Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антигенные свойства инфекционных итермоинактивированных препаратов вакцинныхштаммов вируса болезни Марека

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Антигенные свойства инфекционных итермоинактивированных препаратов вакцинныхштаммов вируса болезни Марека"

На правах рукописи

БОБРОВСКАЯ Ирина Владимировна

Антигенные свойства инфекционных и термоинактивированных препаратов вакцинных штаммов вируса болезни Марека

03.00.23 - биотехнология

I

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Щелково -2000

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском технологическом институте биологической промышленности РАСХН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Лукина В.А.

Научный консультант:

доктор ветеринарных наук,

профессор, член-корреспондент РАСХН Самуйленко А.Я

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук , Кузнецова C.B.

кандидат биологических наук Рукавишников А.В

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (г. Покров).

Защита состоится декабря 2000 г. в 10 22 на заседании

диссертационного совета К.120.17.01 при Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбинат, п/о Кашинцево.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП. Автореферат разослан ноября 2000 г.

Ученый секретарь ^

диссертационного совета, /

кандидат биологических наук ///^Эу^т^ •__Фролов Ю.Д.

пт. в aco^r^-j л i л ъи 9о о

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Болезнь Марека (БМ) - высококонтагиозное вирусное заболевание птиц гряда куриных), проявляющееся образованием опухолей и процессами де-1елинизации нервных тканей, наносит значительный экономический ущерб омышленному птицеводству.

На сегодняшний момент определены три серотипа вируса БМ (ВБМ). К рвому серотипу относятся онкогенные и аттенуированные неонкогенные гаммы. Ко второму - природные непатогенные штаммы вируса герпеса кур ГК). К третьему - антигенно-родственный ВБМ вирус герпеса индеек ГИ).

Согласно принятой классификации возбудителем данного заболевания яв-ется ДНК-содержащий ВБМ, который в настоящее время относится к под-мейству Gammaherpesvirinae (Calnek B.W. and Witter R.L., 1991; Сюрин B.H. др., 1991). Однако в многочисленных сообщениях о структуре генома ВБМ и :рекрестных антигенных реакциях с вирусом простого герпеса (ВПГ) челове-., его предлагают отнести к подсемейству Alphaherpesvirinae (Becker Y.,1992; slecluse H.J. and Hammershmidt W., 1993; Brunovskis P. and Velicer V.,1995; umiga Y.,1998).

Хотя три серотипа различимы в серологических реакциях, они имеют мно-| общих антигенов. Сыворотка против одного серотипа ВБМ обычно пере-)естно реагирует с антигенами других серотипов, но гораздо слабее, чем с •мологичными штаммами (Pratt I. et al.,1994; Oho M. et al., 1995).

Эффективным инструментом для идентификации вирусных антигенов яв-нотся моноклональные антитела (МАТ), которые позволяют изучить струк-фу и функции отдельных белков вируса (Nazerian К. et al., 1996; Lee L.F. et .,1992; Witter R.L.,1995). Так, недавно, Bullow V.V. и Biggs P.M.(1993) под-$ердили, что антиген-А ВБМ является группоспецифическим, но, тем не ме-;е, имеет и типоспецифические детерминанты. Davidson I. и Malkinson М.

(1995г) показали, что серотип-общие нейтрализующие домены располагают! в термостабильных олигомерных формах вирусного антигена В (В-АГ) с bi сокой молекулярной массой, а термолабильный мономерный комплекс В-/ имеет серотип-ограниченые эпитопы.

В последнее время, для идентификации патогенных и непатогеннь штаммов и изолятов ВБМ широко применяют такие высокочувствительш методы исследований генома, как рестрикционный анализ, полимеразная це ная реакция (ПЦР), молекулярная гибридизация и секвенирование (Bumste; N. et al.,1997; Davidson I. et al.,1995; Silva R.F.,1992; Zhu G.S., Ojima T. al., 1992).

Применение рестрикционного эндонуклеазного анализа показало сущес венное различие между образцами ДНК 1, 2 и 3 серотипов, а также меж, ДНК вирусов низкого и высокого пассажа в культуре клеток (Izumiga Y. al., 1998; Lindermaier W., Bauer H. J.,1994; Ross I. et al., 1993).

Результаты проведения ДНК-ДНК гибридизации между геномами ВБМ ВГИ показали, что уровень гомологии нуклеотидных последовательностей г нов, кодирующих гликопротеин A (gA) составляет 73%, а сравнение генов, к дирующих гликопротеин В (gB) трех серотипов ВБМ выявило наличие в hi существенных различий (Потехин C.B. и др.,1998). Многие годы значительнь процент от всех вакцин, применяемых для профилактики БМ приходился препараты на основе штамма FC-126 ВГИ, выделенного Witter R.L. (1970) индеек. Однако в последние годы, в связи с селекцией полевых высоковир лентных штаммов ВБМ данный тип вакцин значительно снизил эффекта ность, а порой и полностью утратил способность защищать птицу от БМ. В соковирулентные мутанты содержат антигены-мишени, несоответствующ таковым на вакцинном вирусе (Witter R.L.,1992; Коровин Р.Н., Зеленск] В.П.,1989; Gingerich Е., 1989; Prajapat K.S.et al., 1990).

Всестороннее углубленное изучение антигенных особенностей ВБМ и е взаимосвязей с другими представителями Herpesvirinae будут способствовав

льнеишем изготовлению новых поколений вакцинных препаратов, препят-вующих селекции ВБМ в природных условиях и появлению высоковиру-нтных патотипов вируса.

Таким образом, представляется своевременным и обоснованным изучение ;тигенных свойств инфекционных и термоинактивированных препаратов кцинных вирусов БМ с привлечением МАТ.

Данные литературы также свидетельствуют о необходимости разработки лее чувствительных и специфичных диагностических тест-систем, особенно я выявления латентных и персистирующих форм ВБМ.

Перечисленные выше обстоятельства явились основополагающими в оп-делении выбора темы диссертационной работы. Цель и задачи исследования.

Цель работы - изучить антигенные свойства инфекционных и термоинак-вированных препаратов вакцинных штаммов вируса болезни Марека с ис-льзованием поли- и моноклональных антител, а также ПЦР для выявления и пированця ДНК ВБМ. В соответствии с целью работы поставлены следующие задачи: получить высокоактивные иммунопероксидазные антивидовые конъюгаты ть^в кур);

изучить фракционный и морфологический состав вирусной популяции в оизводственных сериях вакцины против БМ на основе ВГИ;

получить антигены ВБМ, различающиеся по перекрестной серотипиче-ой активности, применив приемы термоденатурации;

разработать варианты ИФА с применением поли- и моноклональных анти-п для выявления структурных белков ВБМ;

разработать компьютерную программу по обработке данных титрования тигенов в ИФА;

подобрать специфичные праймеры и оптимизировать условия постановки Р для выявления и типирования ДНК вируса болезни Марека.

Научная новизна работы.

Разработан новый способ получения чистого препарата из желтка я кур. Показана возможность исследования полученных гипериммунных сые роток к кур в РДП и в ИФА (подана заявка на получение патента).

Получены и исследованы в ИФА специфичные и стабильные антигенн! комплексы в непрогретых и прогретых ультразвуковых лизатах клеток, инф цированных тремя серотипами ВБМ.

Впервые для анализа антигенного сходства поверхностных белков §В и { разных серотипов ВБМ и ВПГ в ИФА были применены МАТ, направленны« белкам вируса простого герпеса (ВПГ) человека.

Подобраны специфичные праймеры, комплементарные гену гликопроте на А и последовательностям внутренних инвертированных повторов, позе ляющие выявлять ДНК вирулентных, онкогенных штаммов 1 серотипа и в; цинных штаммов 3 серотипа, определены оптимальные параметры постанов ПЦР для обнаружения вирусной ДНК.

Практическая значимость работы.

По результатам исследований разработаны:

методические указания по применению компьютерной программы для с ределения активности вируса в вакцине против БМ иммуноферментным мет дом;

методические указания для выявления ДНК вируса болезни Марека мет дом ПЦР.

Метод ПЦР может быть рекомендован к использованию для идентифм ции и дифференциации вирулентных, онкогенных штаммов ВБМ 1серотш вакцинных штаммов 3 серотипа, а также для контроля за изменениями виру в процессе культивирования при промышленном изготовлении вакцин.

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубл ковано 12 печатных работ. Подана заявка на получение патента: «Способ изг

овления иммунопероксидазных конъюгатов для индикации и идентификации сыворотках крови кур антител различного происхождения».

Апробация результатов. Материалы работы и ее отдельные разделы до-ожены: на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 0-летию проф. В.А. Першина (Щелково, 1998 г.); Всероссийской конферен-ии молодых ученых и аспирантов по птицеводству (Сергиев Посад, 1999 г.); онференции «Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животно-одстве на современном этапе» (Москва, 1999 г); Всероссийской научной конвенции по ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии ¡НИИВВиМ, посвященной 75-летию академика И.А. Бакулова (Покров, 2000 ,); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию .НИТИБП «Научные основы производства ветеринарных биологических лре-аратов» (Щелково, 2000 г.); международной конференции «Биотехнология -000» (Пущино, 2000 г.).

Структура н объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 44- странице машинописного текста, иллюстрированы 26 рисунками и 22 таб-ицами. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литера-уры, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсужде-ие результатов, выводы, практические предложения, список литературы из 68 источников, включающий 124 иностранных и приложение, содержащее окументы, подтверждающие практическую ценность работы.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Работа выполнена в лаборатории по разработке и производству про-ивоопухолевых препаратов ВНИТИБП согласно программе фундаменталь-ых и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению азвития агропромышленного комплекса РФ на 1996-2000 гг. по следующим аданиям:

1. «Разработать би- и поливалентиные вакцины против болезни Марека I ВГИ (РС-126М) и ВГК (апатогенные штаммы)», № гос. регистрации во ВНТ центре 01.9.60001525;

2. «Разработать компьютерную программу по оценке качества вакцин против болезни Марека», № гос. регистрации-01.9.60001528».

2.1.1 .Вирус. В работе использовали: промышленные серии нативной и с; хой вакцины против БМ на основе штаммов ВГИ РС-126 и РС-126 М; штамм ВБМ: Дт, в виде инактивированного формалином и лиофилизированно1 ультразвукового лизата перьевых фолликулов инфицированных БРР-цыплят клеточно-ассоциированный штамм НРЯ8-16 (ВГНКИ); штаммы ВГК: «42 «50» и 5В-1; промышленные серии нативной поливалентной вакцины проп БМ (ВГИ+ВГК).

В качестве контрольных препаратов использовали: культуральную жи, кость, собранную с неинфицированных клеток; ультразвуковые лизаты ней] фицированных культур клеток куриных эмбрионов (КККЭ), культур клетс перипелиных эмбрионов (ККПЭ) и перьевых фолликулов маховых перьев н инфицированных цыплят: гетерологичные герпесвирусы: ИЛТ птиц, штам НТ и ИРТ КРС, штамм ТК-А, ВПГ человека.

2.1.2. Антигены: Ультразвуковые лизаты инфицированных КККЭ в вщ свежеприготовленных, а также длительно хранившихся серий сухой вакцин против БМ на основе ВБМ 3 серотипа (сухие; сухие и нативные термоденат рированные в динамике при 100°С); ультразвуковые лизаты инфицированнь КККЭ в виде препаратов на основе ВБМ 2 серотипа (сухие, сухие и нативнь термоденатурированные в динамике при 100°С); ультразвуковые лизаты н инфицированных КККЭ (сухие, сухие и нативные термоденатурированные динамике при 100°С).

2.1.3. Культура клеток и среды. Трипсинизацию тканей эмбрионов БР кур и приготовление клеточных культур проводили по общепринятым мет дам (Сюрин В.Н. и др.,1991; Лукина В.А., 1992; Слепенко Т.Б.,1987). г

шпсинизации тканей использовали раствор Хенкса и 0,25% раствор трипсина Дифко», США), а для съема и дезагрегаций клеток - 0,125% раствор трипси-

I.

В состав криозащитных сред для консервирования инфицированных ВГИ ВГК клеток входили: среда ИГЛА - 40%, ГЛАЭ - 40%, сыворотка КРС -•%, ДМСО - 10%; для бесклеточного вируса использовали стандартную са-розо-альбуминовую среду (СФГА), а также среду на основе безбелкового абилизатора - 8% сахарозу.

При культивировании ВБМ применяли среды ИГЛА, ГЛАЭ, 199 и сыво-тку КРС в концентрации 5-10% для ростовой и 2% - для поддерживающей еды.

2.1.4. Экспериментальные животные. Для получение антивидовых сыво-ток к IgG из желтков яиц кур, использовали кроликов и баранов, которых [мунизировали препаратами IgG. Сыворотки к неинфекционным препаратам >М получали от морских свинок. Цыплята были использованы для получе-я ультразвуковых лизатов перьевых фолликулов. Специфические к ВГИ и >М сыворотки бр&чи от 50-90 дневных SPF-цыплят. Для проведения ПЦР обы селезенки и фабрициевой сумки были взяты от 7-ми, 14-ти и 21-дневных 'плят, вакцинированных в суточном возрасте десятикратной дозой ВГИ.

2.1 ^.Фракционирование ВГИ. Бесклеточный препарат ВГИ фракциониро-1И на колонке модели К 29/100, заполненной сефадексом G-200 по обще-инятой методике (Гринин A.C., Титов И.Н.,1971). Профиль элюирования 1ков с колонки вычерчивали по данным измерений оптической плотности П) на СФ-26 при ^.=280 нм. Активность и специфичность фракций опреде-ш на культуре клеток и в ИФА. Однородность и чистоту проверяли мето-и вертикального электрофореза в полиакриламидном геле (Гааль Э. и др., 52).

2.1 .б.Концентрнрование и фракционирование методом межфазного разде-1ия вирусных частиц в водных растворах полимеров. Работу проводили в

соответствии с методом, предложенным Альбертсоном В. (1974г), использу внеклеточный ВГИ. Для выбора точки концентрирования построение фазовы диаграмм для каждой серии препарата производили по методике, разработан ной во ВНИТИБП (Г.П. Писеева с сотр.,1981).

2.1.7. Электронная микроскопия. Морфологию ВГИ изучали методо: ультратонких срезов и негативного контрастирования (А.Ф. Марыгина,1987 Образцы исследуемого материала наносили на коллодиевую пленку, укрег ленную углем, и контрастировали раствором фосфорно-вольфрамовой кислс ты (рН 7,0). Полученные препараты просматривали в электронном микроскоп ДЖЕМ-100Б (Япония). Электронограммы получали на фотопластинках М типа «ядерные» с последующим экспонированием на фотобумагу. Электро! но-микроскопические исследования выполнялись в институте теоретической экспериментальной биофизики в г. Пущино, в лаб. ультраструктуры нейро! совместно со ст. науч. сотр. И.М. Санталовой (зав. лаб. проф. Д.А. Мошков).

2.1.8. Выделение, очистка и концентрирование желтка яиц кур. За о> нову выделения 1§0 был взят метод двукратного переосаждения ПЭГ-6000 доочисткой обогащенной фракции на сефадексе 0-200 (Ярыгина Е.И.,1998 Концентрацию подсчитывали по формуле:

[18С]=\'х(ОП280/ 1,31),

где [^О] - выход иммуноглобулина й в мг; V - объем раствора в с\ ОП280 - оптическая плотность раствора при длине волны 280 нм; 1,31 - коэ< фициент экстинкции раствора с концентрацией 1 мг/см3.

Чистоту выделенных препаратов 1£С проверяли, совместно с зав. ла биохимии ВНИВВиМ Середой А.Д., методом вертикального электрофореза ПААГ, используя в качестве маркеров набор белков с определенной м.м. (Г аль Э. и др., 1982). После построения к&чибровочной кривой с помощью ко пьютерной программы по статистической обработке Б1аг§гаГГ, находили м. белков в исследуемых пробах. Специфичность выделенных препаратов прог

ли общепринятым методом иммуноэлектрофореза с полиспецифической сы-роткой, полученной на протеины желтка яиц кур.

2.1.9. Активность и специфичность гипериммунных сывороток кроликов и ранов, содержащих анти-IgG антитела кур определяли в РДП и в ИФА.

2.1.10. Выделение специфических антител из сывороток крови. Антитела гипериммунных антивидовых сывороток крови баранов и кроликов выделя-: методом аффинной хроматографии на колонках К 26 х 40, предварительно оведя двукратное высаливание сульфатом риванола (Маслов Е.В. с тр., 1985). Чистоту и специфичность IgG контролировали общепринятым медом иммуноэлектрофореза.

2.1.11 .Конъюгация антител с пероксидазой. Синтез конъюгатов перокси-зы с аффинно-оЧищенными антителами осуществляли перйодатным'мето-м (P.K. Nakane et А. Kawaoi,1974; М.' В. Wilson et P.K. Nakane, 1978).

2.1.12. Иммуноферментный анализ для определения антигенов ВБМ и ан-тел к ним в сыворотках крови кур. Применяли неконкурентные методы с пользованием антивидовых пероксидазных конъюгатов, специфических ан-тел и иммобилизованного антигена; модифицированный «сэндвич» метод с пользованием МАТ к gD ВПГ и твердофазный ИФА с прямой сорбцией ан-гена. В качестве дифференцирующих специфических антител использовали жотипические (поликлональные) сыворотки SPF-цыплят к 1 и 3 серотипам ЗМ; мышиные МАТ (любезно предоставлены зав. лаб. института вирусоло-и им. Д.И. Ивановского проф. Кущ A.A.) направленные к структурным ком-тентам ВПГ (к gD и gB).

2.1.13. Реакция нейтрализации. Реакцию нейтрализации вирусной актив-юти проводили на КККЭ с сыворотками морских свинок в разведениях от 1:4 I 1:512. В качестве вируссодержащего материала использовали одну серию кцины на основе ВГИ (штамм FC-126) с предварительно оттитрованной (зой вируса (300 ФОЕ в 0,1 см3). Учет реакции проводили на 7 день, считая

титром то разведение сывороток, которое подавляет фокусообразование i менее чем на 50% во всех зараженных данной смесью флаконах.

2.1.14. Реакция непрямой иммунофлуоресценции (ИФ). Суточные мон< слои КККЭ выращивали на покровных стеклах, инфицировали ВГИ или ВГ] фиксировали общепринятыми методами, наносили очищенные МАТ, напра ленные на белок 2С гликопротеина В, а затем антивидовую сыворотку на ве< gB, меченную ФИТЦ (НИИЭиМ им. Н.Э. Гамалеи). Результаты исследовали помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМИНИ-1.

2.1.15. Постановка полимеразной цепной реакции. Для проведения pea ции использовали: дезоксирибонуклеотидтрифосфаты («Serva», ФР «Pharmacia», Швеция); фермент: Тац-полимераза производства фирм "Fermentas", Литва). Оборудование: амплификатор «Touch Dawn», Hybai Англия; комплект Эппендорф, состоящий из центрифуги, термостата, миксер система для электрофоретического разделения ДНК «Hoeffer Scientif Instruments», США; трансшшюминатор, США.

Выделение ДНК из исследуемых образцов проводили фено. хлорофорным методом. Пробы ДНК в объеме 10 мкл амплифицировали в í мкл реакционой смеси, содержащей: 1 тМ каждого праймера, 200 мкМ кажд го dNTD,10 тМ Tris НС1 (рН 8,3) 50 шМ КС1, 3,0 тМ MgCl2 и 2,5 ед. Та полимеразы. Амплификация проходила в термоциклере по следующей пр< грамме: 3 цикла (денатурация ДНК при 94°С - 30-60 сек, отжиг ДНК при 5 60°С - 30-90 сек, синтез комплементарной цепи - при 72°С - 60-90 сек), сл дующие 30 циклов (денатурация - при 94°С - 30 сек, отжиг - при 50°С - ¿ сек, синтез - при 72°С - 50 сек). Аликвоты ПЦР-продуктов объемом 5-10 mi разделяли в агарозном геле.

Учет результатов амплификации проводили при помощи электрофореза агарозном геле по размеру и расстоянию пробегов ПЦР-продуктов и марке; ных ДНК (рестрикцированный Hind III ДНК фага лямбда) (Davidson''I. al., 1995; Гусева Е.В. с сотр., 1998).

Исследования по ПЦР выполнены совместно со ст. науч. сотр. лаб. биофи-ики ВНИИВиМ Цыбановой Л.Я.

2.1.16. Статистическая обработка результатов исследований.

Достоверность результатов опытов оценивали по разностному методу 'тьюдента-Фишера. Цифровые данные подвергали статистической обработке еличин и их ошибок (Меркурьев Е.К.,1979; Лакин Г.Ф.,1980). Компьютерная рограмма для определения активности вакцины против БМ иммунофермент-ым методом разработана совместно инженером-программистом отдела эко-омических исследований и маркетинга ВНИТИБП Шутовой Л.А., используя акет прикладных программ Microsoft Developer Studio. Для аппроксимации гзультатов вычислений применяли математический метод наименьших квад-

1ТОВ.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Синтез имунопероксидазного конъюгата

Для определения антигенной активности ВБМ, ВГК и ВГИ используют «личные серологические методы (Сюрин В.Н. и др., 1998; Gagic M., et .,1995; Bacon L.D., Witter R.L.,1994; Davidson I. et al.,1995; Nazerian K. et „1996; Nagang G.,1995; Слепенко Т.Б.,1987; Тыщенко И. П., Джавадов Э.Д., >92). Но в последние годы для обнаружения вирусных антигенов и антител к ш широко используется ИФА, который включен в число обязательных тес-IB экспресс-диагностики, рекомендуемых ВОЗ (Мищенко В.А. и др., 1995; укина В .А. и др.,1992; 1998; Strivastava R.N. et al.,1992; Lin J.A. et al.,1991; îe L.F. et al., 1992; и др.).

На первом этапе исследований в соответствие с целями и задачами необ-щимо было получить конъюгированные с ферментом пероксидазой анти-IgG риные антитела. Для этого выделение IgG из желтков яиц кур проводили пя-кратным осаждением антител полиэтиленгликолем (ПЭГ) с м.м. 6000 Д без следующей очистки гель-хроматографией. Полученные таким методом пре-

î:

параты антител не отличались по чистоте и специфичности от образцов IgG выделенных из желтков методом трехкратного осаждения ПЭГ с последующе] доочисткой на колонке с сефадексом G-200 (Ярыгина Е.И.,1998).

Антитела к IgG получали иммунизацией кроликов и баранов по разньи схемам (C.B. Кузнецова с сотр., 1984; Н.И. Козлова и Б.Б. Першин, 1989). Пре ципитирующая активность кроличьей сыворотки в РДП была 1:16-1:32, а ба раньей - 1:128. На данной стадии исследований нами была предпринята пс пытка определения активности и специфичности антивидовых сывороток помощью ИФА. В итоге, гипериммунная сыворотка кроликов реагировала IgG кур до разведения 1:64000 с низкими показателями ОП450, тогда как тит сыворотки барана составил 1:256000. При этом показатели ОП450 находилис на максимально высоком уровне.

Таким образом, для исключения возможности приготовления неактивног и неспецифичного конъюгата показана необходимость проверки полученны гипериммунных антивидовых сывороток к IgG кур не только в РДП, но и ИФА.

Y-глобулиновые фракции из гипериммунных антивидовых сывороток пс лучали методом солевого осаждения. Для выделения анти-IgG антител к> был применен метод аффинной хроматографии. В качестве специфичног сорбента использовали иммобилизированные на активированной сефарозе 4 IgG кур.

Конъюгацию аффинно очищенных антивидовых антител с пероксидазс хрена (RZ=3) проводили перйодатным методом (Nakane Р.К., Kawaoi А., 1974'

При титровании антивидовых конъюгатов методом прямого ИФА, устав вили, что рабочее разведение конъюгата на основе кроличьих антител сост вило 1:1000, а на основе бараньих антител - 1:10000. По причине недостаточ) высокой активности кроличьего конъюгата, в дальнейшей работе был испол зован иммунопероксидазный конъюгат на основе бараньих антител, рабоч разведение которого в непрямом ИФА составило 1:2000.

2.2.2. Изучение фракционного и морфологического состава бесклеточного ВГИ (производственные серии сухой вакцины против БМ на основе штамма FC-126).

Препараты на основе ВГИ, как и большинство других вирусов, репроду-щруемых в культуре клеток, обладают структурной гетерогенностью (поли-юрфизмом), которая влечет за собой функциональную. Многими исследова-елями (ПисееваГ.П., 1986; Марыгина А.Ф.1987; Calnek B.W., Witter 1.Ь.,1991;Тыщенко И.П.,1993; Лукина В.А.,1996; Могильный Ю.И. и др.,1997; {жавадов Э.Д. и др., 1999) было показано, что иммуногенность вакцин зависит it количества и степени зрелости вирионов в ее составе.

Для подтверждения данного вопроса нами было проведено фракциониро-ание производственных серий сухой вакцины против БМ на основе ВГИ, итамма FC-126 на колонке с сефадексом G-200. Собранные с колонки фрак-щи исследовали на инфекционность (титрованием в КККЭ), активность и пецифичность (титрованием в ИФА) и концентрацию белка (по ОП при =280 нм на СФ-26). С выборкой фракций был также проведен вертикальный лектрофорез в ПААГ, который показал наличие в них белков с различной модулярной массой (от 65 до 170 кД). В результате была получена антигенно- и [нфекционно-активная фракция (11-я), в которой несмотря на высокую сте-1ень очистки (99,3% от исходного количества в исследуемом препарате), оста-[ись балластные белки преимущественно с м.м. 65 кД.

Далее, концентрирование вируса, содержащегося в 11-й фракции, прово-1или в двухфазной системе водорастворимых полимеров (декстран-юлиэтйленгликоль) с одновременным фракционированием вирусных частиц ю степени их зрелости. Полученные в процессе разделения фазы исследовали ia инфекционную (по ФОЕ) и специфическую активность в ИФА (по АОП), а акже было проведено электронное микроскопирование содержимого интер-)азы и нижней фазы. Установили, что в ИФА принимают участие только концентрированные в интерфазе морфологически полноценные вирионы с шотным нуклеокапсидом. Отсутствие иммунохимической активности в ИФА

и

и незначительная инфекционная активность вируса в составе нижней фазы, ; также электронно-микроскопические исследования, ясно показывают на нали чие в ней в основном «пустых» капсидов, отдельных электронно-прозрачны; «крестообразных» капсидов и многочисленных клеточных обломков.

Полученные результаты подтверждают гетерогенность вирусной популя ции в составе вакцины, а также корреляцию высокой иммунохимической ак тивности с наличием больших концентраций зрелых форм вирионов.

2.2.3. Получение антигенов ВБМ, различающихся по перекрестной серотипической активности (термоденатурация)

ВГИ в антигенном отношении близкородственен штаммам ВБМ. Недавн< Bullow V.V. и Biggs Р.М.(1993) сообщили, что штаммы ВБМ и ВГИ можн< подразделить на три серотипа по перекрестной реакции нейтрализации, в не прямом тесте иммунофлуоресценции и в РДП. Было подтверждено, что А и I антигены являются группоспецифическими (общими для всех серотипов). Хо тя, основываясь на появлении шпор в РДП и на результатах перекрестной взаимодействия, А и В антигены имеют типоспецифические детерминанть (Shunsuke Yachida, 1983).

Для дифференциации вирусов, целью данного этапа работы было полу чить и исследовать в ИФА специфичные и стабильные антигенные комплекс! в прогретых и непрогретых ультразвуковых лизатах клеток, инфицированны: тремя серотипами ВБМ.

Сухие и восстановленные физиологическим раствором препараты на ос нове ВБМ 3 и ВБМ 2 подвергали термоденатурированию при 100°С в течени 5-15, 30, 45 и 60 мин. Антигенную активность, специфичность и инфекцион ность термообработанных и необработанных лизатов устанавливали в ИФА титрованием в КККЭ SPF-эмбрионов. Результаты представлены в табл. 1,2.

Из данных таблиц видно, что во всех обработанных препаратах инфекци онность вируса, учтенная по ФОЕ, через 15 мин, резко снижалась (на 98%) полностью исчезала через 30 мин. В табл. 1 показано, что в препаратах ВБМ 2

мообработанных в сухом виде, структурные компоненты антигена, пере-стно-реагирующие в ИФА с антителами (АТ) к вирусу 1 и 3 серотипов, ностью сохранялись в течение всего периода термообработки (т.е. оказа-ь термостабильными).

Показано, что антигены, реагирующие с АТ к вирусу 1 серотипа, более ствительны к нагреванию в нативном виде по сравнению с антигенами, тирующими с АТ к вирусу 3 серотипа. Уже через 15 мин термообработки езают сигналы, регистрируемые в ИФА. Следовательно, в таком варианте [та антигены, реагирующие с АТ к вирусу 1 серотипа являются термола-ьными. Сохранность же антигенной активности препарата вируса 3 серо-а в нативном виде не зависела от времени термообработки и составила в щем 44% от исходной. Инфекционность полностью утрачивалась через 15

Таблица 1.

Антигенная и инфекционная активность препарата ВБМ 3, тер.моденатурированного в сухом и в нативном виде

Наименование препарата Обработка при 100°С, мин Число опытов Д ОП (М ± ш) Титр вируса на КККЭ (ФОБ/мл)

АТ к ВБМ1 АТ к ВБМЗ

Исходный сухой препарат 0 5 0,70±0,04 0,68±0,02 (3,6+0,2) х 105

Термообрабо-таиный сухой препарат 15 3 0,70±0,03 0,68±0,02 (6,5+0,5) х 103

30 4 0,81±0,04 0,82±0,04 0

45 7 0,74±0,02 0,77±0,02 0

60 3 0,71±0,03 0,74±0,02 0

Термообрабо-тшшыи натив-ный препарат 15 3 0,12±0,02 0,32±0,04 0

30 3 0,07±0,02 0,31 ±0,03 0

45 3 0,09±0,02 0,30±0,02 0

60 3 0,04±0,02 0,29±0,03 0

Примечание: АОП - разница оптических плотностей между положитель-и и отрицательными антигенами.

Таким образом, нам удалось создать условия для выявления групп терг лабильных и термостабильных структурных компонентов ВГИ и, при тер; обработке препаратов вируса 3 серотипа в нативном виде получить антиг реагирующий в ИФА только с АТ к вирусу 3 серотипа.

Результаты исследования антигенной и инфекционой активности термо натурированных препаратов на основе ВГК с высокой степенью цитопати ского действия представлены в табл.2.

Из данных таблицы видно, что в препарате ВБМ 2 в ИФА снижаются л же показатели ОП, характеризующие сохранность антигенной активности 32% для антигенов, реагирующих с АТ к вирусу 1 серотипа и до 35% для аи генов, реагирующих с АТ к вирусу 3 серотипа).

Таблт

Антигенная и инфекционная активность препарата ВБМ 2, термоденатурированного в сухом и нативном виде

Наименование пре- Обработка Число ДОП (М±ш) Титр вируса

парата при100°С опытов АТ к АТк наКККЭ

мин ВБМ1 ВБМЗ (ФОЕ/мл)

Исходный сухой препарат 0 4 0,93±0,04 1,06±0,03 (2,7±0,3)х 10'

Термообработан-ныи в сухом виде ВБМ 2 15 3 0,39±0,03 0,52±0,02 (3,5±0,2)х10:

30 3 0,32±0,02 0,40±0,03 0

45 3 0,25±0,03 0,35±0,02 0

60 3 0,24±0,03 0,23±0,02 0'

Термообработанный нативный ВБМ 2 5 3 0,06±0,02 0,39±0,02 0

Инактивированный ВБМ 1 (шт.,.1т) — 5 0,32±0,03 0,05±0,02 0

При термоденатурировании нативного препарата ВБМ 2 уже чер мин инфекционная и антигенная активность вируса не выявлялась. При ; антигенная активность, определяемая с АТ к ВБМ 3 утрачивалась лиш

о, что свидетельствует о большой устойчивости к экстремальным темпера-ным воздействиям антигенов, реагирующих в ИФА с AT к ВБМ 3.

Примером противоположного взаимодействия может послужить инакти-ованный препарат ВБМ 1 (штамм Jm), который имеет стойкие отрицатель; результаты с AT к ВБМ 3 и реагирует только с AT к ВБМ 1. В опытах установлено, что антигены ВБМ 3, определяющие перекрестную кцию с AT к ВБМ 1 находятся в термолабильных формах общего антиген-о комплекса, в то время как у ВБМ 2 с сильным ЦПД, начинают преобла-ь некоторые характеристики ВБМ 3, так как у этого препарата, термодена-ированного в нативном виде стабилизируются антигены, реагирующие ько с AT к ВБМ 3.

Ранее (Davidson I., Becker Y., Malkinson M.,1995; Лукина В.А.,1996; Яры-а Е.И.,1998) сообщалось о применение метода «сэндвич» ИФА и классиче-го иммунологического приема блокирования активных центров специфн-ких антител для идентификации общих и индивидуальных антигенных де-минант серотипов ВБМ.

В настоящей работе, применив приемы термоденатурирования подтверди-наличие индивидуальных отличительных признаков серотипов ВБМ и пошли следующие неинфекционные антигенные комплексы: 1) перекрестно-гирующие с AT к вирусу 1 серотипа и с AT к ВГИ; 2) реагирующие только Т к ВГИ; 3) реагирующие только с AT к вирусу 1 серотипа.

2.2.4. Применение поли- и моноклональных антител для выявления структурных белков вируса болезни Марека

В последние годы авторы многочисленных исследований по структуре ге-ла ВБМ и перекрестным реакциям ВПГ человека предлагают отнести ВБМ подсемейству Alphaherpesvirinae (Becker Y.,1992; Brunovskis P., Velicer '.,1995; Delecluse H.J.,1993; Горбовицкая M.,1996; Izumega Y„ et al.,1998). <: Davidson I. et al. (1995) показал, что чувствительные к нагреванию олиго-

меры структурного антигена В ВБМ содержат конформационные эпито родственные олигомерам гликопротеина В (gB) альфагерпесвирусов ВПГ-ВПГ-2. Из трех наиболее изученных антигенов (А, В, D), только gB индуци ет измеряемую степень иммунологической защиты (Nazerian К., et al., 19 Davidson I., et al., 1992; Jang H.K. et al., 1996), gA выделяется in vivo и in vitr не имеет отношения к онкогенности (Liu Х.,1992), тогда как gD появляетс чистом виде только in vitro и участвует в проникновении вируса в кле (Anderson A.S.et al., 1998). В геномах ВБМ и ВГИ были идентифицированы крытые рамки считывания (ОРС), гомологичные генам gD ВПГ (Zelnik V. al.,1992; Mitsuru О., et al.,1995). Интересны в этом плане антигенные взаш связи ВБМ и ВПГ по структурному гликопротеину Д (gD), кодируемому у стком гена US6, аналогичному ВПГ и антигену А, аналогичному гликопрот ну С оболочки вириона ВПГ.

С помощью МАТ в лизатах инфицированных клеток идентифициров: семейство серологически родственных гликопротеинов с м.м. 115/110, 63, кД (ВБМ) и 115, 62, 52 и 48 кД (ВГИ). Все обнаруженные гликопротеины и ли общие детерминанты, которые идентифицировались одним из МАТ. Им1 нофлуоресцирующие тесты свидетельствуют о том, что гликопротеины с м 110-115 кД входят в состав антигена В, а гликопротеины с м.м. 49-52 кД в дят в состав антигена Д на поверхности инфицированных клеток и в ци плазме, где они тесно связаны с внутренними структурами (Nazerian К., Wi R.L., Lee L.F.,1996).

Целью настоящей работы явилось исследование клеточно-свободных т моденатурированных, исходных сухих и клеточно-ассоциированных препа тов ВБМ в ИФА, РДП и РН с применением поликлональных сывороток, а т же анализ антигенного сходства поверхностных белков gB и gD разных се] типов ВБМ и ВПГ человека с помощью МАТ, направленных к белкам ВПГ использованием двух модификаций ИФА и реакции непрямой иммунофл; ресценции.

От морских свинок, которым вводили антигены (термоденатурированные эепараты: сухой ВГИ, нативный ВГК, сухие неинфицированные клетки), поучали специфические сыворотки, которые исследовали в РДП и РН. Показа-I, что сыворотка, полученная на неинфекционный сухой препарат ВГИ 00°С, 45 мин), нейтрализовала вирус в разведении до 1:256, а сыворотка, порченная на нативный ВГК (100°С, 5 мин) нейтрализовала вирус до разведе-1я 1:32. Эти данные свидетельствуют о наличие в термоденатурированном ■.инфекционном сухом препарате лизата клеток, зараженных ВГИ, антигена , индуцирующего синтез вируснейтрализующих антител.

Для изучения возможности использования МАТ для детекции белка в >епаратах вирусов 1,2 и 3 серотипов, нами был разработан двойной анти-льный метод «сэндвич» ИФА, в котором в качестве 1 -го и 3-го слоя исполь-вали МАТ 4{6, направленные к §Б. Показано, что МАТ 4% «узнают» белок ) в следующих препаратах: в исходной сухой вакцине на основе ВБМ 3; в инфекционном термоденатурированном в сухом виде препарате ВБМ 3; в ходном препарате ВБМ 2, обладающем ЦПД-активностыо и в поливалент-(й нативной вакцине за счет ВБМ 3, поскольку МАТ не выявляют клеточно-социированный ВБМ 2 с низкой ЦПД-активностыо. Особый интерес пред-авляет сухой термоденатурированный (100°С - 45 мин), перекрестно-агирующий препарат ВГИ, в котором с помощью ИФА выявлено присутст-:е антигена §0. Видимо, в таком варианте термоденатурации белок §0 оста-ся стабильным.

Таким образом, применение МАТ, направленных на антигенную детерми-нту позволяет определить наличие данного антигена в смеси с другими тигенами. С помощью поликлональных антител выявляются два дополни-льных антигена: в сухом инактивированном препарате ВБМ 1 и в термооб-ботанном (100°С - 45 мин) нативном препарате ВБМ 3. Таким образом, [фференцирующими для этих препаратов остаются сыворотки, содержащие Г к ВБМ 1 и АТ к ВБМ 3.

Использование непрямого варианта ИФА для выявления специфически белков в вирусных препаратах с помощью МАТ 4%, показало, что высокост цифичными оказались только антитела, направленные на белок в препар; тах сухой вакцины ВБМ 3. Ни один из исследуемых клеточн< ассоциированных препаратов не прореагировал с МАТ 4Г6 в такой разнови, ности ИФА.

При использовании реакции непрямой иммунофлуоресценции для выя ления белка gB в инфицированных (ВГИ и ВГК) клетках с использование МАТ 2С (направленных к белку §В ВПГ), данный гликопротеин не был обн ружен ни на одной стадии инфекции, включая полное ЦПД.

Таким образом, в результате проведенных нами исследований было пок зано, что поликлональные сыворотки и МАТ 4Т6 выявляли специфичные бел] в непрогретых сухих препаратах на основе ВБМ 2 с высоким ЦПД и ВБМ 3. также в прогретых сухих лизатах клеток, инфицированных только ВБМ 3.

Было выяснено также, что ВБМ и ВПГ содержат общую антигенную д терминанту в белке Исследование гликопротеина Б позволяет четко иде тифицировать ВБМ 2 и ВБМ 3, при фиксации в термоденатурированной фор! в сухом виде (в этом случае дО в препарате не выявляется). То есть, для ВГ £0 является термоустойчивым белком, а для ВГК - термолабильным. На г верхности клеток, инфицированных ВГИ, gD выявляется только метода двойного «сэндвич» в ИФА. Нами было показано, что ВБМ не содержит ант генной детерминанты, опознаваемой МАТ 2С к белку gB ВПГ человека. V следованиями в РДП и в РН сывороток морских свинок, показана возможное получения высокоактивных антител на неинфекционный термоденатури{ ванный комплекс антигенов с вируснейтрализующими свойствами.

2.2.5. Применение компьютерной программы для определения активности вируса в вакцине против БМ иммуноферментным методе

Для избежания «человеческого фактора» при определении активности : руса в вакцине против БМ в ИФА была поставлена задача: разработать кс

отерную программу по обработке данных титрования антигенов в монова-ггаом препарате В ПС. Для этого нами было оттитровано 26 серий этого гпарата. Анализ результатов титрования позволил сформулировать основе требования к методике определения активности вакцины в ИФА. Статическая обработка цифровых данных по итогам титрования большого коли-:тва серий моновалентного препарата, дала возможность объединить их в гыре группы по профилю титрования ВГК с AT к ВБМ 1 + ВБМ 2 и с AT к 1М 3: 1) препараты, содержащие зараженные ВГК клетки с низким цитопа-теским действием в КККЭ; 2) препараты, содержащие преимущественно :тки, зараженные ВГК с высокой цитопатической активностью; 3) препара-, в состав которых входит ВГК, начавший изменять свои характеристики в оцессе культивирования; 4) контрольные препараты неинфицированных -Ток эмбрионов кур и перепелов.

Используя подготовленную базу данных по применению метода ИФА, :ла составлена математическая модель проведения анализа результатов опы-з. В итоге разработаны «Методические указания по применению компью-зной программы для определения активности вируса в вакцине против БМ муноферментным методом».

2.2.6. Идентификация ВБМ с помощью ПЦР

В настоящее время одним из перспективных направлений в изучении эуктур генома, изменчивости вируса и дифференциации существующих кцинных и вирулентных штаммов и изолятов ВБМ является применение та-х высокочувствительных и специфичных методов как амплификация после-вательностей нуклеиновых кислот, а также рестрикционный анализ и карти-вание ДНК (Silva R.F.,1991; Ross L.J.N.,1993; Lindermaier W., et.al.,1994; ividson I., Malkinson M. et al.,1995; Rodriguez J.M.,1997). Результаты прове-ния ДНК-ДНК гибридизации между геномами ВБМ различных серотипов казал, что их уровень гомологии иногда составляет более 99%.

Установлено, что уровень гомологии нуклеотидных последовательност гена, кодирующего gA 1 и 3 серотипов, составляет 73% (Потехин C.B., с сот 1998). Показано также возможное применение ПЦР для выявления ВБМ в р; личных органах и тканях инфицированной птицы (Bumstead N., et al., 1997). связи с тем, что чувствительность этого метода составляет 10-100 вируеш частиц в пробе, а результаты анализа могут быть получены через 5-6 часс данный метод применим для выявления ВБМ на ранних стадиях инфекции также, находящегося в латентной форме. Различия в структуре генома пат генных штаммов ВБМ локализованы, главным образом, в области инвертир ванных повторов. Показано, что число повторов нуклеотидных последог тельностей размером 132 п.н. в этой области коррелирует с патогенностью в руса (Silva R. F., 1992).

Основной целью данного этапа работы являлось отработка метода пост новки ПЦР для выявления ДНК ВБМ 1 и 3 серотипов. Для выбора специфт ских праймеров были использованы нуклеотидные последовательности, ко плементарные гену гликопротеина А ВБМ 1 серотипа (штамм HPRS-16) и серотипа (штамм FC-126) (Zhu G.S.et al.,1992). Для этого были использова! две пары праймеров (см табл.3). Прямые и обратные праймеры ER3F и ER4 комплементарные участкам, расположенным ближе к 3'- концевой области i на gA ВБМ 1. Праймеры ER5F и ER6R, комплементарные, последовательн стям 5'- концевой области гена gA ВБМ 3 (см. табл.3).

Нами была подобрана оптимальная температура отжига праймеров, равн 55°С, при которой получены специфичные ПЦР-продукты (200 п.н. - д штамма HPRS-16 и 388 п.н. - для штамма FC-126). При данном режиме па праймеров: ER3+ER4 гибридизовалась только с ДНК ВБМ 1 серотипа, а пар ER5+ER6 - только с ДНК 3 серотипа. Порог чувствительности ПЦР состав для образцов ДНК ВГИ (штамм FC-126) 100 ФОЕ/см3

Для дифференциации вирулентных штаммов ВБМ 1 с помощью ПЦР v пользовали пару праймеров: ER1F и ER2R, комплементатную последовател

:тям, расположенным в области концевых и внутренних инвертированных второв и фланкирующих повторов длиной 132 п.н. (7.Ьи й.Б.,1992).

Таблица 3.

Нуклеотидная последовательность праймеров и ожидаемый размер

продуктов амплификации

мймеры и позиция Серотип Последовательность нук- ПЦР продукт,

нуклеотидов леотидов H.H.

ER1F (12-36) 1 5'-tgt act tgg agt teg gta tta cttc-3' 250, 380,

ER2R (520-496) 1 5'-atg aga atc cct atg aga 508

aag ege t-3'

ER3F (696-717) 1 5'-cat gca agt cat tat geg tga c-3' 200

ER4R (895-974) 1 5'-tgt ttc cat tet gtc tcc aag a-3'

ER5F (231-248) 3 5'-cgc gta ctg ege ctg acg-3'

ER6R (618-602) 3 5'-caa ett ege tet tga cg-3' 388

Присутствие в профилях электрофореграмм фрагментов (250, 388 и 508 г.), характерных для штамма HPRS-16, указывало на принадлежность иссле-;мой ДНК вируса к онкогенным изолятам 1 серотипа. Оптимальная темпе-гура отжига данной пары праймеров составила 50°С. Полученные данные адетельствуют о том, что электрофоретический анализ ПЦР-продуктов по-гдовательностей генома с тремя использованными нами праймерами (см. )л. 3) позволяет идентифицировать ДНК ВБМ 1 и 3 серотипов, а также пато-шый штамм HPRS-16 от вакцинных штаммов 2 и 3 серотипов

ПЦР была также использована для выявления ДНК ВГИ (штамм FC-126) в гезенке и фабрициевой сумке инфицированных в суточном возрасте цыплят 7-, 14-, и 21-й дни. В результате проведенных исследований разработана гма анализа проб для выявления ДНК ВБМ при помощи ПЦР:

1). Выделение суммарной ДНК из инфицированных КК или селезенки i плят фенольно-детергешным методом;

2). Постановка ПЦР: первый цикл - денатурация : 94°С - 2 мин; отяа 55°С - 2 мин; элонгация : 72°С - 2 мин; следующие 30 циклов: 94°С -1м 55°С - 1 мин; 72СС - 1 мин; последний цикл - 72°С в течение 5 мин.

3). Электрофорез - 2% агароза; IX TBE, 100 Вт, 30 мин.

4). Окраска геля бромистым этидием и обнаружение фрагментов дли 200 п.н. (1 серотип), 388 п.н. (3 серотип) и 250,380,508 п.н. (онкоген! штамм HPRS-16,1 серотипа).

Показано, что с помощью ПЦР ДНК ВГИ выявлена в пробах селезенк фабрициевой сумки, взятых на 7-й, 14-й и 21-й дни после иммунизации ИФА и в РИФ оказались положительными материалы органов цыплят 7-г 14-го дня.

3. ВЫВОДЫ

3.1. Разработан новый способ выделения иммунохимически чистого г парата IgG желтка яиц кур. Показано, что гипериммунные антивидовые ск ротки, полученные иммунизацией чистым препаратом IgG необходимо к тролироватъ не только в РДП, но и в ИФА. Была использована баранья as IgG кур сыворотка для синтеза высокоактивного и специфичного иммунс роксицазного конъюгата с рабочим титром 1:2000.

3.2. Проведенное исследование фракционного и морфологического coi ва вакцинного препарата ВГИ гель-фильтрацией на колонке с сефадексом 200, в системе водорастворимых полимеров и электронной микроскопией, зволило получить ангигенно- и инфекционно активную фракцию вируса с сокой (99,3%) степенью очистки от балластных белков.

3.3. Используя приемы термоденатурирования препаратов ВБМ раз1 серотипов, получены следующие антигенные комплексы: а) перекрестно j гирующие с AT к вирусу 1 серотипа и с AT к ВГИ; б) реагирующие толы AT к ВГИ; в) реагирующие только с AT к вирусу 1 серотипа. Получены не

:кционные, термоденатурированные, сухие антигены, стимулирующие выра->псу антител, обладающих прещшитирующей и вируснейтрализующей ак-шностью.

3.4. Применяя модификации ИФА с использованием МАТ 4Г6 и поликло-льных антител, было выяснено, что ВБМ и ВПГ содержат общую антиген-то детерминанту в белке цБ, исследование которого позволяет четко иден-фицироватъ ВБМ 2 и ВБМ 3. Показано, что ВБМ не содержит антигенной терминангы, опознаваемой МАТ 2С к белку gB ВПГ человека.

3.5. Разработана компьютерная программа для определения активности [руса в вакцине против БМ иммунофермешным методом.

3.6. Отработаны оптимальные условия постановки ПЦР с использованием 1аймеров, комплиментарных вариабельным участкам последовательности ге-

гликопротеина А ВБМ 1 и 3 серотипов, позволяющие выявлять ДНК вак-гнных и вирулентных штаммов в пробах патматериала и зараженных культур еток, содержащих 100 ФОЕ/см3 вируса.

3.7. Амплификация фрагментов генома ВБМ с использованием праймеров, [анкирующих инвертированные повторы длиной 132 п.н., позволяет диффе-нцировать онкогенный штамм НРКБ-16 от вирусов 2 и 3 серотипов.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработанные «Методические указания по выявлению ДНК вируса лезни Марека с помощью полимеразной цепной реакции», могут быть ис-льзованы для выявления вирусной ДНК в патологическом материале и ви-ссодержащей культуральпой жидкости, а также для идентификации возбу-теля.

Разработанные «Методические указания по применению компыотер-й программы для определения активности вируса в вакцине против БМ им-ноферментным методом» позволяют по трем разведениям достоверно опре-гтятъ активность вируса в производствеггаых сериях вакцин против БМ.

Разработанные методические указания и методы исследований р смотрены и одобрены на заседаниях методического совета и утверждены , ректором ВНИТИБП.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мониторинг материнских антител у цыплят, полученных от к; несушек из птицехозяйств с различной эпизоотической обстановкой по бол ни Марека. / Лукина В.А., Ярыгина Е.И., Быкова H.H., Скороходова Л.А., Б< ровская И.В.// Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф., посвященной 70-летию дня рождения проф. Першина В.А.; Щелково-1998, с. 18-19.

2. Особенности вакцинных вирусов болезни Марека в процессе их реп дукции in vitro и in vivo. / Лукина В.А., Ярыгина Е.И., Быкова H.H., Сам; ленко А.Я., Бобровская И.В., Праксин Ф.Г., Крюкова В.В.// Тез. докл. ко] «Проблемы инфекц. и инваз. болезней в животноводстве на соврем, этапе»; - 1999, с. 24-25.

3. Экспресс-метод определения специфических антител и прогнозиро ния эффективности вакцины против БМ. / Ярыгина Е.И., Лукины В.А., Бык< H.H., Скороходова Л.А., Бобровская И.В., Тетеричев В.И. // Тез. докл. конф «Проблемы инфекц. и инваз. болезней в животноводстве на соврем, этап М., - 1999, с. 33-34.

4. Бобровская И.В. Определение иммунологического статуса вакцини ванной против болезни Марека птицы по исследованию полевых сывороток Тез. докл. Всероссийской конференции молодых'ученых и аспирантов по п цеводству; Сергиев Посад - 1999, с. 39-40.

5. Бобровская И.В., Румянцева И.В., Ярыгина Е.И. / Изучение преципи рующей и специфической активности антисывороток, полученных на I желтка кур // Тез. докл. Всерос. научно-практич. конфер., посвященной летию ВНИТИБП: «Научные основы производства вет. биол. препарато Щелково - 2000, с. 18-20

6. Бобровская И.В., Румянцева И.В., Гетман Е.В./ Определение качества :цинального процесса у цыплят, привитых моновалентной вакциной против 1езни Марека. // Тез. докл. Всерос. научно-практич. конфер., посвященной летию, ВНИТИБП «Научные основы производства вет. биол. препаратов», :лково - 2000, с. 15-16.

7. Выявление различными иммунологическими методами структурных 1ков вируса болезни Марека. / Лукина В.А., Ярыгина Е.И., Соловьев Б.В., эровская И.В., Скороходова Л.А., Румянцева И.В. // Тез. докл. Всерос. науч-практич. конфер., посвященной 30-летию ВНИТИБП: «Научные основы шзводства вет. биол. препаратов», Щелково - 2000, с. 8-10.

8. Антигенные свойства термоденатурированных вариантов вируса болез-Марека - влияние термоденатурации на антигенную активность препаратов основе вируса герпеса индеек. / Лукина В.А., Ярыгина Е.И., Бобровская

Соловьев Б.В., Скороходова Л.А., Румянцева И.В. // Тез. докл. Вссрос. чно-практич. конф., посвященной 30-летию ВНИТИБП «Научные основы шзводства вет. биол. препаратов», Щелково - 2000, с 10-12.

9. Антигенные свойства термоденатурированных вариантов вируса болез-Марека - изучение антигенных свойств препаратов на основе вируса герпе-сур. / Лукина В.А., Ярыгина Е.И., Бобровская И.В., Соловьев Б.В., Скорохо-а Л.А., Румянцева И.В. // Тез., докл. Всерос. научно-практич. конф., посвя-iHOft 30-летию ВНИТИБП «Научные основы производства вет. биол. пре-атов», Щелково - 2000, с 12-14.

10. Бобровская И.В., Самуйленко С.А./ Перспективы использования полисной цепной реакции для типирования вируса болезни Марека. // Всерос. чная конфер. по вет. вирусологии, микробиологии и эпизоотологии ИИВиМ, посвященная 75-летию академика И.А. Бакулова, Покров - 2000, с -227.

11. Динамика трансовариальных антител у цыплят, полученных от кур-ушек из птицехозяйств с различной эпизоотической обстановкой по болез-

ни Марека. / Ярыгина Е.И., Лукина В.А., Скороходова Л.А., Бобровская И.; Румянцева И.В. // Всерос. научная конфер. по вет. вирусологии, микробио.1 гии и эпизоотологии ВНИИВиМ, посвященной 75-летию академика И.А. I кулова, Покров-2000, с. 119-121.

12. Антигенная активность термоденатурированных препаратов вир} болезни Марека. / Ярыгина Е.И., Лукина В.А., Соловьев Б.В., Скороходе Л.А., Бобровская И.В., Румянцева И.В. // Тез., докл., международной кон «Биотехнология - 2000», Пущино - 2000, с. 70-71.