Роль салициловой кислоты в регуляции стрессовых ответов в культуре клеток Arabidopsis thaliana

Павлова, Елена Леонидовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль салициловой кислоты в регуляции стрессовых ответов в культуре клеток Arabidopsis thaliana
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Роль салициловой кислоты в регуляции стрессовых ответов в культуре клеток Arabidopsis thaliana"

На правах рукописи

Павлова Елена Леонидовна

РОЛЬ САЛИЦИЛОВОЙ кислоты В РЕГУЛЯЦИИ СТРЕССОВЫХ ОТВЕТОВ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК АНАВЮОРБЮ ТНАЫАЫА

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 з ФЕБ 2010

Иркутск-2010

003491965

Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики Сибирского институ физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, Елена Львовна Таусон

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Щербаков Д. Ю. кандидат биологических наук Чепинога А. В.

Ведущая организация: ГОУ ВПО Иркутский Государственный Университет

Защита диссертации состоится «2» марта 2010 г. в 15 ч на заседаш диссертационного совета Д 003.047.01 при Сибирском институте физиологии биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а 317. Факс (3952)510754, e-mail: matmod@sifibr.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского институ физиологии и биохимии растений СО РАН.

Текст автореферата размещён на сайте Института: www.sifibr.irk.ru

Автореферат разослан <о?7» ¿7/ 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, Д 003.047.01 л р

кандидат биологических наук щ^ЛМп^, Г.П. Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Салициловая кислота (СК) является важной сигнальной молекулой в развитии устойчивости растений к биотическому стрессу. Во время атаки патогенов СК быстро накапливается в клетках растений, индуцируя программируемую клеточную смерть (ПКС) вокруг пораженного участка или, так называемую, реакцию сверхчувствительности (СВЧ), а также способствует формированию пролонгированной системной приобретенной устойчивости (СПУ) к широкому спектру последующих инфекций. Известно, что СК может способствовать развитию устойчивости к абиотическим воздействиям, в том числе и к тепловому шоку. Показано, что у растений СК может ингибировать митохондриальные функции, действуя либо как разобщитель окислительного фосфорилирования, либо как ингибитор. Поскольку в настоящее время считается общепринятым, что митохондрии играют одну из ведущих ролей в развитии ПКС в растительной и животной клетке, можно предполагать, что способность СК вызывать ту или другую физиологическую реакцию может определяться её способностью модулировать митохондриальные функции. В связи с этим представляется крайне важным изучить влияние СК на экспрессию стрессовых генов в зависимости от её способности влиять на митохондрии.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение влияния экзогенной СК на экспрессию стрессовых генов в культуре клеток Arabidopsis thaliana в зависимости от её способности снижать потенциал на внутренней митохондриалыюй мембране.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить влияние салициловой кислоты па жизнеспособность культуры клеток А. thaliana.

2. Исследовать влияние экзогенной салициловой кислоты на развитие индуцируемой термотолерантности у культуры клеток A. thaliana.

3. Выявить влияние салициловой кислоты на потенциал внутренней митохондриалыюй мембраны и дыхательную активность клеток.

4. Изучить экспрессию стрессовых генов (генов БТШ; генов, продукты которых локализуются в митохондриях; генов, продукты которых, предположительно, связаны с ПКС) в зависимости от изменения потенциала на внутренней митохондриалыюй мембране.

Научная новизна. В результате проведенной работы впервые показано, что обработка СК во время мягкого теплового стресса подавляет развитие индуцированной термотолерантности и ингибирует синтез белков теплового шока (БТШ). Подавление синтеза БТШ в условиях мягкого теплового стресса коррелирует со способностью СК снижать потенциал на внутренней митохондриалыюй мембране. Также впервые показано, что в ответ на обработку СК, а также митохондриальными ингибиторами и разобщителями, индуцируется экспрессия гена метакаспазы МСЗ. Способность СК активировать экспрессию МСЗ подавляется в условиях мягкого теплового стресса, независимо от присутствия БТШ. Полученные результаты позволяют предполагать, что активация экспрессии генов БТШ определяется повышением потенциала на внутренней митохондриалыюй мембране, в то же время, понижение потенциала активирует совершенно другую группу генов, к которым принадлежит МСЗ.

Теоретическая и практическая ценность работы. Полученные результаты вносят вклад в познание механизмов функционирования сигнальных систем растений при стрессе. Впервые показано, что активация или ингибировапие экспрессии стрессовых генов растений могут осуществляться в результате изменения заряда на внутренней митохондриальной мембране. Салициловая кислота рассматривается как посредник, который, действуя на митохондрии, регулирует либо выполнение защитной программы,

связанной с экспрессией генов БТШ, либо программы ПКС. Материалы диссертации могут быть использованы при разработке курсов лекций по физиологии растений, генетики и молекулярной биологии и учитываться при создании новых сортов растений.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации были представлены на Всероссийской конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным фактором внешней среды» (Иркутск, 2007, 2009), Международной конференции «Биология клеток in vitro и биотехнология» (Москва, 2008), а также на научной сессии СИФИБР СО РАН (Иркутск, 2008).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных работ, в том числе 1 статья в рецензируемом журнале «Физиология растений».

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения, выводов, списка цитированной литературы и приложений. Список цитированной литературы включает 262 работы, из них 17 отечественных и 245 зарубежных авторов. Работа изложена на 151 странице, содержит 22 рисунка, 1 таблицу и 2 приложения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. В работе использовали восьмидневную культуру клеток Arabidopsis thaliana L. Heyn, (раса Columbia), выращенную при 26°С на роторном шсйкере при 130 об./мин в темноте, что соответствовало второй половине логарифмической фазы роста. Культуру получали из 14-ти дневных проростков, выращенных при 26°С на МС-среде (Murashige, Skoog, 1962), содержащей 3% сахарозы, 0,5 мг/мл тиамина - HCl и 0,1 мг/л 2,4-Д, далее пересевали каждые 14 дней с разведением свежей средой в 6 раз.

Обработка клеток. Обработку клеток суспензионной культуры производили путем добавления концентрированных растворов действующих веществ в культуральную среду. Для создания теплового стресса культуру клеток инкубировали на водяном термошейкере Elpan 357 (Польша) либо на минитермошейкере TS-100 ("BioSan", Латвия).

Оценка жизнеспособности. Количество жизнеспособных клеток оценивали по их способности восстанавливать 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (ТТХ) (Еникеев и др., 1995). Количество мертвых клеток оценивали с помощью окрашивания Эвансом голубым.

Выделение белка. Выделение суммарного белка проводили 0,1 М Трис-НС1 буфером (pH 7,4-7,6), содержащим 3 мМ ДДС-Na, 1 мМ ß-меркаптоэтанола. Для ингибирования протеаз добавляли 0,5-1 мМ фенилметил-сульфонилфторида (ФМСФ). Образцы центрифугировали 15 мин (15000g) при 4°С. Белок из супернатанта осаждали трехкратным объемом охлажденного ацетона. Осадок белка растворяли в 625 мМ Трис-НС1 буфере (pH 6,8), содержащем 8 мМ ДДС-Na, 0,1 М ß-меркаптоэтанола, 10% глицерина, инкубировали 5 мин при 100°С и ценгрифугировали 15 мин (5000g) при 4°С. Количество белка определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1957).

Белковый электрофорез с ДДС-Na. Электрофорез проводили в блоках полиакриламидного геля размером 70x80x1 мм по модифицированной системе Лэммли (Laemmli, 1970), используя прибор для электрофореза Mini-PROTEAN III Electrophoretic Cell ("BIO-RAD", США) по прилагаемой инструкции. Гели окрашивали в водном растворе, содержащем 0,1% Кумасси R-250 ("Sigma", США), 25% изопропанол, 10% уксусную кислоту.

Вестерн-блотгинг. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану ("Sigma", США) проводили в Towbin - буфере (25 мМ Трис-НС1, 192 мМ глицин, 10% метанол, pH 9,2) в приборе для блоггинга ("BIO-RAD", США). Перенос проводили в холодной комнате в течение 2,5 ч: в течение первых 0,5 ч при напряжении 200 Вив течение следующих 2 ч при напряжении 400 В. Далее мембрану помещали на 20 с в раствор 0,5% красителя Понсо и отмывали. После этого нитроцеллюлозную мембрану помещали в блокирующий раствор,

содержащий 2%-ное сухое обезжиренное молоко, 10 мМ Трис-HCl (pH 7,4) и 150 мМ NaCl (трис-солевой буфер - TBS), и оставляли на ночь при температуре 0-4°С. Далее мембрану инкубировали в растворе антител в TBS. Время инкубации с антителами подбирали экспериментально от 10 мин до 4 ч в зависимости от используемых антител. Для проявления окрашивания мембрану помещшш в раствор, содержащий 100 мМ Трис-HCl (pH 9,5), 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 0,17 мг/мл 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфата ("Sigma", США), 0,33 мг/мл питротетразолия синего ("Sigma", США).

ОТ-ПЦР-анализ. Тотальную РНК выделяли с помощью набора SV Total RNA Isolation System ("Promega", USA). Для синтеза первой цепи кДНК использовали 1 мкг тотальной РНК, праймер oligo(dT)I8 (20 рМ) и набор REVERTA ("АмплиСенс", Москва). Полуколичественный ОТ-ПЦР-апализ был выполнен при использовании кДНК в качестве матрицы (50 нг) и геноспецифичных праймеров (10 рМ каждого). Последовательности праймеров были выбраны с помощью програмы VectorNTI на основе последовательностей кДНК целевых генов (wwu'.arabidopsis.org). Амплификацию проводили по схеме: 95°С - 40 с, 58°С - 60 с, 72 °С - 90 с с предварительным прогревом 3 мин при 95°С и конечным - 10 мин при 72°С с использованием амплификатора Mastercycler gradient thermocycler ("Eppendorf'). Количество циклов предварительно подбиралось, учитывая результаты амплификации кДНК каждого из генов для определения линейной области увеличения концентрации ПЦР-продукта. Равные объемы ПЦР-продуктов разделяли в 1,5% агарозном геле.

Определение дыхательной активности. Поглощение кислорода клетками регистрировали полярографически с платиновым электродом закрытого типа (электрод Кларка) в ячейке объемом 1,4 мл на полярографе ОН-105 (Венгрия) (Трушанов, 1973) Клетки вносили в полярографическую ячейку, термостатируемую при 26°С. Температуру в ячейке поддерживали с помощью ультратермостата U10 (ГДР). Чтобы отделить митохондриачьное дыхание от неспецифичсского поглощения кислорода, в полярографическую ячейку добавляли 0,15 мМ азида натрия (ингибитор ЭТЦ митохондрий), 2 мМ бензгидроксамовой кислоты (БГК, ингибитор альтернативной оксидазы). Скорость поглощения кислорода выражали в нмолях поглощенного кислорода в мин на г сырого веса, учитывая растворимость кислорода в воде.

Микроскопия. Микроскопический анализ клеток проводили с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа AxioObserver ZI (Германия) с цифровой монохромной камерой AxioCam MRm3 и пакетом программного обеспечения для захвата и анализа изображений "AxioVision Rel.4.6". Визуализацию величины потенциала на внутренней митохондриальной мембране проводили с использованием 5 мкМ потенциал-зависимого катионного красителя JC-1. Для количественной оценки интенсивность флуоресценции митохондрий в красном канале обсчитывали статистически.

Выделение салициловой кислоты. Культуру клеток отфильтровывали и 1,5 г ткани замораживали в жидком азоте для хранения. Перед выделением CK к растительному материалу добавляли 1 мкМ внутреннего стандарта (мета-оксибензойная кислота). Тотальные фенольные соединения выделяли по методу Мийдла (Мийдла и др., 1975) с модификациями. Анализ очищенных экстрактов проводили методом газожидкостнон хроматографии с использованием хромато-масс-спектрометра 5973N/6890N MSD/DS Agilent Technology (USA). Анализ проводили в режиме регистрации но полному ионному току (SCAN). Для идентификации салициловой кислоты использовали сравнение се времени удерживания со временем удерживания стандарта, а также библиотеку масс-спектров NIST05.

Статистическая обработка данных. Биологическая повторность экспериментов во всех случаях была 3-8 кратная. Полученные данные обработаны статистически:

рассчитаны средние арифметические значения и их стандартные отклонения (Лакин, 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Влияние экзогенной салициловой кислоты иа жизнеснособность культуры клеток А. ЖаНапа Для определения влияния СК на жизнеспособность культуры клеток А. IИаНапа в среду инкубации добавляли СК в конечной концентрации 0.5; 1; 2,5 и 5 мМ и инкубировали в течение 24 часов при 26°С (рис. 1). Определение жизнеспособности клеток

о о. 12

С 8

0,5 I 2.: Концентрация С К. мМ

гЗл

К 0.5 1 2.5

Концстрация СК, мМ

Рис. 1. Влияние разных концентраций СК на жизнеспособность клеток А. ¡ИаНапа. Определение жизнеспособности по восстановлению ТТХ (а) и окрашиванию Эвансом голубым (б). Клетки обрабатывали 0,5: 1; 2,5 и 5 мМ СК и инкубировали 24 ч при 26°С. К - контроль, проводили с помощью двух различных методик: по их способности восстанавливать ТТХ и по окрашиванию мертвых клеток Эвансом голубым. Видно, что снижение количества клеток, способных восстанавливать ТТХ (рис. 1а), совпадает с увеличением количества мертвых клеток (рис. 16). Длительная обработка СК в зависимости от концентрации снижала жизнеспособность культуры клеток Л. ¡ИаНапа. Наиболее эффективной оказалась а б

К 6 18

Время обработки, ч

Рис. 2. Временная динамика снижения жизнеспособности культуры клеток А. ¡ИаНапа при обработке 5 мМ СК,

Определение жизнеспособности по восстановлению ТТХ (а) и окрашиванию Эвансом голубым (б). Клетки инкубировали с 5 мМ СК 6, 18,24 ч при 26°С. В качестве контроля (К) использовали клетки, инкубированные 24 ч в отсутствии СК.

Рис. 3. Влияние СК на морфологию клеток А. ¡ИаНапа.

Микрофотография клеток в 01С. Культуру клеток инкубировали с 5 мМ СК в течение 24 ч при 26°С. К - контроль. Масштабный отрезок равен 10 мкм.

концентрация СК 5 мМ, которая вызывала наибольшее снижение жизнеспособности клеток - на 71% (рис. 1 а).

Изучение действия 5 мМ СК в динамике показало, что уже после 6 ч инкубирования количество жизнеспособных клеток снижалось на 46% (рис. 2а). Как и в предыдущем эксперименте (рис. I) определение жизнеспособности по восстановлению ТТХ (рис. 2а) и по окрашиванию Эвансом голубым (рис. 26) дало сопоставимые результаты. Поэтому в дальнейших экспериментах использовали 5 мМ СК и метод оценки жизнеспособности клеток по восстановлению ТТХ.

Известно, что одним из признаков развития ПКС в культуре клеток является конденсация протопласта с отставанием плазмалеммы от клеточной стенки (плазмолиз) (Зи^шэк! е1 а!., 2002: Оагаа-НегесКа еЛ а!., 2008).

С помощью световой микроскопии с использованием метода дифференционно-интерфереционного контраста (01С) мы изучили морфологию клеток, погибших от действия СК (рис. 3). Как видно на рис. 3, гибель клеток сопровождалась конденсацией протопласта и отставанием его от клеточной стенки.

Показано, что функции БТШ в клетках животных не ограничиваются восстановлением повреждённой структуры белков и диссоциацией белковых агрегатов. Эти белки могут выполнять антиапоптозные функции, блокируя развитие ПКС (Вееге, 2004; 01с1е1о1 е1 а1.. 2006). Поэтому было сделано предположение, что БТШ культуры клеток А. I.каПапа, синтезируемые при мягком тепловом стрессе, могут снижать гибель клеток, вызываемую СК.

Максимальный уровень синтеза НэрЮ! и Нэр 17.6 в культуре клеток А. ЛаНапа наблюдается при 37°С (ШЫтпоу ег а!., 2007). Чтобы выяснить, как повышенное содержание БТШ влияет на жизнеспособность клеток А. вшИапа при обработке СК, их инкубировали при 26 и 37°С (120 мин), затем обрабатывали 5 мМ СК в течение 24 ч при 26°С (рис. 4). Результаты показали, что предварительное инкубирование клеток А. IИаИапа при 37°С защищаю их от гибели, вызванной обработкой СК. Способность клеток восстанавливать ТТХ при этом повышалась на 31%, по сравнению с контролем.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что СК пропорционально концентрации вызывает гибель клеток А. IИаИапа, которая развивается в динамике и сопровождается отставанием цитоплазмы от клеточной стенки. Предварительная обработка клеток в условиях мягкого теплового стресса, приводящая к синтезу БТШ, защищает их от гибели, вызванной СК.

г*

г1~|

Рис. 4. Влияние мягкого теплового стресса на гибель клеток А. IИаИапа. вызванную обработкой СК. Определение жизнеспособности по восстановлению ТТХ. Клетки предварительно инкубировали при 26°С или 37°С в течение 120 мин, затем обрабатывали 5 мМ СК 24 ч.

2. Влияние сачициловой кислоты на жизнеспособность культуры клеток A. thaliana при мягком тепловом стрессе

Известно, что предварительная обработка умеренно высокими температурами индуцирует

толерантность к последующему более жёсткому тепловому воздействию. Это явление называется индуцированная термотолерантность и является важнейшим защитным механизмом при температурных стрессах (Sung et al., 2003). Целью следующей серии экспериментов было изучение влияния СК на индуцированную термотолерантность и синтез БТШ в культуре клеток A. thaliana. Для этого, прежде всего, необходимо было определить концентрации СК, не влияющие на жизнеспособность клеток при нормальных условиях инкубирования (26°С) и при мягком тепловом стрессе (37°С). Клетки инкубировали 2 ч с разными концентрациями СК (0,1; 0,25 и 0,5 мМ) при 26°С или 37°С, отмывали от СК и определяли их жизнеспособность спустя 48 ч инкубации при 2б°С. Результаты показали (рис. 5), что кратковременная обработка СК в диапазоне концентраций от 0 до 0,5 мМ не имела самостоятельного отрицательного воздействия на жизнеспособность клеток A. thaliana при 26 и 37°С.

Для изучения влияния СК на индуцированную термотолерантность клетки А. thaliana инкубировали 120 мин с концентрациями СК 0,1; 0,25 и 0,5 мМ при обычной температуре выращивания (26°С) и в условиях мягкого теплового стресса (37°С), затем

Рис. 5. Влияние разных концентраций СК на жизнеспособность клеток А. гИаЬапа при нормальной температуре и в условиях мягкого теплового стресса.

Определение жизнеспособности по восстановлению ТТХ. Клетки инкубировали при 26 или 37°С (120 мин) в присутствии 0,1; 0,25 и 0,5 мМ СК (СК26, СК37) или в её отсутствии (К26, К37), отмывали, инкубировали 48 ч при 26°С.

12 -р 10 х 5 1- 2 о g 8 С о Я & е " ,1 a u 11 « о С. 2 CQ р 0 -Е-1 1*1 rf rt [f -f-j гЬ — rf —

К26 V. Об 1Ж2М.1 СКОЛИ СК16-0.5> КП ч. К37 СК51-0.1 СК51-0.25 СКЭТ-OV "V -у 50°С 50°С

Рис. 6. Влияние СК на индуцируемую термотолерантность.

Определение жизнеспособности по восстановлению ТТХ. Клетки инкубировали при 26 или 37°С (120 мин) в присутствии 0,1; 0,25; 0,5 мМ СК (СК26, СК37) или в её отсутствии (К26, К37), отмывали, инкубировали 120 мин при 26°С, затем подвергали жесткому тепловому шоку (50°С 10 мин) и далее инкубировали 48 ч при 26°С.

клетки отмывали от СК и подвергали действию жесткого теплового шока (50°С 10 мин) (рис. 6). Результаты показали, что жесткий тепловой шок вызывал значительное снижение жизнеспособности культуры клеток A. thaliana. Обработка СК при 26°С несколько увеличивала термотолерантность клеток. Аналогичным образом, обработка СК при обычной температуре инкубирования повышала термотолерантность горчицы (Dat et al., 1998), картофеля (Lopez-Delgado et al., 1998) и арабидопсиса (Clarke et al, 2004). Предварительная обработка при 37°C защищала клетки от гибели при жестком тепловом стрессе. Однако присутствие СК в условиях мягкого теплового стресса пропорционально концентрации снижало устойчивость клеток к 50°С по сравнению с клетками, обработанными при 37°С в отсутствии СК. Таким образом, обработка СК подавляет развитие индуцированной термотолерантности.

играют важную роль в ответе клетки на тепловой стресс.

2б°С

37°С

К СК,

0.1

СКц25 СК05

к ск(

0.1

СК0Л$ ск03

HSP101 HSP60

HSPJ7.61

в-тив

26°С

37"С

К CKni CK{j25 СКг„ К СК

0.5

CK{U5 ски

Известно, что БТШ Развитие индуцируемой термотолерантности во многом определяется повышением уровня синтеза HsplOl (Queitsch et al., 2000) и низкомолекулярных БТШ (нмБТШ), к которым относятся белки Hspl7.6 (Wehmeyer et al., 1996). Было сделано предположение, что инги-бирующий эффект СК на индуцируемую термотолерантность может объясняться её способностью препятствовать активации синтеза БТЩ при мягком тепловом стрессе. Для проверки этого предположения в культуру клеток A. thaliana добавляли СК, инкубировали в течение 120 мин при температуре 26 и 37°С и анализировали экспрессию генов HSP101, HSP60 и HSP 17.61 методом ОТ-ПЦР.

Здесь и далее в качестве контрольных генов использовали гены «домашнего хозяйства» B-TUB либо АСТ2. Результаты, представленные на рис. 7а, показали, что СК в концентрациях 0,1; 0.25 и 0,5 мМ не оказывала влияния на экспрессию генов HSP101 и HSP 17.61 при обычной температуре инкубирования (26°С). В условиях мягкого теплового стресса (37°С 120 мин) активировалась экспрессия БТШ HSP10I и HSP17.6I, но не менялся уровень экспрессии HSP60. Добавление СК при этой температуре в зависимости от концентрации подавляло экспрессию HSP101 и HSP17.61. Присутствие 0,5 мМ СК практически полностью ингибировало экспрессию этих генов при 37°С (рис. 7а). Экспрессия HSP60 почти не менялась во всех вариантах эксперимента. Аналогичные результаты были получены методом иммуноблоттинга с антителами против HsplOl.

Шр101 Е$р60 №р17.61

Рис. 7. Влияние СК на экспрессию и синтез БТШ в клетках А. ЛаИапа при мягком тепловом стрессе.

Представлены результаты ОТ-ПЦР-анализа (а) и иммуноблоттинга (б). Клетки инкубировали при 26 или 37°С (120 мин) в присутствии 0,1; 0,25 и 0,5 мМ СК. К - контроль.

НврИ.б! и НчрбО (рис. 76). В условиях мягкого теплового стресса повышался синтез Нэр101 и Нхр 17.61, а присутствие СК этот процесс ингибировало.

Таким образом, присутствие СК при мягком тепловом стрессе подавляет развитие индуцируемой термотолерантности, что сопровождается ингибированием синтеза БТШ.

3. Влияние салициловой кислоты на функции митохондрий Влияние СК на индуцированную термотолерантность и синтез БТШ при мягком тепловом стрессе аналогично ранее описанному эффекту митохондриальных ингибиторов и разобщителей, которые подавляли развитие индуцируемой термотолсрантности и экспрессию БТШ при мягком тепловом стрессе (ШкЪуапоу й а1., 2007; Федосеева и др., 2008). Известно, что СК может подавлять окислительное фосфорилирование в митохондриях, действуя как разобщитель или ингибитор (Когтап с\ а1., 2004). Поэтому далее было изучено влияние СК на поглощение кислорода культурой клеток А. ЛаИапа. Для этого клетки инкубировали 120 мин при 26°С с разными концентрациями СК в присутствии или в отсутствии бензгидроксамовой кислоты (БГК), ингибитора альтернативной оксидазы (АО). Результаты экспериментов приведены на рис. 8, из которого видно, что добавление БГК не влияло на уровень поглощения кислорода

клетками в отсутствии СК. При концентрации СК 0,25 мМ дыхание оставалось таким же, как в контроле, но при добавлении БГК уровень поглощения кислорода снижался на 20%. Это говорит о том, что СК частично ингибирует основной путь передачи электронов по ЭТЦ, активируя альтернативный путь, осуществляемый альтернативной

оксидазой. СК в концентрации 1 мМ достоверно снижала скорость дыхания, при этом уровень альтернативного дыхания достигал почти 50%. СК в концентрации 5 мМ значительно ингибировала поглощение кислорода клетками (на 88%) как в присутствии БГК. так и без нее.

., 2007), мягкий тепловой стресс вызывает повышение потенциала внутренней митохондриальной мембраны (пПАу) в клетках А. IИаИапа. Способность митохондриальных ингибиторов и разобщителей подавлять индуцируемую термотолерантноегь и синтез БТШ при мягком тепловом стрессе коррелировала с их способностью снижать пНАч/ (ЮкИуапоу е! а1., 2007). Известно, что СК в диапазоне концентраций от 0,1 до 1 мМ снижает пИЛу в культуре клеток животных (Ыййег й а1., 2006). На основании этих данных было сделано предположение, что СК, подобно разобщителям и ингибиторам, будет препятствовать повышению гЩДц/ при тепловом стрессе в культуре клеток А. (ИаИапа. Поэтому было изучено влияние СК на кНЛу с помощью флуоресцентного красителя 1С-1 (рис. 9). Этот краситель при низком значении пНЛху существует в виде мономеров и флуоресцирует в зеленом спектре. При повышении пйАч/ .ГС-1 образует агрегаты, в результате чего его флуоресценция смещается в красную область. Полученные результаты подтвердили, что при мягком тепловом стрессе происходит повышение т1Д\(/. СК в концентрации 0,5 мМ вызывала снижение гЩАху, причем при 37°С снижение пНАу было сильнее. Это позволило предположить, что

Рис. 8. Изучение влияния СК на интенсивность поглощения кислорода клетками А. ¡ИаИапа. Клетки инкубировали 120 мин при 26°С с 0,25; 1 и 5 мМ СК в присутствии БГК (+БГК) или в её отсутствии (-БГК). К - контроль.

Как было показано ранее (ШкЬуапоу е( а!

CK ингибирует синтез БТШ и, следовательно, развитие индуцируемой термотолерантности при мягком тепловом стрессе, подавляя повышение mtAy при 37°С.

4. Экспрессия стрессовых генов при действии салициловой кислоты и мягкого теплового стресса

Известно, что как экзогенно добавленная CK, так и изменение её эндогенного уровня, может вызывать активацию целого спектра различных генов, участвующих в

защитных ответах, направленных на выживание клетки или, наоборот - на её гибель (Vlot et al., 2009). Предполагается, что многие свойства CK определяются ее способностью модулировать функционирование митохондрий (Norman et al., 2004). Действительно, развитие ПКС, как правило, сопровождается деполяризацией внутренней митохондриальной мембраны (Reape et al., 2008). В связи с этим нами было сделано предположение, что снижение mtAvji при действии CK может вызывать активацию экспрессии проапоптозных генов.

В ответ на обработку CK с помощью ОТ-ПЦР-анализа изучали экспрессию генов БТШ: HSP10I, HSP 17.61, HSP 17.611 и HSP60; генов, продукты которых локализованы в митохондриях: VDAC, UCP, ANT; генов метакаспаз, продукты которых, предположительно, связаны с ПКС: MCI, МС2, МСЗ, МС4, МС5, МС6, МС7, МС8, МС9. Для этого культуру клеток А. thaliana инкубировали с разными концентрациями CK (0,25; 0,5; 1 и 5 мМ) в течение 120 мин при 26°С (рис. 10). Подтверждая результаты предыдущего эксперимента (рис. 7а), обработка всеми используемыми концентрациями CK при 26°С не влияла на экспрессию генов БТШ (рис. 10а). Экспрессия генов VDAC и UCP также не изменялась при обработке CK (рис. 106). В то же время экспрессия гена ANT незначительно активировалась в присутствии 0,1 и 0,25 мМ CK. Анализ экспрессии генов метакаспаз показал, что обработка CK не влияла на экспрессию МС2, МС7 и МС9 (рис. 10в), а также и других генов метакаспаз (данные не приведены), кроме одного. Экспрессия гена МСЗ значительно увеличивалась при концентрациях CK от 0,25 мМ до 1 мМ. При концентрации CK 5 мМ активации экспрессии этого гена не наблюдалось.

Показано, что у А. thaliana мягкий тепловой стресс, индуцирующий синтез БТШ, подавлял экспрессию предположительных проапоптозных генов (Larkindale. Vierling, 2008). Поэтому далее было изучено, действие экзогенной CK на экспрессию гена МСЗ в условиях мягкого теплового стресса. Для этого к клеткам А. thaliana добавляли 1 мМ CK и инкубировали в течение 120 мин при температуре 26 и 37°С (рис. 11). Обработка CK при 37°С не приводила к активации экспрессии гена МСЗ. Более того, при 37°С подавлялся и тот небольшой базовый уровень экспрессии этого гена, который наблюдался при 26°С в

а 26

СК26 37 СК37

..г V ; V V- Л til

DIC

JC-1

красный канал

Рис. 9. Влияние СК на пИДу у клеток А. ¡Иакапа. Микрофотография клеток (а) и статистический обсчет данных (б). Клетки инкубировали 120 мин при 26°С или 37°С с 0,5 мМ СК, далее окрашивали .1С-1 в течение 10 мин.

отсутствии СК. В условиях мягкого теплового стресса базовый уровень экспрессии МСЗ прогрессивно снижался в зависимости от времени инкубирования при 37°С вплоть до полного исчезновения через 120 мин, тогда как экспрессия генов БТШ, наоборот, увеличивалась (рис. 12). Таким образом, в условиях мягкого теплового стресса экспрессия гена МСЗ подавлялась._

а К 0,25 0,5 1 5 в К 0,25 0,5 1 5

МС2

HSP101

HSP60 МСЗ шшшшш

HS PI 7.61 МС7

HS PI 7.61 I МС9

КО,25 0,5 1 5

VDA С г К 0,25 0,5 1 5

UCP АСТ2

ANT в-тив 1

Рис. 10. Влияние СК на экспрессию генов в клетках А. МаИапа. Представлены результаты ОТ-ПЦР-анализа. Клетки инкубировали с 0,25; 0,5; 1 и 5 мМ СК в течение 120 мин при 26°С.

Известно, что БТШ могут ингибировать развитие ПКС в клетках животных (Beere, 2004; Didelot et al., 2006). Чтобы проверить, может ли повышенный уровень белков HsplOl и Hspl7.6 ингибировать активацию экспрессии МСЗ, был изучен эффект CK на активацию экспрессии МСЗ после инкубирования клеток А. thaliana при 37°С (когда БТШ уже синтезировались, а активирующий их мягкий тепловой стресс закончился). Клетки А. thaliana инкубировали при 26 или 37°С 120 мин, затем обрабатывали 1 мМ CK 120 мин, но уже при 26°С, чтобы исключить влияние фактора повышенной температуры.

На рис. 13 видно, что присутствие транскриптов HSP101 и HSP17.6I и,

следовательно, самих белков не препятствовало CK активировать экспрессию МСЗ. Таким образом, именно мягкий тепловой стресс, а не синтезирующиеся в результате него БТШ, ингибируют активацию экспрессии гена метакаспазы МСЗ.

Данная метакаспаза по последовательности транзитного пептида, предположительно, имеет митохондриальную локализацию, возможно, её функции имеют отношение к работе этих органелл. Поэтому далее изучали экспрессию гена МСЗ в ответ на нарушения функций митохондрий, вызванные применением ингибиторов и разобщителей окислительного фосфорилирования (антимицин А (АА) и СССР)

МО /4 СТ2

Рис. 11. Влияние СК на экспрессию гена МСЗ в клетках А. /ЬаИапа при мягком тепловом стрессе.

Представлены результаты ОТ-ПЦР-анализа. Клетки инкубировали при 26 или 37°С в течение 120 мин с 1 мМ СК.

(рис. 14). Несмотря на различный механизм действия АА и СССР, обработка этими агентами приводит к снижению mtA\|/. Результаты эксперимента показали, что МСЗ

активировалась в ответ на действие этих веществ. Это позволяет предполагать, что экспрессия гена МСЗ в клетках A. thaliana зависит от состояния митохондрий. Поскольку обработка СК, а также АА и СССР приводит к снижению mtA\|/ (рис. 9), очевидно, что одним из сигналов активации экспрессии гена метакаспазы МСЗ в клетках А. thaliana является снижение заряда на внутренней митохондриальной мембране.

37°С 15 30 60 120

HSP101 HSP60 HSP17.6I

HSP17.6II МСЗ АСТ2

Рис. 12. Экспрессия генов БТШ и МСЗ в клетках A. thaliana при мягком тепловом стрессе. Представлены результаты ОТ-ПЦР-анализа. Клетки инкубировали 0, 5, 15, 30, 60 и 120 мин при 37°С. Отбор проб проводили сразу после окончания всех обработок.

5. Сравнение динамики изменения потенциала на внутренней митохондриальной мембране и эндогенного уровня салициловой кислоты при мягком тепловом стрессе.

При мягком тепловом стрессе происходит повышение mtA\j/ в клетках A. thaliana (рис. 9). Изучение динамики изменения mtA\|/ в условиях мягкого теплового стресса (рис. 15) показало, что потенциал на внутренней митохондриальной мембране

значительно

поднимается в течение первых 5 мин инкубирования клеток при 37°С и далее остается примерно на этом же уровне. Таким образом, наблюдается обратная связь (т.е. отрицательная корреляция) между mtAy и базовой экспрессией МСЗ, так как при повышении mtAv|/ происходит снижение базовой экспрессии МСЗ и наоборот.

Известно, что повышение уровня эндогенной СК в клетках растений наблюдается не только при развитии ПКС, но и при мягком тепловом стрессе (Ван и др., 2005; Suzuki et al.,

2008). Посколь-

К СК С АА

Рис. 14. Экспрессия гена МСЗ при обработке митохонд-риальными ингибиторами и разобщителями в клетках А. thaliana.

Представлены результаты ОТ-ПЦР-анализа. Клетки обрабатывали 1 мМ СК, 4 мкМ СССР (С) и 2 мкМ антимицина А (АА) в течение 120 мин при 26°С.

К26СК26К37 37+СК26

МСЗ HSP101 HSP 17.61 АСТ2

Рис. 13. Влияние СК и мягкого теплового стресса на экспрессию генов БТШ и МСЗ в клетках А. thaliana.

Представлены результаты ОТ-ПЦР-анализа. Клетки обрабатывали 120 мин при 26°С (К26) и 37°С (К37) в отсутствии СК, при 26°С в присутствии 1 мМ СК (СК26) или обрабатывали СК при 26°С сразу после инкубирования при 37°С (120 мин) (37+СК26).

ку тепловой стресс при 37°С вызывал повышение mtAv|/ (рис. 15), а обработка экзогенной СК приводила к его снижению (рис. 9), было изучено изменение уровня эндогенной СК в культуре клеток A. thaliana при 37°С. Для этого культуру клеток A. thaliana инкубировали 0, 5, 15, 30 и 60 мин при 37°С (рис. 16), определяли уровень СК методом газожидкостной хроматографии. Как видно из результатов, уровень эндогенной СК более чем в два раза увеличивается через 15 мин воздействия 37°С. Через 30 мин 13

обработки при этой температуре содержание эндогенной СК возвращалось на исходный уровень.

Сравнение динамики изменения уровня эндогенной СК и т1Л\|/ при 37°С свидетельствует, что такое повышение уровня СК не приводит к снижению потенциала на внутренней митохондриальной мембране.

4. ОБСУЖДЕНИЕ

1. Мягкий тепловой стресс способствует защите клеток от летального действия СК СК является сигнальной молекулой, индуцирующей развитие реакции СВЧ (Mur et al., 2007). В случае СВЧ предполагается, что накопление критической концентрации эндогенной СК в клетках запускает процессы клеточной гибели (Mur et al., 2007). Известно, что клеточная гибель в процессе СВЧ идет по механизму ПКС со многими характерными для неё чертами, такими как ДНК-ладдернинг (Yao et al., 2002; Kiba et al., 2006; Тарчевский и др., 2008), падение mtA\|/ (Yao et al., 2004), выход цитохрома с (Kiba et al., 2006), активация каспазной активности (del Pozo, Lam, 1998). Накопление СК в клетке в концентрации меньше критической приводит не к гибели клеток, а к активации программ, направленных на выживание, например, развитию СПУ (Hoeberichts, Woltering, 2002). Очевидно, что растение посредством изменения концентрации СК регулирует выполнение ПКС. В инфицированных участках ПКС происходит в местах накопления максимальной концентрации СК (Enyedi et al., 1992).

В наших условиях наиболее эффективная гибель клеток наблюдалась при обработке 5 мМ СК в течение 24 ч, причем гибель клеток происходила в зависимости от времени инкубирования с СК (рис. 1, 2). Аналогичные данные с использованием той же самой

с соавт. (2008) на культуре клеток A. thaliana. Однако действующие концентрации экзогенной и эндогенной СК, инициирующие СПУ или ПКС, существенно различаются. Эндогенная СК запускает эти процессы в значительно меньшей концентрации. Так, экспрессия PR-белков и индукция СПУ у табака наблюдается при уровне эндогенной СК 0,5-1,5 мкМ (Vernooij et al., 1994), тогда как для индукции сходного уровня устойчивости и экспрессии защитных генов требуются концентрации экзогенной СК 10 мкМ и более. Индукция СВЧ у табака наблюдалась при концентрации эндогенной СК, равной приблизительно 0,1 мМ (Enyedi et al., 1992), а ПКС - при концентрации экзогенной СК 0,75 и более мМ (Kawai-Yamada et al., 2004). Таким образом, нельзя 14

Время обработки, мин 37°С

Рис. 15. Изменение гШАу при мягком тепловом стрессе в клетках А. йшИапа. Клетки инкубировали 0, 5, 15, 30 и 60 мин при 37"С, за 10 мин до окончания температурной обработки добавляли 5 мкМ КМ.

концентрации СК получены Garcia-Heredia

Время обработки, мин 37°С

Рис. 16. Изменение уровня эндогенной СК при мягком тепловом стрессе в клетках А. IIгаНапа.

Клетки инкубировали 0, 5, 15, 30 и 60 мин при 37°С. Отбор проб проводили сразу после окончания всех обработок.

сравнивать действующие концентрации экзогенной и эндогенной СК, не принимая во внимание ряд важных факторов, влияющих на поглощение, метаболизм и компартментацию СК в растительных клетках. Кроме того, СК является довольно нестабильной молекулой и быстро разрушается. Известно также, что экзогенная СК быстро поглощается и выводится из клеток. Chen с соавт. (2001) показали, что более 85% поглощенной СК экскретировалось клеткой в течение 5 ч. Очевидно, что для достижения физиологического эффекта требуется гораздо большая концентрация экзогенной СК, чем эндогенной (Xie, Chen, 1999).

Одним из характерных признаков ПКС является отставание цитоплазмы от клеточной стенки. Плазмолиз и дальнейшая конденсация протопласта у растений являются активными процессами и не проявляются у клеток, погибающих некротическим путём, так как вакуоль растительной клетки играет ведущую роль при проявлении конденсации протопласта. (Swidzinski et al., 2002). В наших условиях гибель при дейсгвии СК развивалась во времени (рис. 2), сопровождалась остановкой цитоплазмы, и наблюдалось отставание цитоплазмы от клеточной стенки (рис. 3). Аналогичные результаты были получены при обработке СК культуры клеток A. thaliana (Garcia-Heredia et al., 2008). Таким образом, есть основания считать, что СК вызывает гибель клеток, которая, согласно литературным данным, определяется как программируемая.

На настоящий момент известно, что БТШ могут подавлять апоптоз у животных, вызванный различными стимулами, такими как тепловой шок, ультрафиолетовое излучение, хемотерапевтические агенты, фактор некроза опухолей (Вееге, 2004; Didelot et al., 2006). Считается, что некоторые БТШ могут играть как анти-, так и проапоптозную роль (Didelot et al., 2006). У растений как анти-, так и проапоптозная роль БТШ практически не изучена. Показано, что инкубирование культуры клеток A. thaliana в условиях мягкого теплового стресса (37°С), при котором синтезируются БТШ (HsplOl, Hsp70 и Hspl7.6), защищало от ПКС, вызванной жестким тепловым шоком (Rikhvanov et al., 2007). Аналогично этому, предобработка в условиях мягкого теплового стресса способствовала снижению гибели культуры клеток A. lhaliana от СК. Таким образом, БТШ защищают клетки не только от действия жесткого теплового шока, но и от других факторов, не связанных с высокой температурой, в том числе, от летального действия СК. Это явление получило название «перекрёстная устойчивость». В литературе имеется много работ, где показано, что при мягком тепловом стрессе происходит повышение устойчивости к действию различных стрессовых факторов таких, как аноксия, окислительный сгресс, ультрафиолетовое излучение. Первоначально предполагалось, что все эти стрессоры вызывают в клетке агрегацию и денатурацию белковых молекул, а перекрестная устойчивость достигается в результате предотвращения этих процессов посредством функционирования БТШ и других защитных систем клетки (Ananthan et al., 1986). Впоследствии оказалось, что при этих воздействиях в клетках животных может развиваться Г1КС. Таким образом, стало очевидно, что одним из молекулярных механизмов перекрестной устойчивости является способность БТШ ингибировать развитие ПКС (Вееге, 2004). Перекрестная устойчивость также может развиваться и у растений (Chinnusamy et al., 2004). Мягкое тепловое воздействие, сопровождающееся синтезом БТШ, индуцирует устойчивость растений не только к жесткому тепловому шоку, но и к другим абиотическим стрессам, включая аноксию, окислительный стресс, тяжелые металлы (Nover, 1984; Baniwal et al., 2004). Эти воздействия в растительной клетке могут вызывать развитие ПКС. Возможно, что явление перекрестной устойчивости у растений также определяется способностью БТШ ингибировать развитие ПКС.

2. Салициловая кислота вызывает ингибирование индуцируемой термотолерантности

Синтез БТШ является необходимым звеном в развитии индуцируемой термотолерантности. Ведущую роль в этом явлении у растений играет HsplOl, принадлежащий к семейству белков HsplOO/ClpB (Schirmer et al., 1996; Queitsch et al., 2000). HsplOl в процессе своего функционирования активно взаимодействует с нмБТШ растений, которые обеспечивают более эффективную его работу (Lee et al., 2005). Цитозольные белки Hspl7.6 (I и II класс) принадлежат к семейству нмБТШ (Wehmeyer et al., 1996), Hsp60 является митохондриальным белком, участвующим в фолдинге импортируемых белков в митохондрии (Bukau, Horwich, 1998).

Повышение температуры до 37°С индуцировало экспрессию и синтез HsplOl и Hsp 17.61 в клетках A. íhaliana (рис. 7), чем до определенной степени объясняется повышение жизнеспособности культуры при жестком тепловом шоке 50°С (рис. 6). При обработке СК при нормальной температуре в нашей системе экспериментов наблюдалось повышение устойчивости клеток к 50°С, причем примерно одинаковое во всех используемых концентрациях (0,1-0,5 мМ). Однако такое увеличение термотолерантности оказалось незначительным по сравнению со степенью развития защитной программы, индуцированной инкубированием клеток при 37°С. Наши результаты согласуются с литературными данными, так как уже было показано, что экзогенная СК способствует увеличению термотолерантности (Dat et al., 1998).

Некоторые авторы показали, что СК может вызывать экспрессию генов БТШ. По данным Snyman, Cronje (2008) СК в концентрации 0,1 мМ как самостоятельно, так и совместно с тепловым стрессом в течение 17 ч активировала синтез Hsp70 в проростках томата. В проростках A. thaliana, методом нозерн-блоттинга показано, что обработка 0,1 мМ СК при 26°С, в течение 24 ч индуцировала экспрессию гена HSP17.6I, но не влияла н экспрессию HSP101 (Clarke et al., 2004). В наших условиях эксперимента обработка С1 при 26°С в течение 120 мин не вызывала не только экспрессию HSP101, но и HSP17X (рис. 7). Это несоответствие можно объяснить различными условиями эксперимента (время обработки, концентрация СК), а также тем, что нами была использована культура клеток A. thaliana, a Clarke с соавт. (2004) - проростки. Однако следует отметить, что литературные данные по влиянию СК на экспрессию БТШ несколько противоречивы. Так, с использованием ДНК-микрочипов Blanco с соавт. (2009) показали, что в ответ на обработку проростков A. thaliana 0,5 мМ СК в течение 2,5 ч активируется экспрессия ген HSP17.8-CI, но не приводят никаких данных по изменению экспрессии HSP 17.61.

Возможно, что повышение термотолерантности при обработке СК при 26°С в наших условиях эксперимента происходило за счет активации экспрессии других стрессовых генов, не взятых нами в анализ. Поэтому, нельзя полностью исключать механизм повышения термотолерантности при обработке СК за счет синтеза БТШ. Известно, что СК может действовать на транскрипционные факторы теплового шока (Hsfs) растений и животных, способствуя их ДНК-связывающей активности, хотя это может и не приводить к синтезу БТШ (Jurivich et al., 1992; Snyman, Cronje, 2008). Не исключено, что СК способствует повышению термотолерантности за счет образования большого количеств перекиси водорода, что в свою очередь, приводит к активации механизмов антиоксидантной защиты. Так, известно, что СК индуцирует многие защитные ферменты, такие как супероксиддисмутаза, глутатионредуктаза и другие (Chen, 1996).

Несмотря на то, что обработка СК при нормальной температуре инкубирования повышала термотолерантность, это соединение значительно ингибировало развитие индуцированной термотолерантности, вызванное обработкой 37°С (рис. 6), причем в данном случае наблюдалась зависимость жизнеспособности клеток A. thaliana от используемой концентрации СК. Одновременно СК заметно подавляла экспрессию и

синтез Hspl7.6I и HsplOl при мягком тепловом стрессе (рис. 7). Другие авторы показали, что СК в том же диапазоне концентраций подавляла тепловую индукцию синтеза Hspl7.6 и HsfA2 в растениях томата (Cronje, 2002). Clarke с соавт. (2004) показали на проростках А. thaliana, что мутанты, неспособные накапливать СК и неэкспрсссирующие PR-белки, могли синтезировать IIspl7.6 и HsplOl при тепловом стрессе, что позволило авторам сделать вывод о независимости их синтеза от СК и, тем самым, отсутствии влияния накопления эндогенной СК на развитие индуцированной термотолерантности (Clarke et al., 2004). На основании полученных нами результатов можно сделать вывод, что СК снижает индуцированную термотолерантность, подавляя синтез БТШ при мягком тепловом стрессе.

3. Салициловая кислота активирует экспрессию гена метакаспазы МСЗ

Активация каспаз - цистеиновых протеаз со специфичностью к остатку аспарагиновой кислоты - является специфической чертой ИКС у животных (Yuan et al., 1993). Наиболее близкими к животным каспазам у растений и дрожжей являются аргинин/лизин-специфичные цистеиновые протеазы, получившие название метакаспазы (Vercammen et al., 2007). Геном A. thaliana содержит 9 метакаспаз, которые могут быть по особенностям своих структур и последовательностей разделены на два типа (Sanmartín et al., 2005). Метакаспазы типа I содержат N-концевой продомен, богатый пролином и глутамином, который отсутствует у метакаспаз типа И. Растительные метакаспазы имеют различную локализацию: в клеточной стенке, митохондриях, хлоропластах и цитозоле (Sanmartín et al., 2005; Vercammen et al., 2007). В отличие or животных каспаз, которые постоянно присутствуют в клетке и активируются при развитии ИКС, экспрессия генов некоторых растительных метакаспаз инициируется при абиотических и биотических стрессах (Sanmartín et al., 2005). Рассмотрение метакаспаз как функциональных аналогов животных каспаз предполагает их участие в процессах ПКС. Однако к CD протеазам (группа, к которой относятся каспазы) принадлежат и другие протеазы, многие из которых имеют функции, не связанные с ПКС. Поэтому до сих пор нет единого мнения о том, стоит ли относить метакаспазы к аналогам каспаз. Вопрос о роли метакаспаз в IIKC на данный момент является нерешенным. В литературе имеются данные, свидетельствующие как за, так и против участия метакаспаз в ПКС. Известно, что СК играет важную роль в ПКС, вызванной биотическим стрессом (Alvarez, 2000), а также добавление высоких концентраций СК вызывает гибель клеток по типу ПКС (Kawai-Yamada et al., 2004; Garcia-HeTedia et al., 2008; Тарчевский и др., 2008). Поэтому в ответ на добавление СК изучали экспрессию генов метакаспаз.

Из 9 анализированных нами генов метакаспаз только одни (МСЗ) менял свою экспрессию в отвег на СК (рис. 10в). Метакаспаза МсЗ принадлежит к типу 1 и, предположительно, локализуется в митохондриях. Регуляция её экспрессии, функции и субстратная специфичность до сих пор остаются неизвестными. По данным анализа с использованием ДНК-микрочипов геи МСЗ имеет конститутивную экспрессию, которая возрастает в стареющих цветках, в ответ на гипоксию и обезвоживание (Zimmeimann et al., 2004; Sanmartín et al., 2005). Действительно, в наших экспериментах МСЗ имела небольшую базовую экспрессию. В ответ на добавление СК экспрессия гена МСЗ значительно увеличивалась в течение 120 мин инкубирования с СК (рис. 10в). Другие авторы, используя ДНК-микрочипы, показали, что в ответ на добавление 0,5 мМ СК активировалась экспрессия гена метакаспазы МС2, наиболее близкого по гомологии к МСЗ, и продукт которого, предположительно, также локализован в митохондриях. Однако каких-либо сведений об активации СК экспрессии МСЗ в данной работе нет (Blanco et al., 2009). Разница в результатах, возможно, объясняется тем, что были использованы разные подходы: мы работали с гетеротрофной культурой клеток A. thaliana и проводили анализ

транскриптов с помощью ОТ-ПЦР и специфических для гена МСЗ праймеров, a Blanco с соавт. (2009) использовали в качестве объекта исследований проростки A. lhaliana, выращенные на свету, а в качестве метода исследования - анализ с помощью ДНК-микрочипов.

В наших экспериментах базовый уровень экспрессии гена МСЗ заметно снижался пропорционально длительности мягкого теплового стресса и экспрессии генов БТШ (рис. 12). Также экспрессии МСЗ не наблюдалось, если обработку CK проводили при мягком тепловом стрессе (рис. 11). Показано, что при повышенной температуре снижалась экспрессия многих генов, продукты которых участвуют в защите от атаки патогенов и развитии ПКС (Larkindale, Vierling, 2008). У растений, выдержанных при повышенных температурах, снижался уровень эндогенной CK, не было индукции PR-генов, и подавлялась СВЧ (Malamy et al., 1990; Duke, Doehlert, 1996). Предполагается также наличие антагонизма между синтезом БТШ и развитием Г1КС (Larkindale, Vierling, 2008). Однако само по себе присутствие БТШ в клетках не влияло на экспрессию МСЗ при 26°С (рис. 13).

Снижение экспрессии гена МСЗ при инкубировании клеток в условиях мягкого теплового стресса, а также её активация в ответ на CK может указывать на предположительное участие этой метакаспазы в процессах ПКС, вызванной абиотическими или биотическими факторами. Однако пока мы не зарегистрировали повышение экспрессии МСЗ при обработке 5 мМ CK. Требуются дальнейшие эксперименты, чтобы выяснить связь между экспрессией МСЗ и развитием ПКС.

Наличие у метакаспазы МсЗ транзитного пептида митохондриальной адресации позволило предположить, что она может быть связана с функционированием митохондрий. Действительно, в ответ на нарушения митохондриальных функций, вызванные применением ингибиторов и разобщителей окислительного фосфорилирования, наблюдалась активация экспрессии гена МСЗ (рис. 14). Известно, что CK может действовать как разобщитель и ингибитор окислительного фосфорилирования (Maxwell et al., 2002; Norman et al., 2004). Блокирование электронного транспорта CK, возможно, происходит между H АДН-дети дроге назой и пулом убихинолов (Norman et al., 2004). Такое нарушение ЭТЦ подобно специфическому ингибировапию III комплекса антимицином А (АА). Этот ингибитор нарушает прохождение протонов через внутреннюю мембрану митохондрий посредством нарушения потока электронов по ЭТЦ, что приводит к снижению к mtAy. Протонофор СССР также снижает mtAy. Нами было показано, что CK вызывает снижение mtAy (рис. 10), поэтому стимулом, вызывающим экспрессию МСЗ, может являться падение mtAy.

Таким образом, впервые было показано, что ген МСЗ активируется в ответ на экзогенную CK и ингибируется в условиях мягкого теплового сгресса (при котором происходит повышение mtAy), причём независимо от присутствия БТШ. Также, согласно полученным данным, экспрессия МСЗ активируется в ответ на нарушения митохондриальных функций, связанных со снижением mtAy и ингибируется при стимулах, повышающих mtA\[/.

4. Салициловая кислота посредством действия на митохондрии может менять экспрессию стрессовых генов Показано, что митохондрии играют важную роль в защите клеток от действия различного рода стрессовых факторов (Amirsadeghi et al., 2007). CK может менять состояние митохондрий посредством прямого влияния на работу ЭТЦ. CK в концентрации 1 мМ снижала скорость поглощения кислорода клетками A. thaliana, а в концентрации 5 мМ почти полностью ингибировапа дыхание (рис. 8). Полученные нами результаты согласуются с литературными данными. Так, на клетках табака показано, что

концентрации СК до 0,5 мМ вызывают разобщение окислительного фосфорилирования (Norman et al., 2004), а более высокие концентрации (0,75 мМ и более) - ингибирование дыхания (Xie, Chen, 1999; Maxwell et al, 2002). У растений перенос электронов по ЭТЦ может происходить как через цитохромный путь, так и через альтернативный, связанный с акгивностью альтернативной оксидззы (АО) (Vanlerberghe, Mcintosh, 1997). В нормальных условиях (контроль) перенос электронов по ЭТЦ осуществлялся через цитохромный путь, так как присугствие БГК не сказывалось на поглощении кислорода клетками (рис. 8). В отличие от контроля, при инкубировании культуры клеток A. thaliana с 1 мМ СК в присутствии БГК, дыхание ингибировапось более чем в два раза. Это свидетельствует о том. что СК подавляет поток электронов через цитохромный путь, и он движется через АО.

По литературным данным известно, что ряд генов, продукты которых локализуются в митохондриях и связаны с функционированием митохондриальной поры, а также разобщением окислительного фосфорилирования, могут менять свою экспрессию на ранних стадиях ПКС (Swidzinski et al., 2002).

Для изучения изменений на уровне транскриптов нами были выбраны некоторые из таких генов: VDAC, UCP, ANT. Потенциал-зависимый анионный канал Vdac - это белок внешней мембраны митохондрий, который играет важную роль в регуляции пНДу и транспорте ионов и небольших молекул (например, цитохрома с при ПКС). Показано, что экспрессия VDAC увеличивалась при СВЧ (Swidzinski et ai., 2002). Предполагается, что Vdac совместно с Ant, переносчиком аденинуклеотидов, необходимым для синтеза АТФ, может участвовать в формировании митохондриальной потенциал-зависимой поры (МРТР) - канала внутренней мембраны митохондрий, открывающегося на ранних стадиях ПКС (Vianello et al., 2006). Показано, что на ранних стадиях ПКС в клетках животных наблюдается снижение экспрессии ANT (Swidzinski et al., 2002). Белки UCP катализируют активируемый жирными кислотами I перенос протонов из межмембранного пространства в матрикс митохондрий, вызывая, тем самым разобщение окислительного фосфорилирования. UCP, предположительно, играют роль в снижении АФК при стрессе (Swidzinski et а)., 2002). Для изучения экспрессии разобщающих белков был выбран ген UCPI, экспрессия которого больше активировалась в ответ на стресс (Swidzinski et al., 2002). В ответ на тепловой стресс, добавление СК, а также совместное действие этих факторов не было зарегистрировано изменений экспрессии генов VDAC и UCP. Однако в ответ на обработку 0,1-0,25 мМ СК происходила незначительная активация экспрессии АМТ, которой не наблюдалось при более высоких концентрациях СК и в условиях мягкого теплового стресса (рис. 106).

Время обработки при 37ПС, мин

Рис. 17. Сравнение изменения уровня эндогенной СК, пНДу, экспрессии генов БТШ и МСЗ при мягком тепловом сгрессе.

Клегки инкубировали 0, 5, 15, 30 и 60 мин при 37°С и отбирали для изучения динамики пйДу, для определения уровня эндогенной СК и ОТ-ПЦР анализа.

Известно, что мягкий тепловой стресс сопровождается повышением потенциала на внутренней митохондриальной мембране (гШДу) у растений, дрожжей и в животных клетках (Г)а1о«Ь е1 а!., 2005; ШкЬуапоУ е( а1., 2007). Показано, что повышение т1Ду при мягком тепловом стрессе в клетках А. ¡ИаНапа определяет активацию экспрессии генов Б'ГШ и развитие индуцированной термотолерантности (КлкЬ\апо\' с! а]., 2007). пЦД\у значительно повышался при 37°С и достигал своего максимума достаточно быстро - в течение первых 5 мин обработки (рис. 15). Ранее было показано, что митохондриальные разобщители и ингибиторы, снижающие ш1Д\|/, подавляли индуцируемый тепловым стрессом синтез БТШ (Федосеева и др., 2008). В наших экспериментах СК также снижала т1Д\|/ как при обычных условиях, так и при 37°С (рис. 9).

Сопоставляя повышение уровня СК, вызванное инкубацией клеток при 37°С, с изменением пПЛу и экспрессией БТШ и МСЗ в условиях мягкого теплового стресса (рис. 17), видно, что самым первым ответом па мягкий тепловой стресс является повышение потенциала внутренней митохондриальной мембраны. Он увеличивался в 1,5 раза в течение первых 5 мин инкубирования при 37°С, практически сразу же наблюдалось повышение уровня БТШ. Повышение митохондриалыюго потенциала, видимо, служит активирующим механизмом для индукции экспрессии БТШ. Далее т1Лу оставался примерно на одном и том же уровне, а увеличение экспрессии генов БТШ продолжалось дальше. Что касается изменения уровня СК, то максимум его повышения наблюдался через 15 мин действия мягкого теплового стресса. На начальном этапе инкубации клеток при повышенной температуре уровень экспрессии генов БТШ и повышение СК шли параллельно, однако максимум накопления транскриптов Н5Р101 приходился на временной момент, когда внутриклеточное содержание СК возвращалось на исходный уровень. Несмотря на то, что уровень СК повышается в ответ на тепловой стресс, подавления синтеза БТШ и индуцируемой термотолерантности не происходит. Это, возможно, объясняется низкой концентрацией эндогенной СК и кратковременностью ее увеличения, недостаточной для изменения функций митохондрий и снижения гШДу. По нашим расчетам максимальная концентрация СК во время мягкого теплового стресса достигала 0,014 мМ, чего явно недостаточно для влияния на т!Ау. По данным Могтап с соавт. (2004) СК снижала дыхание очищенных митохондрий только в концентрации 0,1 мМ и выше. Однако при СВЧ концентрация эндогенной СК возрастает до 0,1 мМ (ЕпуесИ е1 а!., 1992) и может достигать значений, которые теоретически могут влиять на состояние митохондрий и снижать п^Ду. Снижение пиЛ\|/, вызванное экзогенной СК, предотвращало экспрессию БТШ и, как следствие, происходило ингибирование индуцируемой термотолерантности. На основе полученных нами результатов и литературных данных, можно сделать вывод, что СК, в зависимости от окружающих условий, может индуцировать или подавлять экспрессию БТШ посредством модуляции функций митохондрий. Активация СК экспрессии гена метакаспазы МСЗ, предположительно, локализованной в митохондриях, может являться новым фактом сопряжения функций СК, митохондрий и БТШ, требующим дальнейшего более детального изучения.

Таким образом, СК может являться ключевой сигнальной молекулой, способной изменять состояние митохондрий, а они, в свою очередь, - запускать выполнение защитной программы или, наоборот, ПКС.

выводы

1. Салициловая кислота в концентрации 5 мМ вызывает гибель культуры клеток А. thaliana. Гибель развивается в динамике и сопровождается отставанием цитоплазмы от клеточной стенки.

2. Повышение содержания БТШ в результате инкубирования в условиях мягкого теплового стресса защищает клетки А. thaliana от гибели, вызванной салициловой кислотой.

3. Салициловая кислота подавляет развитие индуцированной термотолерантности, активацию экспрессии генов БТШ и повышение потенциала на внутренней митохондриальной мембране при мягком тепловом стрессе.

4. Экспрессия гена метакаспазы МСЗ активируется в ответ на обработку салициловой кислотой, а также митохондриальными ингибиторами и разобщителями.

5. Активация экспрессии МСЗ, вызванная салициловой кислотой, подавляется в условиях мягкого теплового стресса, но не зависит от присутствия БТШ.

6. Максимальный уровень синтеза БТШ при мягком тепловом стрессе прямо пропорционален значению потенциала на внутренней митохондриальной мембране и обратно пропорционален уровню эндогенной салициловой кислоты.

7. Полученные результаты позволяют предполагать, что активирующий или ингибирующий эффект CK на экспрессию стрессовых генов может определяться ее способностью снижать потенциал на внутренней митохондриальной мембране.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Дзюбина ЕЛ. Влияние салициловой кислоты на развитие индуцированной термотолерантности и индукцию синтеза БТШ в культуре клеток Arabidopsis thaliana ! Е.Л. Дзюбина, Е.Г. Рихванов, E.J1. Таусон, H.H. Варакина, К.З. Гамбург, Т.М. Русалева, Г.Б. Боровский, В.К. Войников // Тезисы докл. / ИД ФБК-ПРЕСС. -Москва, С. 118-119.

2. Павлова ЕЛ. Влияние салициловой кислоты на развитие индуцированной термотолерантности и индукцию синтеза БТШ в культуре клеток Arabidopsis thaliana / E.JI. Павлова, Е.Г. Рихванов, ЕЛ. Таусон, H.H. Варакина, К.З. Гамбург, Т.М. Русалсва, Г.Б. Боровский, В.К. Войников // Физиология растений. - 2009. - Т. 56, № 1. - С. 78-84.

3. Павлова ЕЛ. Влияние салициловой кислоты на развитие индуцированной термотолерантности и индукцию синтеза БТШ в культуре клеток Arabidopsis thaliana / ЕЛ. Павлова, Е.Г. Рихванов, Е.Л. Таусон, H.H. Варакина, К.З. Гамбург, Т.М. Русалева, Г.Б. Боровский, В.К. Войников // Сб. мат-в / УД АН РУз. - Ташкент, 2008. -С. 96-98.

4. Павлова Е.Л. Салициловая кислота подавляет индуцируемую термотолерантность и синтез белков теплового шока в культуре клеток Arabidopsis thaliana / Е.Л. Павлова, Е.Г. Рихванов, Е.Л. Таусон, H.H. Варакина, К.З. Гамбург, Т.М. Русалева, Г.Б. Боровский, В.К. Войников// Сб. мат-в / РИО НЦРВХ СО РАМН. Иркутск, 2009. -С. 350-353.

5. Павлова ЕЛ., Салициловая кислота активирует экспрессию МС2 в культуре клеток Arabidopsis thaliana / Е.Л. Павлова, Е.Л. Таусон, Е.Г. Рихванов, К.З. Гамбург, Г.Б.

Боровский, B.K. Войников // Сб. мат-в / РИО НЦРВХ СО РАМН. - Иркутск, 2009. -С. 354-357.

6. Павлова ЕЛ. Салициловая кислота как возможный модулятор состояния митохондрий Arabidopsis thaliana при мягком тепловом стрессе / E.JI. Павлова, Е.Г. Рихванов, Е.Л. Таусон, H.H. Варакина, К.З. Гамбург, Т.М. Русалева, А.В.Степанов, Г.Б. Боровский, В.К. Войников // Сб. мат-в / Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. - Москва, 2009. - С. 205-206.

Подписано в печать 26.01.10. Формат 210x147 1/16. Бумага писчая белая. Печать RIZO Усл.печ.л. 1.6. Отпечатано в типографии ИП Овсянников A.A. Тираж 100 экз. Заказ №72

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Павлова, Елена Леонидовна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 .Салициловая кислота, общая характеристика.

1.1.1. История открытия.

1.1.2. Биосинтез салициловой кислоты.

1.1.3. Содержание салициловой кислоты в тканях растений.

1.1.4. Салициловая кислота и защита от биотического стресса.

1.1.5. Участие салициловой кислоты в сигнальной трансдукции.

1.1.6. Роль салициловой кислоты в генерации АФК.

1.2. Роль салициловой кислоты в программируемой клеточной смерти.

1.2.1. Общие характеристики программируемой клеточной смерти растений и животных.

1.2.2. Участие салициловой кислоты в реакции сверхчувствительности.

1.2.3. Роль салициловой кислоты у мутантов со спонтанной клеточной гибелью.

1.2.4. Программируемая клеточная смерть, вызванная применением экзогенной салициловой кислоты.

1.3. Явление индуцируемой термотолерантпости.

1.4. Белки теплового шока.

1.4.1. Семейство С1р/Нзр100.

1.4.2. Белки семейства Мзр90.

1.4.3. Белки семейства Шр70.

1.4.4. Шаперонины (семейство НэрбО).

1.4.5. Низкомолекулярпые БТШ.

1.4.6. Регуляция экспрессии БТШ.

1.5. Взаимодействие между салицилат-оносредованпыми сигнальными путями и ответами на действие повышенных температур.

1.5.1. Влияние салициловой кислоты па устойчивость к повышенным температурам.

1.5.2. Влияние салициловой кислоты на синтез БТШ.

1.5.3. Взаимодействие ответов на действие повышенных температур и атаку патогенов.

1.6. Роль митохондрий в стрессовых ответах.

1.6.1. Роль митохондрий в синтезе БТШ.

1.6.2. Влияние салициловой кислоты на функционирование митохондрий.

1.7. Выводы из обзора литературы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Температурные обработки.

2.3. Обработка клеток салициловой кислотой, ингибиторами и разобщителями ЭТЦ.

2.4. Методы оценки жизнеспособности клеток.

2.4.1. Определение жизнеспособности клеток по восстановлению ТТХ.

2.4.2. Окрашивание мертвых клеток.

2.5. Выделение суммарного белка.

2.6. Электрофорез в ПААГе с ДДС-Ыа.

2.7. Окрашивание и обесцвечивание гелей.

2.8. Вестерн-блотинг.

2.9. Использованные антитела.

2.10. ОТ-ПЦР-анализ.

2.10.1. Выделение РНК.

2.10.2. Денатурирующий РНК электрофорез.

2.10.3. Синтез кДНК.

2.10.4. Электрофорез в агарозном геле.

2.11. Определение дыхательной активности.

2.12. Микроскопические методы (флуоресцентная и световая микроскопия).

2.13. Определение содержания эндогенной салициловой кислоты.

2.14. Статистическая обработка данных.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Влияние экзогенной салициловой кислоты на жизнеспособность культуры клеток Л. ihaliana.

3.1.1. Влияние длительной обработки салициловой кислотой на культуру клеток

Л. thaliana.

3.1.2. Действие салициловой кислоты на движение цитоплазмы.

3.1.3. Действие салициловой кислоты на морфологическую структуру клеток.

3.1.4. Влияние предобработки мягким тепловым стрессом на жизнеспособность клеток, обработанных салициловой кислотой.

3.2. Влияние салициловой кислоты на культуру клеток A thaliana при мягком тепловом стрессе.

3.2.1. Влияние кратковременной обработки салициловой кислотой на жизнеспособность клеток A. thaliana.

3.2.2. Влияние салициловой кислоты на развитие индуцированной термотолерантности и синтез БТШ.

3.3. Влияние салициловой кислоты на функции митохондрий.

3.3.1 Изменение интенсивности поглощения кислорода в присутствии салициловой кислоты.

3.3.2. Влияние салициловой кислоты на изменение потенциала внутренней митохондриальной мембраны.

3.4. Экспрессия стрессовых генов при действии салициловой кислоты и мягкого теплового стресса.

3.4.1. Действие салициловой кислоты на экспрессию стрессовых генов.

3.4.2. Изучение экспрессии гена метакаспазы МСЗ.

3.4.2.1. Экспрессия гена МСЗ после инкубации клеток в условиях жесткого теплового шока.

3.4.2.2. Экспрессия гена МСЗ в условиях мягкого теплового стресса.

3.4.2.3. Экспрессия генаМСЗ при нарушениях митохондриальных функций.

3.5. Сравнение динамики изменения потенциала на внутренней митохондриальной мембране и эндогенного уровня салициловой кислоты при мягком тепловом стрессе

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Мягкий тепловой стресс способствует защите клеток от летального действия салициловой кислоты.

4.2. Салициловая кислота вызывает ингибирование индуцируемой термотолерантности.

4.3. Салициловая кислота активирует экспрессию гена метакаспазы МСЗ.

4.4. Салициловая кислота посредством действия на митохондрии может менять экспрессию стрессовых генов.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль салициловой кислоты в регуляции стрессовых ответов в культуре клеток Arabidopsis thaliana"

Известно, что температура — один из самых быстро меняющихся факторов окружающей среды. Большинство районов на Земле подвержены суточным колебаниям температуры, амплитуда которых может достигать десятков градусов, и эти изменения могут происходить в течение нескольких часов. Повышенная температура является одним из самых распространенных неблагоприятных факторов окружающей среды. По причине высокой температуры и засухи происходят большие потери урожаев, поэтому исследование механизмов устойчивости к тепловому стрессу имеет большое практическое значение и до сих пор остается актуальной задачей . I

Тепловой стрессор — фактор, действующий на все группы организмов, будь то бактерии, растения, грибы или животные. Общая черта ответа всех организмов на тепловой стрессор заключается в том, что предобработка мягкими температурами способствует выдерживанию организмом последующей летальной температуры. Это явление было названо «индуцируемой термотолерантностыо». Устойчивость растений к тепловому стрессу во многом определяется белками теплового шока (БТШ). Структура и функции БТШ на сегодняшний день изучены довольно хорошо, однако в механизмах регуляции их синтеза до сих пор остается много неясного.

Растения, в силу своей природы, постоянно подвергаются действию различных неблагоприятных факторов окружающей среды, в том числе изменениям температуры. Из-за невозможности их избежать, растения должны быть хорошо приспособлены и быстро реагировать на изменения температуры. Митохондрии считаются основными сенсорами клеточного повреждения. На данный момент в литературе показана несомненная роль участия,- как растительных, так и животных митохондрий в развитии I-программируемой клеточной смерти (ПКС). Ранее на дрожжах и культуре клеток АгаЫс1ор818 ¡каИапа было показано, что митохондрии арабидопсиса посредством изменения потенциала на внутренней митохондриальной мембране (п^Дц/) регулируют экспрессию генов БТШ в условиях мягкого теплового стресса (Rikhvanov et al., 2007). Этот вывод подразумевал существование эндогенного соединения, способного модулировать функциональное состояние митохондрий клетки при стрессе. В случае растительных организмов этому условию может отвечать салициловая кислота (СК). СК является важной сигнальной молекулой в развитии устойчивости к биотическому стрессу. Известно, что СК во время атаки патогенов быстро накапливается в клетках, индуцируя программируемую клеточную смерть (ПКС) вокруг пораженного участка, так называемый сверхчувствительный ответ (СВЧ)^ и способствует формированию пролонгированной системной приобретенной устойчивости (СПУ) к широкому спектру последующих инфекций (Mur et al., 2007). Также имеются данные о положительной роли СК в развитии устойчивости и к абиотическим стрессам, например, к тепловому. К настоящему времени накоплены достаточно обширные сведения о роли СК в защите от инфицирования патогенами. В то же время имеется относительно немного работ о действии СК на состояние митохондрий. Так, в литературе имеются сведения о влиянии СК на интенсивность поглощения кислорода, активацию альтернативной оксидазы (АО). Показано, что СК может действовать как разобщитель и ингибитор дыхания и окислительного фосфорилирования у табака (Xie, Chen, 1999; Maxwell et al., 2002; Norman et al, 2004). Также показано, что СК снижает уровень АТФ (Xie, Chen, 1999; Maxwell et al., 2002). Известно также, что в ответ на СК активируется экспрессия большого числа генов. Существует предположение, что СК может менять экспрессию генов посредством воздействия на митохондрии (Maxwell et al., 2002).

В связи с этим, целью настоящей работы было изучение влияния экзогенной СК на экспрессию стрессовых генов в культуре клеток Arabidopsis thaliana в зависимости от её способности снижать потенциал на внутренней митохондриальной мембране.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить влияние салициловой кислоты на жизнеспособность культуры клеток А. ЖаИапа.

2. Исследовать влияние экзогенной салициловой кислоты на развитие индуцируемой термотолерантности у культуры клеток А. МаИста.

3. Выявить влияние салициловой кислоты на потенциал на внутренней митохондриальной мембране и дыхательную активность клеток.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Павлова, Елена Леонидовна

ВЫВОДЫ

1. Салициловая кислота в концентрации 5 мМ вызывает гибель культуры клеток А. МаИапа. Гибель развивается в динамике и сопровождается отставанием цитоплазмы от клеточной стенки.

2. Повышение содержания БТШ в результате инкубирования в условиях мягкого теплового стресса защищает клетки А. ЖаНапа от гибели, вызванной салициловой кислотой.

6. Максимальный уровень синтеза БТШ при мягком тепловом, стрессе прямо пропорционален значению потенциала на внутренней митохондриальной мембране и обратно пропорционален уровню эндогенной салициловой кислоты.

7. Полученные результаты позволяют предполагать, что активирующий или ингибирующий эффект СК на экспрессию стрессовых генов может определяться ее способностью снижать потенциал на внутренней митохондриальной мембране.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Павлова, Елена Леонидовна, Иркутск

1. Александров, В Л. Реактивность клеток и белки / В.Я. Александров. -Л.: Наука, 1985.-318 с.

2. Александров В.Я. Реакция клетки на тепловой шок: Физиологический аспект / В.Я. Александров, Кислюк И.М. // Цитология. 1994. - Т.36, №1. - С.5-59.

3. Бурханова, Э.А. Сравнительное изучение влияния салициловой кислоты и (2'-5')-олигоаденилатов на синтез белка в листьях табака при тепловом шоке / Э.А. Бурханова, А.Б. Федина, О.Н. Кулаева // Физиология растений. 1999. - Т.46. - С. 16-22.

4. Ван, Л.-Ж. Влияние тепловой обработки растений винограда на содержание салициловой и абсцизовой кислот и теплоустойчивость растений / Л.-Ж. Ван, В.-Д. Хуан, Ю.-П. Лю, Ж.-Ч. Чжан // Физиология растений. -2005. Т.52, № 4. С. 578-583.

5. Васюкова, Н. И. Индуцированная устойчивость растений и салициловая кислота (обзор) / Н. И. Васюкова, Озерецковская О. Л.// Прикладная биохимия и микробиология. — 2007. Т.43, №4. С. 405-411.

6. Васюкова, Н.И., // Н.Г. Герасимова, О.Л. Озерцовская // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. - Т.35, №5. - С. 557-563.

7. Евстигнеева, З.Г. Структура и функции шаперонов и шаперонинов (обзор) / З.Г. Евстигнеева, H.A. Соловьева, Л.И. Сидельникова // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. - Т.37. - С.5-18.

8. Еникеев, А.Г. Об использовании 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида для оценки жизнеспособности культур растительных клеток / А.Г. Еникеев, Е.Ф. Высоцкая, Л.А. Леонова, К.З. Гамбург // Физиология растений. -1995. Т.42. - С.423-426.

9. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. — М.: Высшая школа, 1973. —343 с.

10. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук. М.: Мир, 1984. — 480 с.

11. Мийдла, X. Фенолкарбоновые кислоты в листьях яблони / X. Мийдла, Халдре Ы., Сависаар С. //. Уч. зап. Тартус. ун-та. 1975. -T.362.-C.3-13.

12. Самуилов, В.Д. Программируемая клеточная смерть у растений / В.Д. Самуилов // Соросовский Образовательный журнал. 2001. - № 10. - С. 12-17.

13. Тарчевский И.А. Элиситор-индуцируемые сигнальные системы и их взаимодействие. 2001 Физиол. растений. 47: 321-331.

14. Тарчевский, И.А. Протеомный анализ изменений в корнях гороха, вызванных апопоз-индуцирующей концентрацией салициловой кислоты / И.А. Тарчевский, В.Г. Яковлева, A.M. Егорова // Докл. РАН. 2008. - Т. 422, № 3. - С. 410-414.

15. Ярилин, А.А. Апоптоз и его роль в целостном организме / А.А. Ярилин // Глаукома. 2003. - №2. - С.46-54.

16. Allen, K.D. Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion PS/'. / K.D. Allen, R.D. Wegrzyn, T.A. Chemova et al. // Genetics. 2005. - V. 169. - P. 1227-1242.

17. Al-Nasser, I.A. Salicylate-induced kidney mitochondrial permeability transition is prevented by cyclosporin A / I.A. Al-Nasser// Toxicol. Lett. 1999. V.105. - P. 1-8.

18. Alvarez, M.E. Salicylic acid in the machinery of hypersensitive cell death and disease resistance / M.E. Alvarez. // Plant Mol. Biol. 2000. - V.44, №1. - P.429^142.

19. Alvarez, M.E. Reactive oxygen intermediates mediate a systemic signal network in the establishment of plant immunity / M.E.Alvarez, R.I. Pennell, P.J. Meijer, A. Ishikawa, R.A. Dixon, C. Lamb // Cell. 1998. - V.92. - P.773-784.

20. Amirsadeghi, S. The role of the mitochondrion in plant responses to biotic stress / S. Amirsadeghi, C.A. Robson, G.C. Vanlerberghe // Physiologia Plantarum. 2007. - V.129. - P.253-266.

21. Baker, C.J. Active oxygen species in plant pathogenesis / C.J. Baker, E.W. Orlandi // Annu Rev Phytopathol. 1995. - V.33. - P.299-321.

22. Baker, C.J. An improved method for monitoring cell death in cell suspension and leaf disc assays using evans blue / C.J. Baker, N.M. Mock // Plant Cell, Tissue Organ Cult. 1994. - V.39. - P.7-12.

23. Balogh, G. The hyperfluidization of mammalian cell membranes acts as a signal to initiate the heat shock protein response / G. Balogh, I. Horvath, E. Nagy et al. // FEBS J. 2005. - V.272, №23. - P.6077-6086.

24. Beere, H. 'The stress of dying': the role of heat shock proteins in the regulation of apoptosis / H. Beere // J Cell Sci. -2004. V.l 17.-P.2641-2651.

25. Beers, E.P. Regulation and execution of programmed cell death in response to pathogens, stress and developmental cues / E.P. Beers, J.M. McDowell // Curr. Opin. Plant Biol. 2001. - V.4. - P.561-567.

26. Bettaieb, A. Thermotolerance induced at a mild temperature of 40 degrees C protects cells against heat shock-induced apoptosis / A. Bettaieb, D.A. Averill-Bates // Cell Physiol. 2005. - V.205 - P.47-57.

27. Biswas, G. Mitochondria-to-nucleus stress signaling in mammalian cells: nature of nuclear gene targets, transcription regulation, and induced resistance to apoptosis / G. Biswas, M. Guha, N.G. Avadhani // Gene. — 2005.- V.18. P. 132-139.

28. Blanco, F. Early genomic responses to salicylic acid in Arabidopsis / F. Blanco, P. Salinas, N.M. Cecchini, X. Jordana, P.V. Hummelen, M.E. Alvarez, L. Holuigue. // Plant Mol Biol. 2009. - V.70 - P.79-102.

29. Bolwell, G.P. Role of active oxygen species and NO in plant dcfence responses / G.P. Bolwell //. Curr. Opin. Plant Biol. 1999.- V.2. -P.287-294.

30. Bonneau, L. What happened to plant caspases? / L. Bonneau Y. Ge, G.E. Drury and P. Gallois // Journal of Experimental Botany. 2008. V.59, № 3. P.491-499.

31. Borsani, O. Evidence for a Role of Salicylic Acid in the Oxidative Damage Generated by NaCl and Osmotic Stress in Arabidopsis Seedlings / O. Borsani, V. Valpuesta, M.A. Botella // Plant Physiol. 2001. - V. 126. - P. 1024-1030.

32. Bosl, B. The molecular chaperone Hspl04-A molecular machine for protein disaggregation / B. Bosl, V. Grimminger, S. Walter // J. Struct. Biol. 2006. J Struct. Biol. 2006. V.156, №1. P.139-148.

33. Brandalise, M. Overexpression of plant uncoupling mitochondrial protein in transgenic tobacco increases tolerance to oxidative stress / M. Brandalise,

34. G. Maia, J. Borecky, A.E. Vercesi, P. Arruda // J Bioenerg Biomembr. — 2003. V.35. - P.203-209.

35. Brendel, C. Multiprotein Bridging Factor-1 (MBF-1) Is a Cofactor for Nuclear Receptors that Regulate Lipid Metabolism / C. Brendel, L. Gelman, J. Auwerx //Mol. Endocrinol. 2002. - V.16. P. 1367-1377.

36. Brodersen, P. The Role of Salicylic Acid in the Induction of Cell Death in Arabidopsis acdl 1 / P. Brodersen, F.G. Malinovsky, K. Hematy, M. Newman, J. Mundy // Plant Physiol. 2005. - V. 138. - PI037-1045.

37. Bukau, B. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines / B. Bukau, A.L. Horwich // Cell. 1998. - V.92. P.351-366.

38. Busch, W. Identification of novel heat shock factor-dependent genes and biochemical pathways in Arabidopsis thaliana / W. Busch, M. Wunderlich, F. Schoffl //Plant Journal. 2005. - V.41. - P. 1-14.

39. Cao, H. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats / H. Cao, J. Glazebrook, J.D. Clarke, S. Volko, X. Dong // Cell. 1997. - V.88. P.57-63.

40. Che, F.S., Biochemical and morphological features of rice cell death induced by Pseudomonas avenae. / F.S. Che, M. Iwano, N. Tanaka, S. Takayama, E. Minami, N. Shibuya, I. Kadota, A. Isogai // Plant and Cell Physiol. 1999. -V.40. - P. 1036-1045.

41. Chen, H.J. Ca2+-dependent and Ca2+-independent excretion modes of salicylic acid in tobacco cell suspension culture / H.J. Chen, W.C. Hou, J.J. Kuc, Y.H. Lin // Journal of Experimental Botany. 2001.-V.52.-P. 1219-1226.

42. Chen, H.J. Ca2+-dependent excretion of salicylic acid in tobacco cell suspension cultures / H.J. Chen, J.J. Kuc // Botanical Bulletin of Academia Sinica. 1999. - V.40. - P.267-273.

43. Chen, W. The promoter of a H202-inducible, Arabidopsis glutathione S-transferase gene contains closely linked OBF- and OBP1-binding sites / W. Chen, G. Chao, K.B. Singh // The Plant Journal. 1996. - V.10. - P.955-66.

44. Chen, Z. Active oxygen species in the induction of plant systemic acquired resistance by salicylic acid / Z. Chen, H. Silva, D.F. Klessig // Science. -1993.-V. 262. P.1883-1886.

45. Chinnusamy, V. Molecular genetic perspectives on cross-talk and specificity in abiotic stress signalling in plants / V. Chinnusamy, K. Schumaker and J.K. Zhu // Journal of Experimental Botany. 2004. - V.55, N.395. - P. 225-236.

46. Chou, M. Termotolerance of isolated mitochondria associated with heat shock proteins / M. Chou, Y.-M. Chen, C.-Y. Lin // Plant Physiol. 1989. - V.89. - P.617-621.

47. Clarke, S.M. Salicylic acid dependent signaling promotes basal thermotolerance but is not essential for acquired thermotolerance in Arabidopsis thaliana / S.M. Clarke, L.A. Mur, J.E. Wood, I.M. Scott // The Plant Journal. 2004. - V.38. - P.432-447.

48. Cronje, M.J. Heat Shock Protein 70 and Defence Responses in Plants: Salicylic Acid and Programmed Cell Death / M.J. Cronje // Faculty of Science at the Rand Afrikaans University Auckland Park South Africa. 2002. - p. 145.

49. Cronje', M.J. Salicylic acid-mediated potentiation of Hsp70 induction •correlates with reduced apoptosis in tobacco protoplasts / M.J. Cronje', I.E. Weir, L. Bornman // Cytometry. 2004. - V.61A. - P.76-87.

50. Dat, J.F. Changes in Salicylic Acid and antioxidants during induced thrmotolerance in mustard seedlings / J.F. Dat, C.H. Foyer, I.M. Scott // Plant. Physiol. 1998. - V.l 18. - P 1455-1461.

51. Dat, J.F. Parallel Changes in H2O2 and Catalase During Thermotolerance Induced by Salicylic Acid or Heat Acclimation in Mustard Seedlings / J.F. Dat, H. Lopez-Delgado, C.H. Foyer, I.M. Scott. // Plant Physiol. 1998. - V.l 16. - P. 1351-1357.

52. Delaney, T.P. Genetic dissection of acquired resistance to disease / T.P. Delaney // Plant Physiol. 1997. - V.l 13. - P.5-12.

53. Delaney, T.P. A central role of salicylic acid in plant disease resistance / T.P. Delaney, S. Uknes, B. Vernooij, L. Friedrich, K. Weymann, et al. // Science. 1994. - V.266. - P. 1247-1250.

54. Delledonne, M. Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance / M. Delledonne, Y. Xia, RA. Dixon, and C. Lamb //Nature. -1998. V.394. -P.585-588.

55. Desagher, S. Mitochondria as the central point of apoptosis / S. Desagher, J-C. Martinou // Trends Cell Biol. 2000. V.10. P.369-377.

56. Devadas, S.K. Preexisting systemic acquired resistance suppresses hypersensitive responseassociated cell death in Arabidopsis hrll mutant / S.K. Devadas, R. Raina // Plant Physiol. 2002. - V. 128. - P. 1234-1244.

57. Didelot, C. Heat shock proteins: endogenous modulators of apoptotic cell death / C. Didelot, E. Schmitt, M. Brunet et al. // HEP. 2006. - V. 172. - P.171-198.

58. Duke, E.R. Effects of heat stress on enzyme activities and transcript levels in developing maize kernels grown in culture / E.R. Duke, D.C. Doehlert // Environ. Exp. Bot. 1996. - V.36. - P. 199-208.

59. Elbaz, M. Constitutive caspase-like machinery executes programmed cell death in plant cells / M. Elbaz, A. Avni, M. Weil // Cell Death Differ. -2002. V.9. -P.726-733.

60. Enyedi, A.J. Localization, conjugation and function of salicylic acid in tobacco during the hypersensitive response to tobacco mosaic virus / AJ. Enyedi, N. Yalpani, P. Silverman, I. Raskin // PNAS, USA. 1992. - V.89. - P.2480-2484.

61. Fadok, V.A. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages / V.A. Fadok, D.R. Voelker, P.A. Campbell et al. // J. Immunol. 1992. -V.148, №7. - P.2207-2216.

62. Fawcett, T.W. Potentiation of heat stress-induced hsp70 expression in vivo by aspirin / T.W. Fawcett, X. Qingbo N.J. Holbrook // Cell Stress & Chaperones. 1997. - V.2, №2. - P. 104-109.

63. Foyer, C.H. Protection against oxygen radicals: an important defence mechanism studied in transgenic plants / C.H. Foyer, P. Descourvie'res, K.J. Kunert // Plant, Cell and Environment. 1994. - V.17. - P.507-523.

64. Frydman, J. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones / J. Frydman // Annu. Rev. Biochem. -2001.- V.70. P.603-647.

65. Fukuda, H. Programmed cell death of tracheary elements as a paradigm in plants / H. Fukuda // Plant Mol. Biol. 2000. V.44. - P.245-253.

66. Garcia-Heredia, J.M. Acetylsalicylic acid induces programmed cell death in Arabidopsis cell cultures / J.M. Garcia-Heredia, M. Hervas, M.A. De la Rosa, J.A. Navarro // Planta. 2008. - V.228, №.1. P.89-98.

67. Giardina, C. Sodium salicylate and yeast heat shock gene transcription / C. Giardina, J.T. Lis//J. Biol. Chem. 1995. - V.18. - P.10369-19372.

68. Glover, J.R. Hspl04, Hsp70 and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins / J.R. Glover, S. Lindquist // Cell. -1998. V.94. - P.73-82.

69. Greenberg, J.T. Uncoupling salicylic acid-dependent cell death and defense-related responses from disease resistance in the Arabidopsis mutant acd5 / J.T. Greenberg, F.P. Silverman, H. Liang//Genetics. 2000.- V. 156.-P.341-350.

70. Gupta, S. HSP60, Bax, apoptosis and the heart / S. Gupta, A.A. Knowlton // J. Cell. Mol. Med. 2005. - V.9, №1. - P.51-58.

71. Hahn, J.S. Genome-wide analysis of the biology of stress responses through heat shock transcription factor / J.S. Hahn, Z. Hu, D.J. Thiele, V.R. Iyer // Molecular and Cellular Biology. 2004. - V.24. - P.5249-5256.

72. Hahn, G. M. Thermotolerance and heat shock proteins in mammalian cells / G. M. Hahn, G. C. Li // Radiat. Res. 1982. - V.92. - P.452-457.

73. Harms, K. Inhibition of wound-induced accumulation of allene oxide synthase transcripts in Xax leaves by aspirin and salicylic acid / K. Harms, I. Ramirez, H. Pena-Cortes//Plant Physiol. 1998. - V.l 18. - P.1057-1065.

74. He, R. Metacaspase-8 Modulates Programmed Cell Death Induced by Ultraviolet Light and H202 in Arabidopsis / R. He, G.E. Drury, V.I. Rotari, A. Gordon, M. Wilier, T. Farzaneh, E.J. Woltering, P. Gallois // J. Biol. Chem. 2008. V.283, №2. P. 774-783.

75. He, Y. Effects of Salicylic Acid on Heat Tolerance Associated with Antioxidant Metabolism in Kentucky Bluegrass / Y. He, Y. Liu, W. Cao, M. Huai, B. Xu, B. Huang // Crop Science. 2005. - V.45. - P. 988-995.

76. Hennig J. Intercoversion of the salicylic acid signal and its glucoside in tobacco / J. Hennig, J. Malamy, G. Grynkiewicz, J. Indulski, D.F. Klessig // The plant Journal. 1993. -V.4. - P.593-600.

77. Hoeberichts, F.A. A tomato metacaspase gene is upregulated during programmed cell death in Botrytis cinerea-infected leaves / F.A. Hoeberichts, A. ten Have, E.J. Woltering // Planta. 2003. - V.217. - P.517-522.

78. Hoeberichts, F.A. Multiple mediators of plant programmed cell death: interplay of conserved cell death mechanisms and plant-specific regulators // F.A. Hoeberichts, E.J. Woltering // BioEssays. 2002. - V.25. - P.47-57.

79. Hong, S.W. Arabidopsis hot mutants define multiple functions required for acclimation to high temperatures / S.W. Hong, U. Lee, E. Vierling // Plant Physiol. 2003. - V.132, №2. - P.757-767.

80. Hong, S.W. Mutants of Arabidopsis thaliana defective in the acquisition of tolerance to high temperature stress / S.W. Hong, E. Vierling // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V.97, №8. - P.4392-4397.

81. Howarth, C.J. Molecular responses of plants to an increased incidence of heat shock / C.J. Howarth // Plant, Cell and Environment. 1991. - V.14. - P.831 -841.

82. Jurivich, D.A. Salicylate triggers heat shock differently than heat / D.A. Jurivich, C. Pachetti, L. Qiu, J.F. Wclk // J. Biol. Chem. 1995. - V.270. -P.24489-24495.

83. Jurivich, DA. Effect of sodium salicylate on the human HS response DA. Jurivich, L. Sistonen, RA. Kroes, RI. Morimoto // Science. 1992. - V.255. -P. 1243-1245.

84. Kaplan, F. Exploring the temperature-stress metabolome of Arabidopsis / F. Kaplan, J. Kopka, D.W. Haskell, W. Zhao, K.C. Schiller, N. Gatzke, D.Y. Sung, C.L. Guy // Plant Physiol. 2004. - V.136. - P.4159-68,

85. Katiyar-Agarwal, S. Search for the cellular functions of plant HsplOO/Clp family proteins / S. Katiyar-Agarwal, M. Agarwal, D.R. Gallie, A. Grover. // Crit Rev Plant Sci. 2001. - V.20, №3 - P.277-295.

86. Kaufmann, S.H. Programmed cell death: Alive and well in the new millennium / S.H. Kaufinann, M.O. Hengartner // Trends Cell Biol. -2001. -V. 11. P.526-534.

87. Kawai-Yamada, M., Dissection of Arabidopsis Bax Inhibitor-1 Suppressing Bax-Hydrogen Peroxide-, and Salicylic Acid-Induced Cell Death / M. Kawai-Yamada, Y. Ohori, H. Uchimiya// The Plant Cell. -2004. V.16. P.21-32.

88. Kessler, A. Plant responses to insect herbivory: The emerging molecular analysis / A. Kessler, I.T. Baldwin // Annu. Rev. Plant Biol. 2002. - V.53. - P.299-328.

89. Kinkema, M. Nuclear localization ofNPRl is required for activation of PR gene expression / M. Kinkema, W.H. Fan, X.N. Dong // Plant Cell. 2000. -V.12. — P.2339—2350.

90. Koo, Y.J. Overexpression of salicylic acid carboxyl methyltransferase reduces salicylic acid-mediated pathogen resistance in Arabidopsis thaliana / YJ. Koo, M.A. Kim, E.H. Kim, J.T. Song, C. Jung //Plant Mol. Biol. 2007. - V.64. - P. 1-15.

91. Koornneef, A. Kinetics of salicylatemediated suppression ofjasmonate signaling reveal a role for redox modulation / A. Koornneef, A. Leon-Reyes, T. Ritsema,

92. A. Verhage, F.C. Den Otter // Plant Physiol. 2008. - V.147. - P. 1358-1368.

93. Kunkel, B.N. Cross talk between signaling pathways in pathogen defense /

94. B.N. Kunkel, D.M. Brooks // Current Opinion in Plant Biology 2002. -V.5. - P.325-331.

95. Kuzmin, E.V. Mitochondrial respiratory deficiencies signal up-regulation of genes for heat shock proteins / E.V. Kuzmin, O.V. Karpova, T.E. Elthon, K.J. Newton // J. Biol. Chem. 2004. - V.279. - P.20672-20677.

96. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assemble of the head bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. 1970. - V.227, № 5259. - P.680-685.

97. Lam, E. Controlled cell death, plant survival and development / E. Lam // Nat Rev Mol Cell Biol. -2004. V.5. -P.305-315.

98. Lamb, C. The oxidative burst in plant disease resistance / C. Lamb, R.A. Dixon // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. - V.48. - P.251-275.

99. Larkindale, J. Heat stress phenotypes of Arabidopsis mutants implicate multiple signaling pathways in the acquisition of thermotolerance / J. Larkindale, J.D. Hall, M.R. Knight et al. // Plant Physiol. 2005a. - V. 138. - P.882-897.

100. Larkindale, J. Core Genome Responses Involved in Acclimation lo High Temperature J. Larkindale, E. Vierling // Plant Physiology. 2008. - V. 146. - P.748-761.

101. Larkindale, J. Protection against heat stress-induced oxidative damage in Arabidopsis involves calcium, abscisic acid, ethylene, and salicylic acid / J. Larkindale, M.R. Knight // Plant Physiol. 2002. - V.128, №2. - P.682-695.

102. Larkindale, J. Plant Responses to High Temperature / J. Larkindale, M. Mishkind, E. Vierling // Plant Abiotic Stress. 2005b. - P. 100-144.

103. Larkindale, J. Thermotolerance and antioxidant systems in Agrostis stolonifera: Involvement of salicylic acid, abscisic acid, calcium, hydrogen peroxide, and ethylene / J. Larkindale, B. Huang. // J. Plant Physiol. 2004. - V.161.-P.405-413.

104. Lebel, E. Functional analysis of regulatory sequences controlling PR-1 gene expression in Arabidopsis / E. Lebel, P. Heifetz, L. Thorne, S. Uknes, Ryals J. // Plant J. 1998. - V.16. - P.223-233.

105. Lecourieux, D. Calcium in Plant Defence-Signalling Pathways // D. Lecourieux, R. Ranjeva, A. Pugin // New Phytol. 2006. - V. 171. - P.249-269.

106. Lee, H. Biosynthesis and metabolism of salicylic acid / H. Lee, J. Leon, I. Raskin // Proc Natl Acad Sci USA. 1995. - V.92. - P.4076-4079.

107. Lee, U. The Arabidopsis ClpB/HsplOO family of proteins: chaperones for stress and chloroplast development / U. Lee, I. Rioflorido, S.W. Hong, J. Larkindale, E.R. Waters, E. Vierling // Plant J. 2007. V.49. P. 115-127.

108. Lee, J.H. An Hsp70 antisense gene affects the expression of HSP70/HSC70, the regulation of HSF, and the acquisition of thermotolerance in transgenic Arabidopsis thaliana / J.H. Lee, F. Schoffl // Mol. Gen. Genet. 1996. -V.252, №1-2. -P.l 1-19.

109. Lee, U. Genetic analysis reveals domain interactions of Arabidopsis HsplOO/ClpB and cooperation with the small heat shock protein chaperone system / U. Lee, C. Wie, M. Escobar et al. // Plant Cell. 2005. - V.17, №2. - P.559-571.

110. Leon, J. Benzoic acid 2-hydroxylase, a soluble oxygenase from tobacco, catalyzes salicylic acid biosynthesis / J. Leon, V. Shulaev, N. Yalpani, M. Lawton, I. Raskin//PNAS USA. 1995b.-V.92. - P. 10413-10417.

111. Leon, J. Hydrogen peroxide stimulates salicylic acid biosynthesis in tobacco / J. Leon, M. Lawton, I. Raskin // Plant. Physiol. 1995. - V.108, №4. - P. 1673-1678.

112. Li, C.Y. Heat shock protein 70 inhibits apoptosis downstream of cytochrome c release and upstream of caspase-3 activation / C.Y. Li, J.S. Lee, Y.G. Ko et al. //J. Biol". Chem. 2000. - V.275. - P.25665-25671.

113. Lin, B.L. Genomic analysis of the Hsp70 superfamily in Arabidopsis thaliana / B.L. Lin, J.S. Wang, H.C. Liu et al. // Cell Stress Chaperones. -2001.-V.6,№3.-P.201-208.

114. Logan, D. Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics are differentially regulated in plants / D. Logan, M. Knight // Plant Physiol. 2003. - V. 133. - P.21 -24.

115. Lopez-Delgado, H. Induction of thermotolerance in potato microplants by acetyl salicylic acid and H2C>2 / H. Lopez-Delgado, J.F. Dat, C.H. Foyer, I.M. Scott//J. Exp. Bot. 1998. - V.49, №.321, P. 713-720.

116. Löscher, R. Biosynthesis of p-hydroxybenzoate from p-coumarate and p-coumaroyl-coenzyme A in cell-free extracts of Lithospermum erythrorhizon cell culture / R. Löscher, L. Heide // Plant Physiol. 1994. - V.l06. -P.271-279.

117. Lowry, O.H. Protein measurement with the folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr et al. // J. Biol. Chem. 1957. - V. 193. — P.265-275.

118. Lu, H. ACD6, a Novel Ankyrin Protein, Is a Regulator and an Effector of Salicylic Acid Signaling in the Arabidopsis Defense Response / H. Lu, D.N. Rate, J.T. Song, J.T. Greenberg // The Plant Cell. 2003. - V.l5. - P. 2408-2420.

119. Malamy, J. Salicylic acid: a likely endogenous signal in the resistance response of tobacco to viral infection / J. Malamy, J.P. Carr, D.F. Klessig, I. Raskin // Science. 1990. - V.250. - P. 1002-1004.

120. Mauch-Mani, B. Production of salicylic acid precursors is a major function of phenylalanine ammonia-lyase in the resistance of Arabidopsis to Peronospora parasitica / B. Mauch-Mani, A.J. Slusarenko // Plant Cell. -1996. V.8. - P.203-212.

121. Maxwell, D.P. Evidence of mitochondrial involvement in the transduction of signals required for the induction of genes associated with pathogen attack and senescence / D.P. Maxwell, R. Nickels, L. Mcintosh // The Plant J. -2002. V.29, №3. - P.269-279.

122. Mayer, M.P. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism / M.P. Mayer, B. Bukau // Cell Mol. Life Sci. 2005. - V.62. -P.670-684.

123. McDowell, J.M. Signal transduction in the plant immune response / J.M. McDowell, J.L. Dangl // Trends Biochem. Sci. 2000. - V.25. - P.79-82.

124. Meric, J-B. Cyclooxygenase-2 as a target for anticancer drug development / J-B. Meric, S. Rottey, K. Olaussen, J.C. Soria, D. Khayat, O. Rixe, J-P. Spano // Crit Rev Oncol Hematol. 2006 - V.59. - P.51 -64.

125. Metraux, J.-P. Systemic acquired resistance and salicylic acid: current state of knowledge / J.-P. Metraux // Eur. J. Plant Pathol. 2001. - V.107, №1. -P.13-18.

126. Meuwly, P. Local and systemic biosynthesis of salicylic acid in infected cucumber plants / P. Meuwly, W. Molders, A. Buchala, J.P. Me'traux // Plant Physiol. 1995. - V. 109 - P. 1107-1114.

127. Miller, G. Could Heat Shock Transcription Factors Function as Hydrogen

128. Peroxide Sensors in Plants? / G. Miller, R. Mittler // Ann Bot. 2006. -V.98. - P.279-288.

129. Mittler, R. Inhibition of programmed cell death in tobacco plants during a pathogen-induced hypersensitive response at low oxygen pressure / R. Mittler, V. Shulaev, M. Seskar, E. Lam // Plant Cell. 1996. - V.8. - P. 1991 -2001.

130. Mittler, R. Oxidative stress responses and shock proteins in the unicellular cyanobacterium Synechococcus R2 (PCC-7942) / R. Mittler, E. Tel-Or // Arch Microbiol. 1991. - V. 155. - P. 125-130.

131. Molders, W. Transport of salicylic acid in tobacco necrosis virus-infectcd cucumber plants / W. Molders, A. Buchala, J.P. M'etraux //. Plant Physiol. -1996. V.l 12. - P.787-792.

132. Möller, I.M. Plant mitochondria and oxidative stress: electron transport, NADPH turnover, and metabolism of reactive oxygen species / Möller IM. // Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 2001. -V.52. - P.561-591.

133. Mur, L.AJ. The hypersensitive response; the centenary is upon us but how much do we know? / L.A.J. Mur, P. Kenton, A.J. Lloyd, H. Ougham, E. Prats // J. of Experimental Botany. 2007. - V.59, №3. - P. 1-20.

134. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol. Plantarum. -1962. V.15.-P.473-479.

135. Neuhaus-Steinmetz, U. Heat shock protein induction by certain chemical stressors is correlated with their cytotoxicity, lipophilicity and protein-denaturing capacity / U. Neuhaus-Steinmetz, L. Rensing // Toxicol. 1997. V.123. - P.185-195.

136. Nicotera, P. Regulation of the apoptosis-necrosis switch / P. Nicotera, G. Melino // Oncogene. 2004. - V.23, №16. - P.2757-765.

137. Nieto-Sotelo, J. Characterization of a maize heat-shock protein 101 gene, HSP101, encoding a ClpB/HsplOO protein homologue / J. Nieto-Sotelo, K.B. Kannan, L.M. Martinez et al. // Gene. 1999. - V.230, №2. - P. 187195.

138. Norman, C. Salicylic Acid Is an Uncoupler and Inhibitor of Mitochondrial Electron Transport / C. Norman, K.A. Howell, A.H. Millar, J.M. Whelan, D.A. Day // Plant Physiology. 2004. - V.134. - P.492-501.

139. Nover, L Arabidopsis and the heat stress transcription factor world: how many heat stress transcription factors do we need? / L. Nover, K. Bharti, P. Doring, S.K. Mishra, A. Ganguli, K.D. Scharf // Cell Stress Chaperones. -2001.-V.6.-P.177-189.

140. Nover, L. Formation of cytoplasmic heat shock granules in tomato cell cultures and leaves / L. Nover, K.-D. Scharf, D. Newmann // Mol. Cell. Biol. 1983.-V.3.-P.1648-1655.

141. Núñez, L. Cell proliferation depends on mitochondrial Ca2+ uptake: inhibition by salicylate / L. Núñez, R.A Valero, L. Senovilla, S. Sanz-Blasco, J. García-Sancho, C. Villalobos // J Physiol. 2006. - V.571, №1. -P.57-73.

142. Ogawa, D. The phenylalanine pathway is the main route of salicylic acid biosynthesis in Tobacco mosaic virus-infected tobacco leaves / D.Ogawa, Nakajima, S. Seo, I. Mitsuhara, H. Kamada, Y. Ohashi // Plant Biotechnology. 2006. - V.23. - P.395-398.

143. Parcellier, A. Hsp27 is a ubiquitin-binding protein involved in I-kappaBalpha proteasomal degradation / A. Parcellier, E. Schmitt, S. Gurbuhani et al. // Mol. Cell Biol. 2003. - V.23. - P.5790-5802.

144. Parsell, D.A. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hspl04 / D.A. Parsell, A.S. Kowal, M.A. Singer et al. // Nature. 1994a. - V.372, №6505. - P.475-478.

145. Paterson, J. R. Salicylic Acid sans Aspirin in Animals and Man: Persistence in Fasting and Biosynthesis from Benzoic Acid Agric / J. R. Paterson, G. Baxter, J. S. Dreyer, J.M. Halket, R. Flynn, J. R. Lawrence // Food Chem. -2008.-V.56.-P.11648-11652.

146. Pozniakovsky, A.I. Role of mitochondria in the pheromone- and amiodarone-induced programmed death of yeast / A.I. Pozniakovsky, D.A. Knorre, O.V. Markova et al. // J. Cell Biol. 2005. - V.168, №2. - P.257-269.

147. Pratt, W.B. Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones / W.B. Pratt, D.O. Toft // Endocr. Rev. 1997. -V.18. - P.306-360.

148. Queitsch, C. Heat shock protein 101 plays a crucial role in thermotolerance in Arabidopsis / C. Queitsch, S.W. Hong, E. Vierling, S. Lindquist // Plant Cell. 2000. - V.12, №4. - P.479-492.

149. Raffaele, S. An essential role for salicylic acid in AtMYB30-mediated control of the hypersensitive cell death program in Arabidopsis / S. Raffaele, S. Rivas, D. Roby // FEBS Lett. 2006. - V.580. - P.3498-3504.

150. Rao, M.V. Ozone-induced cell death occurs via two distinct mechanisms in Arabidopsis: the role of salicylic acid / Rao M.V., Davis K.R. // Plant J. -1999. V.17. - P.603-614.

151. Raskin, I. Role of Salicylic Acid in Plants / I. Raskin // Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1992. - V.43. - P.439-463.

152. Raskin, I. Salicylic acid: a natural induced of heat production in Arum lilies / I. Raskin, A. Ehmann, W. R. Melander, B. J. D. Meeuse // Science. 1987. - V.237.-P.1601-1602.

153. Reape, T.J. Apoptotic-like programmed cell death in plants / T.J. Reape, P.F. McCabe 11 New Phytol. 2008. - V. 180, №1. - P. 13-26.

154. Rhoads, D.M. Mitochondrial reactive oxygen species. Contribution to oxidative stress and interorganellar signaling / D.M. Rhoads, A.L. Umbach, C.C. Subbaiah, J.N. Siedow // Plant Physiol. 2006. - V. 141. - P.357-366.

155. Rikhvanov, E.G. Do Mitochondria Regulate the Heat-Shock Response in Saccharomyces cerevisiae? / E.G. Rikhvanov, N.N. Varakina, T.M. Rusaleva, E.I. Rachenko, D.A. Knorre, V.K. Voinikov // Curr. Genet. -2005. V.48. - P.44-59.

156. Robson, C.A. Transgenic plant cells lacking mitochondrial alternative oxidase have increased susceptibility to mitochondria-dependent and -independent pathways of programmed cell death / C.A. Robson, G.C.

157. Vanlerberghe // Plant Physiol. 2002. - V.129. - P. 1908-1920.

158. Rotari, V.I. Death by proteases in plants: whodunit / V.I. Rotari, R. He, P. Gallois // Physiologia Plantarum. 2005. - V.I23 - P.376-385.

159. Ruffer, M. Evidence against specific binding of salicylic acid to plant catalase / M. Ruffer, B. Steipe, M.H. Zenk // FEBS Letters. 1995. - V.377. -P. 175-80.

160. Ryals, J. Systemic acquired resistance / J. Ryals, S. Uknes, E. Ward // Plant. Physiol. 1994. - V.104, №2 - P. 1109-1112.

161. Saisho, D. Characterization of the gene family for alternative oxidase from Arabidopsis thaliana / D. Saisho, E. Nambara, S. Naito, N. Tsutsumi, A. Hirai, M. Nakazono // Plant Mol Biol. 1997. - V.35. - P.585-596.

162. Sakaki, K. Response of genes associated with mitochondrial function to mild heat stress in yeast Saccharomyces cerevisiae / K. Tashiro, S. Kuhara, K. Mihara // J. Biochem. (Tokyo). 2003. - V.I34. - P.373-384.

163. Samali, A. Thermotolerance and cell death are distinct cellular responses to stress: dependence on heat shock proteins / A. Samali, C.I. Holmberg, L. Sistonen etal.//FEBS Lett. 1999. - V.461, №3. - P.306-310.

164. Sanchez, Y. Hspl04 is required for tolerance to many forms of stress / Y. Sanchez, J. Taulien, K.A. Borkovich et al. // EMBO J. 1992. - V.I 1, №6. -P.2357-2364.

165. Sanmartin, M. Caspases. Regulating death since the origin of life / M. Sanmartin, L. Jaroszewski, N.V. Raikhel, E. Rojo // Plant Physiol. 2005.1. V.137. -P.841- 847.

166. Schirmer, E.C. An Arabidopsis heat shock protein complements a thermotolerance defect in yeast / E.C. Schirmer, S. Lindquist, E. Vierling // Plant Cell. 1994. - V.6, №12. - P.1899-1909.

167. Schirmer, E.C. HSPlOO/Clp proteins: a common mechanism explains diverse functions / E.C. Schirmer, J.R. Glover, M.A. Singer et al. // Trends Biochem. Sci. 1996. - V.8. - P.289-296.

168. Senaratna, T. Acetyl salicylic acid (Aspirin) and salicylic acid induce multiple stress tolerance in bean and tomato plants / T. Senaratna, D. Touchell, T. Bunn, K .Dixon // Plant Growth Regul. 2000. - V.30. - P. 157161.

169. Shah, J. The salicylic acid loop in plant defense / J. Shah // Curr Opin Plant Biol. 2003. - V.6. - P.365-371.

170. Shi, Y. Mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis / Y. Shi // Mol Cell. 2002. - V.9. - P.459-470.

171. Shimmen, T. Cytoplasmic streaming in plants / T. Shimmen // Current Opinion in Cell Biology. 2004. - V.16. - P.68-72.

172. Shirasu, K. Salicylic acid potentiates an agonist-dependent gain control that amplifies pathogen signals in the activation of defense mechanisms / K. Shirasu, H. Nakajima, V.K. Rajasekhar, R.A. Dixon, C. Lamb // Plant Cell -1997.-9.-P.261-270.

173. Skulachev, V.P. Bioenergetic aspects of apoptosis, necrosis and mitoptosis / V.P. Skulachev // Apoptosis. 2006. - V.l 1, №4. - P.473-485.

174. Smith, J.A. Rapid induction of systemic resistance in cucumber by Pseudomonas syringae pv. syringae / J.A. Smith, R. Hammerschmidt, D.W. Fulbright// Physiol. Mol. Plant Pathol. 1991. - V.38. - P.223-235.

175. Smykal, P. High-molecular-mass complexes formed in vivo contain smHSPs and HSP70 and display chaperone activity / P. Smykal, I. Hardy, P.M. Pechan // Eur. J. Biochem. 2000. - V.267. - P.2195-2207.

176. Snyman, M. Modulation of heat shock factors accompanies salicylic acid-mediated potentiation of Hsp70 in tomato seedlings // M. Snyman, M.J. Cronje // Journal of Experimental Botany. 2008. - V.59, N.8. - P.2125-2132.

177. Sticher, L. Systemic acquired resistance / L. Sticher, B. Mauch-Mani, J.P. Me'traux // Annu Rev Phytopathol. 1997. - V.35. - P.235-270.

178. Stirling, P.S. Getting a grip on non-native proteins / P.S. Stirling, V.F. Lundin, M.R. Leroux // EMBO Rep. 2003. - V.4. - P.565-570.

179. Strobel, N.E. Chemical and biological inducers of systemic resistance to pathogens protect cucumber and tobacco plants from damage caused by paraquat and cupric chloride / N.E. Strobel, A. Kuc. //. Phytopathology. -1995. V.85. - P.1306-1310.

180. Stupack, D.G, Apoptotic cues from the extracellular matrix: regulators of angiogenesis / D.G. Stupack, D.A.Cheresh // Oncogene. 2003. - V.22.1. P.9022-9029.

181. Sung, D.Y. Acquired Tolerance to Temperature Extremes / D.Y. Sung, F. Kaplan, K.J. Lee, C.L. Guy // Trends Plant Sci. 2003. - V.8., №4. - P. 179187.

182. Suzuki, N. The transcriptional co-activator MBF1C is a key regulator of thermotolerance in Arabidopsis thaliana /N. Suzuki, S. Bajad, J. Shuman, V. Shulaev, R. Mittler // J Biol Chem. 2008. - V.283, №14. - P.9269-9275.

183. Sweetlove, L.J. The impact of oxidative stress on Arabidopsis mitochondria / L.J. Sweetlove, J.L. Heazlewood, V. Herald, R. Holtzapffel, D.A. Day, C.J. Leaver, A.H. Millar, // Plant J. 2002. - V.32. - P.891-904.

184. Swidzinski, J.A. A custom microarray analysis of gene expression during programmed cell death in Arabidopsis thaliana / J.A. Swidzinski, L.J. Sweetlove, C.J. Leaver // Plant J. 2002. - V.30, №4. - P.431-446.r

185. Takanaga, H. pH-dependent and carriermediated transport of salicylic acid across Caco-2 cells / H. Takanaga, I. Tamia, A. Tsuji // Journal of Pharmacy and Pharmacology. 1994. - V.46. - P.567-570.

186. Thornberry, N.A. Caspases: Enemies within / N.A. Thornberry, Y. Lazebnik//Science. 1998. V.281 - P. 1312-1316.

187. Trost, L.C. Role of mitochondrial permeability transition in salicylate toxicity to cultured rat hepatocytes: implications for the pathogenesis of Reye's syndrome / L.C. Trost, JJ. Lemasters // Toxicol. Appl. Pharmacol. -1997. V.147. - 431-441.

188. Tsuda, K. Structure and expression, analysis of three subtypes of Arabidopsis MBF1 genes / K. Tsuda, Yamazaki, K. // Biochim. Biophys. Acta. 2004. - V.1680. - P.l-10.

189. Vallad, G.E. Systemic Acquired Resistance and Induced Systemic Resistance in Conventional Agriculture / G.E. Vallad, M. R. Goodman // Crop Sci. 2004.- V.44. - 1920-1934

190. Vanlerberghe, G.C. Alternative oxidase: from gene to function / G.C. Vanlerberghe, L. Mcintosh // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. -1997. V.48. - P.703-734.

191. Vercammen, D. Are metacaspases caspases? / D. Vercammen, W. Declercq, P. Vandenabeele, F. Van Breusegem // The Journal of Cell Biology. 2007. - V.179, №.3. - P.375-380.

192. Vianello, A. Plant mitochondrial pathway leading to programmed cell death / A. Vianello, M. Zancani, C. Peresson, E. Petrussa, V. Casoli, J. Krajnakova, S. Patui, E. Braidot, F. Marci // Physiologia Plantarum. 2006. - V.O. -P.l-11.

193. Vierling, E. The roles of heat shock proteins in plants / E. Vierling // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1991. - V.42. - P. 579-620.

194. Vlot, A.C. Salicylic Acid, a Multifaceted Hormone to Combat Disease / A.C. Vlot, D.A. Dempsey, D.F. Klessig. // Annu. Rev. Phytopathol. 2009. V.47. - P. 177-206.

195. Vlot, A.C. Systemic acquired resistance: the elusive signal(s) / A.C. Vlot, D.F. Klessig, S.-W.Park // Curr. Opin. Plant Biol. 2008. - V.l 1. - P.436-42.

196. Walter, M.H. The induction of phenylpropanoid biosynthetic enzymes by ultraviolet light or fungal elicitor in cultured parsley cells is overridden by a heat-shock treatment / M.H. Walter // Planta. 1989. - V. 177. - P. 1-8.

197. Wagner, A.M. The alternative respiration pathway in plants — role and regulation / A.M. Wagner, K. Krab // Physiologia Plantarum. 1995. - V.95. -P.318-25.

198. Walling, L.L. The myriad plant responses to herbivores / L.L. Walling // J.

199. Plant. Growth Regul. 2000. - V.19. - P. 195-216.

200. Watanabe, N. Recent advance in the study of caspase-like proteases and Bax inhibitor-1 in plants: their possible roles as regulator of programmed cell death / N. Watanabe, E. Lam // Mol Plant Pathol. 2004. - V.5. - P.65-70.

201. Watanabe, N. Two Arabidopsis metacaspases AtMCPlb and AtMCP2b are arginine/lysine-specific cysteine proteases and activate apoptosis-like cell death in yeast / N.Watanabe, E. Lam // Journal of Biological Chemistry. -2005. V.280. - P.14691-14699.

202. Wegele, H. Hsp70 and Hsp90 a relay team for protein folding / H. Wegele, L. Muller, J. Buchner // Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. - 2004. - V.151. - P. 1-44.

203. Wegrzyn, R.D. Mechanism of prion loss after Hspl04 inactivation in yeast / R.D. Wegrzyn, K. Bapat, G.P. Newnam et al. // Mol. Cell Biol. 2001. -V.21. - P.4656-4669.

204. Wehmeyer, N. Synthesis of Small Heat-Shock Proteins Is Part of the Developmental Program of Late Seed Maturation . N. Wehmeyer, L.D. Hernandez, R.R. Finkelstein, E. Vierling // Plant Physiol. 1996. - V.l 12.P. 747-757.

205. Weibezahn, J. Novel insights into the mechanism of chaperone-assisted protein disaggregation / J. Weibezahn, C. Schlieker, P. Tessarz et al. // Biol. Chem. 2005. - V.386. - P.739-744.

206. White, R.F. Acetylsalicylic acid (aspirin) induced resistance to tobacco mosaic virus in tobacco / R.F. White // Virology. 1979. - V.99, №2 -P.410-412.;

207. Wildermuth, M.C. Isochorismate synthase is required to synthesize salicylic acid for plant defence / M.C. Wildermuth, J. Dewdney, G. Wu, F.M. Ausubel / Nature. 2002. - V.414. - P.562-565.

208. Winegarden, N.A. Sodium salicylate decreases intracellular ATP, induces both heat shock factor binding and chromosomal puffing, but does not induce hsp 70 gene transcription in Drosophila / N.A. Winegarden, K.S.

209. Wong, M. Sopta, J.T. Westwood // J. Biol. Chem. 1996. - V.271. -P.26971-26980.

210. Wolf, B.B. Suicidal tendencies: Apoptotic cell death by caspase family proteinases / B.B. Wolf, D.R. Green // J. Biol. Chem. 1999. - V.274 -P.20049-20052.

211. Woltering, E.J. Do plant caspases exist? / E.J. Woltering, A. van der Bent, F.A. Hoeberichts // Plant Physiol. 2002. - V.130. - P. 1764-1769.

212. Xanthoudakis, S. Hsp60 accelerates the maturation of pro-caspase-3 by upstream activator proteases during apoptosis / S. Xanthoudakis, S. Roy, D. Rasper et al. // EMBO J. 1999. - V.18. - P.2049-2056.

213. Xie, Z. Salicylic acid induces rapid inhibition of mitochondrial electron transport and oxidative phosphorylation in tobacco cells / Z. Xie, Z. Chen // Plant Physiol. 1999. -V. 120. -P.217-225.

214. Yalpani, N. Pathway of salicylic acid biosynthesis in healthy and virus-inoculated tobacco / N. Yalpani, J. Leon//Plant. Physiol. 1993. V.103,N1. - P.315-321.

215. Yamanouchi, U. A rice spotted leaf gene, Spl7, encodes a heat stress transcription factor protein / U. Yamanouchi, M. Yano, H. Lin, M. Ashikari, K. Yamada// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - V.99. - P.7530-7535.

216. Yang, J. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked / J. Yang, X. Liu, K. Bhalla et al. // Science. 1997. -V.275, №5303. - P. 1129-1132.

217. Yang, J.Y. The involvement of chloroplast HSPlOO/ClpB in the acquired thermotolerance in tomato / J.Y. Yang, Y. Sun, A.Q. Sun et al. // Plant Mol. Biol. 2006. - V.62, №3. - P.385-395.

218. Yao, N. The mitochondrion an organelle commonly involved in programmed cell death in Arabidopsis thaliana / N. Yao, B.J. Eisfelder, J. Marvin et al. // Plant J. - 2004. - V.40, №4. - P.596-610.

219. Yao, N. Apoptotic cell death is a common response to pathogen attack in oats / N. Yao, S. Imai, Y. Tada, H. Nakayashiki, Y. Tosa, P. Park, S. Mayama // Molecular Plant-Microbe Interactions. 2002. - V.15. - P. 10001007.

220. Yu, D. Is the high basal level of salicylic acid important for disease resistance in potato? / D. Yu Y. Liu, B. Fan, D.F. Klessig, Z. Chen // Plant Physiol. 1997. -V. 115. - P. 343-349.

221. Yuan, J. The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme / J. Yuan, S. Shaham, S. Ledoux et al. // Cell. 1993. - V.75, №4. - P.641-652.

222. Zhang, S. Activation of tobacco SIP kinase by both a cell wall-derived carbohydrate elicitor and purified proteinaceous elicitins from Phytophthora spp / S. Zhang, H. Du, D.F. Klessig // Plant Cell. 1998b. - V.l 0. - P.435-449.

223. Zhang, S. N resistance gene-mediated de novo synthesis and activation of a tobacco MAP kinase by TMV infection / S. Zhang, D.F. Klessig // Proc Natl Acad Sei USA. 1998a. V.95. -P.7433-7438.

224. Zimmermann, P. GENEVESTIGATOR. Arabidopsis microarray database and analysis toolbox / P. Zimmermann, M. Hirsch-Hoffmann, L. Hennig, W. Gruissem//Plant Physiol. 2004. - V.l36. - P.2621-2632.

225. Zuppini, A. Monitoring programmed cell death triggered by mild heat shock in soybean-cultured cells / A. Zuppini, V. Bugno, B. Baldan // Funct Plant Biol. 2006. V.33. - P.617-627.

Информация о работе

Павлова, Елена Леонидовна
кандидата биологических наук
Иркутск, 2010
ВАК 03.01.05

Диссертация

Роль салициловой кислоты в регуляции стрессовых ответов в культуре клеток Arabidopsis thaliana - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы