Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Митохондриальная регуляция экспрессии белков теплового шока у растений и дрожжей

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Митохондриальная регуляция экспрессии белков теплового шока у растений и дрожжей"

На правах рукописи

Федосеева Ирина Владимировна

МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА У РАСТЕНИЙ И ДРОЖЖЕЙ

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Иркутск, 2011

3 О ИЮН 2011

4851318

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Сибирском институте физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН, г. Иркутск

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Войников Виктор Кириллович

профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Родченко Октябрина Павловна

профессор

кандидат биологических наук Гарник Елена Юрьевна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Воронежский Государственный Университет

Защита диссертации состоится 06 сентября 2011 г. в 10°° ч. на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Учреждении Российской академии наук Сибирском институте физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 317. Факс (3952) 510754; e-mail: matmod@sifibr.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждении Российской академии наук Сибирском институте физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН.

Автореферат разослан «. июня 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, Д 003.047.01 кандидат биологических наук

Г.П. Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Кальций и активные формы кислорода (АФК) являются важными вторичными мессенджерами, участвующими в ответной реакции организма на различные биотические и абиотические воздействия (Тарчевский, 2002; Медведев, 2005; Mazars et al., 2010). Тепловой стресс, индуцирующий синтез белков теплового шока (БТШ), во всех случаях сопровождается усилением генерации АФК (Карпец, Колупаев, 2009). АФК могут участвовать в активации экспрессии генов БТШ (Saidi et al., 2011). Одновременно, повышение температуры вызывает временный всплеск уровня кальция в цитозоле у растений (Saidi et al., 2009; Kotak et al., 2007) и млекопитающих (Balogh et al., 2005), что также может приводить к активации экспрессии генов БТШ. С другой стороны, митохондрии играют активную роль в гомеостазе внутриклеточного кальция (Walsh et al., 2009), а также являются одним из основных источников АФК у растений (Moller, 2001; Rhoads et al., 2006), животных (Skulachev, 2006) и дрожжей (Rigoulet et al., 2011). В то же время, остаётся неизвестным, какую роль митохондрии играют в регуляции экспрессии генов БТШ у растений и дрожжей.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение роли митохондрий в регуляции экспрессии БТШ в культуре клеток Arabidopsis thaliana и дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

1. Изучить эффект митохондриальных ингибиторов и разобщителей на экспрессию генов БТШ и развитие индуцированной термотолерантности при тепловом стрессе.

2. Изучить изменение дыхательной активности клеток и величины потенциала на внутренней митохондриальной мембране при тепловом стрессе.

3. Определить связь между функциональной активностью митохондрий и содержанием внутриклеточного кальция во время теплового стресса.

4. Изучить эффект экзогенного кальция на термотолерантность и индукцию синтеза Hspl04 в клетках дрожжей S. cerevisiae.

Научная новизна. Полученные результаты показывают, что развитие индуцированной термотолерантности и индукция синтеза БТШ при мягком тепловом стрессе, сопровождаются повышением дыхательной активности и гиперполяризацией внутренней митохондриальной мембраны в культуре клеток A. thaliana и дрожжах S. cerevisiae. Нарушение энергетических функций митохондрий ингибирует развитие индуцированной термотолерантности, синтез БТШ при мягком тепловом стрессе. Впервые показано, что повышение уровня цитозольного кальция при тепловом стрессе в клетках дрожжей S.

з

cerevisiae сопровождается повышением потенциала на внутренней митохондриальной мембране (mtAvj/), что в свою очередь, определяет активацию экспрессии генов БТШ при тепловом стрессе. Впервые показано, что экстраклеточный кальций индуцирует синтез Hspl04 и повышает термотолерантность дрожжей S. cerevisiae.

Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые показано, что митохондрии посредством изменения потенциала на внутренней митохондриальной мембране регулируют экспрессию генов БТШ в культуры клеток A. thaliana и дрожжей S. cerevisiae при тепловом стрессе. Полученные результаты подтверждают ведущую роль БТШ в защите клетки от действия летального теплового шока. Обнаруженная способность митохондриальных ингибиторов н разобщителей подавлять экспрессию генов БТШ может быть использована в сельскохозяйственной практике для борьбы с вредителями, а также для исследования в области медицины.

Апробация работы. Результаты исследования по теме диссертации были представлены на Всероссийской конференции «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006), Всероссийской конференции «Структура и экспрессия митохондриального генома растений» (Иркутск, 2006), Всероссийской конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным фактором внешней среды» (Иркутск, 2007, 2009), Международной конференции «Биология клеток in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008), XXXII Международном конгрессе FEBS «Molecular machine» (Вена, Австрия, 2007), на Международной конференции «International conference for plant mitochondrial biology» (Hohenroda, Германия, 2011).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 11 научных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения, выводов, списка цитированной литературы и приложений. Список цитированной литературы включает 421 работу, из них 20 отечественных и 401 работа зарубежных авторов. Работа изложена на 191 странице, содержит 30 рисунков и 1 таблицу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали культуру клеток Arabidopsis thaliana (L.) Heynh (раса Columbia), полученную из 14-ти дневных проростков, выращиваемую в темноте при 26 °С в среде, содержащей соли по Murashige, Skoog (1962), 3% сахарозы, 0.5 мг/мл тиамина-HCl и 0.1 мг/мл 2.4-Д. Для экспериментов использовали 8-ми дневную культуру, что соответствовало второй половине

логарифмической фазы роста, которая характеризуется наибольшей физиологической активностью клеток и наименьшим конститутивным уровнем синтеза БТШ.

Также в работе использовали штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae 74-D694 (ШТа, adel-14(UGA), trpl-289(UAG), his3A-200, игаЗ-52, 1еи2-3, 112 [/ш"])), который является родительским типом для изогенного ему мутанта hspl04A, предоставленные проф. S. Lindquist (Институт биомедицинских исследований, Уайтхед, США), а также мутант дыхательной недостаточности, полученный после обработки этидиум бромидом штамма 4/-74-D694; штамм W303-1A (Mata ade2-l игаЗ-1 his3-ll,15 Ieu2-3,112 trpl-1 canl-100, SUC2), полученный от к.б.н. Д.А. Кнорре (НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского при МГУ им. М.В. Ломоносова); мутант аас2Ааас1А с делегированными генами двух изоформ АДФ/АТФ транслокатора ААС2 и ААС1 (Mata ade2 his3 trpl Ieu2 игаЗ aac2::HIS3 aacl::LEU2 aac3::URA3); штамм H207 (MATa. his3-Al leu2-3,112 trpl-289 ura3-52 sstl-2), который является родительским типом для изогенных ему мутантов rnidlA (штамм Н311), cchIA (штамм Н317), предоставленные проф. Н. Iida (Tokyo Gakugei University, Япония). Дрожжи выращивали при 30 °С до середины логарифмической фазы роста.

Обработка клеток. Обработку клеток суспензионной культуры производили путем добавления концентрированных растворов действующих веществ в культуральную среду.

Оценка жизнеспособности. Количество жизнеспособных клеток суспензионной культуры оценивали по их способности восстанавливать 2.3.5-трифенилтетразолий хлорид (ТТХ) (Еникеев и др., 1995). Количество жизнеспособных клеток дрожжей оценивали по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ), либо капельным методом.

Определение дыхательной активности. Поглощение кислорода клетками регистрировали полярографически с платиновым электродом закрытого типа (электрод Кларка) в термостатируемой ячейке объемом 1.4 мл при 26 °С на полярографе ОН-Ю5 (Венгрия) (Трушанов, 1973). Скорость поглощения кислорода выражали в нмолях поглощённого кислорода в мин на г сырого веса, учитывая растворимость кислорода в воде. Уровни поглощения кислорода клетками дрожжей измеряли при 30 °С и выражали в нмоль поглощённого кислорода в мин на 1><107 клеток. Температуру в ячейке поддерживали с помощью ультратермостата U10 (ГДР).

Выделение общего белка, электрофорез белков и Вестерн-блоттинг. Для выделения общей белковой фракции ткани растирали с кварцевым песком в жидком азоте. Белковые фракции получали методом дифференциального

5

центрифугирования из гомогенатов тканей. Электрофорез белков в ПААГе с ДЦС-Na проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970), используя прибор для электрофореза Mini-PROTEAN III Electrophoretic Cell фирмы BIO-RAD (США). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану ("Amersham", США) и последующую обработку антителами проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.

ОТ-ПЦР-анализ. Тотальную РНК выделяли с помощью набора SV Total RNA Isolation System ("Promega", USA). Для синтеза первой цепи кДНК использовали 1 мкг тотальной РНК, праймер oligoídT)^ (20 рМ) и набор REVERTA ("АмплиСенс", Москва). Полуколичественный ОТ-ПЦР-анализ был выполнен при использовании кДНК в качестве матрицы (50 нг) и геноспецифичных праймеров (10 рМ каждого). Равные объемы ПЦР-продуктов разделяли в 1.5% агарозном геле.

Микроскопия. Анализ клеток проводили с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа AxioObserver ZI (Германия) с цифровой монохромной камерой AxioCam MRm3 и пакетом программного обеспечения для захвата и анализа изображений "AxioVision Rel.4.6". Визуализацию величины потенциала на внутренней митохондриальной мембране клеток A. íhaliana проводили с использованием 5 мкМ потенциал-зависимого катионного красителя JC-1, для дрожжей использовали 5 мкМ потенциал-зависимого катионного красителя метилового эфира тетраметилродамина (TMRM). Для количественной оценки интенсивность флуоресценции митохондрий обсчитывали статистически.

Люминесценция экворина. Для изучения уровня внутриклеточного кальция использовали штаммы Н207, Н311, Н317, трансформированные плазмидой pGAPAQl, несущей ген APOAEQUORIN, на минимальной среде SC (-Tip). Для восстановления функционального экворина из апоэкворина (Nakajima-Shiraada et al., 1991) к осадку дрожжей добавляли 1 мл среды SC, содержащей 0.15 мкМ коэлентеразина (Sigma, США), и инкубировали при 30 °С в течение 60 мин в темноте. Люминесценцию после теплового стресса измеряли с временным интервалом в одну секунду с помощью люминометра LumiCounter 2500 (Microtech-Nichion Co., Funabashi, Japan), используя программное обеспечение для анализа кривых люминесценции Lumi (Microtech-Nichion).

Статистическая обработка данных.

Биологическая повторность всех экспериментов была 2-8 кратная. Полученные данные обработаны статистически: рассчитаны средние арифметические значения и их стандартные отклонения (Лакин, 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Дисфункция митохондрий и защитная реакция на тепловой стресс в клетках суспензионной культуры A. thaliana

Предварительная обработка умеренно высокими температурами индуцирует синтез БТШ (Мельников, Ротанова, 2010; Richter et al., 2010). Результаты, полученные с помощью вестерн-блоттинга, показали, что тепловой стресс (37°С) резко увеличивал синтез HsplOl, Hsp70; Hspl7.6 (класс 1) и Hspl7.6 (класс II) (рис. 1а) в культуре клеток A. thaliana. Эти белки играют ключевую роль в развитии индуцированной термотолерантности у растений (Queitsch et al., 2000; Hong, Vierling, 2000, 2001; Kotak et al., 2007; Singh, Grover, 2010; Lee et al., 2005; Haslbeck et al., 2005).

Чтобы выяснить, как обработка митохондриальными ингибиторами и разобщителями повлияет на индукцию синтеза БТШ при тепловом стрессе, клетки суспензионной культуры A. thaliana обрабатывали этими агентами при

150 мкМ 20 мкМ

150 мхМ 20 мкМ

ЮмкМ 1ыМ

К26 А26 С26 К37 А37 С37

К26 АнД.6 Д26 КЗ7 Ан37Д37

HsplOl Шр70 "Hsp60 «

Hspl7.6a> Hspl7.6(II)

150мкМ20мкМ 150 мкМ 20 мкМ

К26 А26 С26 К37 А37 С37

К26 Ан26 Д26 К37 Ан37 Д37

К - контроль; А - азид натрия; С - СССР; Ан - антимицин А; Д - ДНФ.

Рис. 1. Эффект митохондриальных ингибиторов и разобщителей на синтез и экспрессию БТШ в культуре клеток А. МаНапа.

а - вестерн-блоттинг суммарных белков против соответствующих антител. б - продукты ОТ-ПЦР анализа.

26 °С или 37 °С и регистрировали изменение уровня их синтеза. Обработка клеток азидом натрия, СССР, антимицином А и ДНФ при обычной температуре инкубации несколько индуцировала синтез Hsp70, тогда как уровень HsplOl, Hspl7.6 (класс I) и Hspl7.6 (класс II) оставался прежним (рис. 1я). В то же время, присутствие исследуемых агентов во время мягкого теплового стресса (37 °С) ингибировало индукцию их синтеза. Содержание Hsp60 не изменялось при обработке ингибиторами ни при 26 °С, ни при 37 °С, что свидетельствует об одинаковой нагрузке белка на трек.

Чтобы подтвердить результаты вестерн-блотгинга использовали метод полуколичественного ОТ-ПЦР анализа. В качестве контроля использовали ген EIF4A1. Транскрипционные профили генов HSP101 и HSP60 в клетках, обработанных при 26 и 37 °С в присутствии или отсутствии азида натрия, а также СССР (рис. 1(5) в основном были схожи с данными, полученными с помощью вестерн-блоттинга (рис. 1а). Мягкий тепловой стресс (37 °С) увеличивал уровень транскриптов HSP101 и HSP17.6C-C1. Азид натрия и СССР ингибировали экспрессию HSPI0I, индуцированную тепловым стрессом (рис. 16).

Предварительная обработка умеренно высокими температурами индуцирует устойчивость к последующему жёсткому тепловому воздействию. Это явление получило название индуцированная термотолерантность (Карпец, Колупаев, 2009; Richter et al., 2010; Saidi et al., 2011). Как видно из рисунка 2,

Рис. 2. Эффект митохондриальных ингибиторов и разобщителей на индуцированную термотолерантность культуры клеток А. /ИаНапа. Жизнеспособность клеток определяли, спустя 48 ч инкубации при 26 °С по восстановлению ТТХ. К — контроль; А - азид натрия; Д — ДНФ; Ан -антимицин А; С - СССР. п= 3. М±Б. О.

тепловой стресс (37 °С) значительно повышал способность клеток переносить жёсткий тепловой шок (50 °С). Если выживаемость клеток, непосредственно обработанных при 50 °С, составила 2%, то после тепловой предобработки (37 °С) выживало около 80%. Развитие индуцированной термотолерантности сопровождалось индукцией синтеза БТШ (рис. 1).

Чтобы установить, приводит ли ингибирование синтеза БТШ к подавлению развития индуцированной термотолерантности, изучали эффект обработки митохондриальными ингибиторами и разобщителями на жизнеспособность по способности клеток восстанавливать ТТХ. Обработка исследуемыми агентами при 26 °С не имела негативного влияния на способность клеток восстанавливать ТТХ после летального теплового шока (50 °С) (рис. 2). Однако ингибиторы и разобщители эффективно подавляли развитие индуцированной термотолерантности, вызванное тепловым стрессом (37 °С).

Чтобы сравнить уровни дыхательной активности клеток при 26 °С и во время мягкого теплового стресса, когда синтезируются БТШ и развивается индуцированная термотолерантность, клетки инкубировали при 26 и 37 °С и после восстановительного периода измеряли уровни поглощения кислорода в полярографической ячейке. После инкубации при 37 °С наблюдали двукратное увеличение поглощения 02 клетками А. thaliana (рис. 3). Присутствие азида натрия (ингибитор IV комплекса ЭТЦ) и антимицина А (ингибитор III комплекса ЭТЦ) во время инкубации при 26 и 37 °С значительно снижало дыхание. Комбинированное действие

антимицина А и бензгидроксамовой кислоты (БГК, ингибитор альтернативной оксидазы)

приводило к практически полному ингибированию дыхательной

активности при обеих

исследованных температурах

(рис. 3). Добавление разобщителей -

Рис. 3. Изменение дыхательной активности культуры клеток А. /ИаНапа при мягком тепловом стрессе. Уровни поглощения кислорода измеряли при 26 °С и выражали в нмоль 02/ (мин х мг сырого веса). К-контроль; А-азид натрия, 50 мкМ; Ан-антимицин А, 2 мкМ; Ан+Б-антимицин А, 2 мкМ, и бензгидроксамовая кислота, 2 мМ; Д-ДНФ, 200 мкМ; С-СССР, 4 мкМ. п=3.

К26 Ант26 С26 КЗ 7 Ант37 С37

светлое поле

ЛС-1 'зелёный канал

.КМ красный канал

Рис. 4. Интенсивность флуоресценции 1С-1 в контрольных (К26) клетках культуры А. ЛаНапа и после теплового стресса 37 °С (К37) в присутствии или отсутствии антимицина А - 2 мкМ (Ант26, Ант37) и СССР - 4 мкМ (С26, С37). Масштабная линейка равна 10 мкм.

СССР и ДНФ существенно не изменяло уровень дыхательной активности.

Чтобы проверить зависимость между усилением поглощения кислорода и изменением потенциала на внутренней митохондриальной мембране (гЩДц/) в культуре клеток А. /ИаИапа во время мягкого теплового стресса в качестве флуоресцентной пробы использовали катионный краситель ЯМ, способный накапливаться на внутренней мембране митохондрий пропорционально электрохимическому потенциалу. Тепловой стресс при 37 "С приводил к значительному увеличению флуоресценции, свидетельствуя о повышении гЩЛу при мягком тепловом стрессе (рис. 4). Обработка антимицином А и СССР, как при 26 °С, так и при 37 °С эффективно подавляла флуоресценцию КМ (рис. 4). 2. Дисфункция митохондрий и защитная реакция на тепловой стресс в клетках дрожжей сегеимяе

Удобным объектом для исследования митохондриальной регуляции экспрессии генов БТШ являются дрожжевые организмы, соединяющие в себе преимущества микроорганизмов и все характерные черты эукариот. Энергетический метаболизм дрожжей 5. сеге\'шае различается в зависимости от источника углерода в среде инкубации. При росте на этаноле дрожжи используют окислительный метаболизм, получая энергию исключительно за счёт окислительного фосфорилирования. При росте на глюкозе дрожжи, главным образом, получают энергию за счет брожения (Мепсо й а1., 2007). Поэтому интенсивность дыхания дрожжей на этаноле выше, чем на глюкозе

ю

(рис. 5). Соответственно, значение тЛДу в обычных условиях также выше на среде этанолом, чем на среде с глюкозой (рис. 5). Повышение температуры инкубации дрожжей до 39 °С приводило к повышению тЪЛу в клетках дрожжей как в клетках, инкубируемых на среде с глюкозой, так и на среде с этанолом. Следовательно (рис. 5), гиперполяризация внутренней митохондриальной мембраны дрожжей при тепловом стрессе не зависит от окислительного или бродильного энергетического метаболизма.

•2

о

хЗО ¡25 -

ь ■

S1S

о 10 - f%

1 5 г. Л

1 °

5 С к

□ ГЛЮКОЗА

□ЭТАНОЛ

5 51)1)

= -ш

а

е£

с и 1 1 > 1 ч 1 л

б ■ В □ D

зЬ м 5 =. 5 в t " 1 S ■

Рис. 5. Изменение дыхательной активности и значения

потенциала на внутренней митохондриальной мембране в

клетках дрожжей штамма W303-1A в условиях бродильного

(среда YEPD, глюкоза) и окислительного (среда YEPE, этанол) метаболизма.

а - уровни поглощения кислорода измеряли при 30 °С в отсутствии (К) или в присутствии 1 мкМ СССР и 150 мкМ азида натрия и выражали в нмоль 02/ (мин х 107 клеток).

б - обсчёт интенсивности флуоресценции TMRM в

контрольных клетках (КЗО) дрожжей и после теплового стресса (К39). Данные выражены в процентах от флуоресценции TMRM в клетках, растущих на среде YEPD (глюкоза) при 30 °С (КЗО). п=3. M±S. D е - микрофотографии клеток с флуоресценцией TMRM Масштабная линейка равна 10 мкм.

Используемые ингибиторы и разобщители при обычной температуре инкубации (30 °С) одинаково эффективно снижали т1Д\|/ в клетках дрожжей, выращиваемых на среде с глюкозой и этанолом (рис. 6). В то же время, эффект используемых агентов на гиперполяризацию внутренней митохондриальной мембраны, вызванной тепловым стрессом при 39 °С, резко различался. Если добавление СССР значительно снижало повышение пЦД\|/ при 39 °С как у дрожжей, использующих бродильный тип метаболизма (глюкоза, рис. 6), так и у дрожжей, использующих окислительный тип метаболизма (этанол, рис. 6), то добавление антимицина А слабо ингибировало повышение пиДу, индуцированное тепловым стрессом, у дрожжей на среде с глюкозой, но на

И

среде с этанолом степень ингибирования была примерно такая же, что и в случае СССР (рис. 6).

В соответствии с литературными данными (Sanchez et al., 1992; Stanley et al., 2010), базовый уровень синтеза Hspl04 при 30 °C был значительно выше у дрожжей, использующих окислительный энергетический метаболизм (на среде с этанолом), чем у дрожжей с бродильным энергетическим метаболизмом (на среде с глюкозой) (рис. 6). Отметим, что повышенный конститутивный уровень синтеза Hspl04 на этаноле согласуется с повышенным уровнем mtAvj/ (рис. 5). Несмотря на различия в базовом уровне синтеза Hspl04 у дрожжей тепловой стресс при 39 °С в обоих случаях приводил к значительной индукции его синтеза (рис. 6). Обработка антимицином А и азидом натрия при обычной температуре инкубации 30 °С не влияла на базовый уровень синтеза Hspl04. В то же время, обработка разобщителем СССР при 30 °С приводила к значитель-

КЗО ЛЗО СЗО ЛятЗО К19 AJ9 ЛитЗЭ СЭ9

глюкоза этанол

К30 АЗО АнтЗЙ СЗО К39 А39 Ант39 С39 , .„. КЗО АЗвАнтЗОСЗО К39А39 Аит39 С39

Hsp 1 04 -- —- Ч-ад.--—--------—

Hsp60

Рис. 6. Обсчёт интенсивности флуоресценции TMRM в контрольных клетках (КЗО) дрожжей штамма W303-1A и после теплового стресса (К39) на среде с YEPD (глюкоза) (а) и YEPE (этанол) (б) в присутствии 150 мкМ азида натрия (АЗО, А39), 10 мкМ антимицина А (АнтЗО, Ант39), 20 мкМ СССР (СЗО, С39) и синтез Hspl04 и Hsp60 на среде YEPD (глюкоза) и YEPE (этанол) (в). Данные выражены в процентах от флуоресценции TMRM контрольных клеток (КЗО). п=5. M±S. D.

ному повышению уровня синтеза НэрКМ у дрожжей, выращиваемых на среде с глюкозой (рис. 6). Такого эффекта не наблюдалось на среде с этанолом (рис. 6). Более того, на среде с этанолом обработка СССР при 30 °С дрожжей даже снижала повышенный базовый уровень синтеза НБр104, характерный для дрожжей, использующих окислительный энергетический метаболизм (рис. 6).

Способность антимицина А модулировать уровень синтеза Нзр104 при тепловом стрессе зависела от энергетического метаболизма дрожжей. На среде с этанолом антимицин А, также эффективно, как и СССР, ингибировал тепловую индукцию синтеза Нзр104. Однако, на среде с глюкозой какого-либо отрицательного эффекта антимицина А на способность клеток синтезировать Нзр104 при тепловом стрессе не наблюдалось (рис. 6). Надо отметить, что на среде с глюкозой антимицин А слабо ингибировал повышение гЩДу при тепловом стрессе (рис. 6) и практически не ингибировал тепловую индукцию синтеза НзрЮ4 (рис. 6), а на среде с этанолом антимицин А эффективно ингибировал повышение ш1Ау при тепловом стрессе и также эффективно ингибировал тепловую индукцию синтеза Нзр104 (рис. 6). 3. Изучение зависимости между изменением концентрации внутриклеточного кальция и гиперполяризацией внутренней митохондриальной мембраны при мягком тепловом стрессе у дрожжей 5. сегеушае

Известно, что при повышении температуры наблюдается кратковременное повышение уровня цитозольного кальция ([Са2+]Ц1ГТ) у растений и животных(Ва1о§Ь е1 а1., 2005; Бияшева и др., 1993; 8а1сН е1 а1., 2011). Есть основание полагать, что существует связь между уровнем кальция в цитозоле и повышением потенциала на внутренней митохондриальной мембране (РогшакоуБку е1 а1., 2005). Поэтому на следующем этапе работы необходимо было выяснить, происходит ли повышение кальция при тепловом стрессе в цитозоле у дрожжей и существует ли зависимость между этим событием и изменением п^Дху.

Изменение содержания кальция в цитозоле ([Са2+]цнт) при тепловом стрессе изучали в клетках 5. сегегЬше, экспрессирующих апоэкворин, который в присутствии коэлентеразина превращается в белок экворин, люминесцирующий в присутствии ионов Са2+.

На первом этапе изучили влияние теплового стресса на изменение уровня внутриклеточного кальция при выращивании дрожжей на среде 8С. На среде ЯС тепловой стресс приводил к практически мгновенному повышению люминесценции экворина в клетках штамма родительского типа (рт) (рис. 7). Максимум люминесценции регистрировался через 20 с после теплового воздействия, затем наблюдалось снижение, а спустя ещё 400 с значение

13

-рт ■ midlA

cchlA

■рт •midlA cchl/t

время, с

время, с

Рис. 7. Изменение уровня цитозольного кальция при тепловом стрессе в клетках дрожжей S. cerevisiae на среде SC (я) и YEPD {б). На рисунке представлены данные типичного эксперимента (и= 5).

люминесценции возвращалось на контрольный уровень (рис. 7).

В транспорте кальция через плазматическую мембрану в клетках дрожжей S. cerevisiae участвуют белки Cchlp и Midlp. При выращивании на минимальной среде SC (с низкой концентрацией кальция) люминесценция экворина у одиночных мутантов (cchlA и midlA) была гораздо ниже, чем у клеток штамма родительского типа, что указывает на участие белков Cchlp и Midlp в транспорте кальция внутрь клетки через плазматическую мембрану при тепловом стрессе (рис. 7а).

Аналогичным образом, на полной среде YEPD (с высокой концентрацией кальция) в клетках штамма родительского типа, (точно так же как и на среде SC) тепловой стресс приводил к временному повышению люминесценции экворина (рис. 76). Однако в этих условиях эксперимента (в отличие от экспериментов на среде SC) отсутствие белков Cchlp и Midlp не приводило к столь значительному снижению люминесценции (рис. 76). Это обстоятельство указывает, что на богатой среде с высокой концентрацией кальция повышение уровня [Са2+]цит при тепловом стрессе может происходить, в основном, независимо от функционирования белков Cchlp и Midlp.

Отсутствие белков Cchlp и Midlp не оказывало значительного влияния на синтез Hspl04 и развитие индуцированной термотолерантности при росте на среде YEPD (рис. 8). Клетки одиночных мутантов (midlA и cchlA) развивали индуцированную термотолерантность в меньшей степени, однако эта разница не была значительной.

100 □ КЗО ОК39

80 Г1!

и о * 60 £ НЕ- -I-

£ я 40 а ?

л св 20

г

рт midlA cchlA

pm III: JIЛ i thlA

30°c 39°c 30°c wt зо°с 39°с1[_р101

• Hsp60

Как следует из рисунка 9 после 10 мин теплового стресса (39 °С) у одиночных мутантов (midlA и cchlA), выращенных на среде YEPD, наблюдалось двукратное снижение повышения mtAy, чем у штамма родительского типа. Однако мягкий тепловой стресс продолжительностью 30 мин вызывал примерно одинаковую степень гиперполяризации внутренней митохондрииальной мембраны у штамма родительского типа и одиночных мутантов (рис. 9). Следовательно, отсутствие белков Cchlp и Mid 1 р приводит только к временному снижению гиперполяризации внутренней митохондриальной мембраны, вызванной тепловым стрессом.

Рис. 8. Влияние мутаций в генах ССН1 и MIDI на термотолерантность и синтез БТШ клеток дрожжей 5. cerevisiae на среде YEPD. а — выживаемость после действия летального теплового шока (50 °С). и=3. M±S. D. б - синтез Hspl04 и Hsp60 при 30 и 39 °С.

39С, 10 мин

г 1500 glOOO

ОЗО'С □39°С

А

39С, 30 мин

□зи°с:

D39°C

.J

cchu тШЛ

Рис. 9. Влияние мутаций в генах ССН1 и MIDI на mtAvj/ при мягком тепловом стрессе в клетках дрожжей S. cerevisiae на среде YEPD. п=3. M±S. D.

4. Эффект экзогенного кальция на ответ дрожжей 5. сегеу'шае на повышение температуры.

Показано, что обработка 200 мМ СаС12 активирует экспрессию 163 генов у дрожжей 5. сегеуьч'ше (УовЫпкЛо е1 а1., 2002). С другой стороны известно, что обработка экзогенным кальцием индуцирует синтез БТШ у растений (Кин^эоу е1 а1., 1998; Тгойшоуа Й а1., 1999). Поскольку тепловой стресс вызывает временное повышение уровня кальция в цитозоле дрожжей (рис. 7) необходимо было изучить, как обработка экзогенным кальцием влияет на индукцию синтеза I ¡яр 104 и термотолерантность дрожжей. Для этого сначала определяли время и концентрации СаС12, оптимальные для индукции синтеза Няр104 и развития

15

термотолерантности. Дрожжи, выращенные при 30 °С на среде УЕРО (глюкоза), обрабатывали 200 мМ СаС12 в течение 30, 60 и 120 мин, отмывали от агента и подвергали действию летального теплового шока (50 °С). Тепловой шок при 50 °С оказывал ярко выраженное летальное действие на клетки дрожжей (рис. 10). Обработка клеток 200 мМ СаС12 в течение 30 мин увеличивала выживаемость клеток после действия летального теплового шока (50 °С). С увеличением времени воздействия до 120 мин протекторный эффект ионов кальция заметно снижался. Обработка клеток 200 мМ СаС12 в течение 30 мин при 30 °С значительно увеличивала индукцию Нзр104, но в меньшей степени, чем при 39 °С. Однако длительная (120 мин) инкубация клеток в присутствии ионов кальция (200 мМ) ингибировапа синтез этого белка. Не наблюдалось по сравнению с контролем и увеличения синтеза Няр70-88а2.

Варьируя различные концентрации СаС12 было установлено, что наиболее оптимальный эффект на термотолерантность и синтез Няр 104 достигался при обработке клеток дрожжей СаС12 в концентрации 400 мМ (рис. 10).

а) 200 мМ СаС12, мин «) СаС12, мМ

0 30 60 120 0 100 200 400

0 1

и о 2

кп

I4

8 вш

б) мин г) СаС12, мМ

0 30 60 120 К39 0 100 200 400 К39

........... ' '"""" №р104

■ Фтт* ттт **•""» •я*» &а2 Ш&тЛ*

Рис. 10. Влияние ионов Са2+ на термотолерантность и синтез Мер 104 в клетках дрожжей & сегеушде штамма Ч/-74-0694 на среде УЕРО. а не- выживаемость после действия теплового шока при 50 °С; б и г - синтез Шр104 и 5ва2 в клетках дрожжей, обработанных Са2+.

Чтобы доказать, что именно ионы кальция приводят к увеличению термотолерантности клеток дрожжей, а также, что его действие является специфичным, в следующих экспериментах дрожжи обрабатывали ионами

16

магния и марганца. Полученные результаты показали, что процент выживших клеток, определяемый по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ), в контроле с увеличением продолжительности летального теплового шока резко снижался (рис. 11а), тогда как обработка СаС12 повышала устойчивость клеток к тепловому шоку 50 °С. Почти такой же эффект на развитие термотолерантности вызывала предварительная обработка при 39 °С. Причём обработка 400 мМ М§С12 и 400 мМ МпС12 приводила к меньшему эффекту на

термотолерантность, чем ионы кальция (рис. 11а). Результаты, полученные с помощью вестерн-блоттинга, подтвердили, что в отличие от кальция, ионы магния и марганца не вызывают

существенного увеличения индукции синтеза Нкр104 (рис. 11).

Хлорид лантана является блокатором кальциевых каналов и снижает поступление кальция в цитозоль. Добавление 1 мМ ЬаС13 эффективно ингибировало индукцию синтеза Нзр104 в присутствии кальция (рис. 12). Таким образом, кальций специфически повышает термотолерантность и синтез 11яр] 04 у дрожжей и его эффект на эти процессы зависит от функционирования кальциевых каналов на

плазматической мембране. У дрожжей при тепловом стрессе транскрипционные факторы Мбп2 и Мзп4, вместе с фактором теплового шока, регулируют экспрессию НБР104

17

Рис. 11. Влияние ионов Са , Mg Мп2+ на термотолерантность и синтез Hspl04 в клетках дрожжей S. cerevisiae штамма H'-74-D694 на среде YEPD. a - выживаемость после действия теплового шока (50 °С), определяемая по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ). я=3. M±S. D.; б - синтез Hspl04 и Ssa2 в клетках дрожжей в контроле (КЗО), при 39 °С (К39) и обработанных ионами Са2+ (СаЗО), Mg2+ (Mg30), Мп2+ (МпЗО).

LaCl,, мМ

КЗО

0

СаЗО

0.2 0.5 1 СаЗО СаЗО СаЗО

К39

- - ц-т'"'

■ Hsp60

Рис. 12. Влияние различных концентраций ЬаСЬ на синтез Hspl04 в клетках дрожжей S. cerevisiae штамма 4y-74-D694 на среде YEPD. Для сравнения справа приведён синтез Hspl04 и Ssa2 при 39 °С, 30 мин (К39).

(Еркина и др., 2009). Показано, что обработка 400 мМ СаС12 активирует экспрессию гена СРХ1, кодирующего глутатионпероксидазу, в зависимости от присутствия Мвп2 и Мвп4 (ОЬ<Ме с1 а1., 2010). Чтобы выяснить, зависит ли эффект экзогенного кальция на экспрессию Н8Р104 от присутствия Мбп2 и Мяп4, был изучен эффект экзогенного кальция на термотолерантность и синтез Мер 104, используя мутант гтп2Атхп4А.

Полученные результаты показали, что мягкий тепловой стресс 39°С индуцировал синтез Шр104 у мутанта тхп2Атхп4А в той же степени, что и в клетках штаммов родительского типа (рис. 136). Обработка СаС12 индуцировала синтез НврКМ в клетках штаммов родительского типа, но в меньшей степени, чем при 39 °С, и повышала устойчивость к последующему летальному тепловому шоку 50 °С (рис. 13а). Ионы Са2+ не индуцировали синтез Нэр 104 в клетках мутанта тяп2Атяп4А (рис. 136). Соответственно, развития термотолерантности при обработке экзогенным кальцием в клетках гп5п2Атэп4А не происходило (рис. 13а). Таким образом, кальций индуцирует синтез Н8р104 5. сегеу'к'ше, активируя транскрипционные факторы М.чп2 и Мвп4.

родительский тип т*п2/1/шп4Л

КЗО СаЗО К39 Са39 КЗО СаЗО К39 Са39

КЗО СаЗО К39 Са39 н 104 КЗО СаЗО КЗ9 Са39

НзрбО

Рис. 13. Влияние ионов кальция на термотолерантность и синтез Нзр104 при 30 и 39 °С в клетках дрожжей 5. сегеу^Ачае штамма родительского типа \V303-1A и изогенного ему мутанта XVт$пА2т8п4А на среде УЕРЭ. а - выживаемость после действия теплового шока (50 °С); б - синтез Нэр 104 и №р60.

ОБСУЖДЕНИЕ

В последние годы стало очевидно, что функции митохондрий не ограничиваются окислительным фосфорилированием. Помимо производства энергии, эти органеллы играют активную роль в реализации программируемой клеточной смерти (Skulachev, 2006; Vianello et al., 2007; Cheng et al., 2008;). В ходе, так называемой ретроградной регуляции, митохондрии могут регулировать экспрессию ядерных генов у дрожжей и растений (Sweetlove et al. 2007; Vanlerberghe et al., 2009; Юрина, Одинцова, 2008; Юрина, Одинцова, 2010).

Полученные результаты позволяют предполагать, что митохондрии вовлечены в регуляцию экспрессии генов БТШ при тепловом стрессе. Нарушение функционирования митохондрий в результате обработки митохондриальными ингибиторами и разобщителями подавляет индукцию синтеза БТШ при тепловом стрессе в культуре клеток A. thaliana (рис. 1) и в клетках дрожжей S. cerevisiae (рис. 6), что сопровождается ингибированием индуцированной термотолерантности (рис. 2). В то же время в ряде случаев обработка этими агентами при обычной температуре инкубации может также индуцировать синтез БТШ. Таким образом, в зависимости от условий, дисфункция митохондрий может активировать или подавлять экспрессию генов БТШ. Этот результат доказывает, что митохондрии растений и дрожжей играют активную роль в реализации защитной программы при тепловом стрессе.

Тепловой стресс, вызывающий индукцию синтеза БТШ, приводил к повышению mtAvjr в клетках растений (рис. 4) и дрожжей (рис. 5). Феномен повышения mtAy при тепловом стрессе был подтвержден другими исследователями, использующими клетки животных (Balogh et al. 2005; Pallepati, Averill-Bates, 2010). Поскольку агенты, способные при данных экспериментальных условиях деполяризовать mtAy, одновременно подавляли тепловую индукцию синтеза БТШ и развитие индуцированной термотолерантности, то есть основание предполагать наличие причинно-следственной связи между гиперполяризацией внутренней митохондриальной '' мембраны и активацией экспрессии генов БТШ. Очевидно, что обнаруженная закономерность характерна только для условий теплового стресса. Деполяризация митохондриальной мембраны при обычных условиях инкубации также, в ряде случаев, приводила к индукции синтеза БТШ.

Согласно предположению Balogh et al. (2005) гиперполяризация внутренней митохондриальной мембраны в клетках животных при тепловом стрессе является следствием повышения уровня кальция в цитозоле. Аналогичным образом, Pozniakovsky et al. (2005), наблюдая повышение mtAvy в клетках дрожжей при обработке амиодароном, предположили существование связи между гиперполяризацией внутренней митохондриальной мембраны и

19

уровнем кальция в цитозоле. Известно, что митохондрии животных поглощают кальций в зависимости от mtAy (Griffiths, Rutter, 2009). Поступление кальция в митохондрии в момент стресса стимулирует активность дыхательных ферментов (Denton, 2009), что приводит к гиперполяризации внутренней митохондриальной мембраны, усилению продукции АФК и изменению редокс-состояния клетки (Griffiths, Rutter, 2009). Изучение изменение уровня кальция в цитозоле дрожжевой клетки показало, что тепловой стресс приводит к практически мгновенному повышению уровня кальция в цитозоле дрожжевой клетки (рис. 7). Аналогичное явление происходит и в клетках растений (Бияшева и др., 1993; Saidi et al., 2011). Не удалось показать значительного эффекта делеций в генах MIDI и ССН1, кодирующих кальциевые каналы на плазматической мембране дрожжей, на значение mtAy (рис. 9), синтез Hspl04 (рис. 8) и развитие индуцированной термотолерантности (рис. 8). Очевидно, на богатой кальцием среде у дрожжей функционирует система транспорта кальция, независимая от этих белков (рис. 7; Muller et al., 2003). Тем не менее, по аналогии с клетками животных, полученные результаты позволяют предполагать, что причиной повышения mtAy в клетках растений и дрожжей является временное повышение уровня кальция в цитозоле.

Изменение уровня кальция в клетке играет важную роль в активации экспрессии генов при различных стрессовых воздействиях (Тарчевский, 2002), в том числе, и при тепловом стрессе (Saidi et al., 2011). На это указывают результаты, демонстрирующие, что обработка экзогенным кальцием вызывает индукцию синтеза БТШ у растений (Kuznetsov et al., 1998; Trofimova et al., 1999). Аналогичным образом, обработка экзогенным кальцием клеток дрожжей индуцировала синтез Hspl04 и повышала их термотолерантность (рис. 10). Вероятно, сигнал, активирующий экспрессию Hspl04, зависит от транскрипционных факторов Msn2 и Msn4, поскольку делеция генов, кодирующих эти факторы, подавляла способность клеток дрожжей синтезировать Hspl04 и развивать термотолерантность в ответ на обработку экзогенным кальцием (рис. 13).

Таким образом, полученные результаты позволяют выдвинуть следующую последовательность событий, приводящих к экспрессии генов БТШ при тепловом стрессе. Тепловой стресс вызывает кратковременное повышение уровня кальция в цитозоле. Повышение уровня кальция в клетке непосредственно (в результате его поступления в митохондрии) или опосредованным образом активирует активность митохондрий и вызывает повышение mtAy. Повышение mtAvjf приводит к усилению генерации АФК митохондриями, что может активировать экспрессию генов БТШ. Митохондрии, в свою очередь, обеспечивают определенный уровень кальция в

20

цитозоле, который необходим и достаточен для активации экспрессии генов БТШ. Если стресс слишком сильный, кальций повышается в клетке до критического уровня. Следствием этого является падение митохондриалыюго потенциала, открытие митохондриальной поры и активация программируемой клеточной смерти.

ВЫВОДЫ

1. Присутствие митохондриальных ингибиторов и разобщителей во время теплового стресса подавляет индукцию синтеза БТШ и развитие индуцированной термотолерантности в культуре клеток A. thaliana и дрожжей S. cerevisiae.

2. Тепловой стресс вызывает усиление дыхательной активности и повышение электрохимического потенциала на внутренней митохондриальной мембране, что, по-видимому, имеет важное значение для активации экспрессии БТШ.

3. Повышение потенциала на внутренней митохондриальной мембране при тепловом стрессе сопровождается повышением уровня цитозольного кальция в клетках дрожжей S. cerevisiae.

4. Обработка экзогенным кальцием индуцирует синтез Hspl04 и повышает термотолерантность дрожжей S. cerevisiae.

5. Полученные данные позволяют предполагать, что повышение уровня кальция при тепловом стрессе вызывает гиперполяризацию внутренней митохондриальной мембраны, что является важным условием для активации экспрессии генов БТШ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. И.В. Федосеева. K.M. Гамбург, H.H. Варакина, Т.М. Русалева, ЕЛ. Таусон, И.В. Ступникова, Г.Б. Боровский, A.B. Степанов, Е.А. Давьщенко, Е.Г. Рихванов, Войников В.К. Действие азида натрия и 2,4-динитрофенола на развитие индуцированной термотолерантности и индукцию синтеза БТШ 101 в суспензионной культуре Arabidopsis thaliana II Физиология растений. - 2008. -Т.55, №2. - С.245-252.

2. И.В. Федосеева. H.H. Варакина, Т.М. Русалева, Г.Б. Боровский, Е.Г. Рихванов, В.К. Войников. Эффект ионов кальция на синтез Hspl04 и термотолерантность дрожжей Saccharomyces cerevisiae. II Микробиология. — 2010. -Т.79, №2. - С.173-179.

3. E.G. Rikhvanov, K.Z. Gamburg, N.N. Varakina, T.M. Rusaleva, I.V. Fedoseeva. E.L. Tauson, I.V. Stupnikova, A.V. Stepanov, G.B. Borovskii, V.K. Voinikov Nuclear-mitochondrial cross-talk during heat shock in Arabidopsis cell culture. // Plant J. - 2007. - V.52, №4. - P.763-778.

4. И.В. Федосеева. К.З. Гамбург, H.H. Варакина, Т.М. Русалева, E.JI. Таусон, И.В. Ступникова, Г.Б. Боровский, Е.Г. Рихванов, В.К. Войников.

21

Действие азида натрия и динитрофенола на развитие индуцированной термотолерантности и индукцию синтеза HsplOl в суспензионной культуре Arabidopsis thaliana. Материалы Всероссийской научной конференции «Структура и экспрессия митохондриального генома растений», Иркутск, 2006 г., издательство РИО НЦРВХ СО РАМН, С. 117.

5. Е.Г. Рихванов, H.H. Варакина, И.В. Федосеева.Т.М. Русалева, И.В. Ступникова, В.К. Войников. Индукция синтеза стрессовых белков Saccharomyces cerevisiae зависит от функционирования митохондрий. Материалы Всероссийской научной конференции «Структура и экспрессия митохондриального генома растений», Иркутск, 2006 г., издательство РИО НЦРВХ СО РАМН, С. 85.

6. И.В. Федосеева. К.З.Гамбург, H.H. Варакина, Т.М. Русалева, E.JI. Таусон, И.В. Ступникова, Г.Б. Боровский, Е.Г. Рихванов. Участие митохондрий в регуляции синтеза стрессовых белков Arabidopsis thaliana.. Всероссийская конференция «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете» - ТЕЗИСЫ Казань, 2006, С. 126.

' 7. А. V. Stepanov, Е. G. Rikhvanov, К. Z. Gamburg, I.V. Fedoseeva. N. N. Varakina, Т. М. Rusaleva, E.L. Tauson, I. V. Stupnikova, G. B. Borovskii, V. K. Voinikov. The role of mitochondria in heat shock response in Arabidopsis cell culture. XXXII FEBS «Molecular machine», Vienna, Austria, 2007, FEBS Journal, V.274, Issue si, P.202.

8. И.В. Федосеева, K.3. Гамбург, H.H. Варакина, Т.М. Русалева, Е.Л. Таусон, A.B. Степанов, Г.Б. Боровский, Е.Г. Рихванов, В.К. Войников. Роль митохондрий в развитии защитной реакции на тепловой шок. IX Международная конференция «Биология клеток in vitro и биотехнология» -ТЕЗИСЫ Москва, ИД ФБК-ПРЕСС, 2008, С. 424-425.

9. И.В. Федосеева, Т.М. Русалева, H.H. Варакина, A.B. Степанов,Е.Г. Рихванов, Г.Б. Боровский, В.К. Войников. Экстраклеточный кальций индуцирует термотолерантность и синтез Hspl04 в Saccaromyces cerevisiae. Материалы Всероссийской научной конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск, 2009, издательство РИО НЦРВХ СО РАМН, С. 487-491.

10. Е.Г. Рихванов, И.В. Федосеева. Т.М. Русалева, H.H. Варакина, A.B. Степанов, Г.Б. Боровский, В.К. Войников. Влияние кальциевых каналов плазматической мембраны на синтез Hspl04 и развитие индуцированной термотолерантности у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Материалы Всероссийской научной конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск 2009, издательство РИО НЦРВХ СО РАМН, С. 398-401.

11. G. Borovskii, Е. Rikhvanov, К. Gamburg, N. Varakina, Т. Rusaleva, L Fedoseeva, E, Tauson, I. Stupnikova, A. Stepanov, E. Pavlova, Y. Phedotova, V. Voinikov. Cell mitochondria acts as a stress sensor and as a dispatcher of programmed cell death. International conference for plant mitochondrial biology, Hohenroda, Germany, 2011, P.78.

Подписано к печати 06.06.2011 г. Формат 60*84/16. Объем 1,4 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 513. Издательство Института географии им. В.Б. Сочавы СО РАН 664033 г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 1

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федосеева, Ирина Владимировна, Иркутск

61 11-3/1104

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК СИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ РАСТЕНИЙ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РАН

На правах рукописи

Федосеева Ирина Владимировна

МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА У РАСТЕНИЙ И ДРОЖЖЕЙ

03.01.05 - физиология и биохимия растений

диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор

Войников Виктор Кириллович

Иркутск, 2011

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...............................................................................................5

1. ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................7

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................9

2.1. Механизмы термотолерантности..............................................................................9

2.2. Классификация БТШ................................................................................................11

2.3. Регуляция синтеза БТШ...........................................................................................24

2.4. Механизмы регуляции экспрессии генов БТШ.....................................................31

2.5. Митохондрии, как регулятор процессов, отличных от процесса производства энергии..............................................................................................................................46

2.6. Дрожжи как модельный объект..............................................................................53

2.7. Выводы из обзора литературы и формулирование цели исследования и задач 54

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.......................................................................................57

3.1. Объекты исследования.............................................................................................57

3.2. Использованные концентрации ингибиторов и разобщителей ЭТЦ..................57

3.3. Температурные обработки и обработка ингибиторами и разобщителями ЭТЦ 58

3.4. Определение жизнеспособности.............................................................................59

3.5. Определение дыхательной активности..................................................................60

3.6. Определение каталазной активности.....................................................................60

3.7. Выделение суммарного белка.................................................................................61

3.8. Электрофорез в ПААГе с ДДС-Ш.........................................................................62

3.9. Окрашивание и обесцвечивание гелей...................................................................62

3.10. Вестерн-блоттинг...................................................................................................62

3.11. Использованные антитела.....................................................................................63

3.12. ОТ-ПЦР-анализ.......................................................................................................63

3.12.1. Выделение РНК....................................................................................................63

3.12.2. Денатурирующий РНК электрофорез..............................................................64

3.12.3. Синтез кДНК......................................................................................................64

3.13. Флуоресцентная микроскопия..............................................................................65

3.14. Люминесценция экворина.....................................................................................66

3.15. Статистическая обработка данных.......................................................................67

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.............................................................................................................68

4.1. Дисфункция митохондрий и защитная реакция на тепловой стресс в клетках суспензионной культуры А. ШаНапа.............................................................................68

4.1.1. Изучение влияния ингибиторов ЭТЦ на экспрессию БТШ в клетках суспензионной культуры А. ЛаИапа..............................................................................68

4.1.2. Изучение влияния ингибиторов ЭТЦ на развитие индуцированной термотолерантности в клетках суспензионной культуры А. ЖаИапа....................71

4.1.3. Специфичность действия ингибиторов ЭТЦ на развитие индуцированной

термотолерантности в клетках суспензионной культуры А. ЛаИапа....................76

4.1.3. Изучение эффекта мягкого теплового стресса на дыхательную активность и гиперполяризацию внутренней митохондриальной мембраны в клетках суспензионной культуры А. ОпаИапа..............................................................................78

4.2. Дисфункция митохондрий и защитная реакция на тепловой стресс в клетках дрожжей 5. сегеушае......................................................................................................83

4.2.1. Изучение влияния ингибиторов ЭТЦна гиперполяризацию внутренней митохондриалъной мембраны и экспрессию генов БТШ в клетках дрожжей S. cerevisiae в зависимости от типа энергетического метаболизма...........................83

4.3. Изучение зависимости между изменением концентрации внутриклеточного кальция и гиперполяризацией внутренней митохондриалъной мембраны при мягком тепловом стрессе у дрожжей S. cerevisiae.......................................................91

4.3.1. Изучение влияния мутаций в генах ССН1 и MIDI на параметры роста и особенности функционирования митохондрий в клетках дрожжей S. cerevisiae ..91

4.3.1.1. Параметры роста дрожжей на твердой среде..................................................92

4.3.1.2. Параметры роста дрожжей на жидкой среде...................................................95

4.3.1.3. Измерение интенсивности поглощения кислорода........................................95

4.3.1.4. Базовая термотолерантность.............................................................................95

4.3.2. Изучение влияния мутаций в генах ССН1 и MIDI на развитие индуцированной термотолерантности и синтез Hspl04 в клетках дрожжей S. cerevisiae...........................................................................................................................98

4.3.3. Изучение влияния мутаций в генах ССН1 и MIDI на способность азида натрия ингибироватъ индуцированную термотолерантность и синтез Hsp 104 в клетках дрожжей S. cerevisiae......................................................................................99

4.3.4. Влияние мягкого теплового стресса на уровень кальция в цитозоле клеток дрожжей S. cerevisiae...................................................................................................101

4.3.5. Изучение влияние азида натрия на изменение уровня внутриклеточного кальция при мягком тепловом стрессе в клетках дрожжей S. cerevisiae..............106

4.3.6. Изучение влияния мутаций в генах ССН1 и MIDI на изменение потенциала на внутренней митохондриалъной мембране и дыхательную активность в клетках дрожжей S. cerevisiae...................................................................................................108

4.4. Эффект экзогенного кальция на ответ дрожжей S. cerevisiae на повышение температуры...................................................................................................................111

4.4.1. Обработка экзогенным кальцием повышает термотолерантность и синтез БТШ в клетках дрожжей S. cerevisiae.......................................................................Ill

4.4.2. Влияние экзогенного кальция на термотолерантность в зависимости от присутствия белков Cchlp Midlp...............................................................................112

4.4.3. Специфичность действия ионов кальция на термотолерантность и синтез Hsp 104 в клетках дрожжей S. cerevisiae...................................................................114

4.4.4. Повышение термотолерантности и индукция синтеза Hspl04 подавляется азидом натрия в клетках дрожжей S. cerevisiae......................................................120

4.4.5. Изучение влияния ионов кальция на индуцированную термотолерантность и синтез Hsp 104 в клетках дрожжей S. cerevisiae......................................................120

4.4.6. Изучение влияния ионов кальция на синтез Hsp 104 в клетках мутанта

msn2Amsn4A....................................................................................................................122

5. ОБСУЖДЕНИЕ.........................................................................................................126

5.1. Митохондрии играют ключевую роль в развитии ответа на тепловой стресс у культуры клеток A. thaliana и дрожжей S. cerevisiae.................................................126

5.2. Тепловой стресс вызывает повышение потенциала на внутренней митохондриальной мембране в клетках культуры клеток A. thaliana и дрожжей S. cerevisiae.........................................................................................................................133

5.3. Мягкий тепловой стресс вызывает повышение концентрации цитозольного кальция в клетках дрожжей S. cerevisiae.....................................................................138

5.4. Обработка экзогенным кальцием индуцирует синтез HSP104 и повышение термотолерантности в клетках дрожжей S. cerevisiae...............................................142

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ..........................................................................................................147

7. ВЫВОДЫ...................................................................................................................150

7. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ......................................................151

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АБК - абсцизовая кислота АБК - абсцизовая кислота

АМД - амиодарон - 2-бутил-3-(3,5-дийод-4-диэтиламиноэтоксибензоил)-бензофуран

АФК - активные формы кислорода

БГК - бензгидроксамовая кислота

БТШ - белки теплового шока

ВТМ - вирус табачной мозаики

ГДФ - гуанозиндифосфат

ГТФ -трифосфат

ДНФ - 2,4-динитрофенол

КОЕ - колониеобразующая единица

мтДНК - митохондриальная ДНК

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

ПКА - протеинкиназа А

ПКС - программированная клеточная смерть

СССР - карбонил-цианид-3-хлоро-фенилгидразои

ТСБ - трис-солевой буфер

ТСБ - трис-солевой буфер

ТТХ - 2,3,5 - трифенилтетразолиум хлорид

ФМСФ - фенилметилсульфонилфлюорид

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

цГТФ - циклический гуанозинмонофосфат

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

ЭТЦ - электрон-транспортной цепь митохондрий

[Са2+]цит- цитоплазматический кальций

ААА+ (ATPases associated with various cellular activities) - АТФ-азы, связанные с различными клеточными активностями СаМ - кальмодулин

Cbl (calcineurin B-like) - кальцинейрин-В-подобный белок

CDPK (Ca -dependent protein kinase) - Ca -зависимая протеинкиназа

Clp (caseinolytic protease) - казеинолитическая протеаза

DACC (depolarization-activated cation channels) - катионные каналы, которые

открываются при деполяризации мембраны

DBD (DNA-binding domane) - ДНК-связывающий домен

DRE (dehydration-responsive element) - си-элемент, отвечающий на дегидратацию DRE/CRТ (dehydration responsive element/C-repeat) - элемент в промоторах генов, чувствительных к дегидратации

НАСС (hyperpolarization-activated cation channels) - катионные каналы, которые

открываются при гиперполяризации мембраны

Hip (Hsp70 interacting protein) - Hsp70 связывающий белок

Hop (Hsp70/Hsp90 organizing protein) - Hsp70/Hsp90 организующий белок

Hsc70 (heat shock cognate 70-kD) - родственный Hsp70 белок

HSE (heat shock element) - элемент теплового шока

Hsf (heat shock factor) - фактор теплового шока

Hsp (heat shock protein) - белок теплового шока

IP3 - инозитол-1,4,5-трифосфат

JC-1 - 5,5',6,6'-тетрахлоро-1,1 ',2,2'-тетраэтилбензимидазоло-карбоцианин йодид LACS - система транспорта кальция с низкой афинностью (low-affinity Са2+ influx system)

mtA\|/ - потенциал на внутренней митохондриальной мембране

NBD (nucleotide binding domane) - нуклеотид-связывающий домен

NES (nuclear export signal) - домен ядерного экспорта

NLS (nuclear localization signal) - участок ядерной локализации

sHsps (small heat shock proteins) - низкомолекулярные белки теплового шока

STRE (stress response element) - стресс - чувствительный элемент

TAR (transcriptional-activation region) - область активации транскрипции

TMRM - метиловый эфир тетраметилродамина

VGCCs (voltage-gated Са2+ channels) - потенциал управляемый кальциевый канал L-типа

VICC (voltage-independent cation channels) - потенциал независимые катионные каналы

кукурузы ZwHsp22 в ответ на действие теплового стресса повышалась экспрессия других ядерных генов БТШ (Rhoads et al., 2005). По данным анализа микроэррэй в клетках A. thaliana, обработанных ротеноном, увеличивалась активность ряда генов, кодирующих митохондриальные шапероны: Hsp60, HsplO и др. (Lister et al.,

2004). Вероятно, митохондриальная регуляция стрессовых генов не ограничивается только тепловым стрессом. Например, было показано, что в растениях А. thaliana нарушение функционирования комплекса I (НАДН-дегидрогеназа) электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий в результате мутации в гене FR Ol приводило к снижению экспрессии генов, регулируемых холодом (Lee et al., 2002).

Несмотря на то, что эти данные подтверждают гипотезу о существовании пути передачи информации между митохондриями и ядром, остаются до конца не понятны механизмы, с помощью которых эти два генома взаимодействуют и влияют на генетическую активность друг друга. Исследования, проведённые на различных объектах, предлагают различные пути передачи сигнала от митохондрий к ядру, включая 02 (Poyton, Dagsgaard, 2000; Bailey-Serres, Chang,

2005), АФК (Rhoads et al., 2006; Miller, Mittler, 2006; Saidi et al., 2011) и изменения в гоместазе Са2+ (Biswas et al, 2005; Balogh et al., 2005; Saidi et al., 2011).

Результаты, полученные в последнее десятилетие, показывают, что функции митохондрий не ограничиваются только окислительным фосфорилированием. Показано активное участие митохондрий в развитии программированной клеточной гибели (ПКГ) в клетках животных и растений (Vianello et al., 2007). Следует также отметить, что митохондрии являются одним из основных источников АФК в нефотосинтезирующих клетках и тканях растений (Moller, 2001; Rhoads et al., 2006; Blokhina, Fagerstedt, 2010), а также у дрожжей (Гордеева и др., 2003; Perrone et al., 2008; Rigoulet et al., 2011). С другой стороны, в клетках животных митохондрии играют активную роль в гомеостазе внутриклеточного кальция. Повышение уровня Ca в цитозоле сопровождается транспортом этого иона в митохондрии (Cerella et al., 2010; Kornmann, Walter, 2010).

Несмотря на то, что с одной стороны, митохондрии играют активную роль во

2+

внутриклеточном гомеостазе АФК и Ca , а с другой стороны эти вторичные мессенжеры участвуют в регуляции экспрессии генов БТШ при тепловом стрессе, роль митохондрий в регуляции экспрессии генов БТШ остаётся неизученной.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Механизмы термотолерантности

Способность растений, как и других организмов, выдерживать кратковременное действие повреждающих температур определяется их базовой термотолерантностью. Однако, если растения подвергнуть неповреждающему тепловому воздействию, на 10 °С выше оптимальной температуры роста, то в них развивается способность выдерживать последующий повреждающий тепловой шок. Это явление известно как приобретённая, или индуцированная термотолерантность (Kapoor et al., 1990; Vierling, 1991; Flahaut et al., 1996; Burke et al., 2000; Hong, Vierling, 2000; Massie et al., 2003; Larkindale et al., 2005). Способность выдерживать и адаптироваться к сверхоптимальным температурам является следствием, как повышения собственно термостабильности клеточных структур, так и способности восстанавливать повреждённые при тепловом шоке структурные компоненты.

Тепловой шок комплексно влияет на клеточные функции, снижая выживаемость, продукцию и накопление биомассы, урожайность. Поэтому развитие термотолерантности затрагивает многие процессы. При этом одни процессы могут быть специфическими для базовой термотолерантности, другие -запускаются во время развития индуцированной термотолерантности, а третьи участвуют в обоих процессах. Известно, что тепловой стресс влияет на целостность и функции биологических мембран, вызывая перестройки в их подвижности и проницаемости через изменение конформации мембранных белков и состава жирных кислот (Alfonso et al., 2001; Sangwan et al., 2002). Термостабильность клеточных мембран является косвенным показателем устойчивости многих растений к тепловому стрессу (Wahid et al., 2007).

Функции ферментов также чувствительны к изменениям температуры. Изменения ферментативной активности при тепловом стрессе могут приводить к дисбалансу метаболизма или вызывать полную инактивацию ферментов вследствие денатурации белков (Vierling, 1991; Kampinga et al., 1995).

Тепловой стресс может вызывать в клетке генерацию активных форм кислорода (АФК), вызывая окислительный стресс, приводящий в свою очередь к дальнейшим клеточным повреждениям (Davidson et al., 1996; Larkindale, Knight,

2002; Vacca et al., 2004; Van Breusegem et al., 2008). АФК вызывают перекисное окисление ненасыщенных мембранных лииидов и пигментов, приводя к изменению проницаемости клеточных мембран (Liu, Huang, 2000; Xu et al., 2006). Однако организмы обладают рядом ферментативных и не ферментативных систем детоксикации, играющих важную роль в защите клеток от АФК.

При тепловом стрессе различные виды растений накапливают множество растворимых веществ, таких как сахара, пролин, глицин-бетаин, холин О - сульфат (Sairam, Tyagi, 2004). Накопление растворимых веществ может также увеличивать стресс устойчивость растений.

В условиях высокой температуры возрастает количество вторичных метаболитов, таких как фенольные соединения, включая флавоноиды, антоцианы, лигнин и фенилпропаноиды (Chalker-Scott, 2002; Wahid, Ghazanfar, 2006). Фенилпропаноиды синтезируются фенилаланин аммоний-лиазой через фенилпропаноидный метаболический путь. В условиях теплового стресса активность этого фермента увеличивается и индуцируется синтез фенольных соединений. Полагают, что фенольные соединения уменьшают окисление, вызванное тепловым стрессом в условиях высокой солнечной радиации (Rivero et al., 2001).

Когда растения и проростки подвергаются нагреванию, важные клеточные белки денатурируют, приводя к образованию нерастворимых агрегатов, которые мешают организму восстанавливаться после действия теплового шока. Одна из защитных систем, участвующих в развитии индуцированной термотолерантности, ассоциируется с синтезом и накоплением специфических белков, названных белками теплового шока (БТШ; Hsp, heat shock protein) (Vierling, 1991; Wahid, 2007; Sonna et al., 2002; Терёшина, 2005; Efeoglu, 2009). Индукция БТШ является консервативным механизмом термотолерантности для про- и эукариот. Полагают, что эти белки действуют в качестве молекулярных шаперонов, чтобы защищать клеточные белки от необратимой денатурации, индуцированной теплом, и помогать рефолдингу уже повреждённых стрессом белков (Boston et al., 1996; Vabulas et al., 2010). БТШ имеют не только свой уникальный способ действия, который включает шаперонную активность (Wang et al., 2004; Richter et al., 2010),

но и взаимодействуют с другими системами защиты, включая синтез осмопротекторов (Diamant et al., 2001) и антиоксидантов (Panchuk et al., 2002).

Кроме