Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная организация хромосом и изменение генома у трансгенных сельскохозяйственных животных

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная организация хромосом и изменение генома у трансгенных сельскохозяйственных животных"

На правах рукописи

КОЗИКОВА ЛАРИСА ВАСИЛЬЕВНА

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ХРОМОСОМ И ИЗМЕНЕНИЕ ГЕНОМА У ТРАНСГЕННЫХ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Специальность 03.00.15-генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в лаборатории молекулярной цитогенетики Государственного научного учреждения Всероссийский научно-

исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный консультант: член-корреспондент РАСХН, профессор,

доктор биологических наук, заслуженный деятель науки РФ А.Ф.Яковлев (ГНУ ВНИИГРЖРАСХН)

Официальные опоненты: доктор биологических наук, профессор

Т.И. Кузьмина (ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН)

доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ А.И. Жигачев (СПбГАВМ)

доктор биологических наук

Т.В. Кузнецова (ГУ НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН)

Ведущее учреждение: Институт цитологии РАН

Защита состоится « ^ » мая 2005 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 006.012.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных по адресу: 196601, Санкт-Петербург-Пушкин, Московское шоссе 55-а. Факс: (812) 465 99 89

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН Автореферат разослан марта 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук "" Г.Н. Сердюк

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Исследования по теме диссертации проводили в рамках федеральной целевой программы фундаментальных и прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации. Государственный регистрационный номер НИР 01.200.118849.

1.1. Актуальность проблемы. Организация ядра является эволюционно консервативной и отражает структурно-функциональную организацию генома. На последней 15-й международной конференции по изучению хромосом (5- 10 сентября 2004 г., Лондон) были отмечены следующие основные области применения онтогенетических исследований: 1. Выявление линейной дифференцированности хромосом для более точного определения хромосомных перестроек; 2. Взаимосвязь аберраций хромосом и некоторых заболеваний; 3. Соединение методов молекулярной биологии и цитогенетики с применением FISH. 4. Развитие методов хромосомной инженерии, введение в геном генов и хромосом в сочетании с методами цитогенетики, которые находят применение в области генотерапии, функциональной геномики (Griffin, Bridger, 2004).

Одной из основных функций хромосом является репродукция, которая осуществляется по длине хромосомы и находится в тесной связи с конденсацией и генетической активностью. В метафазной хромосоме эти зоны репликации разграничены во времени и пространстве. Стабильность репликационной структуры и ее специфичность для каждой хромосомы указывает на высокую упорядоченность укладки хромосомной нити в метафазной хромосоме, строго воспроизводящуюся в ряду клеточных поколений (Захаров и др., 1982).

Последние два десятилетия характеризуются значительными успехами в области направленной генетической трансформации клеток и животных. Ценность таких опытов заключается в возможности получения трансгенных животных с измененным генотипом и фенотипом, а также передачи трансформированных признаков потомкам. К настоящему времени получены трансгенные животные с повышенными темпами роста, измененным количеством и качеством молока, шерсти, увеличенной плодовитостью. Создаются животные, которые могут быть источниками органов для ксенотрансплантации, производства ценных биологически активных препаратов, таких как гемоглобин, фактор свертываемости крови, альфа-антитрипсин, интерферон и др. (Андреева, Тарантул, 2003; Зиновьева, Эрнст, 2004; Cozzi et al., 2000). Трансгенные организмы оказались ценной, перспективной моделью для изучения различных аспектов теоретической и прикладной биологии.

В многочисленных публикациях по трансгенозу не уделяется достаточного внимания видовым особенностям раннего эмбриогенеза, последствиям микроинъекции генов в зиготы с изучением дестабилизации реципиентного генома. Актуальность проблемы генетической трансформации

животных, а также недостаточная изученность структурно-функциональной организации генома сельскохозяйственных животных и влияния различных факторов на эффективность трансгеноза определили цели и задачи данного исследования.

1.2. Цель работы и задачи исследования. Целью исследования являлось изучение структурно-функциональной организации хромосом у интактных животных, а также у эмбрионов и животных после введения генов соматотропной оси в зиготы разных видов сельскохозяйственных животных.

В этой связи в настоящей работе были поставлены следующие задачи:

- провести морфометрический анализ и определить уровень спонтанных аберраций хромосом в эмбрионах кур в норме и при использовании криоконсервированного семени;

охарактеризовать структурную дифференцированность хромосом кур;

- выявить характер включения 3Н-тимидина в макрохромосомы и микрохромосомы кур с учетом внутри- и межхромосомной асинхронности репликации ДНК;

- показать взаимосвязь линейной структуры хромосом с внутрихромосомной асинхронностью репликации ДНК на примере 1-й аутосомы кур;

- охарактеризовать репликационную активность генома кролика и ее взаимосвязь с процессом конденсации методом RBA-маркирования;

- изучить первый раунд репликации ДНК в пронуклеусах кролика;

- получить трансгенных кроликов и свиней с введенными генами соматотропной оси с учетом анализа интеграции генов, фенотипических показателей, характера наследования трансгенов;

- изучить уровень дестабилизации генома кроликов и свиней, полученных из эмбрионов, в которые микроинъецировали ген рилизинг фактора гормона роста (hGRF);

- исследовать экспрессию репортерных генов у предимплантационных зародышей сельскохозяйственных животных.

13. Научная новизна. Впервые детально выявлены скорость и порядок репликации ДНК хромосом кур в течение всего S - периода с регистрацией характера включения 3Н-тимидина через каждый час, что позволило определить относительное содержание ДНК в макрохромосомах (73.7%) и микрохромосомах (26.3%). Репродукция макро- и микрохромосом идет на протяжении всего S-периода, но с преимущественным синтезом ДНК микрохромосом в первой его половине, за исключением W-хромосомы, которая репродуцируется в конце S-фазы. Синтез ДНК в ZZ-хромосомах проходит синхронно в течение всего S-периода. На основе нормализации денситометрических профилей впервые проведено картирование G-полос первой пары аутосом кур с количественной характеристикой длины, локализации и интенсивности окрашивания этих полос. При сопоставлении G-полос с локализацией зерен серебра по длине 1-й хромосомы в начале S-фазы метка преимущественно локализуется в светлоокрашенных зонах, в конце периода синтеза ДНК характер распределения зерен серебра по длине аутосомы

полностью совпадает с локализацией темных G-полос. На примере сравнительного анализа RBA-окрашенных хромосом показана взаимосвязь процессов репликации и конденсации хромосом кролика, находящихся на разных уровнях конденсации.

Получены трансгенные кролики и свиньи с интеграцией векторных последовательностей и полноценных копий гена рилизинг фактора гормона роста человека (hGRF) и гормона роста быка (bGH), под контролем промотора металлотионеина мыши (МТ-1). Выявлено два ярко выраженных фенотипических эффекта: увеличение и уменьшение массы тела по сравнению со своими сверстниками. Трансгенные потомки первого поколения наследовали способность к замедленному или ускоренному росту. У трансгенных кроликов и свиней наблюдали снижение либидо у самцов, повышенную эмбриональную и постнатальную смертность.

Впервые количественно определена степень дестабилизации генома при воздействии чужеродных генов (частота микроядер и множественные ассоциации хромосом) у животных, полученных из зигот с введенными экзогенными генами.

1.4. Теоретическая и практическая ценность работы. Теоретическая значимость представленной работы заключается в получении достаточно полной картины репродукции хромосом кур в течение всего S-периода. Скорость синтеза ДНК макрохромосом и микрохромосом кур в S-фазе изменяется в узких пределах с перепадом около 12%. Интенсивность репликационных процессов значительно (на три четверти) снижается в конце S-фазы. Показана низкая индивидуальная изменчивость скорости синтеза ДНК в макрохромосомах. Подтверждена связь внутрихромосомной асинхронности репликации ДНК со структурной (блочной) дифференцированностью и процессом конденсации хромосом. На одноклеточной эмбриональной стадии вскрыта взаимозависимость асинхронного синтеза ДНК в пронуклеусах и морфологических изменений в процессе их роста, выявлены два типа хроматина, отличающихся по времени репликации ДНК.

При введении генов соматотропной оси в зиготы и ранние эмбрионы кроликов и свиней получена устойчивая интеграция экзогенного материала в геноме реципиентов с появлением новых фенотипических признаков, наследуемых в ряду поколений. Трансгенные кролики передавали ген рилизинг фактора гормона роста потомству первого поколения с частотой 50%.

Практическая значимость диссертационной работы состоит в совершенствовании приемов приготовления препаратов хромосом из тканей ранних эмбрионов кур и количественной оценки результатов дифференциального окрашивания, которые необходимы для проведения цитогенетического контроля племенных животных, линий и пород, ветеринарной цитогенетики и картировании хромосом.

Приемы использования репортерных генов для отбора трансгенных эмбрионов и введение MAR-последовательностей значительно повышают эффективность получения трансгенных животных.

Применение методов определения частоты микроядер и ассоциаций хромосом позволяет судить о степени дестабилизации генома животных с перенесенными генами.

1.5. Апробация работы. Материалы исследований были представлены и обсуждены на 45 российских и международных научных конференциях и симпозиумах, в том числе основных: на IV и VII всесоюзных симпозиумах по структуре и функции ядра (Алма-Ата, 1977; Харьков, 1980); Ш и IV всесоюзных обществе генетиков и селекционеров (ВОГИС) им. Н.И. Вавилова (Ленинград, 1977; Кишинев, 1981); XXXIII и ХХХХХШ Европейских

ссоциациях животноводства (Ленинград, 1982, Египет, Каир, 2002); III и IV национальных конференциях Болгарии по цитогенетике (Пловдив, 1984; Враца,

1989); I всесоюзной конференции по цитогенетике сельскохозяйственных животных (Москва, 1985); VI и VIII интернациональных симпозиумах по актуальным проблемам генетики птиц (Чехословакия, Смоленицы, 1985, 1989); V франко-чехословацком заседании по теме « от ооцита к эмбриону» (Прага,

1990); XV и XVI симпозиумах генетических дней Чехословакии (Чешские Будеевици, 1991, 1992); XVI симпозиуме по генетике сельскохозяйственных животных Словакии (Нитра, 1993); международной конференции общества генетиков им. Г. Менделя, посвященной 40-ю двойной спирали ДНК (Чешская республика, Брно, 1993); X интернациональном симпозиуме по актуальным проблемам генетики птиц (Словакия, Нитра, 1993); I, II и III всероссийских обществе генетиков и селекционеров (ВОГИС) им. Н.И. Вавилова (Саратов, 1994; С-Петербург, 2000; Москва, 2004); международном симпозиуме «Молекулярная генетика и биотехнология в оценке изменения геномов сельскохозяйственных животных» (С.-Петербург, 1994); XIII симпозиуме Польского общества генетиков (Варшава); XXV заседании FEBS (Копенгаген, 1998); первом Польском конгрессе по биотехнологии (Вроцлав, 1999); международном совещании «Молекулярные фермы» (Франция, Ля Гранд Мотте, 2000); I международном конгрессе по биотехнологии (Москва, 2002); международном симпозиуме «Дни польской науки в России » (С.-Петербург, 2002); международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, 2004); международной конференции «Сохранение генетических ресурсов» (С.-Петербург, 2004).

1.6. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 114 научных работ, среди которых основных - 70, в том числе три методических рекомендации. Работы опубликованы в материалах международных конференций и журналах: «Генетика», «Зоотехния», «Цитология», «Цитология и генетика», «Сельскохозяйственная биология», «J. Animal Feed Sci.», «Animal Science Papers and Reports», «Folia Biologia», «J. of Reproduction and Fertility», «Сб. науч. трудов «Генноинженерные сельскохозяйственные животные » (Министерство науки и технической политики Российской Федерации РАСХН).

1.7. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их

обсуждения, заключения, выводов, практических предложений и списка цитированной литературы из 378 источников, среди которых 298 на иностранных языках. Диссертация изложена на 321 страницах, содержит 36 таблиц, 57 рисунков.

1.8. Основные положения, выносимые на защиту.

• Морфологический и морфометрический анализ хромосом сельскохозяйственных животных с получением и анализом денситометрических профилей G-полос метафазных пластинок с различной степенью конденсации;

• Идентифицикация сходных по морфологии хромосом кроликов методом RBA-маркирования с представлением взаимоотношения процессов репликации и конденсации;

• Взаимосвязь процесса репликации ДНК на протяжении S-периода со структурной организацией хромосомы;

• Введение и интеграция генов соматотропной оси в геном сельскохозяйственных животных, фенотипические показатели трансгенных животных и характер их наследования;

• Особенности уровня стабильности генома кроликов и свиней, полученных из зигот с введенными генами рилизинг фактора гормона роста человека;

• Выявление паттерна экспрессии чужеродных генов и активации эмбрионального генома с использованием репортерных генов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Эксперименты проводили на базе лаборатории молекулярной цитогенетики, а также на основании договоров, составленных между ВНИИГРЖ и следующими институтами: Киргизским институтом животноводства (г. Бишкек); Институтом генетики и разведения животных Польской академии наук (Ястжембец); Международной лаборатории по биотехнологии на базе института животноводства в Словакии (г. Нитра).

Исследования выполняли на цыплятах и эмбрионах породы белый плимутрок, свободно скрещивающейся популяции из экспериментального хозяйства ВНИИГРЖ; на кроликах возраста от 0,5 до 1 года пород шиншилла, калифорнийская, новозеландская; на свиноматках (крупная белая и словацкая белая мясная) в возрасте старше 8 месяцев и живой массой не менее 80 кг.

Препараты митотических хромосом получали из эмбриональных фибробластов, клеток костного мозга (Трофимова, 1976), и клеток периферической крови (модифицированный метод Moorhead et в1., 1960).

При использовании метода авторадиографии 3Н-тимидин (удельная активность 19,8 К/мМоль) вводили суточным цыплятам интраперитониально из расчета 1мккюри на грамм веса, часть препаратов окрашивали по Гимза, проводили анализ, затем краску удаляли в 70% -м растворе спирта и наносили эмульсию типа "М" (НИИХИМФОТО).

Для получения G-полос на хромосомах кур и свиней был использован модифицированный метод Соколовой О.И. и Погосьянц Е.Е. (1974).

RBA- окраску (R-репликационный бэндинг, В-5-бромдезоксиуридин, А-окраска акридиновым оранжевым) хромосом кролика получали по методу Dutrillaux, Lejeune, (1973).

Оптическую плотность негативных изображений хромосом измеряли с помощью денситометрического комплекса для исследования криволинейных биоструктур, сконструированного и изготовленного Центральным конструкторским бюро АМН СССР (Инин и др., 1976). Приведение денситометрических профилей хромосом с различной степенью конденсации к одному масштабу и выведение нормализованных денситограмм на печать проводили по алгоритмам и программам, разработанным в нашей лаборатории (Яковлев, Березкин, 1978). Статистическую обработку проводили по Стьюденту и Фишеру (Лакин, 1980).

Раскладку кариотипа кролика проводили в соответствии с международными стандартами (Committee for the Standardized Karyotype of the Rabbit (Oryctolagus cuniculus, 1981). Идентифицировали хромосомы свиней согласно рекомендациям Комитета по стандартизации кариотипа домашних свиней (Committee for the Standardized Karyotype ofthe Domestic Pig, 1988).

Трансгенных кроликов и свиней получали методом микроинъекции генов соматотропной оси преимущественно в мужской пронуклеус зигот (Gordon, 1983). Для микроинъекции использовали следующие генетические конструкции: 1. Ген рилизинг фактора гормона роста человека (hGRF), находящийся под контролем промотора гена металлотионеина мыши (МТ-1). Генноинженерная конструкция МТ-1/hGRF была сконструирована Dr. Mayo ( Mayo at al., 1983) и предоставлена проф. А.Ф. Смирновым (ВНИИРГЖ, С.Петербург); 2. Линеаризованные плазмиды pLG3 и pMMTV-bGH, содержащие гены гормона роста быка с собственным промотором и под контролем LTR MMTV промоторов (предоставлены Л.В. Генингом, ИМГ РАН, Москва); 3. Рекомбинантная векторная конструкция MT-1/bGH, в состав которой входил клонированный хромосомный ген соматотропина быка, включающий часть 5' транскрибирующей области и 3'- нетранслируемой области с сайтом терминации, а также ген металлотионеина мыши с промотором и энхансером (получена в Словакии).

С целью изучения экспрессии генов в раннем эмбриогенезе были использованы репортерные гены. Генная конструкция pCMV-LacZ, в которой последовательности гена LacZ кодировали белок В-галактозидазу, под контролем промотора цитомегаловируса (предоставлена Л.Е.Андреевой, ИМГ РАН, Москва). Следующая генетическая конструкция была приобретена в фирме Pharmacia Biotech в виде плазмиды рСН110, в которой ген LacZ находился под контролем промотора SV-40. Профессор М. Okabe (Университет г. Осака, Япония) любезно предоставил генетическую конструкцию pCX-eGFP, в которой кроме последовательностей гена GFP, кодирующего флуоресцентный зеленый белок, находится В-актиновый

промотор цыпленка, энхансер цитомегаловируса и поли-А сигнал В-глобина кролика. Достоинством этой конструкции является прижизненная детекция экспрессии зеленого флуоресцентного белка при УФ облучении с определенной длиной волны.

Гормональную обработку доноров и реципиентов, извлечение и анализ эмбрионов проводили по отработанной методике (Козикова и др. 1990). Рекомбинантную ДНК микроинъекцировали в концентрации 1-5 нг/мкл. Хирургическим путем проводили трансплантацию зигот синхронизированным реципиентам. Через месяц после рождения были взяты образцы тканей ушей и крови для выделения геномной ДНК. Скрининг трансгенных животных и их потомства проводили методами дот- гибридизации и блоттинга по Саузерну (Маниатис и др., 1984). Уровень изменчивости генетического аппарата оценивали с использованием цитогенетического анализа и применения микроядерного теста (МТ).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Морфометрический анализ и структурная дифференцированность хромосом кур.

Интерес к изучению структурно-функциональной организации хромосом птиц вызван наличием хорошо идентифицируемых макрохромосом, облегчающих цитогенетический анализ, и микрохромосом. В отличие от млекопитающих у птиц гомогаметным полом являются самцы с половыми хромосомами, а самки имеют половые хромосомы. По своим размерам хромосомы представляют собой постепенно убывающий ряд. Морфометрический анализ проводили на двух типах клеток: эмбриональных фибробластах и клетках костного мозга. В обоих типах тканей нами был достоверно показан гетероморфизм гомологов первых двух пар, что доказывает асинхронность процесса конденсации даже у гомологичных хромосом, причем, чем длиннее хромосомы, тем более выражен гетероморфизм.

Уровень спонтанных аберраций у эукариотов находится в большой зависимости от возраста, породы и экологических условий, в которых они находятся. Представляет интерес исследование частоты и спектра хромосомных аномалий на ранних стадиях инкубации эмбрионов, полученных путем искусственного осеменения свежим семенем, свежезамороженным и семенем, подверженным криоконсервации в течение длительного времени. Цитогенетический анализ, проведеный на 44 эмбрионах кур, от которых было исследовано 477 метафазных пластинок, свидетельствует о том, что у эмбрионов, полученных путем искусственного осеменения кур породы белый плимутрок, фон спонтанной изменчивости хромосом составляет 5.88%. Доминирующим типом нарушений хромосом в норме являются структурные аберрации (3.57%). Общая частота хромосомных нарушений среди эмбрионов, полученных с использованием замороженного семени, увеличилась на два процента. Этот показатель не может существенно влиять на результаты

оплодотворяемости и выводимости цыплят. Следующая серия опытов была посвящена изучению хромосомных нарушений у эмбрионов, полученных путем оплодотворения семенем, которое хранилось в замороженном состоянии в течение 4-х месяцев. Характерной особенностью хромосомных нарушений среди этих эмбрионов было увеличение более чем в два раза частоты эуплоидии, в основном, за счет триплоидии. В этой серии опытов был выявлен триплоидный эмбрион, все клетки которого содержали тройной набор хромосом и три половые Z-хромосомы. Общее количество хромосомных аберраций возросло на 1% по сравнению с предыдущим экспериментом.

Данные результаты исследования показывают, что цитогенетический контроль в разработке технологии криоконсервирования половых клеток является чувствительным инструментом и необходимым этапом проверки безвредности предлагаемых технологий.

Главной особенностью хромосомной организации является ее структурная дифференцированность по всей длине. Для G-окраски мы использовали хромосомы средней степени конденсации. При помощи микроденситометрии метафазных макрохромосом с последующей нормализацией денситометрических профилей, рассчитаны статистические параметры локализации, длины, относительной и удельной плотности G -полос 1-й пары макрохромосом цыплят. Длину полос и их отдаленность от центромеры измеряли в сотых долях плеча, удельную плотность находили через отношение относительной плотности к ее относительной длине. В каждом гомологе первой пары обнаружено 7 G - полос: 3 - в коротком плече (р) и 4 - в длинном Первая от центромеры полоса короткого плеча является средней по величине и имеет слабую окраску. Две другие полосы короткого плеча располагаются в непосредственной близости друг от друга. Одна из них (Ср) имеет интенсивную окраку. Различия по длине и удельной относительной плотности между полосами короткого плеча достоверны (Р<0.001). В длинном плече можно выделить две короткие (Bq и Dq) и две длинные (Aq и Cq) полосы. Полоса Cq выделяется интенсивной окраской. Приведенные материалы свидетельствуют о том, что применяемый метод анализа денситометрических данных позволяет производить количественную оценку локализации, длины и интенсивности окраски G - полос.

Таким образом, изучение линейно-дифференцированных макрохромосом кур позволяет точно локализовать G-полосы, что важно для идентификации хромосом, а в случае патологии помогает выявлению аберраций хромосом. Исследование линейно-дифференцированных хромосом может служить одним из подходов для выяснения взаимосвязи между структурой хромосом и одной из их главных функций - синтезом ДНК.

3.2. Репликация ДНК в хромосомах кур

Полученные нами данные показали, что 3Н- тимидин в самом начале S-периода активно включается как в макро-, так и в микрохромосомы клеток эмбриональных фибробластов и костного мозга, что указывает на

полирепликонный и одновременный характер вступления в синтез ДНК всех хромосом набора.

Анализ репликации ДНК был проведен в двух типах тканей: в клетках эмбриональных фибробластов и в клетках костного мозга. Включение 3Н-тимидина в хромосомы первичной культуры эмбриональных фибробластов было изучено на протяжении всего S-периода через каждый час. На клетках костного мозга были проведены исследования по выявлению индивидуальных различий по включению 3Н-тимидина в хромосомы.

В течение всего S-периода не менее 67% включившегося в ядро 3Н-тимидина обнаруживается в макрохромосомах (табл.1). В первый час S-периода над макрохромосомами находили 71% зерен серебра от общего их числа над метафазной пластинкой. Число меченых микрохромосом снижается в течение S-фазы от 27 до 6-7. Этот факт свидетельствует о том, что около 2/3 микрохромосом репродуцируются в первой половине S-периода. По числу меченых микрохромосом между отдельными сроками в течение S-фазы установлены достоверные различия. Учет количества зерен серебра над метафазными пластинками показал, что интенсивность репликационных процессов уменьшается (на 1/3 от среднего уровня) к концу S-фазы.

Таблица 1.

Включение 3Н-тимидина в макро- и микрохромосомы эмбриональных фибробластов (г-коэффициент корреляции числа зерен серебра над макрохромосомами к числу зерен серебра над микрохромосомами:*Р< 0.05,

**Р<0.01;п=20)

Час Зерен Метка над Метка над Число г

S- серебра над макрохро- микрохро- меченых

пери метафазой мосомами мосомами микро-

-ода (%) (%) хромосом

I_ 211.9+19.07 71.0+6.65 29.0+2.79 27.3+2.10 0.79**

2 183.2+11.14 67.1+2.71 32.9+2.02 27.2+2.02 0.60**

3 240.8+18.81 68.4+5.81 31.6+4.46 24.6+1.96 0.29*

4 216.4+23.63 73.7+8.16 26.3+3.72 21.4+2.61 0.36*

5 154.9+15.21 75.8+7.17 24.2+2.82 15,3+144 0.91**

6 118.9+15.40 77.3+6.37 22.7+3.75 12.1+1.50 0.94**

7 55.9+9.38 79.2+11.91 20.8+5.74 6.2+1.46 0.77**

8 62.09+9.40 76.8+11.51 23.2+4.53 7.1+1.30 0.73**

Микрохромосомы более обогащены ГЦ-последовательностями и являются R-положительными (Ponce de Leon et al., 1992; Schmid et al., 2000). Кроме этого, микрохромосомы отличаются меньшей степенью метилирования ГЦ-пар оснований и более высоким уровнем ацетилирования гистонов в сравнении с макрохромосомами (McQueen et al., 1998). Эти структурно-функциональные характеристики микрохромосом косвенно указывают на

наличие у них функционального хроматина, что позднее было подтверждено локализацией большого количества генов в микрохромосомах (Сазанов, 2004).

Таким образом, принимая относительное количество 3Н-тимидина за весь S-период в качестве показателя относительного содержания ДНК можно заключить, что в макрохромосомах содержится 73.7%+4.75% ДНК генома, а в микрохромосомах 26.3%+1.91%.

3.2.1.Межхромосомная асинхронность синтеза ДНК

Для изучения характера межхромосомной асинхронности синтеза ДНК в течение S-периода подсчитывали количество восстановленного серебра над каждой макрохромосомой. Гетероморфизм гомологов первых двух пар аутосом давал возможность определить количество метки отдельно над каждым гомологом. Затем находили процентное содержание метки над каждым гомологом или над парой гомологов от суммы зерен серебра над всеми 6 парами макрохромосом. Для определения скорости синтеза ДНК на единицу длины хромосомы находили отношение процентного содержания метки над гомологом, или парой гомологов к их относительной длине, что выражали в процентах. Этот показатель в данной работе именуется относительной скоростью синтеза ДНК. В ряде работ показано, что в разных типах клеток одни и те же области генома могут реплицироваться в различные моменты S-периода в зависимости от того, какие группы тканеспецифичных генов активно 'ji-ji и данном типе клеток (Simon et al., 2001). В начале S-периода синтез ДНК протекает во всех макрохромосомах и в большей части микрохромосом клетки. Середина S-фазы характеризуется активной репродукцией макро- и микрохромосом, хотя в нескольких микрохромосомах репликация ДНК уже завершена. Завершение синтеза ДНК в конце S-периода происходит со снижением интенсивности репликативных процессов и с незначительно выраженной межхромосомной асинхронностью. В большинстве микрохромосомах процесс репликации ДНК уже завершен за исключением W-хромосомы, в которой выявлено много метки.

В таблице 2 дано распределение коэффициентов относительной скорости синтеза ДНК, рассчитанные с учетом относительной длины хромосом цыплят. Результаты показывают, что асинхронность синтеза ДНК аутосом и половых хромосом выражена в небольшой степени. Статистически достоверные различия в скорости репликации ДНК выявлены у гомологов первой пары к седьмому часу S-периода. Следует отметить, что чем меньше аутосомы по размеру, тем выше у них тенденция к выражению асинхронности синтеза ДНК. Репродукция аутосом в основных чертах напоминает динамику синтеза ДНК обеих ZZ-хромосом петушков. Синтез ДНК W-хромосомы в первой половине S-периода протекал, примерно, на 2/3 ниже теоретически ожидаемого уровня, по сравнению с макрохромосомами. Однако в конце S-фазы интенсивность синтеза ДНК в два раза превышала этот же теоретически ожидаемый уровень.

Таблица 2.

Распределение коэффициентов относительной интенсивности синтеза ДНК в клетках

эмбриональных фибробластов кур (%).

№ хромосомы Часы Б • периода

1 2 3 4 5 6 7 8

1а 107.8+3.86 96.2+5.01 90.4+4.13 107.6+6.96 109.4+8.54 110.1+7.53 107.6+11.7 110.1+8.65

16 106.9+4.17 93.7+3.31 102.8+625 96.5+5.51 100.0+5.35 120.1+8.89 73.6± 11.28 99.6+6.27

1 106.9+3.08 94.9+3.26 96.6+4.94 102.0+4.38 104.7+4.76 115.1+5.71 90.8± 9.08 104.8+6.48

2а 94.1+8.15 101.6+6.47 95.8+5.37 110.0+14.2 103.4+6.14 96.6+8.57 100.0+8 68 80.2± 11.28

26 120.9+7.03 114.2+8.23 118.7+6.92 114.2±9.11 104.4+7.47 120.9+5.72 110.4+16.1 83.5+14.5

2 107.5+4.89 107.9+6.91 107.2+3.62 112.+6.44 103.9+4.34 108.7+6.71 105.2+9.97 81.8+6.08

3 102.8+5.14 96.0+3.76 99.0+3.88 ' 101.6+5.77 99.6+5.95 96.5+6.96 98.1+11.82 94.6+6.14

4 101.5+5.07 103.0+6.04 103.7+6.72 88.8+5.97 103.0+5.37 85.1+8.96 88.8+15.88 101.9+14.3

г 98.4+5.57 114.6+12.6 103.2+6.72 114.6+12.2 101.6+6.72 98.4+10.34 144.2+38.8 103.2+19.8

г - 108.9+16.2 112.5+6.78 119.6+22.8 103.6+28.2 108.9+16.9 116.1+33.7 92.8+21.1

6 105.2+5.58 102.6+7.28 98.6+7.53 87.0+20.81 83.1+9.09 71.4+9.12 109.5+17.7 142.2+22.8

У/ 23.5+9.79 31.0+12.1 34.1+9.85 47.0+15.67 94.1+32.10 58.6+17.21 196.0+44.3 196.0+44.6

п 20 25 25 25 30 25 25 25

п-число наблюдений

Следовательно, синтез ДНК аутосом и /-хромосом не имеет принципиальных различий у кур по полу. '-хромосома имеет свою программу скорости синтеза ДНК в течение 8-периода, которая значительно отличается от подобных программ других хромосом.

3.2.2. Внутрихромосомная асинхронность синтеза ДНК

Для изучения распределения зерен серебра по длине хромосом мы использовали микроденситометрию негативных изображений хромосом.

Как в конце, так и в начале 8-периода, имеет место явно выраженная внутрихромосомная асинхронность синтеза ДНК. Получение радиоавтографов метафазных пластинок после включения 3Н -тимидина в конце 8-периода позволяет идентифицировать ' -хромосому среди микрохромосом и идентифицировать равные плечи /-хромосомы по характеру распределения метки.

3.2.3. Взаимосвязь линейной структуры хромосом с внутрихро'мосомной асинхронностью репликации ДНК на примере первой

аутосомы кур

Проведение сравнительного анализа распределения метки и О-полос на примере первой пары аутосом кур показывает, что в начале 8- периода синтез ДНК проходит, в основном, О-негативных участках, т.е. между О-полос. В конце 8-периода локализация метки полностью совпадает с О-полосами, что свидетельствует о преимущественной репликации ДНК гетерохроматических участков. В многочисленных работах выявлена положительная корреляция между линейной дифференциацией хромосом и характером синтеза ДНК. Свойства О-полос также отражают раннюю и позднюю репликацию хромосомных районов и выявляют иерархию генов или группу генов, способных к транскрипции (С1аш8еп й а1., 2002).

33. Характеристика репликационной активности генома кролика методом КБЛ-маркирования

С целью идентификации хромосом кролика была проведена дифференциальная окраска методом ЯБА. В кариотипе кролика при разделении хромосом по центромерному индексу (ЦИ) и размерам можно выделить 4-е группы аутосом и половые хромосомы - X и У. Первая группа включает метацентрические хромосомы (№ 1-6 и ЦИ 0.42-0.49). Вторая группа (№7-11) представлена субметацентрическими хромосомами с более медианным положением центромеры (ЦИ 0.33-0.38), по сравнению с третьей группой (№ 12-17) субметацентриков с более акроцентрическим положением центромеры (ЦИ 0.20-0.29). Четвертая группа (№18-21) состоит из акроцентриков. Половые хромосомы - гетероморфная пара у самцов (ЦИ X-0.44; ЦИ У-0.30).

Этот метод выявляет структурно-функциональные характеристики хромосом, такие как асинхронность (блочность) репликации по длине хромосомы, которая определялась по времени включения 5-бромдезоксиуридина в 8-фазе. Следует отметить, что районы ранней и поздней

репликации во всех хромосомах чередуются, занимая различные по размерам участки, что является отражением внутрихромосомной асинхронности репликации ДНК. Почти все теломерные районы реплицируются в первой половине, центромерные - во второй половине S-периода. Интенсивность репликационных процессов в разных хромосомах различна, что указывает на межхромосомную асинхронность репликации. Только У- хромосома почти полностью реплицируется в первой половине - начале второй половины S-фазы. Наиболее ярким примером гомологичной асинхронности синтеза ДНК являются половые хромосомы самок. Одна из хромосом реплицируются в первой половине, вторая - во второй половине S-периода.

На примере 1-й хромосомы была прослежена взаимосвязь процессов репликации и конденсации. При высокой степени конденсации по сравнению с низкой происходит слияние субблоков в блоки. Такие переходы происходят, в основном, за счет негативных сегментов, при слиянии которых, образуется один негативный блок, или они нивелируются в позитивных блоках. Известно, что районы хромосом после репликации подвергаются конденсации. Отношение суммы длин позитивных сегментов высоко конденсированной первой хромосомы к ее длине составляет 0.74, негативных — 0.26. То же отношение позитивных и негативных сегментов низко конденсированного варианта равно соответственно 0.67 и 0.33. Эти наблюдения позволяют заключить, что сжатие метафазных хромосом идет, в основном, идет за счет негативных, поздно реплицирующихся сегментов. Таким образом, наряду с асинхронностыо репликации имеет место и явление внутрихромосомной асинхронности конденсации. Различие темпов конденсации между не гомологичными хромосомами можно проиллюстрировать на примере первой группы хромосом, сравнивая высокую и низкую степень конденсации (табл.3).

Таблица 3.

Показатели темпов конденсации в первой группе метацентрических хромосом

кролика разных уровней конденсации

Номер Абсолютная длина Абсолютная длина Отношение длин

хромосомы конденсированных слабоконденсирован- разноконденсиро-

хромосом (мкм) ных хромосом (мкм) ванных хромосом

1 5.0+ 0.3 10.0+0.6 0.50

2 4.8+ 0.3 8.6+ 0.5 0.56

3 - 3.8+ 0.5 6.7± 0.6 0.57

4 3.0+ 0.1 5.2+ 0.3 0.58

5 2.0+0.1 3.3± 0.1 0.61

6 1.8+ 0.1 2.9+ 0.1 0.62

При длине маркерной хромосомы 5 мкм число блоков в наших исследованиях составляло 205 (95 R-негативных, 110 R-позитивных); при длине хромосомы №1 около 6.5 мкм число блоков 308 (145 R-негативных, 163 R-позитивных), при длине хромосомы №1 около 10 мкм число блоков 387 (184 R-негативных, 203 R-позитивных).

Следовательно, что при сокращении степени конденсации в два раза число выявляемых сегментов уменьшается примерно на ту же величину.

3.4. Первый раунд репликации ДНК в пронуклеусах кроликов

При оплодотворении важным событием является внедрение хроматина сперматозоида, в результате чего происходит ремоделирование и реорганизация гаплоидного отцовского генома в пронуклеус, что в свою очередь ведет к активации завершения мейоза с образованием женского пронуклеуса. В женском и мужском пронуклеусах начинается значимое событие для эмбриона - первый раунд синтеза ДНК ^-фаза), который длится до короткого периода G2. Особенностью первой фазы репликации ДНК является то, что он контролируется в основном материнскими факторами, хранившимися в ооците на протяжении всего оогенеза. Для изучения репликации ДНК в одноклеточных эмбрионах был использован метод авторадиографии с применением тимидина, меченого тритием, приготовлены ультатонкие срезы и получены радиоавтографы, окрашенные раствором метиленового голубого. Через 14-21 час после спаривания зиготы были получены из яйцеводов кроликов. В начале периода синтеза ДНК (14-16 часов после спаривания) распределение гранул восстановленного серебра в слое эмульсии над мужскими пронуклеусами были более интенсивнымы, чем над женскими, что указывает на асинхронность репликации ДНК. В середине периода синтеза ДНК в двух пронуклеусах репликация ДНК проходила достаточно интенсивно. Завершение репликации ДНК (19-21 час после спаривания) в пронуклеусах проявляется в распределении кластеров репликации по периферии ядра в конденсированных участках хроматина и в проядрышках. В конце S-фазы значительно снижается интенсивность включения радиоактивной метки в обоих пронуклеусах.

Следует отметить, что ДНК-репликативные процессы функционально связаны с морфологическими изменениями в пронуклеусах кролика. В первой половине S-фазы мужской пронуклеус по своему объему уступает женскому, но обладает более сильно выраженной репликативной активностью. В середине S-фазы, когда оба пронуклеуса одинаковы по своим размерам, синтез ДНК протекает с одинаково сильной интенсивностью. Во второй половине S-периода происходит сближение пронуклеусов, при этом мужской пронуклеус становится больше женского, но интенсивность репликации ДНК затухает, по сравнению с женским.

Полученные нами данные указывают на то, что уже на одноклеточной стадии развития выявлены два типа хроматина, которые отличаются по времени репликации ДНК (конденсированный хроматин и проядрышки реплицируются в конце S—фазы, а светлоокрашенный хроматин - в начале и середине S-периода). Именно первый раунд синтеза ДНК, является необходимым для последующей генной экспрессии и протекания следующих клеточных циклов.

3.5. Перенос генов соматотропной оси в зиготы кроликов, получение и анализ трансгенных животных

Трансформация генома стала возможной благодаря достижениям генной инженерии, а также использованию новых методов переноса генетической информации как в соматические клетки, так и в ранние эмбрионы млекопитающих. Успехи экспериментальной эмбриологии в выделении яйцеклеток животных, культивировании, тансплантации и манипуляции с эмбриональными клетками, позволили разработать схемы, используемые в опытах по генетической трансформации.

3.5.1. Получение ранних эмбрионов на стадии зиготы с оценкой их качества, влияние процессов микроинъекции и трансплантации на жизнеспособность зародышей до момента рождения.

Исследования проводили на кроликах, которым методом микроинъекции вводили гены соматотропной оси в пронуклеусы зигот или ядра 2-бластомерных зародышей. Всего было проведено семь серий экспериментов. В первых двух сериях особое внимание было уделено отработке и усовершенствованию приемов получения ранних эмбрионов с учетом их количества и морфологических особенностей. Были выбракованы следующие эмбрионы: с признаками дегенерации (фрагментация цитоплазмы, увеличение перивителлинового пространства, нарушение целостности ядерной и блестящей оболочки), с видимыми геномными нарушениями, а также неошюдотворенные яйцеклетки. Из общего количества полученных эмбрионов количество неполноценных эмбрионов в разных сериях экспериментов изменялось от 1.6% до 8.6% (табл. 4).

После микроинъекции генов в ядра ранних эмбрионов в первой серии экспериментов только 20% эмбрионов прижились после пересадки их реципиентам и сохранили способность развиваться до рождения потомства. 9 реципиентов из 30 оказались сукрольными. Однако лишь у 6 реципиентов беременность завершилась рождением потомства. Всего было получено 54 крольчонка. У остальных 3 реципиентов беременность, диагностируемая визуально и пальпацией, не привела к рождению потомства. Причиной тому была, очевидно, пренатальная гибель плодов с последующим абортированием, либо мацерацией и рассасыванием. Возможно, одной из причин гибели зародышей на разных стадиях пренатального периода является нарушение генетической программы развития, вызванной как процессом микроинъекции, так и мутагенным воздействием экзогенной ДНК.

В контрольной группе при трансплантации не микроинъецированных эмбрионов 17 ложнобеременным самкам беременными стали 14 (82.4%), родившие через 28-30 суток 86 крольчат (56.2% к числу трансплантированных эмбрионов). Результаты рождаемости потомства (соответственно 56.2% против 14.6%), свидетельствовали в пользу того, что процедура микроманипуляции снижает приживляемость эмбрионов после пересадки их реципиентам, и повышает пренатальную гибель зародышей.

Таблица 4.

Количество полученных эмбрионов и оценка их качества_

Название GRF GRF GRF GRF Конт- bGH bGH

введенного роль

гена

№ экспери- 1 2 3 4 5 6 7

мента

Использова- 29 38 17 31 16 6 14

но доноров

Число 412 449 189 310 157 72 126

овуляций

Получено 391 397 184 307 156 69 124

всего (95,0%) (88.4%) (97.3 (99.0%) (99.4 (95.8 (98.4%)

эмбрионов %) %) %)

Получено 12.7 10.4 10.7 9.8 9.8 11.5 8.7

на одного

донора

Полноцен- 369 363 174 300 153 64 122

ных (93.8%) (91.4%) (94.3%) (97.8%) (98.1 (92.7 (98.4%)

эмбрионов %) %)

На стадии 361 358 171 296 150 60 120

зиготы

На стадии 8 5 3 4 3 4 2

2-х бласто-

меров

Неполно- 22 34 10 7 3 5 2

ценных (5.6%) (8.6%) (5.4%) (2.3%) (1.9%) (7.2%) (1.6%)

эмбрионов

Во второй серии экспериментов 356 эмбрионов, сохранивших целостность после микроинъекции гена hGRF, без предварительного культивирования in vitro были пересажены 28 реципиентам (по 12.7 эмбрионов на реципиента). 5 сукрольных самок принесли 32 крольчат (в т.ч. 22 живых), что составило 9% к числу трансплантированных эмбрионов.

Совместно с сотрудниками Института генетики и разведения животных Польской академии наук было проведено еще две серии экспериментов по получению и изучению трансгенных животных после микроинъекции генной конструкции MT-1/hGRF. Всего 474 зиготам были микроинъецированы генные конструкции, содержащие ген рилизинг фактора гормона роста человека, и трансплантированы гормонально синхронизированным реципиентам. Через 3031 день родилось 40 крольчат, из которых 19 живых и 21 мертворожденных. 15 кроликов достигло возраста 8-и и более недель.

В следующих двух сериях экспериментов ранним эмбрионам был введен ген гормона роста быка. Совместно с сотрудниками Института молекулярной

генетики РАН 14 реципиентам, полученными после естественного спаривания, без использования гормонов, было трансплантировано в яйцеводы 64 проинъецированных зигот со смесью плазмид, содержащих ген гормона роста быка. Окрол произошел у 6 самок с рождением 27 крольчат, развившихся из собственных и трансплантированных зигот.

На базе международной лаборатории биотехнологии животных (г. Нитра, Словакия) от 14 доноров было получено 124 ранних эмбриона, среди которых 122 полноценных эмбриона (120 зигот и два 2-бластомерных эмбриона). С помощью микроманипулятора в пронуклеусы зигот было введено 500-800 копий гена МТ-ЬвН. Семи псевдобеременным самкам было трансплантировано 122 ранних эмбрионов. В результате окрола появилось 25 крольчат, что составило 20.5% от числа пересаженных эмбрионов. Следует отметить, что в течение месяца после окрола погибло 6 крольчат.

3.5.2. Анализ интеграции геннных конструкций МТ-1/ЬОКР и МТ-1/ЬОИ в геном кроликов.

Во всех сериях экспериментов были взяты образцы крови или небольшие кусочки тканей ушей, из которых была выделена геномная ДНК. Наличие экзогенных последовательностей генов ИОЯР и ЬвИ в геноме кроликов определяли методом ДНК-ДНК гибридизации в изотопном варианте. Результаты проведения дот-блот-гибридизационных анализов в экспериментах представлены в таблице 5. Как видно из таблицы эффективность траксгеноза различная во всех сериях экспериментов и изменялась от 1.9 до 22.2% от числа трансгенных кроликов к числу новорожденных, от 0.3 до 4.7% от числа имплантированных. В отличие от мышей трансформация генома у сельскохозяйственных животных значительно менее эффективна. В среднем, эффективность генных пересадок овцам, козам, свиньям и крупному рогатому скоту составляет 0.58 (Яехгоаё, Ригее1, 1988).

Для скрининга геномной ДНК использовали рестриктазу НтШН, не имеющую сайтов расщепления внутри ЕсоЫ-НшёШ - фрагмента микроинъецированных генетических конструкций МТ-1/ЬвРР и МТ-1/ЬвИ. Сравнение интенсивности основного гибридизационного сигнала ДНК трансгенных кроликов в первых четырех сериях экспериментов с гибридизационным сигналом ДНК ЕсоЫ-НшёШ- фрагмента (положительный контроль), свидетельствовало о присутствии примерно от 2 до 15 копий гена ИОЯР в клетках трансгенных кроликов. В шестой серии экспериментов блот-гибридизационный анализ ДНК кроликов с зондами, содержащими ген ЬвИ, показал, что у одного кролика присутствует лишь часть гена гормона роста быка и последовательности плазмиды, а у двух остальных кроликов произошел перенос только части одной из рекомбинантных плазмид. В седьмой серии экспериментов низкая интенсивность гибридизационного сигнала геномной ДНК, рестрицированной эндонуклеазой НшёШ, свидетельствовала об интеграции менее одной копии гена ЬОИ на клетку в перестроенном виде.

Таблица 5.

Результаты дот- и блот-гибридизационного анализов геномной ДНК кроликов

№ эксперимента 1 2 3 4 6 7

Проанализировано проб 54 12 22 18 20 18

Положительный 4 6 2 4 3 2

ответ дот-гибри-

дизации

Положительный 1 4 2 4 3 2

ответ блот-

гибридизации

Кол-во транс- 1.9% 12.5% 9.1% 22.2% 11.1% 8%

генных живот- (1/54) (4/32) (2/22) (4/18) (3/27) (2/25)

ных к числу

новорожденных

Кол-во транс- 0.3% 1.1% 1.2% 1.3% 4.7% 1.6%

генных живот- (1/369) (4/356) (2/174). (4/30) (3/64) (2/122)

ных к числу

трансплантиро-

ванных

эмбрионов

Становится очевидным, что лимитирующим фактором получения трансгенных животных является случайный характер интеграции трансгена в геном.

3.53. Фенотипические показатели трансгенных кроликов и наследование

трансгенов hGRF и bGH.

Следует отметить, что видимые фенотипические изменения у многих родившихся в экспериментах крольчат, не были выявлены. Тем не менее, трансгенный кролик № 17, полученный в первой серии экспериментов, уже при рождении был мельче сверстников, и при дальнейшем развитии отставание в росте для него оказалось характерным. Подтверждением служат данные взвешивания кроликов на протяжении 22 недель (рис.1). Сравнение показателей роста трансгенных кроликов со своими сверстниками свидетельствует о прогрессирующем отставании в росте трансгенного кролика. В недельном возрасте при первом взвешивании живая масса "карлика" (70 г) была на 204 г меньше средней живой массы в группе контрольных сверстников (274 г), при последующих взвешиваниях это различие неуклонно увеличивалось.

Во второй серии экспериментов наблюдали противоположный фенотипический эффект у трансгенных кроликов. Уже в недельном возрасте средняя живая масса трансгенных кроликов на 96 г была выше средней живой массы в группе контрольных сверстников (100 г). Максимальная кратность превышения в весе трансгенных кроликов, по сравнению с интактными, была

в 1.97 раза выше в возрасте 4 недели, а при последнем взвешивании составляла 1.2 раза (18-ть недель).

1 3 14 22

Рис.1.Диаграмма весовых показателей трансгенного кролика и интактных сверстников на протяжении 22-х недель

Следует отметить, что в опытах, проведенных в Польше и в Словакии, также были получены трансгенные кролики с ускоренными темпами роста. У трансгенных кроликов, полученных на базе Института животноводства (г. Нитра, Словакия), были выявлены два фенотипических эффекта. Один кролик родился с нарушением конечностей и через два месяца погиб. У другого кролика с интегрированным геном ЬвИ также наблюдали эффект ускоренного роста. В возрасте 7 недель живая масса трансгенного кролика была в два раза больше, чем у его не трансгенных братьев и сестер. Необходимо отметить низкое либидо у трансгенного самца, которое было выявлено при попытке получения потомства. Таким образом, интеграция рост стимулирующих генов ИОЯБ и ЬвИ в геном кроликов имеет два ярко выраженных фенотипических эффекта: увеличение или уменьшение массы тела по сравнению со своими сверстниками.

Для получения потомства трансгенного самца № 17 спаривали с двумя интактными самками, от которых родилось 10 крольчат. Результаты блот-гибридизационного анализа геномной ДНК показали, что 5 крольчат были трансгенными. Длины гибридизующихся фрагментов потомков у кроликов № 4, № 5, № 6 соответствовали 4 9 т.п.н., что свидетельствовало о схожести с длиной основного гибридизирующегося фрагмента (4.9. т.пн.) ДНК трансгенного родителя. У кроликов № 7 и № 8 эти последовательности претерпели изменения, на что указывает уменьшение длины гибридизирующихся фрагментов до 3.5. т.п н. Таким образом, результаты

гибридизационного анализа геномной ДНК кроликов ^ свидетельствуют о передаче трансгенным кроликом № 17 последовательностей ДНК гена hGRF потомкам Р| в 50% случаев (5/10).

Анализ роста и развития потомков трансгенного "карлика" № 17 показал, что они наследовали от отца замедленный рост и соответственно меньшую живую массу по сравнению с контрольной группой животных того же возраста. Уже в недельном возрасте отмечены достоверные (Р<0.05) различия в средней живой массе трансгенных потомков Р| (126±21.8 г) и контрольных сверстников (306.7±18.6 г). При последующих взвешиваниях эти различия составляли в возрасте 2 недели - 287 г (256±47 г против 543±49.8 г), в 7 недель- 362 г (858+36.2 г против 1220± 102.1 г), в 10 недель - 654 г (1086+83 г против 1740± 153.1 г), 673.5 г (1567.5+50.7 г против 2240±151.3 г) в 14 недель.

После спаривания трансгенного кролика, полученного нами в Словакии, с двумя не трансгенными самками, несмотря на его пониженное либидо, от двух пометов получено потомство в количестве 16 голов. Живая масса крольчат F1 при рождении на 30% превышала контрольную группу (Р<0.001). Следует обратить внимание, что спаривание наиболее крупных кроликов одного помета F1 между собой, дало крупных потомков F2, превышающим по средним величинам живой массы контрольную группу, и группу F1. В возрасте 15 недель крупные потомки достигли веса 3700 г, тогда как такая же живая масса в контрольной группе была получена в возрасте 24 недель. Следует отметить повышенную смертность в поколении FL В течение первых 11 недель после рождения погибло 25% крольчат, а во второй период смертности от 22 до 30 недель погибло еще 45% потомства. Биохимический анализ показателей белкового и минерального обмена крови трансгенного кролика и его потомства F1 выявил высокий уровень мочевины (5.54-10.20 ммоль/л), в 3-5 раз превышащих норму, что указывает на нарушения белкового обмена у экспериментальных животных.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что после интеграции гена hGRF в геном трансгенного кролика № 17, его трансгенные потомки первого поколения наследовали не только генотип, но и фенотипические особенности, такие как замедленный рост и развитие, соответственно и более низкую живую массу по сравнению с его контрольными сверстниками. У трансгенных кроликов, с интегрированными генами соматотропной оси, обладающих высокой скоростью роста, в первом и во втором поколениях сохраняются более высокие показатели скорости роста и развития, по сравнению с контрольными кроликами. Как трансгенные особи, так и их потомки обладали пониженной жизнеспособностью.

3.6. Получение трансгенных свиней с геном рилизинг фактора

гормона роста человека (hGRF) с последующим генетическим и фенотипическим анализом.

С целью получения трансгенных свиней было проведено четыре серии экспериментов. На первых этапах экспериментов необходимо было отработать

гормональные схемы суперовуляции для получения ранних эмбрионов на стадии зиготы и метода визуализации ядерного материала, а также создать технологию получения трансгенных свиней в условиях фермы.

В Словакии на базе Института животноводства были проведены две серии экспериментов с целью получения ранних эмбрионов от суперовулированных свиней. Полученные данные указывают на то, что, во-первых, не у каждого животного гормональная стимуляция вызывает эффект суперовуляции, а во-вторых, существует индивидуальная реакция животных на процесс гормональной обработки.

В следующих двух сериях экспериментов для получения ранних эмбрионов на стадиях зиготы и 2-бластомеров было использовано 19 свиней-доноров. В первую группу животных входили самки со спонтанной охотой. Во вторую экспериментальную группу входили доноры, у которых вызывали гормональную стимуляцию полиовуляции. У реципиентов гормонально стимулировали синхронизацию охоты.

В первой группе получили 115 ранних эмбрионов, в среднем по 9.6 эмбриона на свинку. Количество полученных эмбрионов, исходя из определяемого числа овуляций, составила 91.3% (табл. 6).

От второй группы животных получили 159 ранних эмбрионов, в среднем по 22.7 эмбриона на донора, что указывает на то, что гормональная обработка животных позволяет более чем вдвое увеличить выход эмбрионов. Однако гормональная стимуляция полиовуляции отразилась на качестве эмбрионов. Число полноценных эмбрионов в группе №1 (94.8%) было выше, чем в группе №2(81.8%).

Таблица 6.

Получение эмбрионов свиней и их морфологическая оценка_

№ группы

1

Использовано доноров

12

Число овуляций

126

173

Получено эмбрионов

115(91.3%)

159 (91.9%)

Эмбрионы на 1-го донора

9.6

22.7

Полноценных эмбрионов:

109 (94.8%)

130(81.8%)

В т.ч. на стадии зиготы

92

113

На стадии 2-3-х бластомеров

17

17

Неполноценных эмбрионов:

6(5.2%)

29(18.2%)

В т.ч. с признаками дегенерации

С геномными нарушениями

1

Неоплодотворенных яйцеклеток

20

При изучении качества эмбрионов показано, что среди неполноценных эмбрионов были выявлены эмбрионы с признаками дегенерации, триплоидные и один тетраплоидный, но основную часть составляли неоплодотворенные яйцеклетки, особенно среди животных группы № 2 (прошедших гормональную

обработку). В отличие от кроликов в зиготах свиней не просматривались пронуклеусы из-за наличия темноокрашенной цитоплазмы при использовании дифференциального интерференционного контраста по Номарскому, поэтому основную часть зигот, после морфологической оценки их качества, подвергали центрифугированию для смещения цитоплазматических включений, маскирующих пронуклиусы.

Различная степень повреждения эмбрионов при центрифугировании и микроинъекции отразилась на способности эмбрионов развиваться до рождения потомства после пересадки реципиентам. Так, из 92 зигот и 2-3- бластомерных эмбрионов, пересаженных реципиентам в серии экспериментов № 1, до рождения потомства развилось 5.4%. Из 5 использованных свинок-реципиентов, опоросилась одна.

В серии экспериментов № 2 использовано 6 свинок-реципиентов, 5 из которых оказались супоросными (83.3%) и принесли 24 поросенка (в т.ч. 14 живых). В этой серии экспериментов получены более высокие показатели рождаемости потомства, чем в серии экспериментов №1, что возможно вызвано использованием вдвое большего количества эмбрионов при трансплантации, а также была более жестко проведена отбраковка не качественных эмбрионов.

От 5 поросят, родившихся в первой серии экспериментов, и от 24 поросят и мертворожденных плодов во второй серии экспериментов, были взяты образцы тканей ушей и крови, из которых была выделена геномная ДНК для выявления чужеродных последовательностей ДНК гена ИвЯ-Р. С помощью блот-гибридизационного анализа было подтверждено присутствие последовательностей ДНК гена ИОРЯ в геноме лишь одного животного № 1 в первой серии экспериментов. Геномная ДНК свинки № 1, рестрицированная ферментом Нтё111, дала положительный сигнал в области длин фрагментов 12 т.п.н. и 4.6 т.п.н. Интенсивность гибридизационных сигналов свидетельствовала о наличии примерно 10 копий гена ИвЯР в геноме животного. С подтверждением трансгеноза у одной свиньи из 5, родившихся в этой серии экспериментов, эффективность генных пересадок составила 20% к числу новорожденных и 1.1% - к числу трансплантированных эмбрионов.

В следующей серии экспериментов пробы ДНК были исследованы с помощью метода блоттинга по Саузерну, который подтвердил присутствие последовательностей гена ИвЯР в геноме 3 свиней (№66/1, №66/2, №66/3). Интенсивность положительных сигналов, при сравнении с таковой в положительном контроле (порядка 5 копий на диплоидный геном), свидетельствует о присутствии в геноме хряка № 66/1 не более одной копии гена ИвЯР, в геноме хряка № 66/2 - около 10 копий и в геноме хряка № 66/3 - около 3 копий. Подводя итоги в этой серии экспериментов, получили, что общая эффективность трансформации генома свиней с помощью гена ИвЯР составила 12.5% к числу новорожденных и 1.55% - к числу трансплантированных эмбрионов.

Опытные поросята при рождении не имели сильно выраженных фенотипических изменений. У трансгенного хряка в условиях фермы

Поляриково (отделение Ружовый двор, Словакия) были изучены репродуктивные качества. Необходимо указать на снижение либидо. Тем не менее, следует отметить эффект увеличения супоросности. Так, при спаривании 23 нормальных свиноматок с трансгенным самцом 21 самка принесла потомство (91%), тогда как в контроле показатель супоросности составил 7883%. В поколении П получено 223 поросенка в 21 помете, среди которых 213 живых и 4.5% мертворожденных. Средняя живая масса составила 1.41кг, а среднее количество поросят на самку - 10.6. По результатам блот-анализа по Саузерну у потомков не было выявлено чужеродного гена, но полученное потомство отличалось от контрольной группы низкой степенью выживаемости. В течение первых 3 недель жизни погибло 36.9% поросят.

Во второй серии экспериментов средняя живая масса новорожденных поросят составляла 1.4 кг, что соответствовало средней живой массе контрольных сверстников. Интенсивность роста животных в опытной группе, практически, не отличалось от таковой в контрольной группе.

В первой серии экспериментов средняя живая масса поросят при рождении составляла 1.2 кг, что несколько меньше, чем в группе контрольных сверстников (1.41 кг). К месячному возрасту наметилась различная интенсивность роста животных в опытной (4.5+0.76 кг) и контрольной группах (7.0 ±1.1 кг). К 5 месячному возрасту достоверное (Р<0.05) различие в средней живой массе по группам животных было 21.1 кг (25.9+3.1 кг против 47+4.3 кг), к 9-ти месяцам - 37.1 кг (53.0+4.7 кг против 124+3.4 кг). В заключение можно отметить, что в первой серии экспериментов свиньи, полученные из ранних эмбрионов, в которые был введен ген ИОЯР, в годовалом возрасте по размерам и весовым показателям соответствовали 6 месячным контрольным животным. При влиянии рост стимулирующего гена ИОЯР у трансгенной свинки № 1, был выявлен феномен карликовости.

3.7. Цитогенетический анализ и изучение уровня стабильности генома кроликов и свиней, полученных из эмбрионов, в которые микроинъецировали ген hGRF, а также их потомков.

Как известно, микроядра состоят из малых количеств ДНК и представляют фрагменты хромосом. В настоящее время микроядерный тест (МТ) используют в целях биомониторинга. МТ, как показатель геномной нестабильности, особенно актуален при введении в геном чужеродных генетических конструкций и изучении их воздействий на геном трансгенных животных и их потомков. Была исследована частота и количество эритроцитов с микроядрами у интактных кроликов (контрольная группа) и кроликов, полученных из зигот после микроинъекции генетической конструкции МТ-1/ЬвКР (экспериментальная группа). В экспериментах было использовано 30 самцов и самок породы шиншилла в экспериментальной группе и 25 животных породы шиншилла в контрольной группе. Частота клеток с микроядрами была определена на 10000-х эритроцитах от каждого животного. Количество микроядер у интактных кроликов варьировало от 0 до 4.5х10-4 при

среднем значении 1.0х10"4+0.27х10'4. Крайние значения МТ в экспериментальной группе составляли 0.5x1 О*4 и 5.5x10"4 при средних значениях г.^хю^олбхю-4 (р<о.оо1)„ что в два раза превышают показатели у контрольной группы.

У свиней, полученных после введения гена hGRF, МТ-тестирование показало, что средняя частота встречаемости эритроцитов с микроядрами в три раза превосходит (Р<0.001) данный показатель интактных животных. Следует отметить, что увеличение показателей МТ-теста были зарегистрированы в популяциях эритроцитов опытных кроликов и свиней, давший отрицательный сигнал при тестировании на трансгенез.

Анализ препаратов хромосом трансгенного хряка, его потомков и группы контрольных животных показал, что во всех трех группах нет видимых структурных нарушений и транслокаций. В пределах нормы на отдельных метафазных пластинках встречались хроматидные аберрации. Количество полиплоидных клеток во всех 3 группах составило не более 1%. Цитогенетический анализ трансгенного хряка показал повышенную ассоциативную способность метафазных хромосом. Подсчет ассоциаций проводили согласно общепринятым методам на 30 метафазных пластинках от каждого животного во всех трех группах, при этом отдельно учитывали ассоциации 2,3 и более хромосом (табл. 7).

Обращает на себя внимание, что при ассоциации 3 и более хромосом выявлена достоверная разница между трансгенным хряком и его потомками (табл. 7). Та же тенденция сохраняется при подсчете всех типов ассоциаций.

Таблица 7.

Количество ассоциаций хромосом свиней на метафазную пластинку.

Группа животных Количество хромосомных ассоциаций

2-х хромосом 3-х хромосом Более 3-х хромосом Общее число ассоциаций

Трансгенный хряк 1.59+0.39 0.76+0.20 0.53±0.15 2.88+0.44

Потомки ОМ) 1.16±0.10 0.22+0.05* 0.13+0.04* 1.52±0.10**

Контроль 1.00+0.14 0.19±0.07** 0.00+0.0*** 1.19+0.16**

*Р<0.05; **Р<0.01; ***Р<0.001 (уровень достоверности различий с трансгенным хряком)

В контрольной группе практически не выявлены ассоциации 4 и 5 хромосом, в то время как у трансгенного хряка наблюдаются метафазные пластинки с такими ассоциациями (Рис. 2).

Проведенное исследование не позволяет однозначно объяснить высокую эмбриональную и постнатальную смертность потомства трансгенного хряка. Возможно, что происходят нарушения в геноме на разных уровнях. Нельзя исключить того, что способность хромосом трансгенного хряка вступать во множественные ассоциации, может передаваться потомству, что повлечет за

собой риск не расхождения хромосом, как в мейозе, так и в митозе, ведущего к несбалансированности генома, что подтверждают показатели МТ-теста.

Рис. 2. Митотические хромосомы трансгенного хряка с ассоциацией пяти акроцентрических хромосом (G-окраска).

Таким образом, впервые показана повышенная способность метафазных хромосом трансгенного хряка с интегрированным геном рилизинг фактора гормона роста человека, находящегося под контролем металлотионеинового гена мыши, к образованию ассоциаций нескольких хромосом.

3.8. Экспрессия репортерных генов у предимплантационных зародышей сельскохозяйственных животных.

Для идентификации и селекции трансгенных эмбрионов, а также для выявления инициации экспрессии репортерных генов в эмбриональном геноме в настоящем исследовании были использованы два гена LacZ и GFP с различными промоторами.

3.8.1. Экспрессия гена LacZ в ранних эмбрионах кроликов.

В первой серии опытов ген Lac Z в концентрации 2,5 нг/мкл был микроинъецирован в пронуклеус с помощью микроманипулятора через 18-20 часов после спаривания. Во второй серии опытов проводили коинъекцию гена Lac Z с MAR (Matrix Attachment Regions) областями также в концентрации 2,5 нг/мкл. MAR-элементы были получены от глобинового гена цыпленка и любезно предоставлены Dr. A.E.Sippel (Германия).

В таблице 8 представлены результаты, полученные после микройнъекции 2-х генных конструкций в зиготы кроликов. Эмбрионы фиксировали и окрашивали X-gal через 24,48, 72 и 96 часов.

Введение двух репортерных генетических конструкций CMV-LacZ и SV-40-LacZ в геном кроликов сразу после оплодотворения позволили заключить следующее: ген LacZ может служить маркером для изучения, как начальных этапов экспрессии генов, так и в процессе дальнейшего развития

организма. Использование двух разных гетерологичных промоторов не оказало значительного влияния на эффективность трансгеноза.

Таблица 8.

Число эмбрионов после инъекция гена Ьае/ с разными промоторами и МАЯ-последовательностей в зиготы кроликов в разное время культивирования.

Время культивирования (ч)

24_

48_

72_

96_

Всего:

pMV-LacZ

17

30_

16(1) МП

pCMV-LacZ +MAR

20(2)

17_

48(2)

SV-40-LacZ

27

33_

47(2) 26(1) 133(3)

SV-40-LacZ +MAR

44

32(3) 46(1) 23(2) 145(6)

Примечание: В скобках отмечено количество эмбрионов, экспрессирующих В-галактозидазу. -

У кроликов начало активации экспрессии гена Lac Z, под контролем CMV-промотора, выявлено на стадии 6-бластомеров, а под контролем SV-40 промотора - на стадии 4-бластомеров. Мозаичный паттерн экспресси был характерен для большинства эмбрионов, причем интенсивность экспрессии гетерогенна даже в пределах одного эмбриона. Применение MAR-последовательностей даже в виде коинъекции приводит к увеличению выхода трансгенных эмбрионов.

3.8.2. Экспрессия GFP гена у эмбрионов коров, полученных in vitro.

Зиготы были получены in vitro из ооцит кумулюсных комплексов (ОКК) по общепринятой методике (Dusztwska A.M. et al., 2000). Микроинъекцию трансгенной конструкции pCX-EGFP проводили в пронукулеус при использовании микроманипулятора Leitz. Экспрессию GFP гена в эмбрионах определяли через 168 часов культивирования в среде Menezo B-2, используя флуоресцентный микроскоп Fluover FS и стандартный фильтр FITC.

Было проведено 6 экспериментов с эмбрионами, полученными из ОКК методом in vitro созревания, оплодотворения, введения гена GFP в зиготы в концентрации Знг/мкл, 5 нг/мкл и дальнейшего развития. В четырех экспериментальных группах (279 зигот, из которых в контроле 41) после введения гена GFP в зиготы и культивировании в течение 48 часов, количество поделившихся эмбрионов колебалось от 54.5 до 72.7% (в среднем 62.45%), в то время как в контроле, этот показатель варьировал от 83.3 до 90.0% (в среднем 88.05%). Очевидно, что на начальных стадиях культивирования процесс микроинъекции оказывает негативное влияние на развитие эмбрионов коров, полученных из ОКК in vitro. Тем не менее, в контроле при длительном культивировании эмбрионов (168 часов) в питательной среде Menezo B-2 в среднем 44% эмбрионов достигло стадии морулы и бластоцисты, а в экспериментальных группах в среднем 32.2%. Следовательно, отсев нежизнеспособных эмбрионов, полученных in vitro при длительном

культивировании, незначительно отличается в экспериментальных группах от контрольных и составляет приблизительно третью часть от исходных данных.

Экспрессию гена GFP выявляли по наличию зеленой флуоресценции в эмбрионах. В первой группе была выявлена экспрессия у 3 эмбрионов (4.9%), среди которых два находились на стадии морулы и один - на стадии бластоцисты. У одной морулы была 100%-я экспрессия, т.е. все клетки обладали зеленой флуоресценцией, а у другой морулы только 50% клеток флуоресцировали. У бластоцисты отмечено четверть флуоресцирующих клеток (25%). Следовательно, у последних двух эмбрионов отмечен мозаичный характер экспрессии. Во второй и четвертых сериях экспериментах количество трансгенных эмбрионов было меньшим (2.2% и 1.7%). В третьей серии экспериментов не было выявлено эмбрионов с экспрессией гена GFP. Несмотря на то, что эмбрионы были подвегнуты воздействию центрифугирования (1200g) и микроинъекции, повреждающий эффект был выявлен только на начальных стадиях развития (2-4 бластомера) и был нивелирован на поздних стадиях развития (морула-бластоциста).

В пятой и шестой экспериментальных группах было использовано 262 эмбриона, среди которых 64 эмбриона были контрольными. После 48 часов культивирования поделились 48 % зигот, в то время как в контрольной группе процент поделившихся зигот был значительно выше (81,25%). Спустя 168 часов культивирования процент морул-бластоцист в контрольной группе (39,06%) также был выше, чем в инъецированной группе (25,37%). Одной из причин более низкого уровня развития морул и бластоцист в данной группе экспериментов, по сравнению с более ранними исследованиями, может быть увеличение концентрации ДНК, используемой для инъекции. Было идентифицировано три GFP положительных эмбриона коров после пронуклеарной микроинъекции генной конструкции pCX-GFP по зеленой флуоресценции эмбрионов, что составляет 1,51% эффективности трансгеноза или 6,52% от количества морул/бластоцист, причем из трех трансгенных эмбрионов только один был полностью GFP положительным. Средняя эффективность получения трансгенного крупного рогатого скота, как сообщалось другими авторами, составляет менее 1% (Wall J et al., 1996), но многие были мозаиками, а эффективность получения 100% трансгенных животных очень низка и изменяется в пределах от 0,038 до 0,22% (Chen R- et al.,1999).

Таким образом, экспрессию GFP гена можно использовать для селекции эмбрионов коров, что значительно повысит эффективность трансгеноза. Кроме этого, трансгенные эмбрионы могут служить генофондом для получения трансгенных клонированных животных.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны приемы приготовления препаратов хромосом из тканей 3-дневных эмбрионов и определен уровень спонтанных нарушений хромосом кур. Частота таких нарушений у кур породы леггорн, составила 5.88%.

2. По своим морфометрическим параметрам и по локализации О-полос макрохромосомы кур легко идентифицируются и проявляют гетероморфизм среди гомологов. Проведено картирование О-полос первой пары аутосом с количественной оценкой длины, локализации и интенсивности окрашивания этих полос.

3. Репродукция макро- и микрохромосом кур идет на протяжении всего 8-периода с преимущественной репликацией ДНК микрохромосом в первой половине 8-фазы, в отличие от '-хромосомы, активно синтезирующейся в конце периода синтеза ДНК. Половые ЪЪ-хромосомы петухов репродуцируются в течение 8-фазы синхронно. По количественной регистрации включения 3Н-тимидина на протяжении всей 8-фазы определено относительное количество ДНК в макрохромосомах (73.7%) и микрохромосомах (26.3%).

4. Внутрихромосомная асинхронность синтеза ДНК в течение 8-периода тесно связана с особенностями линейной дифференцированности хромосом кур.

5. Методом ЯВА-окрашивания охарактеризована репликационная активность генома кролика второй половины 8-фазы. Показана взаимосвязь процессов репликации и конденсации хромосом кролика на примере сравнительного анализа ЯВА-окрашенных хромосом, находящихся на разных уровнях конденсации.

'6. ДНК - репликативные процессы функционально связаны с морфологическими изменениями в пронуклеусах кролика. В начале 8-фазы мужской пронуклеус в своем объеме уступает женскому, но обладает более сильно выраженной репликативной активностью. В середине 8-фазы, когда оба пронуклеуса одинаковы по своим размерам, синтез ДНК протекает с одинаково сильной интенсивностью. Во второй половине 8-периода мужской пронуклеус становится больше женского, но интенсивность репликации ДНК затухает по сравнению с женским. Выявлены два типа хроматина, которые отличаются по времени репликации ДНК уже на одноклеточной эмбриональной стадии развития.

7. Методом микроинъекции генов соматотропной оси в ранние эмбрионы получены трансгенные животные: 11 трансгенных кроликов с интегрированными генами рилизинг фактора гормона роста человека;

5 трансгенных кроликов, в геноме которых интегрированы векторные последовательности и гены гормона роста быка; 4 трансгенных свиньи, несущих в своем геноме ген рилизинг фактора гормона роста человека.

8. Эффективность переноса генов соматотропной оси у кроликов составила 10,2% к числу родившихся (от 1.9 до 22.2%) или 1.7% к числу трансплантированных эмбрионов (от 0.27 до 4.7%). У свиней эффективность

трансгеноза была 15% к числу родившихся или 1.4% к числу трансплантированных эмбрионов.

9. Интеграция рост стимулирующих генов hGRF и bGH в геном кроликов имеет два протвоположно выраженных фенотипических эффекта: увеличение или уменьшение массы тела по сравнению со своими сверстниками. Отрицательными фенотипическими эффектами у тансгенных кроликов и свиней можно считать снижение либидо у самцов, увеличение количества мертворожденных животных, высокая эмбриональная и постнатальная смертность трансгенных кроликов, свиней и их потомков.

10. После интеграции генов hGRF и bGH в геном трансгенных кроликов и свиней трансгенные потомки первого поколения наследовали не только генотип, но и фенотипические особенности, такие как замедленные или ускоренные темпы роста по сравнению с контрольными сверстниками.

11. После введения чужеродных генов, в ранние эмбрионы кроликов, частота эритроцитов с микроядрами у родившихся животных, была в два раза выше в экспериментальной группе по сравнению с контрольной группой, а у свиней - в 3 раза.

12. Впервые показана повышенная способность метафазных хромосом трансгенного хряка с интегрированным геном рилизинг фактора гомона роста человека, находящегося под контролем металлотионеинового гена мыши, к образованию множественных ассоциаций хромосом.

13. У кроликов начало активации экспрессии гена Lac Z, под контролем CMV-промотора выявлено на стадии 6-бластомеров, а под контролем SV-40 промотора - на стадии 4-бластомеров.

14. У трансгенных эмбрионов обнаружена экспрессия репортерных генов, как во всех клетках, так и в отдельных бластомерах, причем интенсивность экспрессии гетерогенна, даже в пределах одного эмбриона. Применение MAR-последовательностей в виде коинъекции приводит к увеличению выхода трансгенных эмбрионов.

15. Регистрация характера экспрессии GFP гена в эмбрионах коров позволяет отбирать только трансгенные эмбрионы, что значительно повышает эффективность трансгеноза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основе материалов диссертации разработаны методические рекомендации по исследованию хромосом, дифференциальной окраске и использованию приемов генетической инженерии для оценки изменения генома сельскохозяйственных животных, которые могут найти применение в различных молекулярно-цитогенетических и биотехнологических лабораториях, при проведении экологического мониторинга окружающей среды, оценке племенных животных и при внедрении различных технологий в сельском хозяйстве.

При практическом использовании животных, которым были

микроинъецированы чужеродные гены, необходимо проведение

цитогенетического мониторинга. Применение репортерных генов и МЛЯ-

последовательностей повышают выход трансгенных эмбрионов,

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Трофимова (Козикова) Л.В., Яковлев А.Ф. Репродукция хромосом кур в конце периода синтеза ДНК // Цитология и генетика. 1975. Т.9. №3. С.214-217.

2. Трофимова (Козикова) Л.В. Особенности получения препаратов хромосом птиц // Методические рекомендации ВНИИРГЖ. Л. 1976. С.20-30.

3. Трофимова (Козикова) Л.В.Применение авторадиографии для исследования хромосом // Методические рекомендации ВНИИРГЖ. Л. 1976. С.47-56.

4. Трофимова (Козикова) Л.В., Яковлев А.Ф., Коробицин. Методические подходы к гибридизации нуклеиновых кислот // Методические рекомендации ВНИИРГЖ. Л. 1976. С.56-61.

5. Трофимова (Козикова) Л.В., Носач А.К. Методы выявления поперечной исчерченности хромосом сельскохозяйственных животных // Методические рекомендации ВНИИРГЖ. Л. 1976. С.61-65.

6. Трофимова (Козикова) Л.В., Яковлев А.Ф. Хромосомный набор клеток эмбриональных фибробластов кур // Сб. научных трудов ВНИИРГЖ. Л.

"1976.Вып.23.С.70-75.

7. Трофимова (Козикова) Л.В.Лковлев А.Ф. Изменение числа микрохромосом в процессе спирализации макрохромосом // Генетика. 1977. Т.13. №5. С.806-810.

8. Трофимова (Козикова) Л.В. Репликация ДНК по длине макрохромосом кур // Бюллетень ВНИИГРЖ. Л. 1977. Вьш.24. С.6-9.

9. Трофимова (Козикова) Л.В., Яковлев А.Ф. Репликация ДНК микрохромосом у кур // Материалы IV всесоюзного симпозиума по структуре и функции клеточного ядра. Алма-Ата. 1977. С.78-80.

Ю.Яковлев А.Ф., Носач А.К., Бавин В.Г., Трофимова (Козикова) Л.В. Различия в степени асинхронности синтеза ДНК хромосом у домашних млекопитающих и птиц // Материалы 3-го всесоюзного съезда ВОГиС. Л. 1977.С.243-244.

П.Трофимова (Козикова) Л.В.. Яковлев А.Ф. Синтез ДНК первых двух пар аутосом клеток костного мозга цыплят // Цитология и генетика. 1978. Т. 12. №2.С.125-129.

12.Трофимова (Козикова) Л.В., Яковлев А.Ф. Картирование в-полос первой пары аутосом у домашних кур // Цитология. 1978. Т.20. №12. С. 1379-1383.

1 З.Трофимова (Козикова) Л.В., Яковлев А.Ф. Включение экзогенных ДНК в хромосомы кур // Бюллетень ВНИИГРЖ. Л. 1979. Вып.37. С.8-11.

Н.Трофимова (Козикова) Л.В., Соколова Л.Н.,Яковлев А.Ф. Параметры клеточного цикла домашних кур // Сб. научных трудов ВНИИГРЖ. Л. 1979. Вып.28.С113-117.

15.Трофимова (Козикова) Л.В., Яковлев А.Ф. Связь внутрихромосомной асинхронности репликации ДНК макро- и микрохромосом куриных эмбриональных фибробластов. // Материалы всесоюзного VII симпозиума по структуре и функции клеточного ядра. Харьков. 1980. С.52-53.

16.Трофимова (Козикова) Л.В. Цитогенетическая характеристика гибридов петуха с цесаркой и их исходных форм. // Сб. «Экологическая генетика растений и животных». Кишинев. 1981. С. 121-122.

П.Трофимова (Козикова) Л.В., Яковлев А.Ф., Носач А.К., Бавин В.Г. Техника G-окраски хромосом сельскохозяйственных животных // Методические рекомендации «Методы дифференциальной окраски хромосом сельскохозяйственных животных». Л. 1981. С.5-10.

18.Трофимова (Козикова) Л.В. G-окрашивание хромосом птиц // Методические рекомендации. «Методы дифференциальной окраски хромосом сельскохозяйственных животных». Л. 1981. С.9-11.

19.Яковлев А.Ф., Носач А.К., Бавин В.Г., Трофимова (Козикова) Л.В. Репродукция хромосом в течение S-периода // XXXIII ЕАЖ. Ленинград. 1982.С.1-11.

20. Трофимова (Козикова) Л.В. Асинхронность синтеза ДНК макро- и микрохромосом кур // Материалы 4-го съезда ВОГиС. 1981, Т. 1 С.246-247.

21.Козикова Л.В. Идентификация половых хромосом цесарок // Цитология и генетика. 1984. Т.4№3 С.231-232.

22. Козикова Л.В., Яковлев А.Ф. Влияние процесса криоконсервации семени на частоту и спектр хромосомных нарушений у кур // Материалы III национальной конференции. Болгария. Пловдив. 1984. Т.2 С.296-298.

23. Kozikova L.V. Study of reproduction of chromosomes in hens // 6-th International symposium on Actual Problems of Avian Genetics. Smolenice. Czechoslovakia. 1985. P.171-177.

24. Родионов А.В., Козикова Л.В., Челышева Л.А., Раусепп, Куммик Т., Эрматов Ю.А. Изменчивость кариотипов сельскохозяйственных птиц // Сб. научных трудов ВНИИРГЖ. Л. 1987. С.63-73.

25. Газарян К.Г., Андреева Л.Е., Серова И.А., Тарантул В.В., Кузнецова Е.Д., Хайдарова Н.В., Генинг Л.В., Кузнецов Ю.М., Газарян Т.Г., Смирнов А.Ф., Козикова Л.В.. Ефимов A.M. Получение трансгенных кроликов и мышей, содержащих ген гормона роста быка // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1988. Т. 10. С.26-32.

26. Kozikova L.V., Steklenev E.P. Hybridization of domestic hen and the guinea fowl // 8-th International symposium on Actual Problems of Avian Genetics. Smolenice. Czechoslovakia. 1989. P.I 53-157.

27. Rosochacki S.J., Smirnov A.F., Kozikova L.V.. Sadovska J., Efimov A, Zwierzchowski L. Kroliki transgeniczne niosace mMT-GRF // XXV Zlazd Polskiego Towarystwa Biochemicznego Materialy. Torun. Poland. 1989. P.309.

28. Козикова Л.В.. Полеев А.В. RBA-маркеры хромосом кролика // Материалы IV национальной конференции по цитогенетике. Враца. Болгария. 1989. С.200-2001.

29. Козикова Л.В.. Медведев С.Ю., Яковлев А.Ф., Рамша Ю.К. Влияние микроинъекции генов на трансплантацию зигот кроликов // Материалы всесоюзного совещания по трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных. Алма-Ата. 1989. С.23-25.

30. Козикова Л.В., Медведев С.Ю., Бавин В.Г., Ефимов A.M., Смирнов А.Ф., Яковлев А.Ф. Перенос генов в зиготы и эмбрионы животных // Методические рекомендации «Использование приемов генетической инженерии для оценки и изменения генома сельскохозяйственных животных». Ленинград. 1990. С.11-22.

31. Kozikova L.V., Kravtsov V.Y., Medvedev S.Y., Yakovlev A. F. Micronuclei test (MT) on rabbits obtained after microinjection with human growth-hormone realising factor (hMT-GRF) to zygotes // «Through to oocyte to the embryo». 4th Franco-Czechoslovak meeting. Praque. 1990. P.90.

32. Kozikova L.V.. Bulla J., Babusik P., Kuliskova L., Pivko J., Uhrin P. Transgenic animals and their use in agriculture // 5th International symposium «Biological and technical intensification of production and increase of animal products quality» Nitra. Czechoslovakia. 1990. P.25-27.

33. Rosochacki S.J., Kozikova L.V.. Efimov A., Sadovska J., Smirnov A.F., Zwierzchowski L. Successful integration of mMT-GRF gene into rabbits // 5th International symposiume «Biological and technical intensification of production and increase ofanimal products quality» Nitra. Czechoslovakia. 1990.

34. Kozikova L.V.. Sirotkin A.V., Pivko J. Pattern of RNA synthesis in bovine oocytes and cumulus cells during in vitro maturation // Phisiol. Res. (Czechoslovakia) 1991 .№40. P. 641.

35. Kozikova L.V. Mapping late replication zones of rabbits chromosomes // XVth Geneticke dny. Ceske Budejovice. Czechoslovakia. 1991. P.82.

36. Kozikova L.V.. Sirotkin A.V. Autoradiographical analysis of RNA synthesis in bovine oocytes and cumulus cells during in vitro maturation // J. of Reproduction and Fertility. Abstract. 1992. SerJte9. P.86.

37. Bulla J., Pivko J., Babusik P., Paska I., Grafenau P., Oberfranc M., Kozikova L.V.. et'al. Osipana- vhodny model pre tvorbu traqnsgennych zvierat // Zb. Referatov XIII Celoslovenskeho seminara о reprodukcii hospodarskych zvierat. Liptovsky Ondrej. Czechoslovakia. 1992. P.175-179.

38. Rosochacki S.J., Smirnov A.F., Kozikova L.V., Efimov A., Sadovska J., Zwierzchowski L. Transfer of human growth-related genes into rabbits // Animal Science Papers and Reports. 1992. №9. P.81-90.

39. Kozikova L.V.. Kalasnikova L., Vasicek D., Baurova M., Bulla J., Babusik P., et al. Prenos genu do samcieho prvojadra zygoty kralika // Zb. Referatov. XVI Geneticke Dny. Ceske Budejovice. Czechoslovakia. 1992. P. 101-102.

40. Kozikova L.V. Cytogeneticka analysa transgennego kanca a jeho potomstva // XVI Dni Genetiky Hospodarskich zvierat. Nitra. Slovenska republika. 1993. P.16-18.

41. Bulla J., Kalasnikova L., Kozikova L.V., et al. Zivotoschopnost potomkov transgennych zvierat // Zb. Referatov. Geneticka Konferencia GSGM «40 let Dvousrobovice DNA». Bmo. Czech Republic. 1993. P.6.

42. Kalasnikova L.A., Kozikova L.V., Rasheed S.T. et al. Mortality of transgenic animals offsprings // Proceeding of the 1st European Conference on «Progress in Embryo Technology and Genetic Engineering in Cattle and Sheep Breeding». Krakov. Poland. 1994. P.212.

43. Козикова Л.В. Особенности кариотипа трансгенного хряка и его потомства // Генетика. 1994. Т.ЗО С.73.

44. Медведев С.Ю., Козикова Л. В., Яковлев А.Ф. Развитие in vitro и in vivo эмбрионов кроликов, микроинъецированных геном рилизинг фактором гормона роста человека // Материалы международного симпозиума «Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных » Ленинград. 1994. С.21.

45. Козикова Л.В.. Булла И. Цитогенетический анализ трансгенного хряка (МТ-1/hGRF) и его потомства // Сб. научных трудов «Генноинженерные сельскохозяйственные животные » (Министерство науки и технич. политики Российской Федерации РАСХН). 1995. Вып.1. С.68-72.

46. Медведев С.Ю., Козакова Л.В., Босак Н.Г., Бавин ВТ., Яковлев А.Ф. Получение трансгенных кроликов и свиней, несущих ген рилизинг фактора гормона роста человека // Сб. научных трудов «Генноинженерные сельскохозяйственные животные » (Министерство науки и технич. политики Российской Федерации РАСХН). 1995. Вып.1. С.104-109.

47. Медведев С.Ю., Козикова Л.В., Бавин В.Г., Яковлев А.Ф. Рост и развитие трансгенных кроликов и свиней с перенесенным геном рилизинг фактора гормона роста человека // Сельскохозяйственная Биология 1995. №6. С.43-48.

48. Sirotkin A.V., Kozikova L.V., Bulla J. Autoradiographical analysis of RNA synthesis in bovine oocyte - cumulus complexes during in vitro maturation // Zivocisna Vyroba. Czech Repablic. 1997. №42. P.487-493.

49. Rosochacki S.I..Kozikova L.V. Transgenic rabbit zygotes with pCMV-LacZ gene/m Symposium of Polish Genetics Society. J.ofAppl.Genetl998. P.140.

50. Rosochacki S.I., Kozikova L.V. Expression of LacZ reporter gene in early studies of rabbit zygotes // 25th Silver Jubilee FEBS Meeting. 1998. P. 112. The Bella Center, Copenhagen, Denmark. 51, Козикова Л.В.. Росохацкий СИ., Звиежковский Л. Микроинъекция гена LacZ и нуклеотидных последовательностей MAR в оплодотворенные яйцеклетки кроликов: раннее эмбриональное развитие и экспрессия гена LacZ // Цитология . 1999. №3/4. С. 280-281.

51. Козикова Л.В.. Росохацкий СИ., Звиежсковский Л. Микроинъекция гена LacZ и нуклеотидных последовательностей MAR в оплодотворенные яйцеклетки кроликов: раннее эмбриональное развитие и экспрессия LacZ // Цитология. 1999. №3/4. С.280-281.

52. Козикова Л.В., Терлецкий В.П., Пивко Ю., Киселева Т.Ю. Репликация ДНК в пронуклеусах кролика // Сб. научных статей Украинской академии наук « Разведение и генетика с.х.. животных» Киев. 1999. №31-32. С. 102-104.

53. Rosochacki S.J., Kozikova L.V.. Poloszynowich J. Integracja genu reporterowego LacZ do zarodkow. 1 Krajowy congres Biotechnologii. Wroclaw. Poland. 1999. P.I 11-187.

54. Козикова Л.В.. Медведев С.Ю., Попов А.В., Андреева Л.Е., Яковлев А.Ф. Трансгенные животные // Зоотехния. 2000. №11. С.12-13.

55. Козикова Л.В., Росохацкий СИ. Мозаичная экспрессия гена LacZ у ранних эмбрионов кролика// Материалы 2-го всероссийского съезда ВОГиС С.-Петербург, 2000. т.2. С.82-83.

56. Козикова Л.В.. Росохацкий СИ., Звиежковский Л., Терлецкий В.П. Влияние MAR-последовательностей на экспрессию гена LacZ //Сб. «Актуальные проблемы биологии в животноводстве». Боровск. 2000. С.401-402.

57. Rosochacki SJ., Kozikova L. Transgenic animals with growth hormone and growth hormone related genes// Molecular Farming. La Grande Motte (France). Ed. by J.P. Toutant, E. Balaz. 2000. P.132-143.

58. Rosochacki S.J., Kozikova L. Pronuclear microinjection, DNA integration, transgenic mosaicism in rabbit embryons // FEBS. 2001.V.268. P.216-219.

59. Rosochacki S.J., Duszewska A., Kozikova L.. Olszewski R. Expression of GFP in microinjected bovine embryos //Animal Science Paper Report. 2001. №19. P. 193-202.

60. Kozikova L.V.. S.I.Rosochacki, A.F.Yakovlev. Expression of GFP. gene in the rabbit embryos // lth Intern.Congr. Biotechnology - state of the art and prospects of development. Moskow. 2002. P. 157-158.

61. Yakovlev A., Kozikova L., Medvedev S. Obtaining accelerated growth effect, when transfer of a somatotropic axis genes to the rabbits // 53th EAAP annual meeting. 2002. Cairo. P.84-85.

62. А.ФЛковлев, Л.В.Козикова, СКХМедведев, КБулла, С.Росохацкий. Анализ состояния трансгенных животных с генами соматотропной оси // Материалы симпозиума «Дни польской науки в России». СПб. 2002. С.31-34.

63. Козикова Л.В.. Росохацкий СИ. Экспрессия репортерных генов в раннем эмбриогенезе у млекопитающих // Материалы симпозиума «Дни польской науки в России ». СПб. 2002. С.38-42.

64. Rosochacki S.J., Strzelecka M., Kozikova L., Matejczyk M., Oblap R., Poloszynowicz J., Zwierzchowski L. Expression of microinjected gene lacZ during first cleavages ofrabbit embryos. Folia Biol. 2002. V.50. P. 61-67.

65. Козикова Л.В.. Яковлев А.Ф. Селекция эмбрионов крупного рогатого скота по экспрессии гена GFP // Цитология. 2003. №11. С.987.

66. Kozikova L.V.. Rosochacki S.I. Noninvasive fluorescent screening of microinjected bovine embryos to predict trasgene integration // Folia biol. 2003. V. 51. P. 97-104.

67.Duszewska A., Kozikova L., Cybulska M, Korwin-Kossakowski M., Was В., Poloszynowicz J., Wicinska K., Szydlik H., Rosochacki S.J. The use of green fluorescent protein (GFP) to select bovine embryos // J. Animal Feed Science. 2003. V.I2. 73-83.

68.Козикова Л.В., Росохацкий СИ., Яковлев А.Ф. Особенности первого раунда репликации ДНК в мужском и женском пронуклеусах кролика и активация эмбриональной экспрессии репортерных генов // Материалы 3-го всероссийского съезда ВОГиС. «Генетика в XXI в.: современное состояние и перспективы развития». Москва. 2004. T.I. C.38.

69. Козикова Л.В., Яковлев А.Ф. Цитогенетический анализ эмбрионов кур, полученных путем искусственного осеменения криоконсервированной спермой разных сроков хранения // Цитология. 2004. Т.46. №9. С.803-804.

70. Козикова Л.В. Росохацкий СИ., Душевска А., Яковлев А.Ф. Активация эмбриональной экспрессии репортерных генов сельскохозяйственных животных // Материалы международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология». Минск. 2004.

СЛ60-161.

Подписано в печать 11.03.05 Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная Объем 2 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ №23

Отпечатано на ризографе ГНУ СЗНИИМЭСХ

2 2 M¿P?cfc if SI

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Козикова, Лариса Васильевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Структурно-функциональная характеристика хромосом и гетерохроматина

1Л .2. Характеристика генома птиц

1.1.3. Нарушения структуры и функции хромосом

1.1.4. Использование методов трансгеноза для изучения структурно-функциональных характеристик хромосом

1.2. Линейная дифференцированность хромосом

1.2.1. Дифференциальная окраска хромосом 36 1.2.2.0рганизация генома и линейная дифференцированность хромосом

1.3. Репродукция хромосом 41 1.3.1 .Молекулярные аспекты репликации ДНК

1.3.2.Клеточный цикл

1.3.3.Меж- и внутрихромосомная асинхронность синтеза ДНК

1.4. Трансгеноз

1.4.1. Методы генетической модификации генома млекопитающих

1.4.2. Введение рекомбинантных плазмид в ядро оплодотворенной яйцеклетки

1.4.3. Эффективность трансгеноза у лабораторных и сельскохозяйственных животных

1.4.4. Молекулярные механизмы трансгеноза

1.4.5. Экспрессия генных конструкций

1.4.6. Выведение линий трансгенных животных

1.4.7. Особенности роста трансгенных животных

1.4.8. Активация эмбрионального генома

1.4.9. Перспективы использования трансгенных животных 78 1.5. Заключение к обзору литературы

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

2.1. Материал исследования

2.2. Приготовление препаратов митотических хромосом 87 2.2.1 .Получение препаратов митотических хромосом из культуры эмбриональных фибробластов кур

2.2.2. Приготовление препаратов хромосом из клеток костного мозга

2.2.3. Культивирование лейкоцитов периферической крови и приготовление препаратов хромосом

2.3 Метод авторадиографии

2.3.1. Применение авторадиографии для исследования репродукции хромосом.

2.3.2. Анализ радиоавтографов

2.3.3. Авторадиографический анализ зигот кроликов и получение ультратонких срезов

2.4. Методы, выявляющие линейную дифференцированность хромосом

2.4.1. G-окраска хромосом кур и свиней

2.4.2. RBA-окраска хромосом кролика

2.5. Деиситометрия

2.6. Морфометрический анализ и статистическая обработка материала

2.7. Кариотипирование хромосом кроликов и свиней

2.8. Получение вазектомированных кроликов

2.9. Получение зародышей кролика на стадии двух пронуклеусов

2.10. Подготовка доноров и реципиентов свиней

2.11. Метод микроиньекции генов в пронуклеусы зигот

2.12. Трансплантация зародышей

2.13. Получение эмбрионов коров in vitro

2.13.1. Созревание ооцитов in vitro

2.13.2. Оплодотворение ооцитов коров in vitro и получение зигот

2.13.3. Культивирование in vitro эмбрионов коров

2.14. Методы, используемые при анализе экспрессии репортерных генов

2.14.1 .Экспрессия GFP-гена

2.14.2. Экспрессия LacZ гена

2.15. Скрининг трансгенных животных

2.16. Генетические конструкции, использованные для микроиньекции в ранние эмбрионы

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Морфометрический анализ макрохромосом кур

3.1.1. Размеры и морфология макрохромосом кур

3.1.2. Аберрации хромосом у эмбрионов кур

3.1.3. Влияние криоконсервации и сроков хранения семени на частоту и спектр хромосомных аберраций у кур

3.2. Линейная дифференцированность хромосом кур

3.2.1. Характеристика G-полос в макрохромосомах кур

3.2.2. Картирование G-полос первой пары аутосом домашних кур

3.3. Репродукция хромосом кур

3.3.1. Определение параметров G2- и S- периодов

3.3.2. Включение 3Н-тимидина в макро- и микрохромосомы цыплят 136 3.3.2.1.Репродукция хромосом кур в культуре эмбриональных фибробластов

3.3.3. Межхромосомная асинхронность синтеза ДНК

3.3.3.1. Межхромосомная асинхронность репликации ДНК в эмбриональных фибробластах кур

3.3.3.2. Межхромосомная асинхронность репликации ДНК в клетках костного мозга цыплят

3.3.4. Внутрихромосомная асинхронность синтеза ДНК

3.3.4.1. Внутрихромосомная асинхронность репликации ДНК в начале S-периода

3.3.4.2. Внутрихромосомная асинхронность синтеза ДНК в конце S-периода

3.3.5. Взаимосвязь линейной структуры хромосом с внутрихромосомной асинхронностью репликации ДНК на примере 1-й аутосомы кур

3.4. Характеристика репликационной активности генома кролика методом RBA-маркирования

3.4.1.Идентификация хромосом кролика и кариотипирование

3.4.2. Характеристика репликационной активности генома кролика во второй половине S-периода

3.4.3. Сравнительная характеристика хромосом разных уровней конденсации

3.5.Первый раунд репликации ДНК в пронуклеусах кроликов

3.6. Перенос генов соматотропной оси в зиготы кроликов

3.6.1. Получение ранних эмбрионов на стадии зиготы с оценкой их качества

3.6.2. Влияние процесса микроинъекции и величины микроигл на выживаемость эмбрионов

3.6.3. Влияние различных манипуляций, включая трансплантацию, на жизнеспособность зародышей до момента рождения

3.6.4.Анализ интеграции генетических конструкцций

МТ-1 / bGH и МТ-1 /hGRF в геном кроликов

3.6.5. Фенотипические показатели трансгенных кроликов с перенесенными генами hGRF и bGH

3.6.6. Характер наследования трансгенов hGRF и bGH и фенотипический анализ

3.6.7. Изучение стабильности генома кроликов, полученных из эмбрионов, в которые микроинъецировали генную конструкцию МТ-1 /hGRF.

3.7. Введение гена рилизинг фактора гормона роста человека в оплодотворенные яйцеклетки свиней с последующим генетическим анализом

3.7.1. Получение ранних эмбрионов свиней и оценка их качества

3.7.2 Визуализация пронуклеусов и микроинъекция генной конструкции hGRF в зиготы свиней

3.7.3. Гибридизационный анализ интеграции гена hGRF в геном свиней

3.7.4. Фенотипические показатели трансгенных свиней

3.7.5. Цитогенетический анализ и изучение уровня стабильности генома свиней, полученных из эмбрионов, в которые микроинъецировали ген hGRF

3.7. Экспрессия репортерных генов у доимплантационных зародышей сельскохозяйственных животных

3.7.1. Экспрессия генов Lac Z у ранних эмбрионов кроликов

3.7.2. Экспрессия GFP гена у эмбрионов коров, полученных in vitro

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональная организация хромосом и изменение генома у трансгенных сельскохозяйственных животных"

Актуальность проблемы. Исследования по теме диссертации проводили в рамках федеральной целевой программы фундаментальных и прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации. Государственный регистрационный номер НИР 01.200.118849.

Анализ кариотипов и идентификация хромосом позволили выявить наследственные аномалии животных и человека, создавать хозяйственно-ценные гибриды. Изучение типов хромосомных перестроек показали взаимосвязь структуры и функции хромосом, что послужило основой создания одного из тест систем мутагенной активности различных агентов, а также осуществлять цитогенетический контроль пород домашних животных (Яковлев А.Ф., 1985). Одна из основных функций хромосом - репродукция осуществляется по длине хромосомы и находится в тесной связи с конденсацией и генетической активностью. В метафазной хромосоме эти зоны разновременной репликации разграничены во времени и пространстве. Стабильность репликационной структуры и ее специфичность для каждой хромосомы указывает на высокую упорядоченность укладки хромосомной нити в метафазной хромосоме, строго воспроизводящуюся в ряду клеточных поколений (Захаров и др., 1982).

Репродукция хромосом протекает в S- периоде по строго регламентированной программе, которая определяется как геномными, так и внегеномными факторами. Отклонение отдельных хромосом от стандартной программы синтеза ДНК, как правило, приводит к хромосомным аномалиям. Факт чередования рано и поздно реплицирующихся районов, различный характер их конденсации и ряд других сопутствующих свойств, представляются не случайными и требуют дальнейшего изучения.

Изучение репродукции хромосом кур представляется достаточно удобным по сравнению с другими видами сельскохозяйственных животных в виду того, что в кариотипе птиц наряду с хорошо идентифицирующимися макрохромосомами присутствуют микрохромосомы. Сведения о репродукции хромосом кур весьма скромные и не дают полного представления об интенсивности этого процесса в течение S-периода.

Последние два десятилетия характеризуются значительными успехами в области направленной генетической трансформации клеток животных. Трансформация генома стала возможной благодаря достижениям генной инженерии, а также использованию новых методов переноса генетической информации как в соматические клетки, так и в зародыши млекопитающих и птиц. Успехи экспериментальной эмбриологии в выделении яйцеклеток животных, культивировании, трансплантации и манипуляции с эмбриональными клетками, позволили разработать системы, используемые в опытах по генетической трансформации. Ценность таких опытов заключается в возможности получения трансгенных животных с измененным генотипом, фенотипом и передачи трансформированных признаков потомкам.

Существует несколько достаточно надежных методов генетической трансформации зародышей млекопитающих. В их число входит получение генетических химер, интродукция чужеродных генов в зародыши посредством соматических клеток и спермиев, трансфекция, а также микроинъекция клонированных генов непосредственно в пронуклеусы зигот. Многочисленными работами как отечественных, так и зарубежных авторов показано, что последний из методических подходов более эффективен ( Зиновьева, Эрнст, 2004).

Развитие методов генетической инженерии и исследование структуры нуклеиновых кислот позволило глубже понять механизмы действия генов как у прокариотов, так и у эукариотов, на клеточном уровне и на уровне целого организма. Между тем возникает ряд вопросов о закономерностях структурных перестроек в геноме, о механизмах работы специфических генов в процессе развития эукариотических организмов, о тканевой специфичности и дифференциальной активности групп генов.

В последние годы проблема переноса генетической трансформации перешла в стадию активных поисков возможности практического применения генетической инженерии в медицине и сельскохозяйственном производстве. Так, были получены трансгенные животные с повышенными темпами роста, измененным количеством и качеством молока, шерсти, увеличенной плодовитостью. Создаются животные, которые могут быть источниками органов для ксенотрансплантации, а также животные - биореакторы ценных биологически активных препаратов таких как гемоглобин, фактор свертываемости крови, альфа-антитрипсин, интерферон и др. (Андреева, Тарантул, 2003; Зиновьева, Эрнст, 2004; Cozzi et al., 2000).

Положительные результаты переноса генов в соматические клетки млекопитающих и достижения экспериментальной эмбриологии стимулировало развитие нового этапа - переноса генов на уровне целого организма. С усовершенствованием ряда методик появилась возможность вводить с помощью микроинъекций в одноклеточные эмбрионы гомо- и гетерологичные гены, искусственные конструкции генов, фрагменты хромосом или целые хромосомы и даже целые геномы. Современные методы анализа ДНК позволяют с помощью рестриктаз охарактеризовать структуру донорского гена, интегрированного в геном реципиента, число копий и уровень экспрессии. Усовершенствование методов клонирования и секвенирования предоставили возможность создать рекомбинантные генно-инженерные конструкции, сочетающие в себе целевые гены и регуляторные элементы, позволяющие воздействовать на разные уровни экспрессии генов, усиливая их траскрипционную активность в сотни раз.

Трансгенные организмы оказались ценной, перспективной моделью для изучения различных аспектов во многих областях теоретической и прикладной биологии, таких как исследование структурных особенностей хроматина и индивидуальных различий между генами одного организма и геномами разных организмов. Возможности использования трансгенных животных постоянно расширяются, и накопленная информация в ближайшем будущем найдет применение в биотехнологии и хозяйственной деятельности человека, что очень важно ввиду демографических и экологических кризисов перенаселенной планеты. Степень риска при использовании трансгенных организмов следует учитывать с учетом долговременных интересов жизнеобеспечения общества (Жученко, 2003).

В многочисленных публикациях по трансгенозу в основном констатируются факты получения трансгенных организмов с использованием разных генетических конструкций, но не уделяется достаточное внимание видовым особенностям раннего эмбриогенеза, последствиям микроинъекции зигот с изучением дестабилизации реципиентного генома. Актуальность проблемы генетической трансформации животных, а также недостаточная изученность функционально-структурной организации генома сельскохозяйственных животных и влияния различных факторов на эффективность трансформации определили цели и задачи данного исследования.

Цель работы и задачи исследования. Целью исследования являлось изучение структурно-функциональной организации хромосом у интактных животных, а также у эмбрионов и животных после введения генов соматотропной оси в зиготы разных видов сельскохозяйственных животных. В этой связи в настоящей работе были поставлены следующие задачи:

- провести морфометрический анализ и определить уровень спонтанных аберраций хромосом в эмбрионах кур в норме и при использовании криоконсервированного семени;

- охарактеризовать структурную дифференцированность хромосом кур;

- выявить характер включения 3Н-тимидина в макрохромосомы и микрохромосомы кур с учетом внутри- и межхромосомной асинхронности репликации ДНК;

- показать взаимосвязь линейной структуры хромосом с внутрихромосомной асинхронностью репликации ДНК на примере 1-й аутосомы кур;

- охарактеризовать репликационную активность генома кролика и ее взаимосвязь с процессом конденсации методом RBA-маркирования;

- изучить первый раунд репликации ДНК в пронуклеусах кролика;

- получить трансгенных кроликов и свиней с введенными генами соматотропной оси с учетом анализа интеграции генов, фенотипических показателей, характера наследования трансгенов;

- изучить уровень стабильности генома кроликов и свиней, полученных из эмбрионов, в которые микроинъецировали ген рилизинг фактора гормона роста (hGRF);

- исследовать экспрессию репортерных генов у предимплантационных зародышей сельскохозяйственных животных.

Научная новизна. Впервые детально выявлены скорость и порядок репликации ДНК хромосом кур в течение всего S - периода с регистрацией характера включения 3Н-тимидина через каждый час, что позволило определить относительное содержание ДНК в макрохромосомах (73.7%) и микрохромосомах (26.3%). Репродукция макро- и микрохромосом идет на протяжении всего S-периода, но с преимущественным синтезом ДНК микрохромосом в первой его половине, за исключением W-хромосомы, которая репродуцируется в конце S-фазы. Синтез ДНК в ZZ-хромосомах проходит синхронно в течение всего S-периода. На основе нормализации денситометрических профилей впервые проведено картирование G-полос первой пары аутосом кур с количественной характеристикой длины, локализации и интенсивности окрашивания этих полос. При сопоставлении G-полос с локализацией зерен серебра по длине 1-й хромосомы в начале S-фазы метка преимущественно локализуется в светлоокрашенных зонах, в конце периода синтеза ДНК характер распределения зерен серебра по длине аутосомы полностью совпадает с локализацией темных G-полос. На примере сравнительного анализа RBA-окрашенных хромосом показана взаимосвязь процессов репликации и конденсации хромосом кролика, находящихся на разных уровнях конденсации.

Получены трансгенные кролики и свиньи с интеграцией векторных последовательностей и полноценных копий гена рилизинг фактора гормона роста человека и гормона роста быка, под контролем промотора металлотионеина мыши (МТ-1). Выявлено два ярко выраженных фенотипических эффекта: увеличение и уменьшение массы тела по сравнению со своими сверстниками. Трансгенные потомки первого поколения наследовали способность к замедленному или ускоренному росту. У тансгенных кроликов и свиней наблюдали снижение либидо у самцов, повышенную эмбриональную и постнатальную смертность.

Впервые количественно определена степень дестабилизации генома при воздействии чужеродных генов (частота микроядер и множественные ассоциации хромосом) у животных, полученных из зигот с введенными экзогенными генами.

Теоретическая и практическая ценность работы. Теоретическая значимость представленной работы заключается в получении достаточно полной картины репродукции хромосом кур в течение S-периода. Скорость синтеза ДНК макрохромосом и микрохромосом кур в S-фазе изменяется в узких пределах с перепадом около 12%. Интенсивность репликационных процессов значительно (на три четверти) снижается в конце S-фазы. Показана низкая индивидуальная изменчивость скорости синтеза ДНК в макрохромосомах. Подтверждена связь внутрихромосомной асинхронности репликации ДНК с линейной (блочной) дифференцированностью и процессом конденсации хромосом. На одноклеточной эмбриональной стадии вскрыта взаимозависимость асинхронного синтеза ДНК в пронуклеусах и морфологических изменений в процессе роста и развития, выявлены два типа хроматина, отличающихся по времени репликации ДНК.

При введении генов соматотропной оси в зиготы и ранние эмбрионы кроликов и свиней получена устойчивая интеграция экзогенного материала в геноме реципиентов с появлением новых фенотипических признаков, наследуемых в ряду поколений. Трансгенные кролики передавали ген рилизинг фактора гормона роста потомству первого поколения с частотой 50%.

Практическая значимость диссертационной работы состоит в совершенствовании приемов приготовления препаратов хромосом из тканей ранних эмбрионов кур и количественной оценки результатов дифференциального окрашивания, которые необходимы для проведения цитогенетического контроля племенных животных, линий и пород, ветеринарной цитогенетики и картировании хромосом.

Приемы использования репортерных генов для отбора трансгенных эмбрионов и введение MAR-последовательностей значительно повышают эффективность получения трансгенных животных.

Использование методов определения частоты микроядер и ассоциаций хромосом позволяет судить о степени дестабилизации генома животных с перенесенными генами.

Апробация работы. Материалы исследований были представлены и обсуждены на: научной конференции по птицеводству (Загорск, 1975); всесоюзном симпозиуме по структуре и функции ядра (Алма-Ата, 1977); Ш всесоюзном обществе генетиков и селекционеров (ВОГИС) им. Вавилова (Ленинград, 1977); VII всесоюзном симпозиуме по структуре и функции ядра (Харьков, 1980); IV всесоюзном обществе генетиков и селекционеров (ВОГИС) им. Вавилова (Кишинев, 1981); XXXIII Европейской ассоциации животноводства (Ленинград, 1982); III национальной конференции Болгарии по цитогенетике (Пловдив, 1984); I всесоюзной конференции по цитогенетике сельскохозяйственных животных (Москва, 1985); VI и VIII интернациональных симпозиумах по актуальным проблемам генетики птиц (Чехословакия, Смоленицы, 1985, 1989); на XXV заседании Польского биохимического общества (Торунь, 1989); IV национальной конференции Болгарии по цитогенетике (Враца, 1989); всесоюзном совещании по трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных (Алма-Ата, 1989); международном семинаре по биотехнологии животных (Чехословакия, Нитра, 1990); IV франкочехословацком заседании по теме " от ооцита к эмбриону" (Прага, 1990); V международном симпозиуме по интенсификации получения качественной продукции (Чехословакия, Нитра, 1990); XV и XVI симпозиумах генетических дней Чехословакии (Чешские Будеевицы, 1991, 1992); XIII Чехословацком семинаре по репродукции сельскохозяйственных животных (Липтовский Ондрей, 1992); XVI симпозиуме генетики сельскохозяйственных животных Словакии (Нитра, 1993); международной конференции общества генетиков им. Г. Менделя, посвященной 40-ю двойной спирали ДНК (Чехословакия, Брно,

1993); X интернациональном симпозиуме по актуальным проблемам генетики птиц (Словакия, Нитра, 1993); международном симпозиуме по гликокортикоидным гормонам (США, Санта Барбара, 1993); I всероссийском обществе генетиков и селекционеров (ВОГИС) им. Вавилова (Саратов, 1994); международной конференции по фундаментальным проблемам и перспективам развития животноводства на европейском севере (Петрозаводск, 1996); международном симпозиуме "Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных (Ленинград,

1994); I международной конференции "Молекулярно-генетические маркеры животных" (Киев, 1994); международном симпозиуме "Молекулярная генетика и биотехнология в оценке изменения геномов сельскохозяйственных животных (С.-Петербург, 1994); XIII симпозиуме Польского общества генетиков (Варшава); XXV заседании FEBS (Копенгаген, 1998); конференции, посвященной 80-летию МВА им. Скрябина "Совершенствование племенных и продуктивных качеств животных и птиц " (Москва, 1999); первом Польском конгрессе по биотехнологии (Вроцлав, 1999); II всероссийском обществе генетиков и селекционеров (ВОГИС) им. Вавилова (С.-Петербург, 2000); конференции "Актуальные проблемы биологии в животноводстве", ( Боровск, 2000); международном совещании "Молекулярные фермы" (Франция, Ля Гранд Мотте, 2000); I международном конгрессе по биотехнологии (Москва, 2002); международном симпозиуме "Дни польской науки в России " (С.-Петербург, 2002); XXXXXIII Европейской ассоциации животноводства (Египет, Каир,

2002); 2 -й международной научно-практической конференции "Научно-технический прогресс в животноводстве России - ресурсосберегающие технологии производства экологически безопасной продукции животноводства", (Московская обл., Дубровицы 2003); международной научной конференции "Молекулярная генетика, геномика и биотехнология", (Минск, 2004); III всероссийском обществе генетиков и селекционеров (ВОГИС) им. Вавилова (Москва, 2000); международной конференции "Сохранение генетических ресурсов", (С.-Петербург, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 114 научных работ, в том числе 3 методических рекомендации. Работы опубликованы в материалах международных конференций, журналах: «Генетика», «Зоотехния.», «Цитология», «Цитология и генетика», «Сельскохозяйственная биология», «Folia Biologia», «J. of Reproduction and Fertility», «J. Animal Feed Sci.», «Animal Science Papers and Reports», Сб. научных трудов «Генноинженерные сельскохозяйственные животные » (Министерство науки и технической политики Российской Федерации РАСХН)».

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы из 378 источников, среди которых 298 на иностранных языках. Диссертация изложена на 321 страницах, содержит 36 таблиц, 57 рисунков. Основные положения, выносимые на защиту:

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Козикова, Лариса Васильевна

Выводы

1. Разработаны приемы приготовления препаратов хромосом из тканей 3-х дневных эмбрионов, позволяющие определить уровень спонтанных нарушений хромосом кур. Частота таких нарушений у кур породы леггорн, составила 5.88%.

2. По своим морфометрическим параметрам и по локализации G-полос макрохромосомы кур легко идентифицируются и проявляют гетероморфизм среди гомологов. Проведено картирование G-полос первой пары аутосом с количественной оценкой длины, локализации и интенсивности окрашивания этих полос.

3. Репродукция макро- и микрохромосом кур идет на протяжении всего S-периода с преимущественной репликацией ДНК микрохромосом в первой половине S-фазы, в отличие от W-хромосомы, активно синтезирующейся в конце периода синтеза ДНК. Половые ZZ-хромосомы петухов репродуцируются в течение S-фазы синхронно. По количественной регистрации включения 3Н-тимидина на протяжении всей S-фазы определено относительное количество ДНК в макрохромосомах (73.7%) и микрохромосомах (26.3%).

4. Внутрихромосомная асинхронность синтеза ДНК в течение S-периода тесно связана с особенностями линейной дифференцированности хромосом кур.

5. Методом RBA-окрашивания охарактеризована репликационная активность генома кролика второй половины S-фазы. Показана взаимосвязь процессов репликации и конденсации хромосом кролика на примере сравнительного анализа RBA-окрашенных хромосом, находящихся на разных уровнях конденсации.

6. ДНК - репликативные процессы функционально связаны с морфологическими изменениями в пронуклеусах кролика. В начале S-фазы мужской пронуклеус в своем объеме уступает женскому, но обладает более сильно выраженной репликативной активностью. В середине S-фазы, когда оба пронуклеуса одинаковы по своим размерам, синтез ДНК протекает с одинаково сильной интенсивностью. Во второй половине S-периода мужской пронуклеус становится больше женского, но интенсивность репликации ДНК затухает по сравнению с женским. Выявлены два типа хроматина, которые отличаются по времени репликации ДНК уже на одноклеточной эмбриональной стадии развития.

7. Методом микроинъекции генов соматотропной оси в ранние эмбрионы получены трансгенные животные: 11 трансгенных кроликов с интегрированными генами рилизинг фактора гормона роста человека;

5 трансгенных кроликов, в геноме которых интегрированы векторные последовательности и гены гормона роста быка; 4 трансгенных свиньи, несущих в своем геноме ген рилизинг фактора гормона роста человека.

8. Эффективность переноса генов соматотропной оси у кроликов составила 10,2% к числу родившихся (от 1.9 до 22.2%) или 1.7% к числу трансплантированных эмбрионов (от 0.27 до 4.7%). У свиней эффективность трансгеноза была 15% к числу родившихся или 1.4% к числу трансплантированных эмбрионов.

9. Интеграция рост стимулирующих генов hGRF и bGH в геном кроликов имеет два протвоположно выраженных фенотипических эффекта: увеличение или уменьшение массы тела по сравнению со своими сверстниками. Отрицательными фенотипическими эффектами у тансгенных кроликов и свиней можно считать снижение либидо у самцов, увеличение количества мертворожденных животных, высокая эмбриональная и постнатальная смертность трансгенных кроликов, свиней и их потомков.

10. После интеграции генов hGRF и bGH в геном трансгенных кроликов и свиней трансгенные потомки первого поколения наследовали не только генотип, но и фенотипические особенности, такие как замедленные или ускоренные темпы роста по сравнению с контрольными сверстниками.

11. После введения чужеродных генов, в ранние эмбрионы кроликов, частота эритроцитов с микроядрами у родившихся животных, была в два раза выше в экспериментальной группе по сравнению с контрольной группой, а у свиней - в 3 раза.

12. Впервые показана повышенная способность метафазных хромосом трансгенного хряка с интегрированным геном рилизинг фактора гомона роста человека, находящегося под контролем металлотионеинового гена мыши, к образованию множественных ассоциаций хромосом.

13. У кроликов начало активации экспрессии гена Lac Z, под контролем CMV-промотора выявлено на стадии 6-бластомеров, а под контролем SV-40 промотора - на стадии 4-бластомеров.

14. У трансгенных эмбрионов обнаружена экспрессия репортерных генов, как во всех клетках, так и в отдельных бластомерах, причем интенсивность экспрессии гетерогенна, даже в пределах одного эмбриона. Применение MAR-последовательностей в виде коинъекции приводит к увеличению выхода трансгенных эмбрионов.

15. Регистрация характера экспрессии GFP гена в эмбрионах коров позволяет отбирать только трансгенные эмбрионы, что значительно повышает эффективность трансгеноза.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ И РЕАЛИЗАЦИЯ

РЕЗУЛЬТАТОВ.

Полученные результаты позволили расширить понимание клеточных механизмов структурно-функциональной организации хромосом кур, кроликов и свиней в норме и после введения чужеродных генов на ранних стадиях развития.

На основе материалов диссертации разработаны методические рекомендации по исследованию хромосом, дифференциальной окраске и использованию приемов генетической инженерии для оценки изменения генома сельскохозяйственных животных, которые могут найти применение в различных молекулярно-цитогенетических лабораториях, а также методологию и полученные результаты могут использовать специалисты, работающие в области биотехнологии.

Разработанные методы исследования хромосом имеют большую практическую значимость при экологическом мониторинге окружающей среды, оценке племенных животных и при применении различных технологий в сельском хозяйстве.

При практическом использовании животных, которым были микроинъецированы чужеродные гены, необходимо проведение цитогенетического мониторинга. Применение репортерных генов и MAR-последовательностей повышают выход трансгенных эмбрионов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Хроматиновая организация ядра является эволюционно консервативной и отражает структурно-функциональную организацию генома. В течение клеточного деления геном клеток подвергается значительным структурным изменениям, особенно в течение митоза от его начала до сегрегации.

Известно, что все клетки эукариотов проходят клеточный цикл, который контролируется большим комплексов белков, центральными из которых являются циклины, специфичные для каждой фазы. Разно дифференцированные ткани характеризуются индивидуальными особенностями клеточного цикла, т.е. длительность периодов митотического цикла зависит от стадии развития и типа дифференцировки клеток.

Одна из важнейших функций хромосом - это удвоение генетической информации в S-периоде, при этом, синтез ДНК начинается полилокально и одновременно во всех хромосомах набора. Следует подчеркнуть, что каждая хромосома обладает специфичной репликационной структурой, по-видимому, стабильной для данного типа клеток. Наличие внутрихромосомной асинхронности репликации ДНК тесно связано с ее линейной дифференцированностью. Межхромосомная асинхронность синтеза ДНК, как правило, более выражена к концу S-периода.

Необходимо отметить, что уже на уровне сегментов хромосом существуют временные закономерности репликации, выражаемые как удвоение участков хромосом в определенные промежутки S-фазы и в определенном порядке. Геном птиц является уникальным по своей структуре среди теплокровных животных наличием микрохромосом. Синтез ДНК в микрохромосомах завершается, как правило, раньше, чем в макрохромосомах. Почти у всех изученных видов птиц отмечен синхронный характер редупликации ZZ-хромосом и позднее время синтеза W-хромосомы самок.

Наличие эу- и гетерохроматина в хромосомах отражено в такой функциональной характеристике, как репликация ДНК. Известно, что для гетерохроматина характерно позднее завершение репликации. G-диски также характеризуются поздним завершением репликации, но эти структуры хромосом были названы интеркалярным гетерохроматином, к свойствам которого относят повышенную способность к негомологичному спариванию, чувствительность к индуцированным разрывам, обогащенность умеренно повторяющимися блоками нуклеотидов (Henning, 1999). Репликация ДНК является высоко контролируемым и координированным процессом, необходимым для поддержания генома (Waggener, 2002).

В настоящее время - эра хромосомной инженерии, которая находит применение в области генотерапии, функции генов, геномной организации, введения в геном генов и хромосом в сочетании с методами цитогенетики. При введении чужеродной генетической информации непосредственно в геном эукариотов важно получение устойчивой интеграции и функционирования экзогенного материала в геноме реципиента с появлением новых признаков, наследуемых в ряду поколений. При этом наиболее приемлемой является ранняя предъимплантационная эмбриональная стадия развития организма. Таким образом, при трансгенозе идет модификация генома на уровне индивидуальных генов.

Чужеродные гены вводят в зародышевые клетки животных с помощью, рекомбинантных молекул ДНК, содержащих сигналы репликации и транскрипции. Наличие интегрированного трансгена определяют у родившихся животных, абортированных плодов или эмбрионов по присутствию в их геноме последовательностей ДНК донорского типа методами дот- блот-гибридизации по Саузерну.

Показано, что прокол пронуклеуса и микроинъекция генно-инженерных конструкций достоверно снижают жизнеспособность эмбрионов по сравнению с контролем. Отмечено, что у потомства животных, развившихся из таких зигот, значительно возрастает количество различных аномалий тканей, повышается частота рождение не жизнеспособных потомков.

Чужеродные гены, как и собственные, могут активироваться в соответствующие периоды онтогенеза в одной или во многих тканях. Следует учитывать, что при экспрессии одного и того же чужеродного гена трансгенные животные отличаются по месту локализации его в геноме, и представляют собой два уникальных животных, отличающихся друг от друга по ряду свойств, среди которых стабильность трансгена, характер и степень их экспрессии.

Для изучения экспрессии на разных этапах онтогенеза удобно использовать репортерные гены, индукцию экспрессии которых можно вызвать либо методами гистохимии, либо под влиянием ультрафиолета с определенной длиной волны. Наиболее распространен ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), выделенного из медузы Aequorea victoria. Экспрессия этого гена проявляется в стабильной флуоресценции под ультафиолетовым светом. Усиление экспрессии генов приобретает большое значение в трансгенозе. Показано, что MAR/SAR элементы в ряде случаев обладают эффектом энхансеров. У трансгенных эмбрионов выявлен мозаичный и 100% паттерн экспрессии.

В ряде случаев интродукция генов соматотропной оси в геном млекопитающих приводит к изменению фенотипа. Эти исследования показали, что вес и скорость роста животных можно увеличить в 1.5-2 раза за счет экспрессии трансгена. У трансгенных сельскохозяйственных животных также отмечен эффект отставания роста при экспрессии чужеродных генов. У сельскохозяйственных животных эффективность получения быстро растущих трансгенных животных значительно ниже, чем у лабораторных. Наблюдали как отсутствие интенсивности роста и развития, так и значительно опережающих по весу и росту контрольных сверстниц трансгенных кроликов и свиней с эффективной экспрессией генов гормона роста и рилизинг фактора гормона роста.

Выведение трансгенных линий животных показало, эти животные передавали ген рилизинг фактора гормона роста потомству с частотой до 50%. Тем не менее, чужеродный ген гормона роста экспрессировался не у всех потомков, при этом часто животные обладали пониженной плодовитостью или были стерильными.

В настоящее время МТ (микроядерный тест) и цитогенетический анализ используют в целях биомониторинга. МТ, как показатель геномной нестабильности, особенно актуален при введении в геном чужеродных генетических конструкций и изучении их воздействий на геном трансгенных животных и их потомков. Частота эритроцитов с микроядрами была в 2-3 раза выше (Р<0.001) в экспериментальной группе по сравнению с контрольной группой. Эти данные указывают на достоверное повышение кариотипов с генетическими нарушениями в соматических клетках, полученных из эмбрионов, которым были введены рекомбинантные молекулы ДНК с геномами соматотропной оси.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Козикова, Лариса Васильевна, Санкт-Петербург-Пушкин

1. Андреева JT.E. Получение трансгенных лабораторных и сельскохозяйственных животных методом микроинъекции генов в зиготы и эмбрионы. // Автореф. Дисс. канд. биол. наук: Инст. Мол. Ген. АН СССР. М. 1989. С. 17.

2. Андреева J1.E., Хайдарова Н.В., Солодухина Л.И. Эксперименты по микроинъекции гена рилизинг фактора человека в зиготы и эмбрионы свиней. //Докл. ВАСХНИЛ. 1990. №7. С.46-51.

3. Андреева J1.E., Тарантул Трансгенные животные. // Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Наука. М. 2003. С.184-217.

4. Вайсман Б.Л., Голинский С.И., Каледин А.С. и др. Опыты по интеграции в геном мышей клонированных генов тимидинкиназы вируса герпеса и SV-40. // В кн.: Молекулярные механизмы генетических процессов . V Всесоюзн. симпоз. Тез. докл. М. 1983. С. 12.

5. Вайсман Б.Л., Голинский Г.Ф. Общие закономерности и контролирующие механизмы раннего эмбриогенеза млекопитающих в норме и патологии. // Сб. научных работ под ред. А.П. Дыбана, Л. 1985. С.108-114.

6. Вайсман Б.Л., Голинский С.И., Каледин А.С. и др. Трансформация генома мышей с помощью микроинъекции гена тимидинкиназы вируса герпеса в оплодотворенные яйцеклетки // Молекулярная генетика, микробиол. и вирусол. 1986. №3. С.28-34.

7. Газарян К.Г., Тарантул В.З. Элементы генома, регулирующие транскрипцию структурных генов у эукариот. // Онтогенез. 1985. Т. 16. №4. С.325-345.

8. Газарян К.Г., Андреева Л.Г., Серова И.А. и др. Получение трансгеннык кроликов и мышей, содержащих ген гормона роста быка. // Молекулярная генетика. 1988. №10. С.23-26.

9. Газарян К.Г., Андреева Л.Г., Кузнецов Е.Н. и др. Получение трансгенного кролика, несущего транскрибирующийся ген рилизинг фактор гормона роста человека. // Докл. АН СССР. 1989. Т.305. №3. С.726-728.

10. Гиндилис В.М. Митотическая спирализация хромосом и кариограмный анализ у человека.// Цитология. 1966.Т.8.№2. С. 144-156.

11. Голденкова И.В. Репортерные системы: возможности для изучения различных аспектов регуляции экспрессии генов. // Успехи соврем, биол. 2002. Т.122. №6. С.515-526.

12. Гольдман И.Л., Эрнст Л.К., Гоголевский П.А. Теоретические вопросы получения трансгенных животных. Эксперименты на кроликах. // Сельхоз. биол. 1995. №1. С.93-103.

13. Городецкий С.И., Дыбан А.П., Вайсман Б.Л. Стимуляция и торможение роста мышей, несущих ген гормона роста человека. // Бюлл. Эксперим. Биол. и мед. 1986. Т. 101. №6. С.698-702.

14. Дмитриев С.Д., Захаров В.М. Оценка цитогенетического гомеостаза в природных популяциях некоторых видов мелких мышевидных грызунов. // Онтогенез. 2001. Т.ЗЗ. №6. С.447-454.

15. Дыбан А.П., Баранов B.C. Современные проблемы оогенеза// М. Наука, 1977. С.200-233.

16. Дыбан А.П., Городецкий С.И. Трансгенные млекопитающие: изучение фенотипических эффектов гормона роста человека, интродуцированного животным. // Биотехнология. 1987. Т.З. № 3. С.352-357.

17. Дыбан А.П. Цитогенетика раннего развития млекопитающих. // Институт экспериментальной медицины на рубеже тясячелетий. С.-Петербург. Наука. 2000. С.228.

18. Дыбан А.П. Клеточные механизмы начальных стадий эмбриогенеза млекопитающих. // Цитология. 2001. Т.43. №1. С.345.

19. Живаго П.И. Исчерпываются ли изменения кариотипа в онтогенезе сменой гапло- и диплофазы? // Зоол. Ж. 1934. Т. 13. с.473-484

20. Жигачев А.И. Ветеринарная цитогенетика и ее значение для повышения уровня воспроизводства животных. // Матер. Международной конференции по акушерству, гинекологии и биотехнологии воспроизводства животных. С.Петербург. 2001. С.64-66.

21. Жимулев И.Ф., Беляева Е.С. Гетерохроматин, эффект положения гена и генетический сайленсинг. // Генетика. 2003. Т.39. №.2. С. 187-201.

22. Жинкин JI.H. Радиоактивные индикаторы в гистологии. Труды ИЭМ АМН СССР. Л., 1959. С.5-33.

23. Жинкин JI.H. Руководство по цитологии.// М. Наука. 1966. Т.2. С.244.

24. Жученко А.А. Голь генетической инженерии в адаптивной системе селекции растений // Сельхоз. биол. 2003. №1. С.3-33.

25. Завадская Е.С., Захарова Е.С., Кадулин С.Г., Кибардин А.В., Киселев С.В., Гнучев Н.В. Получение рекомбинантного эндостатина в молоке трансгенных мышей. // Генетика. 2001. Т.37. №9. С. 1207-1212.

26. Захаров А.Ф. Хромосомы человека ( проблемы линейной организации) // М. Медицина. 1977. С.57-69.

27. Захаров А.Ф., Бенюш Б.Н., Кулешов Н.П., Барановская Л.И. Атлас хромосом человека. М.: Медицина. 1982. 263 С.

28. Зиновьева Н., Безенфельдер У., Мюллер С., Эрнст Л.К., Брем Г. Исследование экспрессии IGF-1 человека у трансгенных кроликов. Биотехнология 1998, №1.С 3-5.

29. Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К., Брем Г. Трансгенные животные и возможности их использования. // 2000. ВИЖ, С. 128.

30. Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К. Проблемы биотехнологии и селекции сельскохозяйственных животных. // 2004. Москва. С.316

31. Евсиков А.В., Соломко А.П. Уровни и характер трансляции у доимплантационных зародышей мыши с подавленным цитокинезом. // Онтогенез. 1999. Т.30. №2. С. 103-109.

32. Епифанова О.И. Терских В.В. Радиоавтография. // М. Высшая школа.

33. Ефремов В.И. Кинетика пролиферации и клеточного цикла в раннем эмбриогенезе куриного зародыша.// Симпоз. По теме: клеточный цикл. JI. 1978.

34. Инин Ю.С., Хахан Ю.В., Бенюш В.Ф. Денситометрический комплекс для исследования криволинейных биоструктур.// Мед. Техника. 1975. Т.6, С.8-11.

35. Кафиани К.А., Костомарова А.А. Информационные макромолекулы в раннем развитии животных. // М. Наука. 1978.

36. Козикова Л.В., Медведев С.Ю., Попов А.В., Андреева Л.Е., Росохацкий С., Булла И., Яковлев А.Ф. Получение трансгенных животных. // Зоотехния. 2000. №11. С.12-13.

37. Конюхов Б.В., Платонов Е.С. Геномный импринтинг у млекопитающих. // Генетика. 2001. Т.37. №1. С.5-17.

38. Корнберг А. Синтез ДНК.// М. Мир. 1977.

39. Кочнева М.Л. Соматическая хромосомная нестабильность у свиней в норме и при патологии. // Сельхоз. биол. 2003. №2. С.69-72.

40. Кузнецов А.В., Кузнецова И.В. Связывание экзогенной ДНК pRK3/lacZ сперматозоидами кролика, ее перенос в ооциты и экспрессия в доимплантационных эмбрионах. // Онтогенез. 1995. Т.26 №4. С.300-309.

41. Кузнецова Т.В., Баранов B.C. Современные цитогенетические методы в пренатальной диагностике. // В кн. «Современные методы диагностики наследственных болезней». М. РАМН. 2001. С.48-60.

42. Лакин Г.Ф. Биометрия // М. Высш. Шк. 1980.

43. Лиманский А.П. Атомно-силовая микроскопия: от визуализации молекул ДНК и белков до измерения силы межмолекулярных взаимодействий. // Успехи соврем, биол. 2003. Т.123.№6. С.531-542.

44. Ломакина Л .Я. Регуляция биосинтеза ДНК в митотическом цикле. Клеточный цикл.// М. Наука. 1973. С.9-37.

45. Льюин Б. Гены.// М. Мир. 1987. С.396-429.

46. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование // М. Мир. 1984. 479 С.

47. Омельянчук Л.В., Трунова С.А., Лебедева Л.И., Федорова С.А. Основные события клеточного цикла, их регуляция и организация. // Генетика. 2004. Т.40. №3. С.393-310.

48. Островерховая Н.В., Назаренко С.А., Лебедев И.Н., Черемных А.Р. Детекция анеуплоидии у спонтанных абортусов методом сравнительной геномной гибридизации // Генетика. 2002. Т.38. №12. С. 1690-1698.

49. Попова Е.А., Кривохарченко Ф.С., Вильянович Л.И. Развитие мышиных эмбрионов in vitro при различных вариантах микроинъекции. // Онтогенез. 2002. Т.ЗЗ. №2. С.107-110.

50. Прыжкова М.В., Закива И.Г., Кибардин А.В., Георгиев Г.П., Киселев С.В. Использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток для получения трансгенных животных. // Генетика. 2004. №3. С.311-315.

51. Прокофьев М.И., Городецкий С.И., Мезина М.Н., Юткин Е.В., Елагин В.В., Косоруков B.C. Получение трансгенных кроликов с геном тканевого активатора плазминогена. // Докл. РАСХН. 2002. №6. С.35-37.

52. Прокофьева-Бельговская А.А., Слезингер С.И. Репродукция хромосом в первичной культуре эмбриональных фибробластов человека.// Генетика. 1967. Т.П. С.56-67.

53. Прокофьева-Бельговская А.А. Репродукция хромосом. // Успехи современной генетики .1971 Т.З. С.80-99.

54. Разин С.В., Вербовая JI.B., Гольдман И.Л. Новые подходы к созданию трансгенных животных с высоким уровнем тканеспецифической экспрессии чужеродных генов: конструирование и реконструкция геномных доменов // Генетика. 2000. Т.36. С.1443-1455.

55. Разин С.В. Инициация репликации ДНК у высших зукариот. // Генетика.2003. Т.39. №.2. С.173-181.

56. Родионов А.В. Цитогенетика доместицированных птиц: физические и генетические карты хромосом и проблемы эволюции кариотипа // Автореф. Дисс. на соиск. уч. ст. докт. биол. наук. С.-Петербург. С.-Петербургский Гос.Университетет. 2001. С. 42.

57. Роджерс 3. Авторадиография. М.: Атом издат. 1972 Свердлов Е.Д. Введение в проблемы и перспективы молекулярной генетики. // Наука. М. 2003. С.3-14.

58. Серов О.Л., Матвеева Н.М. Генетическая модификация генома животных на уровне хромосом. //Успехи соврем. Биол. 2001. Т.121. №4. С.388-398. Серов О.Л. Генный и хромосомный контроль развития. // Онтогенез.2004. Т.35. №4. С.245-253.

59. Серова И.А., Андреева Л.Е., Семенова Л. А. Повреждающие действия микроманипуляционной техники, примененной для трансгенеза на развитие мышей. // Рабочее совещание «Криоконсервация генетических ресурсов». Сб. докладов. Пущино. 1998. С. 100-113.

60. Сизов А.А., Лебедев Л.Р., Масычева В.И. Разработка вирус-подобной конструкции для рецептор-опосредовательного транспорта гена чГ-КСФ в клетках костного мозга in vivo. // Биотехнология. №1. С. 13-18.

61. СькстеН.И., Сьенсте Т.Г. Факторы транскрипции и ядерный матрикс. // Молек. Биол. 2001. Т.35. №5. С.739-749.

62. Соколова О.И., Погосьянц Е.Е. Кариотип джунгарсного хомячка Phodopus singorus Pall при дифференциальной окраске хромосом. // Цитология. 1974. Т.16. №10. С.1303-1305.

63. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. // М. Мир. 1998. С.369. Сысоев B.C., Александров В.Н. Кролиководство// М. Агропромиздат. 1985. С. 272.

64. Трофимов И.Е., Тиняков Г.Г. Кариотип фазана (Phassianus colchicus) и его сравнение с кариотипом домашней курицы (Gallus domesticus). // Биол. ж. 1933. Т.2. С.33-44.

65. Трофимова J1.B., Яковлев А.Ф. Изменение числа микрохромосом в процессе спирализации макрохромосом. // Генетика. 1977. Т. 13. №5. С.806-810.

66. Хейр А., Разин С.И., Васецкий Е.С. Изменения организации хроматина в раннем развитии и при канцерогенезе. // Онтогенез. 2002. Т.ЗЗ. №2. С.85-89.

67. Хлиманков Д.Ю., Речкунова Н.И., Лаврик О.И. Репликационный комплекс эукариот: изучение структуры и функции методом афинной модификации. // Биохимия. 2004. Т.69. Вып. 3. С.311-327.

68. Холпер Д. Однослойные и суспензионные культуры клеток.//В кн. Методы вирусологии и молекулярной биологии. М. Мир. 1972. С.9-19.

69. Шаталкин А.И. Высший уровень деления в классификации организмов. // Ж. Общей Бил. 2004. Т.65. №1. С. 19-38.

70. Шафей Р.А., Зеленина И.А.Б Семенова М.С. и др. Активность экзогенных генетических конструкций, введенных в клетку методом баллистической трансфекции в онтогенезе мыши. // Онтогенез. 2000. Т.31. №5. С.388-394.

71. Шевелуха B.C. Биотехнология и биобезопасность. // Сельхоз. Биол. 2002. №3. С.3-15.

72. Эрнст Л.К. Проблемы взаимодействия между генотипом и фенотипом у трансгеннных сельскохозяйственных животных. // Сельхоз. Биол. 2001. №2. С.3-9.

73. Эрнст JI.K., Зиновьева Н.А., Брем Г. Современное состояние и перспективы использования трансгенных технологий в животноводстве. // В кн. М. 2002. С.54.

74. Эршлер М.А., Дризе Н.И., Нифонтова И.Н., Терских А.В., Чертков И.Л. Лентивирусный вектор способен к интеграции в геном, так и к существованию и репликации в клетке в виде эписомы. // Бюлл. Эксперим. Биол. и Мед. 2003. Т. 135. №2. С.190-193.

75. Яковлев А.Ф., Трофимова Л.В. Изменение числа микрохромосом в процессе спирализации макрохромосом у Gallus domesticus. // Генетика. 1977. Т.13. №5. С.806-810.

76. Яковлев А.Ф., Березкин В.И. Способ нормализации денситометрических профилей хромосом.// Бюлл. ВНИИ генетики и разведения с.х. животных. 1978. Вып.ЗО. С. 18-22.

77. Al-Shavi R., Kinnaird J., Burke J., Bishop J. Expression of foreign in a line of transgenic mice is modulated by a chromosomal position effect. // Mol. Cell Biol. 1990. V.10. P.l 192-1198.

78. Aladjem M.I., Rodewald L.W., Kolman J.L., Wahl G.M. Genetic dissection of a mammalian replicator in the human B-globin locus // Science. 1998. V.281. P. 1005-1009.

79. Alam G., Cook J.L. Reporter genes: Application to the study of mammalian transcription//Anual. Biochem. 1990. V.188. P. 245-257.

80. Anderson R., Krakauer Т., Camerini-Otero D. DNA metilated gene transfere: recombination between co-transformed DNA sequences and recovery of recombinant in a plasmid. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1982. V.79. P.2748-2752.

81. Anglana M., Apiou F., Bensimon A., Debatisse M. Dynamics of DNA replication in mammalian somatic cells: nucleotide pool modulates origin choice and interorigin spacing. // Cell. 2003. V.l 14. P.385-394.

82. Arrighi F.E., Hsu T.C. Localization of heterochromatin in human chromosomes. // Cytogen. 1971. V. 10. P.81 -86.

83. Arukov Y.G., Wang Y., Belmont A.S. Engineered chromosome regions with altered sequence composition demonstrate heirachical large-scale folding within metaphase chromosome. //J. of Cell Biol. 2003. V.162. P.23-35.

84. Avery O.T., MacLeod C.M., McCarty M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of Pneumococcal types. // J. Exp. Med. 1944. V.79. P.137-158.

85. Baarends W.H., Grootegoed J.A. Chromatin dynamics in the male meiotic prophase. //Cytogen. Genome Res. 2003. V.103. P.225-234.

86. Bak P., Bak A., Zeuthen J. Characterization of human unit fibers. // Chromosoma. 1979 V.73. P.301-315.

87. Barbie D.A., Kudlow B.A., Frock R., Zhao J., Johnson B.R., Dyson N., Hrlow E., Vennedy B.K. Nuclear reorganization of mammalian DNA synthesis prior to cell cycle exit. // Molec. And Cell Biol. 2004. V.24. P.595-607.

88. Bartova E., Kuzubek S., Jirsova P. Nuclear structure and gene activity in human differetiated cells. //J. Structural Biol. 2002. V.139. P.76-89.

89. Behringer R., Mathevs L., Palmiter R., Brinster R. Dwarf mice produced by genetic ablation of growth hormone expressing cells. // Genes Develop. 1988. V.2 P.453-461.

90. Belayeva E.S., Zhimulev I.F. Cytogenetic and molecular aspects of position effect variegation in Drosophila melanogaster. 111. Continuous and discontinuous compaction pf chromosomal material // Chromosoma. 1991. V.100. P.453-466.

91. Belmont A.S., Sedat J.W., Agard D.A. A Three-dimensional approach to mitotic chromosome structure: evidence for a complex hierarchical organization. // J. Cell Biol. 1987. V.105. P.77-92.

92. Berezney R.D., Dubey D., Huberman J.A. Heterogenety of eukaryotic replicons, replicon clusters, and replication foci. //Chromosoma. 2000. V.108. P.471-485.

93. Bianchi N. And Molina O.J. Chronology and pattern of replication in Gallus domesticus. // Chromosoma. 1967. V.21. P.387-397.

94. Biery К., Bondioli К., De Mao F. Gene transfer by pronuclear injection in the bovine. // Theriogenology. 1988. V.29. P.224.

95. Blacrburn E. Structure and function of telomeres. //Narure. 1991. V.350 P.569-573.

96. Blankenstein T. Gene Therapy: Principles and Application. // Birkhauser Verlag, Basel-Boston-Berlin. 1999.

97. Blou J.J. Control of chromosomal DNA replication in the early Xenopus embryo. // EMBO J. 2001. V.20. N13. P.3293-3297.

98. Bomar J., Moreira P., Balise J., Collas P. Differential regulation of maternal and paternal chromosome condensation in mitotic zygotes. // J. Cell Sci. 2002. V.l 15. P.2931-2940.

99. Bonnerot C., Grimber G., Briand P., Nicolas J. Patterns of expression of position-dependent integrated transgenes in mouse embryo. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.2001. V.87. P.6331-6335.

100. Bosze Z., Hirihi L., Carnwath JW., Niemann H. The transgenic rabbit as model for human diseases as a source of biologically active recombinant proteins. // Transgenic Res. 2003. V.l2. P.541-553.

101. Brem G., Brenig В., Goodman H et al. Gene transfer in rabbits and pigs // 3rd World Condress on Genetics Applied to Livestock Production. 1986. V.12. P.45-51.

102. Brem G. Aspects of the Application of Gene Tranfer as a Breeding Technique for Farm Animals. // Biol. Zent. Bl. 1989. №108. P. 108.

103. Brem G., Muller M. Large transgenic mammals. In: Animal with novel genes // Cambridge, England, Cambridge University Press. 1994. P. 179-244.

104. Bridger J.M. Mammalian artifical chromosomes: modern day feats of engineering- Isambard Kindom Brunei style. // Cytogenet. Genome Res. 2004. V.l07. P.5-8.

105. Brinster R., Chen H., Trumbauer M. Et al. Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of fusion gene into eggs // Cell. 1981. V.27. P.223-231

106. Brinster R., Chen H., Trumbauer M. Et al. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjection of eggs // Proc. Natl. Acad. Sci. 1985. V.82. P.4438-4442.

107. Brockdorff N. X-chromosome inactivation: closing in on proteins that bind Xist RNA //Trends Genet. 2002. V.18. P.352-358.

108. Brown W.R., Mee P.J., Hong S.M. Artifical cyromosomes : ideal vectors? // Trends Biotechnol. 200. V.18 P.218-223.

109. Brunet-Simon F., Henrion C., Renard J., Duraithon V. Onset of zygotic transcribtion and the rabbit embryo. // Mol. Reprod. and Devel. 2001. V.58. P. 127136.

110. Burdon Т., Wall R. Fate of microinjected genes in preimplantation mouse embryos. // Mol. Reprod. and Develop. 1992. V.33. P.436-442.

111. Burt D.W. Origin and evolution of avian microchromosomes // Cytogenet. Genome Res. 2002. V.96. P. 97-112.

112. Buther K., Lo C. High frequency DNA rearrangements assotiated with mouse centromeric satellite DNA. // J. Mol. Biol. 1986. V.187. P.547-556.

113. Carione D.L., Skalnik D.G. CpG binding protein is crucial for early embryonic development. //Mol. and Cell Biol. 2001. V.21. P.7601-7606.

114. Chada K., Margam J., Raphael K. et al. Specific expression of a foreign B-globin gene in erythroid cells of transgenic mice. //Nature. 1985. V.314. P.377-380.

115. Chan F.W.S., Homan E.J., Ballou L.U. Transgenic cattle produced by reverse-transcribed gene transfer into mature oocytes. // Sci. 2001. V.291. P.309-312.

116. Chan P.C., Wong J.K., Shin C.K., Wong F.W., Lam K.L., Chan K.M. Common carp metallothionein-1 gene: cDNA cloning gene structure and expression studies. // Biochimica et Biophys. 2004. V.1676. P.l62-171.

117. Chandra H.S. Proposed role of W chromosome inactivation and the absence of dosage compensation in avian sex determination // Proc. Roy. Soc. Lond. B. 1994. V. 258. P. 79-82.

118. Cho R.J., Huang M., Campbell M.J. Transcriptional regulation and function during the human cell cycle. // Nature Genetics. 2001. V.27 P.48-54.

119. Chuch R. Embryo manipulation and gene transfer in domestic animals. // Tibtech. 1987. №5. P. 13-19.

120. Claussen U., Michel S., Muhling P., Westermann M., Grummt U-W., Klomeyer-hausshild K., Leihr T. Demystifying chromosome preparation for the concept of chromosome condensation during mitosis. // Cytogenet. Genome Res. 2002. V.98 P.136-146.

121. Cleaver J.F. Thymidine metabolism and cell kinetics. Amsterdam. 1967.

122. Clement W.N. DNA replication patterns in the domestic fowl. // Cytologia. 1971.V.36. P.168-172.

123. Cline M., Stang H., Mrcola K. Gene transfer in intact animals. // Nature. 1980. V.284. P.422-425.

124. Coelho P.A., Oueiroz-Machado J., Sunkel C.E. Condensin-dependent localization of topoisomerase II to an asial chromosomal structure is required for sister chromatid resolution during mitosis. J.of Cell Sci. 2003. V.l 16. P.4763-4776.

125. Combus R., Balls M. The use of transgenic animals in the European Union: The report and recomendations of ECVAM workshop 28. // ATLA. 1999. V.27 Supl.l. P.21-43.

126. Committee for the Standardized Karyotype of the Oryctolagus cuniculus: Standart karyotype of the laboratore rabbit, Oryctolagus cuniculus// Cytogenet. Cell Genet. 1981 .V.32.P.240-248.

127. Committee for the Standardized Karyotype of the Domestic Pig: Standart Karyotype of the domestic Pig. // Hereditas 1988. V.l 09. P. 151-157.

128. Connolly C.N., Futter C.E., Gibson A., Hopkins C.R., Cutler D.F. Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cell with с DNA encoding horseradish peroxidase. //J. Cell Biol. 1994. V.l 27. P.641-652.

129. Constantini F., Lacy E. Introduction of a rabbit B-globin gene into the mouse germ line // Nature. 1981. V.294. P.92-94.

130. Cook P.R. The nucleoskeletion and the topology of replication. // Cell. 1991. V.66. P.627-635.

131. Cook P.R. The organization of replication and transcription. // Science 1999. V.284.N 5421. P. 1790-1795.

132. Courcelle J., Hanawalt P.C. Rec A- dependent recovery of arrested DNA replication on forks. //Annu. Rev. Genet. 2003. V.37. P.611-646.

133. Cousens C., Carver F.S., Wilmut J. et al. Use of PCR-based methods for selection of integrated transgenes in preimplantation embryos. // Mol. Reprod. Dev. 1994. V.36. P.384-391.

134. Cozzi E., Soi В., Holmes В., White D. Genetic engineering of the donor as an approach to clinical xenotransplantation. // Transplantant Proc. 2000. V.3. P.2701-2703.

135. CraigJ.M., Bickmore W.A. Chromosome bands- flavours to savour // BioEssays. 1993. V.15. P.344-354.

136. Cremer Т., Cremer C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. //Nat. Rev. Genet. 2001. V.2. P.292-301.

137. Cryderman D.,Cuaycong M., Elgin S., Wallrath L. Characterization of sequences assotiated with position-effect variegetion at pericentric sites in Drosophila heterochromatin. // Chromosoma. V.107. P.277-285.

138. Csink A., Henikoff S. Something from nothing: the evolution and utility of satellite repeats. //TIG. 1998. V.14. P.200-204.

139. Cubitt A.B., Heim R., Adams S.R., Boyd A.E., Gross L.A., Tsien R.Y. Understanding improving and using green fluorescent proteins. // Appl. Gen. 1995. V.1.P.561-573.

140. Cuvier O., Hirano T. A role of topoisomerase II in linking DNA replication to chromosome condensation. // J. of Cell Biol. 2003. V.160. P.645-655.

141. Cyranoski D. Crunch time for Korea's clones. // Nature. 2004. V.429. P.12-14.

142. De Boer L.E. and van Brink J.M. Cytotaxonomy of the Ciconiiformes (Aves), with karyotypes of eight species new to cytology// Cytogenet. Cell Genet. 1982. V.34.P. 19-34.

143. De la Barre, Gerson A.F., Gount V., Creaven M., Allis S.D., Dimitrov S. Core histone N-termini play an essential role in mitotic chromosome condensation. // J. EMBO. V.19. P.379-391.

144. De la Serna I.L., Imbalzano A.N. Unfolding heterochromatin for replication. // Nature Genet. 2002. V.32. P.560-562.

145. Dernburg A., Sedat J., Hawley R. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. // Cell. 996. V.86. P. 135-145.

146. De Wet J.R., Wood K.V., Deluca M., Helsinki D.R., Subramani S. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. // Mol. Cell Biol. 1987. V.7. P.725-737.

147. Di Berardino D., Di Meo C.D. International system for chromosome nomenclature of domestic bovids. // Cytogenet. Cell Genet. 2001. V.92. P.284-299.

148. Dobie K., Nicols A., Rout S. Variegated transgene expression in mouse mammary gland is determined by the transgene integration locus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V.93. P.6659-6664.

149. Dorer D., Henikoff S. Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila cells. // Cell. 1994. V.77. P.993-1002.

150. Dorer D., Henikoff S.Transgene repeat arrays interact with distant heterochromatin and cause silencing in cis- and trans-. //Genetics. 1997. V.147. P.l 181-1190.

151. Dreets M.E., Seuenes H. Quantitation of heterogeneous human heterochromatin: microdensitometric analysis of C- and G- bands. Physiol, and Genet. Reprod. Part "a". New-York-London. 1974. P.29-52.

152. Driel R., Francz P. Nuclear architecture and genome functioning in plants and animals: What can we learn from both? // Exp. Cell Res. 2004. V.296. P.86-90.

153. Droin R., Lemieux N., Richer C.L. Analysis of DNA replication during S-phase by means of dynamic chromosome banding at high resolution. // Chromosoma. 1990. V.99. P.273-280.

154. Drouin R., Richer C.-L. High resolution R-banding at the 1250-band level. Schematic representation and nomenclature of human RBG-banded chromosomes. // Genome. 1989. V.32. P.425-439.

155. Dube J.L., Wang P., Elvin J., Lyons K., Celeste A J. The bone morphogenetic protein 15 gene is X-linked and expressed in oocytes. // Mol. Endocrin. 1998. V.12. P.1809-1817.

156. Duszewska A.M., Reclewski Z., Pienkowski M., Karasiewicz J., Modlinski J.A. Development of bovine embryos on Vero/BRL cell monolayers (mixed co-culture). // Thereogenology 2000. V.54 P. 1239-1247.

157. Dutrellaux B. Nouvean systeme de marguage chromosomigue. Les bandes T // Chromosoma 1973.V.41.P.395-402.

158. Dutrellaux B. Sur la nature et l'origine des chromosomes humains. // L'Expansion Scientifigue. Paris. 1975.

159. Eckhard W., Zakharchenko В., Brem G. Transgenic technology in farm animals- progress and perspectives. // Exp. Physiol. 2000. V.85. P.615-625.

160. Eissenberg J.C., Elgin S. Boundary function in control of gene expression. // Trends. Genet. 1991. V.7. P.335-340.

161. Eissenberg J.C., Ge Y-W., Hartnett T. Increased phosphorylation of HP1, a heterochromatin-associated protein of Drosophila, is correlated with heterochromatin assebly // J. Biol. Chem. 1994. V.269. P.21315-21321.

162. Eissenberg J.C., Wallzath L. Progress in nucleic acid research and molecular biology. // 2003. Acad. Press. Amsterdam, Boston, London, New York, Oxford, Paris, San Diego, Singapore, Sydney, Tokyo. Ed by Moldane K. V.74. P.276-293.

163. Emerson B.V. Specificity of gene regulation. // Cell. 2002. V.109. P.267-270.

164. Evans M., Kaufman M. Establishment in culture of pluripotental cells from mouse embryos. //Nature. 1981. V.292. P. 154-156.

165. Feinberg A., Vogelstein B. A technigue for radiolabelling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity // Analytical Biocem. 1983. V.132. P.6-13.

166. Ferreira J., Paolella G., Ramos C., Lamond A.I. Spatial organization of large-chromosome territories.//J/Cell Biol. 1997. V.l39. P. 1597-1610.

167. Foe V.E., Odell G.M., Edgar B.A. Mitosis and morphogenesis in the Drosophila embryo : point and counter-point // The development of Drosophila melanogaster / Ed. Bate M. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press. 1993. P. 149-300.

168. Folger K., Weng E., Wahl G., Capecehi M. Patterns of integration of DNA microinjected into cultures of mammalian cells: evidence for homologous recombination between injected plasmid DNA molecules. // Mol. Cell Biol. 1982. V.2. P. 1372-1387.

169. Ford C.F. Reading Conference 1980. Proceeding of the first international Conference for the standardization of banded karyotypes of domestic animals. // Hereditas. 1980. V.92. P. 145-162.

170. Frederic J. Contribution a letude du caiyotype ches les poulet. // Archives de Biol. 1961. V.72. P.185.

171. Francoise J., Facan S. DNA replication and nuclear architecture. // J. Biochem. 2002. V.85. P.l-9.

172. Garcia M., O'Sullivan R., Peters A.H., Jenuwlin Т., Blaco M.A. Epigenetic regulation of telomere length in mammalian cells by the Suv39hl and Suv39h2 histone methyltransferases. Nature Genet. 2004. V.36. P.94-99.

173. Gasser S.M. Positions of potential : Nuclear organization and gene expression. // Cell. 2001. V.l04. P.639-642.

174. GiannelliP. Human chromosomes DNA synthesis. // S. Karger, Basel. Munchen. New York. 1970.

175. Gilbert D.M. Replication timing and transcriptional control: beyond cause and effect. // Curr. Opin. Cell Biol. 2002.V.14.P.115-125.

176. Gordon J., Seanclos G., Plotkin D. Et al. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. V.77. P.7380-7384.

177. Gordon J., Ruddle R. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei // Science. 1981. V.214. P.l244-1246.

178. Gordon J., Ruddle. Gene transfer into mouse embryos: production of transgenic mice by pronuclear injection // Methods Enzymol. 1983. V.101. P.411.

179. Gorman C.M., Moffat L.F., Howard B.H. Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells. // Mol. Cell Biol. 1982. V.2. P. 1044-1051.

180. Grahan F., Vander E. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus DNA. Virology. 1973. V.52. P.456.

181. GreallyJ.M., Starr D.M., Hwang S. et al. The mouse HI9 locus mediates a transition between imprinted and non-imprinted DNA replication patterns // Hum. Mol. Genet. 1998. V/7 P.91-95.

182. Griffin D.K., Bridger J.M. ICCXV, 15-th International chromosome conference 5-10 th September, 2004 Brunei University, London, UK. // Cytogenet. Genome Res. 2004. V.107. P.3-4.

183. Grunstein M. Yeast heterochromatin : regulation of its assembly and inheritance by histones // Cell. 1998. V.93. P.325-328.

184. Guiller-Gensik Z., Bernheim A., Coullin P. Generation of whole-chromosome painting probes to each chicken macrochromosome // Cytogenet. Cell Genet. 1999. V.87. P.282-285.

185. Haaf Т., Warburton P., Willard H. Integration of human a satellite DNA into simian chromosomes: centromere protein binding and disruption of proper chromosomal segregation. // Cell. 1992. V.70. P.681-696.

186. Hadjidekova V.B., Bulanova M., Bonassi S., Neri M. Micronucleus frequency is increased in peripheral blood lymphocytes of nuclear power plant workers. // Radiat. Res. 2003. V.160. P.684-690.

187. Hammer R., Palmiter R., Brinster R. Partial correction of murine heredity growth disorder by germ line incorporation of a new gene. // Nature. V.312. P.65-67.

188. Hammer R., Brinster R., Rosenfeld. Expression of human growth hormone-realising factor in transgenic mice results in increasing somatic growth // Nature. 1985. V.315. P.413-416.

189. Hammer R.E., Pursel V.G., Rexroad C. Et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection // Nature. 1985. V.315. P.680-683.

190. Hand R. Eukaryotic DNA: Organization of the3 genome for replication. // Cell. 1978. V.l5. P.317-325.

191. Hartmann S., Goldstein J. Effect of genomic position on expression of transduced copies of the white gene of Drosophila. // Sci. 1980. V.220. P.558-561.

192. Hazekamp A., Cock M., Buning T. Adverse effects of transgenesis in farm animals. Abstr. 3-rd Word Congress on Alternative and Animals use in the Life Scienses, Bolonia 29 aug.-2sept. 1999. P. 152.

193. Heap R. Manipulation of growth and lactation. // Proc. Intrernat. Sympos. Exchanding between countries. England. 1989. №9. P.69-79.

194. Heitz E. Der Bau der somatischen Kerne von Drosophila melanogaster // Z. Indukt Abstammungs-Vererbungslehre. 1930. V.54 P.248-249.

195. Henderson A., Roling D. The effect of exogenous DNA insertion at a chromosomal region containing rDNA. Cytogenet. Cell Genet. 1982. V.34. P.310-314.

196. Hendricke C.A., Almeida K.A., Sfitt M.S., Lonnalogadda V.S., Rugo R.F., Kerrison G.F., Engelwad B.P. Spontaneus mitotic homologous recombination at an direct repeat in transgenic mice. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.2003. V.l00. P.6325-6320.

197. Henning W. Heterochromatin // Chromosoma. 1999. V.l08. P. 1-9.

198. Herbomel P. From gene to chromosome: organization levels defined by the interplay of transcription and replication in vertebrates // New Biol. 1990. V.2 P.937-945.

199. Hilliker A.J., Appels R., Shaler A. The genetic analysis of Drosophila melanogaster heterochromatin // Cell. V.21. P.607-619.

200. Hogan В., Costantini F., Lacy E. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual.// Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1986.

201. Holmes V.F., Cozzareli N.R. Closing the ring lines between SMC proteins and chromosome partitioning condesation and supercoiling. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.2000. V.98. P.1322-1324.

202. Hortmann M., Obe G. CABAND: Classification of aberrations in multicolor banded chromosomes. // Cytogenet Genome Res. 2003. V.103. P.24-27.

203. Howard F. Pelc S.R. Synthesis of desoxyribonucleic acid in normal and irradiated cells and its relation to chromosome breakage. // Heredity. 1953.V.6.P.261-273.

204. Hsiao P., Deroo В., Archer T. Chromatin remodeling and tissue-selective responses of nuclear hormone receptors. // Biochem. and Cell Biol. 2002. V.80. P.343-351.

205. Huberman J. A. and Riggs A.D. On the mechanism of DNA replication in Mammalian chromosomes. // J. Mol. Biol. 1968. V.32. N2. P.327-341.

206. Jaenisch R. Transgenic animals. // Science. 1988. V.240. P. 1468-1474.

207. Jakob K.M. RHA synthesis during the DNA synthesis period of the first cell cycle in the root meristem of germinating Vicia faba. // J. Mol. Biol. 1972. V.72. P.370-377.

208. Juengel J.L., Hudson N.L., Heath D.A. Growth differentiation factor 9 and bone morphogenetic protein 15 are essential for ovarien follicular development in sheep. Biol. Reprod. 2002. V.67. P. 1777-1789.

209. Kafatos F.C., Jones C.W., Efstratiadis B.R. et al. // Nucl. Acids Res. 1979. V.7. P. 680-683.

210. Karpen G. Position effect variegation and the new biology of heterochromatin. // Curr. Opin. Genet. Dev. 1994. V.4. P.281-291.

211. Klehr D., Vefss K. And Bode J. Scaffold-attaches regions from the human interferon beta domain be used to enhance the stable expression of genes under the control of various promoters // Biochem. 1991. V.30. P. 1264-1270.

212. Kornberg R.D., Klug A. The nucleosome. // Sci Am. 1981. V.244. P.52-64.

213. Koshland D., Strunnikov A. Mitotic chromosome condensation. // A Rev. Cell Dev. Biol. 1996. V.12. P.305-333.

214. Kozikova L., Kalashnikova L., Vasicek D., Baurova M., Babuchik P., Bulla J., Skultetyova I., Rafay J., Rashid S. Prenos bGH genu do samcieho projadra zygoty kralika. // XVI Geneticke dny, Cheske Budejovice. 1992. Czechoslovakia.

215. Kreitz S., Ritzi M., baack m., Knippers R. The human origin recognition complex protein 1 dissociates from chromatin during S phase in Hela cells // J. Biol. Chem. 2001. V.276. P.6337-6342.

216. Kucherlapati R., Eves E., Song K.-Y. Et al. Homologous recombination between plasmids in mammalian cells can be enhanced by teratment of input DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V.81. P.3153-3157.

217. Q., Stamatoyannopoulas G. Hypersensitive site the human В locus control region functions as a chromatin insulator//Blood. 1994. V.84. P. 1399-1401.

218. Ma H., Samarabandu J., Devdhar R.S., Acharya R., Cheng P.-C., Meng C., Berezney R. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. // J. Cell Biol. 1998. V.143. P.1415-1425.

219. Mac Gregor J., Heddle J., Hite M. Gudelines for the conduct of micronucleus assays in mammalian bone marrow erythrocytes. // Mutat. Res. Genet. Toxicol. 1987. V.189. P.103-112.

220. McLaren A. The impact of pre-fertilization events on post-fertilization development in mammals. // Maternal effects in development. Ed. By B. Newth, M. Balls. Cambridge. 1079. P.287-320.

221. Malinsky J., Koberna K., Stanek D., Masata M., Votruba I., Raska I. The supply of exogenous deoxyribonucleotides accelerates the speed of the replication fork in early S-phase. // J. Cell Sci. 2001. V.l 14. P.747-750.

222. Manbra D.J., Shu-Cheng Chen, T-Y. Yang, Lira S.A. Leukocytes expressing green fluorescent proteins as novel reagents for adoptive cell transfer and bone marrow transplantation studies. // Amer. J. of Pathology. 2001. V.158. P.41-48.

223. Manders E.M.M., Visser A.E., Koppen A., de Leenw W.C., van-Liere R., BrakenhoffG., van Driet R. Four-dimensional imaging of chromatin dynamics during the assembly of the interphase nucleus. // Chromosome Res. 2004. V.l 1. P.537-547.

224. Manuelidis L. Heterochromatic features of an 11 megabase transgene in brain cells. // Proc. Natl. Acad. USA .1991. V.88. P. 1049-1053.

225. Marguant-Le Guienne D., Gerard M., Solari A., Thibault C. In vitro culture of bovine eggs fertilized either in vivo or in vitro. // Reprod. Nutr. Develop. 1989. V.29. P.559-568.

226. Martin P.C. The pattern of autosomal DNA replication in four tissues of the Chinese hamster. //Exp. Cell Res. 1967. V.45. P.85-95.

227. Martinet W., Schrijvers D.M., Kocks M.M. Nucleofection as an efficient nonviral transfection method for human monocytic cells. // Biotechnol. Sett. 2003. V.25.P.1025-1029.

228. Mathews L., Hammer R., Brinster R. Expression of insulin-like growth factor 1 in transgenic mice with elevated levels of growth hormone is correlated with growth. // Endocrinol. 1988. V.123. P.433-437.

229. Matsui S., Sasaki M. Differential staining of nucleolus organizers in mammalian chromosomes. //Nature. 1973. V.246. P. 148-150.

230. Mayo K., Warren R., Palmiter R. The mouse metallothionein 1 gene is transcriptionally regulated by cadmium following tansfection into human or mouse cells//Cell. 1982. V. 29. P.99.

231. Mayo K., Cerelli G., Lebo R. Gene encoding human growth hormone-releasing factor precursor: sequence, and chromosomal assignment // Proc. Nat. Sci. U.S.A. 1985. V.82. P.63-67.

232. Mazzotti G., Gobbi P., Manzoli L., Falconi M. Nuclear morphology during the S- phase. // Microsc. Res. Tech. 1998. V.40. P.418-431.

233. Mc Farlane P. and Callan H.G. DNA replication in the chromosomes of the chicken Gallus domesticus.//J. Cell Sci. 1973. V.13 N3. P.821-839.

234. Mc Knight C., Hammer R., Kuenrel E. Et al. Expression of the chicken transferrin gene in transgenic mice. // Cell. 1983. V.34. P.335-341.

235. McQueen H.A., Fantes J., Cross S.H., Clark V.H., Archibald A.L., Bird A.P. CpG islands of chicken are concentrated on microchromosomes // Nat. Genet. 1996. V.12. P.321-324.

236. McQueen H.A.,Siriaco G., Bird A.P. Chicken microchromosomes are hyperacetylated, early replicating, and gene rich // Genome Research. 1998. V.8 P.621-628.

237. Melini E., Dominco Т., First N. Transcriptional activity in bovine oocyte and embryos. //Theriogenology. 1998. V.49. P.274.

238. MichalskaA., Vize P., Asham R et al. Gene transfer in pigs. // Proc. Aust. Soc. Reprod. Biol. 1986.

239. Mintz В., Chronmiller C., Mett I. A karyotypically normal in vitro line of developmentally totipotent mouse teratocarcinoma cells. // Somatic Cell Genet. 1981. V.7. P.489-396.

240. Mizuno S., Kunita R., Nakabay-Ashi O., Kuroda Y., Arau N., Harata H., Ogawa A., Itoh Y., Terenishi M. Studies on their gene function in sex determination and sex differentiaton. // Cytogenet. Genome Res. 2002. V.99. P.236-244.

241. Moores J.P., Cai A., Hostettler M.E., Arbogust L.A., Vooght J.L., Hyde J.F. Pituitary hormone gene expression and secretion in human growth hormone-releasing hormone transgenic mice: Focus on lactotroph function. // Endocrinology. 2000. V.141. P.81-90.

242. Moorhead P.S., Nowel P.C., Mellman W.J., Bkattips D.M. Huggerford D.A. Chromosome preparation of leukocytes cultured from human peripheral blood// Exp. Cell Res. 1960. V.20. P.613-615.

243. Morton N.E. Parameters of the human genome. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V.88. P.7474-7476.

244. Muller U., Lalanda M., Donlon T. et al. Moderately repeated DNA sequences specific for the short arm of the human Y chromosome are present in XX males and reduced in copy number in a XY femals. // Nucl. Acids Res. 1986. V.14. P. 13251340.

245. Muller W.C., Walker D., Hager L. Large- scale chromatin decondensation and recondensation reculated by transcription from a natural promoter. // J. of Cell Biol.2001. V.l54. P.33-48.

246. Murray J., Nancarrow C., Marshal J et al. Production of merino sheep by microinjection of ovine metallothionein-ovine growth hormone fusion genes. // Reprod. Fertill. Dev. 1989. V.l P.147-155.

247. Neuman E., Schaefer-Ridder M., Wang Y., Hofschneider P. Gene transfer into mouse lyome cells by electroporation in high electric fields. // EMBO J. 1982. V.l. P. 841-845.

248. Ohno S., Christian С./ Stenis C. Nuclear organization of microchromosomes Gallus domesticus//Exp. Cell Res. 1962. V.27. P.612-614.

249. Owens P., Michaska A., Owens J. Expression of a porcine growth hormone gene in mice. // Proc. Aust. Phys. And Pharm. Soc. 1989. V.20. P.24-25.

250. Palmiter R., Brinster R., Hammer R. Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fussion genes // Nature, 1982a. V300. P.611-615.

251. Palmiter R.D., Chen H.Y., Brinster R. M. Differential regulation of metallothionein-thymidine kinase fusion genes in transgenic mice and their offspring. //Cell. 1982b. V.29 P.701-710.

252. Palmiter R., Norstedi G., Gelinas R.G. et al. Methallothionein-human growth hormone fusion genes stimulate growth of mice. // Science. 1983. V.222. P.809-814.

253. Palmiter R.D., Wikie T.M., Chen H.Y., Brinster R. M. Transmission distortion and mosaicism in an unusual transgenic mouse pedigree // Cell. 1984. V.36. P.869-877.

254. Palmiter R., Brinster R. Transgenic mice. // Cell. 1985. V.2. P.343-345.

255. Palmiter R., Hammer R., Brinster R. Expression of growh hormone genes in tansgenic mice. // In: Genetic Manipulation of the Early Mammalian Embryo. Ed. F. Constantini, R. Jaenisch. Cold Spring Harbor. 1985b. P. 122-132.

256. Palmiter R., Brinster R. Germ-line transformation of mice. // Annual Rev. Genet. 1986. V.20. P. 465-500.

257. Pardue M.L., DeBaryshe P.G. Telomeres and telomerase: more than the end of the line // Chromosoma. 1999. V.108. P.73-82.

258. Parrish J.J., Sussko-Parris J.L., Leibfried-Rutledge M.L., Critse E.S., Eyestone W.H., First N.L. Bovine in vitro fertilization with frozen-thawed semen. // Theriogenology 1986. V.25. P.591-600.

259. Paters K.G., Rao P.S., Bell B.S., Kindman A. Green fluorescent fusion proteins: powerful tool for monitoring protein expression in live zebrafish embryos. // Devel. Biol. 1995. V.171. P.252-257.

260. Pell С. Growth promoting properties of recombinant growth hormone. // In Biotechnology in Growth Regulation. Ed. R. Heap. London. 1989. P.85-96.

261. Phi-van Loc., Stratling W. Dissection of the ability of the chicken lysocyme gene 5 matrix attachment region to stimulate transgene expression and to dampen position effects. // Biochem. 1996. V.35. P.735-742.

262. Phi-van Loc., Selke C., von Bodenhausen A., Stratling W.H. An initiation zone of chromosomal DNA replication at the chicken lysozyme gene locus // J. Biol. Chem. 1998. V.273. P. 18300-18307.

263. Pienta K.J., Partin A.W., Coffey D.S. Cancer as a disease of DNA organization and dynamic cell structure. // Cancer Res. 1989. V.49. P.2525-2532.

264. Perry A.C., Wakayama Т., Kishikawa H. Mammalian transgenesis by intra cytoplasmic sperm injection. // Sci. 1999. V.284. №5417. P. 1180-1182.

265. Popov A., Baranova T.V., Suchkova I., Smirnov A., Golubkov V., Sorokin A., Patkin E. The modelling of heterochromatic regions in transgenic mice. // Cytogenet. Cell Genet. 1999. V.85. P.95.

266. Porce de Leon F.A., Y. Li and Weng Z. Early and late replicative chromosomal banding patterns of Gallus domesticus // J. of Heredity. 1992. V.83. P.36-42.

267. Pravtheva D., Wise Т., Ensor N., Ruddle F. Mosaic expression of an Hprt transgene integrated in region of Y heterochromatin. // J. Exp. Zool. 1994. V.266. P.452-468.

268. Prokofieva-Belgovskaya A. A., Slezinger S.I. Replication of human chromosomes in primary cultures of embryonic fibroblasts. // Cytogenetics. 1968. V.15. P.27-28.

269. Pursel V., Rexroad C., Bolt D et al. Progress on gene transfer in farm animals. //Vet. Immunol. Pathol. 1987. V.l 7. P.303-312.

270. Pursel V., Pinkert C., Miller K. et al. Genetic engineering of livestock. // Science. 1989. V.244. P.1281-1288.

271. Quastler H., Sherman F.C. Cell population kinetics in the epitheium of the mouse. // Exp. Cell Res. 1959. V.l7. N3. P.420-438.

272. Quastler H. The analysis of cell population kinetics // In: Cell proliferation. Oxford. Blackwell. 1963. P. 18-36.

273. Radjabli S.L., Bulatova N. Tripsin of banding of avian chromosomes// Mammal. Chromosomes Newsletter. 1974.V.15. P.27-28.

274. Redi C.A., Garagna S., Zacharias H et al. The other chromatin // Chromosoma. 2001. V.l 10. РЛ36-147.

275. Reik W., Collick A., Norris M. Genomic imprinting determined methylation of parental alleles in transgenic mice. // Nature. V.328. P.248-251.

276. Rexroad C., Pursel V. Status of gene transfer in domestic animals. // Proc. 11th International Cong. Anim. Reprod. Devel. 1988. V.5. P.29-35.

277. Rexroad C., Hammer R., Bolr D. Et al. Production of transgenic sheep with growth regulating genes. // Mol. Reprod. Devel. 1989. V.l. P.164-169.

278. Richa J., Lo C. Introduction of human DNA into mouse eggs by injection of dissected chromosome fragments. // Science. 1989. V.245. P. 175-177.

279. Richards E.J., Elgin S.C. Epigenetic codes for heterochromatin formation and silencing: rounding up the usual suspects // Cell. 2002. V.l08. P.489-500.

280. Roberts S., Buck L., Alex R. A structure for amplified DNA. // Cell. 1983. V.33. P.53-83.

281. Roble J.M., Kasinahan P., Sullivan E., Kuroiwa Y., Tomizuka K., Ishida I. Artifical chromosomes vectors and expression of complex proteins in transgenic animals. Theriogenology. 2003. V.59. P. 107-113.

282. Roest H.P., van Klaveren J., de Wit J. Inactivation of the HB6B ubiquitin-conjugation DNA repair enzyme in mice causes male sterility associated with chromatin modification. Cell. 1996. V.86. P.799-810.

283. Rone M. Cromosome preparation and high resolution R- and G-banding techniques. // Cytogenetics of Animals. Ed. By Hainan C.R.E. 1989. P. 11-29.

284. Roschlau K., Rommel P., Roschlau D. Et al. Microinjection of viral vector in bovine zygotes. //Arch.Tierz. Berlin. 1988. V.31. P.3-8.

285. Rosochacki S.J. and Kozikova L.V. Transgenic animals with growth hormone and growth hormone related genes. // Molecular farming 2000. Proceeding og the OECD workshop held in La Grande Motte (France), September 3-6, 2000. P. 132-143.

286. Rothschild M.F. From a sow" ear to a silkpurse: real progress in porcine genomics. Cytogenet Genome Res. 2003. V.102. P.95-99.

287. Ruley H., Fried M. Clustered illegitimate recombination events in mammalian cells involving very short sequence homologies. //Nature. 1983. V.304. P.l81-184.

288. Sanberg A.A., Takagi N., Schmidt M.L. Bross I.D. IX Metasynchronous DNA replication in homologs. // Cytogenetics. 1968. V.7 P.298-332.

289. Sanford J., Forrester L., ChapmanV. Methylation patterns of repetitive DNA sequences in germ cells ofMus musculus. // Nucl. Acids Res. 1984. V.12 P.2823-2836.

290. Santos F., Hendrich В., Reik W., Dean W. Dynamic reprogramming of DNA methylation in the early mouse embryo. // Devel. Biol. 2002. V.24. P. 1720182.

291. Savage J.R.K. An introduction to chromosomal aberrations. // Atlas Genet. Cytogen. Oncol. Haematol. 1999. V.3. P.395-402.

292. Scangos G., Ruddle F. Mechanism and application of DNA-mediated gene transfer in mammalian cells- a review. // Gene. 1981. V. 14. P. 1-10.

293. Schmid W. DNA replication patterns of the heterochromosomes in Gallus domesticus. //Cytogenetics. 1962. P.344-352.

294. Schnieke A., Harbers K., Jaenisch K. Embryonic lethal-mutation in mice induced by retrovirus insertion into 1 collagene gene. // Nature. V.304. P.315-320.

295. Seabright M.A. A rapid banding technigue for human chromosomes. // Lancet. 1971. V.2. P.971-972.

296. Selig S., Okumura K., Ward D.C., Cedar H. Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization // EMBO J. 1992. V.l 1. P. 12171225.

297. Shoffner R.N. Chromosomes of Birds // The Cell Nucleus. 1974. V.2 P.223261.

298. Simi S., Jones В., Simon W. Intrachromosomal telomeric repeats and stabilization of truncated chromosomes in V79 Chinese hamster cells. Mutat. Res. 1998. V.397. P.229-233.

299. Simon I., Tenzen Т., Vostoslavsky R. et al. Developmental regulation of DNA replication timing at the human B-globin locus // EMBO J. 2001. V.20. P.6150-6157.

300. Simons J.,Wilmut I., Clark A. Et al. Gene transfer into sheep. // Biotechnology. 1988. V.6. P.l79-183.

301. Simpson J.L., Rajkovic F. Ovarian differentation and gonadal failure. // Am. J. Med. Genet. 1999. V.89. P. 186-200.

302. Singh N., Ebrahimi F.A., Gimelbrant A.A., Eusminger A.W., Gribnan J., Chess A. Coordination of the random asynchronous replication of autosomal loci. Nature Genet. 2003. V.33. P.339-341.

303. Stahl A., Vagner-Capodano A. Etude des chromosomes du Poult (Gallus domesticus) par les tecniques de fluorescences. Acad. Sci., Paris. 1972. T.275. Ser. D. P.2367-2369.

304. Steffenson S., Coelho P.A., Cobbe N. A role for Drosophila SMC4 in the resolution of sister chromatids in mitosis. Curr. Biol. 2001. V.l 1. P.295-307.

305. Stief A., Winter D.M., Stratling W.H., Sippel A.E. A nuclear DNA Attachment element mediates elevated and position-independent gene activity. // Nature. 1989. V.341. P.343-345.

306. Strauss W., Dausman Y., Beard C. Et al. Germ Line transmission of yeast artifical chromosome spanning the murine al collagen locus. // Sci. 1993. V.259. P.1904-1907.

307. Sumner A. Chromosomes: Organization and Function. // 2003, Maiden, MA: Blackwell Publishes. PP.238.

308. Sun W.H., DePamphilis M.L. Cell cycle-dependent regulation of the association between origin recognition proteins and somatic cell chromatin // EMBO J. 2002. V.21. P.1437-1446.

309. Swanson L., Simmons D., Arriza J. Novel development specifity in the nervous system of transgenic animals expression growth hormone fussion genes. // Nature. 1985. V.317. P.363-366.

310. Swift G., Hammer R., McDonald R et al. Tissue-specific expression of the rat pancreatic elastase-1 gene in transgenic mice. // Cell. 1984. V.38. P.639-646.

311. Takashi M., Hakamata J., Murakami Т., Takeda S., Kaneko Т., Takeuchi K., Ueda M., Kobayashi E. Establishment of LacZ- transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. // Biochem. And Biophys. Res. Commun. 2003. V.305. P.904-908.

312. Tatey S.M., Kulkarni A.B. Gene targeting in immunology. // Indian J. of Exp. Biol. 2000. V.38. P.733-745.

313. Vanderbyl S., MacDonald G.N., Sidhu S., Gung L., Telenius A., Perkins E. Transfer and stable transgene expression of a mammalian artifical chromosome into bone marrow-derived human mesenchymal stem cell. Stem Cell. 2004. V.22. P.324-333.

314. Vernet M., Bonnerot C., Briand P., Nicolas J.F. Changes in permissiveness for the expression of microinjected DNA during the first cleavages of mouse embryos. // Mech. Devel. 1992. V.36. P.129-139.

315. Vernet M., Cavard С., Zider A et al. In vitro manipulation of early mouse embryos induces HIVI-LTR lacZ transgene expression. //Development. 1993. V.l 19. P.1293-1300.

316. Vernon R., Flint D. Role of growth hormone in the regulation of adipocyte growth and function. // In Biotechnology in Growth Regulation. Eds. R.B. Heap et al. London. 1989. P.57-71.

317. Vialard F., Cocquet J., Christin-Maitre S., Veitia R., Fellous M. The X chromosome and ovarian function. // Cytogenet. And Genome Res. 2002. V.99. P.218-223.

318. Visser A.E., Jaunin F., Fakan S., Aten J.A. High resolution analysis of interphase chromosome domains. //J. Cell Sci. 2000. V.l 13. P.2585-2593.

319. Vize P., Michalska A., Lioyd B. Et al. Introduction of a porcine growth hormone fusion gene into transgenic pigs promotes growth. // J. Cell Sci. 1988. V.90. P.295-300.

320. Vlassova I.E., Graphodatsky A.S., Belyaeva E.S., Zhimulev I.F. Constitutive heterochromatin in early embriogenesis of Drosophila melanigaster // Mol. Gen. Genet. 1991. V/229. P.316-318.

321. Vogelstein В., Pardoll D.M., Coffey D.S. Supercoiled loops and eucaryotic DNA replication. // Cell. V.22. P.79-85.

322. Wagner E., Stewart Т., Mintz B. The human B-globin gene and functional thymidine kinase in developing mice // Proc. Natl. Acad. Sci. 1981. V.78. P.5016-5020.

323. Wagner E., Covarubias L., Stewart T. et al. Prenatal lethalities in mice homozygous for human growth hormone sequences integrated in the germ line // Cell. 1983. V.36. P.647-656.

324. Wall R.G. Use of transgenic animals in livestock improvement. // Intern. Conf. On Animal Blood Groups Biochem. Polymorphisms. 1988. P.9.

325. Wall R.G. Transgenic livestock: progress and prospects for the fature. // Teriogenology. 1996. V.45. P.57-69.

326. Wall R.J., Kerr D.E., Bodioli K.R. Transgenic dairy cattle: genetic engineering on a large scale. // J. Dairy Sci. 1997. V.80. P.2213-2224.

327. Wang N., Shoffner R.N. Trypsin G- and C-banding for interchange analysis and sex identification in the chicken // Chromosoma. 1974. V.47.P.61-69.

328. Warburton P., Cooke H. Hamster chromosomes containing amplified human a-satellite DNA show delayed sister chromatid separation in the absence of de novo kinetochore formation. // Chromosoma. 1997. V.106. P. 149-159.

329. Waggener J.M. Initiation of DNA replication in multicellular eukaryotes. // J. of Structural. Biol. 2002. V.140. P. 17-30.

330. Wall R.J., Hawk H.W. Making transgenic livestok. Genetic engenering on a large scale. //J/ Cell Biochem. 1992. V.49. P. 113-120.

331. Ward K., Franclin I., Murray J et al. The direct transfer of DNA by embryo microinjection. // 3rd World congress on genetics applied to livestock production. 1986. V.XII. P.6-21.

332. Watson J.D., Crick F.N. The struture of DNA. // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1953. V.18. P.123.

333. Weise F., Liehr Т., Efferth Т., Kuechler A., Gebhart E. Comparative M-FISH and CGH analysis in sensitive and drug-resistant human T-cell lines. // Cytogenet. Genome Res. 2002. V.98. P.l 18-125.

334. Wiethoff C.M., Middaugh C.R. Barriers nonviral gene delivery. // Pharm. Sci. 2003. V.92. P.203-217.

335. Wiley J., Sons L. The cell cycle and development. // New-York, Weinkeim, Brisbane, Toronto. 2001. P.259.

336. Wilson C., Bellen H., Gehrig W. Position effects on eukaryotic gene expression. // Annu. Rev. Cell Biol. 1990. V.6. P.679-714.

337. Wisudkharawn S., Smith D. Different replication pattern of chromocentres and С bands in Lilium henryi. // Chromosoma. 1985. V.93. P.56-59.

338. Xuemei W., Viveiros M.M., Eppig J.J., Bai Y., Fitzpatrick S.L., Matzuk M.M. Zygote arrest 1 (Zarl) is a novel maternal-effect gene critical for the oocyte-to-embryo transition. //Nature Genet. 2003. V32. P.l87-191.

339. Yakovlev A.F. Influence of molecular biology and biotechnology on the development of cytogenetics. // Cytogenetics of Animals. Ed. By Hainan C.R.E. C.A.B International. UK. 1989. P.205-209.

340. Yerle M., Ehard G. High resolution GTG banding pattern of rabbit chromosomes. // Cytogenetics of animals. Ed. by Hainan C.R. C.A.B International. UK. 1989. P.301-304.

341. Yin Zh., Plader W., Malepszy S. Transgene inheritance in plants. // J. Appl. Genet. 2004. V.45. P. 127-144.

342. Yu Y., Bradley A. Engineering chromosomal rearrangements in mice. // Nature Rev. Genet. 2001. V.2. P.780-790.

343. Yuhua Su, Liebhaber- Stephen В., Cooke N. The human growth hormone gene cluster locus control region supports position-independent pituitary and placenta-specific expression in the transgene mouse. // J. Biol. Chem. 2000. V.275. P.7909

344. Yung kim Sun. High-level expression of human lactoferrin in milk of transgenic mice using genomic lactoferrin seguence. // J. Biochem. 1999. V.l26 P.320-325.

345. Zeng F., Don A., Balwin K., Schultz R.M. Transcript profiling during preimplantation mouse development. // Develop. Biol. 2004. V.272. P.383-496.

346. Zhang R., Wang Y., Li S. Co-expression of multiple gene constructs in transgenic mice. //Biotechnol. Lett. 2001. V.23. P. 1249-1255.

347. Zhimulev I.F. Polytene chromosomes, heterochromatin and position effect variegation // Advances in Genetics. 1998. V.37. P.l-566.

348. Zink D., Bornfleth H., Visser A., Cremer C., Cremer T. Organization of early and late replication DNA in human chromosome territories. // Exp. Cell Res. 1999. V.247. P.176-188.

349. Zolotukhin S. Humanized green fluorescent protein genes and methods. Пат. США, МПК6. C12Q G01N 33/5-3. The Univ. Of Florida Res. 09.10.98. Опубл. 19.10.99. НПК 465/1.

350. Zudova D., Reracova O., Kubickova S., Rubes J. Aneuploidy detection in porcine embryos using fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Genome Res. 2003. V.l02. P.l76-183.

351. Zuniga- Gonzalez G., Torres-Bugarin O., Zamora-Perez A., Gomez-Meda B.C. Different in the number of micronucleated erythrocytes among young and adult animals including humans. Spontaneous micronuclei in 43 species. // Mutat. Res. 2001. V.494 P.l61-167.