Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация вируса болезни Марека методом полимеразной цепной реакции

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Полехин, Сергей Владимирович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Общая характеристика болезни Марека.

2.2. Классификация возбудителя.

2.3. Морфологические особенности вируса болезни Марека.

2.4. Репликация вируса болезни Марека.

2.5. Антигенная вариабельность вируса болезни Марека.

2.6. Свойства некоторых белков, кодируемых ДНК вируса болезни Марека.

2.7. Диагностика болезни Марека.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация вируса болезни Марека методом полимеразной цепной реакции"

Актуальность темы. Болезнь Марека (БМ) - высококонтагиозное, неопластическое, лимфопролиферативное вирусное заболевание кур и индеек, проявляющееся в двух формах: классической (поражение периферической и центральной нервной системы) и острой (лимфоидный лейкоз).

Возбудителем заболевания является вирус, принадлежащий к семейству Herpesviridae [168]. На основе данных серологических исследований Bulow и Biggs [37, 38] определили три серотипа вируса болезни Марека. Серотип 1 включает все онкогенные вирусы и их аттенуированные варианты, серотип 2 -все неонкогенные вирусы, серотип 3 - антигенно-родственные вирусу БМ вирусы герпеса индеек (ВГИ). Серологическая классификация подтверждена на генетическом уровне сравнительными исследованиями фрагментов вирусных ДНК при обработке нуклеиновых кислот рестриктазами [44]. Кроме того, вирусы БМ серотипа 1 по степени вирулентности для птиц подразделяются на высоковирулентные, вирулентные и слабовирулентные штаммы [219].

Болезнь Марека является одним из наиболее распространенных заболеваний кур, встречается во всех странах мира [12] и наносит значительный экономический ущерб промышленному птицеводству.

До конца 1980-х гг. профилактика с использованием живых вакцин, полученных на основе герпесвируса индеек [161, 165], обеспечивала эффективную защиту птицы от БМ. Но, в последнее время, в связи с появлением новых высоковирулентных штаммов вируса, которые способны вызывать заболевание даже у вакцинированной птицы [218], в состав вакцин стали включаться авирулентные и аттенуированные штаммы ВБМ серотипа 1 и штаммы ВБМ серотипа 2 [220]. Кроме того, серьезной проблемой, препятствующей искоренению этой инфекции, является способность вируса длительное время персистировать в организме птиц, не вызывая заболевания. В связи с этим, особое значение приобретают вопросы диагностики болезни Марека.

В настоящее время диагностика болезни Марека включает: патологоанатомические и гистологические исследования; обнаружение антигена в эпителии перьевых фолликулов в РДП; выделение вируса на куриных эмбрионах, культурах клеток с последующей идентификацией его в РДП; биопробу на суточных цыплятах с целью определения патогенности выделенного вируса и выявление антител в сыворотке крови в РДП и ИФА.

Основными проблемами, затрудняющими выявление и идентификацию вируса болезни Марека общепринятыми серологическими методами, являются одновременная персистенция вирулентных и авирулентных штаммов в организме птицы, а также способность вируса длительное время находится в латентной форме [4]. Это определяет необходимость совершенствования имеющихся и разработки новых, более эффективных средств диагностики болезни Марека, что предполагает прежде всего быстроту проведения реакций, повышение их чувствительности, а также возможность не только выявлять, но и идентифицировать вирус.

В последнее время для диагностики вирусных заболеваний широко используется полимеразная цепная реакция (ПЦР). Эта реакция превосходит другие методы по скорости, специфичности и чувствительности.

Метод ПЦР применяется в вирусологии для диагностики многих инфекционных заболеваний, в том числе и болезни Марека. Разработаны методы на основе ПЦР с праймерами на ген gC, позволяющие дифференцировать ВБМ серотипа 1 и ВГИ [20, 231, 233]. Недостатком этих методов является невозможность идентификации ВБМ серотипа 2. Изучалась возможность применения ПЦР для дифференциации онкогенных и не о нко генных штаммов ВБМ серотипа 1 [20, 194, 233], но полученные данные противоречат данным других исследователей [172].

Таким образом, до настоящего времени не было разработано универсального метода дифференциации штаммов вируса БМ всех трех серотипов, а также метода дифференциации вакцинных и патогенных штаммов ВБМ серотипа 1.

Возможность применения ПЦР и нуклеотидного секвенсирования для индикации и идентификации вируса БМ определяются степенью изученности вируса и наличием данных о нуклеотидных последовательностях генов, что позволяет выявить наиболее вариабельные фрагменты генома и разработать тест-систему для индикации и идентификации вируса.

Все перечисленные вопросы являются актуальными, требующими своего разрешения, и послужили основной предпосылкой для проведения исследований по данной теме.

Цель и задачи исследования. Основная цель данных исследований заключалась в разработке метода индикации и идентификации вируса БМ и проведении сравнительного генетического анализа между штаммами вируса.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать метод индикации генома вируса болезни Марека в различных вируссодержащих материалах с помощью ПЦР;

- разработать метод серотипирования вируса БМ на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования вариабельных фрагментов генов gB и тимидинкиназы;

- провести анализ нуклеотидных последовательностей вариабельных областей генов gB и тимидинкиназы изолятов вируса БМ, выделенных в России и странах СНГ, а также вакцинных и патогенных штаммов вируса;

- изучить возможность дифференциации онкогенных и неонкогенных штаммов вируса БМ серотипа 1 на основе ПЦР с праймерами, ограничивающими область инвертированных повторов генома;

- разработать метод дифференциации вакцинных и патогенных штаммов вируса БМ серотипа 1 на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования фрагмента гена рр38;

- провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена рр38 полевых изолятов вируса БМ, выделенных на территории России и стран СНГ, а также отечественных и зарубежных вакцинных и патогенных штаммов.

Научная новизна исследования. Впервые разработан метод на основе ПЦР с праймерами на ген gB, позволяющий проводить индикацию генома и серотипирование вируса БМ в различных вируссодержащих материалах без предварительного выделения вируса.

Определены нуклеотидные последовательности вариабельного фрагмента гена gB 37 полевых изолятов вируса БМ, выделенных на птицефабриках России и стран СНГ в 1996-2001 гг., и 9 отечественных и зарубежных вакцинных и патогенных штаммов.

Определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена рр38 19 полевых изолятов вируса БМ и 5 отечественных и зарубежных вакцинных и патогенных штаммов ВБМ серотипа 1.

Создан банк данных нуклеотидных и соответствующих аминокислотных последовательностей фрагментов генов gB и рр38 вируса БМ.

Практическая значимость исследования. На основании проведенных исследований разработана "Методика индикации генома вируса болезни Марека птиц различных серотипов методом полимеразной цепной реакции и секвенированием фрагмента гена gB", утвержденная директором ВНИИЗЖ.

Эта методика включена в "Методические указания по диагностике вирусных болезней животных методом полимеразной цепной реакции", утвержденные департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ.

На основе прямого секвенирования разработан метод, позволяющий в течение 2-3 дней определять точечные мутации в амплифицированном фрагменте гена рр38 и проводить дифференциацию вакцинных и патогенных штаммов вируса БМ серотипа 1.

Методом прямого секвенирования амплифицированных фрагментов гена рр38 проведена идентификация 19 полевых изолятов вируса БМ, а также 5 отечественных и зарубежных вакцинных и патогенных штаммов.

Результаты исследований патологических материалов из птицехозяйств использовались при постановке диагноза на болезнь Марека и в практических рекомендациях по профилактике заболевания.

Публикация научных исследований. По теме научных исследований опубликовано 5 научных работ.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на научно-практической конференции "Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных", ВНИИЗЖ, г. Владимир (1997 г.), на научно-практической конференции "Современные аспекты ветеринарной патологии животных", посвященной 40-летию ВНИИЗЖ, г. Владимир (1998 г.) и на XI Международном конгрессе вирусологов, 9-13 августа 1999 г., Сидней, Австралия.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 136 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и приложение. Список литературы включает 233 источника, из них 16 работ на русском языке. Работа иллюстрирована 26 рисунками и 11 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Полехин, Сергей Владимирович

6. ВЫВОДЫ

1. Разработан метод индикации генома и серотипирования вируса болезни Марека с использованием "nested"- ПЦР с универсальными и серотипоспецифическими праймерами на ген gB в различных вируссодержащих материалах.

2. Сравнительный анализ первичных структур вариабельной области гена gB 37 полевых изолятов и 9 вакцинных и патогенных штаммов вируса БМ показал, что распределение штаммов и изолятов на генетические группы четко коррелирует с серологической классификацией вируса и результатами серотипирования методом "nested"- ПЦР.

3. С использованием ПЦР установлено отсутствие четкой корреляции между количеством копий повторов генома длиной 132 п.н. и онкогенностью вируса болезни Марека, что не позволяет проводить дифференциацию онкогенных и неонкогенных штаммов вируса серотипа 1.

4. На основе прямого секвенирования разработан метод, позволяющий в течение 2-3 дней определять точечные мутации в амплифицированном фрагменте гена рр38 и проводить дифференциацию вакцинных и патогенных штаммов вируса БМ серотипа 1.

5. В результате исследования патологического материала из 53 птицехозяйств в 37 пробах был выявлен геном вируса БМ серотипа 1, что указывает на широкое распространение вируса.

6. В 13 полевых пробах был выявлен геном вируса БМ всех трех серотипов, что свидетельствует об одновременной персистенции вирулентных и авирулентных штаммов в организме птицы.

7. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена рр38 19 исследованных изолятов вируса БМ серотипа 1 показал, что они идентичны референтным вирулентным штаммам вируса.

110

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагается:

1. "Методика индикации генома вируса болезни Марека птиц различных серотипов методом полимеразной цепной реакции и секвенированием фрагмента гена gB", одобренная ученым советом и утвержденная директором ВНИИЗЖ 21.01.97., которая применяется для идентификации вновь выделенных изолятов вируса БМ из патматериала, поступающего из различных птицефабрик России и стран СНГ.

Данная методика включена в "Методические указания по диагностике вирусных болезней животных методом полимеразной цепной реакции", утвержденные департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ в 1998 г.

2. Создан банк данных нуклеотидных последовательностей фрагментов генов §В и рр38 отечественных и зарубежных изолятов и вакцинных штаммов вируса болезни Марека, что позволяет проводить сравнительный анализ и идентификацию вновь выделенных изолятов вируса.

Ill

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей разных штаммов вируса БМ был использован для выбора участка генома, позволяющего проводить индикацию, серотипирование и штаммовую дифференциацию. Нами выбрано четыре разных участка для амплификации в ПЦР: вариабельная область гена тимидинкиназы для дифференциации вирусов БМ серотипов 1 и 3, вариабельная область гена гликопротеина В ^В) для индикации и серотипирования вируса БМ, область инвертированных повторов генома длиной 132 п.н. для дифференциации онкогенных и неонкогенных штаммов вируса БМ серотипа 1 и фрагмент гена фосфопротеина 38 (рр38) для дифференциации вакцинных и патогенных штаммов вируса БМ серотипа 1.

Анализ нуклеотидных последовательностей гена тимидинкиназы штаммов вируса БМ разных серотипов позволил выявить наиболее вариабельную область. В результате проведенного анализа выбраны две пары серотипспецифических праймеров, гомологичные относительно консервативным участкам, фланкирующим вариабельную область гена gB.

Анализ нуклеотидных последовательностей гена gB 5 штаммов вируса БМ, относящихся к разным серотипам, позволил выявить область, характеризующуюся максимальной вариабельностью. В результате проведенного анализа последовательностей гена gB были выбраны пара общетиповых и 3 пары серотипспецифических праймеров для "nested''-ПЦР, гомологичные относительно консервативным участкам, фланкирующим вариабельную область гена gB.

Для дифференциации онкогенных и неонкогенных штаммов вируса БМ серотипа 1 нами использована пара праймеров, фланкирующих область инвертированных повторов длиной 132 п.н., предложенные Silva (1992). Относительно этих праймеров нами выбрана пара внешних праймеров для "nested" ПЦР.

Анализ нуклеотидных последовательностей гена рр38 штаммов вируса БМ серотипа 1 позволил выявить точечные мутации, позволяющие дифференцировать вакцинные и патогенные штаммы. В результате выбраны пара внешних и пара внутренних праймеров для "гнездовой" ПЦР, фланкирующие вариабельную область гена рр38.

Проведено сравнение фенольного метода выделения ДНК в модификации Аминева и соавт. [1] и метода выделения ДНК на фильтрах GF/F [6]. Показано, что метод выделения ДНК на фильтрах GF/F не уступал фенольному методу по количественному выходу и превосходил его по скорости и технической простоте.

С использованием ДНК, выделенной из концентрированного и очищенного вируса БМ, был осуществлен подбор оптимального температурно-временного режима для ПЦР, а также концентраций компонентов реакций.

Отработана методика амплификации в ПЦР фрагмента гена тимидинкиназы с серотипспецифическими праймерами, которая позволяет идентифицировать вирусы БМ серотипов 1 и 3.

Отработана методика амплификации в ПЦР фрагмента гена gB с общетиповыми праймерами, которая использовалась для индикации вируса БМ в инфицированных куриных эмбрионах, внутренних органах инфицированных птиц, образцах вакцинных и вирулентных препаратов. Кроме того, отработана постановка "nested"- ПЦР с серотипоспецифическими праймерами, которая позволяет определять серотип выявленного вируса.

Для определения нуклеотидной последовательности вариабельной области генов gB и тимидинкиназы нами использовался метод циклического секвенирования, который отличается скоростью и технической простотой анализа. Метод ПЦР и прямого секвенирования амплифицированных фрагментов ДНК вируса БМ был использован для выявления спектра штаммов вируса, циркулирующих на птицефабриках России. Определена первичная структура вариабельной области генов gB и тимидинкиназы 22 изолятов вируса БМ.

Для оценки возможности проведения штаммовой дифференциации с помощью сравнительного анализа первичной структуры выбранной нами вариабельной области мы попытались использовать нуклеотидные последовательности генов gB и тимидинкиназы.

Филогенетический анализ последовательностей вариабельной области гена gB штаммов вируса БМ из базы данных EMBL показал, что они образуют три генетические группы и их распределение коррелирует с серологической классификацией. Таким образом, было показано, что анализ последовательностей выбранной нами вариабельной области гена gB отражает общую структуру филогенетических связей, полученную при анализе последовательностей полного гена gB и серологическую классификацию изученных штаммов.

Нуклеотидные и соответствующие аминокислотные последова-тельности вариабельной области гена gB исследованных изолятов и вакцинных штаммов сравнили между собой и с последовательностями, опубликованными EMBL.

На основе гомологии первичной структуры вариабельной области гена gB можно выделить три группы. В первую группу вошли вакцинные штаммы, относящиеся к герпесвирусу индеек (серотип 3), которые имеют максимальную степень отличий от всех исследованных штаммов (от 26 до 30 %). Во вторую группу вошли штаммы и изоляты, относящиеся к серотипу 2, и в третью группу вошли штаммы и изоляты, относящиеся к серотипу 1.

Таким образом, на нуклеотидном и аминокислотном уровне все исследованные штаммы и изоляты можно разделить на 3 группы, достаточно удаленные друг от друга, что полностью соответствует разделению вируса БМ на 3 серотипа. Результаты секвенирования вариабельного фрагмента гена gB полностью совпадают с результатами серотипирования вируса БМ методом "пез1есГ-ПЦР.

Важной проблемой в диагностике болезни Марека является дифференциация штаммов внутри серотипа. Сравнительный анализ показал, что штаммы и изоляты вируса БМ, относящиеся к одному серотипу, имеют идентичные первичные структуры вариабельного фрагмента гена gB, что не позволяет проводить штаммовую дифференциацию. Исключением являются штаммы БС-126 и ВНИИЗЖ, которые относятся к вирусам серотипа 3. Шт. ВНИИЗЖ по сравнению со шт. РС-126 имеет 3 нуклеотидные замены, но изменения нуклеотидной последовательности фрагмента гена §В не приводят к соответствующим аминокислотным изменениям и не являются значимыми.

Филогенетический анализ последовательностей вариабельной области гена тимидинкиназы штаммов вируса БМ серотипов 1 и 3 из базы данных ЕМВЬ показал, что они образуют две генетические группы и их распределение коррелирует с серологической классификацией.

Нуклеотидные и соответствующие аминокислотные последова-тельности вариабельной области гена тимидинкиназы исследованных изолятов и штаммов сравнили между собой и с последовательностями, опубликованными ЕМВЬ. Сравнительный анализ показал, что все имеющиеся штаммы и изоляты разделены на две группы, что соответствует двум серотипам ВБМ (серотипам 1 и 3), и имеют 41 % различий. Но недостатком этого метода является отсутствие возможности индикации генома штаммов вируса БМ серотипа 2 в связи с отсутствием данных о нуклеотидной последовательности гена тимидинкиназы какого-либо штамма данного серотипа ВБМ. Кроме того, определение первичной структуры вариабельного фрагмента тимидинкиназы не позволяет проводить дифференциацию штаммов вируса БМ внутри серотипов, но может быть использовано для подтверждения серотипирования.

Многие исследователи сообщают о довольно четкой корреляции между онкогенностью вирусов БМ серотипа 1 и количеством повторов длиной 132 п.н., локализованных в области инвертированных повторов генома. Для определения количества копий повторов длиной 132 п.н. нами использована пара праймеров, фланкирующих данную область, предложенная Silva [194], в дополнение к которым нами рассчитана пара внешних праймеров для "nested''-ПЦР.

С использованием разработанной системы были амплифицированы фрагменты ДНК области инвертированных повторов генома 2 вакцинных и 3 патогенных штамма, относящихся к серотипу 1. По результатам ПЦР показано, что геном патогенных штаммов Конкур, Кекава-55 и HPRS-16 содержит 2 копии повтора длиной 132 п.н., что характерно для онкогенных вирусов БМ, а геном вакцинных штаммов CVI-988 и 3004 помимо 4-х и более копий повтора, что характерно для неонкогенных штаммов, содержит 1-3 копии повторов, что говорит о гетерогенности вирусной популяции. Это совпадает с данными других исследователей [194]. При исследовании штаммов SB-1 и FC-126, относящихся к серотипам 2 и 3 соответственно, специфические отрезки ДНК не амплифицировались, что подтверждает отсутствие повторов длиной 132 п.н. у штаммов, не относящихся к серотипу 1.

В дальнейшей работе, при исследовании патматериалов из птицехозяйств, 2-3 копии инвертированных повторов длиной 132 п.н. выявлены в 37 пробах, где был идентифицирован геном вируса БМ серотипа 1. Но в тоже время, в некоторых случаях, помимо фрагментов, соответствующих 2-3 копиям повторов, наблюдали присутствие более высокомолекулярных фрагментов и шлейфов ДНК. Аналогичные данные получены другими исследователями [20, 194, 233].

Несмотря на положительные результаты, у нас есть сомнения относительно возможности использования предложенной системы для дифференциации онкогенных и неонкогенных штаммов ВБМ серотипа 1. Вопервых, при амплификации вирусной ДНК вакцинных штаммов кроме высокомолекулярных фрагментов (более 3-х копий) синтезируются фрагменты, соответствующие 1-3 копиям повторов, что характерно для онкогенных штаммов. На этот факт также указывают другие исследователи [20, 194, 233]. Во-вторых, при амплификации вирусной ДНК полевых изолятов кроме фрагментов, соответствующих 2-3 копиям повтора, очень часто синтезируются более высокомолекулярные фрагменты, что затрудняет дифференциацию. Эти данные совпадают с данными Silva [194] и Zhu и соавт. [233], которые указывают на амплификацию фрагментов, соответствующих 1, 2 и более чем 3-м копиям повтора при высокой концентрации вирусной ДНК онкогенных штаммов. Они отмечают, что для амплификации с данной системой праймеров необходима концентрация ДНК меньше чем 1 нг/мл реакционной смеси. Это вызывает определенные технические сложности и может привести к ложным результатам. В-третьих, Ross и соавт. [172] сравнили вирулентный штамм HPRS-16 и его аттенурованный вариант HPRS-16/att и показали, что HPRS-16/att непатогенен для кур, но содержит только три копии повтора, характерные для онкогенных штаммов.

Таким образом, на основании наших результатов, совпадающих с данными других исследователей, установлено отсутствие четких доказательств того, что участок инвертированных повторов генома длиной 132 п.н. точно определяет патогенный потенциал вируса. Следовательно, предложенная ПЦР-система не позволяет точно и достоверно дифференцировать онкогенные и неонкогенные штаммы ВБМ серотипа 1.

Сравнительный анализ опубликованных нуклеотидных последовательностей известных штаммов с последовательностью соответствующей области полевого изолята позволяет определить штаммовую принадлежность вируса, вызвавшего вспышку заболевания. Создание банка данных структур штаммов вируса болезни Марека, выделенных в разных регионах и в разное время, позволяет проводить сравнение не только штаммов, циркулирующих на территории России, но и выделенных в других странах. Наибольший интерес вызывает дифференциация штаммов вируса БМ серотипа

1, так как только штаммы, относящиеся к первому серотипу, способны вызывать опухоли у кур. Кроме того, в связи с включением в состав вакцин штаммов вируса БМ серотипа 1, штаммовая дифференциация становится необходимой для определения степени патогенности штамма и проверки вакцинного сырья.

Как описано ранее, вариабельные фрагменты наиболее важного в иммуногенном отношении гликопротеина gB и важного для репликации вируса фермента тимидинкиназы не позволяют проводить штаммовую дифференциацию вирусов серотипа 1 в связи с идентичностью нуклеотидной и соответствующей аминокислотной последовательностей всех исследованных штаммов и изолятов. В связи с этим стало необходимо выявить участки генома, имеющие отличия у разных штаммов вируса БМ серотипа 1.

Для оценки возможности проведения штаммовой дифференциации вируса БМ серотипа 1 нами проведен сравнительный анализ первичной структуры разных генов вируса, опубликованных EMBL. В результате проведенного сравнительного анализа нами был выбран ген рр38, кодирующий серотипоспецифический фосфопротеин 38, который считается опухолевым антигеном вируса.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена рр38 опубликованных EMBL 4 штаммов вируса БМ серотипа 1 с разной степенью вирулентности показал высокую консервативность гена, но, в то же время, выявлены некоторые различия между штаммами. Нуклеотидная последовательность гена рр38 авирулентного штамма CVI-988, который используется как вакцинный, имеет от 1 до 4 нуклеотидных замен по сравнению со штаммами HPRS-16 и GA, которые являются вирулентными, и штаммом Md5, который является высоковирулентными. Особый интерес представляет замена "G" на "А" в позиции #320 п.н., которая позволяет отличать штамм CVI-988 от трех вирулентных и высоковирулентных штаммов. Замена "G" на "А" в позиции #326 п.н. позволяет отличать штаммы CVI-988 и HPRS-16 от штаммов GA и Md5. Замены "G" на "С" в позициях #347 п.н. и #348 п.н. позволяют различать штамм Md5 от всех остальных представленных штаммов.

Сравнительный анализ предсказанных аминокислотных последовательностей белка рр38 показал, что все нуклеотидные замены приводят к заменам аминокислот. Так, нуклеотидная замена в позиции #320 п.н. приводит к аминокислотной замене Я на в позиции #107 а.о., нуклеотидная замена в позиции #326 п.н. - к замене в на Е в позиции #109 а.о., а нуклеотидные замены в позициях #347 п.н. и #348 п.н. - к замене Я на Р в позиции #116 а.о.

Аналогичные данные были опубликованы китайскими и американскими исследователями [69], которые предположили, что описанные точечные мутации в гене рр38 могут быть использованы для дифференциации авирулентных и вирулентных штаммов вируса БМ серотипа 1 и могут считаться одними из возможных маркеров онкогенности вируса.

В результате проведенного сравнительного анализа опубликованных ЕМВЬ нуклеотидных последовательностей гена рр38 были рассчитаны 2 пары праймеров (табл. 3) для "пе81есГ-ПЦР (внешние - рр38-ЕБ и рр38-ЕЯ и внутренние - рр38-ГО и рр38-1Я), гомологичные консервативным участкам, ограничивающим область точечных мутаций гена рр38.

На основе ПЦР и прямого секвенирования амплифицированных фрагментов ДНК разработан метод, позволяющий в течение 2-3 дней определять точечные мутации в гене рр38 и проводить дифференциацию вакцинных и патогенных штаммов вируса БМ серотипа 1.

С использованием разработанного метода исследован штамм 3004 вируса БМ серотипа 1 матровой расплодки и после 10, 20 и 30 серий пассажей на культурах клеток. Сравнительный анализ показал полную идентичность фрагмента гена рр38 штамма 3004 матровой расплодки и всех серий пассажа.

Определены первичные структуры фрагмента гена рр38 19 изолятов вируса БМ из 37 исследованных, циркулировавших на птицефабриках России и стран СНГ в 1996-2001 г.г., а также патогенных штаммов Конкур и Кекава-55, полученных из ВГНКИ, и вакцинных штаммов СУ1-988 и 3004.

Нуклеотидные и соответствующие им аминокислотные последовательности амплифицированного фрагмента гена рр38 исследованных изолятов и штаммов сравнили между собой и с последовательностями, опубликованными EMBL.

С использование сравнительного анализа первичной структуры амплифицированного фрагмента рр38 установлено, что штамм 3004 имеет полностью идентичную нуклеотидную последовательность фрагмента гена рр38 с вакцинным авирулентным штаммом CVI-988. 15 исследованных изолятов имеют идентичную структуру с референтным вирулентным штаммом HPRS-16. Другие 4 изолята, а также патогенные штаммы Конкур и Кекава-55, имеют идентичную последовательность с референтным вирулентным штаммом GA. Штамм Md5, который относится к высоковирулентным, имеет от 2 до 4 нуклеотидных отличий от всех представленных штаммов.

Штамм 3004 получен серией пассажей штамма CVI-988 на культуре клеток. Предсказанная аминокислотная последовательность фрагмента белка рр38 штамма 3004, также как нуклеотидная, полностью идентична соответствующей последовательности штамма CVI-988.

Нуклеотидные последовательности фрагментов гена рр38 вакцинных штаммов CVI-988 и 3004 имеют от 1 до 4 нуклеотидных отличий при сравнении с представленными изолятам и другими штаммами. Особый интерес представляет замена "G" на "А" в позиции #320 п.н., которая позволяет отличать вакцинные штаммы от всех исследованных вирулентных и высоковирулентных штаммов и полевых изолятов. Замена "G" на "А" в позиции #326 п.н. позволяет различать вакцинные штаммы и вирулентный штамм HPRS-16 от вирулентного штамма GA и идентичных ему штаммов и изолятов, а также от высоковирулентного штамма Md5. Замены "G" на "С" в позициях #347 п.н. и #348 п.н. позволяют различать штамм Md5 от всех остальных представленных штаммов и изолятов.

Аминокислотные последовательности фрагмента белка рр38 вакцинных штаммов CV1-988 и 3004 имеют от 1 до 3 отличий при сравнении с представленными изолятам и штаммами. Нуклеотидная замена в позиции #320 п.н. приводит к аминокислотной замене R на Q в позиции #107 а.о., что позволяет дифференцировать вакцинные штаммы от всех исследованных штаммов и изолятов. Нуклеотидная замена в позиции #32б п.н. - к замене О на Е в позиции #109 а.о., а нуклеотидные замены в позициях #347 п.н. и #348 п.н. - к замене К на Р в позиции # 116 а.о.

Таким образом, данные наших исследований показывают, что нуклеотидные последовательности амплифицированных фрагментов гена рр38 вакцинных штаммов СУ1-988 и 3004, а также предсказанные аминокислотные последовательности, идентичны между собой и отличаются от соответствующих фрагментов всех других исследованных штаммов и изолятов. На основании этих данных можно сделать вывод, что выявляя точечные мутации в гене рр38 возможно проводить дифференциацию вакцинных и патогенных штаммов вируса БМ серотипа 1.

Кроме того установлено, что нуклеотидные и соответствующие аминокислотные последовательности фрагмента рр38 19 исследованных полевых изолятов вируса БМ серотипа 1 идентичны соответствующим последовательностям референтных вирулентных штаммов вируса.

С использованием результатов собственных исследований, а также последовательностей, полученных из ЕМВЬ, был создан банк данных нуклеотидных и соответствующих аминокислотных последовательностей фрагмента гена рр38 отечественных и зарубежных полевых изолятов и вакцинных штаммов вируса БМ серотипа 1, позволяющий проводить дифференциацию вакцинных и патогенных штаммов.

Таким образом, проведенный комплекс молекулярно-биологических работ позволил разработать метод индикации генома и серотипирования вируса болезни Марека, метод дифференциации вакцинных и патогенных штаммов вируса болезни Марека серотипа 1, а также изучить генетические соотношения между изолятами вируса болезни Марека, циркулирующими на птицефабриках России и стран СНГ, отечественными и зарубежными вакцинными и патогенными штаммами, что имеет большое значение в условиях сложной эпизоотической ситуации, сложившейся на птицефабриках в последние годы.

Результаты исследований проб патологического материала из птицехозяйств используются в лабораториях института при постановке диагноза на болезнь Марека и в практических рекомендациях по профилактике заболевания.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Полехин, Сергей Владимирович, Владимир

1. Аминев А. Г., Аминева С. П., Баборенко Е. П. и др. Обнаружение вируса болезни Ауески методом полимеразной цепной реакции // Молекулярная биология. 1997. - Т. 31. - С. 564-567.

2. Бедристов А.И., Бахтина М.М., Крендельщиков A.B. и др. Клонирование и секвенирование генов, кодирующих гликопротеины А- и В-антигенов онкогенного штамма JM (вируса болезни Марека) // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. - 1996. - № 3. - С. 6-11.

3. Блехерман Б.Е., Токарик Э.Ф., Передереев Н.И. и др. Морфогенез вируса герпеса индеек в культуре клеток (вирус-вакцина против болезни Марека) // -Докл. ВАСХНИЛ. 1976. - № 1. - С. 38-41.

4. Горбовицкая М. Диагностика болезни Марека с использованием ДНК-зондов //Птицеводство. 1996. -№ 2. - С. 27-28.

5. Грибанов О.Г., Щербаков A.B., Перевозчикова H.A., Гусев A.A. Очистка фрагментов ДНК, плазмидной ДНК и РНК с использованием аэросила А-300 и фильтров GF/F (GF/C) // Биохимия. 1996. - Т. 61, № 6. - С.764-768.

6. Коровин Р.Н., Лох В.А., Королев A.M., Соловьев Ю.В. К диагностике острой формы болезни Марека // Тез. докл. 2-ой Всесоюз. конф. молодых ученых по ветеринарии. 14-17 декабря 1971 г. М., 1971. - С. 90-91.

7. Коровин Р.Н., Лох В.А., Зубков Н.Е. Роль генетических факторов в резистентности кур к болезни Марека // Передовой научно-производственный опыт в птицеводстве. Экспресс-информация. 1974. -№ 6. - С. 11-13.

8. Коровин Р.Н., Никитин Е.Е., Лукина В.А. и др. Отечественная вакцина против болезни Марека// Птицеводство. 1973. - № 11. - С. 45-46.

9. Лавров С.В., Мазуренко Н.П., Черняховская Ю.И. и др. Выделение от индеек вируса герпеса, антигенно-родственного вирусу болезни Марека // Физико-химические и биологические свойства некоторых онкогенных вирусов. Рига, 1975. - С. 186-193.

10. Лукина В. А. Вакцина против болезни Марека и оценка ее активности иммуноферментным анализом: Автореф. дис. д-ра. биол. наук. М., 1992.

11. Лукина В.А., Демидов Л.Н., Серебрякова В.Н. Специфическая профилактика и механизм иммунитета при болезни Марека // Курская биофабрика: К 100-летию биологической промышленности России, 1896-1996. Курск, 1996. - С. 422-451.

12. Лукина В. А., Соловьев Б.В., Бьжова Н.Н. и др. Современное состояние и перспективы вакцинопрофилактики болезни Марека // Науч. осн. произв. вет. биол. препаратов: Тез. докл. Всерос. науч.- практ. конф., 8-9 июня 2000 г. -Щелково, 2000. С. 6-8.

13. Марыгина А.Ф. Морфология и морфогенез вируса герпеса индеек: Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1987. - 24 с.

14. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Диагностика вирусных болезней животных. М., Агропромиздат, 1991. - С. 158-166.

15. Фомина Н.В., Гуненкова Н.К., Сюрин В.Н. Современные данные о герпесвирусах кур и индеек. М., 1983. - 53 с.

16. Adldinger Н.К. and Calnek B.W. Effect of chelators on the in vitro infection with Marek's disease virus // Oncogenesis and Herpesviruses / Ed. P.M. Biggs, G. de The, L.N. Payne. Lyon, France, 1972. - P. 99-105.

17. Ash R.J., Ware J.D. Grouth characteristics of a herpesvirus of turkeys // Appl. Microbiol. 1972. - V. 24. - P. 943-946.

18. Bandyopadhyay P.K. Characterization of a highly transcribed DNA region of herpesvirus of turkeys // Gene. 1989. - V. 79. - P. 361-367.

19. Becker Y., Asher Y., Tabor E. e. a. Polymerase chain reaction for differentiation between pathogenic and non-pathogenic serotype 1 MDV and vaccine viruses of MDV serotypes 2 and 3 // J. Virol. Methods. 1992. - V. 40. - P. 307-30

20. Becker Y., Tabor E., Asher Y. e. a. PCR detection of amplified 132 bp repeats in MDV type 1 DNA can serve as an indicate for critical genomic rearrangement leading to the attenuation of virus virulence // Virus Genes. 1993. - V. 7. - P. 277287.

21. Benton W.J., Cover M.S. The increased incidence of visceral lymphomatosis in broiler and replacement birds // Avian Dis. 1957. - V. 1. - P. 320-327.

22. Biggs P.M. A discussion on the classification of the avian leucosis complex and fowl paralisis // Br. Vet. J. 1961. - V. 117. - P. 326-334.

23. Biggs P.M. The Leeuwenhoek lecture, 1997. Marek's disease herpesvirus: oncogenesis and prevention// Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1997. - V. 352. - P. 1951-1962.

24. Biggs P.M., Milne B.S. Biological properties of a number of Marek's disease virus isolates // Oncogenesis and herpesviruses / Ed. P.M. Biggs, G. de The, L.N. Payne. Lyon, France, 1972. - P. 88-94.

25. Biggs P.M., Long P.L., Kenzy S.G., Rootes D.G. Relationship between Marek's disease on the susceptibility of chickens to coccidiae infection // Vet. Rec. 1968. -V. 83. - P. 284-289.

26. Biggs P.M., Purchase H.G., Bee B.R., Dalton P.J. Preliminary report on acute Marek's disease in Great Britain // Vet. Rec. 1965. - V. 77. - P. 1339-1340.

27. Binns M.M., Ross L.J.N. Nucleotide sequence of the MDV RB-1B A antigen gene and the identification of the MDV A antigen as the herpes simplex virus-1 glycoprotein C gomologues // Virus Res. 1989. - V. 12. - P. 371-382.

28. Boezi J.A., Lee L.F., Blakesley R.W. e. a. Marek's disease herpesvirus-induced DNA polymerase // J. Virol. 1974. - V. 14. - P. 1209-1219.

29. Bradley G., Hayashi M., Lancz G. e. a. Structure of the MDV BamHI-H gene family: genes of putative for tumor induction // J. Virol. 1989. - V. 63. - P. 25342542.

30. Bradley G., Lancz G., Tanaka A., Nonoyama M. Loss of MDV tumorogenicity is associated with truncation of RNAs transcribed within BamHI-H // J. Virol. 1989. -V. 63.-P. 4129-4135.

31. Brunovskis P., Velicer L.F. The Marek's disease virus (MDV) unique short region: alphaherpesvirus-homologous, fowlpox virus-homologous, and MDV-specific genes // Virology. 1995. - V. 206. - P. 324-338.

32. Buckmaster A.E., Scott S.D., Sanderson M.J. e. a. Gene sequence and mapping data from MDV and HVT: implications for herpesvirus classification // J. Gen. Virol. 1988. - V. 69. - P. 2033-2042.

33. Bulow V. Further characterization of the CVI-988 strain of Marek's disease virus // Avian Pathol. 1977. - V. 6. - P. 395-403.

34. Bulow V. Epizootology of Marek's disease // Proc. 19-th World's Poultry Congress. Amsterdam, Netherlands, 20-24 sept. 1992. - P. 286-292.

35. Bulow V., Biggs P.M. Differentiation between strains of MDV and HVT by immunofluorescence assays // Avian Pathol. 1975. - V. 4. - P. 133-146.

36. Bulow V., Biggs P.M. Precipitación antigens associated with MDV and a HVT // Avian Pathol. 1975. - V. 4. - P. 147-162.

37. Bumstead N., Sillibourne J., Rennie M. e. a. Quantification of Marek's disease virus in chicken lymphocytes using the polymerase chain reaction with fluorescence detection // J. Virol. Methods. 1997. - V. 65. - P. 75-81.

38. Buscaglia C., Calnek B.W. Maintenance of Marek's disease herpesvirus latency in vitro by a factor found in conditioned medium // J. Gen. Virol. 1988. - V. 69. - P. 2809-2818.

39. Buscaglia C., Calnek B.W., Schat K.A. Effect of immunocompetence on the establishment and maintenance of latency with Marek's disease herpesvirus // J. Gen. Virol. 1988. - V. 69. - P. 1067-1077.

40. Buscaglia C., Calnek B.W., Schat K.A. Effect of reticuloendotheliosis virus and infectous bursal disease virus on Marek's disease herpesvirus latency // Avian Pathol. 1989. - V. 18. - P. 265-281.

41. Calnek B.W. Marek's disease a model for herpesvirus oncology // Crit. Rev. Microbiol. - 1986. - V. 12. - P. 293-320.

42. Calnek B.W. Marek's disease contribution to comparative herpes virology and oncology // Proc. 19-th World's Poultry Congress Amsterdam, Netherlands, 20-24 sept. 1992. - P. 220-232.

43. Calnek B.W., Adldinger H.K. Some characteristics of cell free prepagations of Marek's disease virus //Avian Dis. 1971. - V. 15. - P. 508-517.

44. Calnek B.W., Hitcher S.B. Localization of viral antigen in chickens infected with Marek's disease herpesvirus // J. Natl. Cancer Inst. 1969. - V. 43. - P. 935-949.

45. Calnek B.W., Witter R.L. Marek's disease // Disease of Poultry. 10-th ed. / Ed. B.W. Calnek. Iowa, USA, 1997. - P. 369-413.

46. Calnek B.W., Adldinger H.K., Kahn D.E. Feather follicle epithelium: a source of enveloped and enfectious cell-free herpesvirus from Marek's disease // Avian Dis. -1970. -V. 14. P. 219-233.

47. Calnek B.W., Hitcher S.B., Adldinger H.K. Lyophilization of cell free Marek's disease herpesvirus and herpesvirus from turkeys // Appl. Microbiol. 1970. - V. 20. - P. 723-726.

48. Calnek B.W., Shek W.R., Schat K.A. Spontaneous and induced herpesvirus genome expression in Marek's disease tumor cell lines // Infect. Immunol. 1981. -V. 34. - P. 483-491.

49. Calnek B.W., Shek W.R., Schat K.A. Latent infections with Marek's disease virus and turkey herpesvirus // J. Natl. Cancer Inst. 1981. - V. 66. - P. 585-590.

50. Cauchy L. The detection of viral antigens in Marek's disease by immunoperoxidase // Viral Immunodiagnosis / Ed. E. Krustak, R. Morisett. NY, 1974. - P. 77-78.

51. Cauchy L., Coudert F. Marek's disease // Rev. Sei. Tech. Off. Int. Epiz. 1986. -Y. 5, N. 4. - P. 1025-1035.

52. Cebrian J., Kaschka-Dietrick C., Berthelot N., Sheldrick P. Inverted repeat nucleotide sequences in the genome of MDV and HVT // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 1982. - V. 79. - P. 555-558.

53. Chen X., Velicer L.F. Expression of the Marek's disease virus homolog of herpesvirus of turkey glycoprotein B in E. coli and its identification as B antigen // J. Virol. 1992. - V. 66. - P. 4390-4398.

54. Chen X., Sondermeijer P.J.A., Velicer L.F. Identification of a unique MDV gene which encodes a 38-kD phosphprotein and is expressed in both lytically infected and latently infected lymphoblastoid tumor cells // J.Virol. 1992. - V. 66. - P. 8594.

55. Cheng Y.Q., Lee L.F., Smith E.J., Witter R.L. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies to Marek's disease virus // Avian Dis. 1984. -V. 28, N. 4. -P. 900-911.

56. Cho B.R. Ail improved method for extracting cell-free herpesviruses of Marek's disease and turkeys from infected cell culture // Avian Dis. 1978. - V. 20. - P. 170176.

57. Chubb R.C., Churchill A.E. Precipitating antibodies associated with Marek's disease // Vet. Rec. 1968. - V. 83. - P. 4-7.

58. Churchill A.E., Biggs P.M. Agent of Marek's disease in tissue culture // Nature. -1967. -V. 215. P. 528-530.

59. Churchill A.E., Chubb R.C., Baxendale W. The attenuation with loss of oncogenicity of the herpes-type MDY (strain HPRS-16) on passage in cell culture // J. Gen. Virol. 1969. - V. 4. - P. 557-564.

60. Churchill A.E., Payne L.N., Chubb R.C. Immunization against Marek's disease using a live attenuated virus // Nature. 1969. - V. 221. - P. 744-747.

61. Cook M.K., Sears J.F. Preparation of infectious cell-free herpes-type virus associated with Marek's disease // J. Virol. 1970. - V. 5. - P. 258-261.

62. Coussens P.M., Velicer L.F. Structure and complete nucleotide sequence of the Marek's disease herpesvirus gp 57-65 gene // J. Virol. 1988. - V. 62. - P. 23722379.

63. Coussens P.M., Wilson M.R., Camp H. e. a. Characterization of the gene encoding herpesviruses of turkeys gp 57-65: comparison to Marek's disease virus gp 57-65 and herpes symplex virus glycoprotein C // Virus Genes. 1990. - V. 3, N. 4. - P. 291-307.

64. Cui Z., Ding Y., Lee L.F. MDY gene encoding virus-specific phosphorylated polypeptides and serological characterization of fusion proteins // Virus Genes. -1990. -V. 3. P. 309-322.

65. Cui Z., Lee L.F., Liu J.-L., Kung H.-J. Structural analisis and transcriptional mapping of the MDVs gene encoding pp38, an antigen associated with transformed cells // J. Virol. 1991. - V. 65. - P. 6509-6515.

66. Cui Z., Qin A., Cui X. e. a. Molecular identification of 3 epitopes on 38 kD phosphorylated proteins of Marek's disease virus // Proc. 6th Int. Symp. Marek's Disease / Ed. K.A.Schat e. a. Montreal, Canada, 2001. - P. 103-107.

67. Davidson I., Borovskaya A., Perl S., Malkinson M. Use of the PCR for the diagnosis of natural infection of chickens and turkeys with Marek's disease virus and reticuloendotheliosis virus // Avian Pathol. 1995. - V. 24, N. 1. - P. 69-94.

68. Davidson I., Malkinson M., Strenger C., Becker Y. An improved ELISA method, using a streptavidin-biotin complex, for detecting Marek's disease virus antigen in feather-tips of infected chickens // J. Virol. Methods. 1988. - V. 14. - P. 237-241.

69. Davidson I., Perl S., Malkinson M. Differential diagnosis of MDV and REV infection of chickens using the PCR // Israel J. Med. 1992. - V. 49, N. 2. - P. 8788.

70. DeBoer G.F., Pol J., Oei H. Biological characteristics of Marek's disease vaccine CYI-988 clone CI // Vet. Q. 1987. - V. 9. - P. 16-28.

71. Dunn K., Nazerian K. Induction of Marek's disease vims antigens by IdUrd in a chicken lymphoblastoid cell line // J. Gen. Virol. 1977. - V. 34. - P. 413-419.

72. Endoh D., Niikura M., Hirai K. e. a. Expression and purification of recombinant Marek's disease virus serotype 1 specific phosphorylated protein pp38 in E. coli // J. Vet. Med. Sci. 1994. - V. 56. - P. 823-826.

73. Fukuchi K., Sudo M., Lee Y.S. e. a. The structure of MDV DNA: detailed restriction enzyme map // J. Virol. 1984. - V. 51. - P. 102-109.

74. Fukuchi K., Tanaka A., Schierman L.W. e. a. The structure of MDV DNA: the presence of unique expansion in non-pathogenic viral DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1985. - V. 82. - P. 751-754.

75. Gavora J.S. Genetic aspect of interactions between marek's disease viruses and their hosts // Proc. 19-th World's Poultry Congress. Amsterdam, Netherlands, 2024 sept. 1992. - P. 175-180.

76. Haider S.A., Lapen R.F., Kenzy S.G. Use of feather in a gel precipitation test for Marek's disease // Poult. Sci. 1970. - V. 49. - P. 1654-1657.

77. Hayashi M., Jessip J., Fukuchi K. e. a. The structure of MDV DNA: amplification of repeat sequence in IRs and Trs // J. Microbiol. Immunol. 1988. - V. 32, N. 3. -P. 265-274.

78. Hirai K., Ikuta K., Kato S. Comparative studies on MDV and HVT DNAs // J. Gen. Virol. 1979. - V. 45. - P. 119-131.

79. Hirai K., Ikuta K., Kato S. Restriction endonuclease analisis of the genomes of virulent and avirulent MDV // Microbiol. Immunol. 1981. - V. 25. - P. 671-681.

80. Hirai K., Ikuta K., Kato S. Structural changes of the DNA of MDV during serial passage in cultured cells // J. Virol. 1981. - V. 115. - P. 385-389.

81. Hirai K., Ikuta K., Kitamoto N., Kato S. Latency of herpesvirus of turkey and Marek's disease virus genomes in a chicken T-lymphoblastoid cell line // J. Gen. Virol. 1981. -V. 53. - P. 133-143.

82. Hirose H., Matsuda H., Murata M., Sekiya Y. Preparation of monoclonal antibodies against Marek's disease virus and herpesvirus of turkeys // Jpn. J. Vet. Sci. 1986. - V. 48. - P. 1263-1266.

83. Hlozanek I. The influence of ultraviolet-inactivated Sendai virus on Marek's disease virus infection in tissue culture // J. Gen. Virol. 1970. - V. 9. - P. 45-50.

84. Holland M.S., Silva R.F., Mackenzie C.D. e. a. Identification and localization of glycoprotein B expression in lymphoid tissue of chickens infected with turkey herpesvirus // Avian Dis. 1994. - V. 38. - P. 446-453.

85. Honess R.W., Roizman B. Regulation of herpesvirus macromolecular syntesis. I. Cascade regulation of the syntesis of three group of viral proteins // J. Virol. 1974. -V. 14. - P. 8-19.

86. Honess R.W., Roizman B. Regulation of herpesvirus macromolecular syntesis: Sequential transition of polypeptide syntesis requires fuctional viral polypeptides // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. - V. 72. - P. 1276-1280.

87. Hong C.C., Sevoian M. Interferon production and host resistance to type II avian (Marek's) leukosis virus (JM strain) // Appl. Microbiol. 1971. - V. 22. - P. 818820.

88. Hong Y., Coussens P.M. Identification of an immediate-early gene in the MDV long internal repeat region which encodes a unique 14-kD polypeptide // Virology. 1994. - V. 68, N. 3. - P. 3593-3606.

89. Igarashi T., Takanashi M., Donovan J. e. a. Restriction enzyme map of HVT DNA and its collinear relationship with MDV // J. Virol. 1987. - V. 157, N. 2. - P. 351358.

90. Ihara T., Kato A., Ueda.S. e. a. Comparison of the sequence of the secretory glycoprotein A (gA) gene in Md5 and BC-1 strains of MDV type 1 // Virus Genes. -1989. -V. 3, N. 2. P. 127-140.

91. Ikuta K., Honma H., Maotani K. e. a. Monoclonal antibodies specific to and cross-reactive with Marek's disease virus and herpesvirus of turkeys // Biken. J. 1982. -V. 25. - P. 171-175.

92. Ikuta K., Nakajima K., Ueda S. e. a. Studies on the serological crossreactive between Marek's disease virus and herpesvirus of turkeys using monoclonal antibodies to major virus-specific polypeptides // Arch. Virol. 1984. - V. 81. - P. 337-343.

93. Ikuta K., Nawajima K., Ueda S. e. a. Differences in the processing of secreted glycoprotein A induced by MDV and HVT // J. Gen. Virol. 1985. - V. 66. - P. 1131-1137.

94. Ikuta K., Nishi Y., Kato S., Hirai K. Immunoprecipitation of Marek's disease virus-specific polypeptides with chicken antibodies purified by affinity chromatography//Virology. 1981. -V. 114. - P. 277-281.

95. Ikuta K., Ueda S., Kato S., Hirai K. Most virus-specific polypeptides in cells productively infected with Marek's disease virus or herpesvirus of turkeys possed crossreactive determinants // J. Gen. Virol. 1983. - V. 64. - P. 961-965.

96. Ikuta K, Ueda S., Kato S., Hirai K. Monoclonal antibodies reactive with the surface and secreted glycoproteins of MDV and HVT // J. Gen. Virol. 1983. - V. 64. - P. 2597-2610.

97. Ikuta K, Ueda S., Kato S., Hirai K. Identification with monoclonal antibody of glycoproteins of MDV and HVT related to virus neutralization // J. Virol. 1984. -V. 49.-P. 1014-1017.

98. Ikuta K., Ueda S., Kato S., Hirai K. Processing of glycoprotein gB related to neutralization of Marek's disease virus and herpesvirus of turkeys // Microbiol. Immunol. 1984. - V. 28. - P. 923-933.

99. Isfort J.R., Kung H., Velicer L.F. Identification of the gene encoding Marek's disease herpesvirus A antigen // J. Virol. 1987. - V. 61, N. 8. - P. 2614-2620.

100. Isfort R.J., Sithole R.A., Kung H.-J., Velicer L.F. Molecular characterization of the Marek's disease herpesvirus B antigen // J. Virol. 1986. - V. 59. - P. 411-419.

101. Isfort R.J., Stringer R.A., Kung H.-J., Velicer L.F. Syntesis, proccesing and secretion of the MDV A antigen glycoprotein // Virology. 1986. - V. 57. - P. 464474.

102. Iwata A., Ueda S., Ishihama A., Hirai K. Sequence determination of cDNA clones of transcript from the tumor-associated region og MDV genome // Virology. 1992. -V. 187. - P. 805-808.

103. Kaaden O.R. Transfection studies in vitro and in vivo with isolated Marek'a disease virus DNA // Oncogenesis and Herpesviruses III / Ed. G. de The, W. Henle, F. Rapp. Lyon, France, 1978. - P. 627-634.

104. Kaleta E.F., Bankowski R.A. Production of interferon by the Cal-I and turkey herpesvirus strains associated with Marek's disease // Am. J. Vet Res. 1972. - V. 33.-P. 567-571.

105. Kanamori A., Ikuta K., Ueda S. e. a. Methylation of Marek's disease virus DNA in chicken T-lymphoblastoid cell lines // J. Gen. Virol. 1987. - V. 68. - P. 14851490.

106. Kanamori A., Nakajima K., Hanta K. e. a. Copy number of tandem direct repeats within the inverted repeats of MDV DNA // Biken J. 1986. - V. 29. - P. 83-89.

107. Kaschka-Dierich C., Thomssen R. Studies on the temperature-dependent DNA replication of the herpesvirus of the turkey in chicken embiyo fibroblasts // J. Gen Virol. 1979. - V. 45. - P. 253-261.

108. Kato S., Hirai K. Marek's disease virus // Adv. Virus Res. 1985. - V. 30. - P. 225-277.

109. Kato A., Sato I., Ihara T. e. a. Homologies between herpesvirus of turkey and Marek's disease virus type-1 DNAs within two co-linearly arranged open reading frames, one encoding glycoprotein A // Gene. 1989. - V. 84. - P. 399-405.

110. Kitamoto N., Ikuta K., Kato S., Wataki K. Demonstration of cells with Marek's disease tumor-associated surfase antigen in chicks infected with herpesvirus of turkey, 01 strain // Biken. J. 1979. - V. 22. - P. 137-142.

111. Lau R.Y., Nonoyama M. Replication of the resident Marek's disease virus genome in synchronized nonproducer MKT-1 cells // J. Virol. 1980. - V. 33. - P. 912-914.

112. Lee L.F. Characterization of a monoclonal antibody against a nuclear antigen associated with serotype-1 Marek's disease virus-infected and transformed cells // Avian Dis. 1993. - V. 37. - P. 561-567.

113. Lee L.F., Armstrong R.L., Nazerian K. Comparative studies of six avian herpesviruses // Avian Disease. 1972. - V. 16. - P. 799-805.

114. Lee L.F., Kieff E.D., Bachenheimer S.L. e. a. Size and composition of MDV DNA // J. Virol. 1971. - V. 7. - P. 289-294.

115. Lee L.F., Liu X., Sharma J.M. A monoclonal antibodies with specificity for three different serotypes of Marek's disease viruses in chickens // J. Immunol. 1996. -V. 75,N. 7. -P. 1003-1006.

116. Lee L.F., Liu X., Sharma J.M. e. a. A monoclonal antibody reactive with Marek's disease tumor-associated surfase antigen // J. Immunol. 1983. - V. 130. - P. 10071011.

117. Lee L.F., Liu X., Witter R.L. Monoclonal antibodies with specificity for three different serotypes of Marek's disease viruses in chickens // J. Immunol. 1983. -V. 130. - P. 1003-1006.

118. Lee L.F., Nazerian K., Boezi J.A. Marek's disease virus DNA in a chicken lymphoblastoid cell line (MSB-1) and in virus-induced tumors // Oncogenesis and Herpesviruses II / Ed. G. de The, M.A. Epstein, H. zur Hausen. Lyon, France, 1975. - P. 199-204.

119. Lee Y.S., Tanaka A., Nonoyama M. Partial restriction map of MDV DNA // Gene. 1982. - V. 19. - P. 185-190.

120. Lesnik F., Chudy D., Bogdan J. e. a. Testing the immunogenicity of the dermal antigen of Marek's disease virus // Yet. Med. (Pralia). 1978. - V. 23. - P. 421-430.

121. Li D.S., Green P.F., Skinner M.A. e. a. Use of recombinant pp38 antigen of Marek's disease virus to identify serotype 1-specific antibodies in chicken sera by western blotting // J. Virol. Methods. 1994. - V. 50. - P. 185-195.

122. Liu X., Lee L.F. Development and characterization of monoclonal antibodies to Marek's disease tumor-associated antigen // Infect. Immunol. 1983. - V. 31. - P. 851-854.

123. Makimura K., Peng F.Y., Tsuji M. e. a. Mapping of Marek's disease virus genome: identification of junction sequences between unique and inverted repeat regions // Virus Genes. 1994. - V. 8. - P. 15-24.

124. Malkinson M., Davidson I., Becker Y. Antigen B of the vaccine strains of MDV and HVT presents heat-labile group and serotype specific epitopes // Arch. Virol. -1992. -V. 127. P. 169-184.

125. Maotani K., Kanamori A., Ikuta K. e. a. Amplification of a tandem direct repeat within inverted repeats of MDV DNA during serial in vitro passage // J. Virol. -1986. -V. 58. P. 657-660.

126. Marek J. Multiple Nervenentzuendung (Polyneuritis) bei Huehnern // Dtsch. Tierarztl. Wochenschr. 1907. - V. 15. - P. 417-421.

127. Martin S.L., Aparisio D.I., Bandyopadhyay P.K. Genetic and biochemical characterization of the Thymidine Kinase gene from HVT // J. Virol. 1989. - V. 63, N. 6. - P. 2847-2852.

128. McColl K., Calnek B.W., Harris W.V. e. a. Expression of a putative tumor-associated antigen on normal versus Marek's disease virus-transformed lymphocytes // J. Natl. Cancer Inst. 1987. - V. 79. - P. 991-1000.

129. Mikami T., Onuma M., Hayashi T.T.A. Requirement of arginine for the replication of Marek's disease herpesvirus // J. Gen. Virol. 1974. - V. 22. - P. 115128.

130. Minick C.R., Fabricant C.G., Fabricant J., Litrenta M.M. Atheroarteriosclerosis induced by infection with a herpesvirus // Am. J. Pathol. 1979. - V. 96. - P. 673706.

131. Nakajima K., Ikuta K., Naito K. e. a. Análisis of MDV serotype 1 specific phosphorylated polypeptides in virus - infected cells and Marek's disease lymphoblastoid cells // J. Gen. Virol. - 1987. - V. 68. - P. 1379-1389.

132. Nazerian K. Further studies on the replication of Marek's disease virus in the chicken and in cell culture // J. Natl. Cancer Inst. 1971. - V. 47. - P. 207-217.

133. Nazerian K., Lee L.F., Witter R.L., Burmester B.R. Ultrastructural studies of a herpesvirus of turkeys antigenically related to Marek's disease virus // Virology. -1971.-V. 43.-P. 442-452.

134. Nazerian K., Lee L.F., Yanagida N., Ogawa R. Protection against Marek's disease by a fowlpox virus recombinant expressing the glycoprotein B of Marek's disease virus // J. Virol. 1992. - V. 66. - P. 1409-1413.

135. Nazerian K., Lindahl T., Klein G., Lee L.F. Deoxyribonucleic acid of Marek's disease virus in virus-induced tumors // J. Virol. 1973. - V. 12. - P. 841-846.

136. Nazerian K., Solomon J.J., Witter R.L., Burmester B.R. Studies on the etiology of Marek's disease. II. Finding of a herpesvirus in cell culture // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1968. - V. 127. - P. 177-182.

137. Okada K., Fujimoto Y., Baba N., Murata K. Morphogenesis of the core of herpesvirus of turkeys studied by computerized reconstruction technique // Microscopic Acta. 1982. - V. 82. - P. 117-122.

138. Okazaki W., Purchase W.G., Barmester B.R. Protection against Marek's disease by vaccination with a herpesvirus of turkeys // Avian Dis. 1970. - V. 14. - P. 413429.

139. Ono M., Katsuragi-Iwanaga R., Kitazawa T. e. a. The restriction endonuclease map of Marek's disease virus serotype 2 and collinear relationship among three serotypes of MDV // Virology. 1992. - V. 191. - P. 459-463.

140. Ono M., Kawaguchi Y., Maeda K. e. a. Nucleotide sequence analysis of Marek's disease virus (MDV) serotype 2 homolog of MDV serotype 1 pp38, an antigen associated with transformed cells // Virology. 1994. - V. 201. - P. 142-146.

141. Payne L.N. Pathogenesis of Marek's disease: recent development // Proc. 19-th World's Poultry Congress.;- Amsterdam, Netherlands, 20-24 sept. 1992. P. 189194.

142. Peng F., Bradley G., Tanaka A. e. a. Isolation and characterization of cDNAs from BamHI-H gehe family RNAs associated with the tumorogenicity of MDV // J. Virol. 1992. - V. 66. - P. 7389-7396.

143. Peng F., Donovan J., Specter S. e. a. Prolonged proliferation of primary chicken embryo fibroblasts transfected with cDNAs from the BamHI-H gene family of Marek's disease virus // Int. J. Oncol. 1993. - V. 3. - P. 587-591.

144. Powell P.C. Marek's disease a world poultry problem // World Poultry Sci. J. -1986. -V. 42. - P. 205-219.

145. Powell P.C., Lombardini F. Progress in vaccination against Marek's disease // Clin. Vet. 1987. - V. 110, N. 8. - P. 36-41.

146. Powell P.C., Rennie M. The expression of Marek's disease tumor-associated surfase antigen in various avian species // Avian Pathol. 1984. - V. 13. - P. 345349.

147. Powell P.C., Payne L.N., Frazier J.A., Rennie M. T lymphoblastoid cell line from Marek's disease lymphomas //Nature. 1974. - V. 251. - P. 79-80.

148. Purchase H.G. Immunofluorescence in the study of Marek's disease. I. Detection of antigen in cell culture and an antigenic comparison of 8 isolates // J. Virol. -1969. -V. 3. P. 557-565.

149. Purchase H.G. Clinical disease and its economic impact // Marek's disease / Ed. L. N. Payne. Martinus Nijhoff, Boston, MA, 1985. - P. 17-24.

150. Qin A., Cui Z., Duan Y. Immunological cross-reaction of serotype I Marek's disease virus 38kD phosphorylated protein with serotype II and III viruses // Wei Sheng Wu Hsueh Pao. 1994. - V. 34. - P. 393-397.

151. Rispens B., Van Vloten H., Masterbrock N., Schat K.A. Control of Marek's disease in the Netherlands. II. Field trials on vaccination with an avirulent strain (CVI-988) of Marek's disease // Avian Disease. 1972. - V. 16. - P. 108-125.

152. Roizman B., Carmichael L.E., Deihardt F. e. a. Herpesviridae: definition, provisional nomenclature, and taxonomy // Intervirology. 1981. - V. 16. - P. 201217.

153. Ross L.J.N. Molecular biology of the virus // Marek's disease / Ed. L. N. Payne. Martinus Nijhoff, Boston, MA, 1985. - P. 113-150.

154. Ross L.J.N., Binns M.M. Properties and evolutionary relationships of the MDV homologues of protein kinase, glycoprotein D and glycoprotein I of HS V // J. Gen. Virol. 1991. - V. 72. - P. 939-947.

155. Ross L.J.N., Binns M.M., Sanderson M., Schat K.A. Alterations in DNA sequence and RNA transcription of the Bam HI-H fragment accompany attenuation of oncogenic Marek's disease herpesvirus // Virus Genes. 1993. - V. 7. - P. 33-51.

156. Ross L.J.N., Binns M.M., Tyers P. e. a. Construction and properties of a turkey herpesvirus recombinant expressing the Marek's disease virus homolog of glycoprotein B of herpes simplex virus // J. Gen. Virol. 1993. - V. 74. - P. 371377.

157. Ross L.J.N., DeLorbe W., Varmus H.E. e. a. Persistence and expression of MDV DNA in tumour cells and periferal nerves studied by in situ hibridization // J. Gen. Virol. 1981. - V. 57. - P. 285-296.

158. Ross L.J.N., Milne B.S., Biggs P.M. Restriction endonuclease analisis MDV DNA and homology between strains // J. Gen. Virol. 1983. - V. 64. - P. 27852790.

159. Ross L.J.N., O'Sullivan G., Coudert F. Influence of chicken genotype on protection against Marek's disease by a herpesvirus of turkeys recombinant expressing the glycoprotein B (gB) of Marek's disease virus // Vaccine. 1996. - V. 14.-P. 187-189.

160. Ross L.J.N., O'Sullivan G., Smith G. e. a. Expression of Marek's disease virus genes in limphomas and their roles in oncogenesis // Proc. 5Th Int. Symp. on

161. Marek's Diseas / Ed. R. F. Silva e. a. Rose Printing Co., Inc., Fla., USA, 1996. - P. 40-46.

162. Ross L.J.N., Sanderson M., Scott S.D. e. a. Nucleotide sequence and characterization of the MDV homologue of glycoprotein B of HSV // J. Gen. Virol.- 1989. -V. 70. P. 1789-1804.

163. Saiki R.K., Gelfand P.H., Stoffel S. e. a. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science. 1988. - V. 239. - P. 487491.

164. Sarma G. Fields trial and immunogenecity studies on the polyvalent Marek's disease vaccines in chickens // Proc. 19-th World's Poultry Congress. Amsterdam, Netherlands, 20-24 sept. 1992. - P. 310-314.

165. Schat K.A. Characteristics of the virus // Marek's disease / Ed. L.N. Payne. -Martinus Nijhoff, Boston, MA, 1985. P. 77-112.

166. Schat K.A. Immune responces against Marek's disease virus // Proc. 19-th World's Poultry Congress. Amsterdam, Netherlands, 20-24 sept. 1992. - P. 233238.

167. Schat K.A., Calnek B.W. Demonstration of Marek's disease tumor- associated surfase antigen in chickens infected with nononcogenic Marek's disease virus and herpesvirus of turkeys // J. Natl. Cancer Inst. 1978. - V. 61. - P. 855-857.

168. Schat K.A., Buckmaster A., Ross L.J.N. Partial transcriptional map of MDV in lytically infected cells and lymphoblastoid cell lines // J. Cancer. 1989. - V. 44. -P. 101-109.

169. Schat K.A., Calnek B.W., Fabricant J. Characterization of two highly oncogenic strains of MDV // Avian Pathol. 1982. - V. 11. - P. 593-605.

170. Schat K.A., Calnek B.W., Fabricant J., Graham D.L. Pathogenesis of infection with attenuated Marek's disease virus strains // Avian Pathol. 1985. - V. 14. - P. 127-146.

171. Scholten R., Hilgers L.A.Th., Jeurissen S.H.M., Weststrate M.W. Detection of Marek's disease virus antigen in chicken by a novel immunoassay //sJ. Virol. Methods. 1990. - V. 27. - P. 221-226.

172. Scott S.D., Ross N.L.J., Binns M.M. Nucleotide and predicted amino acid sequence of the MDV and HVT thymidine kinase genes; comporison with thymidine kinase genes of other herpesviruses // J. Gen. Virol. 1989. - V. 70. - P. 3055-3065.

173. Sharma J.M. Fractionation of Marek's disease virus induced lymphoms by velocity sedimentation and association of infectivity with cellular fractions with and without tumor antigen expression // Am. J. Vet. Res. 1981. - V. 42. - P. 483-486.

174. Shek W.R., Schat K.A., Calnek B.W. Characterization of nononcogenic Marek's disease virus-infected and turkey herpesvirus infected lymphocytes // J. Gen. Virol. 1982. -V. 63. - P. 333-341.

175. Shimojima Y., Jang H.K., Ono M. e. a. Identification and DNA sequence analysis of the Marek's disease virus serotype 2 genes homologous to the thymidine kinase and UL24 genes of herpes simplex virus type 1 // Virus Genes. 1997. - V. 14. - P. 81-87.

176. Silva R.F. Differentiation of pathogenic and non-pathgenic serotype 1 MDVs by the PCR amplification of the tandem direct repeats within the MDV genome // Avian Dis. 1992. - V. 36. - P. 521-528.

177. Silva R.F., Barrett J.C. Restriction endonuclease analisis of MDV DNA: differentiation of virsl strains and determination of passage history // Avian Dis. -1991. -V. 35. P. 487-495.

178. Silva R.F., Lee L.F. Monoclonal antibody mediated immunoprecipitation of proteins from cells infected with Marek's disease virus or turkeys herpesvirus // Virology. 1984. - V. 136. - P. 307-320.

179. Silva R.F., Witter R.L. Genomic expansion of MDV DNA is associated with in vitro passage // J. Virol. 1985. - V. 54. - P. 690-696.

180. Silva R.F., Calvert J.G., Lee L.F. A monoclonal antibody reactive with Mareks disease tumor-associated surfase antigen // J. Immunol. 1996. - V. 75, N.7. - P. 1007-1011.

181. Silva R.F., Calvert J.G., Lee L.F. A simple immunoperoxidase plaque assey to detect and quantitate Marek's disease virus plaque // Avian Dis. 1997. - V. 41. - P. 528-534.

182. Silver S., Tanaka A., Nonoyama M. Transcription of the Marek's disease virus genome in a nonproductive chicken lymphoblastoid cell line // Virology. 1979. -V. 93.-P. 127-133.

183. Sithole I., Lee L.F., Velicer L.F. Syntesis and processing of the Marek's disease herpesvirus B antigen glycoprotein complex // J. Virol. 1988. - V. 62. - P. 42704279.

184. Smith G.D., Zelnik V., Ross L.J.N. Gene organization in herpesvirus of turkeys: identification of a novel open reading frame in the long unique region and a truncated homologue of pp38 in the internal repeat // Virology. 1995. V. 207. - P. 205-216.

185. Solomon J.J., Witter R.L., Nazerian K., Burmester B.R. Studies on the etiology of Marek's disease. I. Propagation of the agent in cell culture // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1968. - V. 127. - P. 173-177.

186. Spencer J.L. Marek's disease herpesvirus: comparison of foci (macro) in infected duck embryo fibroblasts under agar medium with fosi (macro) in chicken cells // Avian Dis. 1970. - V. 14. - P. 565-578.

187. Spencer J.L., Calnek B.W. Storage of cells infected with Rous sarcoma virus or JM strain of avian lymphomatosis agent // Avian Dis. 1967. - V. 11. - P. 274-287.

188. Spencer J.L., Calnek B.W. Marek's disease: application of immunofluorescence for detection of antigen and antibody// Am. J. Vet. Res. 1970. - V. 31. - P. 345358.

189. Sugaya K., Bradley G., Nonoyama M., Tanaka A. Latent transcripts of Marek's disease virus are clustered in the short and long repeat regions // J. Virol. 1990. -V. 64. - P. 5773-5782.

190. Ubertini T., Caliiek B.W. Marek's disease in peripheral nerve lesions // J. Natl. Cancer Inst. 1970. - V. 45. - P. 507-514.

191. Van Zaane D., Brinkhoff J.M.A., Gielkens A.L.J. Molecular-biological characterization of Marek's disease virus // J. Virol. 1982. - V. 121. - P. 116-146.

192. Volpini L.M., Calnek B.W., Sekellick M.J., Marcus P.I. Stages of Marek's disease virus latency defined by variable sensitivity to interferon modulation of viral antigen expression // Vet. Microbiol. 1995. - V. 47. - P. 99-109.

193. Wilson M.R., Pulaski J.T., Southwich R.A. e. a. Molecular analisis of the glycoprotein C negative phenotype of attenuated MDV // Virology. - 1994. - V. 199. - P. 393-402.

194. Witter R.L. Protection by attenuated and polyvalent vaccines against highly virulent strains of MDV//Avian Pathol. 1982. - V. 11. - P. 49-62.

195. Witter R.L. Characteristics of MDV isolated from vaccinated commercial chicken flocks: association of viral pathotype with lymphoma frequency // Avian Dis. -1983. -V. 27. P. 113-132.

196. Witter R.L. A new strategy for Marek's disease immunization bivalent vaccine // Avian Pathol. - 1984. - V. 13, N. 2. - P. 133-135.

197. Witter R.L. Principles of vaccination // Marek's disease / Ed. L.N. Payne. -Martinus Nijhoff, Boston, MA, 1985. P. 203-250.

198. Witter R.L. New serotype 2 and attenuated serotype 1 Marek's disease vaccine viruses: comparative efficasy // Avian Dis. 1987. - V. 31. - P. 752-765.

199. Witter R.L. Very virulent MDV: importance and control // World's Poultry. -1989. -V. 45, N. 1. P. 60-65.

200. Witter R.L. Recent development in the prevention and control of Marek's disease // Proc. 19-th World's Poultry Congress. Amsterdam, Netherlands, 20-24 sept. 1992. - P. 298-304.

201. Witter R.L., Lee L.F. Polyvalent Marek's disease vaccines. Safety, efficasy and protective synergism in chickens with maternal antibodies // Avian Pathol. 1984. -V. 13. - P. 75-92.

202. Witter R.L., Burgoyne G.H., Solomon J.J. Evidence for a herpesvirus as an etiologic agent of Marek's disease // Avian Dis. 1969. - V. 13. - P. 171-184.

203. Witter R.L., Nazerian K., Purchase H.G., Burgoyne G.H. Isolation from turkeys of a cell associated herpesvirus antigenically related to Marek's disease virus // Am. J. Vet. Res. 1970. - V. 31. - P. 525-538.

204. Witter R.L., Sharma J.M., Fadley A.M. Pathogenicity of a variant MDV isolates in vaccinated and unvaccinated chickens // Avian Dis. 1980. - V. 24. - P. 210-232.

205. Witter R.L., Silva R.F., Lee L.F. New serotype 2 and attenuated serotype 1 Marek's disease vaccine viruses: selected biological and molecular characteristics // Avian Dis. 1987. - V. 31. - P. 829-840.

206. Witter R.L., Stephens E.A., Sharma J.M., Nazerian K. Demonstration of a tumor-associated surfase antigen in Marek's disease // J. Immunol. 1975. - V. 115. - P. 177-183.

207. Xie Q., Anderson A.S., Morgan R.W. Marek's disease virus ICP4, pp38 and meq genes involved in the maintenance of transformation of MDCC-MSB1 MDV-transformed lymphoblastoid cells // J. Virol. 1996. - V. 70. - P. 1125-1131.

208. Yachida S., Kondo T., Hirai K. e. a. Establishment of a variant type of turkey herpesvirus which releases cell-free virus into the culture medium in large quantities //Arch. Virol. 1986. - V. 91. - P. 183-192.

209. Yoshida S., Lee L.F., Yanagida N, Nazerian K. The glycoprotein B genes of MDV serotypes 2 and 3: identification and expression by recombinant fowlpox viruses // Virology. 1994. - V. 200, N. 2. - P. 484-493.

210. Zelnik V., Darteil R., Audonnet J.C. e. a. The complete sequence and gene organization of the short unique region of herpesvirus of turkeys // J. Gen. Virol.1993. -V. 74. P. 2151-2162.

211. Zelnik V., Ross L.J.N., Pastorek J. Characterization of proteins encoded by the short unique region of herpevirus of turkeys by in vitro expression // J. Gen. Virol.1994. -V. 75. P. 2747-2753.

212. Zerbers M., Tannock G.K., Jenner R.J., Young P.L. Some characteristics of a recent virulent isolate of MDV // Austral. Vet. J. 1994. - V. 71, N. 1. - P. 21-22.

213. Министерство сельского хозяйства и продовольствия РФ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных1. С^глаоовано"даиизжусеврждаю альника ии МСХ РФ еливерстов ЦЪ-Ь 1997 г.

214. Настоящие Методические указания вступают в силу с момента утверждения

215. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ИНДИКАЦИИ ГЕНОМА ВИРУСА БОЛЕЗНИ МАРЕКА ПТИЦ РАЗЛИЧНЫХ СЕРОТИПОВ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ И СЕКВЕНИРОВАНИЕМ ФРАГМЕНТА ГЕНА СВ1. Владимир 1997г.

216. МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

217. ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЗАЩИТЫ ЖИВОТНЫХ

218. ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ КОНТРОЛЯ, СТАНДАРТИЗАЦИИ И СЕРТИФИКАЦИИ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ1. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

219. ПО ДИАГНОСТИКЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

220. Под редакцией члена-корреспондента РАСХН, профессора А.А.Гусева и члена-корреспондента РАСХН, профессора А.Н.Панина

221. Допущено Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации в качестве пособил для работников ветеринарных диагностических лабораторий1. Владимир 1998 г.