Выявление и дифференциация возбудителей коронавирусной и ротавирусной инфекций свиней методом мультиплексной полимеразной цепной реакции

Абид Набиль Бен Салем

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выявление и дифференциация возбудителей коронавирусной и ротавирусной инфекций свиней методом мультиплексной полимеразной цепной реакции
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Выявление и дифференциация возбудителей коронавирусной и ротавирусной инфекций свиней методом мультиплексной полимеразной цепной реакции"

На правах рукописи

АБИД Набиль Бен Салем

ВЫЯВЛЕНИЕ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КОРОНАВИРУСНОЙ И РОТАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЙ СВИНЕЙ МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ

РЕАКЦИИ

03 00 Об «Вирусология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ООЗ1В34и4

Владимир - 2007

003163404

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных», г Владимир

Научный руководитель - кандидат биологических наук

Прохватилова Лариса Борисовна

Официальные оппоненты:

Ведущая организация -

доктор ветеринарных наук Сухарев Олег Иванович,

Российский университет Дружбы Народов, г Москва,

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Глобенко Людмила Алексеевна, ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г Владимир

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (ГНУ ВНИИВВиМ, г Покров Владимирской области)

Защита диссертации состоится «25» декабря 2007г в 10 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220 015 01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу 600901, г Владимир, мкр Юрьевец

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Автореферат разослан «22» ноября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Г. М Семенова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Желудочно-кишечные заболевания новорожденных поросят наносят большой экономический ущерб странам с развитым свиноводством. Высокая патогенность возбудителей данных заболеваний, их устойчивость во внешней среде, способность к персистенции в организме хозяина приводит к быстрому распространению этих болезней

Возбудителями желудочно-кишечных заболеваний являются инфекционные агенты различной природы вирусной (коронавирусный, ротавирусный и энтеровирусный гастроэнтериты), бактериальной (дизентерия, сальмонеллез, колибактериоз и др ), грибковой (кандидамикоз) и паразитарной (балантидиоз, эймериоз и криптоспоридиоз) [www pighealth com/diseases/DIARRHEA HTM, 2007]

К коронавирусам свиней относятся трансмиссивный гастроэнтерит свиней (ТГЭС), эпидемическая диарея свиней (ЭДС), респираторный коронавирус свиней (РКВС) и гемагглютинирующий вирус энцефаломиелита свиней Из них только ТГЭС и ЭДС могут вызывать желудочно-кишечную патологию [Р Debouck and M Pensaert, 1980, К Harada et al, 1963]

Кроме коронавирусов к данной группе патогенов можно отнести ротавирус свиней (РВС) В настоящее время известно 7 групп ротавирусов А, В, С, Е, D, F и G [M Е Conner et al, 1994, L J Saïf, 1990, К W Theil, 1990], из которых первые 4 выделяются от свиней с диарейным синдромом [М К Estes, 1990]

Для вирусных диарей характерно сходство клинических признаков, патоморфологических изменений и эпизоотологических особенностей Поражается обычно тонкий отдел кишечника - эпителиальные клетки ворсинок и микроворсинок, что приводит к нарушению пристеночного пищеварения, транспорта ионов и всасывания Развиваются диареи, обезвоживание, истощение, что и вызывает падеж, особенно среди новорожденных поросят [О Kim and С Chae, 2003, К W Theil et al, 1978, L Vellenga et al 1988] Учитывая сходство в течении заболевания, важную роль

играет своевременная и точная постановка диагноза с использованием методов лабораторной диагностики

Такие методы выявления данных вирусов, как электронная микроскопия (ЭМ), иммуноферментный анализ (ИФА), реакция нейтрализации (РН), не всегда обладают достаточной чувствительностью Это обусловливает необходимость использования методов молекулярной биологии, таких, как полимеразная цепная реакция (ПЦР), главным достоинством которой является специфичность, чувствительность. Кроме этого, мультиплексный вариант ПЦР является быстрым методом для выявления нескольких возбудителей в одной реакции Определение нуклеотидной "последовательности амплифицированного в ПЦР участка вирусного генома и последующий анализ полученных данных подтверждает специфичность реакции и позволяет идентифицировать и дифференцировать штаммы и изоляты вирусов Однако метод выявления и дифференциации вирусов этой группы не был разработан в Российской Федерации

Перечисленные обстоятельства явились основанием при определении темы диссертационной работы

Цели и задачи исследований. Основной целью данной работы явилась разработка метода выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, РВС и ЭДС в вируссодержащих образцах с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

- провести сравнительный анализ первичной структуры известных штаммов вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС и РВС,

- сконструировать синтетические олигонуклеотиды, позволяющие выявлять фрагменты генома указанных вирусов в мультиплексной полимеразной цепной реакции,

- разработать метод выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС и РВС с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции,

- установить первичную структуру амплифицированных фрагментов генома полевых изолятов вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС,

- провести сравнительный анализ первичной структуры фрагментов генома полевых изолятов данных вирусов

- изучить возможность применения разработанного метода для выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС в материалах от естественно инфицированных или экспериментально зараженных этими вирусами свиней, а также в культуральных вируссодержащих материалах

Научная новизна и теоретическое значение. Разработан метод выявления и дифференциации вирусов коронавирусной и ротавирусной инфекций свиней в образцах вируссодержащего материала с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции

Впервые определена нуклеотидная последовательность уникального фрагмента генома в полевых изолятах вируса ЭДС, выделенных на территории РФ Проведен сравнительный анализ первичной структуры фрагмента гена М данных изолятов вируса ЭДС Доказано, что выявленные изоляты содержали нуклеотидные замены в трех позициях гена М Эти замены отсутствуют у других штаммов вируса ЭДС, нуклеотидные последовательности которых депонированы в ОепЬапк

Нуклеотидные последовательности фрагмента гена М выявленных нами изолятов вируса ЭДС были депонированы в международной базе данных ОепЬапк под номерами доступа ЕШ67541, ЕШ79721, ЕШ79722, ЕШ79723, Еи179724, ЕШ79725, Е1Л79726, ЕШ79727, ЕШ79728, ЕШ79729, ЕШ79730 и ЕШ79731

С использованием разработанного метода определена нуклеотидная последовательность фрагментов геномов полевых изолятов РВС и ТГЭС, выделенных на территории РФ

Изучены вероятные филогенетические отношения между выявленными полевыми изолятами ТГЭС, РВС и ЭДС

Практическая значимость. В результате проведенных исследований, разработана «Методика выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции» (2007г), которая позволяет выявлять и дифференцировать корона- и ротавирусы свиней в патологических и культуральных вируссодержащих материалах Методика прошла комиссионные испытания, рассмотрена и одобрена ученым советом, утверждена директором ФГУ «ВНИИЗЖ»

Основные положения, выносимые на защиту:

- метод выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС, основанный на амплификации консервативных участков геномов указанных вирусов в ПЦР,

- результаты оптимизации условий проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции при выявлении и дифференциации коронавирусов и ротавируса свиней,

- первичная структура исследуемых областей генома ранее изученных штаммов и полевых изолятов ТГЭС, ЭДС и РВС,

- сравнительный анализ первичной структуры изученных штаммов и изолятов коронавирусов и ротавируса свиней,

- результаты применения разработанного метода выявления и дифференциации указанных вирусов в материалах от естественно инфицированных и экспериментально зараженных этими вирусами свиней, а также в культуральном вируссодержащем материале

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и опубликованы в материалах VI Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2007г ), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2005-2007 гг

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 научные работы, одна из них опубликована в журнале "Ветеринарная патология", который предусмотрен перечнем ВАК РФ

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 117 страницах и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, собственные исследования материалы и методы, результаты собственных исследований, их обсуждение, выводы, практические предложения и приложения Список литературы включает 236 источников, в том числе 24 на русском языке и 212 зарубежных Работа иллюстрирована 10 таблицами и 9 рисунками

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы

Биологические материалы В работе были использованы вирулентный культуральный штамм «Ленинградский», аттенуированный куяьтуральный штамм «Краснодонский» вируса ТГЭС и производственный модифицированный культуральный штамм «КР-47» вируса РВС, депонированные во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемые в ветеринарии и животноводстве (ФГУ ВГНКИ) под регистрационными номерами «Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП», «Краснодонский-ВНИИЗЖ-ДЕП» и «KP-47-ВНИИЗЖ-ДЕП», соответственно

Ферменты В работе были использованы следующие ферменты

- РНК-зависимая ДНК-полимераза из вируса миелобластоза птиц

(Promega, США),

- Taq-ДНК-полимераза (СибЭнзим, Новосибирск),

- Олигонуклеотиды для ПЦР (ЗАО «Синтол», Москва, Россия)

Реактивы. В работе использовали следующие реактивы

- гуанидин тиоцианат (ГТЦ) (Promega, США),

- минеральное масло «Маркол-52» (Esso,Франция),

- трис-(гидроксиметил)-аминометан (Serva, США),

- этилендиаминтетрауксусная кислота (динатриевая соль) (Serva, США),

- агароза (Promega, США),

- бромистый этидий (Sigma, США),

- маркер молекулярных весов cpX174/HaeIII (Fermentas, Литва)

2.2. Методы

Выделение суммарной РНК. Суммарную РНК из культуральной вируссодержащей суспензии и патологического материала от животных выделяли по методу Грибанова О Г (1997) с модификациями Суспензию (10%) гомогената ткани стенок кишечника или фекалий в объеме 100 мкл помещали в полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл и смешивали с 200 мкл раствора 4 М ГТЦ, тщательно перемешивали на вортексе и инкубировали при 56°С в течение 10-15 мин К смеси добавляли 300 мкл 96% этанола, перемешивали переворачиванием несколько раз и пропускали через стекловолокнистые фильтры ОМ7 под вакуумом Фильтры три раза промывали 80% этанолом (по 700-800 мкл) Остатки этанола удаляли центрифугированием в течение 30 с при 10000 g После центрифугирования фильтры переносили в чистые пробирки, добавляли 50-100 мкл деионизированной воды и центрифугировали при 10000 g в течение 15 с, при этом раствор РНК оставался на дне пробирок Полученную таким образом РНК хранили в течение дня при температуре +4 °С или замораживали при -20 °С для дальнейшего использования

Денатурация дцРНК. Поверх раствора РНК (3 мкл) наслаивали 20 мкл минерального масла и денатурировали прогреванием при 85°С в течение 2 мин, после чего быстро охлаждали на льду

Обратная транскрипция. В пробирку с денатурированной РНК добавляли реакционную смесь, содержащую 5 мкл 5Х буфера для РНК-зависимой ДНК-полимеразы, сМТР до конечной концентрации 1мМ, по 10 пмоль праймеров 81-82, М1-М2 и Р1-Р2, 1,25 ед РНК-зависимой ДНК-полимеразы и деионизированную воду до конечного объема 25 мкл Обратную транскрипцию проводили при температуре 42°С в течение 40 мин Реакцию остановливали прогреванием при 94°С в течение 3 мин

Мультиплексная полимеразная цепная реакция (мПЦР). Первый этап мПЦР (амплификацию) осуществляли в реакционной смеси следующего состава 3 мкл продуктов обратной транскрипции, по 5 пмоль праймеров,

МёС12 до конечной концентрации 3 мМ, 200 мкМ каждого сЮТР, 1,25 ед Taq ДНК-полимеразы, 2,5 мкл 1 Ох буфера для Taq-пoлимepaзы, и деионизированная вода до объема 25 мкл Сверху наслаивали 20 мкл минерального масла Амплификациию проводили при следующих температурных режимах

- один цикл при 94°С в течение 4 мин,

- сорок циклов при 94°С - 1 мин, 60°С - 1 мин и 72°С — 1 мин,

- один цикл при 72°С в течение 5 мин

Для проведения второго этапа мПЦР (реамплификации) использовали продукты амплификации (по 2 мкл) При этом реакционная смесь имела тот же состав Реамплификацию проводили при следующих температурных режимах

- один цикл при 94°С в течение 4 мин,

- тридцать циклов при 94°С - 30 с, 60°С - 30 с и 72°С - 1 мин,

- один цикл при 72°С в течение 5 мин

Электрофорез в агарозном геле. 3 мкл продуктов реамплификации смешивали с 1 мкл буфера для нанесения проб и вносили в лунки 2% агарозного геля Электрофорез проводили при силе тока 50 мА в течение 1520 мин

Анализ полученных результатов. Размер фрагментов ДНК, полученных в мПЦР, определяли, сравнивая их электрофоретическую подвижность с маркером молекулярных весов При этом фрагменты размером 950, 329-269, 425 и 317 п н в реакции амплификации и/или 792, 171-111, 291 и 208 пн в реакции реамплификации свидетельствуют о наличии в тестируемой пробе ампликонов вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС или РВС, соответственно

Очистка продуктов мПЦР. Пробу, содержащую амплифицированную ДНК, переносили в 1,5 мл пробирку, добавляли 200-300 мкл 4 М ГТЦ и перемешивали Смесь пропускали через стекловолокнистые фильтры СБ/Р, используя вакуумный коллектор, а фильтры с сорбированной на них ДНК,

промывали 80% этанолом Остатки этанола удаляли центрифугированием при 10 тыс g в течение 30 с После этого на фильтры наносили 50 мкл деионизированной воды и центрифугировали 10-15 с при 10 тыс g

Секвенирование. Секвенирование продуктов мПЦР проводили с помощью автоматического секвенатора (ABI Prism 3100)

Анализ нуклеотидных последовательностей. Нуклеотидные последовательности генов вирусов ТГЭС, ЭДС, РВС и РКВС были получены из компьютерной базы данных GenBank (www nebí nlm nih gov) Анализ последовательностей и выбор праймеров проводили с помощью пакета программ «BioEdit Sequence Alignment Editor» (Hall T А, версия 7 0 5 2, 2005) и программы «OLIGO» (версия 4 0)

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Анализ нуклеотидных последовательностей генов вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС и РВС. Для разработки метода мПЦР с целью одновременного выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС были проанализированы нуклеотидные последовательности геномов этих вирусов, содержащиеся в компьютерной базе данных GenBank Кроме того, при анализе использовали данные о первичной структуре вируса РКВС Этот вирус, хотя и не является причиной желудочно-кишечных патологий, имеет высокую гомологию с вирусом ТГЭС и отличается от него делецией в гене S (размер делеции 621-681 нуклеотида) и в гене ORF3

Всего было проанализировано 789 последовательностей генов вирусов, выделенных как от свиней, так и от других животных, а также от человека Из них 624 принадлежали ротавирусу, 90 - вирусу ТГЭС, 37 - вирусу ЭДС и 38 последовательностей генов - РКВС

Выбор первичной структуры праймеров

Было проведено выравнивание нуклеотидных последовательностей и выбраны праймеры, соответствующие консервативным областям

последовательностей При выборе праймеров из отмеченных консервативных участков руководствовались следующими критериями содержание G+C должно составлять 30-60%, праймеры не должны включать самокомплементарных участков как внутри себя, так и между собой Желательно, чтобы праймеры имели достаточно высокую и одинаковую или близкую температуру плавления При оценке использовали как термодинамический подход, так и эмпирический метод, основанный на G-C содержании последовательностей праймеров

При выборе области для амплификации участка генома вирусов ТГЭС и ЭДС учитывали тот факт, что оба они относятся к семейству коронавирусов Таким образом, эти два вируса состоят в генетическом родстве Анализ последовательностей этих двух вирусов показал, что, будучи выравненными, эти последовательности имеют участки с высокой гомологией

При разработке праймеров для выявления вируса ТГЭС принималось во внимание, что вирус ТГЭС имеет в природе своего родственника - РКВС, который отличается от исходного вируса делецией в генах S и ORF3 Поэтому логично было совместить методику выявления вируса ТГЭС и РКВС Для этих двух вирусов были сконструированы одни и те же праймеры А дифференциация этих двух вирусов производилась по длине продуктов мПЦР Сюда входили З'-область гена Pol и 5'-область гена S Всего было проанализировано 39 последовательностей генов POL и S штаммов вируса ТГЭС, 26 - РКВС и 5 - ЭДС

Выбор праймеров был основан на принципе наибольшей комплементарности консервативным участкам генома вирусов ТГЭС и РКВС и одновременно наименьшей комплементарности аналогичным участкам генома вируса ЭДС В результате сравнительного анализа первичной структуры фрагмента генома вирусов ТГЭС и РКВС было выбрано и синтезировано 6 праймеров, специфичных для данных вирусов (табл 1)

Таблица 1

Нуклеотидные последовательности праймеров для выявления вируса

ТГЭС/РКВС

Наименование Последовательность нуклеотидов Положение в геноме*

SI 5' -AGGGTAAGTTGCTCATTAGAAATAATGGTAAGTT-3 20298-20331

S2 5' -CTAATTTACCACTAACCAACGTGGAGCTATTA-З' 21216-21247

S3 5' -AAAAATTATTTGTGGTTTTGGTTGTAATGCC-3 20369-20399

S4 5 -GTGTAGTAAAAACATTAGCCACATAACTAGCACA-З' 21127-21160

S5 5' -GCTCTATCACATAACTCAGTCCTAGACACTCCT-3' 20180-20212

S6 5 -CTAGGGACTGGCCATAAGCAATTAACTAATA-3' 21263-21293

* соответствует нуклеотидной последовательности штамма вируса ТГЭС Purdue (номер доступа в GenBank NC_0023 06).

На рис.1 представлено расположение на геноме праймеров для выявления вирусов ТГЭС и РКВС.

Ген POL

Ген S

5' —

20000 20500 21000 21500 22000

'позиции праймеров в геноме

Рис.1. Расположение праймеров па геноме вирусов РКВС и ТГЭС

*Нумерация нуклеотидов соответствует нуклеотидный последовательности штамма вируса ТГЭС Purdue (номер доступа в GenBank NC_0023 06).

В качестве мишени для выявления РВС был выбран ген К8Р5, как наиболее консервативный Было проанализировано 9 нуклеотидных последовательностей этого гена, относящихся к ротавирусам свиней, 40 последовательностей, относящихся к ротавирусам человека, и по одной последовательности, относящихся к ротавирусам крупного рогатого скота, овцы и обезьяны, после чего было сконструировано 6 праймеров (табл 2)

Таблица 2

Нуклеотидные последовательности праймеров для выявления РВС

Наименование Последовательность нуклеотидов Положение в геноме*

Р1 5-ООСТТТТАААОСОСТАСАОТОАТОТСТСТ-З' 1-29

Р2 5 '-ООТССТОАТТСТОТТОАТС ААТССАТАО А-3' 289-317

РЗ 5 -СТСАОСАТТОАСОТААСОАОТСТТСС-З 28-53

Р4 5'-ТОАОТООАТСОТТЮААОСАОААТСАОА-3' 208-235

Р5 5'-ТСААСТСТТТСТООААААТСТАТТСОТАОО-3 100-129

Рб 5 -ОССАОСОТСТОСАТТТСТСТТААС-З 262-285

* нумерация нуклеотидов соответствует последовательности гена Ы8Р5 штамма ОБИ ротавируса свиней (номер доступа в ОепВапк XI5519)

Следует отметить, что выбранные для отжига праймеров участки гена И8Р5 проявляют высокую степень консервативности не только для ротавирусов свиней, но и для представленных в базе данных ротавирусов животных и человека, что, учитывая относительную легкость межвидового переноса, отмеченного для ротавирусов, а также явление реассортации геномных сегментов, повышает степень надежности методики На геноме праймеры располагаются следующим образом (см рис 2)

Р1 Р2

Р5 Р6

РЗ Р4

Ген ЫЭРБ Ц

I-1-1-г77-1

О 100 200 300 664

'позиции праймеров в геноме

Рис.2. Расположение праймеров на гене №Р5 РВС

*Нумерация нуклеотидов соответствует нуклеотидной последовательности штамма ОБи РВС (номер доступа в ОепВапк Х15519).

В качестве мишени для выявления вируса ЭДС по признаку наибольшей консервативности был выбран ген М. Было проанализировано 18 последовательностей этого гена вируса ЭДС, 8 — вируса вируса ТГЭС и 4 — вируса РКВС. Праймеры, сконструированные для данного вируса, представлены в таблице 3.

Таблица 3

Нуклеотидные последовательности праймеров для выявления вируса _ЭДС_

Наименование Последовательность нуклеотидов Положение в геноме*

М1 5'-ОААТТТТАСАТСОААТАТСАТАСТОАСОАТАСТАСТТОТ-3' 54-92

М2 5-СОССАОТАОСААССТТАТАОСССТСТА-3' 452-478

мз 5 '-ТССТТС АСТАТСОСС АТТАС ААСТАСТСТО-З' 95-124

М4 5'-ССТСТСООСССАТСАСАОААСТАСТ-3' 361-385

М5 5 '-ТТС АвС АТССТТАТСОСТТСС АТСА-3' 238-262

Мб 5'-ТОССАОАТОААОСАГГСАСТОААСО-3' 553-577

* соответствует нуклеотидной последовательности гена М штамма вируса ЭДС СУ777 (номер доступа в вепБапк ЫС_003436).

Расположение этих праймеров на гене М генома вируса ЭДС показано на рис. 3.

М5 Мб

М1 М2

мз М4

Ген М

1 100 200 300 400 500 600 680 *позиции праймеров в геноме

Рис. 3. Расположение праймеров на гене М вируса ЭДС.

*Нумерация нуклеотидов соответствует нуклеотидной последовательности штамма вируса ЭДС CV777 (номер доступа в GenBank NC_003436).

Таким образом, в результате сравнительного анализа первичной структуры геномов вирусов коронавирусной и ротавирусной инфекций свиней было сконструировано по 6 специфических праймеров для каждого вируса, чтобы при отработке условий реакции можно было выбрать наиболее оптимальные.

Оптимизация условий постановки мПЦР. Для оптимизации методики мПЦР были использованы культуральные штаммы «Ленинградский» и «Краснодонский» вируса ТГЭС с титром вируса 8,0 1§ТЦЦ50/мл, а также производственный культуральный штамм «КР-47» ротавируса свиней, титр вируса 6,0 1§ТЦД50/мл.

Выше указанные методики могут использоваться по отдельности, но они разрабатывались для совместного использования в мультиплексной ПЦР

Поэтому были учтены следующие факторы во-первых, длина получаемых в реамплификации фрагментов Она была выбрана таким образом, чтобы можно было легко дифференцировать вирусы по результатам электрофореза Во-вторых, температура плавления праймеров выбиралась приблизительно одинаковой для всех праймеров и достаточно высокой (около 60°С), чтобы повысить специфичность отжига

Для увеличения чувствительности и специфичности реакции был разработан вариант «nested» ПЦР с двумя парами праймеров для каждого генома с разными комбинациями

Были проверены различные комбинации праймеров для обратной транскрипции, амплификации и реамплификации Две комбинации для каждого вируса, позволяющие получить наиболее специфичные фрагменты, в дальнейшем использовались в методике

После того как были протестированы разработанные методики по отдельности было необходимо проверить их совместную работу Эксперименты показали, что, будучи использованы вместе в одной пробирке, данные методики работают корректно, то есть способны специфично распознавать искомые патогены

В серии экспериментов были оптимизированы условия реакций концентрация ионов магния, концентрация праймеров, температурные режимы мПЦР

Согласно проведенным исследованиям метод мПЦР был способен выявлять РВС в материале, содержащем вирус в концентрации 1,0 lg ТЦД5о/мл, вирус ТГЭС — 2,0 1§ТЦД50/мл Аналитическая чувствительность метода не изменялась как при использовании одной пары праймеров, так и при проведении ПЦР в варианте мультиплекс

Для подтверждения специфичности разработанной методики ее проверили на материалах, содержащих гетерологичные вирусы Для этого

проводили реакцию мПЦР с использованием праймеров, специфических для одного вируса на материалах, содержащих другие вирусы, используемые в реакции. При этом ложноположительных результатов не наблюдалось, что позволяет говорить о специфичности методики.

В результате оптимизации условий реакции было выбрано по 4 праймера для каждого вируса, позволяющие получить наиболее специфичные фрагменты в ПЦР.

Вирусспецифические фрагменты регистрировали визуально после электрофореза в 2% агарозном геле, просматривая гель в ультрафиолете. На рисунке 4 показана электрофореграмма разделения продуктов амплификации после проведения "nested" ПЦР.

Продукт амплификации

Рис. 4. Электрофореграмма продуктов мПЦР

Цифрами обозначены дорожки: М - маркер молекулярных весов ДНК срХ174/НаеП1 (стрелками обозначены длины фрагментов п.н.); 1 - вирусы ТГЭС, ЭДС и РВС; 2 - вода (отрицательный контроль ПЦР); 3 - полевой изолят вируса ЭДС; 4 - РВС штамм «КР-47»; 5 - штамм «Ленинградский» вируса ТГЭС.

Применение мПЦР для выявления коронавирусов и ротавируса свиней. В наших исследованиях в случае массовых диарей патологический материал исследовали на наличие ротавируса и коронавирусов свиней.

С использованием разработанного метода было исследовано 127 проб от свиней из 17 хозяйств РФ на наличие вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС и РВС

Геном РВС был выявлен у свиней в 14 из 17-ти обследованных хозяйств Вирус ЭДС был выявлен у свиней в 9 хозяйствах При этом в 6 обследованных хозяйствах оба эти вируса содержались в патологическом материале одновременно Геном вируса РКВС был выявлен в двух случаях Эпизоотические изоляты вируса ТГЭС не были обнаружены ни в одном из этих хозяйств

Исследовано 127 образцов патологического материала от свиней с признаками диареи Ротавирус был выявлен в 48 образцах, вирус ЭДС - в 23 образцах При этом в 7 образцах оба эти вируса содержались одновременно.

Для исследования использовали фекалии, кишечник, легкие и селезенку Вирусы ЭДС и РВС выявляли в кишечнике и в фекальных массах Положительные результаты для этих вирусов составляли приблизительно 33% от общего количества проб кишечника для каждого из вирусов, в фекальных массах обнаруживали 7,5% положительных образцов на вирус ЭДС и 41,5% положительных образцов на РВС При этом в легком и селезенке геном вируса ЭДС не обнаруживали Вирус РВС выявлялся в легком и селезенке в 37,5% случаев В 7,5% проб кишечника и 4,5% проб фекалий выявляли одновременно геном вирусов ЭДС и РВС Геном РКВС удалось обнаружить в 2-х образцах тканевой вакцины (табл 4)

Таблица 4

Результаты исследования патологических материалов от свиней

методом мПЦР на наличие вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС и РВС

Патматериал Количество исследованных проб Количество поло ви жительных проб для русов

ЭДС РВС ЭДС/ РВС РКВС

Кишечник 54 18 18 4 0

Фекалии 65 5 27 3 0

Легкое и селезенка 8 0 3 0 2

В нашей работе на наличие вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС и РВС были исследованы образцы от животных разных возрастных групп как с кишечной клиникой, так и от здоровых животных В таблице 5 представлены результаты исследований животных разных возрастных групп

Таблица 5

Результаты исследований образцов от животных разных возрастных

групп на наличие вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС и РВС методом мПЦР

Возраст животных Количество исследованных проб Количество положительных проб для вирусов

ЭДС РВС эдс/ РВС РКВС

1-30 дней 72 22 39 6 2

31-60 ней 10 1 5 1 0

61-90 ней 17 0 2 0 0

Здоровые свиноматки 28 0 2 0 0

Из таблицы видно, что вирус ЭДС выявляли у поросят в возрасте от одного дня до 60 дней В отличие от него РВС выявляли у всех возрастных групп В двух случаях РВС был выявлен при отсутствии диарейного синдрома у здоровых свиноматок Смешанную инфекцию, когда в исследуемом материале одновременно обнаруживали вирусы ЭДС и РВС, регистрировали у поросят в возрасте от 1 до 60 дней

У поросят в возрасте от 1 до 30 дней процент положительных проб составил 95,5% и 81% из общего количества положительных результатов для вирусов РВС и ЭДС, соответственно

При исследовании материалов, поступавших из различных хозяйств Российской Федерации, было выявлено 15 изолятов ротавируса свиней. Методом нуклеотидного секвенирования определили первичную структуру амплифицированного в мПЦР фрагмента гена К8Р5 данных изолятов вируса РВС

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей амплифицированного участка гена №Р5 выявленных нами изолятов вируса РВС показывает высокую консервативность этого фрагмента у всех штаммов и выявленных изолятов данного вируса.

Была построена дендрограмма, отражающая генетическое разнообразие штаммов и выявленных нами изолятов РВС (рис. 5).

HP 140 I НР113

. Мс345

. RMC321 . Мс323 , RMC83 1 RMC100

- Краснодар/А , СС86

1 CN86

- OSU 582

i 470 YM

процент нуклеотидных различий

НИ RU172

Краснодар/Б

Ннжегород/05/06

Татарстан/05/06

Башкнрня/06/06

Ливны/07/06

Ярославль/08/06

Воронеяс/А

Воронсж/Б

Вологдя/11/06

Курская/01/07

Ульяновск/01/07

Белгород/А

Белгород/Б

Белгород/В _

K.U

96Н069 Z10262 512 С V183 ■ М Wa

96Н063

96Н026

96Н070

96Н001

SAH

China

МЗ18

512 А

512 В

0264

К8

TBChen NR1

V51

V252 V47 vl58 v61 vi 15

Рис. 5. Дендрограмма, отражающая филогенетические отношения штаммов и изолятов ротавирусов. Основана на сравнении нуклеотидных последовательностей амплифицированного участка гена

№Р5

Дендрограмма показала, что данные изоляты вируса РВС принадлежат к одной генетической группе (группа А), в которую входят известные штаммы ротавирусов свиней (НР140, НР113, OSU, СС86, CN86, RU172 и YM) и некоторые штаммы ротавируса человека (Мс345, RMC321, Мс323, RMC83, RMC100, 582 и 470) Из дендрограммы также видно, что, за исключением изолята «Краснодар/А», выявленные нами изоляты РВС имеют практически 100% гомологию

Уровень отличий изолята «Краснодар/А» от других выявленных нами изолятов вируса РВС составляет примерно 1,4%, уровень его отличий от штаммов Mc345/RMC321, Mc323/RMC100//RMC83 и 582/470 ротавируса человека составил 4,3%, 2,8% и 1,9%, соответственно, тогда как остальные нами выявленные изоляты РВС отличались от данных штаммов на 2,9%, 1,4% и 0,50%, соответственно

Геном вируса ЭДС был выявлен в 23 из 127 исследованных проб Методом нуклеотидного секвенирования была определена нуклеотидная последовательность для 12 амплифицированных фрагментов гена М вируса ЭДС

Результаты анализа показали, что выявленные нами изоляты вируса ЭДС на территории РФ содержали 3 нуклеотидные замены в трех позициях (144, 207 и 303) гена М Было показано, что эти замены не влияли на аминокислотный состав белка М вируса ЭДС Эти замены отсуствовали у других штаммов данного вируса

Была построена дендрограмма, отражающая генетическое разнообразие штаммов и выявленных нами изолятов вируса ЭДС (рис 6) Она построена на основе сравнения нуклеотидных последовательностей амплифицированного участка гена М Данная дендрограмма показывала, что российские изоляты вируса ЭДС вместе с другими штаммами данного вируса формируют одну генетическую группу, в которую входят штаммы KPEDV, JMe2, Chinji99, LZC и Brl/87 Выявленные нами изоляты вируса ЭДС образуют один кластер внутри данной группы Другие известные штаммы вируса ЭДС относятся к

другой группе, при этом уровень отличий между этим двумя группами составляет более 4%.

процентнуклеотидных различии

Москва/07/05

Вологда/Б

Вологда/А

Краснодар/А

Самара/Б

Курск/01/07

Ярославль/08/06

Ульяновск/01/07

Бепгород/05/07

Башкирия/06/06

Краснодар/Б

Самара/А

- КРЕй\/-9/2000

- ЛУ1е2

- КРЕОУ-9/1997

■ СЫфЭЭ

- СУ777/2004 12С

1 СУ777/2001

1 Вг1/87 ОХ

■ сн/нин/об

- СНШХ/06

- СН/1МТ/06

- ив/оз

ОН

- ^-2004-2 СН/1МВ/06 СН/НМСН/06 СН/ЭНН/Об

Рис.6. Дендрограмма, отражающая филогенетические отношения штаммов и изолятов вируса ЭДС. Основана на сравнении нуклеотидных последовательностей амплифицированного участка М гена

При исследовании патологического материала, поступившего из хозяйств, мы не выявляли вирус ТГЭС. Оптимизация метода мПЦР проводилась с использованием культурального вируса, поэтому с целью изучения возможности применения данного метода для выявления генома

вируса ТГЭС в тканях и органах животных было необходимо провести исследование патологического материала от свиней, содержащего вирус ТГЭС

Более 17 лет назад вспышки данного заболевания наблюдались в одном из хозяйств Нижегородской области От больных поросят был выделен и идентифицирован вирус ТГЭС, который поддерживается до сегоднящего дня путем ежегодного освежения на 25-30 домолозивных поросятах и используется для изготовления инактивированной тканевой вакцины против ТГЭС Данный материал был исследован с помощью разработанной методики, и в нем был выявлен геном вируса ТГЭС

Выявленный нами изолят вируса ТГЭС имел генетическое родство с известным штаммом ТМК-22 и отличался от него лишь на 0,6%

4. ВЫВОДЫ

1 Сконструированы праймеры к консервативным участкам генов КБР5, М и Б вирусов РВС, ЭДС и ТГЭС для использования в мультиплексном варианте полимеразной цепной реакции, которая позволяет специфично выявлять указанные инфекционные агенты в вируссодержащих материалах

2 Разработан метод выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС на основе амплификации фрагментов генов №Р5, М и Б, являющихся наиболее консервативными для выше указанных возбудителей

3 Показано, что при помощи разработанного метода в 127 исследуемых пробах патологического материала от свиней вирус ЭДС выделен в 23, вирус РВС — 48, вирус РКВС в 2 случаях Вирус ТГЭС был выявлен в патологическом материале только от экспериментально инфицированных поросят

4 Установлено, что вирус РВС выявляется у свиней всех возрастных групп как при диарейном синдроме, так и от здоровых свиноматок, что указывает на возможность заражения новорожденных поросят В наших исследованиях вирус ЭДС выявляется при гастроэнтеритах свиней в возрасте

от 1 до 60 дней, хотя данным вирусом заражаются поросята всех возрастных групп В отличие от РВС, вирус ЭДС не выявлен в селезенке и в легких

5 Установлена нуклеотидная последовательность фрагментов генов №Р5, М и 8 вирусов РВС, ЭДС и ТГЭС, соответственно выделенных на территории Российской Федерации

6 Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей исследуемого фрагмента гена №Р5 штаммов и изолятов РВС показал высокую консервативность этого фрагмента у всех штаммов и изолятов данного вируса, выделенных в 14 хозяйствах 11 областей России

7 В результате сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена М штаммов и выявленных нами изолятов вируса ЭДС установлено, что возбудители содержат несколько нуклеотидных замен, характерных только для вирусов, выявленных на территории РФ Эти замены могут дифференцировать российские изоляты от других штаммов и изолятов вируса ЭДС

8 С использованием разработанного метода геном вируса ТГЭС был выявлен в патологическом материале от экспериментально инфицированных поросят Сравнительный анализ показал, что выявленный изолят имеет генетическое родство с известным штаммом ТМК-22 вируса ТГЭС

9 Разработанная методика выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, РВС и ЭДС с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции позволяет выявлять РКВС и дифференцировать его от вируса ТГЭС

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований предлагается для использования в практической работе рассмотренная и одобренная ученым советом и утвержденная директором ФГУ «ВНИИЗЖ» «Методика выявления и дифференциации вирусов трансмиссивного гастроэнтерита, ротавирусной инфекции и эпидемической диареи свиней с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции» Полученные данные о нуклеотидных

последовательностях ротавируса и коронавирусов свиней могут быть использованы для индикации и дифференциации штаммов и полевых изолятов указанных вирусов

6. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1 Абид, Н.С Разработка метода выявления вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней с помощью полимеразной цепной реакции / Н.С. Абид // Ветеринарная патология - М, 2006 - Т 19, № 4 - с 100 - 103

2 Применение полимеразной цепной реакции для выявления ротавируса свиней группы А / Н.С. Абид, С А Чупин, Л Б Прохватилова, Т 3 Байбиков // Тр Федерального центра охраны здоровья животных - Владимир, 2007 - Т 5-с 264-271

3 Разработка метода выявления вируса эпидемической диареи свиней с помощью полимеразной цепной реакции / Н.С. Абид, С А Чупин, Л Б Прохватилова, Т 3 Байбиков // Генодиагностика инфекционных заболеваний VI Всероссийская науч - практ. конф - М, 2007 - с

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Тираж 90 экземпляров, ноябрь 2007г

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Абид Набиль Бен Салем

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика семейства Coronaviridae.

1.2. Основные свойства коронавирусов.

1.2.1. Строение вириона.

1.2.2. Физико-химические свойства.

1.2.3. Структура генома.

1.2.4. Гены и протеины.

1.2.5. Репликация.

1.2.6. Антигенные свойства.

1.3. Характеристика семейства Reoviridae.

1.4. Основные свойства ротавирусов.

1.4.1. Строение вириона.

1.4.2. Физико-химические свойства.

1.4.3.Структура генома.

1.4.4. Гены и протеины.

1.4.5. Репликация.

1.4.6. Антигенные свойства.

1.5. Эпизоотологические данные.

1.6. Патогенез и патологоанатомические изменения.

1.7. Клинические признаки.

1.8. Диагноз и дифференциальный диагноз.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выявление и дифференциация возбудителей коронавирусной и ротавирусной инфекций свиней методом мультиплексной полимеразной цепной реакции"

Возбудителями желудочно-кишечных заболеваний являются инфекционные агенты различной природы: вирусной (коронавирусный, ротавирусный и энтеровирусный гастроэнтериты); бактериальной (дизентерия, сальмонеллез, колибактериоз и др.); грибковой (кандидамикоз) и паразитарной (балантидиоз, эймериоз и криптоспоридиоз) (www.pighealth.com/diseases/DIARRHEA.HTM, 2007).

К коронавирусам свиней относятся трансмиссивный гастроэнтерит свиней (ТГЭС), эпидемическая диарея свиней (ЭДС), респираторный коронавирус свиней (РКВС) и гемагглютинирующий вирус энцефаломиелита свиней (ГВЭС). Из них только ТГЭС и ЭДС могут вызывать желудочно-кишечную патологию (64, 96).

Кроме коронавирусов к данной группе патогенов можно отнести ротавирус свиней (РВС). В настоящее время известно 7 групп ротавирусов: А, В, С, Е, D, F и G (56, 181, 211), из которых первые 4 выделяются от свиней с диарейным синдромом (82).

Для вирусных диарей характерно сходство клинических признаков, патоморфологических изменений и эпизоотологических особенностей. Поражается обычно тонкий отдел кишечника - эпителиальные клетки ворсинок и микроворсинок, что приводит к нарушению пристеночного пищеварения, транспорта ионов и всасывания. Развиваются диареи, обезвоживание, истощение, что и вызывает падеж, особенно среди новорожденных поросят (118, 150, 108). Учитывая сходство в течении заболевания, важную роль играет своевременная и точная постановка диагноза с использованием методов лабораторной диагностики.

Такие методы выявления данных вирусов, как электронная микроскопия (ЭМ), иммуноферментный анализ (ИФА), реакция нейтрализации (РН), не всегда обладают достаточной чувствительностью. Это обусловливает необходимость использования методов молекулярной биологии, таких, как полимеразная цепная реакция (ПНР), главным достоинством которой является специфичность, чувствительность. Кроме этого, мультиплексный вариант ПЦР является быстрым методом для выявления нескольких возбудителей в одной реакции. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированного в ПЦР участка вирусного генома и последующий анализ полученных данных подтверждает специфичность реакции и позволяет идентифицировать и дифференцировать штаммы и изоляты вирусов. Однако метод выявления и дифференциации вирусов этой группы не был разработан в Российской Федерации.

Перечисленные обстоятельства явились основанием при определении темы диссертационной работы.

Цели и задачи исследований. Основной целью данной работы явилась разработка метода выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС в вируссодержащих образцах с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести сравнительный анализ первичной структуры известных штаммов вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС и РВС;

- сконструировать синтетические олигонуклеотиды, позволяющие выявлять фрагменты генома указанных вирусов в мультиплексной полимеразной цепной реакции;

- разработать метод выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС и РВС с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции;

- установить первичную структуру амплифицированных фрагментов генома полевых изолятов вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС;

- провести сравнительный анализ первичной структуры фрагментов генома полевых изолятов данных вирусов.

Впервые определена нуклеотидная последовательность уникального фрагмента генома в полевых изолятах вируса ЭДС, выделенных на территории РФ. Проведен сравнительный анализ первичной структуры фрагмента гена М данных изолятов вируса ЭДС. Доказано, что выявленные изоляты содержали нуклеотидные замены в трех позициях гена М. Эти замены отсутствуют у других штаммов вируса ЭДС, нуклеотидные последовательности которых депонированы в Genbank.

Нуклеотидные последовательности фрагмента гена М выявленных нами изолятов вируса ЭДС были депонированы в международной базе данных Genbank под номерами доступа: EU167541, EU179721, EU179722, EU179723, EU179724, EU179725, EU179726, EU179727, EU179728, EU179729, EU179730 и EU179731.

С использованием разработанного метода определена нуклеотидная последовательность фрагментов геномов полевых изолятов РВС и ТГЭС, выделенных на территории РФ.

Изучены вероятные филогенетические отношения между выявленными полевыми изолятами ТГЭС, РВС и ЭДС.

Практическая значимость. В результате проведенных исследований, разработана «Методика выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции» (2007г.), которая позволяет выявлять и дифференцировать корона- и ротавирусы свиней в патологических и культуральных вируссодержащих материалах. Методика прошла комиссионные испытания, рассмотрена и одобрена ученым советом, утверждена директором ФГУ «ВНИИЗЖ».

Основные положения, выносимые на защиту:

- метод выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС, основанный на амплификации консервативных участков геномов указанных вирусов в ПЦР;

- результаты оптимизации условий проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции при выявлении и дифференциации коронавирусов и ротавируса свиней;

- первичная структура исследуемых областей генома ранее изученных штаммов и полевых изолятов ТГЭС, ЭДС и РВС;

- сравнительный анализ первичной структуры изученных штаммов и изолятов коронавирусов и ротавируса свиней;

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и опубликованы в материалах VI Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2007г.), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2005-2007 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 научные работы, одна из них опубликована в журнале "Ветеринарная патология", который предусмотрен перечнем ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 117 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования: материалы и методы, результаты собственных исследований, их обсуждение, выводы, практические предложения и приложения. Список литературы включает 236 источников, в том числе 24 на русском языке и 212 зарубежных. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 9 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Абид Набиль Бен Салем

5. ВЫВОДЫ

1. Сконструированы праймеры к консервативным участкам генов NSP5, М и S вирусов РВС, ЭДС и ТГЭС для использования в мультиплексном варианте полимеразной цепной реакции, которая позволяет специфично выявлять указанные инфекционные агенты в вируссодержащих материалах.

2. Разработан метод выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС на основе амплификации фрагментов генов NSP5, М и S, являющихся наиболее консервативными для вышеуказанных возбудителей.

3. Показано, что при помощи разработанного метода в 127 исследуемых пробах патологического материала от свиней вирус ЭДС выделен в 23; вирус РВС - 48; вирус РКВС в 2 случаях. Вирус ТГЭС был выявлен в патологическом материале только от экспериментально инфицированных поросят.

4. Установлено, что вирус РВС выявляется у свиней всех возрастных групп как при диарейном синдроме, так и от здоровых свиноматок, что указывает на возможность заражения новорожденных поросят. В наших исследованиях вирус ЭДС выявляется при гастроэнтеритах свиней в возрасте от 1 до 60 дней, хотя данным вирусом заражаются поросята всех возрастных групп. В отличие от РВС, вирус ЭДС не выявлен в селезенке и в легких.

5. Установлена нуклеотидная последовательность фрагментов генов NSP5, М и S вирусов РВС, ЭДС и ТГЭС, соответственно выделенных на территории Российской Федерации.

6. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей исследуемого фрагмента гена NSP5 штаммов и изолятов РВС показал высокую консервативность этого фрагмента у всех штаммов и изолятов данного вируса, выделенных в 14 хозяйствах 11 областей России.

7. В результате сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена М штаммов и выявленных нами изолятов вируса ЭДС установлено, что возбудители содержат несколько нуклеотидных замен, характерных только для вирусов, выявленных на территории РФ. Эти замены могут дифференцировать российские изоляты от других штаммов и изолятов вируса ЭДС.

8. С использованием разработанного метода геном вируса ТГЭС был выявлен в патологическом материале от экспериментально инфицированных поросят. Сравнительный анализ показал, что выявленный изолят имеет генетическое родство с известным штаммом ТМК-22 вируса ТГЭС.

9. Разработанная методика выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, РВС и ЭДС с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции позволяет выявлять РКВС и дифференцировать его от вируса ТГЭС.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований предлагается для использования в практической работе рассмотренная и одобренная ученым советом и утвержденная директором ФГУ «ВНИИЗЖ» «Методика выявления и дифференциации вирусов трансмиссивного гастроэнтерита, ротавирусной инфекции и эпидемической диареи свиней с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции». Полученные данные о нуклеотидных последовательностях ротавируса и коронавирусов свиней могут быть использованы для индикации и дифференциации штаммов и полевых изолятов указанных вирусов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Абид Набиль Бен Салем, Владимир

1. Байбиков, Т.З. Основные инфекционные болезни свиней и их специфическая профилактика в современных условиях / Т.З. Байбиков, A.M. Рахманов, Н.А. Яременко // Актуал. пробл. инфекц. патол. ж-ных: мат. Междунар. науч. конф. Владимир, 2003. -С. 87-90.

2. Гаффаров, Х.З. Инфекционные болезни свиней и современные средства их диагностики, лечения и профилактики / Х.З. Гаффаров, Е.А. Романов // М.: Аквариум-Принт., 2004. С. 192.

3. Гречухин, А.Н. эпизоотология вирусного (трансмиссивного) гастроэнтерита свиней в свиноводческих комплексах с промышленной технологией / А. Н. Гречухин // Инфекционные болезни с.-х. ж-ных: сб. науч. тр.-Л., 1988.-С. 37-40.

4. Душук, Р.В. Трансмиссивный гастроэнтерит свиней (обзорная информация) / Р.В. Душук // М.: ВГНКИ, 1981. 54 с.

5. Егорова, А.И. Ротавирусная инфекция свиней / А.И. Егоров, С.Г. Ерофеев // Ветеринария. 2002. - N 7. - С. 16 -18.

6. Ирская, Г.Е. Локализация вируса трансмиссивного гастроэнтерита в органах поросят при экспериментальном заражении / Г.Е. Ирская // Инфекционные и инвазионные заболевания с.-х. ж-ных и птиц: сб. науч. тр.-Персиановка, 1993 .-С. 7-11.

7. Ирская, Г.Е. Сравнительное изучение лабораторных методов диагностики вирусного трансмиссивного гастроэнтерита свиней / Г.Е. Ирская, Г.Д.

8. Фирсова, Т.Н. Дерезина // Инфекционные и инвазионные заболевания с.-х. ясных и птиц: сб. науч. тр. Персиановка, 1993. - С. 3 - 6.

9. Клинические признаки и диагностика трансмиссивного гастроэнтерита свиней / А.И. Карелин, Г.А. Надточей, В.Н. Ласкавый и др. // Ветеринария.-1987,- № 8.- С. 43 46.

10. Кучерявенко, А.А. Особенности эпизоотологии трансмиссивного гастроэнтерита свиней в хозяйствах промышленного типа / А.А. Кучерявенко // Ветеринария. Киев, 1988. - Т. 63. - С. 50 - 52.

11. Отчет о НИР. Лаборатории диагностики особо опасных болезней животных / ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»); рук.: Щербаков А.В.; исполн.: Ковалишин В.Ф. и др..-Владимир, 2005. 30 с. - Библиогр.: с. 29-30.- Инв. № 239.

12. Погоняйло, Г.Ф. Гастроэнтероколит у свиней / Г.Ф. Погоняйло, А.П. Тарасов, П.П. Пирог // Бюл. науч.-техн. информ. Ленинградского НИВИ. -1956. -Вып. 2. С. 12 - 13.

13. Простой метод выделения и очистки РНК / О. Г. Грибанов, А. В. Щербаков, Н. А. Перевозчикова и др. // Биоорган, химия. 1997.-Т. 23, N29.- С. 763 - 765.

14. Пузанкова, О.С. Серомониторинг трансмиссивного гастроэнтерита свиней // О.С. Пузанкова, Т.З. Байбиков, С.А. Кукушкин // Актуал. пробл. инфекц. патол. ж-ных: мат. Меж. научн. конф. Владимир, 2003. -С. 94 - 97.

15. Пузанкова, О. С. Коронавирусные инфекции свиней / О. С. Пузанкова, Т. 3. Байбиков, С. А. Кукушкин // Журнал практикующего специалиста. 2004. -N11 -12.-С. 42-43.

16. Разработка метода иммуноферментного анализа для диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней / А.И. Собко, А.П. Старчеус, В.А. Синицын и др. // Науч. основы профилактики и борьбы с забол. с.-х. ж-х (сб. науч. работ). Киев, 1987. - С. 53 - 59.

17. Романенко, В.Ф. Инфекционные желудочно-кишечные болезни свиней / В.Ф. Романенко. М.: Колос, 1984. - С. 3 - 65.

18. Сергеев, В.А. Вирусные гастроэнтериты свиней / В.А. Сергеев, Т.И. Алипер, Е.А. Непоклонов // Ветеринария. 2003. - № 4. - С. 3 - 8.

19. Собко, А.И. Справочник по болезням свиней / А.И. Собко, И.Н. Гладенко. -Киев, 1981.-С. 39-46.

20. Шкабура, Ю.П. Стандартизация методов изготовления сухой вирусвакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней на основе глубинного культивирования вируса / Автореф. дс. канд. биол. наук. / Ю. П. Шкабура.-М., 1999.-20 с.

21. Эпизоотическая структура инфекционных болезней свиней в животноводческих хозяйствах России / А.В. Щербаков, В.Ф. Ковалишин,

22. A.С. Яковлева и др. // Актуал. про6л. инфекц. патол. ж-ных: мат. Междунар. науч. конф. Владимир, 2003. - С. 146 - 150.

23. Ястребов, А.С. О лабораторной диагностике вирусного (трансмиссивного) гастроэнтерита свиней /А.С. Ястребов // Ветеринар, наука: межвед. сб. Минск, 1987. - С. 13 - 16.

24. A morphological study of human rotavirus / R. Kogasaka, M. Akihara, K. Horino et al. //Arch. Virol. 1979. - V. 61.- P. 41 - 48.

25. Altenburg, B.C. Ultrastructural study of rotavirus replication in cultured cells /

26. B.C. Altenburg, K.Y. Graham, M.K. Estes II J. Gen. Virol. 1980. - V. 46. - P. 75 -85.

27. Analysis of constructed E gene mutants of mouse hepatitis virus confirms a pivotal role for E protein in coronavirus assembly / F. Fischer, C.F. Stegen, P.S. Masters et al. // J. Virol.- 1998. V. 72. - P. 7885 - 7894.

28. An ELISA optimized for porcine epidemic diarrhoea virus detection in faeces / L. Rodak, L. VaKcek, B. Smid et al. // Vet. Microbiol. 2005. - V. 105, N1. - P. 9 -17.

29. Anderson, R. Membrane and phospholipid binding by murine coronaviral nucleocapsid N protein / R. Anderson, F. Wong // Virology. 1993. - V. 194, N1.-P.224 - 232.

30. Antigenic structure of E2-glycoprotein of transmissible gastroenteritis coronavirus /1. Correa, G. Jimenez, C. Sune et al. // Virus Res. 1988. - V. 10. -P. 77 - 94.

31. Antigenic structure of transmissible gastroenteritis virus nucleoprotein / J.M. Martin Alonso, M. Balbin, D.J. Garwes et al. // Virology. 1992. - V. 188. - P. 168- 174.

32. Aminopeptidase N is a major receptor for the enteropathogenic coronavirus TGEV / B. Delmas, J. Gelfi, R. L'Haridon et al. // Nature. 1992. - V. 357. - P. 417-419.

33. Ballesteros, M.L. Two amino acid changes at the N-terminus of transmissible gastroenteritis coronavirus spike protein result in the loss of enteric tropism / M.L. Ballesteros, C.M. Sanchez, L. Enjuanes // Virology. 1997. - V 227.- P. 378 - 388.

34. Bass, D.M. NS35 and not VP7 is the soluble rotavirus protein which binds to target cells / D.M. Bass, E.R. Mackow, H.B. Greenberg // J. Virol. 1990. - V. 64. - P. 322 - 330.

35. Bastardo, J.E. Attachment of SA-11 rotavirus to erythrocyte receptors / J.E. Bastardo, I.G. Holmes // Infect. Immunol. 1980. - V.29. - P. 1134 - 1140.

36. Beards, G.M.F. Polymorphism of genomic RNAs within rotavirus serotypes and subgroups 11 / G.M.F. Beards // Arch. Virol. 1982. - V. 74. - P.65 - 70.

37. Belopopska, P. Use of a microvirus-neutralizing reaction in diagnosing transmissible gastroenteritis (TGE) / P. Belopopska, A. Motovski // Vet. Med. Nauki.- 1986.-V. 23, N6. P. 8 -11.

38. Binding of transmissible gastroenteritis coronavirus to cell surface sialoglycoproteins / S.W. Christel, G. Zimmer, H. Laude et al. // J. Virol. 2002.-V. 76,N12.-P. 6037-6043.

39. Bovine rotavirus segment 5 protein expressed in the baculovirus system interacts with zinc and RNA / P. Brottier, P. Nandi, M. Bremont et al. // J. Gen. Virol. 1992. - V. 73. - P. 1931 - 1938.

40. Boursnell, M.E. Sequence of the membrane protein gene from avian coronavirus IBV / M.E. Boursnell, T.D. Brown, M.M. Binns // Virus Res.- 1984.-V. 1, N4. P. 303 - 313.

41. Boyle, J.F. RNA-binding proteins of bovine rotavirus / J.F. Boyle, K.V. Holmes // J. Virol.- 1986.- V. 58. P. 561-568.

42. Brierley, I. Characterization of an efficient coronavirus ribosomal frame shifting signal: requirement for an RNA pseudoknot /1. Brierley, P. Digard, S.C. Inglis // Cell. 1989. - V. 57, N4. - P. 537 - 547.

43. Calf diarrhea (scours) reproduced with a virus from a field outbreak / C.A. Mebus, N.R. Underdahl, M.B. Rhoades et al. // Univ. of Nebraska Res. Bull.-1969. -V. 233. P. 1 -16.

44. Cavanagh, D. Coronavirus IBV: further evidence that the surface projections are associated with two glycopolypeptide / D. Cavanagh // J. Gen. Virol. -1983. -V. 64.-P. 1787- 1791.

45. Cell-free translation of murine coronavirus RNA / J.L. Leibowitz, S.R. Weiss, E. Paavola et al. // J. Virol. 1982. - V. 43, N3. - P. 905 - 913.

46. Characterization of monoclonal antibodies against human rotavirus hemagglutinin / S. Kitaoka, N. Fukuhara, F. Tazawa et al. // J. Med. Virol. -1986.-V. 19.-P. 313 323.

47. Characterization of virus-like particles produced by the expression of rotavirus capside proteins in insect cells / S.E. Crawford, M. Labbe, J. Cohen et al. // J. Virol. 1994. - V. 68. - P. 5945 - 5952.

48. Characterization of the sialic acid binding activity of transmissible gastroenteritis by analysis of haemagglutinatination-deficient mutants / C. Krempl, M. L. Ballesteros, G. Zimmer et al. // J. Virol. 2000. - V. 81. - P. 489 - 496.

49. Chasey, D. Detection of rotavirus in experimentally infected piglets / D. Chasey, M. Lucas // Res. Vet. Sci. 1977. - V. 22. - P. 124 - 125.

50. Chasey, D. Virus-like particles associated with porcine epidemic diarrhea / D. Chasey, S. H. Cartwright // Res. Vet. Sci. 1978. - V. 25. - P. 255.

51. Cohen, J. Ribonucleic acid polymerase activity associated with purified calf rotavirus / J. Cohen // J. Gen. Virol. 1977. - V. 36. - P. 395 - 402.

52. Collins, J.E. Comparative virulence of two porcine group-A rotavirus isolates in gnotobiotic pigs / J.E. Collins, D.A. Benfield, J.R. Duimstra // Am. J. Vet. Res. -1989.-V. 50,N6.-P. 827- 835.

53. Conner, M. E. Rabbit model of rotavirus infection / M. E. Conner, M. K. Estes, D. Y. Graham // J. Virol. 1988. - V. 62. - P. 1625 - 1633.

54. Conner, M. E. Rotavirus vaccines and vaccination potential / M. E. Conner, D. 0. Matson, M. K. Estes // Rotaviruses.- N. Y., 1994. P. 285 - 338.

55. Complete sequence (20 kilobases) of the polyprotein-encoding gene 1 of transmissible gastroenteritis virus / J.F. Eleouet, D. Rasschaert, P. Lambert et al. //Virology. 1995. -V. 206. - P. 817 - 822.

56. Coronaviruses / D. A. J. Tyrrell, J.D. Almeida, D.M. Berry et al. // Nature London. 1968. - V. 220. - P. 650.

57. Coronaviridae / D.A.J. Tyrrell, J.D. Almeida, C.H. Cunningham et al. // Intervirology. 1975. - V. 5. - P. 76 - 82.

58. Coronavirus-like particles associated with diarrhea in baby pigs in Quebec / D. C. Turgeon, M. Morin, J. Jolette et al. // Can. Vet. J. 1980. - V. 21, N3. - P. 100.

59. Coronavirus genome: prediction of putative functional domains in the nonstructural polyprotein by comparative amino acid sequence analysis / A.E. Gorbalenya, E.V. Koonin, A.P. Donchenko et al. // Nucleic Acids Res. 1989. -V. 17,N12.-P. 4847-4861.

60. Cox, E. Sites of replication of a porcine respiratory coronavirus related to transmissible gastroenteritis virus / E. Cox, J. Hooyberghs, M.B. Pensaert // Res. Vet. Sci. 1990. - V. 48, N2. - P. 165 - 169.

61. Cukor, G. Human viral gastroenteritis / G. Cukor, N.R. Blacklow // Microbiol. Rev. 1984.-V. 48.-P. 157- 179.

62. Debouck, P. Experimental infection of pigs with a new porcine enteric coronavirus CV777 / P. Debouck, M. Pensaert // Am. J. Vet. Res. 1980. - V. 41, N2.-P.219-223.

63. Delmas, B. Antigenic structure of transmissible gastroenteritis virus. II. Domains in the peplomer protein / B. Delmas, J. Gelfi, H. Laude // J. Gen. Virol.-1986.-V. 67.-P. 1405 1418.

64. Delmas, B. Assembly of coronavirus spike protein into trimers and its role in epitope expression / B. Delmas, H. Laude // J. Virol. 1990. - V. 64, N11. - P. 5367 - 5375.

65. Deregt, D. Structural proteins of bovine coronavirus and their intracellular processing / D. Deregt, M. Sabara, L.A. Babiuk // J. Gen. Virol. 1987. - V. 68, N11.-P. 2863 -2877.

66. Detection of transmissible gastroenteritis virus using cDNA probes / D. A. Benfield, D.J. Jackwood, I. Вас et al. / Arch. Virol. 1991. - V. 116, N1 - 4. - P. 91 -106.

67. Development of protection against coronavirus induced diseases / L. Enjuanes, C. Smerdou, J. Castilla et al. // Review Adv. Exp. Med. Biol. 1995. - V. 380. -P. 197-211.

68. Direct and rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus by RT-PCR / K. Ishikawa, H. Sekiguchi, T. Ogino et al. //J. Virol. Methods.- 1997.- V. 69, N1 -2. -P. 191-195.

69. Disulfide bonds in folding and transport of mouse hepatitis coronavirus glycoproteins / D.J. Opstelten, P. de Groote, M.C. Horzinek et al. // J. Virol. -1993. V. 67, N12. - P. 7394 - 7401.

70. Doyle, L.P. A transmissible gastroenteritis in pigs / L.P. Doyle, L.M. Hutchings // J. Am. Vet. Med Assoc. 1946. - V. 108. - P. 257 - 259.

71. Doyle, L.P. Transmissible gastroenteritis of pigs / L.P. Doyle // North Am. Vet. -1951.-V. 32, N7. P. 477-478.

72. Durate, M. Sequence of the spike protein of the porcine epidemic diarrhea virus /М. Durate, H. Laude//J. Gen. Virol. 1994. - V. 75. - P. 1195 - 1200.

73. Electron microscopy, immune electron microscopy, enzyme immunoassay and immunofluorescent evaluation of rotaviruses isolated from individual calves and piglets / K. Malicki, E. Malicka, M.W. Banbura et al. // Acta Virol. 1990. - V. 34,N6.-P. 523 - 528.

74. Electropherotype heterogeneity within serotypes of human rotavirus strains circulating in Italy / G. Gerna, S. Arista, N. Passarani et al. // Arch. Virol. 1987. -V. 95.-P. 129- 135.

75. Enjuanes, L. Molecular basis of transmissible gastroenteritis virus epidemiology / L. Enjuanes, B.A.M. Van der Zeijst. // The Coronaviridae. N. Y., 1995.-P. 337-376.

76. Esparza, J. A study on the ultrastructure of human rotavirus / J. Esparza, F. Gil//Virology. 1978.-V. 91.-P. 141 - 150.

77. Estes, M.K. Rotaviruses / M.K. Estes, E.L. Palmer, J.F. Obijeski // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1983. - V. 105. - P. 123 - 184.

78. Estes, M.K. Rotavirus gene structure and function / M.K. Estes, J. Cohen // Microbiol. Review. 1989. - V. 53, N4. - P. 410 - 449.

79. Estes, M.K. Rotaviruses and their replication // Virology / B.N. Fields, O.M. Knipe, P.M. Howley. 3rd ed. - Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, 1996. -P. 1625 - 1655.

80. Evidence for a coiled-coil structure in the spike proteins of coronaviruses / R. J. De Groot, W. Luytjes, M. C. Horzinek et al. // J. Mol. Biol. 1987. - V. 196. -P. 963 - 966.

81. Evidence for a porcine respiratory coronavirus, antigenically similar to transmissible gastroenteritis virus, in the United States / D.R. Wesley, D.R. Woods, H.T. Hill et al. //J. Vet. Diagn. Invest. 1990. - V. 2. - P. 312 - 317.

82. Family coronaviridae / L. Enjuanes, D. Brian, D. Canavagh et al. // Virus taxonomy: seven report of the ICTV. San Diego, California, USA, 2000. - P. 835 - 849.

83. Fitzgerald, G. Oral vaccination against TGE reduces mortality / G. Fitzgerald, J. Welter // Pigs. 1990. - V. 6, N4. - P. 27.

84. Four major antigenic sites of the coronavirus transmissible gastroenteritis virus are located on the amino-terminal half spike glycoprotein S / B. Delmas, D. Rasschaert, M. Godet et al. // J. Gen. Virol. 1990. - V. 71. - P. 1313 - 1324.

85. Furuuchi, S. Multiplication of low and high cell culture passaged strains of transmissible gastroenteritis virus in organs of newborn piglets / S. Furuuchi, Y. Shimizu, T. Kumagal // Vet. Microbiol. 1978/79. - V. 3. - P. 169 - 178.

86. Gallagher, T.M. Alteration of the pH dependence of coronavirus-induced cell fusion: effect of mutations in the spike glycoprotein / T.M. Gallagher, C. Escarmis, M.J. Buchmeier//J Virol. 1991.-V. 65, N4. - P. 1916 - 1928.

87. Genetic evolution and tropism of transmissible gastroenteritis coronavirus / C.M. Sanchez, F. Gebauer, C. Sune et al. // Virology. 1992. - V. 190. - P. 92 -105.

88. Genome organization of porcine epidemic diarrhea virus / M. Durate, J. Gelfi, P. Lambert et al. // Adv. Exp. Med. Biol. 1993. - V. 342.- P. 55 - 60.

89. Gnotobiotic piglets experimentally infected with neonatal calf diarrhea reovirus-like agent (rotavirus) / G.A. Hall, J.C. Bridger, R.L. Chandler et al. // Vet. Pathol. 1976. - V. 13. - P. 197 - 210.

90. Gombold, J.L. Analysis of reassortment of genome segments in mice mixedly infected with rotaviruses SA11 and RRV / J.L. Gombold, R. F. Ramig // J. Virol. -1986.-V. 57.-P. 110-116.

91. Griffiths, G. Cell biology of viruses that assemble along the biosynthetic pathway / G. Griffiths, P. Rottier // Semin. Cell Biol. 1992. - V. 3, N5.-P. 367 -381.

92. Haelterman, E. On the pathogenesis of transmissible gastroenteritis of swine / E. Haelterman // J. Amer. Vet. Med. Assoc. 1972. - V. 160, N4, Part 2. - P. 534 -540.

93. Harada, K. Cytopathogenicity of transmissible gastroenteritis virus in pigs / K. Harada, T. Kumagai, J. Sasahara // Natl. Inst. Anim. Health Quart. 1963. - V. 3. -P. 166- 167.

94. Hofmann, M. Quantitation, biological and physicochemical properties of cell culture-adpted porcine epidemic diarrhea coronavirus (PEDV) / M. Hofmann, R. Wyler//Vet. Microbiol. 1989. - V. 20, N2. - P. 131 - 142.

95. Holmes, K.V. Tunicamycin resistant glycosylation of coronavirus glycoprotein: demonstration of a novel type of viral glycoprotein / K.V. Holmes, E.W. Doller, L.S. Sturman// Virology. 1981. - V. 115, N2.-P. 334 - 344.

96. Holmes, К. V. Coronaviridae: The viruses and their replication / К. V. Holmes, M.M. Lai // Virology / ed. B.N. Fields et al.. 3rd ed. - Lippincott: Raven Publishers, Philadelphia, 1996. - P. 1075 - 1103.

97. Hooper, B.E. Lesions of the gastrointestinal tract of pigs infected with transmissible gastroenteritis / B.E. Hooper, E.O. Haelterman // Can. J. Сотр. Med. 1969.-V. 33.-P. 29-36.

98. Identification of a coronavirus inducing porcine gastroenteritis in Spain / G. Jiminez, J.M. Castro, M. del Pozzo et al. // Proc. Int. Pig Vet. Soc. Congr. 1986. -V. 9.-P. 186.

99. Identification of a domain required for autoproteolytic cleavage of murine coronavirus gene A polyprotein / S.C. Baker, C.K. Shieh, L.H. Soe et al. // J. Virol. 1989. - V. 63, N9. - P. 3693 - 3699.

100. Identification of polypeptides encoded in open reading frame lb of the putative polymerase gene of the murine coronavirus mouse hepatitis virus A59 / M.R. Denison, P.W. Zoltick, J.L. Leibowitz et al. // Virology. 1991. - V. 65, N6. - P. 3076 - 3082.

101. Identification of the catalytic sites of a papain-like cysteine proteinase of murine coronavirus / S.C. Baker, K. Yokomori, S. Dong et al. // J. Virol. 1993. -V. 67,N10.-P. 6056-6063.

102. Immunization with baculovirus-expressed VP4 protein passively protects against simian and murine rotavirus challenge / E.R. Mackow, P.T. Vo, R. Broome et al. // J. Virol.- 1990.-V. 64, N1.-P. 1698 1703.

103. Inigo, J. S. Structural maturation of the transmissible gastroenteritis virus / J. Inigo, S. L. Jose, C. Risco // J. Virol. 1999. - V. 73, N10. - P. 7952 - 7964.

104. Interactions between coronavirus nucleocapsid protein and viral RNAs: implications for viral transcription / R. S. Baric, G. W. Nelson, J. 0. Fleming et al. // J. Virol. 1988. - V. 62. - P. 4280 - 4287.

105. Intestinal permeability to macromolecules in piglets infected with transmissible gastroenteritis virus / L. Vellenga, T. Wensing, H.J. Egberts et al. // Vet. Res. Commun. 1988. - V. 12, N6. - P. 481 - 489.

106. Intracellular processing of the N-terminal ORF la proteins of the coronavirus MHV-A59 requires multiple proteolytic events / M.R. Denison, P.W. Zoltick, S.A. Hughes et al.//Virology.- 1992.-V. 189, N1. P. 274 - 284.

107. In vitro assembly of the murine coronavirus membrane protein El / P.J.M. Rottier, P. Vandenburg, J. Armstrong et al. // Adv. Exp. Med. Biol. 1984. - V. 173.-P. 53 -64.

108. Isolation of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in Korea / C.H. Kweon, B.J. Kweon, T.S. Jung et al. // Korean J. Vet. Res. 1993. - V. 33. - P. 249 - 254.

109. Isolation of porcine epidemic diarrhea virus in porcine cell cultures and experimental infection of pigs of different ages /1. Shibata, T. Tsuda, M. Mori et al. //Vet. Microbiol. 2000. - V. 72. - P. 173 - 182.

110. Jim, S. O. Identification of a putative receptor 150 kDa polypeptide for porcine epidemic diarrhea virus in porcine enterocytes / S. O. Jim, D. S. Song, B. K. Park // J. Vet. Sci. 2003. - V. 4, N3. - P. 269 - 275.

111. Joo, M. Mutagenic analysis of the coronavirus intergenic consensus sequence / M. Joo, S. Makino // J. Virol. -1992. V. 66, N11. - P. 6330-6337.

112. Kabcenell, A.K. Processing of the rough endoplasmic reticulum membrane glycoproteins of rotavirus SA11 / A.K. Kabcenell, P.G. Atkinson // J. Cell Biol. -1985.-V. 101.-P. 1270- 1280.

113. Kemeny, L.J. Quantitative transmissible gastroenteritis virus shedding patterns in lactating sows / L.J. Kemeny, R.D. Wood // Am. J. Vet. Res. 1977. -V. 38, N3.-P. 307-310.

114. Kim, O. In situ hybridization for the detection and localization of porcine epidemic diarrhea virus in the intestinal tissues from naturally infected piglets / O. Kim, C. Chae // Vet. Pathol. 2000. - V. 37, N1. - P. 62 - 67.

115. Kim, O. Experimental infection of piglets with a Korean strain of porcine epidemic diarrhea virus / O. Kim, C. Chae // J. Сотр. Pathol. 2003. - V. 129. - P. 55 - 60.

116. Klenk, H.D. Cotranslational and posttranslational processing of viral glycoproteins / H.D. Klenk, R. Rott // Curr.Top. Microbiol. Immunol. 1981. - V. 90.-P. 19-48.

117. Kooi, C. Differentiation of acid-pH-dependent and -nondependent entry pathways for mouse hepatitis virus / C. Kooi, M. Cervin, R. Anderson // Virology. -1991.-V. 180, N1.-P. 108-119.

118. Kubo, H. Localization and neutralizing epitopes and the receptor-binding site within the amino-terminal 330 amino acids of the murine coronavirus spike protein / H. Kubo, Y. Yamada, F. Taguchi // J. Virol. 1994. - V. 68. - P. 5403 - 5410.

119. Kiinkel, F. Structural and functional analysis of the surface protein of human coronavirus OC43 / F. Kiinkel, G. Herrler // Virology. 1993. - V. 195, N1. - P. 195 - 202.

120. Lai, M.M. Replication of mouse hepatitis virus: negative-stranded RNA and replicative form RNA are of genome length / M.M. Lai, C.D. Patton, S.A. Stohlman // J. Virol. 1982. - V. 44, N2. - P. 487 - 492.

121. Lai, M.M. Coronavirus: organization, replication and expression of genome / M.M. Lai // Annu. Rev. Microbiol. 1990. - V. 44. - P. 303 - 333.

122. Lai, M.M.C. The molecular biology of coronaviruses / M.M.C. Lai, D. Canavagh // Adv. Virus Res. 1997. - V. 48. - P. 1 - 100.

123. Laude, H. Replication of transmissible gastroenteritis coronavirus (TGEV) in swine alveolar macrophages / H. Laude, B. Charley, J. Gelfi // J. Gen.Virol. -1984.-V. 65.-P. 327-332.

124. Laude, H. Porcine respiratory coronavirus: molecular features and virus-host interactions / H. Laude, K.V. Reeth, M. Pensaert // Vet. Res. 1993. - V. 24. - P. 125 - 150.

125. Liu, M. Identification of the simian rotavirus SA11 genome segment 3 product / M. Liu, P. A. Offit, M. K. Estes // Virology. 1988. - V. 163. - P. 26 -32.

126. Localization of antigenic sites of the E2 glycoprotein of transmissible gastroenteritis virus /1. Correa, F. Gebauer, M.J. Bullido et al. // J. Gen. Virol. -1990.-V. 71.-P. 271 -279.

127. Maass, O.R. Rotavirus proteins VP7, NS28, and VP4 form oligomeric structures/ O.R. Maass, P.H. Atkinson // J. Virol. 1990. - V. 64, N6. - P. 2632 -2641.

128. McCrae, M.A. Molecular biology of rotaviruses. V. Terminal structure of viral RNA species / M.A. McCrae, J.G. McCorquodale // Virology. 1983. -V. 126.-P. 204-212.

129. Mason, B.B. Biochemical mapping of the simian rotavirus SA11 genome / B.B. Mason, D.Y. Graham, M.K. Estes // J. Virol. 1983. - V. 46. - P. 413 -423.

130. Major receptor-binding and neutralization determinants are located within the same domain of the transmissible gastroenteritis virus (coronavirus) spike protein / M. Godet, J. Grosclaude, B. Delmas et al. // J. Virol. 1994. - V. 68. - P. 8008 -8016.

131. McCrae, M. A. Molecular biology of rotaviruses. II. Identification of the protein-coding assignments of calf rotavirus genome RNA species / M.A. McCrae, J.G. McCorquodale//Virology. 1982. - V. 117. - P. 435 - 443.

132. Mitchell, D.B. Simian rotavirus SA11 segment 11 contains overlapping reading frames / D.B. Mitchell, G.W. Both // Nucleic Acids Res.- 1988.- V. 16.- P. 6244.

133. Molecular biology of transmissible gastroenteritis virus / H. Laude, D. Rasschaert, B. Delmas et al. // Vet. Microbiol. 1990. - V. 23. - P. 147 - 154.

134. Moon, H. W. Pathophysiology of viral diarrhea / H. W. Moon // Viral Infections of the Gastrointestinal Tract. -N. Y., 1994. P. 27 - 52.

135. Moon, H.W. Comparative histopathology of intestinal infections / H.W. Moon // Adv. Exp. Med. Biol. 1997. - V. 412. - P. 1 - 19.

136. Morin, M. Transmissible gastroenteritis in feeder pigs: observations on the jejunal epithelium of normal feeder pigs and feeder pigs infected with TGE virus / M. Morin, L.G. Morehouse // Can. J. Сотр. Med. 1974. - V. 38, N3. - P. 227 -235.

137. Mutational analysis of the RNA pseudoknot component of a coronavirus ribosomal frameshifting signal /1. Brierley, N.J. Rolley, A.J. Jenner et al. // J. Mol. Biol. -1991. V. 220, N4. - P. 889 - 902.

138. Much, D.H. Purification and characterization of epizootic diarrhea of infant mice virus / D.H. Much, I. Zajac // Infect. Immunol. 1972. - V. 6. - P. 1019 -1024.

139. Nucleotide sequence and expression in Escherichia coli of the gene encoding the nonstructural protein NCVP2 of bovine rotavirus / M. Bremont, A. Charpilienne, D. Chabanne et al. // Virology. 1987. - V. 161. - P. 138 - 144.

140. Nucleotide sequence of bovine rotavirus gene 1 and expression of the gene product in baculovirus / J. Cohen, A. Charpilienne, S. Chilmonczyk et al. // Virology.-1989.-V. 171, N1.-P. 131 -140.

141. Nucleotide sequence of the human coronavirus 229E RNA polymerase locus / J. Herold, T. Raabe, B. Schelle-Prinz et al. // Virology. 1993. - V. 195, N2. - P. 680 -691.

142. Offit, P.A. Identification of the two rotavirus genes determining neutralization specificities / P.A. Offit, G. Blavat // J. Virol. 1986. - V. 57. -P. 376 - 378.

143. Offit, P.A. Rotavirus-specific cytotoxic T lymphocytes cross-react with target cells infected with different rotavirus serotypes / P.A. Offit, K.L. Dudzik // J. Virol. 1988. - V. 62. - P. 127 - 131.

144. Organization of two transmissible gastroenteritis coronavirus membrane protein topologies within the virion and core / D. Escors, E. Camafeita, J. Ortego et al. // J. Virol. 2001. - P. 12228-12240.

145. Pathology of neonatal calf diarrhea induced by reo-like virus / C.A. Mebus, S.L. Stair, N.R. Underdahl et al. //Vet. Pathol. -1971. V. 8. - P. 490 - 505.

146. Pathogenesis of porcine rotaviral infection in experimentally inoculated gnotobiotic pigs / K.W. Theil, E.H. Bohl, R.F. Cross et al. // Am. J. Vet. Res. -1978.-V. 39, N2.-P. 213-220.

147. Pathogenicity of experimental infection with 'pneumotropic' porcine coronavirus / D. O'Toole, I. Brown, A. Bridges et al. // Res. Vet. Sci. 1989. - V. 47.-P. 23 -29.

148. Pathology of experimental CV777 coronavirus enteritis in piglets / R. Ducatelle, W. Coussement, P. Debouck et al. // Vet. Pathol. 1982. - V. 19. - P. 57 - 66.

149. Paton, J.T. Synthesis of simian rotavirus SA11 double-stranded RNA in a cell-free system / J.T. Paton // Virus Res. 1986. - V. 6. - P. 217 - 233.

150. Paton, J.T. Structure and protein composition of the rotavirus replicase particle / J.T. Paton, C.O. Gallegos // Virology. 1988. - V. 166. - P. 358 - 365.

151. Pensaert, M. B. A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine / M. B. Pensaert, P. Debouck // Arch. Virol. 1978. - V. 58. - P. 243 - 247.

152. Pensaert, M. Porcine epidemic diarrhea (PED) caused by a coronavirus: present knowledge / M. Pensaert, P. Callebaut, P. Debouck // Proc. 7th I.P.V.S. Congr. Mexico, 1981.-P. 52.

153. Pensaert, M.B. Transmissible gastroenteritis virus (respiratory variant) / M.B. Pensaert // Virus infections of porcines. Amsterdam: Elsevier Science Publishers B.V., 1989.-P. 154 165.

154. Petrie, B.L. Identification of rotavirus particle types / B.L. Petrie, D.Y. Graham, M.K. Estes // Intervirology. -1981. V. 16. - P. 20 - 28.

155. Physiochemical properties of transmissible gastroenteritis virus hemagglutination / M. Noda, F. Koide, M. Asagi et al. // Arch. Virol. 1988. - V. 99.-P. 163 - 172.

156. Point mutations in the S protein connect the sialic acid binding activity with the enteropathogenicity of transmissible gastroenteritis coronavirus / C. Krempl, B. Schultze, H. Laude et al. //J. Virol. 1977. - V. 71. - P. 3285 - 3287.

157. Poncet, D. Roravirus protein NSP3 (NS34) is bound to the 3 end consensus sequence of viral mRNAs in infected cells / D. Poncet, C. Aponte, J. Cohen // J. Virol. -1993. V. 67. - P. 3159 - 3165.

158. Poncet, D. Four nucleotides are the minimal requirement for RNA recognition by rotavirus non-structural protein NSP3 // D. Poncet, S. Laurent, J. Cohen // EMBO J. 1994. - V. 13. - P. 4165 - 4173.

159. Porcine epidemic diarrhea: laboratory results and field observations / P. Callebaut, P. Debouck, M. Pensaert, et al. // Results of Pig Research. Brussels, 1984.-P. 44.

160. Post-translational glycosylation of coronavirus glycoprotein El: inhibition by monensin / H. Niemann, B. Boschek, D. Evans et al. // EMBO J. 1982. - V. 1, N12.-P. 1499- 1504.

161. Predicted membrane topology of the coronavirus protein El / P.J. Rottier, G.W. Welling, S. Welling-Wester et al. // Biochemistry. 1986. - V. 25, N6. - P. 1335 - 1339.

162. Preliminary studies on the isolation of coronavirus 229E nucleocapsids / E.O. Caul, C.R. Ashley, M. Ferguson et al. // FEMS Microbiol. Lett. 1979. - V. 5. -P. 101 -105.

163. Purification and characterization of bovine rotavirus cores / P. Bican, J. Cohen, A. Charpilienne et al. // J. Virol. 1982. - V. 43. - P. 1113 -1117.

164. Rapid diagnosis of porcine epidemic diarrhea virus infection by polymerase chain reaction / C.H. Kweon, J.G. Lee, M.G. Han et al. // J. Vet. Med. Sci. -1997.-V. 59, N3.-P. 231 -232.

165. Rasschaert, D. The predicted primary structure of the peplomer protein E2 of the porcine coronavirus transmissible gastroenteritis virus / D. Rasschaert, H. Laude// J. Gen. Virol. 1987. - V. 68,N7.-P. 1883 - 1890.

166. Relation between viruses from acute gastroenteritis of children and a new born calves / Т.Н. Flewett, A.S. Bryden, H.A. Savies et al. // Lancet. 1974. - V. 2.-P. 61 -63.

167. Retention of a cis Golgi protein requires polar residues on one face of a predicted alpha-helix in the transmembrane domain / С. E. Machamer, M.G. Grim, A. Esquela et al. // Mol. Biol. Cell. 1993. - V. 4, N7. - P. 695 - 704.

168. Rixon, F. Rotavirus RNA segments sized by electron microscopy / F. Rixon, P. Taylor, U. Desselberger // J. Gen. Virol. 1984. - V. 65. - P. 233 - 239.

169. Robert F. R. Pathogenesis of intestinal and systemic rotavirus infection / F. R. Robert // J. Virol. 2004. - V. 78, N19. - P. 10213 - 10220.

170. Rodger, S. M. Demonstration of reovirus-like particles in intestinal contents of piglets with diarrhea / S. M. Rodger, J.A. Craven, I. Williams // Aust. Vet. J. -1975.-V. 51.-P. 536.

171. Rotavirus as a cause of diarrhea / E.H. Bohl, E.M. Kohler, L.J. Saif et al. //J. Am. Vet. Med. Assoc. 1978. - V. 172. - P. 458 - 463.

172. Rotavirus-specific antibodies in fetal bovine serum and commercial preparations of serum albumin / P. A. Offit, H. F. Clark, A. H. Taylor et al. // J. Clin. Microbiol. 1984. - V. 20. - P. 266 - 270.

173. Rotavirus subgroup characterisation by restriction endonuclease digestion of a cDNA fragment of the VP6 gene / M. Iturriza Gomara, C. Wong, S. Blome et al. // J. Virol. Methods. 2002. - V. 105, N1. - P. 99 - 103.

174. Rottier, P. Signal recognition particle-dependent insertion of coronavirus El, an intracellular membrane glycoprotein / P. Rottier, J. Armstrong, D.I.Meyer // J. Biol. Chem. 1985. - V. 260, N8. - P. 4648 - 4652.

175. Ruggeri, F.M. Antibodies to the trypsin cleavage peptide VP8* neutralize rotavirus by inhibiting binding of virions to target cells in culture / F.M. Ruggeri, H.B. Greenberg // J. Virol. -1991. V. 65. - P. 2211 - 2219.

176. Saif, L. J. Nongroup A rotaviruses / L.J. Saif // Viral Diarrheas of Man and Animals. Florida: CRC Press, 1990. - V. 1. - P. 73 - 95.

177. Saif, L.J. Coronavirus immunogens / L.J. Saif// Vet. Microbiol. 1993. - V. 37. - P. 285 - 297.

178. Saif, L.J. Transmissible gastroenteritis and porcine respiratory coronavirus / L.J. Saif, R.D. Wesley // Diseases of Swine. Ames, Iowa, 1999. - P. 295 - 325.

179. Saif, L. J. Transmissible gastroenteritis virus and porcine respiratory coronavirus / LJ. Saif, K. Sestak // Diseases of Swine. Ames, Iowa, 2006. - P. 489-516.

180. Saraste, J. Pathways of protein sorting and membrane traffic between the rough endoplasmic reticulum and the Golgi complex / J. Saraste, E. Kuismanen // Semin. Cell Biol. 1992. - V. 3. - P. 343 - 355.

181. Sawicki, S.G. Coronavirus minus-strand RNA synthesis and effect of cycloheximide on coronavirus RNA synthesis / S.G. Sawicki, D.L.Sawicki // J. Virol. 1986. - V. 57, N1. - P. 328 - 334.

182. Sawicki, S.G. Coronavirus transcription: subgenomic mouse hepatitis virus replicative intermediates function in RNA synthesis / S.G. Sawicki, D.L. Sawicki // J. Virol. 1990. - V.64, N3. - P. 1050 - 1056.

183. Sequence and topology of a model intracellular membrane protein, El glycoprotein, from a coronavirus / J. Armstrong, H. Niemann, S. Smeekens et al. //Nature. 1984.-V. 308,N59-61.-P. 751 -752.

184. Sequence analysis of the membrane protein gene of human coronavirus 229E / P. Jouvenne, C.D. Richardson, S.S. Schreiber et al. // Virology.- 1990.- V. 174, N2.-P. 608 -612.

185. Sequence analysis of human coronavirus 229E mRNAs 4 and 5: evidence for polymorphism and homology with myelin basic protein / P. Jouvenne, S. Mounir, J.N. Stewart et al. // Virus Res. 1992. - V. 22, N2. - P. 125 - 141.

186. Sethna, P.B. Coronavirus subgenomic minus-strand RNAs and the potential for mRNA replicons / P.B. Sethna, S.L. Hung, D.A. Brian // Proc. Natl. Acad. Sci. 1989.- V. 86, N14. - P. 5626 - 5630.

187. Sethna, P.B. Minus-strand copies of replicating coronavirus mRNAs contain antileaders / P.B. Sethna, M.A. Hofmann, D.A. Brian // J. Virol. 1991. - V. 65, N1.-P. 320-325.

188. Shaw, D.P. Experimental rotavirus infection in three-week old pigs / D.P. Shaw, L.G. Morehouse, R.F. Solorzano // Am. J. Vet. Res. 1989. - V. 50. - P. 1961 - 1965.

189. Snijder, E. J., Toroviruses: replication, evolution and comparison with other members of the coronavirus-like superfamily / E. J. Snijder, M. C. Horzinek // J. Gen. Virol. 1993. - V. 74. - P. 2305 - 2316.

190. Stably expressed FIPV peplomer protein induces cell fusion and elicits neutralizing antibodies in mice / RJ. De Groot, R.W. Van Leen, M.J. Dalderup et al.//Virology. 1989.-V. 171, N2.-P. 493 -502.

191. Stohlman, S.A. Phosphoproteins of murine hepatitis viruses / S.A. Stohlman, M.M.C. Lai // J.Virol. 1979 - V. 32. - P. 672 - 675.

192. Structure of rotaviruses as studied by the freeze-drying technique / A. Roseto, J. Esgaig, E. Delain et al. //Virology. 1979. - V. 98. - P. 471 - 475.

193. Studies on the particles of infantile gastroenteritis virus (orbivirus group) / J.S. Tam, M.T. Szymanski, P.J. Middleton et al. // Intervirology. 1976. - V. 7. -P. 181 -191.

194. Sturman, L.S. Isolation of coronavirus envelope glycoproteins and interaction with the viral nucleocapsid / L.S. Sturman, K.V. Holmes, J. Behnke // J. Virol. -1980. V. 33, N1. - P. 449-462.

195. Synthesis and subcellular localization of the murine coronavirus nucleocapsid protein / S.A. Stohlman, J.O. Fleming, C.D. Patton et al. // Virology. 1983. - V. 130,N2.-P. 527 - 532.

196. Targeted recombination demonstrates that the spike gene of transmissible gastroenteritis coronavirus is a determinant of its enteric tropism and virulence / C.M. Sanchez, A. Izeta, J.M. Sanchez-Morgado et al. // J. Virol. 1999. - V. 73. -P. 7607-7618.

197. TGEV coronavirus ORF4 encodes a membrane protein that is incorporated into virions / M. Godet, R. l'Haridon, J.F. Vautherot et al. // Virology. 1992. -V. 188,N2.-P. 666-675.

198. The complete sequence (22 kilobases) of murine coronavirus gene 1 encoding the putative proteases and RNA polymerase / H.J. Lee, C.K. Shieh, A.E. Gorbalenya et al. //Virology.- 1991.- V. 180, N2.- P. 567-582.

199. The coronavirus gastroenteritis virus causes infection after receptor-mediated endocytosis and acid-dependent fusion with an intracellular compartment / G. H. Hansen, B. Delmas, L. Besnardeau et al. // J. Virol. 1998. - V. 72, N1. - P. 527 -534.

200. The 5'-end sequence of the murine coronavirus genome: implications for multiple fusion sites in leader-primed transcription / C.K. Shieh, L.H. Soe, S. Makino et al. // Virology. 1987. - V. 156, N2. - P. 321 - 330.

201. The influence of divalent cations on the stability of human rotavirus / J.A. Shirley, J.M. Beards, M.E. Thouless et al. // Arch. Virol. 1981. - V. 67. - P. 1 -9.

202. The isolation of porcine reovirus-like agents (rotaviruses) from acute gastroenteritis of piglets / G. N. Woode, J. Bridger, G.A. Hall et al. // Med. Microbiol. 1976. - V. 9. - P. 203 - 209.

203. The genome organization of the Nidovirales: similarities and differences between arteriviruses, toroviruses and coronaviruses / A.A.F. De Vries, M.C. Horzinek, P.G.M. Rottier et al. // Semin. Virol. 1997. - V. 8. - P. 33 - 47.

204. The 9-kDa hydrophobic protein encoded at the 3' end of the porcine transmissible gastroenteritis coronavirus genome is membrane-associated / F.Y. Tung, S. Abraham, M. Sethna et al. // Virology. 1992. - V. 186. - P. 676 - 683.

205. Theil, K.W. Group A rotaviruses / K.W. Theil // Viral Diarrheas of Man and Animals . Florida: CRC Press, 1990. - V. 3. - P. 35 - 72.

206. The postulated role of feeder swine in the perpetuation of the transmissible gastroenteritis vims / M. Morin, R. F. Solorzano, L. G. Morehouse et al. // Can. J. Сотр. Med. 1978. - V. 48. - P. 379 - 384.

207. The structure of the rotavirus inner capsid studied by electron microscopy of chemically disrupted particles / J. E. Ludert, F. Gil, F. Liprandi etal.//J. Gen. Virol. 1986. - V. 67. - P. 1721 - 1725.

208. The transmissible gastroenteritis coronavirus contains a spherical core shell consisting of M and N proteins / C. Risco, I.M. Anton, L. Enjuanes et al. // J. Virol. 1996. - V. 70. - P. 4773 - 4777.

209. Transmissible gastroenteritis in feeder swine: Clinical, immunofluorescence and histopathological observations / M. Morin, L.G. Morehouse, R.F. Solorzano et al. // Can. J. Сотр. Med. 1973. - V. 37, N3. - P. 239 - 248.

210. Transmissible gastroenteritis virus, but not the related porcine respiratory coronavirus, has a sialic acid (N-glycolylneuraminic acid) binding activity / B. Schultze, M. L. Krempl, L. Ballesteros et al. // J. Virol. 1996. - V. 70. - P. 5634 - 5637.

211. Transmissible gastroenteritis and porcine epidemic diarrhea in Britain / G. C. Pritchard, D. J. Paton, G. Wibberley et al. // Vet. Res. 1999. - V. 144. - P. 616 -618.

212. Transmissible gastroenteritis coronavirus gene 7 is not essential but influence in vivo virus replication and virulence / O. Javier, S. Isabel, A. Fernando et al. //Virology. 2003. - V. 308, N1. - P. 13 - 22.

213. Tropism and immunoprotection in transmissible gastroenteritis coronaviruses / L. Enjuanes, C. Sanchez, A. Mendez et al. // Dev. Biol. Stand. 1995. - V. 84. -P. 145 - 152.

214. Two modes of human rotavirus entry into MA 104 cells / H. Suzuki, S. Kitaoka, T. Konno et al. // Arch. Virol. 1985. - V. 85. - P. 25 - 34.

215. Tzipori, S. Isolation of a rotavirus from deer / S. Tzipori, I.W. Caple, R. Butler // Vet. Rec. 1976. - V. 99. - P. 398.

216. Ultrastructural localization of rotavirus antigens using colloidal gold / B.L. Petrie, H.B. Greenberg, D.Y. Graham et al. // Virus Res. 1984. - V. 1. - P. 133 -152.

217. Un nouveau coronavirus porcin. Etude sero-epidemiologiques retrospectives dans les elevages de Bretagne / A. Jestin, Y. Le Forban, P. Vannier et al. // Receuil de Med. Vet. 1987. - V. 163, N5. - P. 567 - 571.

218. Vaughn, E.M. Antigenic and biological diversity among transmissible gastroenteritis virus isolates of swine / E.M. Vaughn, P.S. Paul // Vet. Microbiol. -1993.-V. 36.-P. 333 347.

219. Verification of sensitivity and specificity of group a rotavirus detection in piglets faeces with monoclonal blocking ELISA methods / L. Rodak, B. Smi'd, Z. Nevorankova et al. //J. Vet. Med. B. 2004. - V. 51, N4. - P. 160 - 165.

220. Wagner, J.E. Electron microscopy of intestinal epithelial cells of piglets infected with a transmissible gastroenteritis virus / J.E. Wagner, P.D. Beamer, M. Ristic // Can. J. Сотр. Med. 1973. - V. 37, N2. - P. 177 - 188.

221. Ward, C.W. Structural homologies between RNA gene segments 10 and 11 from UK bovine, simian SA11, and human Wa rotaviruses / C.W. Ward, A.A. Azad, M.L. Dyall-Smith // Virology. 1985. - V. 144. - P.328 - 336.

222. Weingartl, H.M. Evidence for a putative second receptor for porcine transmissible gastroenteritis virus on the villous enterocytes of newborn pigs / H.M. Weingartl, J.B. Derbyshire // J. Virol. 1994. - V. 68. - P. 7253 - 7259.

223. Weiss, C. Rapid inactivation of rotaviruses by exposure to acid buffer or acidic gastric juice / C. Weiss, H.F. Clark // J. Gen. Virol. 1985. - V. 66. - P. 2725 - 2730.

224. Wege, H. Hybridoma antibodies to the murine coronavirus JHM: characterization of epitopes on the peplomer protein (E2) / H. Wege, R. Dorries, H. Wege//J. Gen. Virol. 1984. - V. 65. - P. 1931 - 1942.

225. Wesley, H.D. Genetic analysis of porcine respiratory coronavirus, an attenuated variant of transmissible gastroenteritis virus / H.D. Wesley, R.D. Wood, A.K. Cheung // J. Virol. 1991. - V. 65. - P. 3369 - 3373.

226. Wood, E.N. An apparently new syndrome of porcine epidemic diarrhea / E.N. Wood // Vet. Rec. 1977. - V.100. - P. 243.

227. Wood, E.N. Transmissible gastroenteritis and epidemic diarrhea of pigs / E.N. Wood // Brit. Vet. J. 1980. - V. 135. - P. 305 - 314.

228. Wood, E.N. Transmissible gastroenteritis of pigs / E.N. Wood, G.C. Pritchard, E.A. Gibson // Vet. Rec. -1981. V. 108, N2. - P. 41.

229. Zhao, X. Presence of subgenomic mRNAs in virions of coronavirus IBV / X. Zhao, K. Shaw, D. Cavanagh // Virology. 1993. - V. 196, N1. - P. 172 - 178.

Информация о работе

Абид Набиль Бен Салем
кандидата биологических наук
Владимир, 2007
ВАК 03.00.06

Диссертация

Выявление и дифференциация возбудителей коронавирусной и ротавирусной инфекций свиней методом мультиплексной полимеразной цепной реакции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы