Биологическая характеристика штамма ВН-96 вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней и разработка биотехнологических параметров его культивирования

Симоненко, Наталья Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биологическая характеристика штамма ВН-96 вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней и разработка биотехнологических параметров его культивирования
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биологическая характеристика штамма ВН-96 вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней и разработка биотехнологических параметров его культивирования"

На правах рукописи

Симоненко Наталья Валерьевна

Биологическая характеристика штамма ВН-96 вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней и разработка биотехнологических параметров его культивирования

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 6 МАЙ 2011

Саратов 2011

4847998

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Саратовском научно-исследовательском ветеринарном институте Россельхозакадемии

Научный руководитель доктор ветеринарных наук

Ласкавый Владислав Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, доцент

Гулий Ольга Ивановна, доктор биологических наук, профессор Хайруллин Рамиль Магзинурович

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная

сельскохозяйственная академия»

Защита диссертации состоится «/» » 2011 г. в /¿засов на засе-

дании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова».

Автореферат диссертации разослан « 2011 г. и размещен на

сайте: www.sgau.ru

Отзывы на автореферат направлять по адресу:410012, г. Саратов, Театральная пл.1, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Л.В. Карпунина

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Трансмиссивный (вирусный) гастроэнтерит свиней (ТГЭС) - остро протекающая, высоко контагиозная болезнь, которая поражает животных всех возрастных групп, но главным образом поросят до 3-х месячного возраста и наносит значительный экономический ущерб промышленному свиноводству (Ястребов, 1999; Сергеев, 2007; Lanteir et al., 1990; Saif, 1999).

Определённые успехи в борьбе с ТГЭС связаны с внедрением в практику живых культуральных моно- и ассоциированных вакцин, результативность применения которых в крупных свинокомплексах, как правило, недостаточно эффективна, что связано с существенными нарушениями технологии содержания и кормления, несоблюдением обязательных ветеринарно-санитарных требований, перегруппировкой и завозом из отдалённых регионов России и зарубежных стран животных, хронически инфицированных вирусами и бактериями с различным уровнем патогенности (Ласкавый, 1998; Алипер, 2002; Красочко и др., 2005; Ласкавый и др., 2007).

За последние 10-15 лет в мире резко возрос объем научных разработок, связанных с более широким применением перевиваемых линий клеток (ПЛК) в качестве субстрата для производства иммунобиологических препаратов (ИБП). Важное место в решении задач применения ПЛК в биотехнологии занимают вопросы выбора, контроля и стандартизации свойств, совершенствования технологии культивирован™ ПЛК, создания рабочих и посевных банков клеток в жидком азоте, поиска и апробации новых более эффективных антибактериальных препаратов, а также проблем контаминации и деконтаминации культур клеток и ИБП от бактерий и микоплазм (Тарасов, 1990; Ночевный, 2002; Герасимов, 2006).

Исследования, направленные на поиск, паспортизацию и стандартизацию ПЛК, предназначенных для получения вируса ТГЭС с выраженными антигенными и иммуногенными свойствами, а также разработка более стабильного по генетическим и иммунобиологическим показателям авирулентного штамма вируса ТГЭС, пригодного для профилактики данного заболевания у свиней разных половозрастных групп, является актуальной задачей на современном этапе и имеет большое практическое значение.

Цель работы - изучение биологических свойств штамма ВН-96 вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, оптимизация условий его культивирования в перевиваемой линии клеток и обоснование использования в качестве потенциального вакцинного препарата.

Для достижения поставленной цели нами были определены следующие задачи:

1. Провести селекцию штамма ВН-96 вируса ТГЭС и изучить его физико-химические свойства.

2. Оценить в сравнительном аспекте чувствительности первичной и перевиваемых тест-культур клеток к вирусу ТГЭС; провести отбор наиболее перспективной ПЛК в качестве субстрата для серийного производства вирусного антигена.

3. Подобрать средства и методы деконтаминадии тест-культур с использованием моно- и комплексных препаратов на основе фторхинолонов и поверхностно активных веществ;

4. Осуществить стандартизацию и паспортизацию культуральной модели в качестве субстрата для получения штамма ВН-96 вируса ТГЭС;

5. Определить оптимальные условия культивирования штамма ВН-96 вируса ТГЭС стационарным и роллерным методами; оптимизация условий стабилизации штамма ВН-96 вируса ТГЭС;

6. Изучить антигенные и иммуногенные свойства штамма ВН-96 вируса ТГЭС; обосновать перспективность его использования в качестве вакцинного препарата.

Научная новизна. Впервые выделен и изучен штамм ВН-96 вируса ТГЭС, определены оптимальные условия его культивирования и изучена бляш-кообразующая способность. На основании изучения антигенных и иммуноген-ных свойств обоснована перспективность использования штамма ВН-96 вируса ТГЭС в качестве вакцинного препарата.

Впервые доказана возможность и перспективность использования метода проточной цитометрии для экспресс-оценки культуральных, цитометрических и морфологических показателей, а также выбора наиболее перспективной культуральной модели для репродукции вируса ТГЭС.

Практическая значимость. Разработаны методы концентрирования и очистки культурального вируса ТГЭС штамм ВН-96. Апробирован эффективный способ деконтаминации линии клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) при помощи моно- и комбинации препаратов на основе Энрофлона-К и поверхностно-активных веществ. Определена оптимальная схема деконтаминации ПЛК сублинии СПЭВ-б от микоплазм. Подготовлены для практического использования очищенные от микоплазм-контаминантов эталонный и рабочий криобанки ПЛК сублинии клеток СПЭВ-б со стабильными культуральными и цитометрическими показателями. Определены оптимальные условия культивирования вируса ТГЭС в ПЛК сублинии СПЭВ-б стационарным и роллерным методами. Предложена защитная среда оптимального состава, разработаны режимы лиофилизации и условия хранения сухих форм культурального вируса ТГЭС.

По материалам диссертационной работы опубликованы «Методические рекомендации о порядке аттестации и поддержания перевиваемых линий клеток, используемых для культивирования вирусов и производства иммунобиологических препаратов ветеринарного назначения» (в соавторстве с Л. П. Дьяконовым, В. П. Уласовым, Б. В. Соловьевым, 2007), утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН A.M. Смирновым от 19.10.2007г.

Основные положения, выносимые на защиту

1. На основании определения размеров и морфологии частиц, изучения физико-химических свойств, электрофореггической подвижности и молекулярной массы структурных белков, антигенных и иммуногенных свойств подтверждена подлинность и специфичность штамма ВН-96 вируса ТГЭС.

2. Перевиваемая линия клеток СПЭВ-б наиболее чувствительна к штамму ВН-96 вируса ТГЭС.

3. Эффективная деконтаминация линии клеток почки эмбриона свиньи от микоплазменной инфекции достигается при использовании энрофлона-К и комбинаций препаратов норфлоксацина с этонием и, энрофлона-К с твином-80.

4. Оптимальными условиями для выращивания линии клеток СПЭВ-б и репродукции штамма ВН-96 вируса ТГЭС являются: посевная концентрация клеток 150 тыс./мл, заражение в суспензию в дозе 5,0-6,0 lg ТЦД50, время адсорбции вируса клетками не менее 60 минут при 37°С, применение фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота и культивирование вируса роллсрнцм методом.

5. Для замораживания и лиофилизации штамма ВН-96 вируса ТГЭС в биотехнологическом процессе эффективно использование защитной среды ВГНКИ-3.

Работа выполнена в лаборатории бактериальных и вирусных инфекций ГНУ Саратовского научно исследовательского ветеринарного института Рос-сельхозакадемии по научно-исследовательской теме: «Усовершенствовать средства и методы защиты поросят от вирусных инфекций» (№ per. ВНТИЦ 01200607301) в рамках программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития АПК РФ.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на: Международной научно-производственной конференции «Экологобиологические проблемы повышения продуктивного долголетия животных» (Екатеринбург, 2006 г.); Международной научно-практической конференции «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных» (Покров, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы, задачи и пути научного обеспечения приоритетного национального проекта «Развитие АПК» (Новочеркасск, 2008).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

О&ьем и структура диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы, методы, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, практических предложений, списка литературы. Список литературы включает 218 источников, в том числе 136 отечественных и 82 зарубежных. Работа иллюстрирована 27 таблицами и 12 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

В работе использовали: штаммы вируса ТГЭС: штамм «T036SD192» (Япония) с титром 8,0 lgTLtfWiwi, полученный из коллекции микроорганизмов Всесоюзного института экспериментальной ветеринарии (ВИЭВ) в 1973 г, штамм «РИМС», полученный из сухой лиофилизированной вакцины РИМС (ГДР); штамм ВН-96 с титром 6,5-7,5 ^ТЦДзо/мл выделен из вакцинного штамма

«РИМС» (методом предельных разведений с последующим 5-кратным клонированием микробляшек) на перевиваемой культуре СПЭВ (крупнобляшечный вариант).

В качестве материала для исследований использовали:

- трофоварианты линии клеток почки эмбриона свиньи, полученные из Всероссийского государственного НИИ контроля, стандартизации и сертификации (ВГНКИ) ветпрепаратов (СПЭВ, 305 пассаж) и из Всесоюзного научно-иследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии (ВНИИВВ и М) (СПЭВ, 184 пассаж), которые пассировали стационарным и рол-лерным методами в соответствии с требованиями паспорта. Для различия тро-фовариантов линии клеток СПЭВ, сохраняемые в ВГНКИ ветпрепаратов (305 пассаж), были обозначены как СПЭВ-а, а линии клеток СПЭВ, сохраняемые в ВНИИВВ и М (184 пассаж), как СПЭВ-б. Эффективность пассирования перевиваемых линий оценивали по урожаю клеток (УК), индексу пролиферации (ИП) и морфологии клеток в культуре;

- питательные среды: «199», «Игла МЕМ», «Игла ДМЕМ», 0, 2% раствор версена, фосфатно-буферный раствор (ФБР) с рН 7,2-7,4; 0,25% раствор трипсина (ФС 42-3321-96); L-глутамин сухой (ТУ 6-09-16-1426-87); сыворотки крови (СК) плодов коров (ФС 42-3368-97) и крупного рогатого скота (ВФС 42-268ВС-90) в концентрации 5-10%;

- фторхинолоны (ФХЛ): в качестве антимикоплазменных средств испытывали энрофлон-К (ТУ 934342-016-47611900-00), изготовленный на основе эн-рофлоксацина в дозе 10 мкг/мл и 2 комплексных препаратов на основе норфлок-сацина (50 мкг/мл) и энрофлона-К (35 мкг/мл) с поверхностно-активными веществами (ПАВ) - этонием и Tween-80 (SERVA 374775) в дозе 7 мкг/мл.

При проведении экспериментальных исследований использовали лабораторных и сельскохозяйственных животных: 16 кроликов (2-2,5 кг), 28 белых крыс (170-200 г), 35 новорожденных поросят, 50 свиней разных возрастных групп.

Индикацию микоплазм в клеточных культурах проводили микробиологическим методом в соответствии с Методическими рекомендациями по выделению, культивированию и идентификации микоплазм, ахолеоплазм и уреаплазм (1983), а также цитохимическим методом (ЦХМ) контроля, основанном на окраске ДНК клеток микоплазм флюорохромами: оливомицином или Hoechst-33258 (Методические рекомендаций по способу выявления микоплазм в культурах перевиваемых клеток, 1983). Индикацию микоплазм культур клеток в полимераз-ной цепной реакции (ПЦР) проводили на базе ВГНКИ ветпрепаратов совместно с д.б.н. И.Л. Обуховым в соответствии с требованиями Методических указаний по диагностике возбудителей микоплазмоза методом полимеразной цепной реакции (1997).

Для очистки ПЛК от микоплазмениой инфекции использовали различные препараты на основе ФХЛ. Схема деконтаминации тест-культур предусматривала внесение антимикоплазменных препаратов в суспензию изолированных клеток в течение 10 пассажей. Результативность деконтаминации ПЛК от микоплазм оценивали по ростовым свойствам, морфологии клеток в культуре, индек-

су пролиферации (ИП) и результатам цитохимического метода (ЦХМ) и полиме-разно цепной реакции.

Чувствительность деконтаминированных и исходных (контроль) линий клеток СПЭВ к вирусу ТГЭС оценивали в течение 3 пассажей. Доза и способ заражения (в суспензию клеток и на монослой), условия и длительность культивирования вируса были оптимальными. Уровень накопления вируса оценивали микрометодом на плашках и выражали в lg ТЩЬг/мл, Активность вируса оценивали по методу Рида и Менча.

ГОЖ сублиний СПЭВ-а и СПЭВ-б выращивали в стационарных условиях на покровных стеклах в пробирках в соответствии с требованиями паспорта. Ци-тометрическое исследование проводили на лазерном проточном цитофлуори-метре-сортере EPICSR «Elite» (Coulter, USA), оборудованном аргоновым лазером CYONICS (Uniphase, USA) с длиной волны возбуждения 488 нм и мощностью луча 15 тВт. Полученные гистограммы подвергали математической обработке с использованием программ ЕХР032 (Beckman-Coulter, USA) и Multi Сусе (Phoenix Flow Systems, USA).

Тест-культуры инфицировали штаммом ВН-96 вируса ТГЭС в дозе 4,0 lg ТЦД50 через 72 часа культивирования. Фиксацию и окрашивание опытных и контрольных культур осуществляли через 3, 4 и 5 суток после заражения. Покровные стекла извлекали из пробирок, отмывали физиологическим раствором, фиксировали в растворе Буэна два часа при комнатной температуре, отмывали 70%-ным этанолом в течение суток и окрашивали смесью азура с эозином по Романовскому. Препараты изучали в световом микроскопе и фотографировали при увеличении 32x10 с зеленым фильтром на пленку «Микрат-300».

Для изучения бляшкообразующей способности штамма ВН-96 по методу С. Д. Дальбекко и А. М. Фоггота (1954) использовали перевиваемую линшо клеток СПЭВ, выращенной в пластиковых матрасах объемом 25 см2. Наблюдение за появлением бляшек осуществляли ежедневно с 3 по 7 сутки. Подсчет, оценку величины и формы бляшек проводили на светлом фоне. Электронно-микроскопический анализ вируса ТГЭС проводили по методике А.П. Пономарева с помощью электронного микроскопа JEM-100B (Jeol, Япония) при увеличении х 245000.

Концентрирование культурального вируса ТГЭС проводили центрифугированием в градиенте сахарозы по методу С.М. Horzinek (1982). Полученную суспензию очищенного вируса использовали для анализа белков при помощи электрофореза в додецилсульфат натрия полиакриламидном геле (ДСН-ПААГ) при постоянном напряжении 80В в течение 20 мин и в дальнейшем при напряжении 200В в течение 3-х часов. Результаты разделения протеинов на электро-фореграмме обрабатывали с помощью программы Gel-Imager, пакета программы Gel explorer версия 1,0 (ДНК-технология, Москва).

Оценку идентичности генома вируса ТГЭС из очищенного и сконцентрированного материала проводили с помощью ПЦР. Выделяли РНК вируса ТГЭС с использованием коммерческого набора с суспензионным силикатным сорбентом NucleoS+TM (Биоком, г. Москва) согласно инструкции производства препарата.

Результаты ПЦР документировали на трансиллюминаторе, оснащенным видеосистемой DNA-analyzer.

Лиофилизацию штамма ВН-96 вируса ТГЭС 5-го пассажа с активностью 6,5 18ТЦЦзс/мл проводили в ампулах ШПВ-6 в «Лаборатории инструментальных методов контроля» ФГУ ВГНКИ на установке LIOVAK GT-2. В качестве защитных сред (ЗС) использовали обезжиренное молоко (ОМ), среду ВГНКИ-3 и среду ЛС-18. В контроле лиофилизацию штамма ВН-96 вируса ТГЭС проводили без стабилизатора.

Для иммунизации крыс и кроликов использовали штаммы вируса ТГЭС ВН-96 и «TO^SD^» и инактивированную вакцину ЧССР. Активность сывороток крови оценивали в реакции нейтрализации (РМН), проводимой по Методике выявления антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней в реакции нейтрализации на микропанелях (2000).

Проверку антигенной и биологической активности штамма ВН-96 вируса ТГЭС проводили на 12 подсвинках, серонегативных по отношению к ТГЭС. Перед введением и через 22 дня после инъекции вируса сыворотки крови животных исследовали в РМН на наличие антител к вирусу ТГЭС. За животными проводили ежедневное наблюдение, а первые 3 дня после введения вируса проводили термометрию. Исследование биологической активности и стабильности штамма ВН-96 вируса ТГЭС проводили путем титрования в РМН и последовательного 7-ми кратного пассирования на перевиваемой линии клеток СПЭВ. в культуре клеток СПЭВ. Исходный вирус и культуры 3, 5 и 7 пассажей титровали в планшетах в 3-кратной повторности.

Достоверность результатов подтверждали путём статистической обработки результатов по общепринятым методикам и определения различий средних значений с помощью критерия Стьюдента. Результаты считали достоверными при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение и биологическая характеристика штамма ВН-96 вируса ТГЭС

На предварительном этапе нашей работы сравнительное изучение пригодности линии клеток СПЭВ для контроля специфической активности вируса ТГЭС проводилось с использованием штамма «РИМС». Активность образцов этого штамма вируса ТГЭС по ЦПД и методом бляшек была сопоставимой и достигала, соответственно, 6,22±0,07 lg ТЦД50/мл и 6,06±0,23*Ю6 БОЭ/мл. Под агаровым покрытием клетки монослоя равномерно окрашивались и сохраняли жизнеспособность в течение 8-9 суток, затем наблюдался их частичный лизис, достигающий максимума к 10-12 дню после заражения. Бляшки округлой формы различного размера выявлялись с 4-суток наблюдения и достигали максимальной величины на 6-7 сутки (рис. 1).

Рис. I. Бляшки, образуемые в монослое ПЛК СПЭВ штаммом ВН-96 вируса ТГЭС: К - контроль ПЛК. 4,5-опытные образцы ПЛК

Сравнительное изучение физико-химических свойств штамма ВН-96 вируса ТГЭС

Для электронно-микроскопического анализа выделенного варианта ВН-96 вируса ТГЭС использовали метод негативного контрастирования. Установлен диаметр вирионов на уровне 144,8±7,2 нм. При измерении вирионов в окрашенных фосфо-вольфрамовой кислотой препаратах были обнаружены плеоморфные, оболочечные вирионы со слоем булавовидных отростков (пепломеров) в виде короны длиной 12-20 нм. В суспензии присутствовали преимущественно неповрежденные вирусные частицы (более 90%). Количество дефектных частиц было невелико (рис.2)..

Рис. 2. Электронная микрофотография сконцентрированного препарата штамма ВН-96 вируса ТГЭС ( х 245000)

Сравнительный анализ размеров и морфологической характеристики частиц свидетельствовал о том, что они соответствуют __________вирусу рода Coronavirus животных. Нами был проведен анализ структурных белков штамма ВН-96 вируса ТГЭС методом электрофореза в ДСН-ПААГе и получена электрофореграмма с достаточным разделением белковых фракций маркера и вируса ТГЭС, что позволило сделать вывод о достаточно высокой концентрации вирусных белков в пробе после стандартной окраски геля

красителем КУМАССИ-С850. Анализ молекулярных масс выявленных белков показал, что они специфичны для вируса ТГЭС.

Были выявлены: белок Р (крупный поверхностный гликопротеин S) с молекулярной массой 170-200 кДа; белок N (основной нуклеокапсидный протеин) с молекулярной массой 50-62 кДа и белок М (матриксный мембранный протеин) с молекулярной массой 25-35 кДа (рис. 3).

В треке вирусных протеинов отмечено наличие фракции 15-17 кДа. По данным Wesley R.D. и Woods R.D. (¡986) такую же величину имеет негликоли-зируемый протеин 17кДа (I7K), который принадлежит структурному белку вируса ТГЭС. Следовательно, было достигнуто разделение всех известных белков вируса ТГЭС. Для идентификации нуклеиновой кислоты вируса ТГЭС нами была испытана технология изготовления тест-системы для ПЦР с использованием специфического праймера - консервативного участка генома S вируса ТГЭС, содержащего 886 пар нуклеотидов (пн).

Бедки ВТГС ВТГС Маркер Белки маркера

Щ?) (кДа)

Белок Е г—: //

(35-25) / , *_- -

Белок Р / г (160-200) Бело^' ' (50-62)

Белок 1 "К (15-17) ^

—.............

Рис. 3. Электрофореграмма структурных белков очищенного и сконцентрированного

препарата штамма ВН-96 вируса ТГЭС Примечание: ВТГС - трек структурных белков ТГЭС, Маркер - трек молекулярного белкового MapKepa"Precision plus protein standards AllBlue".

Результаты испытаний показали, что эта методика позволяет достоверно судить о наличии в концентрированном и очищенном образце генома вируса ТГЭС. На полученной электрофореграмме продуктов ПЦР в агарозном геле было достигнуто достаточно высокое разделение ДНК-маркера (DNA-Ladder 100) и комплементарной ДНК (кДНК) антигена вируса ТГЭС. В треках вирусной нуклеиновой кислоты выявлена единственная характерная фракция специфического продукта ПЦР (кДНК величиной 886 пн), свидетельствующая о наличии генома вируса ТГЭС в исследованной пробе (рис. 4).

ЙЙКВТГС (ПН1 К(-) ВТГС М Фрагменты маркера(пн)

Рис. 4. Электрофореграмма продуктов ПЦР кДИК. полученной из концентрированного препарата штамма ВН-96 вируса ТГЭС Примечание: К (-) - отрицательный контроль ПЦР: ВТГС - трек продуктов ПЦР кДНК препарата концентрированного ТГЭС; М - трек молекулярного ДНК-маркера "ОЫА-ЬасИег 100".

Сравнительная оценка чувствительности перевиваемых сублиний клеток почки эмбриона свиньи к вирусу ТГЭС

Нами были изучены на пригодность для использования в биотехнологии получения антигенного препарата вируса ТГЭС ПЛК сублиний СПЭВ-а и СПЭВ-б. Установлено, что клетки сублинии СПЭВ-б существенно отличаются м-уНю от сублинии СПЭВ-а по уровню адгезии, морфологическим показателям и ростовым свойствам. Клетки сублинии СПЭВ-а были зернистыми, рисунок монослоя слабо выражен, к концу периода роста в культуре отмечали дегенеративные изменения, а в культуральной жидкости - округлые апоптозные тельца, количество которых в процессе длительного культивирования возрастало.

Клетки сублинии СПЭВ-б, после хранения в жидком азоте в течение 30 лет, имели, по тесту витального окрашивания трипановым синим, жизнеспособность на уровне 82-86%,. При этом они сохранили свои адгезивные свойства и. в течение трех пассажей (общий 178-ой пассаж), полностью восстановили ростовые характеристики. На третьи сутки культивирования формировался конфлюэнт-ный клеточный монослой, цитоплазма клеток была мелкозернистая и вакуолизи-рована незначительно, ядерный хроматин равномерно распределен по всей кариоплазме. Изредка в монослое встречались гигантские и двуядерные клетки, местами отмечены интенсивно окрашенные участки монослоя, состоящие из клеток, растущих в несколько слоев (фокусы многослойного роста). На фоне нормальных митозов достаточно часто встречались неправильные - с отставанием хромосом в метафазе - 3-х и 4-х полюсные митозы.

При заражении ПЛК СПЭВ штаммом ВН-96 вируса ТГЭС было установлено, что более высокочувствительной тест-культурой является сублиния клеток СПЭВ-б. в которой вирус репродуцируется более интенсивно и накапливается в

максимальных титрах 7,0-7,5 ^ ТЦД^/мл. Сублиния клеток СПЭВ-а оказалась менее чувствительной культуральной моделью для размножения вируса, т.к. накопление вируса в пассажах было на 0,5 ]g ТЦДзо/мл ниже и не превышало 7,0 ^ ТЦД5(/мл.

Стандартизация перевиваемых сублиний клеток СПЭВ - субстратов для производства штамма ВН-96 вируса ТГЭС

В процессе биотехнологического производства антигена вируса очень важен этап контроля ПЛК на микоплазменную контаминацию. В нашей работе для индикации микоплазм в культурах сублиний клеток СПЭВ-а и СПЭВ-б параллельно использовали микробиологический и цитохимический методы контроля, а также ПЦР.Анализ полученных результатов показал, что микоплазменная инфекция сублиний клеток СПЭВ установлена в обеих тест-культурах как в ПЦР, так и ЦХМ, который пригоден для предварительного контроля и оценки уровня инфицированности клеточных культур микоплазмами. Микробиологический метод контроля оказался не эффективным (табл. 1).

Таблица 1 - Сравнительная оценка чувствительности методов индикации микоплазм - контаминантов в первичной и перевиваемых культурах клеток

Наименование культуральных моделей Шифр культур Результаты индикации микоплазм

Методы контроля

ПЦР ЦХМ мм

Перевиваемые сублинии клеток почки эмбриона свиньи СПЭВ-а + + -

СПЭВ-б + + _

Первичная культура клеток почек эмбрионов свиньи ПЭС - - -

Примечание: (-) - отрицательный результат; (+) - положительный результат контроля.

Далее были решены вопросы деконтаминации сублиний клеток СПЭВ от микоплазм-контаминантов при помощи моно- и комплексных препаратов на основе фторхинолонов. Установлено, что энрофлон-К в оптимальной дозе является достаточно активным в отношении микоплазм-контаминантов и умеренно-токсичным для сублиний клеток СПЭВ. Применение препарата по методу Mowles (1988) в течение 10 пассажей позволило очистить культуры клеток от микоплазменной инфекции благодаря оптимальному соотношению дозы ФХЛ, концентрации клеток и уровня инфицированности микоплазмами клеток в культурах.

Комбинации препаратов на основе фторхинолонов и ПАВ также характеризовались выраженными антимикоплазменными свойствами и обеспечили декон-таминацию сублинии клеток СПЭВ-б от контаминанта в течение первых 5 пассажей.

Препарат на основе норфлоксацина (50 мкг/мл) и этония (7,0) даже в более высокой концентрации оказался менее токсичным и вызывал лишь незначитель-

ные цитоморфологические изменения сублинии клеток СПЭВ-б, а последующее восстановление культуральных и морфологических показателей происходило в более короткие сроки (рис. 5).

Рис. 5. Перевиваемая линия клеток СПЭВ: а - чистая культура СПЭВ; б - разрушение культуры СПЭВ микоплазмами (начальная стадия), появление «окон» по стрелке; в - инфицированная микоплазмами культура СПЭВ; г - культура СПЭВ после деконтаминации

Энрофлоном-К

Последующее 10-ти кратное пассирование культуры клеток с контрольным набором антибиотиков не изменило положительного результата. Достоверность деконтаминации образцов субкультур СПЭВ была подтверждена ЦХМ и в ПЦР.

Свободные от микоплазм-контаминантов сублинии клеток СПЭВ-а и СПЭВ-б обладали выраженными ростовыми свойствами и в процессе серийного пассирования сохраняли исходную морфологическую структуру монослоя без признаков дегенерации клеток в культуре. Декоитаминированные от микоплаз-менной инфекции культуральные модели были размножены в стационарных условиях в соответствии с требованиями паспорта. Повторный контроль в ПЦР не выявил микоплазменной инфекции в образцах деконтаминированных сублиний клеток, сохраняемых в банке в жидком азоте.

Для анализа и стандартизации наиболее перспективных для практики линий клеток ряд авторов рекомендовали метод проточной цитометрии (ПЦ) (Полетаев, 1989; Ночевный и др. 2003). В нашей работе была проведена оценка при-

годности и перспективности использования ПЦ для анализа трофовариантов линий клеток СПЭВ-а и СПЭВ-б по следующим показателям: размерам клеток, гранулярности, распределению ДНК по фазам клеточного цикла и запрограммированной клеточной гибели - апоптозу.

Анализ клеток СПЭВ-а и СПЭВ-б с использованием малоугольного и 90° светорассеивания показал, что исходные образцы суспензий содержат соответственно 42,8 и 52,65 % пролиферирующих клеток, а также конгломераты, состоящие из 2-3 и более клеток. Отмечено также, что трофоварианты линии клеток СПЭВ-а, прошедшие дополнительно 111 пассажей, увеличились в среднем на 15% и достигли среднестатических размеров 18,87±2,11 мкм. В тоже время клетки линии СПЭВ-б, сохраняемые в криобанке с 1972 г., состояли из прозрачных, мелкозернистых, эпителиоподобных клеток размером не более 15,0±2,50 мкм (табл. 2).

Таблица 2 - Сравнительная характеристика культуральных и цитометрических показателей трофовариантов ПЛК СПЭВ

Показатели

Значение показателей

СПЭВ- а

Наименование тест-культур

спэв-е

Источник получения

ВГНКИ

ВНИИВВ и М

Культуральные свойства

Номер пассажа 305 | 184

Ростовая питательная среда «Игла МЕМ» (10% сыворотки крови к. р. С.)

Индекс пролиферации (ИП). 3-5 4-6

Контаминация микоплазмами - -

Цитометрические показатели

Размеры клеток, мкм 18.87 ±2,11 15,86 + 2,50

Гранулярность (МЕАМ) 461 379

Апоптоз, % 41,8 3,6

S 22,7 3,3

Фазы g2/g, 1,945 1,917

клеточного s+g2+m,% 24,0 10,3

цикла Показатели PC % CV PC% CV

G[+Go 76.0 6,6 89.7 4,9

G,+M 1,3 3.5 7,0 5,1

По показателю гранулярности исследуемые сублинии клеток СПЭВ заметно отличаются друг от друга, что подтверждают показатели МЕАМ для клеток сублинии СПЭВ-а на уровне 461 и для сублинии СПЭВ-б в пределах 379. Следует также отметить, что увеличение размеров и гранулярности клеток сублинии СПЭВ-а происходит параллельно в результате неадекватных условий и длительности пассирования клеток т-\)Ьго.

Результаты сравнительного изучения распределения ДНК по фазам клеточного цикла ПЛК СПЭВ, прошедших различное количество пассажей, показали, что культура СПЭВ-б оказалась более перспективной для практики, чем сублиния СПЭВ-а. Это заключение обосновано тем, что клетки СПЭВ-б интенсивно

пролиферируют (ИП4-6) in vilro, а показатель G2/G1 равный 1,917 характерен для нормально растущей культуры и указывает на отсутствие в популяции аномальных клеток с измененным количеством ДНК. Анализ гистограмм распределения клеток в зависимости от содержания ДНК показал, что для линий клеток СПЭВ-б показатель апоптоза был в 11,6 раза ниже, чем в культуре клеток СПЭВ-а и не превышал 3,6%.

Полученные данные, а также высокие ростовые свойства и удовлетворительные показатели клеточного цикла дают основание рекомендовать в качестве наиболее перспективного клеточного субстрата ПЛК СПЭВ-б, как для производства антигена, так и для контроля активности вируса ТГЭС. Напротив, длительное пассирование сублинии клеток СПЭВ-а и неудовлетворительные показатели клеточного цикла привели к значительному приросту (41,8%) апоптотических клеток. Эти факты говорят о старении и практической непригодности данной культуральной модели.

Таким образом, в результате исследований в качестве тканевого субстрата нами предложена перевиваемая сублиния клеток СПЭВ-б, характеризующаяся высоким ростовым потенциалом, оптимальными показателями ПЦ, нормальной морфологией и высокой чувствительностью к вирусу ТГЭС.Экспериментально подтверждена коррелятивная зависимость величины апоптоза и качества тест-культуры.

Этот факт указывает на возможность и перспективность использования достаточно экономичного метода ПЦ для экспресс-оценки, выбора и стандартизации образцов ПЛК гомологичного вида, но сохраняемых в российских и международных криобанках, а также позволяет рассматривать апоптоз в качестве объективного, практически значимого показателя, при выборе наиболее перспективного клеточного субстрата, отвечающего требованиям ВОЗ, как для целей диагностики, так и производства вакцин.

Оптимизация условий культивирования вируса ТГЭС в перевиваемой сублинии клеток почки эмбриона свиньи СПЭВ-б

На следующем этапе работы была решена задача разработки оптимальных условий культивирования вируса ТГЭС штамма ВН-96 и штамма TOi^SD^ в стационарных и роллерных культурах клеток СПЭВ в зависимости от факторов внешней среды.

Анализ полученных данных показал, что для получения максимальных титров штамма ВН-96 вируса ТГЭС оптимальными являются значения следующих факторов: посевная концентрация клеток 150 тыс./мл, заражение в суспензию в дозе 5,0-6,0 lg ТЦД5(), время адсорбции вируса клетками не менее 60 минут при 37°С, применение фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота и культивирование вируса роллерным методом.Эти показатели являются наиболее существенными, взаимозависимыми и определяющими, в итоге, уровень накопления вируса ТГЭС. В указанных условиях накопление штамма ВН-96 вируса ТГЭС достигал 6,5-7,5 и даже 8,0 lg ТЦДад/мл, что было подтверждено в экспериментальных условиях и, в последующем, в условиях производства (табл. 3).

Таблица 3 - Влияние дозы заражения на уровень накопления штамма ВН-96 вируса ТГЭС в сублинии клеток СПЭВ-б

Доза заражения, lg ТЦЦж Время адсорбции, мин. Накопление вируса, lg ТЦДм/мл

Срок культивирования, сут.

3 4 5 6 7

3.0 60 1,89±0,2 3,11±0,2 3.89±0.2 4.61 ±0,1 3,56+0,1

4.0 5.0+0,3 5.56+0, 6,0±0.3 * 5,28±0.3 4.0±0,3

5.0 5,39±0,4 7,0+0.3 * 6,78±0,2 5,33+0,3 5,0±0,3

6.0 5,89±0,2 7.0±0,3 * 6.89+0,4 5.89±0,2 5,0±0,3

Примечание: * - срок максимального накопления вируса (сутки).

Серийное пассирование штамма ВН-96 вируса ТГЭС в перевиваемой сублинии клеток СПЭВ-б

Возможность и перспективность длительного пассирования штамма ВН-96 вируса ТГЭ в сублинии клеток СПЭВ-б оценивали в оптимальных условиях и сроках культивирования, соответствующих ранее установленным показателям. Полученные данные свидетельствуют о том, что сублиния клеток СПЭВ-б является достаточно чувствительным субстратом для серийного пассирования штамма ВН-96 вируса ТГЭ свиней. Параллельно оценивали характер цитоморфологи-ческих изменений в тест-культуре под воздействием вируса ТГЭС. Контрольная монослойная сублиния клеток СПЭВ-б была представлена прозрачными, мелкозернистыми, эпителиоподобными клетками полигональной формы, которые сохранялись без смены ростовой среды в течение 6-8 суток. Урожай клеток в мо-нослойной культуре в 1 л матрасе достигал 35-40 млн.

В инфицированной сублинии клеток СПЭВ-б дегенеративные изменения под воздействием штамма ВН-96 обнаруживались через 36-48 часов после заражения. На 3-4 сутки наблюдения отмечается массовое округление клеток (круг-локлеточная дегенерация) и их частичное отслоение от субстрата с образованием «окон». Ряд клеточных элементов сливаются в многоядерные симпласты.

Таким образом, в результате проведенных исследований для серийного пассирования вируса ТГЭС была предложена высокочувствительная, неконта-минированная сублиния клеток СПЭВ-б, обеспечивающая накопление штамма ВН-96 на уровне 7,0-7,33 lg ТЦД5о в течение 10 пассажей.

Опытно-промышленное производство штамма ВН-96 вируса ТГЭС

Производство иммунобиологических препаратов требует выпуска больших объемов активных антигенов с минимальными затратами труда, средств и времени. Решение данной проблемы предполагает применение более эффективного и более производительного роллерного метода культивирования вирусов.

В проведенных нами экспериментах оценивали возможность и перспективность культивирования штамма ВН-96 вируса ТГЭС в сублинии клеток СПЭВ-б роллерным методом. Для этого использовали пластиковые роллерные бутыли объемом 2л (Rollerbottle Cellmaster) фирмы Greiner bio-one Weaton (USA). Скорость вращения бутыли составляла 12 об/час. В контрольных экспериментах ви-

рус выращивали в стационарных условиях в пластиковых матрасах (Сгешег) объемом 0,6 л. Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что культивирование вируса ТГЭС во вращающихся бутылях является более эффективным и производительным, чем метод стационарных культур (табл. 4).

Таблица 4 - Сравнительное культивирование штамма ВН-96 вируса ТГЭС стационарным и роллерным методами

Метод Объем Полезная Объем Доза за- Срок Накопле-

культиви сосу- площадь ПКК, суспензии, ражения. культи ние

ровакия дов. сосудов, тыс ./мл мл 1ЕТЦД® вир.. вируса,

л см2 сут. 'В

ТЦДч/мл

Роллерный 2,0 840 200 300 7.5±0,1

Стационарный 0,6 150 150 150 5,5 5 6,6±0,2

(контроль)

Примечание: ПКК - посевная концентрация клеток.

Во вращающихся сосудах отмечали практически 100%-ную адгезию клеток СПЭВ-б к поверхности субстрата, в контрольных - не более 90-95%, а моно-слойные культуры формировались на 24 часа раньше, чем в матрасах. Границы клеток и рисунок монослоя в роллерных культурах были более выраженными, зернистость отсутствовала. К 5 суткам наблюдения рН среды снижался с 7,4-7,6 до 6,9-7,1, за счет увеличения метаболической активности клеток в культуре.

Таким образом, роллерный метод культивирования обеспечивает оптимальные условия для репродукции штамма ВН-96 вируса ТГЭС в большей части клеточной популяции и накопление больших объемов антигена с активностью не ниже 7,33-7,5 ^ ТЦЦ5(/мл. Стабильное изготовление стерильного антигена наиболее реально при использовании энрофлона-К, обладающего выраженными антибактериальными и антимикоплазменными свойствами, что особенно важно при крупномасштабном производстве ПЛК, вируссодержащих материалов и иммунобиологических препаратов.

Установление оптимальных параметров лиофилыюго высушивания культурального вируса ТГЭС

Установлено, что при стандартных условиях лиофилыюго высушивания культурального вируса ТГЭС практически равноценным защитным эффектом характеризовались стабилизаторы ВГНКИ-3 и ОМ. Визуальный контроль показал, что высушенные образцы штамма ВН-96 вируса ТГЭС представлены в форме аморфных «таблеток» светлых тонов, не содержат «кратеров» и «каверн», имеют форму нижней части ампул и легко отделяются от стекла при легком встряхивании.

Снижение активности в образцах вируса с оптимальными защитными средами в результате замораживания и лиофилизации составляло, соответственно, с ОМ 0,7-0,9 lg ТЦД5(/мл. Дальнейшие исследования по термоинактивации сухих образцов штамма ВН-96 вируса ТГЭС в течение года при 20+2° С и 37±0,5° С подтвердили равноценность (р<0,01) стабилизирующих свойств, защитных сред

ВГНКИ-3 и ОМ при коэффициенте корреляции (Я) соответственно 0,85 и 0,80 и целесообразность применения на практике стабилизатора ВГНКИ-3. Это обусловлено тем, что исходное сырье для производства ОМ нестандартно по качеству, поэтому с практической точки зрения более целесообразно и более практично использовать защитную среду ВГНКИ-3. Полученные данные свидетельствуют о том, что лиофилизированный штамм ВН-96 вируса ТГЭС со стабилизатором ВГНКИ-3 является достаточно стабильным препаратом (табл. 5).

Таблица 5 - Стабильность штамма ВН-96 вируса ТГЭС, высушенного с различными защитными средами при температуре 20±2° С

Сроки хранения, сут. Активность вируса, 1;; ТЦДчп/мл

Наименование защитных сред

ВГНКИ-3 ЛС-18 ОМ

Нативный вирус 6,5 6,5 6,5

0-проба 5,56±0,1 5,36±0,1 5,56+0,1

120 5,56±0,1 5,11 ±0,2 5,39+0,1

240 5,11 ±0,2 4,56±0,1 5,11+0,2

360 4,56±0,1 4.28±0,2 4,89+0,2

Я 0,9 0.8 0.5

При температуре минус 20° С в течение 2-х лет музейного хранения (срок наблюдения) препарат практически сохранил исходную активность вируса. При 4-8° С сухой препарат также сохранял стабильность, и лишь через 18-24 мес. хранения потери активности вируса достигали 1,0 ^ ТЦД50/мл.

Таким образом, в результате сравнительных исследований для практического использования были предложены защитная среда ВГНКИ-3 и оптимальные режимы высушивания полуфабриката, обеспечивающие сохранность вируса ТГЭС не менее 2-х лет хранения, как в замороженном состоянии, так и в условиях бытового холодильника.

Изучение антигениых свойств штамма ВН-96 вируса ТГЭС

Для доказательства возможности применения штамма ВН-96 вируса ТГЭС в культуре клеток СПЭВ-б для изготовления нативных и лиофилизированных образцов антигенов против ТГЭС нами были проведены сравнительные исследования по оценке его антигенных свойств, штамма «ТОз^Оцц» и вакцины производства ЧССР.

Установлено, что на 30-й день после иммунизации всеми испытуемыми штаммами вируса ТГЭС в сыворотках крови белых беспородных крыс были выявлены специфические вируснейтрапизующие антитела при постановке реакции нейтрализации (РН). При этом, в сыворотке крови крыс при введении штамма ВН-96 антитела определялись в разведении 1/128 и при введении вакцины ЧССР - 1/256, что было выше значений для сыворотки крови крыс при введении штамма «ТОу^П-.ч,».

Полученные результаты позволили провести дальнейшие сравнительные исследования антигенных свойств штамма ВН-96 и вакцины производства ЧССР

на кроликах. Выявлены специфические вируснейтрализующие антитела в РН при разведении сывороток крови 1/512, что подтвердило одинаково высокую ан-тигеную активность этих штаммов.

На следующем этапе исследований антигенную активность штамма ВН-96 определяли на 12 серонегативных по отношению к ТГЭС подсвинках. За животными проводили ежедневные наблюдения, а первые три дня после введения вируса измеряли температуру тела. Клинические наблюдения за иммунизированными животными не выявили у поросят каких-либо отклонений в их состоянии; животные оставались клинически здоровыми на протяжении всего срока наблюдений. Через 22 дня после иммунизации все подсвинки стали сероположитель-ными, титры специфических антител определялись на уровне 4,5-7,0 log2 против штамма «Ленинградский» и 5,5-7,5 log2 против штамма ВН-96.

Исследование биологической активности штамма ВН-96 вируса ТГЭС изучали с помощью проведения 7 последовательных пассажей на культуре клеток СПЭВ. Исходный титр вируса составлял 5,25±0,25 lg TLUWcm3. На 3-ем пассаже титр вирус составлял 5,75+0,31 lg ТЦДд/см\ а к 5-му пассажу вирус накапливался в максимальных титрах и составлял 7,00+0,51 lg 'ПДДзц/см'.П то же время дальнейшее пассирование не привело к повышению титра ТГЭС штамма ВН-96.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что выделенный штамм ВН-96 вируса ТГЭС обладает выраженными антигенными свойствами и высокой биологической активностью. Данный факт позволил сделать вывод о перспективности его использования для конструирования вакцины.

Сравнительная оценка иммунобиологических свойств штамма ВН-96 вируса ТГЭС в условиях свиноводческого комплекса

Для оценки вирулентности штамма ВН-96 вируса ТГЭС использовали 15 однодневных поросят, полученных от серонегативных по ТГЭС свиноматок. Предварительно сухой препарат в ампулах разводили физраствором и вводили перорально (п/о) в объёме 5 мл/гол., содержащем вируса 105 lg ТЦДед. Пяти контрольным животным препарат не вводили и содержали их отдельно при температуре 32-35 °С. Клинические признаки ТГЭС (температурная реакция, диарея, рвота, мышечная дрожь и конвульсии) и других вирусных инфекций (классической чумы свиней, болезни Ауески, РРС, везикулярной болезни, энтеро-, парво- и аденовирусов) отсутствовали. Гибели поросят в течение срока наблюдения (20 суток) не отмечено. Следовательно, штамм ВН-96 вируса ТГЭС является авиру-лентным, не вызывает поствакцинальных осложнений и гибели животных.

Реверсибельность аттенуированного штамма ВН-96 вируса ТГЭС оценивали на новорожденных безмолозивных поросятах в течение 5 пассажей. Для каждого пассажа штамма использовали по 5 поросят. В первом пассаже для интрана-зального заражения животных использовали исходный штамм в дозе 2x106'5 lg ТЦД50. Через 2-3 суток 2-х поросят из 5-ти забивали. Из тканей тонкого отдела кишечника, лёгких и лимфоузлов готовили 10 % суспензию, которую осветляли центрифугированием, добавляли антибиотики и в качестве исходного материала в объёме 5 мл использовали для интраназалыюго заражения (2-ой пассаж) поро-

сят, а также для вирусвыделения на культуре клеток СПЭВ. Аналогичным образом проводили 3-5 пассажи. После каждого пассажа 3 оставшихся вакцинированных поросят выдерживали в течение 10 суток и оценивали общее состояние животных по клиническим признакам. Проведённые исследования показали, что штамм ВН-96 сохраняет исходные биологические свойства в течение 5 пассажей.

Иммуногенность штамма ВН-96 оценивали на 25 дневных поросятах, полученных от серонегативных по ТГЭС свиноматок. Опытных поросят (15 голов) однократно внутримышечно вакцинировали штаммом ВН-96 в дозе 4,2 ^ ТЦДМ). Контрольных поросят (10 голов) не вакцинировали и содержали отдельно при температуре 32-35°С. Через 10 дней после введения вируса отбирали пробы крови. Полученные сыворотки исследовали в РМН на наличие специфических антител. Результаты исследований показали, что штамм ВН-96 вируса ТГЭС обеспечивает синтез вируснейтрализующих антител в организме привитых поросят, определяемых в сыворотке крови в титре 2,11±0,39 и 100% сохранность вакцинированных поросят.

Таким образом, проведенные исследования позволили выделить и охарактеризовать биологические свойства штамма ВН-96 вируса ТГЭС, которые сохраняются в течение 5 пассажей. Доказано, что штамм ВН-96 является безвредным и авирулентным для лабораторных животных и поросят, генетически стабилен в процессе серийного пассирования, характеризуется выраженными антигенными и иммуногенными свойствами, что позволяет рекомендовать его для конструирования вакцины против вируса ТГЭС. Отработаны биотехнологические параметры культивирования штамма ВН-96 вируса ТГЭС, использования и деконтаминации ПЛК СПЭВ, обоснованы используемые питательные среды и ростовые добавки, оптимальные режимы замораживания и лиофилизации куль-турального вируса ТГЭС, рекомендованные к практическому использованию.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что по размерам и морфологии частиц, электрофоретической подвижности и молекулярной массе структурных белков, по наличию в треках ПЦР вирусной нуклеиновой кислоты характерной фракции комплементарной ДНК (кДНК) величиной 886 пар нуклеотидов вирионы штамма ВН-96 соответствуют показателям коронавируса свиней. Специфичность штамма ВН-96 подтверждена в реакции нейтрализации со специфической сывороткой крови и в ПЦР.

2. Установлена различная чувствительность первичной культуры клеток почек эмбриона поросят и перевиваемых сублиний клеток СПЭВ к штамму ВН-96 вируса ТГЭС. Наиболее чувствительной и перспективной культуральной моделью для практического применения является ПЛК сублинии СПЭВ-б.

3. Выявлено, что деконтаминация линии клеток СПЭВ в максимальных концентрациях, не превышающих 40-50 тыс./мл, от микоплазменной инфекции наиболее успешна при использовании моно-препарата на основе энрофлона-К по методу Мовлеса и двух комбинированных препаратов: норфлоксацин (50мг/мл) + этоний (7мкг/мл) и энрофлон-К (35 мкг/мл) + твин-80 (7мкг/мл).

4. Определена целесообразность применения метода проточной цитомет-рии для экспресс-оценки и выбора наиболее перспективной культуральной модели для производства антигена и контроля активности вакцины против ТГЭ свиней. Установлена обратная зависимость ростовых свойств и величины апоп-тоза сублшши клеток СПЭВ-б.

5. Максимальное накопление вируса (6,67-7,33 Ig ТЦД}д/мл) происходит при посевной концентрации ПЛК сублинии клеток СПЭВ-б 150тыс/мд, заражении в суспензию клеток ПЛК штамма В №96 вируса ТГЭС из расчета 5,0 lg ТЦЦ50/МЛ, адсорбции вируса клетками в течение 60 минут при 37°С. Оптимальной ростовой питательной средой является среда «Игла МЕМ» с 2-4% фетальной сывороткой крови; накопление вируса роллерным методом достоверно выше на 0,7-1,0 lg ТЦДзо/мл, чем в стационарной культуре.

6. Определена эффективная защитная среда - ВГНКИ-3, в которой лио-филыю высушенный штамма ВН-96 сохраняет безвредность для лабораторных животных и исходную активность не менее двух лет, при температуре хранения 4-6° и минус 20"С.

7. Штамм ВН-96 вируса ТГЭС обладает безвредностью, авирулеттюстью для лабораторных животных и поросят, сохраняет исходные биологические свойства в течение 5-и пассажей, генетически стабилен в процессе серийного пассирования, характеризуется выраженными антигенными и иммуногенными свойствами, что позволяет использовать его для конструирования вакцины против вируса ТГЭС.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Методические рекомендации о порядке аттестации и поддержания перевиваемых линий клеток, используемых для культивирования вирусов и производства иммунобиологических препаратов ветеринарного назначения // Дьяконов Л. П., Уласов В. Н., Соловьев Б. Н„ Симоненко Н. В. и др. - М. - 2006 г.

2. Методические указания по поддерживанию, хранению и контролю линии клеток «СПЭВ-б», утвержденные ФГУ ВГНКИ от 6 апреля 2007 г.

3. Для деконтаминации линии клеток СПЭВ от микоплазменной инфекции рекомендуется использовать моно-препарат на основе энрофлона-К и два комбинированных препарата на основе норфлоксацина с этонием и энрофлон-К с твином-80. Максимальные концентрации обрабатываемых ПЛК не должны превышать 40-50 тыс./мл. Сыворотки крови, вносимые в питательную среду, необходимо предварительно обработать с профилактической целью энрофлоном-К в дозе 20 мкг/мл в течение 72 часов при 37° С.

4. Рекомендуется для экспресс-оценки и выбора наиболее перспективной культуральной модели для производства антигена использовать метод проточной цитометрии, при котором достигается быстрая оценка характеристик клеток по показателям: размеры клеток, гранулярность, распределение ДНК по фазам клеточного цикла и запрограммированная клеточная гибель - апоптоз.

5. Для лиофилизации штамма ВН-96 вируса ТГЭС предлагается применять защитную среду ВГНКИ-3, обеспечивающую его безвредность для лаборатор-

ных животных и сохранение исходной активности штамма не менее двух лет при температуре хранения 4-6° и минус 20° С.

6. Рекомендуется использовать штамм ВН-96 вируса ТГЭС в качестве производственного атгенуированного штамма для изготовления диагностических и иммунобиологических препаратов против трансмиссивного гастроэнтерита свиней.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дьяконов Л.П. Методические рекомендации о порядке аттестации и поддержания перевиваемых линий клеток, используемых для культивирования вирусов и производства иммунобиологических препаратов ветеринарного назначения/ Л.П. Дьяконов, В.П. Уласов, Б.В. Соловьев, Н.В. Симоненко // Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины. - Москва, 2006. - Ч. IV.-С. 422-439.

2. Ласкавый В.Н. Иммунофарм - эффективный иммуномодулятор для профилактики тансмиссивного гастроэнтерита свиней в неблагополучных хозяйствах / В.Н. Ласкавый, Н.В. Воронова (Симоненко), В.Т. Ночевный // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных: сб. тр. межд. науч.-практ. конф. - Покров, 2008,- С. 172-175.

3. Ласкавый В.Н. Стандартизация сублиний клеток почки эмбриона свиньи методом проточной цитометрии / В.Н. Ласкавый, Н.В. Воронова (Симоненко), С.Г. Юрков, Л.А. Яковлева, Б.В. Виолин, В.Т. Ночевный // Аграрная наука. - 2007. -№ 4. - С. 29-31.

4. Симоненко Н.В. Очистка линии клеток почки эмбриона свиньи от микоплазменной инфекции/ Н. В. Симоненко И Вестник Саратовского госуии-верситета им. Н.И. Вавилова. - 2008. - № 2. - С. 53-55.

5. Симоненко Н.В. Оптимизация условий накопления вируса ТГЭ свиней в культуре перевиваемой линии клеток почки эмбриона свиньи / Н.В. Симоненко //Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики инфекционных болезней животных и птиц: сб. науч. тр. - Екатеринбург, 2008. - Вып. 2. - С. 92-95.

6. Симоненко Н.В. Стабилизация изолята «ВН-96» вируса ТГЭ свиней методом лиофильного высушивания/ Н.В. Симоненко // Проблемы, задачи и пути научного обеспечения приоритетного национального проекта «Развитие АПК»: сб. материалов Всерос. науч.-практ. конф. - Новочеркасск, 2008. - С. 5760.

7. Симоненко Н.В. Изучение физико-химических и иммунобиологических свойств штамма ВН-96 вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней / Н.В. Симоненко, В.Н. Ласкавый, В.Т. Ночевный // Аграрная наука. - 2010. - № 11.- С. 30-32.

Симокенко Наталья Валерьевна

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 6.05.2011 г. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ № 797.

Отпечатано в типографии ООО «Техно-Декор» г. Саратов, Московская, 160

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Симоненко, Наталья Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Трансмиссивный (вирусный) гастроэнтерит свиней (историческая справка).

1.2. Физико-химические и биологические свойства вируса ТГЭС.

1.3. Культуральные свойства вируса ТГЭС.

1. 4. Влияние различных факторов на уровень накопления вирусов в монослойных культурах клеток.

1.5. Некоторые аспекты стандартизации перевиваемых линий клеток.

1. 6. Стабилизация вируса методом лиофильного высушивания.

1. 7. Средства и методы специфической профилактики ТГЭС.

ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2. 1. Материалы и методы.

2. 1. 1. Объекты исследования.

2. 1.2. Подготовка перевиваемой линии клеток.

2. 1.3. Методы индикации микоплазм в клеточных культурах.

2. 1.4. Цитометрические исследования линий клеток.

2. 1.5. Условия культивирования вируса.

2. 1. 6. Цитоморфологические методы изучения инфицированных и контрольных культур клеток.

2. 1. 7. Изучение бляшкообразующей способности штамма ВН-96. 52 2. 1. 8. Физико-химические методы исследования культурального вируса ТГЭ свиней.

2. 1. 9. Лиофилизация вируса.

2.1.10. Проверка антигенной и биологической активности штамма ВН-96 вируса ТГЭС.

2.1.11. Статистическая обработка результатов исследований.

2. 2. Результаты исследований и их обсуждение.

2.2.1. Выделение и биологическая характеристика штамма ВН-96 вируса ТГЭС.

2.2.2. Сравнительная характеристика и оценка чувствительности сублиний клеток почки эмбриона свиньи к штамму ВН-96 вируса ТГЭС.

2.2.3. Стандартизация перевиваемых сублиний клеток СПЭВ - субстратов для производства штамма ВН-96 вируса ТГЭС.

2.2.4. Оптимизация условий культивирования вируса ТГЭС в сублинии клеток СПЭВ-б.

2.2.5. Серийное пассирование штама ВН-96 вируса ТГЭС в сублинии клеток СПЭВ-б.

2.2.6. Опытно-промышленное производство вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней.

2.2.7. Лиофильное высушивание культурального вируса ТГЭС.

2.2.8. Изучение антигенных свойств и биологической активности штамма ВН-96 вируса ТГЭС.

2.2.9. Сравнительная оценка иммунобиологических свойств штамма «ВН-96» вируса ТГЭС в условиях свиноводческого комплекса.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологическая характеристика штамма ВН-96 вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней и разработка биотехнологических параметров его культивирования"

Трансмиссивный (вирусный) гастроэнтерит свиней (ТГЭС) - остро протекающая, высоко контагиозная болезнь, которая поражает животных t всех возрастных групп, но главным образом поросят до 3-х месячного возг раста и наносит значительный экономический ущерб промышленному свиноводству [101,135,164,193].

За последние 10-15 лет в мире резко возрос объем научных разработок, связанных с более широким применением перевиваемых линий клеток (ПЛК) в качестве субстрата для производства иммунобиологических препаратов (ИБП). Важное место в решении задач применения ПЛК в биотехнологии занимают вопросы выбора, контроля и стандартизации свойств, совершенствования технологии культивирования ПЛК, создания рабочих и посевных банков клеток в жидком азоте, поиска и апробации новых более эффективных антибактериальных препаратов, а также проблем контаминации и деконтаминации культур клеток и ИБП от бактерий и микоплазм [15, 27, 66,123].

Исследования, направленные на поиск, паспортизацию и стандартизацию ПЛК, предназначенных для получения вируса ТГЭС с выраженными ан- ■ тигенными и иммуногенными свойствами, а также разработка более стабильi ного по генетическим и иммунобиологическим показателям авирулентного штамма вируса ТГЭС, пригодного для профилактики данного заболевания у свиней разных половозрастных групп, является актуальной задачей на современном этапе и имеет большое практическое значение.

Для достижения поставленной цели нами были определены следующие задачи:

1. Провести селекцию штамма ВН-96 вируса ТГЭС и изучить его физико-химические свойства.

3. Подобрать средства и методы деконтаминации тест-культур с использованием моно- и комплексных препаратов на основе фторхинолонов и поверхностно активных веществ;

6. Изучить антигенные, и иммуногенные свойства штамма ВН-96 вируса ТГЭС; обосновать перспективность его использования в качестве вакцинного препарата.

Научная новизна. Впервые выделен и изучен штамм ВН-96 вируса ТГЭС, определены оптимальные условия его культивирования и изучена бляшкообразующая способность. На основании изучения антигенных и им-муногенных свойств обоснована перспективность использования штамма ВН-96 вируса ТГЭС в качестве вакцинного препарата.

7 '

Впервые доказана возможность и перспективность использования метода проточной цитометрии для экспресс-оценки культуральных, цитометриче-ских и морфологических показателей, а также выбора наиболее перспективной культуральной модели для репродукции вируса ТГЭС.

Практическая значимость. Разработаны методы концентрирования и очистки культурального вируса ТГЭС штамм ВН-96. Апробирован эффективный способ деконтаминации линии клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) при помощи моно- и комбинации препаратов на основе Энрофлона-К и поверхностно-активных веществ. Определена оптимальная схема деконтаминации ПЛК сублинии СПЭВ-б от микоплазм. Подготовлены для практического использования очищенные от микоплазм-контаминантов эталонный. и рабочий криобанки ПЛК сублинии клеток СПЭВ-б со стабильными кулъ-туральными и цитометрическими показателями. Определены оптимальные условия культивирования вируса ТГЭС в ПЛК сублинии СПЭВ-б стационарным и роллерным методами. Предложена защитная среда оптимального состава, разработаны режимы лиофилизации и условия хранения сухих форм культурального вируса ТГЭС.

По материалам диссертационной работы опубликованы «Методические рекомендации о порядке аттестации и поддержания перевиваемых линий клеток, используемых для культивирования вирусов и производства иммунобиологических препаратов ветеринарного назначения» (в соавторстве с Л. II. Дьяконовым, В. П. Уласовым, Б. В. Соловьевым, 2007), утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН А.М. Смирновым от 19.10.2007г.

Основные положения, выносимые на защиту <

1. На основании определения размеров и морфологии частиц, изучения физико-химических свойстб, электрофорешческой подвижности и молекулярной массы структурных белков, антигенных и иммуногенных свойств подтверждена подлинность и специфичность штамма ВН-96 вируса ТГЭС.

2. Перевиваемая : линия клеток СПЭВ-б наиболее чувствительна к штамму ВН-96 вируса ТГЭС.

3. Эффективная деконтаминация линии клеток почки эмбриона свиньи от микошазменной инфекции достигается при использовании энрофлона-К и комбинаций препаратов норфлоксацина с этонием и энрофлона-К с твином 80. . ' < ' ' ' ^ ' ' \ . . . V;-'. , . . - •/.

4. Оптимальными условиями для выращивания линии клеток СПЭВ-б и репродукции штамма ВН-96 вируса ТГЭС являются: посевная концентра-. ция клеток150 тыс:/мл, заражение в суспензию в дозе 5,0-6,01g ТЦДзо, время адсорбции вируса клетками не менее 60 минут при 37°СУ применение феталь ной сыворотки крови крупного рогатого скота и культивирование вируса роллерным методом.

5. Для замораживания и лиофилизации штамма ВН-96 вируса ТГЭС в биотехнологическом процессе эффективно использование защитной среды вгнки-з. ' .

Работа выполнена в лаборатории бактериальных и вирусных инфекций ГНУ Саратовский научно исследовательский ветеринарный институт Россельхозакадемии:

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на: Международной научно-производственной конференции «Экологобиологические проблемы повышения продуктивного долголетия животных» (Екатеринбург, 2006 г.); Международной научно-практической конференции «Проблемы профилактики и борьбы. а особо опасными, экзотическими и.малоизученными инфекционными болезнями животных» (Покров, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы, задачи и пути научного 1 - ' ■ ' ' ! обеспечения приоритетного национального проекта «Развитие АПК» (Новочеркасск, 2008)1 ; ,

Публикации. '-.'»"

По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы и результаты исследований и их обсуждение, заключения, выводов, практических предложений, списка литературы. Список литературы включает 218 источников, в том числе 136 отечественных и 82 зарубежных. Работа иллюстрирована 27 таблицами и 12 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Симоненко, Наталья Валерьевна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что по размерам и морфологии частиц, электрофоретической подвижности и молекулярной массе структурных белков, по наличию в треках, ПЦР вирусной нуклеиновой кислоты характерной фракции комплементарной ДНК (кДНК) величиной 886 пар нуклеотидов вирионы штамма ВН-96*соответствуют показателям коронавируса свиней. Специфичность штамма ВН-96 подтверждена в реакции нейтрализации со специфической сывороткой крови и в ПЦР.

5. Максимальное накопление вируса (6,67-7,33 lg ТЦД50/мл) происходит при посевной концентрации ПЛК сублинии клеток СПЭВ-б 150тыс/мл, заражении в суспензию клеток ПЛК штамма ВН-96 вируса ТГЭС из расчета 5,0 lg ТЦД5о/мл, адсорбции вируса клетками в течение 60 минут при 37°С. Оптимальной ростовой питательной средой является среда «Игла МЕМ» с 2-4% фетальной сывороткой крови; накопление вируса роллерным методом достоверно выше на 0,7-1,0 ^ ТЦД5о/мл, чем в стационарной культуре.

6. Определена эффективная защитная среда - ВГНКИ-3, в которой лио-фильно высушенный штамма ВН-96 сохраняет безвредность для лабораторных животных\и исходную активность не менее двух лет, при температуре хранения 4-6° и минус 20°С.

7. Штамм ВН-96 вируса ТГЭС обладает безвредностью, авирулентностью для лабораторных животных и поросят, сохраняет исходные биологические свойства в течение 5-и пассажей, генетически стабилен в процессе серийного пассирования, характеризуется выраженными антигенными и иммуногенными свойствами, что позволяет использовать его для конструирования вакцины против вируса ТГЭС.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Методические рекомендации о порядке аттестации и поддержания перевиваемых линий клеток, используемых для культивирования вирусов и производства иммунобиологических препаратов ветеринарного назначения // Дьяконов Л. П., Уласов В. Н., Соловьев Б. Н., Симоненко Н. В. и др. - М. - 2006 г.

3. Для деконтаминации линии клеток СПЭВ от микоплазменной инфекции рекомендуется использовать моно-препарат на основе энрофлона-К и два комбинированных препарата на основе норфлоксацина с этонием и энрофлон-К с твином-80. Максимальные концентрации обрабатываемых ПЛК не должны превышать 40-50 тыс./мл. Сыворотки крови, вносимые в питательную среду, необходимо предварительно обработать с профилактической целью энрофло-ном-К в дозе 20 мкг/мл в течение 72 часов при 37°С.

5. Для лиофилизации штамма ВН-96 вируса ТГЭС предлагается применять защитную среду ВГНКИ-3, обеспечивающую его безвредность для лабораторных животных и сохранение исходной активности штамма не менее двух лет при температуре хранения 4-6° и минус 20° С.

6. Рекомендуется использовать штамм ВН-96 вируса ТГЭС в качестве производственного аттенуированного штамма для изготовления диагностических и иммунобиологических препаратов против трансмиссивного гастроэнтерита свиней.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Трансмиссивный (вирусный) гастроэнтерит свиней (ТГЭС) - остро протеt ! кающая, высоко контагиозная болезнь, которая поражает животных всех возрастных групп, но главным образом поросят до З-х месячного возраста и наносит значительный экономический ущерб промышленному свиноводству [27, 29, 54, 134, 176]. Основным средством борьбы с вирусом ТГЭС является специфическая профилактика при помощи моно- и ассоциированных вакцин, а также инактивированных препаратов, технология изготовления-и схема применения которых несовершенны, поэтому результативность вакцинации животных' недостаточно эффективна. Не отвечают современным требованиям и вопросы подбора, контроля и паспортизации культуральных моделей, условия получения и оценка качества антигена, а также контроля активности и подлинности штамма вируса ТГЭС. Следует также указать на целый ряд нерешенных и малоизученных проблем по применению иммунобиологических препаратов (ИБП) в неблагополучных по ТГЭС хозяйствах [98, 121, 134,135].

За последние 10-15 лет в мире резко возрос объем научных разработок, связанных с более широким применением перевиваемых линий клеток (ПЛК) в качестве субстрата для производства иммунобиологических препаратов (ИБП). При общей тенденции более широкого применения ПЛК в биотехнологии существует целый ряд нерешенных и малоизученных проблем, тормозящих процессы разработки и совершенствования ИБП и, в частности, вакцин против. ТГЭС. Важное место в решении этих задач занимают вопросы выбора, контроля и стандартизации свойств, высокочувствительных к вирусу ТГЭС культу-ральных моделей, совершенствования технологии культивирования ПЖ, характеристики и методов получения штаммов вируса ТГЭС в больших объемах, i i 1 создания рабочих и посевных банков клеток в жидком азоте, стабилизации свойств и условий хранения вируса, поиска и апробации новых более эффективных антибактериальных препаратов, а также проблем контаминации и деконтаминации культур клеток и ИБП от бактерий и микоплазм [20, 123]. Поэтому исследования, направленные на поиск, паспортизацию и стандартизацию ПЛК, предназначенных для получения вируса ТГЭС с выраженными антигенными и иммуногенными свойствами, а также вопросы оптимизации условий культивирования вируса ТГЭС, представляют для ветеринарии бесспорную! актуальность. 1

В результате селекции штамма «РИМС» был получен стабильный крупно-бляшечный вариант вируса ТГЭС размером бляшек 4,5-5,0 мм, условно названный ВН-96, и изучены его морфологические, физико-химические и биологические показатели.

Использование современных физико-химических методов достоверно показало, что по морфологии вирионов, электрофоретической подвижности, молекулярной массе структурных белков, а также по результатам ПЦР исследуемый вирус следует квалифицировать, как штамм вируса ТГЭС.

В результате выполненных исследований были получены деконтаминиро-ванные от микоплазм сублинии клеток СПЭВ. Установлено, что наиболее приемлемой в научном и практическом плане является перевиваемая сублиния клеток, сохраняемая в ВНИИВВ и М (СПЭВ, 184 пассаж), и условно обозначенная нами как СПЭВ-б. Данная культура характеризуется однородной клеточной популяцией, нормальной морфологией, высоким ростовым потенциалом и оптимальными показателями проточной цитометрии (ПЦ). Она стабильна по ка-риотипу, интенсивно пролиферирует, длительно сохраняется в жидком азоте и поэтому перспективна для массового производства вируса ТГЭС. Кроме того, линия клеток СПЭВ-б характеризуется высокой чувствительностью к вирусу ТГЭС и обеспечивает максимально высокое накопление штамма ВН-96 на уровне 7,0-7,33 ^ ТЦД50, поэтому сублиния клеток СПЭВ-б была предложена нами в качестве тканевого субстрата для производства антигена.

Экспериментально подтверждена зависимость величины апоптоза и качества тест-культуры. Этот факт указывает на возможность использования метода

ПЦ для экспресс-оценки и стандартизации образцов перевиваемых линий клеток (ПЛЕС) гомологичного вида, а также позволяет рассматривать апоптоз в качестве практически значимого показателя, при выборе наиболее перспективного клеточного субстрата.

Анализ полученных данных показывает, что результативность культивирования вируса ТГЭС существенным образом зависит от исследуемых факторов. Наибольшее влияние на уровень накопления штамма • ВН-96 в сублинии клеток СПЭВ-б оказывают: концентрация клеток в суспензии, доза и способ заражения, время адсорбции вируса, качество сыворотки крови и способ культивирования. Эти показатели являются наиболее существенными, взаимозависимыми и определяющими в итоге уровень накопления вируса ТГЭС. Остальные факторы культивирования вируса имеют относительно постоянные величины, поэтому их следует поддерживать на уровнях близких к оптимальным значениям. В указанных условиях накопление штамма ВН-96 вируса ТГЭС достигало 6,5-7,5 и даже 8,0 ^ ТЦД50/мл, что было подтверждено в экспериментальных условиях и в последующем-в условиях производства. Стабильное изготовление стерильного антигена наиболее реально при использовании Энрофлона-К, обладающего выраженными анти-бактериальными и антимикоплазменными свойствами.

Наибольшее преимущество имеет роллерный метод культивирования, который обеспечивает, в итоге, оптимальные условия для репродукции-штамма ВН-96 вируса ТГЭС в большей части клеточной популяции и накопление больших объёмов антигена с.активностью не ниже 7,33-7,5 \% ТЦЩо/мл.

В результате сравнительных исследований для практического использования были предложены защитная среда ВГНКИ-3 и оптимальные режимы высушивания полуфабриката, обеспечивающие сохранность штамма ВН-96 вируса ТГЭС не менее 2-х лет хранения, как в замороженном состоянии, так и в условиях бытового холодильника.

Таким образом, в результате исследовании установлено, что выделенный штамм ВН-96 вируса ТГЭС свободен от бактериальной, грибковой и микоплаз-менной контаминации, сохраняет исходные биологические свойства в течение 5-и пассажей, генетически стабилен в процессе серийного (20 пассажей) пассирования, невирулентен для лабораторных животных и свиней различного возраста, а также обладает высокой антигенной активностью.

Испытания штамма ВН-96 в условиях свинокомплекса подтвердили его безвредность, авирулентность, отсутствие контагиознасти и наличие выраженных антигенных и иммуногенных свойств. Не установлено отрицательного влияния на привесы и сохранность животных.

Результаты проведённых исследований позволяют рекомендовать штамм ВН-96 в качестве производственного для изготовления диагностических и иммунобиологических препаратов против трансмиссивного гастроэнтерита свиней.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Симоненко, Наталья Валерьевна, Саратов

1. Алипер Т.И. Трансмиссивный гастроэнтерит свиней; разработка методов- лабораторной диагностики и средств специфической профилактики: дис. .д-ра. биол. наук/Т.И.Алипер. -М. -2001. -С.41-42.

2. Аноятбеков М.В. Профилактика и меры борьбы с трансмиссивным-гастроэнтеритом, ротавирусной болезнью и колибактериозом свиней в условиях Таджикистана: дис. . д-равет. наук/М.В. Аноятбеков М. - 1997. - С. 10-32.

3. Ануфриев П.А. Трансмиссивный гастроэнтерит свиней (эпизоотология, диагностика и профилактика): дис. канд. вет. наук/ П.А. Ануфриев Воронеж. -1999.-122 с.

4. Апоптоз: начало будущего/ А.Н. Маянский и др.// Журнал микро-биол. 1997. - №2. - С. 88-94.

5. Белополска П. Культивирание на вируса трансмисивания гастроэнтерит в постоянна клетъчна линия/ П. Белополска, А. Мотовски // Вет. науки. -2004. — Т. 21. -№б. С. 11-17.

6. Биологические свойства некоторых штаммов трансмиссивного гастроэнтерита свиней/ Л.А. Мельникова и др. .// Труды ВГНКИ. 1990. - Т. 29-30. -С. 47-51.

7. Бут В.И. Морфология тимуса при ТГЭ свиней/ В.И. Бут// Диагностика, патоморфология, патогенез и профилактика болезней в пром. животноводстве: Межвуз. науч. сб. Саратов. - 1990. - Ч. 2. - С. 69-71.

8. Васильев В.Ф. Трансмиссивный гастроэнтерит свиней: вирусоносигель-ство и специфическая профилактика: автореф. дис. +канд. вет. наук/ Васильев В.Ф. Воронеж. - 1997. - 18 с.

9. Вирусные болезни сельскохозяйственных животных: Тез. докл. всерос. науч.-практ. конф., 17-21 апр. / ВНИИЗЖ//Владимир, 1995. 306 с.

10. О.Вишневская В.И. Механизмы повреждения и криопротекции биологических структур/В.И. Вишневская//Киев. 1997. - С. 11-12.

11. Влияние некоторых физико-химических факторов на структуру и свойства вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней/ А.П. Пономарев и др. .// Тр. Фед. центра охр. здоровья животных. Владимир: ФГУ ВНИИЗЖ. -2005.-Т. 3.-496 с.

12. Выделение и культивирование in vitro вирулентного* штамма вируса1 трансмиссивного гастроэнтерита свиней/ Г.Г. Рухадзе и др.// Вопр. вирусол. — 1993.- №6.-С. 272-273.

13. Гаффаров Х.З. Антигенная активность ассоциированной вакцины против гемофилезного полисерозита, трансмиссивного гастроэнтерита свиней и отечной болезни поросят-отъемышей/ Х.З. Гаффаров, М.А. Ефимова, Г.Н. Спиридонов // Вет. врач. -2003. №3. - С. 41-44.

14. Госманов Р.Г. Ветеринарная вирусология/ Р.Г. Госманов, Н.М. Колычев// Учебники и учеб. пособия для студентов высш. учеб. заведений. Колос. -М.-2006.-304 с.

15. Герасимов Н.И. Разработка лабораторного способа поддержания перевиваемых культур клеток СПЭВ, GH-91, VERO/ Н.И. Герасимов, С.К. Ста-ров, В.Н. Герасимов// Вет. патология. -2006. №4. - С. 168-170.

16. Гриве Р. Лиофилизация вирусов/ Р. Гриве// Доклад на симпозиуме по лиофилизации. Лион. — 1968.

17. Грачев В.П. Оценка перевиваемых клеточных линий, как субстрата, для производства биологически активных веществ/ В.П. Грачев, Д.Петриччиани// ЖМЭИ. 1985. -№2. - С. 276-277.

18. Демидова С.А. Контаминанты клеточных культур/ С.А. Демидова, Н.М. Ритова// Вопр. вирусол. 1974. - №5. - С. 521-527.

19. Душук Р.В. Трансмиссивный гастроэнтерит свиней/ Р.В. Дущук// М: Наука,-1982. 56 с.

20. Дьяконов Л.П. Животная клетка в культуре/ Л.П. Дьяконов, В.М. Ситькова// Спутник М. -2000. - 400 с.

21. Дьяконов JI.П. Результаты исследований по диагностике микоплазма-контаминации и деконтаминации культур клеток/ Л.П. Дьяконов, A.A. Позд-нчков, М.Т. Гололобова// Тр. ВИЭВ. 1991. - Т. 53. - С.63-67.

22. Защитная среда для приготовления сухой вирусной вакцины/ Э.Ф. То-карик и др. .// Ветеринария. 1995. - Т.2. - С. 15-20.

23. Изучение иммунобиологических свойств вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней с различными адыовантами/ О.С. Пузанкова и др. .// Науч. основы произ-ва вет. биол. преп.: Тез. докл. Щелково. -2000. -С. 85-87.

24. Иммунная реакция и «лактогенный иммунитет» при пероральной вакцинации свиноматок против трансмиссивного гастроэнтерита/ И.И. Касюк и др. .// С.-х. биология. -2000. №7. - С. 116-117.

25. Иммунобиологические свойства аттенуированых штаммов вируса TTC./ Т.И. Алипер и др.// Ветеринария. 2002. - №3. - С. 21-26.

26. Карелин А.И. Трансмиссивный гастроэнтерит свиней и меры борьбы/ А.И. Карелин// Ветеринария. 1985. - №2. - С. 41-43.

27. Карелин А.И. Влияние температурно-влажностного режима помещений на устойчивость поросят-сосунов к вирусному (трансмиссивному) гастроэнтериту свиней/ А.И. Карелин, В.Н. Ласкавый// Бюлл. ВИЭВ. 1985. - Вып. 60.-С. 35-37.

28. Карелин А.И. Профилактика и меры борьбы с трансмиссивным гастроэнтеритом свиней/ А.И. Карелин, Г.А. Надточей, Т.С. Коростелева// Бюл. ВИЭВ. -1982. -Вып. 46. С. 8-9.

29. Карелин А.И. Клинические признаки и диагностика трансмиссивного гастроэнтерита свиней/ А.И. Карелин, П.А. Надточей, В.Н. Ласкавый// Ветеринария. 1987. - №8. - С. 43-46.

30. Карпухина О.Г. Энрофлон-К как средство для профилактики и декон-таминации клеточных культур и иммунобиологических препаратов от бактериальной и микоплазменной инфекции: дис. . канд. мед. наук/ О.Г. Карпухина — М., 2003.-С. 27-40.

31. Каган Г.Я. Микоплазма инфекция в культурах клеток/ Г. Я. Каган, И. В. Раковская//Л.: Медицина. -1998. - 173 с.

32. Клестова З.С. Влияние температуры на изменение инфекционной активности и состава популяции вируса ТГЭ/ З.С. Клестова// Тез. докл. науч.-произв. конф. Витебск: ВВИ, Белорус. НИИ экспер. ветер, им. С.Н. Вышелес-ского// - Минск. -2000. - 260 с.

33. Кобатов А.К. Сублимационное высушивание вирусных препаратов/ А.К. Кобатов, В.О. Виноходов, Д.О. Виноходов// Приложение к тому 1 (48) «Архив ветеринарных наук». Санкт-Петербург. - Ломоносов. -1998. - С. 5470.

34. Кобыльников Н.В. Иммуногенность сухой культуральной вирусной вакцины против ТГЭ свиней из штамма ВГНКИ/ Н. В. Кобыльников// Контроль качества биологических ветеринарных препаратов: Сб. науч. тр. М. - 1987. -С. 42-45.

35. Ковальская Л.А. Защитная среда для вирус-вакцины против ньюкасл-ской болезни птиц (штамм Ла-сота): автореф. дис. +канд. биол. наук/ Ковальская Л. А. -Москва, 1986. -16 с.

36. Колышкин В.М. Разработка и совершенствование средств диагностики, профилактики и терапии при чуме плотоядных: дис. . канд. биол. наук/ В. М. Колышкин -Москва, 1999. С. 46-56.

37. Конопаткин A.A. Вирусный (трансмиссивный) гастроэнтерит/ А. А. Конопаткин// Эпизоотология- и инфекционные болезни с/к животных. М. -2004.-С. 363-369.

38. Кузнецова М.С. Оценка антигенности и иммуногенности вакцинных препаратов1 против трансмиссивного гастроэнтерита свиней в производственных условиях: автореф. дис. +канд. вет. наук/ Кузнецова М. С. — Москва, 1991. -21с.

39. Кузнецова М.С. Изучение иммуногенности и антигенности препаратов против ТГЭС в зависимости от схемы иммунизации/ М. С. Кузнецова, Т. И. Алипер// Тез. докл. всерос. науч.-практ. конф. Владимир, 1995. - С. 129.

40. Кузнецова М.С. Изучение иммуногенности препаратов против ТГЭС в зависимости от концентрации вирусного антигена/ М.С. Кузнецова, Т.И. Алипер; В.А. Сергеев// Тез. докл. 4-ой Всесоюз. конф. ВИЭВ. - М.- 1991. -С. 62-63.

41. Культивирование и обнаружение коронавирусов в культуре клеток/ И.Н. Соколова и др.// Бюл. ВИЭВ. 1993. - Вып. 49. - С. 46-48.

42. Лабораторная диагностика вирусных гастроэнтеритов при эпизооти- * ческом исследовании больных свиней/ А.П. Старчеус и др.// Тез. докл. 3 Всесоюз. конф. по эпизоотол. Новосибирск. - 1991, - С. 259-260.

43. Ласкавый В.Н. Профилактика (трансмиссивного) гастроэнтерита свиней в промышленных комплексах: автореф. дис. +д-ра вет. наук/ Ласкавый В.Н. -Москва, 1998.-38 с.

44. Левантин Д. Развитие-свиноводства в странах мира/ Д. Левантин// Свиноводство. 2000. -№4. - С. 26-28.

45. Методика выявления антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свинейвреакции нейтрал из ациина панелях/ O.G. Пузанкова// Владимир. -2004. -18 с.

46. Методические указания (РД 42-28-10-89) по аттестации перевиваемых клеточных линий-субстратов производства-и контроля медицинских иммунобиологических препаратов. М. - 1989. — 21 с.

47. Методы получения сывороток против трансмиссивного гастроэнтерита свиней/ М.М. Пятрайтите и др.// Тр. ВГНКИ. М. - 1980. - Т. 29-30. - С. 55-58.

48. Михайлова-Г.Е. Использование антибиотиков для деконтаминации клеточных культур от микоплазм./Г.Р. Михайлова, Т.М. Хижнякова, Р.Я. Под-черняева//Ж. Вет. патология. -№ 1. -2005. С. 48-51.

49. Мониторинг и измерение процессов по ИСО 9000:2000 / «Трек» -М. -2001,-№11.-24с.

50. Мораска Л. Проточная цитометрия/ Л. Мораска, Э. Эрба// Культура животных клеток. Методы. -М. 1989. - С. 182-214.

51. Мосин В.Н. Трансмиссивный гастроэнтерит свиней (Распространение, профилактика и меры борьбы): автореф. дис. + канд: вет. наук/ Мосин В.Н: — Минск, 1998. 22 с.

52. Мотовски А. Опити за пероральна вакцинация на новорождены пара-сета срещу трынамиссивен гастроентерит/А. Мотовски, П. Булопека, С. Йорданов// Вет. мед. науки. - 1985. - Т. 22, №5. - С. 11-15.

53. Мотовски А. Изшггване на низкопасажен клеточнокултурален вирус а катоваксина на срещу ТГЕ/А. Мотовски, П. Белополска, С. Челебиева// Проблема иммунит. и спец. проф.: Сб. науч. тр. София. -2005. - Т. 2. - С. 222-223.

54. Нежута А А. Экспериментальное обоснование и совершенствование режимов сублимационной сушки биопрепаратов: автореф. дис. +канд. техн. наук/ Нежута А. А. Одесса, 1981. - 25 с.

55. Некоторые аспекты культивирования вирусов болезней свиней/ В.И.Балышева и др.// Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотич.- болезнями животных: Матер, междунар. науч.- практ. конф. Покров. - 1998. - С. 108.

56. Непоклонов Е.А. РГА и РНГА для выявления вируса ТГЭС и специфических антител/ Е.А. Непоклонов// Тез. докл. Всерос. науч.- практ. конф. — Владимир. 1995.-С. 60.

57. Непоклонов Е.А. Использование различных культуральных систем для аттенуации вируса ТГЭ/ Е.А. Непоклонов, В.А. Филатов, Е.С. Федорова// Вет. пробл. промышленного свиноводства: Тез. докл. Киев. - 1983. - С. 32.

58. Нестеренко В.Ф. Патология органов дыхания и пищеварения/ В.Ф. Нестеренко, Е.С. Воронин// Действие диметилсульфоксида (ДМСО) на репродукцию вируса ТГС в культуре клеток. Москва. —2005. — С. 32-35.

59. Николаева Н.П. Оценка физико-химических свойств вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней/ Н.П. Николаева, Л.А. Мельникова // С.-х. биология. -2003. -№>4 С. 105-108.

60. Никитин Е.Е. Замораживание и высушивание биологических препаратов/ Е.Е. Никитин, И.В. Звягин// Колос. М. -1971. - 342 с.

61. Новохатский Л.С. Клеточные культуры в вирусологии/ Л.С. Новохат-ский// Общая вирусология: Руководство. М. - 1982. -Т. 1. - С. 463-493.

62. Ночевный В.Т. Профилактика и методы деконтаминации клеточных культур от бактерий и микоплазм при помощи фторхинолонов (обзор)/ В Т.

63. Ночевный, A.C. Новохатский, О.Г. Карпухина// Клеточные культуры. Информ. Бюл. Санкт-Петербург. -2002. - Вып. 17. - С. 9-15.

64. Ночевный В.Т. Суспензионое культивирование некоторых первичных перевиваемых клеток для вирусологических целей/ В.Т. Ночевный, Д.Ф. Осид-зе// Актуальн. вопр. вет. вирус. -М. 1976. - С. 58-60:

65. Ночевный В.Т. Культура клеток кожи перепелиных эмбрионов/ В.Т. Ночевный, C.B. Хайдуков// Аграрная наука. 2001. - №б. - С. 22-24.

66. Обухов И.Л. Динамика репродукции штаммов вируса ТГС в культуре клеток/ И.Л. Обухов// Профилактика эффективных спец. ср-в защиты животных и методы контроля и качества биопрепаратов: Сб. науч.тр. -М. -1991. Т. 53. -С. 95-99.

67. Орлянкин Б.Г. Классификация вирусов и номанклатура вирусов позвоночных/ БХ. Орлянкин// Методическое пособие РАСХН ВИЭВ. М. -1998.-63 с.

68. Орлянкин Б.Г. Особенности функционирования иммунной системы слизистых оболочек и стратегия специфической профилактики вирусных гастроэнтеритов поросят: Обзор/ Б.Г. Орлянкин, Т.И. Алипер// С.-х. биология. Сер. Биология животных. 2003. - № 2. - С. 10-19.

69. Орлянкин Б.Г. Структура и биология вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней: Обзор/ Б.Г. Орлянкин, Т.И. Алипер, Е.А. Непоклонов// С.-х. биология. Сер. Биология животных. — 2002. № 2. - С. 8-18.

70. Осидзе Д.Ф. Получение культур клеток из тканей животных и их использование в вирусологии: дис. .д-ра биол. наук/ Д.Ф. Осидзе -Москва, 1974.-485с.

71. Осидзе Д.Ф. Получение культур клеток из тканей животных и их использование в вирусологии: дис. .д-ра биол. наук/ Д.Ф. Осидзе Москва, 1974.-485с.

72. Патент на изобретение №2140982. Аттенуированный штамм трансмиссивного гастроэнтерита свиней (Transmissive gastrroenteritis virus)/ И. Ф. Вишняков и др.// ВНИИВВиМ. Покров. - 1998. -3 с.

73. Патент на изобретение 734279. Вакцинный штамм вируса (Transmissive gastrroenteritis №5 ВГНКИ)/Л. А. Мельникова и др.//ВГНКИ. -М 1980.

74. Патент на изобретение №2266328. Штамм «Ильиногорский» вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней для изготовления диагностических и» вацинных препаратов/ О. С. Пузанкова и др.// ФГУ ВНИИЗЖ. -Владимир. -2005. -8 с.

75. Патент на изобретение №2266327. Штамм «Краснодонский» вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней для изготовления диагностических и вацинных препаратов/ О. С. Пузанкова и др.// ФГУ ВНИИЗЖ. Владимир. -2005. -8 с.

76. Патент на изобретение №2266326. Штамм «Ленинградский» вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней для изготовления диагностических и вацинных препаратов/ О. С. Пузанкова и др.// ФГУ ВНИИЗЖ. Владимир. -2005. -8 с.

77. Патент на изобретение №1238294. Способ получения вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней/Д. Ф. Осидзе и др.//ВГНКИ. М. -1995. -2 с.

78. Падейская E.H. Фторхинолоны/ E.H. Падейская, В.П. Яковлев// Био-информ. М. - 1995. - 208 с.

79. Париж Б.М. Изучение стабильности лиофилизированного вируса гриппа/ Б.М. Париж, Р.Л. Балик, A.A. Парубель// Матер. XXII науч. сессии инта вирусологии АМН СССР. -М. 1964. - Т. 2. - С. 23-24.

80. Перспективы использования метода проточной цитометрии для стандартизации перевиваемыхлиний клеток /В:-Т. Ночевный и др. .// Матер, меж-дун. науч. конф. Владимир. - 2003. - С. 498-500.

81. Погоняйло Г. Ф. Гастроэнтероколитусвиней/ Г.Ф. Погоняйло, А.П: Тарасов, П.И. Пирог//Бюл. науч.- тех: информ. Ленинградского НИВИ. 1956. -Вып. 2.-С. 12-13.

82. Полетаев А:И. Проточная цитометрия и сортировка в цитологии, молекулярной биологии, биотехнологии и медицине/ А.И. Полетаев// Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. Общие проблемы физико-химической биологии, М; - 1999; - Т. 12. - С. 3-87.

83. Получение концентрированного очищенного препарата вируса трансг миссивного ■ гастроэнтерита свиней и изучение его антигенных свойств/ В: А. Сергеев и др. .// Вопр. вирусол. -1997. №б. - С. 718-724:

84. Промени в митотичия индекс на клетки от линия СПЕВ след инфекция с вируса на трансмисивния гастроэнтерит/ Г. Татаров и др. . // Вёт. сбирка. -1990:-4.-С. 27-29;

85. Профилактика вирусных гастроэнтеритов новорожденных телят и поросят/ В.И. Геведзе и др:.// Вет. наука произ-ву. Минск. — 1995. — Вып. 28: -С. 66-70.

86. Притулин П.И. Болезни свиней/ ПИ. Притулин// Колос. М. - 1999. -С. 48-56.

87. Раковская И.В. Биологическая характеристика микоплазм-контаминантов тканевых культур: дис. . канд. мед. наук/И.В. Раковская — М., 1966.-215 с.

88. Рухадзе Г.Г. Какой быть вакцине против вирусных гастроэнтеритов: проблемы и перспективы/ Г.Г. Рухадзе, Т.И. Алипер, В.А. Сергеев// Вопр. виру-сол. -1989. — №1. — С. 5-16.

89. Рухадзе Г.Г. Разработка тест-системы иммуноферментного анализа для выявления антигена вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней/ Г.Г. Рухадзе, Т.И. Алипер, В.А. Сергеев//Вопр. вирусол. -2000. -№3. С. 315-319.

90. Романенко В.Ф. Инфекционные желудочно-кишечные болезни свиней/ В.Ф. Романенко// Колос М. - 1984. - С. 3-158.

91. Сергеев В.А. Вирусные вакцины/ В.А. Сергеев// Киев: Урожай, 1993. -283-288 с.

92. Сергеев В.А. Вирусные гастроэнтериты свиней: Основные результаты исследований и разработок/ В.А. Сергеев, Е.А. Непоклонов, Т.И. Алипер// Тр. ВИЭВ. 2003. - Т. 73. - с. 72-78.

93. Сергеев В. А. Размножение вирусов животных в культуре ткани/ В.А. Сергеев//Колос. -М., 1999.-311 с.

94. Сергеев В.А. Специфическая профилактика и вирусоносительство при ТГЭ/ В.А. Сергеев// Ветеринария. 2007. - № 4. - С. 34-36.

95. Сергеев В.А. Особенности иммунитета и стратегия вакцинопрофи-лактики вирусных инфекций/ В.А. Сергеев, Т.И. Алипер, Г.Г. Рухадзе// С.-х. биология. -1988. №4. - С. 28-32.

96. Сергеев В.А. Оценка антигенной активности вакцинных штаммов вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней и ротавируса свиней/ В.А. Сергеев, Т.И. Алипер, Г.Г. Рухадзе//Ветеринария. 1989. -№l. - С. 30-32.

97. Специфическая профилактика инфекционных болезней, животных/

98. A.B. Селиванов и др. .// Ветеринария. 1997. - №5. - С. 17-20.

99. Способ изготовления вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней и способ профилактики трансмиссивного гастроэнтерита свиней/

100. B.А. Сергеев и др. .//Авторское свидетельство № 1398131, 1988.

101. Сравнительное испытание иммуногенных свойств культивированных штаммов ТГЭ и вакцины ГДР и ЧССР/ Е.А. Непоклонов и др.// Тр. ВИЭВ. -1984.-Т. 60.-С. 70-80.

102. ПО. Стегний М.Ю. Влияние продолжительности хранения вирусов в условиях умеренно-низких температур на их ультраструктуру и биологическуюактивность / М.Ю. Стегний// Експериментальна I клйична медицина 2004. -№2.- С. 68-71.

103. Суспензионное культивирование вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней/В.А. Сергеев и др.//Вопр. вирусол. 1989. -№ 1. - С. 103-106.

104. Султанова З.Д. Сравнительная морфологическая, культуральная и вирусологическая характеристика перевиваемых линий клеток/ З.Д. Султанова, К.С. Куликова, Э.Б. Гуревич // Вопр. вирусол. 1998. - № 3. - С. 291-298.

105. Собко А.И. Получение очищенного коронавируса ТГЭ свиней для выявления в иммуноферментном анализе иммуноглобулинов класса А и G/ А.И. Собко//М.,2003,-242 с.

106. Собко А.И. Гладенко И. Н. Справочник по болезням свиней/ А. И. Собко, И.Н. Гладенко// Киев: Урожай, 1981. С. 39-46.

107. Стефанова В.Н. Культура клеток СПЭВ: анализ структурно-функциональной организации хромосом/ В.Н. Стефанова// Совр. Достижения и проблемы биотехнологии с/х жив-х 6-я Международн.науч.конф. -Дубровицы (ВГНИИ животноводства) . -2006. С 174.

108. Стрижакова О.М. Разработка средств и методов-дифференциальной диагностики и иммунопрофилактика TTC и респираторной коронавирусной инфекции свиней/ О.М. Стрижакова// Покров,. 1997. Т. 2. - С. 21.

109. Сюрин В.Н. Руководство по ветеринарной вирусологии/ В.Н. Сюрин // Колос. М. - 1986. - С. 286-295.

110. Сюрин В.Н. Ветеринарная вирусология/ В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина//Колос. -М. -1984. 376 с.

111. Сюрин В.Н. Вирусные болезни животных/ В.Н. Сюрин, А.Я. Самуй-ленко, Б.В. Соловьев //Колос. -М. -1998. С. 165-183.

112. Сюрин В.Н. Частная ветеринарная вирусология/ В.Н. Сюрин, Н.В. Фомина// Колос. М. -1979.— 472 с.

113. Тарасов В.Н. Клеточные культуры в производстве биологически активных веществ/ В.Н. Тарасов// Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. Вирусология. -М. -2005. Т. 8. - С. 135-139.

114. Тарасов В.Н. Клеточные культуры в вирусологии // Итоги науки и техники ВИНИТИ/ В. Н. Тарасов// Сер. Вирусология. М. - 1990. - №9. - 167с.

115. Требования к перевиваемым линиям клеток, используемым для производства биологических препаратов/ Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов// Серия технических докладов ВОЗ № 745. М. -1988.-С. 85-89.

116. Троценко Н.И. Практикум по ветеринарной вирусологии / Н.И. Тро-ценко, Р.В. Белоусова, Э. Преображенская// Колос. М. - 2000. - С. 23-30.

117. Файбич М.М. Стабилизация вакцинных препаратов в процессе высушивания и хранения/ М.М. Файбич// ЖМЭИ. 1968. - № 2. - С. 59-66.

118. Федорова Е.С. Культуральные свойства вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней (TTC)/ Е.С. Федорова, Е.А. Непоклонов, Т.В. Гальнбек// Бюл. ВИЭВ. 1985. - Вып. 60. - С. 29-32. '

119. Фильченков A.A. Апоптоз и рак/ A.A. Фильченков, P.C. Стойка// Морион. Киев. - 1999. - 184 с.

120. Хаертынов С.Х. Рекомендации по профилактике, диагностике кон-таминирования культур клеток микроорганизмами и мерам их деконтаминации/ С.Х. Хаертынов, Л.П. Дьяконов, А.Н. Курносов // Казань, 1998. 33 с.

121. Шкабура Ю.П. Стандартизация методов изготовления сухой вирус-вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней на основе глубинного культивирования вируса: автореф. дис. +канд. биол. наук/ Шкабура Ю.П. М., 1999.-20 с.

122. Шкабура Ю.П. Глубинное культивирование вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней/ Ю.П. Шкабура, В.Т. Ночевный// Омский биокомбинат,

123. ВГНКИ. Акт. вопр. ветер.: Тез. докл. 1-ой науч.- практ. конф. фак. вет. мед. НГАУ. Новосибирск. - 1997. -123 с.

124. Энрофлон-К эффективное средство для профилактики и деконта-минации линий клеток от микоплазменной и бактериальной инфекции/ В.Т Но-чевный и др. .// Аграрная наука. — 2003. - № 6. - С.13-16.

125. Ястребов A.C. Вирусные гастроэнтериты свиней/ A.C. Ястребов // Хата. Минск. - 1999. - 80 с.

126. Ястребов A.C. Вирусные гастроэнтериты свиней (распространение, диагностика и специфическая профилактика): автореф. дис. +д-ра вет. наук/ Ястребов A.C.-Минск, 1999. 32 с.

127. Ястребов A.C. Диагностическая эффективность реакции диффузной преципитации в агаровом геле при вирусном трансмиссивном гастроэнтерите свиней/ A.C. Ястребов// Бюл. ВИЭВ. -1995. Вып. 60. - С. 38-40.

128. Ястребов A.C. Концентрирование вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней с помощью мембран/ A.C. Ястребов, Д.В. Бучукури, А. М. Быч-ковский//Вет. наука произв-ву. Минск. - 1990. - Вып. 28. - С. 3-6.

129. Ястребов A.C. Антигенная активность инактивированной вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита, ротавирусной болезни и колибакге-риоза свиней/ A.C. Ястребов и др.// Вет. наука произ-ву. Минск. - 1992. -Вып. 30. - С. 6-10.

130. Список использованной иностранной литературы.

131. Birch J. Suppresion of programmed cell death in industrial scale biological production systems/ J. Birch// Demonstration' project within EC-framework V «Quality of Life and Managemrnt of Living Resurses». 2002.

132. Bohl E. H. The use of cell cultures for the study of TGE virus of swine/ E.H. Bohl, T. Kumagai// Proc. 69th. Ann. Meet. U. S. Livestock San. Ass. -2000. P. 342-350.

133. Boswarthe B.T. Induction of the 2-5A sistem by interferon and transmis-sibe gastroenteritis virus/ B.T. Boswarthe, N.J. Maclachian, M.I. Johnaton// J. Interferon Res. 1989. - Vol. 11. - 45. - P. 277-288.

134. Brian D. A. Genome of porcine transmissible gastroenteritis virus/ D.A. Brian, D.E. Dennis, J.S. Guy// J Virol. -2003 May. -34(2):410-15.

135. Brown T.T. Jr. Laboratory evaluation of selected disinfectants as virucidal agents againstporcine parvovirus, pseudorabiesvirus, and transmissible gastroenteritis virus/ T.T. Jr. Brown// Am J Vet Res. 1981 Jun. - 42(6): 1033-6.

136. Completion of the sequence of the genome of the coronavirus avian infectious bronchitis virus/M. E. Boursnell et al.// J Gen Virol. 1987. - 68. - P. 57-77.

137. Cepica A. Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity and spontaneus cell-mediated cytotoxicity against cells infected with porcine transmissible gastroenteritis virus/ A. Cepica, J.B. Derbyshire// Can. J. Сотр. Med. -1983. 47. - P. 298303.

138. Chen K.S. Enzymatic and acidic sensitivy profiles of selected virulent and attenuated transmissible gastroenteritis viruses of swine/K.S. Chen//Am. J. Vet. Res. -2003.-46.-P. 632-636.

139. Contribution of passive immunity to porcine respiratiry Coronavirus to protection against transmissible gastroenteritis virus challenge exposure in sucking' pigs/ K. Sestak et al .// Am. J. Vet. Res. 1996. - 57. - P. 664-671.

140. Coriell L. Methods of prevention of bacterial, fungal and other contaminations/ L. Coriell.// Contamination f Tissue Culture. NY; London. - 1973. - P. 308-345.

141. Detection of transmissible gastroenteritis virus by RT-PCR and differentiation from porcine respiratory Coronavirus/ D. Paton et al.//J Virol Methods. — 1997 Jul.-66(2):303-9.

142. Doyle L. Transmisible gastroenteritis in pigs/ L. Doyle, L. Hutchigs// J. Am. Vet. Med. Ass. 1946. - Vol.108. -43. - P. 257-289.

143. Dulas C.C. Isolement du virus la transmissibe gastroenteritis du porc sur cultures allulaires et comparisons antigenique aves deux souches uricanes/ C.C. Dulas, P. Boulanger, J.B. Phnaeuf// Can. Vet. J. -2002. Vol. 16. - P. 77-81.

144. Durimanv A.G. A new continuous teline kidney cell culture (FK-91) for reproduction of the carnivore .parvoviruses/ A.G. Durimanv, A. M. Shestopalov, O.V. Trapezov// Intern. Sei. Congr. On Animal Production, 60%, Proc. Warsawa. — 1996.-P. 173-175.

145. Frederick G. T. Local and systemic cell-mediated immunity against transmissible gastroenteritis, an intestinal viral infection of swine/ G.T. Frederick, E.H. Buhl// J. Imunol. -2003. 116:1000-1004.

146. Enjuanes L.P. Molecular basis of transmissible gastroenteritis virus epidemiology in the Coronaviridae/ L. Enjuanes, Van der Zeijst B. A. M.// Ed. S.G. Sid-dell. New York: Plenum Press. 1995. - P. 337-376.

147. Etude comparee de tris souches du cornavirus de ia gastrenterite trsnsmis-sible: conditions de ia replication virale et de ia synthese des antigenes structuraúx/ T.D. Nguyen et al .// Ann. Inst. Pasteur, Virol. 1987. - Vol. 138. - 3. -P. 315-330.

148. Ford R.B. Enrofloxacin: a new antimicrobial strategy in small animal practice/R.B. Ford//Western Veter. Conf. (Nevada). -1988. -P. 48-51.

149. Furuuchi S. Field trials on transmissible gastroenteritis live virus vaccine in newborn piglets/ S. Furuuchi, M. Shimizu, Y. Shimizu// Natl. Inst. Anim. Health Q., (Tokyo). -2001. -18:135-142.

150. Furuuchi S. Vaccination of newborn pigs with an attenuated strain of transmissible gastroenteritis virus/ S. Furuuchi, Y. Shimizu, T. Kumagai// Am. Vet. Res.-1976.-37:1401-1404.

151. Garwes D.J. et al./ Edv ExpM Biol. 1987. - 218 : 509.

152. Garwes D.J. et al./ Vet. Res. 1988. - 122 : 86.

153. Garwes D.J. Coronaviruses in animals// virus Intestions the gsstroenteritis Tract / d. A.J. Tyrell, A.Z. Karikian.Waker. NY. - Basel. -2001. -315 p.

154. Harada K. Cytopathogenicity of transmissibe gastroenteritis virus in pigs/ K. Harada, T. Kumagai, J. Sasahara//Nate. Inst. Animal Healht Quarrt. 1963. - 1661. P

155. Henning E.R. Comparison of intramuscular and oral moditied live virus TGE vaccines/ E.R. Henning, P.C. Thomas// Vet. Med. Small. Anim. Clin. -2001, -76:1789-1792.

156. Hess R.G. Active immunization of feeder pigs against transmissible gastroenteritis (TGE); Influence of maternal antibodes/ R.G. Hess, Y.S. Chen, P.A. Bachmann//Proc. Int. Congr. Pig Vet. Soc.2003. 7:1.

157. Histchemical and immunohistchemical study f the mucsal tymphoid system in swin/ J.A. Ramos et al.// Am. J. Vet. Res. -1999. 53:1418-1426.

158. Horzinek M.C. Antigenic relationships among Homologous structural polypeptides of porcine, Feline, and canine coronaviruses/ M.G. Horzinek, H. Lutz, N.C. Pedersen// Infection and immunity. 1982. - Vol. 37. - 3. - P. 1148-1155.

159. Induction of milk Ig A antibodes by porcine respiratory coronavius infection/ P. Callebaut et al// Adv. Ep. Med. Biol: 1990. - 276. - P. 421-428.

160. Jimine G. et al.// J Virol. 1986. - 60 :131.

161. Kaji T. Pasive immunization against transmissible gastroenteritis virus in piglets of ingetions of milk of sows inoculated with attenuated virus/ T. Kaji, Y. Shi-mizu// Natl. Inst. Anim. Health Q. Tokyo. -2002. -18: 43-52.

162. Kenny G. The susceptibilities of Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticym to the never guinolones/ G. Kenny, F. D. Cartwriht // 7th Int. eongr. Int. Organ. Mycoplasmol. (JOW). Baden near Vienna, June 2-9. 1988: compend. Abstr. -Wien., S. A.-P. 9.

163. Kerr J.F. R. Apoptosis a basic biolgical phenomenon with wideranging implication in tissue kinetics/ J.F. R. Kerr, A. . Wyllie, A.R. Currie// Br. J. Cancer. -1972. - 26. - P. 239-257.

164. Kerzner D. Sodiun transport and the inestinol epithelins during the coarse of viral enterity/D. Kerzner// Gastroenterology. -2003. Vol. 72. - P. 457.

165. Lactogenic immunity to transmissible gastroenteritis (TGE) virus. Passive protection of piglets and detection of serum and milk antibody classes by ELISA/ S. Bernard et al .// Vet. immunol. immunopathol. 1990. - Vol. 24. - 1. - P.37-47.

166. Laude H. In vitro properties of low- and high-passaged strains of transmissible-gastroenteritis Coronavirus of swine/ H. Laude, J. Gelfi, J. M. Aynaud// Am J Vet Res. -. 1981 Mar. 42(3):447-9.

167. Laviada M. D. Proteins specified by swine transmissible gastroenteritis virus: identification of non-structural proteins by two-dimensional electrophoresis/ M. D. Laviada, de Diego M., J. M. Escribano// Microbiología. -1991 Sep. 7(2):90-7.

168. Lee K.M. Propogation of transmissibe gastroenteritis virus in tissue culture/ K.M. Lee// Am. N. Y. Acad. Sci. -2000. Vol. 66. - 191p.

169. Mac Kenzie, A.P. The physicochemical basis for the freeze-drying process/Mac Kenzie, A.P.//Develop. Iol. Stand. 1977. - Vol. 36: - P. 51-67.

170. Mocsari E. Properties of the "Ckp " transmissible gastroenteritis virus srtain. 1. Immunofluorescence assay on the viral replication in cell cultures/ E. Mocsari// Acta Vet. Acad. Sci. Hung. 1976. - Vol. 26. - 3. - P. 341-350.

171. Moscari E./ Acta Vet AcadSci Hung. 1980. - 28 :341.

172. Moscari E./ Acta Vet Acad Sci Hung. 1980. - 28 : 131.

173. Mowles J. M. The use for ciprofloxacin for the elimination of mycplasma from naturally infected cell lines/ J.M. Mowles// Cytotechnology. 1988. - Y. 1. - P. 355-358.

174. Moxley R.A. 1989. Clinical evaluation of transmissible gastroenteritis virus vaccination procerdures for inducing lactgenic immunity in sows/ R.A. Moxley, L.D. Olson//Am. J. Vet. Res. -2003.-50:111-118.

175. Nguyen TD. et al.// J Gen Virol. 1986. - 67:939.

176. Paltineanu D. Valoarea testelor de imunofluorescenta in diagnostiqul ga-strenteritei trsnsmissible a porcului (GET).2. Evidentieria anticorpilor specifici/ D.Paltineanu, A D. Stanuica// Prod. Anim. Zootehn. Med. Vet. 1988. -Vol. 38. -11.-P. 39-44.

177. Pike B.V. Lipids of transmissibe gastroenteritis virus and relation to thuse of two different host cells/ B.V. Pike, D.J. Garwes// J. gen. Virol. 1997. - 3-4. - P. 531-535.

178. Pensaert M. B. Immunity in TGE of swine after ifection and vaccination in Viral Enteritis in Humans and Animals/ M. B Pensaert// Ed. F. Bricout and R. Scherrer INSERM. Paris. - 2004. - 90:281-293.

179. Robinzon L. Contamination of human cell-cultures by PPLO/ L. Robin-zon, R. Wichelhausen, B. Roisman//Science. 1956. - Vol. 124. - P. 1147-1148.

180. Saif L.J. Enteric viral infection of swine/ L.J. Saif// In: Proc. 15th IPVS congress. Birmingham. -2001. - 1. - P. 57-61.

181. Saif L.J. Immunity to transmissible gastroenteritis virus and porcine respiratory Coronavirus infections in swine/ L.J. Saif, J.L. Van Cott, T.A. Brim// Vet. Immunol. Immunopathol. -2001. 43. -P 89-97.

182. Saif L. J. Transmissible gastroenteritis and porcine respiratory Coronavirus/ L.J. Saif, R. Wesley// In: Disesases f Swine. Iowa State Univ. Press. -1999. P. 295-325.

183. Saif L.J. Mucosal immunity: an overview and studies of enteritic and respiratory Coronavirus infection in a swine model of enteric disease/ L. J. Saif// Vet.Immunol. Immunpathol. -1996.-54. -P 163-169.

184. Schrder Y. Enrofloxacin a new antimicribial agents/ Y. Schrder// Aft. Vet. Ver. 1989. - Vol. 61. -2. - P. 122-124.

185. Seroprevalence- of porcine, respirstor Coronavirus infection in spanish breding sows/L. Lanza et al.// Prev. Vet. Med. -1993. 17:263-269.

186. Shimizu M.Lymphocyte prolifirative response to viral antigen in feeder pigs infected with transmissible gastroenteritis/ M. . Shimizu, Y. Shimizu// Infect. Immun. -1979. -23. -P. 239-243.

187. Seiiii K.K. Myciplasma interactions with cell cultues, unculturadad living cell and the problems posed by their presence in tisue cultures/ K.K. Sethi, M.Teschner// Klin. Wscht. -2004. Bd. 50. - 2. - P. 26-33.

188. Sprino P. Intestinal immune response of feeder pigs to infection with, transmissible gastroenteritis virus/ P. Sprino, Morilla, M. Ristic// Am J. Vet. Res. -2005.-Vol. 37.-P. 171-175.

189. Sprino P.J. Intestinal;, pulmonary, and serum antiboyresponses of feding pigs exposed to transmissible gastroenteritis virus by oral and oral-intranasal routes of inoculation/ P.J. Sprino, M. Ristic// Am. J. Vet. Res. -1983. 43. - P. 255-261.

190. Sune S. et al .// Virol. 1990. - 177 :559.

191. The multiplication of transmissible gastroenteritis viruses in several cell lines originated from porcine kidney and effects of trypsin on the growth of the virus/ E. Honda et al . // Jap. J. Vet. Sei. 1990. - Vol. 52. - № 2. - C. 217-224.

192. The transmissible gastroenteritis coronavirus contains a spherical core shell consisting of M and N proteins/ C. Risco et al.// Prod. Anim. Zootehn. Med. Vet. 1988. -Vol. 38. - 11. - P. 39-44.

193. Transmissible gastroenteritis (TGE) of swine: Survivor selection of TGE virus mutants in stomach juice of adult pigs/ J.M. Aynaud et al.// J. Gen. Virol. -1985: -66:1911-191.

194. Use of flow cytometry technigues in studying mechanisms off apoptosis in leukemic cells/ A.M. Gorman et al .// Cytometry. 1997. - Vol. 29. - P. 97-195:

195. Welch S.K.W. et al .//Arch Virol. 1988. - 101 : 221.

196. Welch S.K.W. Cell-mediated immune-responses of nursing pigs inoculated with attenuated or virulent transmissible gastroenteritis virus/ S.K.W. Welch, L.J. Salf, S. Ram//J. Virol. -2005.-65:3369-3373.

197. Welch S.K.W. Cellmediated immune responses of sucking pigs inoculated with attenuated of virulent transmissible gastroenteritis virus/ S.K.W. Welch, L. J. Salf, S. Ram//Am. J. Vet. Res. -1988. Vol. 49.-8. -P. 9631.

Информация о работе

Симоненко, Наталья Валерьевна
кандидата биологических наук
Саратов, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Биологическая характеристика штамма ВН-96 вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней и разработка биотехнологических параметров его культивирования - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы