наблюдали в течение 78-300 дней.

Эффективность вакцинации рассчитывали по Формуле:

Е = СА-В)/А х 100 X (или Е - 100 - (Вх100/А), где Е - эффективность вакцинации. X: А - число случаев БМ в контрольной группе, %: В - число случаев БМ в опытной группе, %.

2.1.8. Концентрирование, очистку и Фракционирование внеклеточного ВГИ проводили методом мекфазного разделения вирусных частиц в водных растворах полимэров, предложенным Альбергсоном (1974). Построение Фазовых диаграмм и выбор точки концентрирования для каждой серии опытов проводили по методике, разработанной во ВНИТИБП (Писеева Г.П.. Лукина В.А., дьяконов л.П., 1981).

2.1.9. Электронно-микроскопические исследования ВГИ методами ультратонких срезов и негативного контрастирования выполняли в секторе электронной микроскопии ВНИиТИБП совместно с зав. секта-

dom Блехерманом Б.Е. и ст. науч. сотр. марыгиной А.Ф.

2.1.10. Концентрированный и очищенный гликопротеинный антиген а с газ получали из культуральной жидкости методами: ультрафильтрации через ядерные Славсановые) и ацетагаеллюлозные Фильтры С совместно с науч. сотр. Панферовой C.M. ), хроматографией на колонках. заполненных ультрагелем АсА-44 Сфишы "1KB". Швеция). Активность очищенного га определяли в ифа и РДП.

2.1.11. Получение иммунных сывороток, специфические к ВГИ сыворотки получали от 48-70-дневных SPF-цыплят породы бурый леггорн. СпециОические к иггамму Jm ВБМ С США) и цггамму CVI 988 сыворотки от SPF-птицы были предоставлены научн. сотр. Баррос Пало-мой Е.В. (ВГНКИ). специфичекие к ВГК сыворотки получали от 180-200-дневных SPF-цыплят. Специфические к гА сыворотки получали гипериммунизацией кроликов.

2.1.12. Выделение, очистка и концентрирование иммуноглобулинов класса G желтка яиц кур. За основу выделения иммуноглобулинов класса G желтка яиц кур был взят метод двукратного переосаждения ГВГ-6000 сPoison. 1980). Иммунохимически чистый препарат IgG желтка яиц кур получали из глобулиновой Фракции гель-хроматографией на сефадексе G-200 ("Pharmacia", Швеция) или ультрагеле А-4 ("Reactifs IBF", Франция).

Чистоту и специфичность выделенных препаратов IgG проверяли методом электрофореза в ПААГе и иммуноэлектрофореза с полиспецифической, полученной на проте^ины желтка яиц кур, сывороткой по общепринятым методикам.

Концентрацию IgG подсчитывали по формуле: СIgG] - V х (0П280 / 1.31), где [IgG] - выход иммуноглобулина G в мг: V - объем раствора в см3: 0П280 - оптическая плотность раствора учтенная при длине волны 280 нм на спектрофотометре СФ-26 (СССР): 1.31 - экстинкция

раствора IgG с концентрацией 1 мг/см3.

2.1.13. Антисыворотки на IgG желтка яиц кур получали иммунизацией кроликов по методу Куо-Чин-Яна СХант е., 1990) и по методике. разработанной в лаборатории иммунологии ВНИТШ1С Кузнецова С.В. С com. 1984).

2.1.14. Выделение специфических антител из антивидовьк сывороток крови проводили методом аффинной хроматографии. Чистоту и специфичность антител контролировали методом иммуноэлектрофореза в агаре с IgG келтка яиц кур по общепринятым методикам.

2.1.15. Синтез конъюгатов пероксидазы со специфическими антителами осуществляли перйодатным методом СР.К.Nakane ' and A.Kawaol, 1974: М.В.Wilson and Р.К.Nakane,: 1978).

2.1.16. При разработке тест-системы Ш для определения антигенов различных серотипов ВБМ и антител к ним применяли неконкурентные методы с использованием антивидовых антител и иммобилизованного антигена: модифицированный "сэндвич"-мэтод с иммобилизованными антителами и метод блокирования ША.

2.1.17. Производственные опыты для оценки серологического статуса вакцинированной птицы и эффективности вакцины методами ИФА проводили на базе Щелковского биокомбината и АО ПАФ "КУРС" г. лакинск владимирской обл. Клинические наблюдения, вскрытие, учет павшей и выбракованной птицы, отбор крови у разновозрастной птицы осуществлялись при участии вет. врача Крюковой в.В.

2.1.18. Достоверность результатов опытов оценивали критерием Стыодента. При статистической обработке экспериментальных результатов использовали Формулы регрессионного анализа СЛакин Г.Ф., 3980: Рпкицкий П.Ф.. 1967).

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Разработка способов выделения антител из иалтков яиц кур для получения антивидовых иымужйеривнтных коныгеггов

Для обнаружения вирусов ЕМ и антител к ним в мировой практике широко используют различные серологические и иммунологические методы, в том числе и ИФА С Лукина В. А., 1991: Adeniran G. А., Dyejide А., 1995: Dulow V.. Lesjak т., 1987: Françoise С., Ahluuia R.. 1984: Ikuta К.. 1988: Lee L.F.. Ren D., Li Y., Sui D.. 1992: Schölten R., Hilgert L.A.T., 1990: Witter R.L., Lee L.F., Sharma J.M., 1990), который по чувствительности превосходит РДП и РИФ В 20-40 И более раз СCheng Y.Q., Lee L.F., 1985). Для модели "Вирусы БМ - антитела к ним" мы также применили ИФА.

На первом этапе исследований в соответствии с целями и задачами необходимо было получить конъюгированные с Ферментом перок-сидазой антикуриные антитела класса IgG. для этого разработали способ выделения IgG из желтков яиц кур сочетанием методов препаративной биохимии: солевое осавдение, гель-хроматографию на сефа-дексе G-200 или ультрагеле А-4. Принципиальной разницы между гелями не обнаружили. Титр IëG в РДП составил 7-8 1оег- Данный способ защищен Св соавторстве) а.с. N 1497811.

Антитела к IgG желтка яиц кур получали иммунизацией кроликов по разным схемам. Наибольшей специфичностью и преципитирую-щей активностью С 5-7 loga) обладала антисыворотка, полученная по схеме, разработанной во ВНИТИБП (Кузнецова а В. с сотр., 1984).

Гамма-глобулиновую Фракцию из гипериммунной антасыворотки выделяли методом солевого осаждения, антивидовые антитела - методом аффинной хроматографии.

При оценке различных иммуносорбентов установили, что пред-

почтительнее использовать СШ-^-активированные СеФарозу 4В и ага-розу, а не ультрагель АсА 34 или акрилекс П-300.

Аффинно очищенные антивидовые антитела и гамма-глобулины конъюгировали с пероксидазой хрена перйодатным методом CNakane Р.К.. Kawaol А., 1974).

При титровании антивидовыя кон-ыогатов санти-lgG желтка яиц кур), установлено, что рабочее разведение конъюгатов на основе аффинных специфических антител составляет 1:5000-1:50000 С для лиофильно высушенных препаратов - 1:400-1:6400). а на основе гам-ма-глобулиновой фракции - только 1:500-1:1200. Конъюгаты на основе аффинных антител обладали высокой специфичность!), что позволило исключить стадию хроматографического отделения несвязавшейся пероксидазы из технологии получения конъюгатов.

Конъюгаты использовали для отработки методов ИФА применительно к нашим условиям, а также для индикации и идентификации в ИФА антигенов ВБМ. ВГИ и ВГК и антител к ним в сыворотках крови кур, инфицированных различными серо типами ВБМ.

2.2.2. разработка вариантов ИМ для оценки биологической активности вакцин протав болезни Марека

Известна зависимость хромофорной реакции в ИФА от количественного содержания антигена, сорбируемого на полистироле с Бор-сук Э.А. и др., 1991: Саггарова JI.И. и др., 1994: Скобина З.В., Джавадов Э. Д., 1988: Dulov V., Lesjak m., 1987: Françoise С. » Ahluwla R., 1984: Lee L. F., Ren D.. Li Y., Sui D., 1992: Scholteri R., Hilgert L.A.T.. 1990). Предполагая наличие такой зависимости ит количественного содержания инфекционного ВГИ в препаратах, исследуемых в ИФА, приступили к ее изучению.

Препараты ВГИ, репродуцированные в культуре клеток, обла-

даюгг структурной гетерогенностью С полиморфизмом). Стабильные и надежные результаты вакцинации могут- быть получены при использовании препаратов из максимально гомогенной, вирусной популяции с Лукина в. А.. 1996; МарыгинаА.®., 1987: писееваг.П.. 1986: тьь шенко И.П., 1993: Calnek B.W.; Witter R.L, 1991: Vielinz Е.. 1987). Капсиды с злектронноплотными центрально расположенными нуоеоидами, которые принято считать зрелой Формой, способны приобрести суперкапсидную мембрану и индуцировать выработку антител при попадании в организм птицы.

Результаты исследований 15 серий вакцины по морфологическому составу, Фокусообразованию в культуре клеток и иммунокимичес-кой активности в ИФА показали, что активные в ИФА вакцины содержали значительное количество вируса, прошедшего полный цикл морфогенеза в ядре и цитоплазма. Низкая иммунонимическая активность коррелировала с наличием больших количеств внутриядерных незрелых Фош вируса.

Для изучения"состава бесклеточных препаратов ВГИ и получения гомогенной вирусной популяции с преобладанием полноценных ви-рионов провели Фракционирование вирусных частиц в двухфазной система водорастворимых полимеров декстран-полизтиленгликоль.

Нашими опытами установлено, что в процессе межфазного разделения удалось сконцентрировать в промежуточной Фазе морфологически зрелые вирионы и полноценные нуклеокапсиды с максимально плотной упаковкой нуклеоида, которые активно вступают в иммунохими-ческую реакцию "антиген - антитело cigG)". Оказалось, что в ИФА принимают участие не все вирусные частицы, входящие в вакцину, а только те, которые, попав в организм животного, вызовут полноценный поствакшнальный иммунитет.

Большое внимание было уделено оптимизации парамэтров поста-

новки ИФА. Базируясь на данных литературы и собственных исследованиях. отработали схемы различных вариантов ИФА. В результате были скомпанованы иммуноферментнда наборы для оценки биологической активности вакцин против БМ, прошедшие широкую комиссионную апробацию. Документация на наборы утверждена департаментом Ветеринарии РФ 23 июня 1997 года.

При производстве сухой вакцины из ВГИ традиционно использует стабилизаторы, в состав которых входят белки (например, СФГА). Такие вакцины сохраняют исходнуп активность в условиях бытового холодильника не более месяца. Предложенный нами метод стабилизации ВГИ в безбелковой среде позволяет получать сухой препарат длительного хранения, который используется в ИФА в качестве антигена без фоновых реакций, что удовлетворяет требованиям, предъявляемым к биологическим компонентам наборов для имму-ноферментных анализов. На данный способ стабилизации безклеточно-го ВГИ получено положительное решение за N 5015791/13.

Изучая зависимость степени инФекшюнности вируса в вакцине от сроков ее хранения, отметили низкий процент корреляции показателей биологической активности по ФОБ и в ифа для свежеприготовленных препаратов Св среднем, 40-60 % в зависимости от способа стабилизации вакцины), однако, в процессе хранения сз-Ю лет} наблюдали появление значительной положительной связи между покаг-зателями инфекционной и иммунохимической активности как для вакцины на основе СФГА, так и для вакцины на основе безбелкового стабилизатора с71,0+7,2 % и 90,0+2,2 % соответственно). Показатели биологической активности сухих вакцин, определенные по фое и в ИФА после длительного хранения препаратов, свидетельствовали о сохранности шлыш стабильных форм вирусных частиц.

Учитывая иммунохимичесшо активность клеток в ИФА и сравнивая полученные результаты с инфекционной активностью вируса в на-

тивной вакшне, определенной по ФОЕ, обнаружили, что корреляция между этими показателями оказалась довольно высокой С65,8 %). Присутствие в зачительной доле инфицированных клеток зрелых форм вирионов и полностью сформированных нуклеокапсидов приближает методы оценки нативной вакцины по иммунохимической и инфекционной активности.

Таким образом, показано, что разработанные варианты ИФА позволяют достоверно определять биологическую активность вакцины против БМ.

2.2.3. Определение антигенных детерминант различных сероткпов ВБМ и антител к ним методом блокирования ША

Применив классический метод блокирования ИФА. определили общие и специфические для ВБМ, ВГИ и ВГК антигенные детерминанты. В результате при использовании имеющихся антигенов и антител, с большой долей вероятности установлено следупцее: 1) вакцинный ВГИ и вирулентный, но денатурированный. ВБМ штамм Лш не имеюгг общих антигенных детерминант: 2) индуцированный ВГИ низкомолекулярный гликопротеинный антиген А (гА) содержит перекрестнореагирупаие с ВГИ и ВБМ антигенные детерминанты, условно обозначенные л и а. Детерминанта л не выявлена у вирионов иммуногенного вакцинного ВГИ Сштамм ГС-126). аттенуированного ВЕМ С штамм кекава). но обнаружена у вирулентных штаммов ВБМ (штаммы Ли и Конкур) и неиммуно-генного варианта ВГИ; 3) на поверхности клеток, инфицированных ВГИ, и морфологически зрелых вирионов имеются идентичные антигенные детерминанты: 4) установлена детерминанта, определявшая специфичность исследованных штаммов ВБМ (антигеннная детерминанта »); 5) обнаружена общая антигенная детерминанта на ВГК (штамм БВ-1) и клетках животного происхождения.

Полученные результаты важны для идентификации в ИФА вирусов БМ разных серо типов и антител к ним.

2.2.4. динамика развития постаакцинального гуморального

иммунитета у кур, привитых юно-, би- и поливагентными вакцинами против БН

изучение гушрального поствакцинального иммунитета против БМ начали с вопроса о влиянии материнских антител на процесс антите-лообразования в ответ на введение вакцины, так как среди причин; по которым вакцинация против БМ не достигает нужного результата, ряд авторов С Adentran G.A.. Dvejide А., 1995; Calnek B.W.. Witter R.L.. 1991; Lee L.F., Witter R.L..1991) указывают наличие гомологичных к вакцинным вирусам материнских антител.

Исследуя динамику материнских антител у вакцинированных и невакцинированных цыплят, заметили, что наиболее длительное время трансовариальные антитела определятся у невакцинированных цыплят (до 40 суток после вылущения). У цыплят, вакцинированных качественными препаратами, материнские антитела обнаруживаются до 30 дня после вакцинации, если же применять вакшны с избытком гА, то редукция материнских антител происходит за 10-20 дней, что указывает на их частичную взаимную нейтрализацию.

Таким образом, материнские антитела влияют на виремию вакцинного вируса и не препятствуют заражению птиц вирулентным ВЕМ, делая вакцинальный ответ менее однородным, замедленным и трудно корректируемым.

При изучении динамики гуморальных поствакцинальных антител и

значитштыи подъем уровней анти-ВГИ антител уже на 40 день после вакцинации. Достоверный подъем поствакцинальных антител регистрируется в последнее время С1995-1998 гг.) в более поэ-

дние сроки Сна 50-56 сутки). Смещение уровней максимального накопления анти-ВГИ антител к более позднему сроку можно объяснить высокими показателями титров материнских перекрестно реагирующих антител у всех суточных цыплят. Антитела отодвигают сроки оптимальной приживляемости вакцинного вируса и иммуноответа.

Изучая поствакшнальный гуморальный иммунитет у привитых против БМ цыплят по наличию антител С класса 103) к вакцинным и полевым вирусам БМ, установили зависимость иммунного ответа не только от наличия материнских антител, но и от ряда других Факторов. Так, показано. что на эффективность вакцинации существенно влияет количественное содержание как полноценных вирионов, так и низкомолекулярного гликопротеинного антигена в вакцине. Первый подъем антител в сыворотках крови цыплят, вакцинированных препаратом с большим содержанием гА (600 нг/смЗ), зарегистрирован не 70 день. У цыплят, инокулированных вакциной с количеством гА е препарате 30 нг/с»3, значительный подъем уровней поствакцинальных антител наблюдался в пробах сывороток, взятых на 40-8С дни, а рост антител, перекрестно реагирующих с ВГИ и ВБМ, обнаруживается только на 120 день.

Изучение динамики антител в крови птиц, вакцинирующую дозу для которых устанавливали по количеству ФОЕ в культуре клеток, пс количеству ПВ, определенных в ИФА и по морфологическому составу, позволило сделать вывод о том, что высота уровней специфически» антител на. 40-60 сутки в ответ на введение моновалентной вакцинь против БМ, является положительным Фактором, коррелирующим с повышением специфической защиты. Показано, что при плавном снижена уровней материнских антител к 30 дню после вакцинации и появлении у 60 х цыплят антител, реагирующих с ВГИ на 40 сутки, можнс прогнозировать благоприятное течение вакцинального процесса. I наоборот, медленное снижение материнских антител, обнаружение и*

i ИФА до 40 суток свидетельствует о неблагоприятном вакцинальном чроцессе.

На основании представленных данных появилась возможность сонтроля качества вакцины уже на 40-60 день после вакцинации, а те на 80-100 день, когда обнаруживали признаки БМ при осмотре зольной птицы или при вскрытии трупов павшей птиш.

При изучении влияния моно-. би- и поливалентных вакцин на ди-4амику поствакцинальных антител в ряде опытов установлено, что 1Рогноз эффективности вакцинации, составленный по итогам исследо-заний сывороток в ИФА, полностью совпадал с данными патологоана-гомического вскрытия павшей и вынужденно убитой по окончании опыта птицы.

Анализируя изложенное, можно утверждать о возможности прог-юзирования поствакцинального иммунного ответа организма цыплен-са и эпизоотической ситуации в птицехозяйстве по степени прижив-тяемости вакцинного вируса и зффективнности вакцинации, опреде-генных в ИФА в более ранние сроки, по сравнению с теми сроками, в сакие проявляются клинические признаки БМ.

Проведенные исследования легли в основу методики определе-1ия серологического статуса вакцинированной против ЕМ птицы с шью оценки качества вакцины методом иммуноФерментного анализа

2.2.5. Выделение апатогенных пггамиов ВТК и изучение в И&А их протективнык свойств

Опираясь на полученные результаты по антигенным особенностям трех серотапов ВЕМ. а также на показатели гуморального пос-^2с!™::2ль::сгс «^¿унитёта у кур, привитых в суточном возрасте акцинами на основе ВГИ, ВБМ, ВГК или их сочетаниями, мы предпри-1яли попытку изолировать ВГК.

Применяя общепринятые методики, у птиц из благополучного по БМ птицехозяйства выделили 5 изолятов ВГК. Два из них, обозначены наш как штаммы ВГК "42" и "50", тщательно изучении, паспортизированы и депонированы в ВГНКИ как производственные, вакцинные штаммы С патента N 2085582 и N 2085583}.

При пассировании ВТК в культуре клеток эмбрионов SPF-кур обнаружили, что размножение вируса сопровождается слабым цитопати-ческим действием. Это затрудняло учет активности вируса по Фоку-собразованию. Попытки получить ВГК с высокой репродуктивной активностью в КККЭ привели к снижению иммуногенных свойств вируса в составе вакцины против БМ. Показано, что наибольшей протективной активностью обладали смеси вирусов серотипа 3 и серотипа 2 с низкой репродуктивностью в культуре клеток.

В комиссионных опытах по изучению иммуногенности поливапен-тных препаратов было подтверждено явление "протективного синергизма", подробно описанное Witter R.L. С1988, 1989, 1995). В наших экспериментах испытываемые моновакцины не обладали абсолютным защитным эффектом Сот 36,6 % для штамма "50" ВГК до 97.2 X для штамма "LS-2" модифицированного ВШ, но би- и поливалентные препараты на основе ВГИ и ВГК надежнее защищали птицу от БИ С 99,7-100,0 X).

Исследуя иммунный статус вакцинированных ппад в благополучных и неблагополучных по ЕМ птицехозяйствах мы обратили внимание на тот Факт, что на течение поствакцинального процесса у птиц из конкретного птицекозяйства влияет выбранный препарат для профилактики БМ. Динамика антител к разным серотипам ВБМ свидетельствует о том, что в птицехозяйствах, длительное время применяющих вакцину против БМ на основе ВГИ + ВГК, происходит постепенное снижение циркуляции патогенных штаммов ВБМ.

Итак, установленоно» что используемые применительно к нашим

условиям тест-системы ИФА обладают высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью при индикации антигенов ВБМ. ВГИ и ВГК и антител к ним. Нами впервые определены динамика и уровень накопления антител к ВБМ, ВГИ и ВГК в лабораторных и полевых условиях, показано влияние материнских антител на развитие гуморального поствакцинального иммунитета. ИФА является достоверным методом для изучения гуморального поствакцинального иммунитета у птиц, привитых moho-, би- и поливалентными вакцинами против БМ, из хозяйств с различной эпизоотической обстановкой. Установление закономерностей развития иммунитета и возможность дифференцирования поствакцинальных антител позволили разработать наборы ИФА и использовать их для определения иммунохимической активности вакцинных препаратов против БМ на биофабриках, а также для определения серологического статуса вакцинированной против БМ птицы в птицехозяйствах.

з. вывода

3.1. Разработан способ получения иммунохимически чистого препарата IgG желтка яиц кур сочетанием методов препаративной биохимии: ионообменной хроматографии, гель-фильтрации, осаждения неионными полимерами, центрифугирования С А. с. N 1497811Э. Лио-Фильно высушенный препарат обладает высокой прецититирупцей активностью С титр в РДП 7-8 1оё2), которая сохраняется в течение двух лет.

3.2. Иммунохимически чистый препарат IgG использован для иммунизации кроликов с целью получения анти-lgG кур антител, на базе kotcpis: с«гггезирйван активный и высоко специфичный иммунопе-раксидазный антивидовой конъюгат. Рабочее разведение жидких конъюгатов составило 1:5000 - 1:50000, лиофилизованных - 1:400 -

1:6400.

3.3. Иммунопероксидазный конъюгат использован для идентит кации антигенных детерминант и серовариантов ВБМ, диФФерендааш антител к ним, индикации гликопротеинного низкомолекулярного гА антител к нему, оценки биологической активности вакцин против I в различных модификациях иммунофермзнтного анализа

3.4. Разработан способ стабилизации ВГИ в безбелковой среде что позволило применять ВГИ в качестве антигена в ИВА без Фоне вых реакций. Способ положен в основу изготовления сухой вирусвак цины с длительным сроком хранения при +4- - +8- С (положительно решение по приоритетной справке N 5015791/13).

Вакцина из стабилизированного в безбелковой среде ВГИ изго тавливается на ПЦБК с 1992 г. Разработан Проект Инструкции на е изготовление взамен предыдущей.

3.5. Оптимизированы условия постановки ИФА, позволяшие оп ределять качество вакцин против БМ, а по количественному содержа нию в «зови кур на 50-60 дни прогнозировать ситуацию по БМ птицехозяйстве.

3.6. Разработан набор для оценки биологической активное! вакцинных штаммов и вирусвакцин против БМ иммуноферментным мето дом.

3.7. Разработаны методы выделения от невакшнированной пти цы из благополучных по БМ птицехозяйств апатогенных штаммов виру са герпеса кур второго серотипа и их идентификации в ИФА. Выделе но пять изолятов, два из которых, под номерами "42" и "50", изу чены в комиссионных опытах, паспортизированы и депонированы ВГНКИ в качестве производственных, вакцинных иггаммов. Эти штамм в совокупности с ВГИ используются для изготовления би- и полива лентной вакцины против БМ (патенты N 2085582 и N 2085583).

3.8. Изучено развитие поствакцинального гуморального иммуни

тета у кур к ВГИ и ВЕМ в динамике, что позволяет оценивать качество применяемой moho-, би- и поливалентной вакцины против БМ. Динамика антител свидетельствует о том. что ВГК с низкой репродуктивной активностью в культуре клеток в совокупности с ВГИ ингиби-рует репликацию вирулентного ВБМ, начиная со 120-дневного возраста.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты проведенных исследований использованы при разработке нормативно-технической документации по изготовлению, контролю и применению набора для оценки биологической активности вакцин против ЕМ иммуноФерментным методом. Нормативно-техническая документация утверждена 26 июня 1997 г. Разработанный набор прошел апробацию на ГЩБК с положительным эффектом. Опытная партия наборов изготовлена в лаборатории по разработке и производству противовирусных биопрепаратов ВНИТИБП.

Предложенный способ стабилизации ВГИ в безбелковой среде лег в основу измененой инструкции по изготовлению и контролю сухой

вирусвакцины против БМ на основе штамма FC-126M ВГИ. Вакцина на

i

основе стабилизированного в безбелкой среде ВГИ внедрена на ШБК с 1992 г.

Разработанный способ определения иммуноглобулинов класса G в сыворотках крови невакцинированной и вакцинированной против ЕМ птицы позволил определять эффективность вакцинации и прогнозировать ситуацию по БМ в птицехозяйстве.

Выделенные из благополучного по БМ птицехозяйства штаммы "42" и "яп» ВГК с ™сс:сс« з££сп.тивнистью применены в качестве компонентов поливалентной вакцины против БМ.

Найденные закономерности гуморального поствакцинального им-

мунитета у кур, привитых moho-, би- и поливалентными вакцинами против ЕМ позволили прогнозировать эффективность вакцинации без контрольного заражения цыплят вирулентным вирусом БМ.

5. СПИХК ОСНОВНЫХ РАБОТ. ОГРБЛИКОВАНШХ Ш ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Выделение и испытание апато генных изолятов вируса кур с целью создания би- и поливалентных вакцин против болезни Марека. /В. А» Лукина, Н. Н. Быкова, Е. И. ярыгина и др. //Тез. докл. всерос. науч. конф. "Вирусные болезни с/х животных". - Владимир, 1995. -С. 255.

2. Выявление A-антигена вируса геотеса индеек и антител к нему иммуноФерментным анализом. /В. А. Лукина, А. А. Бойко, Е.И.Яры-гина и др. //Передовой научно-произв. опыт в биол. промышленности. - М., 1987. - N 8. - С. 1-4.

3. Исследование методом иммуноферментного анализа биологической активности вакцин против болезни Марека и напряженности поствакцинального иммунитета для прогноза эффективности вакцинации. /В. А. Лукина. Е. И. Ярыгина, А.Я.самуйленко и др. //В печати.

4. Лукина В.А., Быкова Н.Н., Ярыгина Е. И. Гуморальные поствакцинальные реакции организма кур на введение моно- и бивалентной вакцины против болезни Марека. //Тез. докл. всерос. науч. кон®. "ИнФекц. болезни молодняка с/х животных". М., 1996. - С. 32-34.

5. Лукина В.А.. Быкова Н.Н., ярыгина Е.И. Зкспресс-метщ оценки биологической активности вирусвакцины против болезни Марека с БЮ. //Тез. докл. 2-ой Междунар. науч.-практич. конф. "Актуал. проблемы вет.-сан. контроля с/х продукции", ч. 2. "Актуал. проблемы вет. медицины". - М., 1997. - С. 113.

6. Лукина В.А.. Ярыгина Е.И., Авдосьева И.К. Взаимосвяз!

между уровнем антител, выявляемых у вакцинированных цыплят в ИФА. и устойчивостью их к болезни Марека. //Сб. науч. трудов "Разработка технологич. процессов изготовления биопрепаратов для профилактики и диагностики болезней с/х животных". - М.. 1991. - С. 32-42.

7. Лукина В.А., Ярыгина Е.И., Быкова H.H. Возможность прогнозирования заболевания болезнью Марека цыплят, привитых вакциной на основе вируса герпеса индеек. // Тез. докл. 5-ой Всерос. конФ. "Науч. основы технологии проиьшш. производства ветер, био-логич. препаратов". - Шелково, 1996. - С. 10-11.

8. Лукина В.А., Ярыгина Е.И. Идентификация антигенов вируса болезни Марека блокированием иммунофермэнтного анализа. //Тез. докл. Всес. конФ. "Методы получения, анализа и применения Ферментов". - Рига, 1990. - с. 188.

9. Оценка активности в иммуноФерментаом анализе вакцины против болезни Марека на основе вируса герпеса индеек. /В. А. Лукина, Е. И. Ярыгина. г.П.Писеева и др. // Тез. докл. Всес. науч. конФ. "Вйрусн. болезни с/х животных". - Владимир, 1995. - С. 256.

10. получение иммунопероюсидазного конъюгата анти-leG желтка яиц кур и исполозование его для выявления вируса герпеса индеек и антител к нему. /В.А.Лукина. Е.И.Ярыгина, H.H.Быкова. А. Я. самуйленко //Тез. докл. Всес. науч.-теор. конФ. молодых ученых "Актуал. вопросы ветер, вирусологии". - Владимир, 1990. - С. 38-39.

11. Способ получения антигена вируса герпеса индеек. ■ /в. А. Лукина, С. Г. Панова. Н.М. Пухова. Е. И. Ярыгина // положительное решение по приоритетной справке N 5015791 от 06.12.1991 г.. 1994 г.

12. Способ получения иммунохимически чистого препарата IgG желтка яиц кур. /Е.и.Ярыгина. A.A.бойко, Т.Я.Шкварук и др. //Авторское свидетельство N 1497811. - 01.04.1989.

13. Штамм вируса герпеса кур как компонент для изготовления бивалентной вакцины против болезни Марека. /В. А. Лукина, Е. В. Бар-рос Палома, Ф.Г.Праксин, H.H.Быкова, Е. И. Ярыгина и др. // Патент N 2085582. - 27.07.1997.

14. Штамм вируса герпеса кур как компонент для изготовления бивалентной вакцины против болезни Марека. /В. А.Лукина, Е. В. Бар-рос Палома, Ф.Г.Праксин, H.H.Быкова, Е.И.Ярыгина и др. // Патент N 2085583. - 27.07.1997.

15. Ярыгина Е.И. Выделение иммуноглобулина класса G из желтка куриных яиц. //Тез. докл. респ. науч.-практич. конф. мол. ученых и специалистов в г. Чимкенте "Проблемы интенсификации животноводства в казахской ССР". - Алма-Ата, 1986. - с. 117-118.

16. Ярыгина Е.И.. Быкова H.H., Лукина В.А. Стандартизация вирусных антигенов набора для оценки биологической активности вакцин против болезни Марека / Тез. докл. 2-ой Междунар. науч.-практич. конф. " Акту ал. проблемы вет.-сан. контроля с/х продукции", ч. 2 "Актуал. проблемы вет. медицины". - М., 1997. -С. 112.

17. Ярыгина Е.И.. Быкова H.H. применение афЦмнной хроматографии для получения иммунопероксидазного конъюгата анти-leG кур. //Тез. докл. науч.-произв. конф. "100 лет Курской биофабрики аг-робиол. промышленности России". - Курск, 1996. - с. 369-370.

18. Ярыгина Е.И., Лукина В. А. Стабильность производственных серий сухой вакцины, определяемая в иммуноферментном анализе. //Тез. докл. 5-ой Всерос. конф. "Научные основы технологии про-мышл. производства вет. биологии, препаратов". - Щелково. 1996. -С. 8-9.

19. Ярыгина E.H., Шкварук Т.Я., Бойко A.A. Получение антисыворотки к ieG желтка яиц кур. // Билл. ВИЭВ. - М., 1987 - Вып. 68. - С. 58-59.