Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение, свойства и применение иммобилизованной рибофлавинкиназы из дрожжей

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение, свойства и применение иммобилизованной рибофлавинкиназы из дрожжей"

Р Г Б ОД

1' 0 1 ' 2 о к о'* «о ала

АКАДЕМ1Я НАУК УКРЛ!НИ ШСТИТУГ Б10Х1М11 1М.О.В.ПАЛЛАД1НА

На права* рукопису

ПРЕОБРАЯЗЮЬХА Олема МмолаКша

ОТРИМАНЯ, ВЛАСТОПСТ1 I ЗАСТОСУВАИНЯ 1ЫИОБ1Д130ВАН01 РИВМШ1НКШЗИ ХР11ХЯ1В

03.00.04 - 01ох1м1я

Автореферат дисертацП на здобуття наукового ступени кандидата б!олог1чиих наук

Км1в - 1994

Робота виконана у в1дд1л! регуляцП кл!тинного синтееу нивь-комолекулярних сполук 1 у в1дд1л! 01ох1м1чно1 генетики В1дд1лення регуляторних систем кл!тини 1нституту С1ох1ыП 1м.0.В.Паллад1на АН Укра1ви

Науковнй квр1вннк - кандидат б!олог1чних наук Кац»жо В.Е.

0ф1ц1йн1 оооиеити: - доктор б1ологччних наук, професор

Куд1нов С.А. - кандидат б1олог!чних наук Эакальсышй А. 6.

аров1дца устамва - 1нститут м1кроС1ологП 1 в!русологП

"Л................

при 1нститут1 61ох1м11 1м. О.В.Палдад1на ДН Укра1ни за адрессю:" 252030, ы.Ки1в-30, вул.Леонтовича, 9

3 дисертац!ею ыожна ознашмнтнса у 01бл1отеиД 1нститута 61ох1ы11 1ы. 0.В.Падлад1на АН Укра'1ни

Автореферат роз!слашш

■■ .. ¡С^ТИ^/ 1994 р.

1м.Д.К.Заболотного АН Укра1ни (м.Ки!в)

Учений секретар спец1ал!эовано1 вчено! ради

0.В.К1рсенко

ЗАГЛЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Лктуалыпсть пройлеми. Останшм часом все бшьшого значения набувае розробка ферментативних способов синтезу складннх за структурою оргашчиих сполук. Ферментатнвннй синтез, на вшмшу к Li метод!в хЫчного синтезу, характеризуеться строгого спецнфпшстю ди б'юлопчннх катаяЬатор!в.

Важливе значении мае розробка ферментативних способт синтезу флавшовнх нуклеотцш, а саме FMN. FMN (рибофлавш-5'-фосфпт) - коферментна форма в'ггамшу В2, входить до складу ряду окисно-вщновних фермент'т клтши - флавопротеинв. Як ефективннй заа'б метабодшно! Tepanil FMN застосовують для л!кування та профшактикл захворговань в дерматолога, офтальмологи, гастроентерологп. FMN е внхшною речовиного для синтезу FAD, використовуеться як реактив у наукових досл'щженнях.

До цього часу препарат» FMN одержують хЬпчпим синтезом. Але, як стало нещодавно в'шомо, таю препарати м'кггять до 60% ¡зомерних домалок, як! за хЬпчною структурою вщр1зняються вщ рибофлавш-5'-уосфату,а ix бюлопчна актившсть практично не иивчена [Entscli et al.,1983; Nielsen et al., 1983J . HaitKpauii препарати провщних cniTOBiix ффм при висоюи вартосп М1стять вш 25 до 40% ¡зомерних домшок. Мжробюлопчне виробннцтво FMN на даний час вшсутне, оскшьки мпфооргашзми, що здатш нагромаджувати цеп нуклеотид у культурах, не onncani.

В клтпн синтез FMN здшснюсться за допомогою ферменту АТР: рибофлавш-5'-фосфотрансферази (ри6офлавшюнази),який фосфорилюе рибофлавш (РФ) строго по S'-положенню бгшого рибпильного ланшога з утворенням РФ-5'-фосфату. У зв'язку з ним доцшьно використання цього ферменту для розробки методу синтезу препаратш FMN високого ciynemo чистота, як! б не М1стили ¡зомерних доминок.

Мета та заедания доЫджешчг. Головною метою робота було дослшити можлнвють використання РФ-кшази з м»фооргашзм1В у процесах ферментативного синтезу препаратш FMN. Для досяшення поставлено! мети у роботт ставилися тага осношп завдання:

1. лошук продуцента ферменту серед мпфоорпитм'т;

2. розробка методш видшення i очищения ферменту;

3. отримання ¡ммобинзованнх npenapatiß РФ-кшази i

дослшження ix властивостей; .

4. розробка ферментативного методу синтезу FMN за

допомогою отриманих препарата РФ-кшазн.

Наукова новизна робота. В poGoTi розроблено два иових високочутливих метода визначення активное^ РФ-кшази. Дослщжено актившсть РФ-кшази у 31 штаму мкрооргашз.шв PÍ3HHX систематичних груп. Найвиший piBCHb ферментативно}' активноеп виявлено у парафш- та метанолутишзуючих дрЬкдлив -Pichia guilliermondii, Candida maltosa i Hansenula polymorpha. У цих дрЬкдаав виявлено явище шдукци синтезу РФ-кшази при вирощуванш на парафшах або метаноли Серед мутант!u Н. polymorpha з констшугивним синтезом РАО-залежноГ алкогольоксидази знайдено суперпродуцент ферменту Н. polymorpha ВКПМ Y-926.

Розроблено процедури очистки РФ-кшази з дрЬкдоав-продуцентш цього ферменту i детально дослщжено н властивость

Отримано ÍMM06LnÍ30Bani препарата дрЬкджово! РФ-кшази включениям в структуру псшакриламйшого гелю.ковалентшш приеднанням до похщних агарози, псшакриламшу i силохром1в. Проведено пор1вняльне дослщжепш; властивостей розчиипо! та ÍMMo6LnÍ30Bano'¡ РФ-кшази. Остановлено,що ¡ммобийзац'ш ферменту суггево не впливае на каталггичш характеристики, але значно стабишуе РФ-кшазу.

Розроблено методи синтезу FMN та його анатопв в реакторах перюдичного та безперервного типу да на ochobí розчипноТ та ÍMMo6LnÍ30BaHoi РФ-кшази. Огримаш таким способом препарати FMN практично не мютять домшок i е виключно РФ-5'-фосфатом.

Метод визначення активноеп РФ-кшази та метод синтезу FMN i його аналопв захишеш авторськими свшоцтвами.

Иауково-практичне значения роботы. Дослщжения фермен пв, що синтезують флавшов1 нуклеотиди е важливе з точки зору фундаментально! науки, осюльки закоиом1рносп бюсинтезу FMN i FAD у MÍKpoopranÍ3MÍB до цього часу вивчеш недостатпьо. Розробка метод|в ¡ммобшЬацп РФ-кшази, отримання нерозчинних препаратов ферменту та дослщжения ix властивостей вносить вагомии виесок в таку область бюлопчно! науки, як шженерна ензимологш.

Дослщжения процеав ферментативного синтезу FMN, проведене в робот!, може бути використане при масштабувашп i впроваджешп в промисловють ферментативного методу синтезу коферментних форм вггамшу В2- Такий cnoci6 мае cyneBi переваги перед Х1м1чпим синтезом, оскшьки дае можлшпсть проводити трансформацпо РФ 3¡ 100% виходом FMN i отримуваати препарати, ям не мютять ¡зомерних домшюк з невизначеною Сполопчною актившстю.

Апробащя робота та пуб.йкацП. Матеркши дисертацй доповщались i обговорювались на симпоз!ум1 "Биохимия, фармакология и медицинское применение производных витаминов

и других предшественников коферментов" (1ркутськ, 1983), V Всесоюзному бюх1м1чному зЪл'1 (Москва, 1986), III Всесоюзшй конференци "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Пушило, 1986), V Укра'шському бюх)М1чному зЪд! (Кшв, 1987), IV Всесоюзшй конференци "Биосинтез ферментов

микроорганизмами" (Ташкент, 1988), VI 3-13Д1 Украшського м'жробюлопчного товаристпа (Кшв, 1989), Всесоюзной конференци "Проблемы микробного синтеза витаминов и их производных" (Ташкент, 1990), Всесоюзшй конференци "Методы получения, анализа и применения ферментов" (Рига, 1990), ВсосоюзнШ школь ceMiiiapi "Био-термо-хемилгоминесценция" (Москва, 1990), 15 М1жиародному симпоз1ум1 по дрЬкджах (Рига, 1991), 7 Всесоюзному снмпоз!ум1 "Инженерная этимология" (Москва, 1991), Всесоюзшй конференци "Достижения биотехнологии -агропромышленному комплексу" (Чершвш, 1991), VI з1зд1 Украшського товариства генетсшв i селекшонер1в (Кшв, 1992), 16 ЛИжиародшй конференци по генетиш i молекуляршй бюлогн др1ждж1в (Вцень, 1992), 7 Мжнародному симпоз1ум! по Cj сполуках (BapuiK, 1992), 7 ввропейському KOHrpeci по бттехнологц (Флореншя, 19,3).

За матергллпмп дисертацишо! роботи опубликовано 2 статп та 18 тез доповшей, отримано 2 авторських свшоцтва.

Структура та об'см роботы. Дисерташя складаеться з! вступу, огляду Л1тератури, опису матер1алт i методт досл'щжень, викладення результате дослижень та ix обговорення, висновюв i списку л1тературп (225 першоджерел). Робота викладена на 161 CTopinui друкованого тексту, киострована 42 „.алюнками i 17 таблицями.

МАТЕР1АЛИ I МЕТОДИ

В робот1 використовували дродш: Saccharomyces ccrevisiae раса XII, парафшутшшую'и др!ждаа Pichia guilliermondii АТСС 9058 i мутант ш»ого виду ВКПМ Y-432 з дерепресованою РФ-пермеазою, npoMiioioBi штамп Candida maltosa 774, 777 i 899; штамп метанолупшзуючих др'/ждж'ю Candida boidi ;ii Т2А, ВСБ 719, Pichia pinws 1031, MH4 i Hansenula polymorpha 42a, а також ML3.ML8.ML9, ВКПМ Y-201 (НД1 Генетика,м.Москва).

-бактери: Escherichia coli К-12, Bacillus licneniformis 28KA, Bacillus subtilis BKM B-428 i Shgw, а також ауксотрофи по РФ ВКПМ В-5101 i D-I07 (НД1 Генетика i кафедра мнсробюлогй Льв'тського лержушверситету).

-мшел^альний гриб Eremothecium ashbyii 1906 (НД1 Генетика). MiKpooprani3MH культивували на вщповшних середовншах [Burkholder, 1943; Spizizen, 1958; Yagi, 1956).

Безклтшш екстрактн отримувалн балютичннм методом руйнування або екстракшею ацетонов!ix порошков кляин.

Актившсть РФ-ынази визначали за методом Кащенко i Щ1976]. Визначення активное« РФ-юнази у вщношенш сщноаченого РФ проводили за модифжованим методом [Kearney et al., 1979],

Актившсть FAD-синтетази визначали за методом Schrecker i Kornberg (1950), актившсть л ужи oí фосфатази - за модиф'шованим методом СтругавшиковоГ i ¡н. |1973|, використовуючи в якост} субстрату FMN.

Фракцюнування безюнтинних екстракт1в сульфатом aMoiiiio i оргашчними розчинниками здшсшонали за загальноприйнятимн методиками [Скоупс, 1985).

Гелъ-хроматографто безкллшших екстракт1в i препарат РФкшази проводили на сефадексах G-75, G-100 i G-J50 , молселект! G-75; юнообмшну хроматографш - на KM- i ДЕАЕ-целюлозах.

Для ¡ммобшзацц РФ-кшази включениям у п о л i а к р и л а м iд н i ш гель (ПААГ) використовували розчини з концентращею акриламшу 20-40% i вшносною концентрацию 1^,№-метилен-б1сакриламщу 24%.

Пщготовку i активашю носцв для ¿ммобинзацц РФ-кшази здШснювали за загальноприйнятими методиками [Вудворд, 1988; Еерезин и др., 1976; Туркова, 1980). Амшогексилагарозу, акрилекси Р-150 i П-200 активували 25%, а амшопропшсилохром - 12,5% глугаровим альдепдом. Акрилекси А-100, АНС4 i С-100 обробляли спиртовим розчином дициклогексилкарбодимшу (0,5 мг/мл), акрилекс АН-100 - охолоджениМ 2%-ним розчином NaN02-Бензохшонсидохром i епоксисилохром використовували без додатково'1 активацй. В якостч основного буфера при ¡ммобишаци РФ-кшази на активопаних бромщаном агароз1 та сефароз1, акрилексах А-100, АНСц, С-100 i АН-100 використовували 10 шМ фосфатний буфер, рН 8,0, на bcíx ¡нших hocíhx - 10 шМ фосфатний буфер, рН 7,0.

1ммоб1шзацЬо фермента на активованих бромщаном arapo3i та сефароз! проводили карбамщним методом; на ам!ногексилагароз1, акрилексах Р-150, П-200, А-100, АНС4 i С-100 i aMiHonponlnciuioxpoMi - амцшим методом; на акрилекс! АН-100 -азидним методом.

Концентрацда бшку в препаратах визначали за методом Lowry i in. [1951).

Константи М1хаел1са (Km) РФ-кшази для субстрата реакци визначали гргфчно за методом Lineweaver i Berk (1934). Енерпю активацй реакии фосфорилювання РФ визначали за тангенсом кута нахилу прямо! на графку залежносп швидкост! синтезу FMN вщ

температури в координатах Appeniyca [Диксон i Уэбб, 1982]. Константу швидкосп процесу ¡нактивацн, операшйну стабшыпсть ферменту в npoueci робота peaKTopiß безперервноТ дп, а також швперюд збереження активное^ розраховували за методами, описаними paniiue [Варфоломеев и Березин, 1976].

Ефектишпсть процесу ¡ммобшзацц ошнювалм за виходом ферментативноТ активности я кии виражали як процентне вщношення активного ферменту, що зв'язався з hociem, до Bcie'i KüibKOCTi ферменту в препарат! взятому для ¡ммобШзацп.

РЕЗУЛЬТАТ!! ДОСЛЩЖЕНЬ ТА КХ ОБГОВОРЕННЯ

I. Розробка новик мстод1В внзначення активност! РФ-.пнази.

1сную>п метода внзначення РФ-кшази базуються на роздшенн! субстрату РФ-кшазно> peaKui'i - РФ i продукту - FMN за допомогою р1зних вшив хроматографа [Кащенко и др.,1976; Brook et al., 1986; Eggeling et al., 1977; McCormick et al., 1962; Zak et al., 1982], e TpyÄOMicTKiiMii i багатоиапиими.

Розробляли HOBi, npocTi у виконанш i високочутлив1 методн внзначення ак .umiocTi ферменту. Перший метод базуеться на ycyiieimi непрореагованого РФ ¡з реакцшно! cyMiuii за допомогою йога транспорту в клтши мутантного штаму Р. guilliermondii ВКПМ Y- 432. Процес здйгсшое РФ-пермеаза специф1чна до РФ, але не до FMN [Сибирный и др., 1977].Шелл поглинання РФ активн1сть РФ-кшази можна вим!рювати по галькосп утвореного FMN прямою флуориметр1ею проби.

Внзначено оптимальш умови для повного усунення РФ ¡з реакшйнпх с у?.! шей (рис.1). Клтши в концентрацП 10 мг/мл понижали ¡3 peaKuinHirx сумшей практично весь РФ за 1,5 год шкубаци.

Метод здшешовали по cxeMi: дослщжуват ал1квоти ферментного препарату змшували з репкцшного сум!шшю, яка Micriina РФ у концентрацП 30 цМ, ATP - 0,3 mM, MgS04 - 1 mM i 25 mM фосфатний буфер, pH 8,0, i ¡нкубували при 37°С. Для зупннкн реакцн проби прогртали на киплячш водянШ баш протягом 4 хв. До охолоджених проб додавали суспензпо дрЬкяжовнх кл'гпш в 0,5 М КН2РО4 ¡з розрахунку 10 мг па 1 мл проби, шелл чого проводили ¡нкубацпо з перемпиуванням 90 хв при 30°С. Осад усувалн центрифугуванням. В отриманому супернатант'1 визначали концентрацио FMN флуориметрнчннм методом. Як видно з рис.2 штенсившсть флуоресценци досл1ожуваного препарату ферменту з. Р. guilliermondii зростае лшШно залежно Bin BMicTy РФ-кшази в npo6i в д1апазош вщ 40 до 240 цЕ/пробу.

о о.

20--

. 10--

час, хв

Рис.1. Залежшсть концентраци залншкового РФ в реакщншй cyMimi в!д часу ¡нкубацй рЬних концентрацш клггин P. guilliermondii ВКПМ Y-432 з реакшйною сумшшю. Вихшна концентрация РФ в реакшйшй сушин 0,1

тМ (-) 1 30 jiM (---); концентрация клтш 3 мг/мл (О), 5 мг/мл (Д) i 10

мг/мл (D).

80т

ц

о 604-

а

§ 40 + а о s 0. О

*20 +

/

/

/

/

/

00

160

240 РФ-юназа, цЕ

Рис.2. Залежнкть флуоресценцп реакцШно! cyMimi п!сля вилучення РФ клтшами P. guilliermondii ВКПМ Y-432 вщ активносп РФ-кшаэи в проб!.

Другий метод - бюлюмшесцентний, грунтуеться на використанш ферментативно! системи i3 свпгних бактерм люциферази/РММ-редуктази, в яюй продукт РФ-кшазно5 реакцп -FMN здШснюе функци кофактора [Hastings et al., 1985]. При використанн! набору реакпшв для бюлюм'шесцентного анализу "КРАБ" (сектор бютехнологп 1нституту бюф1зики СВ АН Pocii) i б1олюм1но1метра БЛМ-7801 (СКТБ "Наука", СВ АН Pocff) метод эдЫснювали наступним чином: в кювету люмшометра вносили 50 мкл 0,01% розчину мфистинового альдегиду, 20 мкл 1 шМ розчину NADH, 40 мкл cyMiiui "КРАБ", 370 мкл 0,1 М фосфатного буфера, ' рН 7,0 i 20 мкл дослщжуваноТ проби. На рис.3, А представлено катбрувальний граф»к залежноеп ¡нтенсивност! бюлюмшесценци ад зктивносп РФ-юнази для препарату фермента ¡з Н. polymorpha.

- 3 використанням бюлюмшесцентно! репстрацн к1лькост1 утвореного FMN вперше для РФ-юнази розроблено метод безперервного контролю активности У цъому випадку в термостатовану при 37°С юовету люмшометра вносили Bci необхщш для бюлюмшометричного ана/изу компонента i 50 мкл реакщйноТ cyMimi для визначення РФ-кшазно! активносп. Реакцию починали внесениям 50 мкл дослшжуваного ферментного розчину. На рис.3, В представлено залежшсть бюлюмшесценци вщ активности РФ-к'шази в npo6i.

Гис.У. Визнячення РФ-юназн oi якттносп бюлюм1несцентним методой». Д - метод з вщбором проб; В - безперервний метод, цифрами на f Г[к1ф'|ку пока чано активн1сТь РФ-к'шази шЕ/пробу.

Опрацьоваш в данй робот! методи визначення активное™ РФ-кшази дають добре вщтворюваш результата, характеризуються

високою чутлив!стю (до 0,01 цЕ/проб}) i можуть використовуватис» у широкому д!апазош дослщжень ферменту, в тому числ! при проведенш кшетичних експеримента, а також для експрес-контролю процесу синтезу FMN у 6íoxímÍ4Hkx реакторах.

2. Визначення РФ-кшазио! активност! у деяких мжрооргашзмш.

Проведено пошук джерел РФ-кшази серед мшрооргашзмш p¡3-них систематичних груп (бактерШ, дрЬвдиав, мщел1альних rpnöiii) з використанням бюмасси промислових штам1в-продуцент1в РФ В. subtilis i Е. ashbyii, продуцентов бшково-вЬамшних концентрат С. maltosa i Н. polymorpha.

Визначення РФ-кшазно! активноеп у бактерш В. subtilis Shgw, В. subtilis ВКПМ В-5101, В. subtilis ВКМ В-428, В. subtilis D-107 В. licheniformis 28 KA i Е. coli К-12 показало, що актившсть ферменту у дослцркених пред ставни kíb бактерШ була низькою i коливалась в межах 9,5-57,1 дЕ/мг бшку. Ще нижчим р1внем ферментативно! aKTHBHocri характер|зуються L. arabinosus [Snoswell, 1957) Е. coli [Katagiri et al., 1959) i В. ammoniagenes [Manstein et al., 1986]. Ha BWMiity Bia дослщженого Kearney i íh. [1979] штама В. subtilis H52, який проявляв РФ-юназну актившсть ттьки по вщношенню до вщновленого РФ, у двох ¡з п'яти представшшв роду Bacillus (В. subtilis ВКПМ В-5101 i В. licheniformis 28 KA) виявлено актившсть ферменту як з окисленим, так i з вщновленим субстратом.

РФ-юназну актившсть визначали в мщелй др1жджепод1бного гриба E.ashbyii. При культивуванш штама Е. ashbyii 1906 НД1 Генетика на багатому середовшш в раншй стацюнаршй фаз1 росту актившсть РФ-юнази в безклтшних екстрактах сягала 3,8 тЕ/мг. Але культура вщзначалась генетичною нестабшьшстю по флавшогеннш активност! i pinino фермент!в синтезу флавшових нуклеотшйв. Актившсть РФ-кшази. в мщелй може змшюватися в значних межах (вщ 65 цЕ/мг до 3,8 mE/мг). Дослщження 6ioMacH Е. ashbyii, вирощено! в умовах промислового виробництва на Bi0xÍMÍ4H0My завод1 (м. Пшськ, Бшорусь) показало, що при такому культивуванш активн1сть РФ-кшази в мщелн не перевищуе 60 цЕ/мг..

Перспективним джерелом для видшення рибофлавшкшази е бюмаса парафш- i метанолутагизуючих дрЬкдоав (табл.1). Осюльки ¡снують дат про стимулящю флавшогенезу P. guilliermondii при вирощуванш на парафшах нафти [Nishio, 1970; Диканская, 1972), було дослщжено вплив цього джерела вуглецю на актившсть РФ-кшази в безклтшних екстрактах парафшутшюуючих дрмцрюв. В результат проведених експериментш у парафшутншзуючих др1жцж1в Р. guilliermondii i С. maltosa виявлено явище зростання РФ-кшазно! актив но ст i в 1,3-1,5 рази при культивуванш клгшн на

парафшах, пор1внянно з píbhcm ферментативно! ¿kthbhoctí в титанах, як! виросли на цухрах.

Табл. 1. Активтсть РФ-кшази в безклггинних екстрактах деяких ВИД1В др1ждоав при внрощуванш на рЬних джерелах вуглецК».

Вид дрЬкюк1в Питома активность фермента (цЕ/мг)

Глюкоза Параф! ни Метанол

S". cerevísiae раса XII 17,0

Р. gulllicrmondii АТСС 9058 122.1 155,3

Р. guilliermondii ВКПМ Y-432 147.5

С. maltosa 774 176,3 231,4

С. maltosa 777 175.1 263,0

С. maltosa 899 252,2 324,6

С. boidinii Т2А 78,0 180,2

С. boidinii ВС Б 719 81,1 161,4

Р. pinus 1031 242,0 417,3

Р. pinus МН4 300,4 453,2

Н. polymorpha Ml3 64,8 320,0

Н. polymorpha ML8 116,4 371,6

Н. polymorpha ML9 104,0 528,2

Н. polymorpha ВКПМ Y-201 128,7 1200,0

Н, polymorpha 42а 231,9 285,0

Н. polymorpha 2g (ВКПМ Y-926) 192,3 3200,0

Н. polymorpha 5g 380,4 663,9

Н. polymorpha 7g 174,0 823,6

Н. polymorpha 11 g 240,6 476,9

Значно вища ¡ндукц1Я синтезу РФ-кшази виявлена у метилотрофних др1ждж!в при культивуванш на метансш як единому джерел! вуглецю (табл.1). Деяю автори вщмИали сутгеву (в 6-8 pa3iB) шдукшю сштезу FAD-синтетази i незначну 1ндукшю синтезу РФ-кшази при вирощуванш на метанол! дрЬвдт Kloeckera sp. [Shimizu et al., 1977) i C. boidinii [Eggeling et .al.,1977]. У дослщжених нами промислових штамт Н. ро!ушофЬа активность РФ-кшази може зростати у. 9 раз1В при упшзаци метанолу. Осюлькн, як в окисленн! парафш1в [Kemp et al., 1988], так i в окисленш метанолу [Fuyii et al., 1972; Patel et al., 1981J дрЬаджами приймають участь FAD-залежт алкогольоксидази, при утилпацц цнх джерел вуглецю зростае попгреба клгтн у FAD, яка забезпечуетъся збшьшенням ршня активност! фермент синтезу флавшових нухлеотшив.

Надпродуценти РФ-инази знайдено при дослщженш формальдепд-резистёнтних мутантов Н. ро!утофЬа з порушеною глюкозною катаболггною penpecieio синтезу ферменпв метаболизму

метанолу [Kashchenko et a!., 1992]. У одного з таких цгпишв (Н. polymorpha 2g) з конститугивним синтезом алкогольоксидази виявлено 17-кратне збшьшення р1вня РФ-юназно! акгивносп при культивуванж на метанол! у пор'шняншз клггинами, як! вирощеш на глюкоз1. За величиною питомо! активного РФ-юнази (бшьш н1ж 3 шЕ/мг) Н. polymorpha 2g сутгево перевищуе bcí bíaomí джерела ферменту. Штам задепоновано ВсеросШською колекщею промислових MÍKpoopraHÍ3MÍB як продуцент рибофлавшюнази Н. polymorpha Y-926.

3. Вишлення i очищения РФ-кшази з параф!н- i метанолугил1з)точих

дрЫдасЬ.

Дослщжували можливкгть використання простих i оперативних методш очистки ферментíb для отримання препарат РФ-кшази з парафш- i метанолуптзуючих дрЬкююв, яю були б ' здатш ефективно трансформуватн РФ у FMN. Особливу увагу було звернено на усунення з препарата РФ-кшази ферментов, яю приймають участь у перетворенш субстратов i продугав РФ-юназно! реакци - лужно! фосфатази i FAD-синтетази.

В робот» вперше розроблено проиедури очистки для ферменту з С. maltosa i Н. polymorpha. Показано, що РФ-юназа цих дрЬкдаав осаджуеться сульфатом амошю в межах насичення 0,4-0,8 чим нагадуе фермент i3 P. guilliermondii [Кащенко и др., 1976], В. ammo^-niagenes [Manstein et al., 1986] i печшки щура [McCormick, 1962).

Виявлено, що РФ-юназа з P. guilliermondii i Н. polymorpha може бути сконцентрована i очищена у 2-6 pasiB при осадженш етанолом або ацетоном в концентрацн 50-90%, на вщмшу в1д ферменту з пивних др1ждоюв, який осаджувався при концентрацц етансшу 18 - 35% [Kearney i Englard, 1951]. При фракшонуванш бшюв сульфатом амонно або оргашчними розчинниками разом 3Í значно! частиною баластних битв усувалося до 95% лужно! фосфатази. Крш цього вщбувалось концентрування РФ-кшази.

При гель-фшьтраци на сефадексах G-100, G-75 i акрилексл Р-60, завдяки невеликШ молекуляршй Maci (28 кДа) [Кащенко и др., 1976], РФ-юназа вшд1лясгься вщ значно! частини високомолекулярних бшюв.повшстю вщ фосфатаз, а також низькомолекулярних сполук.

Для одержання бшьш очищених препаратов РФ-юнази використовували юнообмжну хроматографа. Встановлено, що за спорщнешстю до юнообмшниюв ферменти ¡з Н. polymorpha i С. maltosa значно вщрпнютъся в'щ РФ-кшази з P. guilliermondii [Кащенко и др., 1976]. Остання míuho сорбувалася на КМ-сефадекед i не зв'язувалась з ДЕАЕ-сефадексом. РФ-юназа з Н.

polymorpha проявляла протилеж!п властивосп - вщсутшсть споршненост! до КМ-целюлози i добру сорбшю на ДЕАЕ-целюлоз1, чим нагадувала фермент з печшки шура [McCormick, 1962], В. ammoniagenes [Manstein et al., 1986J i соевих 6o6íb [Mitsuda et al., 1963J. Фермент з парафшутилЬуючих др1жджт С. maltosa проявляв cnopíaHeHícn» як до катюно-, так i до ашонообмшника.

Враховуючи властивосп i поведшку РФ-кшази з парафш- i метанолутшизуючих дрЬкююв при фракцюнуванш на р1зних сорбентах i хроматографчних носЫх, було розроблено 2-3-х етатн процедури видшення i очистки ферменту:

I. Др!ждж1 Р. guilliermondii руйнували бал1стичким методом. Безклггинж екстракти фракшонували сульфатом амонио. Осад, отрнманий при насиченн» солГ 0,4-0,9, розчиняли в 10 mM фосфатному буфер'!, pH 6,0 i використовували для гель-хроматографп на сефадека G-100 i наступноТ íohoo6míhhoí хроматограф» на КМ-целюлозь Шсля вилучення баластних бшю'в стартовим буфером РФ-кшазу вимивали з колонки за допомогою rpaaieHTHoro зб1пьшення (0-0,э М) концентрацц NáCl в 10 mM фосфатному буфер!, pH 8,0 (табл. 2).

Табл.2. Очншення РФ-кжази з дрюциив Р. guilliermondii . АТСС 9058.

Етап Процедура Offon мл Búiok, мг Активн!сть РФ-кшази Вих1д, % Очистка

пнтома, тЕ/мг загальна ' Б/ "

1 безклтшний

екстракт 100 I9S0 0,12 0,244 100

2 сульфат гшошю

0,4-0,9 26 790,4 0,22 0.175 71,7 1,8

3 ссфалекс G-100 % 24,2 2,3! 0,056 23,0 19,3

4 КМ-целюпоза 21 1,3 29.50 0.039 16,0 245,8

(Г. Модифжовану процедуру використовували для одержання препарат ферменту з Н. ро!утпогрЬа (табл.3). " цьому випадку безклгсинний ехстракт дрЬадзыв фракцюнували охолодженим етиловим спиртом. Фракцию биюв, отриману осадженням при 5090% концентрат» етанолу використовували для гель-хроматографи на сефадека' С-75 1' наступноТ шообмшноГ хроматограф!? на ДЕАЕ-целюлоз». Колонку промивали 10 тМ трю-НС! буфером, рН 8 для вилучення баластних б1люв I РФ-кшазу вимивали за допомогою град1ентного зростання (0-0,3 М) концентрат! №С1.

Табл.З. Очищения ВКПМ Y-201.

РФ-юнази з дрицдав Н. polymoipha

Етап

Процедура

Об'ем, Б1лок,

мл мг

Активность РФ-кшази

питома, шЕ/мг

запшьна Б

Вих!д, %

Очистка

безклггинний екстракт етанол 50-90% сефадекс G-75 ДЕАЕ-целюлоза

142 20 60

2357,0 707,2 168,0

0,30 0,71 1,62

0,712 0,498 0,272

30 26,7 3,91 0,104

100

70 2,4

38 5,4

14,6 13,0

111. Спрощену процедуру очистки використовували для одержання препарате ферменту з С. maltosa. Безклггинний екстракт С. maltosa одержували екстракцкю ацетонових пороишв кл^тин (40 мг/мл) протягом 40 хв при 0°С. До екстракту додавали сульфат амошю до насичення 0,9. Осад збирали, розчиняли в 10 шМ фосфатному буфер!, рН 7,0 i вносили в колонку Í3 молселектом G-75. Шсля гельхроматографц вщбирали фракци з питомою актившстю не менше.нЬк 1,7 шЕ/мг.

В результат розроблених процедур очищения ферменту отримано препарата РФ-юнази з парафш- i метанолутшизуючих дрЬкдаюв, як! володцоть високою питомою активною (1,6-30 mE/мг) i здатш ефективно трансформувати РФ у FMN. За величиною питомо1 активносто отримаш препарати ферменту з Р. guilliermondli, С. maltosa i Н. polymorpha значно перевищують очищен1 препарати РФ-юнази з шших мисрооргашзмш IKatagiri et al., 1959; Manstein et al., 1986; Snoswell 1957]. 3a bmíctom ферменту найбшьш очищеш' препарати в 1,5 раза перевищували гомогенн! препарати з B.ammoniagenes , яю були отримаш за допомогою

афШНО! ХрОМаТОГрафН IManstein et al., 19861.

4.1ммобшзащя дрЬкджово! РФ-к1нази на рвних нос1ях.

При застосуванш бюлопчних катал]заторш для ферментативно! трансформаци оргажчних сполук найбшьш перспективними е процеси, як! здШснюють ÍMM06úii30BaHÍ ферменти. Ымобиизащю др1жджово1 РФ-юнази проводили за такими методами, як включения в структуру гелю i ковалентне приеднання до носив, я va широко використовуктгься для .отримання бюлопчних каталтторт в промиедовосгп i наукових

I

дослшженнях [Chibata, l978;Miyawaki et al., 1982; Уонг и др., 1983; Siegers et al., I986J.

При ÍMMo6Lni3aui¡ РФ-кшази включениям в структуру ПААГ використовували препарати ферменту з Н. polymorphe з питомою актившстю 1,6 гпЕ/мг бшка. Найбшьш високий вихщ ферментативно! активносп при »ммобипзацй сягав 18% i спостерггався при пол1меризацн ПААГ з концентрашею мономера в cyMÍmi 20% та вщносною концентрац1ею зшиваючого агента 4%. Питома актившсть одержаних 1ммобйнзованих препарата» ферменту складала 0,34 шЕ/мл гелю. При цьому 32% актипкосп РФ-кшази втрачалось при подр1бненш гелю i виявлялося в буферному розчшн теля промивки одержакого ¡ммобЫзованого препарату ферменту. Близько 50% ферменту Ыактивупалося у npoueci «ммобЬгнзаци, що, як виявнлось, пов'язано з денатуруючою д1ею деяких компонент пол1мер1зацШно'»' cyMiiui.

НайбЬчьш перспективж результата отримано при ковалентному приеднанш ферменту з Р. guilliermomíii, С. maltosa i Н. polymorpha до лохшних агарози, акрилексу i силохрому (табл.4). Активность РФ-кшази в таких препаратах сягала 0,023 Е/г носы, ефективжеть процесу ¡ммобишацн складала 71,6%, що в 2,4 рази вище, нме для ¡ммобшзованого на ©-амшоалюл-агарозг високоочшценого ферменту з печшки тура [Merrill et al., 1979]. При робот! з такими розповсюдженими в промислових бютехнолопчних процесах неоргашчними носгями як модифкованг силохроми виршгальним фактором для одержання оптимальних результат при ¡ммобинзацп РФ-кшази виявився enoeiö проведения uici процедури. За рахунок ¡нтенсифжацн процесу активацп носпв i процесу зв'язування ферменту (циюпчним прокачусанням розчину РФ-к1нази через шар носы) вдалось досягнут 37% виходу активного ферменту при ¡ммобшзацц ira амшопротлсилохромК

Висока ефективжеть процесу ковалентно! ¡ммобишаца др1жджово1 РФ-кшази дае можливють одержати нерозчинш препарати, здатш за короткочасну шкубащю трансформувати весь наявний в реакишшй сумшп РФ у FMN.

5. Дослщження властивостей ¡ммоб1л!зоваио1 РФ-кшази.

На наступному етат проводили пор1вняльне вивчення властивостей розчинноТ та ¡ммобйшованиоТ на р1зних ноешх РФ-кшази (табл.5).

При 1ммобш1зацц фермента з метилотрофних дргжвдав Н. polymorpha в ПААГ практично не змшюються ochobhí кшетичш властивос-п ферменту, що, цшком можливо, пов'язане 3¡ збереженням молекулою б1лка свое! нативно! конформаци при

Табл.4.1ммоб№зацш дргжджово! РФ-кшази ковалентиим прнеднанням до носив.

Актившсть 1ммобш1- Вихш актив- .

Джерело НосШ ФунхШональна .Метод эованоГ РФ-кшази ного ферменту

ферменту • група зв'язування при шмобш-зацй, %

• тЕ/мг бика ШЕ/Г НОС1Я

Р. ешШег- сефароза 4В Нароксилыш ВКЖ 0,130 3,18 47,3

топ<Ш сефароза 4В «- - « - 3.210 22,50 10,6

сефароза 4В «- - « . 1,650 11,36 71,6

агароза «- - « - 1,392 9,70 . «1.0

амШогекснл- первинна глутаровий 0,528

апрош аи!но вльлеНд 0,30 18^

акрилекс П-200 ам!дна . « . 0,220 15,64 29,5

акрилекс Р-150 ам1ана -« - 0,156 7,50 14,0

акрилекс А-100 первинна дицнклогскснл-

ам!но карбоднмш 2,500 0,45 6,8

акрилекс С-100 карбоксильна - << - 2,500 1,35 20,5

акрилекс АНСл карбоксильна - « - 2,080 1,50 22,7

акрилекс АН-100 пдразид кислот ЫаИОг 1,250 0,08 2,1

амшопрол!л- первинна глугаровий

силохром ам!но альдег1я 0,025 0,15 4,5

амшопропи-

• . сглохром - « - - «- 0,427 0,90 17^

амшопропи-

силохром - « - - «- 0,349 3,55 36,6

епоксисплохром епоксндна 0,062 0,18 13,0

С. таИсва ам'шопропш- первинна глутаровий

силохром амшо алъдепд 0,083 3,19 14,9

Н. ро1утог-

рЬа сефароза 4В пдроксильиа ВгСЫ 0,252 3,90 36,7

Табл.5. Властивосп розчикко! та 1ммобШзовано1 дрЬкджово! РФ-мнази

Препарата ферменту (джерело/носй) Оптимуми ДЦ Енерпя активаци, юсал/моль Кш, цМ Стабильность

збер1тання при 0°С про1гр1вання при 80°С

темпера-турний РН РФ АТР

К^, год-1 Ц/2, доби Кш, хв-1

Н. ро1угаогрЬа нативний фермент 38 8,75 9,16. 20 90 2,39 х 10-2 1,2

Н. ро1утогрЬа включения в ПААГ 40 9,00 .9,58 20 90 6,10 х 10-3 1,67 х 10-3 5,4 17,4

Р. рнШегтошШ нативний фермент 45 9,15 14,8 12 6,7 1,64 х 10-2 2,0 4,1 х 10-1 0,23 х 10-2

Р. ¿иШегакнкШ^ сефароза 45 8,75 9,9 83 270 7,9 х Ю-4 56,0 2,5 х 10-1 1,0 х 10-1

Р. ги!Щеппоп(}и акрилеккс П-200 45 9,6 7,8 37 30 0,24x10-2 12,0 4,8 х 10-1 2,2 х 10-1

Р. виШегтошШ амшопропшовиЙ силохром 35-45 7.1 8.2 11,0 20 27 1,64 х 10-3 9,50x10-4 17,5 3,3x10-1 1,8 х 10-1

? ё.

1 I

oooooonnoooo

---^ Л1 Л1 ~ Л* s-я ~ X

W W U Ы «J

nonzsnnnnnnn

iJ VI Oí o uuu uuu

X

u> tj.

?

C9 j I • ■ • • • • « -3

« 2 5 AAAAAAAA = 5- £ а AAAAAAAAS s sí ' ' • « • > < >3

A A * A A 2 i i a X

в ,

S> ■

* s в ® J»

A A A A A A A A A A

» ; S

A ЛЯ A Л«

■e-ë-ô-

ov «4»

? ? ? с ' f-f-p-"

• M •

u» oo Ы u*

о

%

■a -o >

Ifii

с 5. о S =: = 3 =

1" !

=

' S

7. ÇJ

il Ц

is

î? s

а

s »

3

що 1ммобцпзована РФ-кшаза за субстратною специф1чшстю не вшрпняеться вщ розчинного ферменту i здатна перетворювати у BianoBiaHi noxiairi FMN аналоги РФ з заменами метильних груп у 7 i 8 положениях 1зоалоксазину. При цьому спорщнешсть ¡ммобинзованого ферменту до аналопв може змшюватися залежно вщ природи замюника в 7 i 8 положениях. Таким чином, др1жджова РФ-кшаза при ковалентшй ¡ммобиизацн збери'ае свою субстратну специф^чшсть, що свшчить про вШсутш'сть сутгевих конформашйшгх змш в активному центр1 ферменту.

Bei отримаш ¡ммобшзоваш препарати РФ-кшази иабували бшьш01 стшкост! до дн високих температур i значно! стобшьност! (табл.5). Найбшьш сутгево (в 17-21 раз) фермент стабишувався при ¡ммобшзацн на сефароз1 i силохромьЧерез 90 д!б збер1гання на холод! ¡ммобипзований фермент проявляв 20% вихшио}' активности що е важливою передумовою для використания його у довготривалих процесах ферментативно! трансформаци РФ у FMN.

6. Дослщжения процсст ферментапганого синтезу FMN

Розробляли методи ферментативно'1 трансформаци РФ у FMN в реакторах перюдичного i безперервного типу дц з розчинною i ¡ммобшзованою РФ-кшазою.

Для оптим!заци умов трансформаци РФ у FMN в реакторах перюдично'1 да дослщжували концентрацй' ioniB Zi Mg2+j ЯК1 мають найбтьший активуючий ефект на процес трансформаци РФ у FMN. Активуючий вплив цих ioHia на фермент визначали при концентрацй РФ i ATP в реакшйшй cyMimi 0,1 шМ i концентрациях активатор1в 3 рМ - 1 гпМ. Як видно з наведених даних (рис. 4), як для розчинноТ.так i для ¡ммобиизовано! РФ-кшази максимальний вих1ц FMN спостер1гаеться при концентрацй' юшв-активаторт екв1М0лярнш концентрацй нуклеотидного субстрату - AT Р. Бшьш висок1 концентрацй активаторш знижували швидюсть фосфорилювання РФ. Визначена спорщнешсть ферменту до цих ioHiB (нативний: Zn2+ - 13 рМ, Mg2+ - 12 цМ; шмобшзований: Zn2+ - 1,9 рМ, Mg2+ - 3,2 рМ).

Пдабрано параметри (швидюсть протаання реакцШно! cyMimi через реактор, концентращю субстрат1в, активаторов i ферменту) за яких досягаеться повна трансформаци! субстрату, або 100% вихщ цшьового продукту. Для ферменту ¡ммобшзованого на сефароз! при швидкост1 протоку 2 мл/год/г ¡ммобишованого препарату, активносТ1 3,2 niE/г, концентрацй AT Р х Mg 0,2 rnM i РФ 0,2 шМ повна трансформащя субстрату вщбувалась за 61 хв.

При crynim конверси субстрату (0,7) i швидкост! протоку (4,5 мл/год/г) час безвщмовно! роботи реактора безперервного

типу ди з 1ммобш1зованим на сефароз! ферментом складав 10 д!б

при продуктивное^ процесу синтезу РКШ 2,4 ммоль/г бшка за добу.

0-8 т А

6т в

/

~Ят-

1х10~6 1х10~5 1х10"4 1х10~3 1х10_6 1хЮ"5 1х10~4 ХхЮ"3 1они активаторт, М

Рис. 4. Залеиипсть швидкост! синтезу ЯМЫ розчинною (А) 1 ¡ммобЫзовлною (В) РФ-юназою в 1а концентрат! 1он1в ¿п2+(0) 1 М82+(»).

Час, доби

Рис.5. Синтез у реактор! безперервио! • ли з РФ-кшазою,

¡ммобиизованою на сефароз» (1), акрилекс! П-200 (2) > амшопроп1лснлохром! (3). •

Як встановлено в попередшх дослшженнях розчинна > ¡ммобЬшзована дрхжджова РФ-юназа кр1м високо{ специф1чност1 дн (фосфорилювання РФ тшьки по 5'-пдроксильнш груш) проявляв певну толерантность до замюниюв у положениях 7 1 8 гшрофобноТ частини ¡зоалоксазинового кшьця РФ . Ця властивкть ферменту

вщкривае можлив1сть ферментативного синтезу аналопв FMN. В реактор! перюдично! ди з розчинною РФ-кшазою проведено ферментативну трансформацию ряду аналопв РФ (табл.7).

Табл.7. Bmïct аналопв FMN (в м!кромолях) в peaicropi перюдично» дн' з РФ-кшазою ¡з дрЬкдЖ1В P. guilliermondiï

N5 Положения злмшшка Час теля початку ¡нкубаци, хв.

7 8 30 60 90 120 150 210

1 СНз CF3 11,8 19.9 20,0 20,0 20,0 20,0

2 CF3 СН3 5,6 10,6 15,0 18,4 20,0 20,0

3 CF3 CF3 4,6 8,6 12,0 15,5 17,6 20,0

4 Cl CF3 8,8 15,6 20,0 20,0 20,0 20,0

5 CF3 Cl 7,0 12,8 17,4 19.6 20,0 20,0

6 CI СНз '0,2 17,8 20.0 20,0 20,0 20,0

7 CF3 H 5,0 10,0 14,2 18,2 20,0 20,0

8 СНз NH2 11.4 18,8 20,0 20,0 20,0 20,0

9 СНз N(CH3)2 5.4 10,4 15,6 18,2 20,0 20,0

Особливо чист! фосфорильоваш по 5'-положенню аналоги FMN можуть використовуватися для наукових дослщжень.у першу чергу, при вивченш тонких мехашзм1в катал ¡зу, який здшснюють флавопроте'ши [Merrill et al., 1981; Ghisla et al.,1986] i при лжуванш деякнх захворювань [Trachewsky et al., 1982; Becker et al., 1990; Bhaskar et al., 1990].

Основною характеристикою 1ммобшзованих фермент при використант ïx в процесах ензиматично! трансформацц е операщйна стабшьшсть.Цей параметр визначали в реакторах безперервного типу ди протягом 90 д1б (рис.5). ГНвперюд збереження активносп отриманих ¡ммобипзованих препаратт досягав 27 Д1б (kjn=2,3 х 10" 3 i 5,3 х 10-4 год-1), що за величиною cniBpo3MipHo з операшйною стабтьшстю таких ¡ммобшзованнх ферментзв, як ß-галактозидаза та глюкозо1зомераза, як! використовуються в промисловосл [Wang et al., 1983].

KpiM того, виявлено захисний вплив субстрат i активатор1в на стабмьшсть розчинкого i ¡ммобийзованого ферменту. Процес ¡нактивацп розчинного ферменту в присутносп субстрапв при 37°С вщбувався двоспшйно з константами 6,5 х 10*2 i 1,3 х 10"2 год-1. 1нактивашя в цих же умовах без субстрат характеризувалась значно вищою швидкклто <kjn= 1,7 х 10~ 1 год-1), в ю,5 раз бшьшою, жж при 36epiraHHi на холода У npoueci безперервного синтезу FMN при 37°С ¡ммобшзована РФ-кшаза проявляла у 31 раз бшьшу стабшьжсть (кщ=2,3 х 10-3 j 5,3x10-4 год"'), н1ж розчинний фермент при 36epiraHHi на холодь

Проведено анали чистоти отриманих npenapattB FMN за допомогою методу високоефективно! рщинно! хроматографа (ВЕРХ) (рис.6). Як видно, в препарат наявний винятково РФ-5'-фосфат, на вщмшу в!д комершйних препарат1в провщних закордонних ф!рм [Nielsen et al., 1983], де в основному nixy F MiCTiwoc» бшя 70% РФ-5'-фосфату. Компонента D i Е були ¡дентифкован! як РФ-З'-фосфат i РФ-4'-фосфат. Компонента А-С виявилися дифосфатами' РФ, а компонент G - Рф, rmíct якого складае вщ 4,5% (препарата FMN Sigma Grade И, Boeh-ringer 15405) до 9,6% (препарата Serva 34360).

А

100 Ё370 90

80 _ . 70 _ СО _

so..

40 _ 30 _

20 ^

10 _ 0 „

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

Рис.6. ВЕРХ' анал!з препаратов FMN, одержаннх в результат! ферментативно! трансформацП РФ (А). В - ВЕРХ анал!з комерцйших npenapaiin FMN [Nielsen et al., 1983).

I i ] i i F Col itfii В 1! ir- 1 h ' «o го >o o i.mu «I iC. 1. Hí'l.C chrunutc^rom oí commcfcial FMN umn. Nudivwl 10 C„. 25Q x 4 jmn.clujnt. It>> m uiiaum ftwnule. pH J.7. in 17* methanol. i

From Nielsen P.et al.,Anal. Biochem.,130,353-368,198 3,.

- 21 -висношш

1. Розроблено iiodí оперативно та високочутлиш методи визначения активное^ РФ-кшази: прямин флуорометроочний метод на ochobí усунення иепрореагонаного РФ клтшами ооотаму Р. gutllisrmondü ВКПМ Y-432 та бюлоомшесцентооош метод па ochobí сунрнження РФ-кшазноо реакцп з FMN-редуктазною/люциферазиою системою ckíthhx бактерШ.

2. Проведено пошук джерел РФ-кшази серед m¡KpoopraiiÍ3MÍB. Встаношоено, шо перспективною сирошшою для вндьлеошя цъого ферменту с 6ioMaca парафш- та метанолутил1эуючих лр1ждаав Р. guillierniondü, С. maltosa i Н. polymorphu, серел яких винайдено суперпродуцент <1>ерменту Н. poiymotpha ВКПМ Y-926. У парафш i метонолутилозуючих дрожджш виявлено явите шдукии РФ-кшази вуглеиепйми субстратами: парафшами або метанолом.

3. Розроблено npocTÍ та технологии» лосгупш процедури вид'шення та очшиеинн РФ-кшази иа основ» фракц'юнувашт бишв сульфатом амоиш, ороаопчиими розчшшиками (спиртом, ацетоном), гель-ф'ольтранм та ¡oiioo6mímho] хроматографа, за допомогою якнх отримано високоактивш препарата ферменту придатоп для трансформацп РФ у FMN.

4. Дослоджено можлитсгь оммобЫзащо отриманих препаратов РФкшази ргзними методами: включениям в структуру ПААГ, ковалентним приеднанням до hocííb opranÍ4HoT (noxiani агарози та ПААГ) i oieopraniMiioí' (молифковаш силохроми) природи i вперше одержано ¡ммобшкюван! препарата РФ-кшази з M¡Kpooprati¡3míb. Найбьтьш активоп препарата (до 0,023 Е/г нос!я) отримано при ¡ммоболшцн ковалентним приеднанням до CNBr-aKTHBOBaHOÍ сефарози та гранульованого ПААГ.

5. Досл'оджено шоастивостт розчинних та ¡ммобипзованнх препаратов РФ-кшази. Показано, шо там каталотичж характеристики, як температурошй ¡ рН оптнмуми дГ|, субстратна сиецифшоость практично не змшюються при ¡ммоболшци; енергоя активаци реакцн фосфорилюваооня РФ, спорщнешсть до субстратов i íohíb активаторов можуть дещо змшюватися в залежносто вод джерела ферменту i способу оммобшзаци. Нерозчинш препарата ферменту проявляли в 10-21 раз бшьшу стаболыисть, нЬк розчинооо.

6. Розроблено процеси синтезу FMN та аналопв цього кофермеопу на осново використання розчинноо та ¡ммобшзованоо РФ-юнази. Проведено опттшашю умов ферментативное трансформацй РФ у реакторах перюдичного та безперервного типу дн i встаиовлено, що оперативна стабольность шмоболозованого

ферменту у довготривалому nponeei синтезу FMN сягае 27 д16. Показано можлншеть використаннн ¡ммобЬшовано!' дрЬкджово! РФ-кшазн для отримання npenapatíb FMN внеокого ступеню чисто™,

СПИСОК РОБ1Т, ОПУШИКОВЛНИХ ПО TEMI ДИСЕРТЛЦЙ

1. Кащенко Ü.E., Преображенская Е.Н., Шавловский Г.М. Получение флапннопых кофермектов путем эизиматической трансформации рибофлагшна//Б|Юхпмпя, фармакология и медицинское применение производных витаминов и других предшественников коферментов. Тезисы докл. симпозиума.-Иркутск, 1983.-е.58-59.

2. Кащенко В.Е., Преображенская E.H. Получение, свойства и применение иммобилизованной рибофлавинкиназы its дрожжей//Тезисы ст, сообщ. V Всесоюзн. биохим. еъезда.-М.:Наука,1986.-т.'2.-сЛ53.

3. Шавловский Г.М., Кащенко В.Е., Струговшнковав Л.П., Преображенская E.H. Свойства рнбофлашшкиназы и закономерности ее биосинтеза у различных видов лрожжси//Биосинтез ферментов микроорганизмами. Тезисы докл.

III Всесоюзн. конф.-Пущино, l9S6.-c.49.

4. Преображеиська О.М., Kautel iko В.6. 1ммобшзашя лр!жджово{ . рнбофлашнмназн на гелях пгарози i доелиженни властивостей

¡ммобшзованого фермента// V Укр. 6¡oxím. з'Узд.Тези докл.-Кшв, 19S7.-4.2.-c.I70.

5. Кащенко В.Е., Преображенская E.H., Федорович Д.В., Погорилко Л.Р., Шавловскнй Г.М. Очистка, свойства, иммобилизация и применение ферментов, синтезируют шнх флапиновые нуклеот1шы//Биосинтез ферментов микроорганизмами. Тезисы докл.

IV Всесоюзн. конф.-Ташкеит, 1983.- с.83-84.

6. Кащенко В.Е., Преображенская E.H., Шавловский Г.М. Получение и свойства иммобилизованной рибофлавинкиназы из'дрожжей Pichia gu¡Hiermondii//yKp. биохим. журн.-1989.-т.61, N 1.-е, 32-36.

7. Кащенко В.Е., Погорилко Л.Р., Преображенская E.H. Получение и свойства дрожжевой рибофлавинкиназы, иммобилизованной на гелях полиакрилам1ша//УЦ съезд Укр. микробиол. об-ва. Тезисы докл.- Киев-Черновцы, 19S9.-4.L-c.6I.

8. Кащенко В.Е., Преображенская E.H., Шавловский Г.М. Способ получения флавинмопонуклеотнла п его аналогов. Авторское свидетельство СССР N 1531494. I9S9.

9. Кащенко В.Е., Погорилко Л.Р., Преображенская E.H. Обнаружение и свойства термостабильной рнбофлашшкшшы - нового фермента синтеза флавинмононуклеотида у дрожжей//Проблемы микробного синтеза витаминов и их производных. Тезисы докл. Всесоюзн. конф.-Ташкент, 1990.-С.60-61.

10. Кащенко В.Е., Преображенская E.H., Погорилко Л.Р. Получение очищенных и иммобилизованных препаратов рибофлавшшшазы и их использование в процессе ферментативного • синтеза

флавинмононуклеогида//Методы получения, анализа и применения ферментов. Тезисы докл. Всесоюзн. конф.-Ригп, 1990.-е.57-58.

11. Кащенко В.Е., Преображенская Е.Н., Сибнрный А.А. Разработка нового биолюминесцентного метода определения концентраций АТФ//Бно-тсрмо-хемнл1омниесценция. Методические указания Всесоюзн. щколы-семинара.-М.-Суздаль, 1990.-ч.2.-с.63-65.

12. Кащенко В.Е., Преображенская Е.Н. Биолюминесцентный метод определения активности рибофлавинкипазы//Био-термо-хемилюмнпешенцпя. Методические указания Всесоюзн. школы-семиппра.-М.- Суздаль,. 1У90.-Ч.2.-с,65-67.

13. Kashchenko V.E., Preobrazhenskaya E.N., Fayura L.R., Brj'k R.M., Sibirny А.А. Enzymatic preparation of flavin mononucleotide using yeast riboflavin kinase//Proc. 15-th Internat. Specialized Symp, on Yeast.-Riga, 199J.-p.61.

14. Kashchenko V.E., Preobrazhenskaya E.N., Fayura L.R., Bryk R.M., Sibirny A.A. Preparation of flavin mononucleotide by riboflavin enzymatic phosphorylation//Enzyme engineering. Proc. 7-th All-Union Symp.-Moscow, 1991.-p.37.

15. Kas/hchenko V.E., Preobrazhenskaya E.N. New bioluminescence assay for ATP detennination//Enzyme engineering. Proc. 7-th Ail-Union Symp.-Moscow, 1991.-p. 127.

16. Кащенко U.E., Преображенская E.H., Сибирный А.А. Способ определения активности рибофлпвинкинлзы. Авторское свидетельство СССР N 1631089, 1990//Бюл. изобретений.-1991.- N 8.

17. Кащенко В.Е., Преображенская Е.Н., Боренкпй Ю.Р. Новые методы определения содержания витамина В2 в пищевых и кормовых продуктах//Достнжеш1я биотехнологии агропромышленному комплексу. Тезисы докл. Всесоюзн. конф.-Черновцы, 1991.-т.2,-с.153-154.

Кащенко В.Е., Преибраженскан Е.Н., Погорилко Л.Р. Иммобилизация дрожжевой рибофлапинккназы включением в полиакрштмплный гель//Приклад. биохнм. и микробиол.-1991.-t.27.N 5.-C.711-719.

19. Кащенко В.., Преображенська О.М., Cn6iproift А.А. Селения мутант метилогрофних Л1мжджлв Hansenula ро1утоф!1а продуцентов риПо(|)лав!НК11ппп//У1 ЗЪд Укр. товариства генетик!в i селекщонер1в. Тези долов.-Кшв, 1992.-T.1.-C.115.

20. Kashchenko V.E., Preobrazhenskaya E.N., Kshemmska G.P., Sibirny А.А. The mutants of methylotrophic yeast as the producers of riboflavin kinase and FMN-adenylyltransferase//Yeast.-l992.-v.S.-S.614, 14-52 B.

21. Kashchenko V.E., Preobrazhenskaya E.N., Sibirny A.A. Selection of the methylotrophic yeast mutants: Novel producers of flavin nucleotides synthesizing enzymes//Proc. CI-Seventh Internat. Symp.-Warwick, 1992.-p.99.

2?.. Ka.shchenko V.E., Prcobrazhenskaya E.N., Fayura L.R., Bryk R.M.,Sibirny Л.Л, Preparation of ilavmmonoiuicleotida in batch and continuous flow enzyme reactors with soluble and immobilized riboflavin kmase//6-th European Cong, on Biotechnology. Abstact books.-Firenzc, 1993,-v.ll.-p.TU223.

ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ РИБОФЛАВИНКИНАЗЫ ИЗ ДРОЖЖЕЙ

РЕЗЮМЕ

Исследована возможность применении иммобилизованной рибофлавинкиназы (АТР:рибофлавин-5'-фосфотрансферазы) для получения препаратов FMN, не содержащих изомерных примесей с неопределенной биологичнекон активностью. Разработаны два новых высокочувствительных метода определения активности рибофлавинкиназы. Проведен поиск источников фермента среди ряда штаммов микроорганизмов, в том числе используемых в промышленности. Показано, что наиболее перспективным источником для выделения рнбофлавинкипазы является биомасса парафин- и метанолутнлнзируюшнх дрожжи Pichia guilliermondii. Candida maltosa и Hanscnula polymorpha. У этих дрожжей обнаружена индукция синтеза рибофлавинкиназы при выращивании на парафинах или метаноле. Среди мутантов Н. polymorpha с нарушенной глюкознон катаболитной репрессией синтеза ферментов метаболизма метанола найден сверхпродуцент рибофлавинкиназы И. polymorpha ВКПМ Y-926. Разработаны простые и эффективные процедуры очистки дрожжевой pn6o<¡yiumiHKHiuuu, позволяющие получать высокоактивные препараты. Получены иммобилизованные препараты фермента включением в структуру полиакриламидного геля и ко валентным присоединении к носителям органической (производные агарозы, полнакрндамида) и неорганической (модифицированные силохромы). природы. Детально исследованы их свойства и доказано, что при иммобилизации фермент сохраняет основные каталитические характеристики и значительно стабилизируется. Разработаны процессы синтеза FMN и его аналогов в реакторах периодического и непрерывного типа действия с использованием растворимой и иммобилизованной рибофлавинкиназы.