Биологические свойства природных изолятов вируса болезни Марека, циркулирующих на территории Российской Федерации

Джулардов, Геннадий Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биологические свойства природных изолятов вируса болезни Марека, циркулирующих на территории Российской Федерации
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства природных изолятов вируса болезни Марека, циркулирующих на территории Российской Федерации"

На правах рукописи

ДЖУЛАРДОВ Геннадий Викторович

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПРИРОДНЫХ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА БОЛЕЗНИ МАРЕКА, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

03.00.06. - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Москва - 2009 г.

003474281

Работа выполнена в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Алипер Тарас Иванович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Соловьев Борис Васильевич Доктор медицинских наук, профессор Баринский Игорь Феликсович

Ведущая организация:

ФГУ «Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Защиты Животных», г. Владимир

Защита состоится «Л » 2009 г. в часов

на заседании диссертационного Совета Д.001.020.01 при ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (адрес: 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан < М» 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Болезнь Марека (БМ) является наиболее распространенньш лимфопролиферативным заболеванием кур, которое характеризуется развитием злокачественных лимфом в висцеральных органах (острая форма) и поражением нервов (классическая форма).

Болезнь широко распространена в странах с развитым птицеводством и причиняет большой экономический ущерб. Во всем мире потери от БМ в птицеводческой промышленности ежегодно оцениваются в 1—2 млрд. долларов [С. Morrow и F. Fehler, 2004].

Заболеванию подвержены куры всех возрастов. Однако наиболее чувствительными являются суточные цыплята мясных и яичных пород. Смертность поголовья при острой форме болезни может достигать 60-80% [В.Н. Сюрин 1998; F. Davidson, 2004].

В нашей стране с 1974 г. БМ удавалось контролировать с использованием вакцин на основе 1-го, 2-го и 3-го серотипов ВБМ. Однако, среди привитого поголовья периодически отмечали возникновение вспышек данного заболевания. Причиной явилось появление в природе новых более вирулентных форм вируса БМ, в связи с изменчивостью возбудителя и, как следствие, недостаточной протективной способности вакцин.

За последние 30 лет отмечено повышение патогенности вируса БМ: от умерепновирулентных (т ВБМ) до сверхвирулентных (vv+ ВБМ) штаммов. При этом антигепного различия между штаммами не обнаруживали, все они относились к первому серотипу [R.L. Witter, 1997].

Лабораторией Онкологических Болезней Птиц (ADOL, США) был разработан стандартный метод оценки степени вирулентности полевых изолятов вируса БМ 1-го серотипа (ВБМ-1), который обозначили как «Best Fit» [R.L. Witter, 2005]. Метод основывается на степени лимфопролиферативных поражений, индуцированных полевыми изолятами ВБМ-1 у вакцинированной птицы, в сравнении с референтными штаммами. Однако, им трудно руководствоваться в других лабораториях, поскольку для проведения исследования необходима чувствительная линия СПФ-кур «15x7 ab+», доступная в основном только в США. Для устранения этого препятствия в ADOL было предложено использовать местные породы СПФ-кур, чувствительные к ВБМ.

В России подобных исследований не проводили. Из-за отсутствия диагностических центров, вопрос о циркуляции в птицеводческих хозяйствах штаммов ВБМ-1 с различной степенью вирулентности не изучали.

Все это обусловило необходимость разработки и использования метода патотипирования ВБМ-1, не только для оценки эпизоотической ситуации, но и изучения распространения и эволюционной изменчивости вируса. Используя модификацию метода «Best Fit», мы пытались выявить новые высокопатогенные штаммы ВБМ-1 на территории РФ с целью усовершенствования стратегии вакцинации и применения соответствующих мер контроля.

Возникновение вспышек БМ среди вакцинированного поголовья кур может быть связано с не всегда удовлетворительным проведением мероприятий по специфической профилактике. В связи с этим необходим систематический контроль гуморального ответа птицы на введение вакцинного штамма ВБМ.

В настоящее время для серологической диагностики БМ применяют РДП, реже РН и ИФ. Об использовании ИФА, обладающего гораздо более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с вышеуказанными методами, в литературных данных имеются весьма ограниченные сведения. Это может быть связано с рядом причин, таких как: перекрестная реактивность, высокий неспецифический фон реакции [Y-Q Cheng, 1984], а также неудовлетворительная чувствительность тест-системы [V. Zelnik, 2004].

Очевидно, что вышеуказанные проблемы были связаны с источником получения антигена ВБМ, полученного на клетках куриного происхождения (ФЭК, ПЦ). Для устранения этого недостатка необходимо было использовать культуру клеток другой природы, чувствительную к ВБМ.

Такой культурой оказалась рекомбинантная линия клеток SOgE, полученная из фибросаркомы перепела [С. Moscovici, 1977; D. Schumacher, 2002]. Наличие подобной клеточной системы позволяло получить вирусный антиген БМ, пригодный для разработки тест-системы ИФА с целью обнаружения антител к ВБМ. Данная тест-система может служить ценным инструментом при проведении ретроспективной диагностики и оценки эффективности специфической профилактики против БМ.

Цель работы и задачи исследования. Изучение биологических свойств российских природных изолятов вируса болезни Марека первого серотипа (ВБМ-1) и разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к ВБМ-1 для оценки эффективности вакцин.

Для достижения указанной цели поставлены следующие задачи:

1) Адаптация и оценка модифицированного «Best Fit» метода с использованием СПФ-цыплят породы белый леггорн линии Щелково;

2) Выделение и изучение изолятов вируса болезни Марека, циркулирующих на территории РФ, состоящее из следующих этапов:

■ очистка изолятов ВБМ 1-го серотипа от контаминации другими вирусами;

■ проведение первичной оценки степени вирулентности исследуемых изолятов на невакцинированных цыплятах;

• определение патотипа исследуемых изолятов на вакцинированных цыплятах;

• сравнение вирулентности современных российских полевых изолятов ВБМ-1 с европейскими и американскими изолятами;

■ получение матричных расплодок отечественных изолятов ВБМ-1.

3) Разработка метода ИФА для выявления Ат к ВБМ-1:

■ получение и иммунохимимическая характеристика вирусного антигена пригодного для ИФА с последующей иммобилизацией его на микропанели;

* определение оптимальных концентраций компонентов и условий проведения реакции;

■ выявление величины пороговых показателей специфической и неспецифической реакции;

■ сравнительный анализ ИФА и РДП, определение корреляции и относительной чувствительности этих тестов.

Научная новизна. Представлены и впервые систематизированы сведения о патогенности изолятов ВБМ-1, циркулирующих на территории РФ, их распространении, особенности клинических проявлений БМ в полевых условиях.

Показано, что использование модификации метода латопширования является необходимым для стандартизации оценки вирулентности ВБМ первого серотипа и изучения состояния проблемы в разных странах.

Сравнительное изучение патотипов ВБМ-1, циркулирующих на территории РФ и американских референтных штаммов, подтвердило предположение об изменчивости штаммов ВБМ-1 в сторону увеличения вирулентности.

Полученные данные служат обоснованием для усовершенствования контроля заболевания в условиях повышения вирулентности возбудителя и разработки новых подходов в идентификации и дифференциации ВБМ.

Разработана тест-система на основе непрямого варианта ИФА для определения поствакцинальных антител к вирусу БМ первого серотипа с использованием антигена, из рекомбинантной перепелиной перевиваемой клеточной линии ЗО^Е. Чувствительность разработанной тест-системы позволяет выявлять Ат у птицы на ранних сроках после вакцинации.

Изучена диагностическая ценность ИФА в сравнении с РДП и проведена оценка относительной чувствительности данных тестов.

Практическая значимость работы. Получена коллекция российских изолятов ВБМ-1, которая может служить основой банка референтных штаммов ВБМ первого серотипа, что является важным этапом для дальнейшего изучения болезни, дифференциации изолятов ВБМ-1 и разработки эффективных средств специфической профилактики, способствующих повышению сохранности птицепоголовья в России и других странах.

Отработаны и усовершенствованы методы выделения и патотипирования отечественных природных изолятов ВБМ-1, что позволяет проводить мониторинг эпизоотической ситуации и является предпосылкой создания первого в России референтного центра по БМ.

Изолированные и охарактеризованные вирулентные штаммы ВБМ-1, представляющие три патотипа, а именно, 14 Н 193/6 (уу) и 22В/9 (у)

депонированы в государственную коллекцию вирусов Российской Федерации (НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН).

Основные положения, выносимые на защиту.

Чувствительность СПФ-птицы линии Щелково породы Белый леггорн к вирусу болезни Марека является достаточной для проведения экспериментов по оценке вирулентности полевых изолятов ВБМ-1.

Модифицированный метод «Best Fit» позволяет достоверно определять степень вирулентности российских полевых изолятов вируса БМ 1-го серотипа.

Подтверждена изменчивость полевого ВБМ-1 в сторону увеличения вирулентности. Степень вирулентности 19-ти отечественных изолятов ВБМ-1 была схожа с американскими аналогами и являлась достаточной, чтобы вызывать БМ среди вакцинированного поголовья.

Разработанная тест-система непрямого ИФА на основе специфического Аг ВБМ-1, полученного с использованием рекомбинантной перепелиной линии клеток SOgE, является высокочувствительной и высокоспецифичной для оценки уровня поствакцинальных Ат.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета НПО НАРВАК (2005-2009 гг.), на 4-м международном симпозиуме молекулярных исследований вируса болезни Марека (Делавар, США, 2006), на' 3-м международном ветеринарном конгрессе по птицеводству (Москва, 2007), на конференции молодых ученых, посвященной 120-й годовщине со дня рождения Н.И. Вавилова (Киев, 2007), а также на заседаниях ученого совета НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского (2006-2007 гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 25 рисунками. Список литературы включает 178 источников, из которых 142 зарубежных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Вирусы. Референтные штаммы ВБМ-1: JM/102W, Md5, 648А; вакцинные штаммы 301В/1 (ВБМ-2), FC-126 (ГВИ); ВРЭ - REV-T(F) (ADOL, США). Вакцинный штамм ВБМ-1 (Rispens, Marek Vac forte™, LAH, Germany).

Изоляты ВБМ. Изоляты ВБМ-1 для определения патогенности были получены с птицефабрик европейской части РФ.

Культуры клеток. Для выделения, размножения и титрования ВБМ использовали культуру куриных фибробластов (ФЭК).

Рекомбинантную культуру клеток SOgE использовали для получения специфического антигена ВБМ-1 для его применения в ИФА.

Испытуемые сыворотки для непрямого ИФА. Сыворотки крови кур для приготовления положительного и отрицательного контролей и для исследования в ИФА были получены из архива R&D и вивария компании LAH (Germany).

Лабораторные животные. В работе были использована СПФ-цыплята породы Белый леггорн линии Щелково.

Специфические компоненты. Моноклональные антитела (МкА): Н19 -ВБМ-1, 2BN90 - ВБМ-1 + Rispens, Y5 - ВБМ-2, L78 - ГВИ, 11А25 - ВРЭ (ADOL, США).

Антивидовой пероксидазный конъюгат Anti-Chicken IgY (IgG) (Sigma, Израиль).

Диагностические наборы. Набор для выявления ВЛП методом ИФА ООО «НПП АВИВАК». Лабораторная тест-система для выявления ДНК ВИАЦ методом ПЦР в реальном времени (НПО «НАРВАК»). Набор для измерения концентрации белка на спектрофотометре ВСА Protein Assay Kit™ (PIERCE, США).

Выделение, культивирование и титрование ВБМ. Полевые изоляты ВБМ-1 выделяли, культивировали и титровали на культуре ФЭК. Для приготовления первичной культуры клеток использовали СПФ-эмбрионы линии Щелково, применяя стандартную процедуру трипсинизации.

Cepomunupoeanue изолятов ВБМ. Серотипирование осуществляли методом иммунофлюоресценции с применением МкА, специфичных для всех трех серотипов вируса (L. Lee и др, 1983).

Выявление Аг ВЛП р27 в сыворотке крови кур методом ИФА. Отсутствие контаминации ВЛП подтверждали ИФА (коммерческий набор «НПП АВИВАК») для выявления группоспецифического антигена р27 (Fadly, A.M. и Witter, R.L., 1998).

Выявление вируса ретикулоэндотелиоза (ВРЭ) в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ). Присутствие ВРЭ выявляли методом непрямой иммунофлюоресценции со специфическими для ВРЭ МкА (Cui и др., 1986).

РНИФ проводили по общепринятой методике.

Выявление ВИАЦ методом ПЦР в реальном времени. Контаминацию вирусом инфекционной анемии цыплят (ВИАЦ) определяли в количественной ПЦР в реальном времени с соответствующими праймерами (Markowski-Grimsrud, 2002).

Замораживание клеток. Замораживание клеток проводили по общепринятым методикам.

Выявление Am к ВБМ в сыворотке крови кур (или Аг ВБМ) реакцией диффузионной преципитации. Постановку РДП выполняли согласно общепринятой методике.

Получение Аг ВБМ-1. Для получения специфического Аг ВБМ-1 брали культуру SOgE, инфицированную вакцинным штаммом Rispens с инфекционной активностью не менее 106,0 ФОЕ/см3.

Инфицированные клетки подвергали воздействию ультразвука (60 сек, 60 Ватт). Лизат использовали в качестве Аг при иммобилизации на микропанели.

Концентрацию белка в полученном вирусном препарате определяли спектрофотометрическим методом с использованием коммерческого набора (ВСА Protein Assay Kit™, PIERCE®). Структурный состав антигена определяли методом электрофореза в ПААГ-ДСН, его антигенную активность и специфичность подтверждали в иммуноблотгинге.

Иммуноферментный анализ. В работе испытывали непрямой вариант ИФА, оптимальные условия постановки которого определяли экспериментально.

Статистическая обработка результатов. При анализе и статистической обработке результатов вычисление средней арифметической, средней геометрической, средневзвешенного значения, стандартного отклонения, коэффициента корреляции результатов проводили с использованием программы Excel для Windows.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Определение вирулентности полевых изолятов ВБМ-1

За период выполнения работы было получено и обработано более 200 проб крови птицы из восьми регионов РФ. Более чем из 80 образцов крови из 30 хозяйств в культуре ФЭК были выделены изоляты ВБМ. В ходе исследований было изолировано более 35 изолятов ВБМ-1. Проведены опыты по деконтаминации смешанных образцов вирусов с использованием контактной передачи ВБМ-1 от птицы к птице. В результате нам удалось очистить от ВЛП и патотипировать три изолята первого серотипа (9А, 181 и 26Е). От ВБМ-2 данной методикой избавиться не удалось. Поэтому изоляты ВБМ-1, контаминированные вирусом БМ 2-го серотипа, в дальнейшую работу не включали.

2.2.1.1. Чувствительность СПФ-цыплят линии Щелково к ВБМ-1

Опыт проводили по стандартной схеме метода «Best Fit» в ADOL (США), используя СПФ-кур линии Щелково (Белый леггорн).

Было сформировано пять групп птицы, от 9 до 16 голов в каждой. Контрольную группу птицы не вакцинировали и не инфицировали. Одну невакцинированную группу заражали штаммом JM/102W (v). Три оставшиеся группы были привиты вакциной из штамма FC-126 или бивалентной вакциной (FC-126 + 301В/1) в первый день после выведения, а через пять дней после вакцинации цыплят инфицировали вирулентными штаммами Md5 (w) и 648А (w+). Птицу содержали в изоляторах Horsfall-Bauer в течение 56 дней после заражения.

Исключение составили бивалентная вакцина, содержащая штамм вируса БМ второго серотипа 301 В/1, аналогичный штамму 8В-1 (ВБМ-2).

Результаты определения чувствительности СПФ-кур линии Щелково к ВБМ-1, в сравнении с чувствительностью американской линии птицы «15x7 аЬ+» (АБОЬ), рассматриваемой в качестве эталонной, отражены в таблице №1.

В зависимости от вирулентности штамма, использованного для заражения, патологические изменения, характерные для БМ, были обнаружены у 12,5—62,5% вакцинированных птиц. Они проявлялись в виде поражений периферических нервов и нервных сплетений, а также лимфоидных опухолей в висцеральных органах, частота встречаемости которых колебалась в пределах 25-60%. Количество павшей птицы было незначительным.

Как видно из таблицы 1, чувствительность СПФ-цыплят линии Щелково при заражении референтными штаммами ВБМ-1 оказалась несколько ниже, чем у кур линии «15x7 аЬ+» (США) по всем признакам, за исключением частоты обнаружения опухолей в висцеральных органах. Однако, для использования в экспериментах по патотипированию, базирующихся на анализе клинических признаков и патологоанатомических изменений, характерных для БМ у вакцинированной и невакцинированной птицы это не имело существенного значения. Для патотипирования полевых изолятов ВБМ-1 чувствительность цыплят линии Щелково была достаточной.

Таблица 1. Сравнительное определение чувствительности вакцинированных и невакцинированных СПФ-цыплят линии «15х7аЬ+» (АБОЬ, США) и цыплят линии Щелково к заражению вирулентными референтными штаммами ВБМ-1.

Референт-иый штамм Кол-во , птицы в изоляторе Поражения от БМ Смертность от (55-78 д.п.з.) Наличие опухолей

Опыт Вакцинный штамм Кол—по птицы с выявленными опухолями % Г.М Кол-во павшей птицы Среднее число дней до гибели" Кол-во птицы с поражениями нервов %ь Кол-во птицы с поражениями висцеральных органов ; %ь

СПФ- нет нет 10 0 0.0 0 0.0 0 0.0 0 0.0

куры нет .ГМ/102\Г 14 14 100.0 4 25.5 ■,14'. - 100.0 . 6 ■■':■■■. 42.9

«15х7аЬ+» РС-126 Мё5 14 14 100.0 1 69.0 14 100.0 6 42.9

РС-126 648А 13 : 13 ■■■■:. 100.0 7 . 51.4 13 100.0 10 76.9

РС-126 +8В-1 648А 15 10 66.6 1 69.0 10 100.0 1 10.0

СПФ- ■ ' нет : : нет 16 0 . . 0.0 0 0.0 ■ ■•/о - 0.0 -"О-".'■■■;■'■■■•. 0.0

куры нет 11 6 54.5 0 0.0 4 66.7 2 33.3

Щелково РС-126 16 ■ 2 ■ : 12.5 : 0 0.0 100.0 .; - 1 50.0

РС-126 648А 16 10 62.5 2 50.0 9 90.0 6 60.0

РС-126 +301В/1 648А 9 ". -V Л; 4 '■■ 44.4 : 1 :':А 49.0 75.0 25.0

* Количество дней после заражения ь Вычисляется от количества птицы с поражениями от БМ д.п.з. - дней после заражения

2.2.1.2. Выявление контаминации изолятов ВБМ-1 чужеродными вирусами

Одной из проблем выделения изолятов ВБМ-1 являлась контаминация экзогенными вирусами лейкоза птиц (ВЛП). Была предпринята попытка очистить изоляты ВБМ-1 до начала патотипирования. Данную процедуру проводили с использованием контактной передачи ВБМ-1 от птицы к птице.

В результате от ВЛП удалось очистить пять изолятов (9А, 181, 26Е, 26С и 50). Такие изоляты сохраняли для дальнейшего исследования.

Все пробы полевых изолятов ВБМ-1 проверяли на присутствие вакцинных ВБМ 1-го, 2-го и 3-го серотипов (К^репБ, 8В-1, РС-126 соответственно) методом флюоресцирующих МкА. При обнаружении вакцинных ВБМ, исследуемые пробы ВБМ-1 из дальнейшей работы исключали. Однако, в эксперименте по очистке от ВЛП, мы также пытались избавиться от контаминации ВБМ-2 методом контактной передачи. Данный эксперимент не увенчался успехом.

Контаминации изолятов ВБМ-1 вирусом ретикулоэндотелиоза за весь период исследований обнаружено не было, вирус инфекционной анемии цыплят был выявлен в лейкоцитарной фракции в 3 случаях, однако в процессе пассирования в культуре ФЭК репликации вируса не происходило, что было подтверждено исследованием изолятов методом ПЦР на уровне 6-11 пассажей.

Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

Таблица 2. Результаты по очистке контаминированных изолятов вируса

Изолят Контаминация Заключение

ВБМ-2 ВЛП ВИАЦ ВРЭ

181 - + - - Очищен

9А - + - - Очищен

5D + + - - Не очищен от ВБМ-2

26С - + - - Очищен

26Е - + - - Очищен

2.2.1.3. Определение вирулеитности полевых изолятов ВБМ-1 модифицированным методом «Best Fit»

Необходимой составной частью метода патотипирования «Best Fit» является оценка патологоанатомических изменений, характерных для БМ, выявляемых при вскрытии птицы, инфицированной полевыми изолятами, в сравнении с изменениями, которые вызывают вирулентные референтные штаммы ВБМ-1. Поражения, вызываемые этими штаммами, должны быть аналогичными в повторяющихся опытах, но при этом четко различаться и коррелировать с патотипом используемого штамма.

Для проведения патотипирования методом «Best Fit» было использовано три группы птиц: невакцинированные, вакцинированные ГВИ (штамм FC-126) и вакцинированные бивалентной вакциной (ВБМ-2+ГВИ (штамм

301В/1+РС-126)). Для удобства эксперимент проводили в два этапа. На первом этапе устанавливали первичную оценку вирулентности полевых изолятов ВБМ-1 на невакцинированной птице. На втором (патотипирование) - полевыми изолятами инфицировали цыплят, привитых двумя типами вакцин. Для сравнительной оценки в качестве контролей использовали вирулентные референтные штаммы, представляющие определенный патотип: .ГМ/102\¥ (V), Мс15 (уу) и 648А (уу+) (АООЬ).

Первичная оценка вирулентности. Цыплят инфицировали исследуемыми изолятами ВБМ-1 в первый день жизни в дозе 500 ФОБ. Продолжительность опытов составила 8 недель. Всех павших цыплят вскрывали, учитывая патологоанатомические изменения, характерные для БМ. По окончании эксперимента всех выживших птиц подвергали эвтаназии и проводили вскрытие. Наиболее яркие клинические и патологоанатомические проявления выражались в виде кратковременных переходящих параличей, синдрома ранней смертности (СРС) в период между 8-м и 18-м днями после заражения при отсутствии признаков БМ, а также поражениями нервов и висцеральных органов. Все полученные данные по экспериментальным группам сравнивали с данными контрольных референтных групп.

Результаты опытов по первичной оценке вирулентности выражали как относительное значение следующих показателей: СРС (%), общая частота выявления БМ (%) (по сумме признаков, обнаруженных как у погибшей, так и у убитой птицы), выведенные из числа зараженных цыплят за вычетом неспецифически погибших.

Таким образом, как видно из таблицы 3 все 25 исследуемых изолятов вызывали БМ у невакцинированной птицы. Общая частота выявления БМ колебалась в пределах 70-100%. Это означало, что каждый изолят обладал определенной вирулентностью, степень которой предстояло определить в эксперименте по патотипированию.

Таблица 3. Первичная оценка вирулентности полевых изолятов вируса БМ первого серотипа на СПФ-цыплятах линии Щелково. _

Серия Вирус Кол-во птицы в изоляторе СРС' % Выявление БМ у павшей птицы (%) Общая частота выявления БМ (%)

1 ЛИ/102\У 10 0 30 90

М<15 10 0 90 100

10А 10 40 60 100

10В 10 70 30 100

23А 10 10 90 100

23В 10 20 80 100

41 10 60 40 100

41 10 40 50 100

22А 10 0 20 80

22В 10 0 30 100

Серия Вирус Кол-по птицы в изоляторе СРСа ; , % Выявление БМ у павшей птицы (%) Общая частота выявления БМ (%)

л;-2, ЛМ/102\У 10 0 33 67

■ Мс15 ю 33 67 100

6С 10 0 0 80

. 4В 10 10 ,:,40., 100

4Б 10 10 30 100

8П 10 0 ■,",г" .-30' :::.-/; .'. г'■""..;.... 80 .,::■•.'

22А/1 10 0 30 80

22А12 : ? '10';;:' 0 .. 40 '-' 80 :

22В/9 10 0 40 70

11 С/2 10 - 12,:":"- 88

3 ЛМ/102\У 10 0 и

М(15 10 0 70 100

9А ■ ^ 0 50

141 10 0 10 100

14Н " :ю 0 0 80

181/1 10 0 0 80

181-/1 '-.40." 10 90

19.1/1 10 0 0 70

А 19Х'6 -„1.0-:.. 0 10 80

26Е/1 10 50 40 90

26С/Ц1) ю 0 70

Патотипирование. Цыплят вакцинировали в 1-й день жизни в дозе 2000 ФОБ (одна доза бивалентной вакцины содержала по 1000 ФОБ каждого вируса). На 6-й день цыплят инфицировали изолятами ВБМ-1 в дозе 500 ФОБ.

Через 56 дней после инфицирования всю выжившую птицу подвергали эвтаназии и вскрывали. Основное внимание' было направленно на обнаружение макроскопических поражений в периферических нервах, лимфоидных и висцеральных органах, коже и мышцах.

Результаты патотипирования представлены в таблице 4. В ходе исследований было установлено, что степень вирулентности почти всех полевых изолятов была выше степени вирулентности контрольного штамма Мё5, но ниже таковой референтного штамма 648А. Из двадцати исследуемых изолятов, только один 22В/9 был отнесен к патотипу V, т.к. показатели выявления БМ у павших еттац (%) и общей частоты выявления БМ (%) у всех групп птиц больше соответствовали показателям, полученным для штамма JM/102W, чем для штамма Мё5. Степень поражений, индуцированных остальными изолятами, была средней между показателями реферептных штаммов Мё5 и 648А. Основываясь на сравнении общей частоты выявления БМ (%), и особенно по средневзвешенной величине этого параметра, одиннадцать исследуемых полевых изолятов были отнесены к патотипу уу, восемь к патотипу уу+.

Таблица 4. Определение вирулентности полевых изолятов вируса БМ первого серотипа модифицированным

методом «Best Fit».

• Серия Вирус Количество птииы вакцинированной: Выявление БМ у .-."■ павшей иттш (%) Общая частота выявления БМ (%) Патотипс

FC-126 FC-126 +301В/1 ГС-126 FC-126 +301В/1 FC-126 FC-126 +301В/1 ♦Средне- :..: " взвешеююеь

1 JM/102W 14 Н/ГГ 0 Н/П 0 Н/П 0

Md5 12 10 Л;-, ,,17 ■■ : : 0: \ —33.': 0

648Л 13 9 23 11 39 33 35

ЮЛ г 13 rv. 12 8 39 25 >,:■■ ■30 VV+ :

10В 13 11 23 0 23 18 20 W

23Л 12 13 8 0 33 ..... 21 ' VV

23В 14 12 14 0 21 25 24 W+

41 12 ч: : 13 8 8 .„: 50 15 ;::::;; ' ИП - УГ л'- W+

4J 14 12 14 8 29 25 26 W+

JM/102W V - 14 H/II 0 Н/ГГ 0 ЮТ 0

MdS 14 13 7 0 36 0 12

648А v:М4;. 29 14 50 .,29. таг 36

4В 14 14 0 7 43 21 29 VV+

4D ■ 13 ,:' 13 0 :■: ..-UO.-/ 39 23 28 W+

8D 13 14 0 0 33 21 25 W+

22Л/1 :: 13 13 0 0 31 15 21 ; W

22А/2 13 14 0 0 31 14 20 W

: 22В/9 14 ■ 14 0 0 0 2 V

11 С/2 14 14 7 0 29 14 19 VV

Серия Вирус Количество птицы вакцинированной: Выявление БМ у павшей птицы (%) Общая частота выявления БМ Патотипс

ГС-126 1"С-126 +301В/1 ГС-126 УС-126 4-301 В/1 ГС-126 РС-126 ; +301В/1 * Средневзвешенное-

3 .ГМ/102\У 13 Н/П 8 Н/П 8 Н/П 8

М<15 14 : 13 ■ : 7 0 36 ■■,.-■■' 15 22

648Л 14 12 21 8 64 42 49

6С 12 14 - 0 : 0 :.". 33 -21 ■ ■.■::■;■■;. ■■ 25 УУ

9А 13 13 8 0 39 15 23 УУ

: 141 12 13 42 23 х -29 уу

14Н 14 13 0 0 43 39 40 УУ+

181/1 14 14 ■.■•■-:■■.:; 0 0 л 29 21 '. 24 ' . УУ

19.1/6 13 13 0 0 31 31 31 УУ

26Е/1 14 12 ■ ■;*.' 0 .:■; 0 38 ■■'.■: 25 . 29 УУ

а СРС = синдром ранней смертности (смерть между 8-18 днем после заражения)

* Ь Средневзрешенное значение от обшей частоты выявления БМ (%) у цыплят, вакцинированных РС-126 и бивалентной вакциной; для бивалентной вакцины берут двойное значение среднего взвешенного с Н/П = не применялось (не делали) •Средневзвешенное значение - математическая величина

Средневзвешенное значение вирулентности (%) в экспериментах по патотипированию рассчитывали по общей частоте выявления БМ (%) в группах, вакцинированных штаммом РС-126 и бивалентной вакциной. Учитывая значимость вклада, для групп, вакцинированных бивалентной вакциной, использовали расчет по двойному средневзвешенному значению (метод Гаусса) (значение общей частоты выявления БМ (%) в группах, привитых: РС-126 + бивалентной вакциной + бивалентной вакциной, деленное на 3).

Точки распределения изолятов ВБМ-1 по шкале вирулентности относительно референтных штаммов рассчитывали в интервале между показателями вирулентности штаммов 1М/102\У и Мс15, используя средние значения (%) выявления признаков БМ у павшей птицы и общей частоты выявления БМ у групп, вакцинированных моновалентной вакциной, или в интервале между показателями вирулентности штаммов Мё5 и 648А, используя средневзвешенное значение. Интервальную величину образовывали два референтных штамма с уровнем вирулентности непосредственно ниже и выше уровня вирулентности исследуемого патотипнруемого изолята. Ниже приведена формула для расчета точек распределения изолятов ВБМ-1 по вирулентности относительно референтных штаммов:

Точка распределения —

вирулентности полевого юолята

вирулентности более вирулентного реферепс-ттамма

вирулентности менее вирулентного референс-пггамма

внрулентпостн менее вирулентного референс-штамма

После расчета «точек распределения» изолятов ВБМ-1 по вирулентности относительно референтных штаммов стало возможным представить графически спектр вирулентности полевых изолятов (рис. 1).

—ом

-СТОЛ

4 I 8

I I I

з 'я ? 1,5! г

III ■■_I,

-п- —Пи"-о-™— и

0,1 02 0,3 0.4 0.5 0.» 0.7 0.8 0,9

М<Г5 Распределение кмлятое ВБМ 648Д

Рисунок 1. Распределение полевых изолятов вируса БМ первого серотипа по вирулентности.

Как видно на представленном рисунке, только один изолят 22В/9 со значением 0,15 расположен в интервале JM/102W и Md5. Другие 19 изолятов занимают промежуточное положение между штаммами Md5 и 648А.

Практически все изоляты были выделены с европейской части Российской Федерации (Белгородская, Вологодская, Курская, Липецкая, Московская, Ростовская, Краснодарский край) и Свердловской области. Большинство образцов патматериала было получено с птицефабрик, неблагополучных по болезни Марека, где наблюдалась различная степень интенсивности заболевания с варьирующим процентом проявления характерных неопластических изменений, выявляемых при вскрытии. На пяти птицефабриках удалось выделить по нескольку изолятов ВБМ-1. Изоляты, выделенные на птицефабриках Ростовской (Ростов-на-Дону) и Курской области, показали высокую степень сходства по вирулентности. Это дало основание предположить, что они являются разновидностями одного штамма. Однако, в случае выделения нескольких изолятов на птицефабриках Вологодской области и Краснодарского края степень их вирулентности значительно варьировала.

2.2.2. Разработка непрямого варианта твердофазного ИФА для определения поствакцинальных антител в сыворотке крови кур к вирусу БМ первого серотипа

За основу разрабатываемой иммуноферментной тест-системы нами был взят стандартный вариант непрямого твердофазного ИФА.

Основными иммунологическими реагентами, используемыми нами для разработки непрямого варианта твердофазного ИФА, служили антиген ВБМ-1 в виде лизата (белковой смеси), полученного из перевиваемой клеточной линии SOgE, инфицированной вакцинным штаммом Rispens (ВБМ-1), антивидовые (антикуриные) моноклональные антитела IgY (IgG) (Sigma, США). Ключевым звеном технологической цепи по производству иммуноферментной тест-системы явилось получение и иммунохимическая характеристика антигена (лизата), используемого для иммобилизации на микропанели.

Получение антигена. Культуру клеток SOgE инфицировали ВБМ-1 (Rispens). На пятые сутки производили сбор вирусного материала. Для выделения использовали вирус с инфекционной активностью не ниже Ю6'0 ФОЕ/см3. Клеточный лизат получали ультразвуковой обработкой суспензии инфицированных клеток (60 сек, 60 Ватт). Очищение лизата от клеточного детрита производили центрифугированием (2000g/10 мин.). Специфическую активность вирусного антигена контролировали в РДП.

Определение концентрации белка в полученном лизате. Концентрацию белка в осветленном клеточном лизате определяли спектрофотометрическим методом с использованием набора ВСА™ (Pierce, США). Перед измерением концентрации белка полученный лизат разводили десятикратно ФБР.

Концентрация белка в полученном лизате (вирусном антигене) составила 2,7 мг/мл.

Определение белкового состава и антигенной активности вирусного препарата. Белковый состав вирусного препарата определяли с помощью электрофореза в ПААГ-ДСН, а антигенную активность ВБМ-1 оценивали в иммуноблоттинге с контрольными положительными и отрицательными сыворотками крови (рис. 2).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что доминирующим белком, ответственным за специфическое связывание комплекса Аг-Ат является гликопротеин с М.м. 49 кД, специфически выявляемый с помощью антивидового конъюгата (IgY (IgG), Sigma, США) и ВБМ-1-положительной сыворотки.

М Л

62 кД 49 кД

28 кД

................ : |::i;:;::iS:i; ipili

к-

ри Рр HS И8

ШжмШ

Рисунок 2. Анализ М.м. белков вирусного препарата методом электрофореза в ПААГ-ДСН (А) и антигенной активности ВБМ-1 в иммуноблоттинге (Б). А: М - белки-маркеры молекулярной массы;

JI- белки лизата из культуры SOgE, инфицированной ВБМ-1 Б: иммунопероксидазное окрашивание реплик гелей после реакции с контрольными положительными (1-3) и отрицательными (4-6) сыворотками крови кур, содержащих и не содержащих антитела к ВБМ соответственно.

Из данных литературы [B.W. Calnek и R.L. Witter, 1991] известно, что антигеном, играющим основную роль в вакцинном иммунитете и ответственным за синтез специфических ВНА, является структурный антиген В вируса БМ, который представлен тремя гликопротеинами с молекулярной

массой 100 кД, 60 кД и 49 кД (gplOO, gp60, gp49). Наши данные носят уточняющий характер и показывают, что специфическое связывание комплекса Аг-Ат происходит с белком М.м. 49 кД, входящим в состав структурного антигена В, который, как показывает исследование, обладает выраженной антигенной и иммуногенной активностью. Основные антигенные детерминанты вируса БМ, ответственные за синтез вируснейтрализующих антител, локализованы в В антигене, являющимся индуктором протективного иммунного ответа.

Результаты проведенных исследований показали, что метод получения вируса БМ позволяет нарабатывать его в препаративных количествах с дальнейшим использованием в качестве антигена в разрабатываемой иммуноферментной тест-системе.

При постановке непрямого варианта твердофазного ИФА в качестве антивидового конъюгата использовали антитела к IgY (IgG) курицы, меченные пероксидазой хрена (Sigma, США) в рабочем разведении (1:20000).

2.2.2.1. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к вирусу БМ

Разработка непрямого варианта ИФА состояла из ряда последовательных этапов, при проведении которых решались следующие основные задачи:

1) получение и характеристика положительного и отрицательного контролей для тест-системы;

2) отработка условий сенсибилизации лунок полистироловых микропанелей (твердая фаза) вирусным Аг ВБМ-1;

3) оптимизация условий проведения ИФА;

4) оценка эффективности разработанной тест-системы, предназначенной для выявления антител к ВБМ-1, в сравнении с методами аналогичной направленности (РДП).

Для получения положительного и отрицательного контролей (сыворотки крови кур, содержащие и не содержащие антитела к ВБМ-1) были проведены исследования сывороток крови (п=84), полученных от вакцинированных и клинически здоровых неиммунных птиц, направленные на определение уровня ВБМ-специфических антител с помощью РДП. Пробы, показавшие положительный или отрицательный результат, объединяли и исследовали повторно. Таким образом, были получены контрольные образцы, представляющие собой пул сывороток крови, содержащих и не содержащих вирусспецифические антитела, соответственно. Активность и специфичность полученных проб была подтверждена в иммуноблоттинге с использованием ВБМ-1 (Rispens) в качестве антигена (рис. 2). Результаты анализа показали, что антитела положительного контроля специфически взаимодействовали с основными структурными белками вируса, в пробах отрицательного контроля подобного взаимодействия не наблюдалось.

При отработке условий постановки ИФА концентрацию антигена, рабочие разведения контролей определяли в предварительных экспериментах

методом «шахматного» титрования, где последовательные разведения антигена располагались в вертикальных рядах, а последовательные разведения контролей в горизонтальных рядах одной микропанели (таблица №6).

Оптимальной концентрацией антигена и рабочими разведениями компонентов иммуноферментной тест-системы считали их конечные значения, обеспечивающие в лунках с положительным контролем ОП 450 > 1,0, а в лунках с отрицательным - < 0,2.

Таблица 5. Результаты «шахматного» титрования рабочих разведений контролей и антигена ВБМ-1 в ИФА._

Конц -ция Аг (мкг/ ш).. ОП 450 положителыюго/отрицательцого контролей, взятых в разведении: 1/х

10 УЖ, 80 160 320 640 1280 2560

"3,38 4/ 1,201 3,791/ 0,259 3,629/ 0,095 3,718/ 0.0-1 3,577/ 0,02 3,1/ 0,011 2,562/ 0.006 2,019/ 0,004 1,465/ 0,004 1,06/ 0,001

1,69 3,754/ 1,429 3,547/ 0,345 3,531/ "0,124 3,518/ 0,065 3,401/ 0,034 2,999/ 0,018 2,438/ 0,01 1,932/ ,0,005 1,429/ 0,004 1,02/ 0,0"4

0,84 3,802/ 1,412 3,66/ 0,341 3,51/ 0,142 3,57/ 0,072 3,366/ 0,035 3,079/ 0,084 2,6/ 0.01 V 2,043/ 0,005 1,478/ 0,004 0,996/ 00'))

0,42 3,53/ 1.12 3,151/ 0.29 2,878/ 0,133 2,372/ 0,065 1,925/ 0,034 1,689/ 0,018 1,344/ 0.01 1,001/ 0,005 0,71/ 0,005 0,463/ 0,003

0,21 2,243/: 0,716 ,1,828/ 0,215 1,541/ 0,097 1,285/ 0,049 0,929/ 0,027 0,797/ 0,017 0,588/ 0,01 0,441/ 0,005 0,318/ 0,005 0,195/ 0,003

0,11 1,525/ 0,614 ,1,201/ 0,204 0,966/ 0 п>>4 0,745/ 0,049 0.517/ 0,027 0,405/ 0,014 0,292/ 0,008 0,213/ 0,006 0,142/ 0,005 0,085/ 0,005

0,05 1,209/ 0,575 0,919/ 0,21 0,768/ 0,102 0,528/ 0.055 0,683/ 0,029 0,277/ 0,018 0,187/ 0,013 0,126/ 0,005 0,085/ 0,005 0,051/ 0,005

0,03 1,06/' 0,528 0,841/ 0,196 0,606/ 0,116 0,416/ 0.057 0,308/ 0,029 0,181/ 0.025 0,141/ 0,013 0,134/ 0,006 0,069/ 0,006 0,035/ 0,005

Примечание: в данном эксперименте использован конъюгат в разведении 1:20000. ОП контроля конъюгата в двух последних рядах планшета не превысило показателя 0,005.

Из данных, приведенных в таблице 5 видно, что оптимальным рабочему разведению положительного и отрицательного контролей соответствует разведение 1/640 (1,001/0,005). С учетом практичности проведения анализа было выбрано рабочее разведение сывороток 1/500.

Далее была проведена повторная отработка оптимальной рабочей концентрации антигена ВБМ-1 для сенсибилизации в лунках планшетов. При этом положительные и отрицательные контроля использовали в установленном рабочем разведении 1/500. В результате исследования было установлено, что оптимальная концентрация находится в пределах 1—3 мкг/мл. С учетом практичности проведения анализа выбрана рабочая концентрация 2,7 мкг/мл (разведение 1/1000).

В этих же экспериментах для оптимизации основных параметров тест-системы (чувствительности и специфичности) тест-системы выбирали:

1) тип сорбционной активности полистирола микропанелей: полистирол высокой и средней активности;

2) фирму производителя микропанелей: Nunc Polysorp (Дания), Greiner Microlon (Германия) и Dinex Immulux (США);

3) буфер для сорбции антигена: 0,01 М ФБР (рН=7,4) и 0,1 М карбонатно-бикарбонатный буфер (рН=9,6);

4) время и температуру иммобилизации антигена на микропанели: 2 часа при +37°С и 18 часов при +4°С;

5) структуру антигена: нативный белок (конформационные эпитопы) и денатурированный белок (линейные эпитопы);

Исследования проводили эмпирически в системе непрямого варианта твердофазного ИФА. Во всех опытах в качестве раствора, блокирующего несвязавшие белок участки пластика использовали сухое обезжиренное молоко, в качестве субстратной смеси использовали раствор ТМБ, а раствором, останавливающем реакцию (стоп-раствор) являлся 1 М Н3РО4. Реакцию оценивали по показателям ОП 450 в лунках с положительным и отрицательным контролями и антигеном (как описано выше).

Полученные результаты показали, что оптимальными являются микропанели Greiner Microlon со средней сорбционной активностью полистирола. Сенсибилизацию Аг необходимо проводить нативной формой белка в течение 18 часов при +4°С. Оптимальными буферами являются ФБРТ (твин 20 0,05%) (для промывки лунок), ФБР (для разведения антигена). В качестве раствора, блокирующего несвязавшие белок участки пластика использовали ФБРТ, содержащий 5% сухого обезжиренного молока. Этот же раствор использовали для разведения конъюгата, испытуемых и контрольных проб. При соблюдении этих условий и использовании специфических реагентов в следующих концентрациях (разведениях): антигена вируса БМ -2,7 мкг/мл, контролен - 1/500 и конъюгата - 1/20000 при 60 минутной инкубации при +37°С на каждом этапе, неспецифическое взаимодействие компонентов полностью исключалось, а показатели ОП 450 в лунках с положительными и отрицательными пробами были > 1,0 и < 0,2 соответственно.

Приготовление высокоположительного и положительного контролен Для приготовления вышеуказанных контролей был использован пул положительной и отрицательной контрольных сывороток. Выбор оптимального соотношения позитивной и негативной сывороток лежал в основе принципа приготовления высокоположительного и положительного контролей для достижения показателей ОП > 1,0 и > 0,5 соответственно.

Результаты исследования показали, что высокополжительному контролю отвечает соотношение поз/нег сыворотка 1/2, а положительному 1/7.

Определение параметров внутренних контролей качества. Данное исследование состояло из двух стадий:

1) Определение воспроизводимости метода для внутренних контролен качества: контроль конъюгата, высокоположительный контроль, положительный контроль и отрицательный контроль.

2) Математическая обработка результатов с выводом среднего значения процента позитивности и верхнего и нижнего контрольного пределов для четырех вышеуказанных контролей (таблица №7).

Для этого каждый из четырех контролей был исследован в ИФА в 552-х повторностях. Результаты исследования приведены в таблице 6.

Таблица 6. Определение значений верхнего и нижнего контрольных

К++ К+ К- КК

Сред. знач. ПП _ 100 48 1

СО 2 0

Сред. знач. ПП + ЗСО 102 54 > 2т ■ 1

Сред. знач. ПП - ЗСО 98 42 . ' 'Ой': 0

где К-н- высокоположительный контроль, К+ положительный контроль, К-отридательный контроль, КК контроль конъюгата, ПП процент позитивности, СО стандартное отклонение.

2.2.2.2. Оценка диагностических параметров разработанной иммуноферментной тест-системы

На первой стадии была проведена отработка возможных вариантов учета и интерпретации результатов реакции при исследовании проб, взятых в одном разведении. Для этого были проведены исследования по определению закономерности распределения значений ОП 450 и коэффициента связывания (Ксв.) отрицательных и положительных (содержащих антитела к ВБМ-1) сывороток, т.е. порогового значения (cut off или позитивно-негативный порог - ПНП), разграничивающего положительную и отрицательную реакции.

Для определения этого значения мы использовали 284 сыворотки крови кур, не содержащих, по данным РДП, антител к вирусу БМ и 296 сывороток крови от вакцинированной птицы с различным уровнем специфических антител в РДП.

Отобранные в РДП положительные и отрицательные сыворотки крови исследовали методом ИФА в рабочем разведении, соответствующем разведениям контролей (1/500). Каждая сыворотка крови проверялась в трех параллельных лунках. Перед учетом реакции по формуле, приведенной ниже, высчитывали среднее значение ОП 450 для каждой испытуемой пробы. Относительное содержание ВБМ-1-специфических антител в пробах определяли по коэффициенту связывания (Ксв.) отражающему содержание антител в испытуемой пробе по отношению к содержанию антител в положительном контроле. Математически это выражается следующей формулой:

к _(ОЯ450ЯЯФ-ОЯ450/С-Ф) шо

где ОП450 ИПср, ОП450 К' и ОП45оК+ - средние арифметические значения оптической плотности в лунках с испытуемой пробой, отрицательным и положительным контролями соответственно.

Анализ распределения положительных и отрицательных сывороток в зависимости от Ксв показал, что для 99,3% отрицательных сывороток Ксв не превышал 9, а у 98,6% положительных сывороток Ксв был выше 9 (рис. 4).

100

эо

* so

| 70

f «о

о 50

£ 40

| 30

* 20

3 6 9 12 20 30 40 50 60 70 >0 «0 100 >100 Коэффициент связывания

Рисунок 4. Распределение количества отрицательных и ВБМ-1-положительных сывороток в зависимости от Ксв.

Таким образом, значение Ксв, позволяющее дискриминировать положительные и отрицательные сыворотки в ИФА, составляло 9.

В заключение, был сделан общий вывод о том, что анализируемые сыворотки, имеющие Ксв. менее 9, с вероятностью (0,99) не содержат антител к вирусу болезни Марека первого серотипа. В специфических сыворотках к ВБМ-1 в большинстве случаев 98,6% значение ОП 450 превышало аналогичный показатель отрицательного контроля в 2,1 раза, а Ксв. был более 9. Исходя из этого, величина ПНП (cut off) для Ксв., являющаяся критерием дифференциации положительных и отрицательных проб, при котором минимально количество ложноположительных и ложноотрицательных результатов составляет 9.

В дальнейшем все пробы, значение Ксв. для которых было меньше ПНП, считались отрицательными, а пробы со значением Ксв. равным или превышающем этот показатель - положительными.

На второй стадии определяли чувствительность и специфичность разработанной иммуноферментной тест-системы в сравнении с референтными методами (РДП). Традиционно эти параметры высчитываются согласно стандартам МЭБ (Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2004).

В сравнительном аспекте с использованием ИФА и РДП было исследовано 580 сывороток крови кур различных возрастных групп, полученных из 8 птицехозяйств, расположенных в различных регионах РФ

(таблица 7). Постановку и интерпретацию полученных результатов осуществляли, как описано в разделе «Материалы и методы».

Таблица 7. Сравнительная оценка эезультатов в ИФА и РДП.

Результат РДП, количество проб: : ;

положительных < (п=296) отрицательных (п=284)

Результат ИФА, количество проб:" положительных 292 2

отрицательных 4 • 282

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что диагностическая чувствительность разработанной тест-системы по отношению к РН составила 98,6%, диагностическая специфичность - 99,3%. Совпадаемость результатов двух методов составила 98,9%.

Перекрестной реактивности со специфическими сыворотками к вирусам лейкоза птиц, ларинготрахеита, ньюкаслской болезни, энцефаломиелита птиц, реовируса птиц, инфекционной бурсальной болезни и инфекционного бронхита кур выявлено не было.

ИФА обладает рядом преимуществ (быстрота и простота, проведения анализа, возможность инструментального учета реакции и автоматизации всех ее этапов, стабильность при хранении всех необходимых реагентов и воспроизводимость результатов) и, поэтому, наша иммуноферментная тест-система может быть использована в качестве скринирующего теста при обследовании птицы в практических условиях.

3. ВЫВОДЫ

1. Модифицированный и апробированный нами метод патотипирования «Best Fit» является достоверным и практичным способом оценки степени вирулентности полевых изолятов ВБМ 1-го серотипа.

2. Чувствительность СПФ-птицы линии Щелково к ВБМ-1, предложенной вместо линии СПФ-кур «15x7 аЬ+» (США) оказалась незначительно ниже, чем у американской птицы. Однако, её чувствительность была достаточной для проведения патотипирования полевых изолятов ВБМ-1.

3. Модифицированным методом «Best Fit» охарактеризована степень вирулентности двадцати полевых изолятов ВБМ-1, выделенных в восьми регионах Российской Федерации.

Одиннадцать изолятов представляют патотип w, восемь изолятов -патотип vv+. Все изоляты обладали выраженной вирулентностью, и вызывали клинические признаки и патологоанатомические изменения, характерные для БМ у вакцинированного поголовья.

Один изолят (22В/9) отнесен к патотипу v, который вызывал опухоли только у невакцинированных кур (70 %). Изоляты с более низким уровнем вирулентности не выявлены.

4. С использованием перепелиной рекомбинантной линии клеток SOgE, инфицированной вакцинным штаммом Rispens получен высокоспецифический антиген ВБМ-1, пригодный для разработки иммуноферментной тест-системы для выявления антител к вирусу болезни Марека.

5. Разработана высокоспецифичная и высокочувствительная иммуноферментная тест-система на основе непрямого варианта твердофазного ИФА для определения антител к ВБМ-1 в сыворотке крови кур, позволяющая оценивать уровень напряженности поствакцинального иммунитета против БМ.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дудникова Е.К., Норкина С.Н., Алипер Т.И,, Власов А.Н., Джулардов Г.В., Lusy F. Lee, Richard L. Witter Патотипирование полевых изолятов вируса болезни Марека, выделенных на территории РФ в 2001-2005 гг., методом "best fit" // Вопросы вирусологии, № 1, 2009. - стр. 36-41.

2. Vladimir Zelnik, Gennadij Dzhulardov, Andrea Eschbach, Dierk E. Rebeski Development of ELISA assay method for measurement of antibodies to Marek's disease virus in chicken serum // 4th International Workshop of the Molecular Pathogenesis of Marek's disease virus. - Delaware, 2006. - p. 42.

3. Дудникова E.K., Норкина C.H., Власов A.H., Джулардов Г.В. Патотипирование полевых изолятов вируса болезни Марека методом "BEST FIT' // Материалы Ш-го Международного Ветеринарного Конгресса по Птицеводству. Москва, 2007. - стр. 117.

4. Gennady Dzhulardov, Ekaterina Dudnikova, Svetlana Norkina, Anatoly Vlasov, Anna Slobodchuk, Lusy F. Lee, Richard L. Witter Application of the "Best Fit" pathotyping assay for evaluation of russian isolates of Marek's disease virus // Conference for Young Scientists, Ph.D. Students and Students on Molecular Biology and Genetics. Kiev, 2007. - p. 117.

Список сокращений

Аг — антиген;

At - антитело;

ВЛП - вирус лейкоза птиц;

ВРЭ — вирус ретикулоэндотелиоза;

ИФ — иммунофлюоресценция;

ПЦ - почка цыпленка;

РДП - реакция диффузионной преципитации;

СПФ - свободный от специфических патогенных возбудителей

ФОЕ - фокусообразующая единица;

ФЭК - фибробласты эмбриона курицы

m - умеренновирулентный (с англ. mild); v - вирулентный (с англ.

virulent), vv - высоковирулентный (с англ. very virulent), w+ —

сверхвирулентный ВБМ-1.

Подписано в печать: 20.05.2009

Заказ № 2139 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 \v\vw. autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Джулардов, Геннадий Викторович

стр.:

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Историческая справка.

1.2. Эпизоотическая ситуация по болезни Марека.

1.3. Характеристика вируса болезни Марека.

1.4. Классификация и биологические свойства ВБМ.

1.5. Классификация вируса болезни Марека серотипа 1 в соответствии с принципами патотипирования.

1.6. Патотипирование методом «Best Fit» ADOL.

1.7. Вирусы БМ серотипа 2.

1.8. Вирусы БМ серотипа 3.

1.9. Эпизоотологические особенности.

1.10. Клинические признаки.

1.11. Патологоанатомические и гистологические изменения.

1.12. Диагностика.

1.12.1. Иммунодиагностика ВБМ.

1.13. Иммунитет.

1.14. Контроль и специфическая профилактика.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологические свойства природных изолятов вируса болезни Марека, циркулирующих на территории Российской Федерации"

Актуальность темы

Болезнь Марека (БМ) является наиболее распространенным лимфопролиферативным заболеванием кур, которое характеризуется развитием злокачественных лимфом в висцеральных органах (острая форма) и поражением нервов (классическая форма). Заболеванию подвержены куры всех возрастов. Однако наиболее чувствительными являются суточные цыплята мясных и яичных пород. Смертность поголовья при острой форме болезни может достигать 60-80% [5, 75].

Возбудителем БМ является ДНК-содержащий вирус (ВБМ), относящийся к роду Mardivirus семейства Herpesviridae. Согласно биологическим свойствам ВБМ разделены на три вирусные группы. К первому серотипу относятся патогенные (онкогенные) штаммы ВБМ и их аттенуированные формы, ко 2-му серотипу относится' неонкогенный вирус герпеса кур, к 3-му серотипу условно относят природноапатогенный герпес вирус индеек (ГВИ), антигенно-родственный вирусу БМ.

Болезнь широко распространена во всех странах мира с развитым птицеводством и причиняет большой экономический ущерб. Потери от БМ в птицеводческой промышленности всего мира ежегодно оцениваются в 1-2 млрд. долларов (С. Morrow и F. Fehler, 2004).

Массовую специфическую профилактику болезни Марека в СССР начали проводить в 1974 г. с использованием вакцин отечественного производства из штамма FC-126 (ГВИ). Это дало положительные результаты и в течение 25 лет эпизоотическая ситуация по БМ находилась под контролем. Однако, в начале 90-х гг. среди привитого поголовья птиц снова начали отмечать учащение случаев возникновения данного заболевания. Аналогичную динамику наблюдали и в других странах мира с развитой птицеводческой промышленностью. Ситуацию, выходящую из-под контроля, исследователи, объясняли появлением-в^ природе-новых-более вирулентных форм вируса БМ, в связи с его изменчивостью и, как следствие, недостаточной протективной способности вакцин на основе ГВИ. Для совершенствования контроля БМ в ветеринарной практике России стали применять би- и поливалентные вакцины на основе первого, второго и третьего серотипов ВБМ. В целом это позволило стабилизировать обстановку по БМ в стране. Однако ситуация, связанная с изменчивостью ВБМ в сторону повышения вирулентности, оставалась актуальной как в России, так и во всем мире, где было развито промышленное птицеводство (В.И. Смоленский, 2000, неопубликованные данные).

В работах R. L. Witter [171] указывается, что за последние 30 лет отмечено повышение патогенности вируса БМ: от умеренновирулентных (т ВБМ) до сверхвирулентных (vv+ ВБМ) штаммов. При этом антигенное различие между этими штаммами не обнаруживали, все они относились к первому серотипу.

Лабораторией Онкологических Болезней Птиц (ADOL, США) был разработан стандартный метод оценки степени вирулентности полевых изолятов, который обозначили как «золотой стандарт» [173]. Однако, им трудно руководствоваться в других лабораториях, поскольку авторы, для оценки вирулентности полевых изолятов ВБМ-1 в экспериментальных условиях используют чувствительных к ВБМ линию СПФ-кур «15x7 аЬ+», доступную в основном только в США. Для устранения этого препятствия Witter предложил провести сравнение патологоанатомических изменений, вызываемых референтными и полевыми штаммами вируса БМ, с использованием других чувствительных к ВБМ СПФ-линий кур. Этот метод был апробирован с положительными результатами на двух американских СПФ-линиях кур и получил название «Best Fit» [173]. Однако сообщений о подтверждении достоверности данного метода в независимых лабораториях не поступало.

В нашей стране подобных исследований не производили. Из-за экономического кризиса,который длился^ в. России более ! 0 лет, научные исследования БМ, включая изучение полевых изолятов, также как и усовершенствование мер борьбы с заболеванием практически не проводились. Из-за отсутствия диагностических центров, вопрос о циркуляции в птицеводческих хозяйствах штаммов ВБМ-1 с различной степенью вирулентности (от авирулентных до сверхвирулентных) не изучали. Хотя стоит отметить, что в более ранних исследованиях по БМ отечественными авторами было опубликовано несколько сообщений по выделению различных изолятов ВБМ при вспышках болезни в хозяйствах (Коровин, 1971, 1979, Лавров, 1975, Мазуренко, 1974, Яковлева, 1973, 1975), однако, отсутствие стандартных методик не позволило в полной мере охарактеризовать вирулентность полученных изолятов.

С конца 90-х гг. прошлого века и вплоть до настоящего времени роль БМ в инфекционной патологии птиц стала возрастать. В этот период снова начала прослеживаться опасная тенденция по учащению случаев БМ и увеличению неблагополучных районов. Можно сказать, что возникла ситуация, когда БМ наблюдали почти в каждом птицехозяйстве страны. Среднегодовой падеж птицы от БМ мог достигать 18% от всех инфекционных болезней (В.И. Смоленский, 2000, неопубликованные данные). В очередной раз одной из основных причин ухудшения эпизоотической ситуации могла явиться циркуляция вновь появившихся в природе высоко- и сверхвирулентных форм ВБМ-1.

Другой потенциальной причиной вспышек БМ среди вакцинированного поголовья кур (кроме циркуляции в хозяйствах высоко- и сверхвирулентных форм ВБМ-1) может быть не всегда удовлетворительное проведение мероприятий по специфической профилактике против БМ. В связи с этим необходим систематический контроль гуморального ответа птицы на введение вакцинного штамма ВБМ.

В настоящее время для серологической диагностики БМ применяют РДП, реже РН и ИФ. Об использовании ИФА, обладающего гораздо более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с вышеуказанными методами, в литературных данных имеются весьма ограниченные сведения. Это может быть связано с рядом причин, таких как: перекрестная реактивность, высокий неспецифический фон реакции [46], а также неудовлетворительная чувствительность тест-системы [177].

Такой культурой оказалась рекомбинантная линия клеток SOgE, полученная из фибросаркомы перепела [108, 141]. Наличие подобной клеточной системы позволяло получить вирусный антиген БМ, пригодный для разработки тест-системы на основе непрямого варианта ИФА с целью обнаружения антител к ВБМ. Данная тест-система могла служить ценным инструментом при проведении ретроспективной диагностики и оценки эффективности специфической профилактики против БМ.

Цель работы и задачи исследования

Целью исследований явилось изучение биологических свойств российских природных изолятов вируса болезни Марека первого серотипа (ВБМ-1) и разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к ВБМ-1 для оценки эффективности вакцин.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

2) Выделение и изучение изолятов вируса болезни Марека, циркулирующих на территории РФ, состоящее из следующих этапов: очистка изолятов ВБМ 1-го серотипа от контаминации другими вирусами; проведение первичной оценки степени вирулентности исследуемых изолятов на невакцинированных цыплятах; определение патотипа исследуемых изолятов на вакцинированных цыплятах; сравнение вирулентности современных российских, полевых изолятов ВБМ-1 с европейскими и американскими изолятами; получение матричных расплодок отечественных изолятов ВБМ-1.

3) Разработка метода ИФА для выявления Ат к ВБМ-1: получение и иммунохимимическая характеристика вирусного антигена пригодного для нИФА с последующей иммобилизацией его на микропанели; определение оптимальных концентраций компонентов и условий проведения реакции; выявление величины пороговых показателей специфической и неспецифической реакции; сравнительный анализ нИФА и РДП, определение корреляции и относительной чувствительности этих тестов.

Научная новизна

Представлены и впервые систематизированы данные о патогенности изолятов ВБМ-1, циркулирующих на территории РФ, их распространении, особенности клинических проявленийБМ в.полевыхусловиях.^

Показано, что использование модификации метода патотипирования является необходимым для стандартизации оценки вирулентности ВБМ первого серотипа и изучения состояния проблемы в разных странах.

Сравнительное изучение патотипов ВБМ-1, циркулирующих на территории РФ и американских референтных штаммов подтвердило предположение об изменчивости штаммов ВБМ-1 в сторону увеличения вирулентности.

Разработана тест-система на основе непрямого варианта ИФА для определения поствакцинальных антител к вирусу БМ первого серотипа с использованием антигена, из рекомбинантной перепелиной перевиваемой клеточной линии SOgE. Чувствительность разработанной тест-системы позволяет выявлять Ат у птицы на ранних сроках после вакцинации.

Изучена диагностическая ценность нИФА в сравнении с РДП и проведена оценка относительной чувствительности данных тестов.

Практическая значимость работы

Получена коллекция российских изолятов ВБМ-1, которая может служить основой банка референтных штаммов ВБМ первого серотипа, что является важным этапом для дальнейшего изучения болезни, дифференциации изолятов ВБМ-1 и разработки эффективных средств специфической профилактики, способствующих повышению сохранности птицепоголовья в России и других странах.

Отработаны и усовершенствованы методы выделения и патотипирования отечественных природных изолятов ВБМ-1, что позволяет проводить мониторинг эпизоотической ситуации по БМ и является предпосылкой создания первого в России референтного центра по БМ.

Изолированные и охарактеризованные вирулентные штаммы ВБМ-1, представляющие три патотипа, а именно, 14 Н (w+), 19J/6 (w) и 22В/9 (v) депонированы в государственную коллекцию вирусов Российской Федерации (НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН).

Основные положения, выносимые на защиту

1) Чувствительность СПФ-птицы линии Щелково породы Белый леггорн к вирусу болезни Марека является достаточной для проведения экспериментов по оценке вирулентности полевых изолятов ВБМ-1.

2) Модифицированный метод «Best Fit» позволяет достоверно определять степень вирулентности российских полевых изолятов вируса БМ 1-го серотипа.

3) Подтверждена изменчивость полевого ВБМ-1 в сторону увеличения вирулентности. Степень вирулентности 19-ти отечественных изолятов ВБМ-1 была схожа с американскими аналогами и являлась достаточной, чтобы вызывать БМ у вакцинированного поголовья.

4) Разработанная тест-система непрямого ИФА на основе специфического Аг ВБМ-1, полученного с использованием рекомбинантной перепелиной линии клеток SOgE, является высокочувствительной и высокоспецифичной для оценки уровня поствакцинальных Ат.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Болезнь Марека (Polinevritis interstinalis chronica, Polinevritis gallinarum (лат.); Fowl or range paralisis, neural, okular, (grey or paerly eye) and vaskular lymphomatosis, March's leukosis, March's disease, Polynevritis, Neurolymphomatosis galinarum (англ.), БМ, нейролимфоматоз птиц, паралич птиц, энзоотический нейроэнцефаломиелит птиц) — высококонтагиозное заболевание кур вирусной природы, проявляющееся в классической (поражение периферической и центральной нервной системы) и острой (лимфоидные опухоли в висцеральных органах) формах.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Джулардов, Геннадий Викторович

выводы

Одиннадцать изолятов представляют патотип w, восемь изолятов — патотип vv+. Все изоляты обладали выраженной вирулентностью, и вызывали клинические признаки и патологоанатомические изменения, характерные для БМ у вакцинированного поголовья.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Джулардов, Геннадий Викторович, Москва

1. Бакулин, В.А. Болезни птиц. Болезнь Марека / В.А. Бакулин. Санкт-Петербург, 2006. С. 43-53.

2. Бисиешвили, А.И. Патоморфология нервной системы кур при болезни Марека / А.И. Бисиешвили, Г.В. Коновалов, Р.Н. Коровин // Ветеринария. -1979. № 8. - С. 43-45.

3. Болезни домашних и сельскохозяйственных птиц. Болезнь Марека / под общ. ред. Б.У. Калнека и др.. Эймс: Айова Стейт Юниверсити Пресс, 2003. - С. 426-465.

4. Виноградов, В.Н. Физико-химические и биологические свойства некоторых онкогенных вирусов. Патоморфология болезни Марека / В.Н. Виноградов, А.И. Павловская Рига: Зинатне, 1975. - С. 211—225.

5. Вирусные болезни животных. Болезнь Марека / под общ. ред. Сюрина В.Н. и др.. ВНИТИБП, Москва, 1998. С. 689-721.

6. Демкин, Г.П. Ветеринарно-санитарные меры по охране с.-х. животных и птицы. Эпизоотология, диагностика и профилактика острой формы болезни Марека у цыплят / Г.П. Демкин, Я.Д. Скатин Саратов, 1975. - С. 37-40.

7. Демкин, Г.П. Патоморфология, патогенез и диагностика болезней сельскохозяйственных животных. К патоморфологии острой болезни Марека у кур / Г.П. Демкин. Москва: «Колос», 1980. - С. 207-208.

8. Деревлева, Т.А. Применение вирус-вакцины против болезни Марека / Т.А. Деревлева, Р.А. Зубцова // Ветеринария. 1976. - № 6. - С. 53-54.

9. Дроздов, Б.И. Некоторые эпизоотологические особенности острой формы болезни Марека : Автореф. дис. . канд. биол. наук / Б.И. Дроздов. -Тарту, 1975. 22 С.

10. Дудникова, Е.К. Патотипирование полевых изолятов вируса болезни Марека методом "Best fit" / Е.К. Дудникова и др.. Вопр. вирусологии. -Москва, 2009. №1. - С. 36-41.

11. Енчев, С. Клинико-морфологични особености на пилета, експериментално заразени с щам HPRS-16 на марековата болеет / С. Енчев и др. // Вет.-мед. науки. 1977. - Т. 14, № 7. - С. 23-31.

12. Коровин, Р.Н. К диагностике острой формы болезни Марека : Тез. докл. 2-ой Всес. конф. молодых ученых по ветеринарии / Р.Н. Коровин и др..// 1971. С. 90-91.

13. Коровин, Р.Н. Эпизоотология острой формы болезни Марека / Р.Н. Коровин и др. //Ветеринария. 1972. - № 8. - С. 63-64.

14. Коровин, Р.Н. Характеристика штаммов вирусов острой формы болезни Марека / Р.Н. Коровин и др. // Ветеринария. 1973. - № 11. - С. 47-49.

15. Коровин, Р.Н. Биологический контроль вирус-вакцины против болезни Марека : Тез. докл. Всес. науч. конф. по вет. вирусологии / Р.Н. Коровин и др. //М., 1973. ч.1. - С. 150-151.

16. Коровин, Р.Н. Производственные испытания отечественной вирус-вакцины против болезни Марека / Р.Н. Коровин // Ветеринария. 1974. - № 12. - С. 54-55.

17. Коровин, Р.Н. Проблемы экспериментальной онкологии и лейкозов человека и животных. Современное состояние исследований в области эпизоотологии и иммунологии болезни Марека / Р.Н. Коровин М.: «Колос», 1979. С. 217-223.

18. Коровин, Р.Н. Опухолевые болезни птиц / Р.Н. Коровин, В.П. Зеленский. М.: «Колос», 1984. - С. 134-205.

19. Кудрявцев, Ф.С. Аэрозольная вакцинация цыплят при болезни Марека : Тез. 3-ей Всес. конф. по аэрозолям / Ф.С. Кудрявцев и др.. Ереван, 1977. -Т. 3. - С. 60.

20. Культивирование клеток и тканей животных / Л.П. Дьяконов и др.. -Ставрополь, 1986. С.41-42; 85-90.

21. Лукина, В.А., Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии / В.А. Лукина, И.А. Хорьков // Промышленное производство отечественной культуральной вирус-вакцины против болезни Марека : Тез. докл. 5-ой Всес. вет. вирусолог, конф. Казань, 1980. С. 125.

22. Мазуренко, Н.П. Изучение лимфомы Марека / Н.П. Мазуренко и др. // Вестник АМН СССР. 1972. - № 10. - С. 11-20.

23. Мазуренко Н.П. Создание живой вирусной вакцины против болезни Марека кур / Н.П. Мазуренко и др. // «Вирусы рака и лейкоза». М., 1975. -С. 105-107.

24. Мазуренко, Н.П. Влияние вакцинации кур против болезни Марека на содержание патогенного вируса в эпителии перьевых фолликулов / Н.П. Мазуренко, Л.С. Яковлева, И.В. Плахов // «Вирусы рака и лейкоза». М., 1975.-С. 144-146.

25. Медицинская вирусология. Герпесвирусы / под общ. ред. Д.К. Львова и др.. М.: Медицинское информативное агентство, 2008. - С. 260-266.

26. Научные основы производства ветеринарных препаратов / В.А. Лукина и др.. -М., 1989.-С. 55.

27. Нго, Т. Иммуноферментный анализ / Т. Нго и Г. Ленхофф. М.: Мир. 1988. - 446 с.

28. Никитин, Е.Е. Опыт приготовления вакцины против болезни Марека кур в промышленных условиях : Тез. докл Всес. межвуз. науч. конф. по вет. вирусологии / Е.Е. Никитин и др. // М., 1973. ч.1. - С. 148-149.

29. Пауэл, П. Болезнь Марека / П. Пауэл // Тез. докл. 9-го Междунар. симоз. по сравнит, изуч. лейкоза и родств. заболеваний, Сухуми (Пицунда), 1979.-С. 200.

30. Плахов, И.В. Изучение вакцинирующих свойств аттенуированного вируса лимфомы Марека в лабораторных условиях : автореф. дис. . канд. мед. наук / И.В. Плахов. Москва, 1978. - 21 С.,

31. Справочник ветеринарного лаборанта / под общ. ред. В.Я. Антонова. -М.; «Колос», 1981. С. 112-113.

32. Практикум по ветеринарной вирусологии / Н.И. Троценко, Р.В. Белоусова, Э.А. Преображенская. Изд. 2-е, исправ. - М.; Москва: «Колос», 2000 - С. 103—119. : ил. - (Учебники для вузов. Специальная литература).

33. Физико-химические и биологические свойства некоторых онкогенных вирусов. Выделение от индеек вируса герпеса, антигенно родственного вирусу болезни Марека / Лавров С.В. и др.. Рига: Зинатне, 1975. С. 186— 193.

34. Яковлева, JI.C. Изучение свойств штамма Кекава вируса болезни Марека в опытах на цыплятах / JI.C. Яковлева и др. // Вопросы вирусологии. 1973 - № 5. - С. 588-594.

35. A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens. Marek's disease / Swayne D.E. et al.. American Association of Avian Pathologists, 1998.-P. 116-124.

36. Anderson, D.P. Age susceptibility of chickens to Marek's disease / D.P. Anderson, C.S. Eidson and D.J. Richey // Am J Vet Rec. 1971. - № 32 - P. 935938.

37. Antin, P.B. Isolation and characterization of an avian miogenic cell line / P.B. Antin and C.P. Ordahl // Devel. Biology 1991. - № 143 - P. 111-121.

38. Basarab, O. Comparisons of cell-free and cell-associated Marek's disease vaccines in maternally immune chicks / O. Basarab and T. Hall // Vet Rec. 1976. - № 99. - P. 4-6.

39. Biggs, P.M. Marek's disease / P.M. Biggs et al. // 15th World's Poultry Congress, 1972.

40. Biggs, P.M. Marek's disease. In A.S. Kaplan (ed.). The Herpesviruses / P.M. Biggs. New York: Academic Press, 1973. - P. 557-594.

41. Biggs, P.M. Biological properties of a number of Marek's disease virus isolates / P.M. Biggs and B.S. Milne // Oncogenesis and Herpesviruses : IARC, Lyon, France, 1972. P. 88-94.

42. An enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibodies to Marek's disease virus / You-Quan Cheng et al. // Michigan. 1984. - Vol. 28, №4.-P. 900-910.

43. Buckmaster, A.E. Gene sequence and mapping data from Marek's disease virus and herpesvirus of turkeys-implications for herpesvirus classification / A.E. Buckmaster et al. // J Gen Virol. 1988. - № 69. - P. 2033-2042.

44. Bulow, V. Differentiation between strains of Marek's disease virus and turkey herpesvirus by immunofluorescence assays / V.V. Bulow and P.M. Biggs // Avian Pathol. 1975. - № 4. - P.133-146.

45. Bulow, V. Precipitating antigens associated with Marek's disease viruses and a herpesvirus of turkeys/ V.V. Bulow and P.M. Biggs // Avian Pathol. 1975. - № 4. - P.147-162.

46. Buscaglia, C.B.W. Effect of immunocompetence on the establishment and maintenance of latency with Marek's disease herpesvirus / C.B.W. Buscaglia, B.W. Calnek and K.A. Schat // J Gen Virol. 1988. - № 69. - P. 1067-1077.

47. Calnek, B.W. Marek's disease / B.W. Calnek et al. // In Diseases of Poultry, Iowa, 1972. P. 470.

48. Calnek, B.W. Genetic Resistance. In L.N. Payne (ed.). Marek's Disease / B.W. Calnek. Boston: Martinus Nijhoff, 1985. - P. 293-328.

49. Calnek, B.W. Survival and disinfection of Marek's disease virus and the effectiveness of filters in preventing airborne dissemination / B.W. Calnek and S.B. Hitchner // Poult Sci. 1973. - № 52. - P. 35-43.

50. Calnek, B.W. Feather follicle epithelium: A source of enveloped and infectious cell-free herpesvirus from Marek's disease / B.W. Calnek, H.K. Adidinger and D.E. Kahn // Avian Dis. 1970. - № 14. - p. 219-233.

51. Calnek, B.W. Lyophilization of cell-free Marek's disease herpesvirus and a herpesvirus from turkeys / B.W. Calnek, S.B. Hitchner and H.K. Adidinger // Appi Microbiol. 1970. - № 20. - P. 723-726.

52. Calnek, B.W. Pathogenicity of low-virulence Marek's disease viruses in normal versus immunologically compromised chickens / B.W. Calnek et al. // Avian Dis. 1977. - № 21. - P. 346-358.

53. Calnek, B.W. Comparative pathogenesis studies with oncogenic and nononcogenic Marek's disease viruses and turkey herpesvirus / B.W. Calnek et al. // Am J Vet Rec. 1979. - № 40. - P. 541-548.

54. Calnek, B.W. Modification of Marek's disease pathogenesis by in ovo infection or prior vaccination / B.W. Calnek, K.A. Schat and J. Fabricant. // Viruses in Naturally Occurring Cancers : Cold Spring Harbor, New York, 1980. -Vol. 7, P. 185-197.

55. Calnek, B.W. Latent infections with Marek's disease virus and turkey herpesvirus / B.W. Calnek, W.R. Shek and K.A. Schat // J Nati Cancer Inst. 1981. - № 66. - P. 585-590.

56. Calnek, B.W. Research note-field trials with a bivalent vaccine (HVT and SB-1) against Marek's disease / B.W. Calnek et al. // Avian Dis. 1983. - № 27. -P.844-849.

57. Cebrian, J. Inverted repeat nucleotide sequences in the genomes of Marek's disease virus and the herpesvirus ofJhe„ turkey. / J. Cebrian .et al. // Proc Nati

58. Acad Sci USA, 1982. № 79. - P. 555-558.

59. Cho, B.R. In vitro biological differences between the pathogenic and apathogenic Marek's disease herpesvirus / B.R. Cho // Avian Dis. 1976. - № 20. -P. 242-252.

60. Cho, B.R. Dual virus maturation of both pathogenic and apathogenic Marek's disease herpesvirus (MDHV) in the feather follicles of dually infected chickens / B.R. Cho // Avian Dis. 1977. - № 21. - P. 501-507.

61. Churchill, A.E. Immunization against Marek's disease using a live attenuated virus / A.E Churchill, L.N. Payne, and R.C. Chubb // Nature 1969. - №221 - P.744.747.

62. Cole, R.K. Natural resistance to Marek's disease: A review / R.K. Cole // Proc Int Symp Marek's Dis.: American Association of Avian Pathologists, Kennett Square, PA, 1985. P. 318-329.

63. Cole, R.K. Studies on genetic resistance to Marek's disease / R.K. Cole //Avian Disease/ 1968. - №12. - P. 9-28.

64. Cox, F.E.G. History of human parasitology / F.E.G. Cox // J Roy Soc Med. -1979.-№72.-P. 635.

65. Coussens, P.M. Structure and complete nucleotide sequence of the Marek's disease herpesvirus gp57-65 gene / P.M. Coussens and L.F. Velicer // J Virol. -1988. № 62. - P. 2373-2379.

66. Cui, Z.-Z. Marek's disease virus gene clones encoding virus-specific phosphory-lated polypeptides and serological characterization of fusion proteins / Z.-Z. Cui, Y. Ding and L.F. Lee // Virus Genes. 1990. - № 3. - P. 309-322.

67. Davidson, I. An improved ELISA method, using a streptavidin-biotin complex, for detecting Marek's disease .virus antigens in feather-tips of infectedchickens /1. Davidson et al. // Journal of Vir. Methods. 1986. - № 14. - P. 237241.

68. Davidson, F. Marek's disease: An involving problem / F. Davidson and Nair V. Institute for animal health, Compton laboratory, ELSEVIER Academic Press, UK, 2004.

69. Diseases of poultry. Marek's disease / B.W. Calnek and R.L. Witter. Ames, Iowa State University Press, 1991. P. 342-385.

70. Ellis, M.N. Serological responses to mycoplasma synoviae in chickens infected with virulent or avirulent strains of Marek's disease virus / M.N. Ellis et al. //Poult Sci. 1981. - № 60. - P. 1344-1347.

71. Fabricant, C.G. Virus-induced atherosclerosis / C.G. Fabricant et al. // J Exp Med. 1978. - № 148. - P. 335-340.

72. Gross, W.B. Effect of social stress on occurrence of Marek's disease in chickens / W.B. Gross // Am J Vet Rec. 1972. - № 33. - P. 2275-2279.

73. Gupta, S.K. Role of thymus-dependent immune system in HVT protection against Marek's disease / S.K. Gupta, M.U. Kharole, D.S. Kalra // Avian Diseases. 1982. - Vol. 26, № 1. - P. 7-13.

74. Han, P.F.S. The influence of restricted feed intake on the response of chickens to Marek's disease / P.F.S. Han and J.R. Smyth, Jr. // Poult Sci. 1972. -№51.-P. 986-991.

75. Higgins, D.A. Fowl immunoglobulins: Quantitation in birds genetically resistant and susceptible to Marek's disease / D.A. Higgins and B.W. Calnek // Infect Immun. 1975. - № 12. - P. 360-363.

76. Higgins, D.A. 1975. Fowl immunoglobulins: Quantitation and antibody activityduring Marek's disease .ingenetically resistant and susceptible birds/ D.A.

77. Higgins and B.W. Calnek // Infect Immun. 1975. - № 11. - P. 33-41.

78. Hirai, K. Comparative studies on Marek's disease virus and herpesvirus of turkey DNAs / K. Hirai, K. Ikuta and S. Kato // J Gen Virol. 1979. - № 45. - P. 119-131.

79. Hlozanek, I. Lack of pathogenicity of Marek's disease herpesvirus and herpesvirus of turkeys for mammalian hosts and mammalian cell cultures / I. Hlozanek and V. Sovova // Polia Biol. 1974. - № 20. - P. 51-58.

80. Igarashi, T. Restriction enzyme map of herpesvirus of turkey DNA and its collinear relationship with Marek's disease virus DNA / T. Igarashi et al. // Virology. 1987. - № 157. - P. 351-358.

81. Ikuta, K. Monoclonal antibodies specific to and cross-reactive with Marek's disease virus and herpesvirus of turkeys / K. Ikuta et al. // Biken. 1982. - № 25. -P. 171-175.

82. Jakowski, R.M. Hematopoietic destruction in Marek's disease / R.M. Jakowski et al. // Avian Dis. 1970. - № 14. - P. 374-385.

83. Jeurissen, S.H.M. Chicken anaemia virus influences the pathogenesis of Marek's disease in experimental infections depending on the dose of Marek's disease virus / S.H.M. Jeurissen and G.P. de Boer // Vet Q 1993. - № 14. - P. 8184.

84. Kaaden, O.R. Transfection studies in vitro and in vivo with isolated Marek's disease virus DNA / O.R. Kaaden // Oncogenesis and Herpesviruses III : IARC, Lyon, France, 1978. P. 627-634.

85. Kaleta, E.F. Possible causes of Marek's disease in HVT vaccinated chicken flocks / E.F. Kaleta // Clinica Veterinaria. 1978. - Vol. 101, № 5. - P. 238-250.

86. Kawamura, H. A herpesvirus isolated from kidney cell culture of normal turkeys / H. Kawamura et al. // Avian Dis. 1969. - №13 - P. 853-863.

87. Kenzy, S.G. Excretion of the Marek's disease agent by infected chickens / S.G. Kenzy and P.M. Biggs // Vet Rec. 1967. - №80. - P. 565-568.

88. Kenzy, S.G. Transmission of classical Marek's disease by affected and carrier birds / S.G. Kenzy and B.R. Cho // Avian Dis. 1969 - №13 - P. 211-214.

89. Komegay, J.N. Marek's disease virus-induced transient paralysis: Clinical and electrophysiologic findings in susceptible and resistant lines of chickens / J.N. Komegay et al. //Am J Vet Rec. 1983. - № 44. - P. 1541-1544.

90. Lee, L.F. Size and composition of Marek's disease virus deoxyribonucleic acid / L.F. Lee et al. // J Virol. 1971. - № 7. - P. 289-294.

91. Lee, L.F. Suppression of mitogen-induced proliferation of normal spleen cells by macrophages from chickens inoculated with Marek's disease virus / L.F. Lee et al. //J Immunol. 1978. - № 120. - P. 1554-1559.

92. Lee, L.F. Monoclonal antibodies with specificity for three different serotypes of Marek's disease viruses in chickens / L.F. Lee, X. Liu and R.L. Witter //JImmunol. 1983.-№ 130.-P. 1003-1006.

93. Lesnik, F. Immunization against Marek' s disease using virus-specific antigens free from infectious virus / F. Lesnik and L. J. N. Ross // Folia Microbiol.- 1976.-№21.-P. 252.

94. Liberona P. Marek's . still a threat! / P. Liberona et al. // Poultry Adviser.- 1990.-Vol. 23, № l.-P. 65-71.

95. Marek, J. Multiple Nervenentzuendung (Polyneuritis) bci Huchnern / J. Marek //Dtsch Tierarztl Wochenschr. 1907. - № 15. - P. 417-421.

96. Mason, R.J. Marek's disease: Resistance of turkey herpesvirus-infected chicks against lethal JM-V agent / R.J. Mason and K.E. Jensen // Am J Vet Rec. -1971.-№32.-P. 1625-1627.

97. Markowski-Grimsrud, C.J. Developmentofstrain7specific-real-time PCRand RT-PCR assay for quantitation of chicken anemia virus / C.J. Markowski-Grimsrud, M.M. Miller and K.A. Schat // Journal of Virol Methods- 2002. № 101.-P. 135-147.

98. Minick, C.R. Atheroarteriosclerosis induced by infection with a herpesvirus / C.R. Minick et al. // Am J Pathol. 1979. - № 96. - P. 673-706.

99. Moscovici, C. Continuous tissue culture cell lines derived from chemically induced tumors of Japanese quail / C. Moscovici et al. and Michael M.C. Lai [et al.] // Cell. 1977. - Vol. 11 - P. 95-103.

100. Naciri, M. Interactions of Cryptosporidia and savage or vaccinal virus in Marek's diseases in chickens / M. Naciri, O. Mazzella and F. Coudert // Rec Med Vet. 1989. - № 165. - P. 383-387.

101. Naito, M. Demonstration of a Marek's disease virus-specific antigen in tumour lesions of chickens with Marek's disease using monoclonal antibody against a virus phosphorylated protein / M. Naito et al. // Avian Pathol.- 1986. -№ 15.-P. 503-510.

102. Nazerian, K. Protection against Marek's disease by a fowlpox virus recombinant expressing the glycoprotein В of Marek's disease virus / K. Nazerian et al. // J Virol. 1992. - № 66. - P. 1409-1413.

103. Nicholls, T.J. Marek's disease in sixty week-old laying chickens / T.J. Nicholls // Aust Vet J. 1984. - № 61. - P. 243.

104. Okazaki, W. Protection against Marek's disease by vaccination with a herpesvirus of turkeys / W. Okazaki, H.G. Purchase and B.R. Bunnester // Avian Dis. 1970. - № 14. - P. 413-429.

105. Ono, M. The restriction endonuclease map of Marek's disease virus (MDV) serotype 2 and collinear relationship among three serotypes of MDV / M. Ono et al. // Virology. 1992. - № 191. - P. 459-463.

106. Otaki, Y. Depression of vaccinal immunity to Marek's disease by infection with chicken anemia agent / Y. Otaki et al. // Avian Pathol. 1988. - № 17. - P. 333-347.

107. Patracku, I.V.JJse,of Japanese quail embryo fibroblast cells for propagationand assay of turkey herpesvirus FC-126 / I.V. Patracku and B.W. Calnek // Avian Dis. 1970-№14. -P. 413.

108. Paul, P. Preliminary observations on egg transmission of turkey herpesvirus (HVT) in turkeys / P. Paul et al. // Avian Dis. 1972. - № 16 - P. 27-33.

109. Payne, L.N. Studies on Marek's disease. II. Pathogenesis / L.N. Payne and P.M. Biggs // J Nati Cancer Inst. 1967. - №39. - P. 281-302.

110. Payne, L.N. Pathogenesis of Marek's disease in chicks with and without maternal antibody / L.N. Payne and M. Rennie // J Nati Cancer Inst. 1973. - № 51.-P. 1559-1573.

111. Payne, L.N. Pathogenesis of Marek's disease / L.N. Payne, J.A. Frazier and P.C. Powell // Int Rev Exp Pathol. 1976. - № 16.- P. 59-154.

112. Payne, L.N. Transient effect of cyclophosphamide on vaccinal immunity to Marek's disease / L.N. Payne et al. // Avian Pathol. 1978. - № 7. - P. 295-304.

113. Phillips, P.A. Course of infection in tissues of susceptible chickens after exposure to strains of Marek's disease virus and turkey herpesvirus / P.A. Phillips and P.M. Biggs // J Nati Cancer Inst. 1972. - № 49. - P. 1367-1373.

114. Powell, P.C. Dissociation of antiviral and antitumor immunity in resistance to Marek's disease / P.C. Powell and J.G. Rowell // J Nati Cancer Inst. 1977. - № 59.-P. 919-924.

115. Prasad, L.B.M. Isolation of Marek's disease herpesvirus of low pathogenicity from commercial chickens / L.B.M. Prasad, J. Scott and P.B. Spradbrow // Aust Vet J. 1977. - № 53. - P. 405-406.

116. Pratt, W.D.* Characterization of reticuloendotheliosis virus-transformed avian T-lymphoblastoid cell lines infected with Marek's disease virus / W.D. Pratt, R.W. Morgan and K.A. Schat // J Virology. 1992. - № 66. - P. 7239-7244,

117. Purchase, H.G. Effect of vaccination with herpesvirus of turkeys (HVT) on horizontal spread of Marek's disease herpesvirus / H.G. Purchase, W. Okazaki // Avian Diseases. 1971. - Vol. 15, № 2. - P. 391-397.

118. Purchase, H.G. Role of herpesviruses in the Marek's Disease, a malignant lymphoma of chickens / H.G.Purchase,Jet ,al. .//„Oncogenesis, and-herpesviruses,1972.-№31.-P. 1634-1638.

119. Purchase, H.G. Long-term field trials with the herpesvirus of turkeys vaccine against Marek's disease / H.G. Purchase, W. Okazaki, B.R. Burmester // Avian Diseases. 1972. - Vol. 16, № 1. - P. 57-71.

120. Purchase, H.G. Clinical disease and its economic impact / H.G. Purchase // Marek's Disease : Martinus NijhofT, Boston, MA, 1985. P. 17-24.

121. Purchase, H.G. Characterization of five isolates of Marek's disease / H.G. Purchase and P.M. Biggs // Res Vet Sci. 1967. - №8. - P. 440-449.

122. Purchase, H.G. The differential diagnosis of lymphoid leukosis and Marek's disease (slide study set) / H.G. Purchase and J.M. Sharma // American Association of Avian Pathologists, Kennett Square, PA. 1970.

123. Purchase, H.G. Amelioration of Marek's disease and absence of vaccine protection in immunologically deficient chickens / H.G. Purchase and J.M. Sharma //Nature. 1974. - № 248. - P. 419-421.

124. Rispens, B.H. Control of Marek's disease in the Netherlands. I. Isolation of an avirulent Marek's disease virus (strain CVI988) and its use in laboratory vaccination trials / B.H. Rispens et al. // Avian Dis. 1972. - № 16. - P. 108-125.

125. Riddell, C. Herpes virus of turkey vaccine: Viraemias in field flocks and in experimental chickens / C. Riddell, B.S. Milne, P.M. Biggs // Veterinary Record. -1978. Vol. 102, № 6. - P. 123-126.

126. Schat, K.A. Characteristics of the virus / K.A. Schat // Marek's Disease : Martinus Nijhoff, Boston, MA, 1985. P. 77-112.

127. Schat, K.A. Characterization of an apparently nononcogenic Marek's disease virusXK.A.^Schat and B.W. Calnek //XNati Cancer Inst. --1978. № 60. - P.1075-1082.

128. Schat, K.A. Marek's disease / K.A. Schat // Proc 19th World's Poultry Congress, Amsterdam, Netherlands, 1992. P. 233.

129. Schat, K.A. Characterisation of two highly oncogenic strains of Marek's disease virus / K.A. Schat, B.W. Calnek and J. Fabricant // Avian Pathol. 1982. -№ 11.-P. 593-605.

130. Schumacher, D. Generation of a permanent cell line that supports efficien growth of Marek's disease virus (MDV) by constitutive expression of MDV glycoprotein E / D. Schumacher et al. // J Gen Virol. 2002. - № 83. - P. 19871992.

131. Scott, S.D. Identification and sequence analysis of the homologs of the herpes simplex virus type 1 glycoprotein H in Marek's disease virus and the herpesvirus of turkeys / S.D. Scott et al. // J Gen Virol. 1993. - № 74. - P. 11851190.

132. Sevoian, M. The effects of JM and JM-V leukosis strains on chicks vaccinated with herpes virus of turkeys (HVT) / M. Sevoian and C.R. Weston // Poult Sci. 1972. -№ 51. - P. 513-516.

133. Sevoian, M. Avian lymphomatosis. I. Experimental reproduction of the neural and visceral forms / M. Sevoian, D.M. Chamberlain and F.T. Counter // Vet Med. 1962. - №57. - P. 500-501.

134. Sharma, J.M. Marek's disease / J.M. Sharma // A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens : 3 rd American Association of Pathologists, New Bolton Center, PA, 1989. P. 89-94.

135. Shanna, J.M. Genetic resistance to Marek's disease. Delineation of the response of genetically resistant chickens to Marek's disease virus infection / J.M. Shanna and H.A. Stone // Avian Dis. 1972. - № 16. - P. 894-906.

136. Sharma, J.M. Absence of age-resistance in neonatally thymectomised chickens as evidence for cell-mediated immune surveillance in Marek's disease / J.M. Shanna, R.L. Witter and H.G. Purchase // Nature. 1975. № 253. - P. 477479. . . .

137. Siccardi, FJ. The differential diagnosis of lymphoid leukosis and Marek's disease / F.J. Siccardi and B.R. Burmester // USDA, Tech Bull 1412, Washington, DC, 1970.

138. Solomon, J.J. Studies on the etiology of Marek's disease. I. Propagation of the agent in cell culture / J.J. Solomon et al. // Proc Soc Exp Biol Med. 1968. -№127.-P. 173-177.

139. Swayne, D.E. Marek's disease virus-induced transient paralysis in chickens: Alterations in brain density / D.E. Swayne, O.J. Fletcher and L.W. Schierman // Acta Neuropathol. 1988. - № 76. - P. 287-291.

140. Theis, G.A.'Effects of lymphocytes from Marek's disease-infected chickens on mitogen responses of syngeneic normal chicken spleen cells / G.A. Theis // J Immunol. 1977. - № 118. - P. 887-894.

141. Waseem, M. Detection of infective agents from tissues of birds having Marek's disease like disease syndrome / M. Waseem, R.C. Pathak, D.P. Singh // Ind. J. Experimental Biology. 1977. - Vol. 15, № 11. - P. 1053-1059.

142. Witter, R.L. Studies on the epidemiology of Marek's disease herpesvirus in broiler flocks / R.L. Witter et al. // Avian Diseases. 1970. - Vol. 14, № 12. — P. 255-267.

143. Witter, R.L. Experimental infection of turkeys and chickens with a herpesvirus of turkeys (HVT) / R.L. Witter, J.J. Solomon // Avian Diseases. -1972. Vol. 16, № 1. - P. 34-44.

144. Witter, R.L. Polyvalent Marek's disease vaccines: safety, efficacy and protective synergism in chickens with maternal antibodies / R.L. Witter, L.F. Lee // Avian Pathology. 1984. - Vol. 13, № 1. - P. 75-92.

145. Witter, R.L. Epidemiology of Marek's disease A review / R.L. Witter // Oncogenesis and Herpesviruses : IARC, Lyon, France, 1972. - P. 111-122.

146. Witter, R.L. Protection by attenuated and polyvalent vaccines against highly virulent strains of Marek's Disease virus / R.L. Witter // Avian Pathol. 1982. - № 11.-P. 49-62.

147. Witter, R.L. Association „in broiler chickens-between natural serotype 2

148. Marek's disease virus infection and leukosis condemnations / R.L. Witter // Proc Int Symp : Marek's Disease, American Association of Avian Pathologists, Kennett Square, PA, 1985. P. 545-554.

149. Witter, R.L. Very virulent Marek's disease viruses: Importance and control / R.L. Witter // In Proc 18th World's Poultry Congress : World's Poultry Congress, Nagoya, Japan, 1988. P. 92-97.

150. Witter, R.L. Epidemiology of a herpesvirus of turkeys: Possible sources and spread of infection in turkey flocks / R.L. Witter and J.J. Solomon // Infect Immun.- 1971.-№4. -P. 356-361.

151. Witter, R.L. Prospects for the control of Marek's disease through isolation rearing / R.L. Witter and J.J. Solomon // Progr Immunobiol Stand. 1972. - №5. -P. 163-168.

152. Witter, R.L. Survival of Marek's disease agent in litter and droppings / R.L. Witter, G.H. Burgoyne and B.R. Bunnester // Avian Dis. 1968. - №12 - P. 522530.

153. Witter, R.L. Cell culture techniques for primary isolation of Marek's disease-associated herpesvirus / R.L. Witter, J.J. Solomon and G.H. Burgoyne // Avian Dis. 1969.-№13.-P. 101-118.

154. Witter, R.L. Isolation from turkeys of a cell-associated herpesvirus antigenically related to Marek's disease vims / Witter R.L. et al. // Am J Vet Rec.- 1970. -№31. P. 525-538.

155. Witter, R.L. Pathogenicity of variant Marek's disease virus isolants in vaccinated and unvaccinated chickens / R.L. Witter, J.M. Sharma and A.M. Fadly // Avian Dis. 1980. - № 24. - P. 210-232.

156. Witter, R.L. Characteristics of Marek's disease viruses isolated from vaccinated commercial flocks: association of viral pathotype with lymphoma frequency / R.L. Witter // Avian Diseases. 1983. - № 27. - P. 113-132.

157. Witter, R.L. Nonhursal lymphomas induced by nondefective reticuloendotheliosis vims / R.L. Witter, J.M. Sharma and A.M. Fadly // Avian Pathol. J986.-№ 15.- P. 467^486. .

158. Witter, R.L. New serotype 2 and attenuated serotype 1 Marek's disease vaccine viruses. Selected biological and molecular characteristics / R.L. Witter, R. Silva and L. Lee //Avian Dis. 1987. - № 31. - P. 829-840.

159. Witter, R.L. Biological diversity among serotype 2 Marek's disease viruses / R.L. Witter, L.P. Lee and J.M. Sharma // Avian Dis. 1990. - № 34. - P. 944-957.

160. Witter, R.L. Characteristics of CVI988/Rispens and R2/23, two prototype vaccine strains of serotype 1 Marek's disease virus / Witter R.L., L.F. Lee and A.M. Fadly // Avian Diseases. 1995. - № 39. - P. 269-284.

161. Witter, R.L. Increased virulence of Marek's disease virus field isolates / Witter R.L. // Avian Diseases. 1997. - № 41. - P. 149-163.

162. Witter, R.L. An acute form of transient paralysis induced by highly virulent strains of Marek's disease virus / Witter R.L. et al. // Avian Diseases. 1999. - № 43. - P. 704-720.

163. Witter, R.L. Classification of Marek's disease virus according to pathotype -philosophy and methodology / Witter R.L. et al. // Avian Pathology. 2005. - № 31.-P. 525-538.

164. Yoshida, S. The glycoprotein В genes of Marek's disease virus serotypes 2 and 3: Identification and expression by recombinant fowlpox viruses / S. Yoshida et al. // Virology. 1994. - № 200. - P. 484-493.

165. Zander, D.V. The use of blood from selected chickens as an immunizing agent for Marek's disease / D.V. Zander et al. // Avian Dis. 1972. - № 16. - P. 163-178.

166. S219. Zelnik, V. The genome of turkey of herpesvirus / V. Zelnik et al. // J Gen Virol. 1995. - №76. - P. 2903-2907.

167. Zelnik, V. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELIS A) for detection of Marek's disease virus-specific antibodies and its application in an experimental vaccine trial / V. Zelnik et al. // J Vet Med. 2004. - № 51. - P. 61-67.

168. Zygraich, N. Inoculation of one-day-old chicks with different strains of turkey herpesvirus. II. Virus replication in tissues of inoculated animals / N. Zygraich, C. Huygelen !LAvian Diseases. 1972. - Vol. 16, № 4. - P. 793-798.

Информация о работе

Джулардов, Геннадий Викторович
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.06

Диссертация

Биологические свойства природных изолятов вируса болезни Марека, циркулирующих на территории Российской Федерации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы