Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение закономерностей роста свободных и иммобилизованных клеток дрожжей и молочнокислых бактерий на молочной сыворотке

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение закономерностей роста свободных и иммобилизованных клеток дрожжей и молочнокислых бактерий на молочной сыворотке"

1ШЩ0НЛЛЫ1АЛ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ИНСТИТУТ ШОЧЗВИОЛОГЙЙ И ВИРУСОЛОГИИ

На правах рукописи П;7Г7П;ШъЛг.Ь Кл'^БЬЧС КАМЛЛИЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ РОСТА СВОБОДНЫХ И ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ И МОЛОЧНОКИСЛЫХ

БАКТЕРИЙ НА МОЛОЧНОЙ СЫВОРОТКЕ

03.00.07. - микробиология АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологичесютс яяук

Алнатм, 1395

Работа выполнена в Казахском Государственном Национальном Университете им. Аль-Фараби на кафедре микробиологии

Научные руководители: член-корреспондент НАН РК,

доктор биологических наук, профессор М.Х.ШИГАЕВЛ

кандидат биологических наук, доцент А.А.ЮГБАНОВА

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук, профессор САУЕЕНОВА М.Г.

Кандидат биологических наук, доцент СШЯВСКШ Ю.А.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: КазНИИ пищевой промышленности Казахской сельскохозяйственной Академии

Защита диссертации состоится 22 декабря 1995 года в 14 часов на заседании специализированного совета Д 53.24.01, по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Институте микробиологии и вирусологии HAH PK по адресу: 480100, Алматы, ул. Богенбай-батыра, 103.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотека Института микробиологии и вирусологии HAH PK.

Автореферат разослан * ноября 1995г.

Ученый секретарь специализированного совета, * / • /

доктор биология, tau наук /у'х, Н.А.АЯтхожина

/

3

ВВЕДЕНИЕ

/.кгугщ юоть таы>/. Проблема рационального использования миличиоп сыворотки, образующейся при 'переработке цельного и оовпкирешгого молока на сир, творог, казеин и различные молочко-белковые концентраты привлекает большое внимая») и-гапд-жлтел'.'й (Гилллз и др., 1978; Коиоиович я др., 1982; K-wui'-Tifi и др., шз.с>; Гимячскйя и др., 1982; Шаь-Л'йн и др., 1978; Шилвр, 1980). Известно, что молочная снпороткв содержит г.п сгошоинн мплгагв » ™""tz7z~z1z. w. ».wm-ioùimi

- /Vmivaa (.в сраднем 4,GS) и потому шкот слугшть полноценным субстратом для роста микроорганизмов, продуцирующих различные химические соединения. Известии способы использования молочной сыворотки для производство этанола, ферментированных напитков и др. (A.C. 59979Q СССР; A.C. II8I555 СССР; Скородумова, I9S9; Moulin, Galzy, 1981; Sohaefer et al., 1985). Рентабельность этих производств связана с низкой стоимостью молочной слтхгрстки к с тем, что лпрря;,->вцься пооочгаге пухуукти, тоюто как сывороточные болкя и nofiFrt-ouupToBä» братаа, после высушивания могут быть псиизчашкни ир кор'д сельекохоаяйстовнимм юлотгшм (ßibbonn, i;t-:i-ti)v, ! se?; Картель» Груяюнко, ÏS89; Сенкевкч, Рздель, 1989; Хромцов, 31.;90),

В иослодиив год»» внимание исследователей привлекает ншсЛояизовашше клетки микроорганизмов, нрокмуцэстгт которых и^дашнстрированы в работах ряда авторов (Еачуряна, 19ЭЭ; Бькер и др., 1У87; Ее резин, 1987). Сйга сводятся к возможности многоирятчто яспплт.п-яашм ШМООШГДЗОПвШШХ клеток в уконъшеиип в связи о а тал затрат па вираапвште !.üixpoQpraH>i3MGB, а тага® к стшганкв затрат на виде ленив конечного продукта. Иммобилизация, независимо от используемого метода небезразлична для клеток микроорганизмов, потому что оггз приводит к изменении состава микро- и макроокруявния клеток, модификации клеточного метаболизма, а т.д. В литература имеются лишь единичные сведопйя о фпзислегки роста иммобилизованных клеток лактозосбрэгивэтих дрожжей.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение закономерностей роста • свободных и иммобилизованных клеток дрожжей Torulopoiu kefyr таг. kumie

T-I7 И молочнокислых бактерий Laotooooous laotie 40 и Lactobacillus delbrueokii eubap. bulgarious штамм 221 на молочной сыворотке.

В связи с этим были поставлены следующие задачи :

I. Изучение роста свободных и иммобилизованных клеток дроюкей и молочнокислых бактерий на молочной сыворотке в монокультуре.

2.. Изучение роста смешанной культуры свободных и иммобилизованных клеток дрожжей и молочнокислых бактерий на молочной сыворотке.

3. Повышение физиологической активности клеток дрожжей и молочнокислых бактерий при помощи нового химического ооединения - СЭС.

Выносимые на защиту положения i

1. Клетки лактозосбракивающих дрожжей Torulopeie kefyr var. kumie T-I7 могут быть использованы для получения этанола на основе молочной сыворотки.

2. Иммобилизация положительно влияет не показатели роста свободных и иммобилизованных клеток дрожжей Torulopeie kefyr var. kumiB T-I7 И молочнокислых бактерий Laotooooous laotie 40 И Lactobacillus delbrueokii subsp. bulgarious штамм 221 при выращивании их на молочной сыворотке.

3. Для стимуляции метаболической активности иммобилизованных клеток дрожжей Torulopsis kefyr var. kumie T-I7 можно использовать препарат СЭС, активирующий рост и метаболическую активность свободных клеток.

Научная новизна. Впервые показано, что клетки лактоз'осбрахивакадих дрокжей Torulopeie kefyr var. kumie T-I7 при ферментации молочной сыворотки образуют этанол в концентрациях, сопоставимых с таковой для ранее использованных культур Kluyverorayoee fraqilie, Candida pseudotropioalis и Zymomonaa mobilie.

Впервые показано положительное влияние стимулятора СЭС на метаболическую активность иммобилизованных клеток дрожжей Torulopeie kefyr var. kumie T-I7.

Практическое значение. Результаты работы могут быть рекомендованы для использования в биотехнологии, микробиологической и молочной промышлвшгости для ' получения спирта, напитков и белка ферментацией молочной сыворотки.

Аярояяння работы: Материал! диссертации долоконн нм

(1ЦОПОГТГ?"П{.ч1 МЧКЬУЗГ-ГСКОЯ K'ni''"!Jr.!:Hi1i" «'«¡ОДНУ У'ЮПНХ Г;

!П,.;И ¡-.у. дл.п атг>, í'.-yi; ин б Конференций биохимиков p^víijújúiK сролнйй Атгя и Кагяхстаип. Ташкент, 1991; нп Иотеояяией конкуренции яШот8Х11"логип к биофизика микробнкт иилуляцвП". Алма-Ата, 1991: т биологической мозхвузовсноС H"tT^Tw>i«ani »тда* у^лт* к студ»»«тов КозГУ. Алптн, 1993; аа •>'. м?«ру:.'Г-пгтоа КйНфорОНЩШ МОЛОДЫХ уЧвННХ II утудонтов КазГУ. Алматы, 1994; ля .„mom.——;-

GO-лптмш .„л. for,l.

, ^ ^ цст.о;.! рнбопг ^ Диссертация состоит из

введения, обаора литературы, раздела шшзчандвго описание объектов к методов исследования, 4 разделов, содоржащих описание экспвришнтальннх работ, заключения, выводов, списка цитированной литература, включающего 176 наименований, из которых 58 - на иностранных языках и приложения. Работа изложена на ПО страницах машинописного текста, иллиогрнропяпа б таблицами и 15 рисунками.

ОВЬЕКТЫ ¡f ttSTOJ?! КСХЖЯООШП

3 ххиюч'ч иопольг-онгшюь cj'ií.'ü'kxgío кул'-тур; :

Яро«.; Torulop"!» ¡¡сн'уг Uuüii:; 7--17 ИП КОДЯОКЦКП

:-\-riín;:¡!!f мшфоОко.;:оп:п КазГУ мьк Лль-ФпрпОЧ. Kyjn турп :>»;:<!j\<:n~¡ i::¡ к;/?игся "X.üUxr'K'!;;!,

íiü,-)íi:;poiiCTnni;!fflí; ет'-.ул ки-nf.oSL Uaooiiarcmyoes oarevisiao

i'--12 изученный из Госвгропрома FK.

Ы0Л0ЧНГяп»п»у 'акг^т^'И- LtjU О'ч-:"-':- I:;.!1,;.-. 4.- ■■ l.i^vtw«¡ •H.-.Dt''!>".•!•: i 'rtit:^.. ffl'i'aMM 221 113

1:афзДрм микробиолопп! КазГУ од. Аль-Фарабк.

В качестве питательных сред использовали солодовое сусло, полученное но пивзавода г.Алматы. и теоттакуа кэлэчнуп сыворотку, ГГОЛ"Чайную "-3 KO.WWOl кух«п Sí Сойотского P'üins-I г.Ак»е»тн ил'!, к» И г.Кжшти, С-гврилязаик« «ПУЗ,*»

пропадала при 0,6 атм, п тттшз 30 кзнут.

!; качеотр'.! ОТИМуЛЯТОПЗ - ^«'ЛПСЛСГпч'еиХО« аКГ.ШНОСУ» "игосоргвнг-ялгв использовали синтетический препарат -спллцилинат сахароза (СЭО), обладавший свойствами ПАВ, полученный на основе прйродкнх соодшшниЛ в !Ш1 HAIí FK. В

качестве полимерных носителей - ПААГ, каррагинан, альпшат кальция, волокнистый носитель (сплющенная полимерная пить) и носитель "Вия" (представляющий собой волокна типа ресниц).

Определение показателя жизнеспособности . (ПЖ) имдабилизовашшх клеток проводили методом минрокультуралыюго анализа (Луста, Сихте, 1990), количественный учет микроорганизмов в гранулах геля - методом Кощеенко К.А. и Скрябина Л.К. (1984).

Метаболическую активность свободных и иммобилизованных клеток микроорганизмов оценивали по изменению кислотности среда и концентрации редуцирующих веществ (Филиппович и др., 1982), концентрации этанола, определяемой

газохроматографически (Агранович, 1979), молочной кислоты -колориметрически и тазохроматографически (Атраыентова и др., 1977; Агранович, 1979), кальция - с помощью атомно -абсорбционного спектрофотометра (Агранович, 1979; Муравьева и др., 1988), белка - биуретовым методом (Филиппович и др., 1982; Хансон, Филипс, 1984) и общих липидов - методом N.Zöllner, K.Klreoh (ЧССР, биотест, Ы.Zollner, K.Kireoh, 1962). Скорость потребления кислорода регистрировали полярографически (Тривен, 1973; Виноградова и др., 1989).

Полученные результаты подвергались статистической обработке (Урбах, 1976; Плохивский, 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение роста свободных и иммобилизованных клеток дрокяей на молочной сыворотке

Первая серия опытов имела целью - изучение поведения дрожжевых клеток, иммобилизованных в различные гели и включала четыре варианта ; I - свободные клетки Torulopeie kefyr var. kumie T-I7; 2, 3, 4 варианты - клетки Torulopsis kefyr var. kumis T-I7 иммобилизованные в ПААГ, а также в гели каррагинана и альгината кальция.

Выявлено, что процент включения микроорганизмов в гели мало зависит от свойств гелей и составляет для ПААГ -89,1+3,2%, каррагинана - 90,0i3,6%, альгината,- 95,0+3,6%.

Для изучения роста и физиологической активности

иммобилизованных клеток дрожжой паквасочнил материал ('.■гродине или иммобшппопгчпше шмтчи) нносяди в субстрат а п.-,-.?tto;vf mm I/Hi. ироСи из культурзлыгой срэда отбирали через 24, <18 и 72 часа от начала экспериментов. Согласно получением данным, 1грирост белка в ходе 48 часового культивирования свободных клеток поставил 45Т, для кл&ток, вшдачошшх в ПААГ, голи кпррапшяня и яльтюта кальция - 17, 128 и 47% с-кпт-птсгг'йнно. Эти результата свидетельствующие о том. я*л клетки, включетше в ГШг

-u.in«" .*..", „^д ^ппняк;:, получешпдш при

показателя жизнеспособности (ПН) иммобилизованных клеток микроорганизмов. Так, этот параметр для клеток, иммобилизованных в ПААГ, гели каррогинала и альпяшт кальция равен 35,0+2,0$, 70,0+2,32 и 70,0+2,1® соответственно.

Известно, что иммобилизация микробных клеток мокат различным образом отражаться на интенсивности протекающих в них биохимических процессов. Согласно получении* дажшм, яри росте сяободгале и иммобилвиолзншх клеток дрогж«й на молочной сыворотке скорость потребления кислорода почта ко меняется. Клетки, иммобилизованные п гели альптната кальция и кзрроптянй, в на", яе культивирования активно используют кислород, но утя с первых часов акошршзкта отот процосс замедляется, тогда как интенсивность спиртообрпзоьаипя в эти сроки резко увеличивается. П кдотиях вкятшна в

ПААГ, памо-пю сличается интенсивность и дыхшшп, и бро-дшц;ь

Результата изучения с;;орое*н катаболизма согласуются с данными по измерению содержания jw«w>?a - если клзткп,

гчклпчг-тши* г ПдАГ, ¡с конку экспптгш^:-«гл упшвид.ув! тсjh-v.-j 50! л.чкт.-,.*«. го mircmffi-i микрсорг&ииьям я клеим, аклотеншга ь гранулы коррагинана я альгттта кальция - 70 --80* пмэвдэгося в среде углевода.

Одним из важнейших тг^имдестз тсобвлизовэюш iuso'tg;: является тзмоаность nx »югокр/лиого ясшл|.:юяатш. В &№.-,укдас экспорикзитах Сала кзучона метаболическая жгшкияь клеток лргжяпЯ, додебяяизэвышнх в кзрряпадш! в т, ою 3-х кратного испэлъзою;^? irx д.лл имркзптоща: «апочной сивороткИ (по 72 часа). Согласно полученным данный, в »тих условиях дроЕпз продолжают размножаться, о чем сввдетольствуйт увеличение содержания белка в гранулах на 30 - 403, яктиаяо

утилизировать лактозу и образовывать спирт, причем интенсивность этих процессов в 3-ей серии сравнима с таковыми в 1-ой серии экспериментов.

Математическая обработка полученных результатов была проведена на ЭВМ "Искра-1256". Корреляционный анализ показал наличие значительной обратной (отрицательной) связи между изученными физиолого ~ биохимическими показателями интактных клеток и клеток, иммобилизованных в каррагшшн и альгинат кальция.

Таким образом, включение клеток дрожжей Тогц1орв1в ке*уг таг, 1шш1а Т-17 в гели природных полисахаридов - каррагтшна и альгината приводит к стимуляции их роста и метаболической активности. Использование для иммобилизации ПЛАТ, мономером которого является токсическое вещество - акриламид, приводит к снижению изучаемых параметров.

Изучение спиртообразувдей активности иммобилизованных клеток дрожжей Тоги1оре1а ке!уг унт. кишХе Т-17 при их росте на натуральной и сгущенной молочной сыворотке

■ В литературе отсутствуют сведения об использовании культуры дрожжей Тоги1оре:1а кеХуг уаг. кцт!е Т-17 для получения этанола. Нами проведено изучение спиртообразуицвй активности клеток дрожжей Тоги1орв1в кеГуг кит! в Т-17,

иммобилизованных включением в гель альгината кальция и сорбцией на полимерных носителях - волокнистом и виях. Каждый эксперимент включал 3 серии, в ходе проведения которых изучалась ферментативная активность одной и той же порции иммобилизованного биокатализатора. Согласно полученным данным, иммобилизованные клетки дрожжей Тоги1оре!в кеГуг уаг. киМа Т-17 независимо от используемых для иммобилизации методов и носителей при росте на молочной сыворотке активно сбракивают лактозу с образованием этанола, причем наиболее активно этот процесс протекает в клетках, иммобилизованных в альгинатный гель. Так, если концентрация этанола в субстрате, сброженном свободными клетками Тоги1ора!а кеГуг уаг. кшп!в Т-17, составляет 2,2+0,2%, то в случае клеток, иммобилизованных адсорбцией на вие, волокнистом носителе и .включением в гель альгината кальция эта величина составляет 2,О',2%; 2,910,2% и

: 1.-0,1% с.члгепствщ'но. И-х крчтноп нстлыовлгаэ одной и т;-й .к ! ив» »ум- 'Гтлтаппшог'и Оништ&шоагора для ферментации сыворотки ткьзало, что к кошу 1-й серии выход г,у»цплв составлял 2,2*0,2%, второго - I ,Я*0,г%, третьего -2,0+0,2*. При фпрмянттгт» '.гаг'прт^ саппротки клеткгам, -''и.'П''■ ¡¡л гт:.и!;тмг'р>!')м и типа ''бия" к ;с(ЛП1','

' го пг:с,гон;а виход итанола составлял 2,9+0,2*, второго -2,510,2%, третьего - 2,6+0.2%: КЛПТКГОла. актЛшп»"««-- -""——г: ¿.и™.«. ^ "+•> ^ ** соответственно; кл^гкпт, включошгыми в гель альгпногз кальция 3,4+0,3*, 3,7+0,2^ и 3,8+0,1% соответственно.

Эта результаты означают, что иммобилизованные клоткп кумысных дрожжей, независимо от типа носителя, при повторных пассаиах сохраняют (физиологическую активность на уровне таковой у свободных клеток.

Для увеличения выхода этанола нами проведено сгугаяние

МСЛО'ПГТ? "POpOTK.il :1\'ТПМ т-.'-'ТТЧР'гВи'1.;!^ Д': 2-Х 'фЧ'ПК.Ч'О у?/,-,!![,!?■<;,ц.у . Кпкдд« "ори:1 сггг:':н: гклтчлз пять

ьйр:п!Г'>р : ; ьаршлгт - контт»ин^бол.'з;: .'сллтюч ТогшориЬ"' "КоТ>-г •■' ->; ■ (-лиг;,-. !Г--!7 ПрП рост- Н'. '¿РЛПГ'НОй МОЛОЧНОД

с:лг>роткг : •>г-ч]>.1 г-;}■ - ийсбо.члч" щпт.т Ъ:г>П.>рп}.ь ¡пм'уг

¡г< ('.г.-Г;,;1' !;иг(пс, Г 17. '•.г.и'ПС'ШШО о мЛЫ'ЦКгТ

К')."!.Ш!.'-' - !Г: ип.-.?1 ОЪГШл 1ТОС;Г"ПЛ,1Г.,

Ь'* ЙЬ ГПмШп-'-.О: 1 СГУ'^'гЛЮ:. .. ЧТи

концентрация спирта в сброягаштой сгуя^зтшой молочной сывопотка

экспериментах с яативной сывороткой и составляет 3,87г. Аналогичны® результаты получены п с ю.*мобнлизоваинымп нлвткамп лактозосбракивающих дрожжей.

?;>ч;г-' "ena'o-ooiui'';' ; г. /лч-1сгт 1 C'/uCiV'^i

■ TVH!f>)u;r>; Ч ^из'ШТОЛи;« уволл-шть

ППСОЛ ГгТ"ПО"Г> 00 фэргочТЯКИП КуШСШ.гС iTiK-'f-r,

Tori; 1 ct>c. 3'' И" '"V" . '< i г- "--1-;

Для оптимизации роста и шипения физиологической aKTiffiHocTH клеток дроге®ft Torulopsis Icefyr- var. fxraie Т-17 в молочную сыворотку добавлялась меласса - отход производства сахара. Для сравнения культивировал! пэ такой кэ среде клетки

дрозюкей ЗаооЬаготуоев оегеУ1в1ае гибрид Р-12. Экспершенти проводились по следующей схеме : Варианты I, 2 и 3 - субстрат - молочная сыворотка с добавлением 1%, 5% и 10% мелассы соответственно, вариант 4 - молочная сыворотка без добавок. Закваска в этих вариантах - Тоги1оре1а кеГуг уаг. кипив Т-17. Вариант 5, 6 и 7 - субстрат - молочная сыворотка с добавлением IX, Ъ% и 10% мелассы соответственно, вариант 8 - молочная сыворотка без добавок. Закваска в этих вариантах БаооКаготуоев оегв71в1ае гибрид Р-12. Во всех экспериментах посевной материал вносился в объеме 10%, ферментация проводилась при температуре 28°С. Данные по содержанию спирта приведены в таблице I.

Таблица I.

Влияние внесения мелассы в среду на интенсивность спиртового брожения (концентрация спирта в Ж)

Варианты \ часы 24ч 48ч 72ч

I 1,20 ±0,20 3,80 +0,10 2,92 + 0,20

2 1,05 +0,20 4,10 +0,10 3,75 + 0,20

3 0,90 +0,10 3,70 ±0,10 4,65 + 0,20

4 1,30 +0,10 2,70 ±0,10 2,70 ± 0,20

6 0,40 +0,10 0,40 +0,10 0,40 + 0,10

6 1,65 +0,20 2,10 +0,20 2,25 + 0,20

7 2,25 +0,10 4,17 +0,20 5,55 + 0,20

8 0,00 0,00 0,00

Из.приведенных данных видно, что дрожки Топи1орв1в кеГуг уаг. килив Т-17 при росте на молочной сыворотке с добавлениями мелассы продуцируют больше спирта во всех вариантах по сравнению с контролем. Самый высокий выход спирта-4,65% получен в варианте 3, где мелассы вносилось 10%. При культивировании дрожжей ЗаооЬаготуоев оегеу1в!ае гибрид Р-12 на молочной дыворотке с добавлением мелассы получен самый высокий выход спирта 5,55Ж. Из данных, полученных для 5-го и 8-ГО вариантов следует, ЧТО дрокки ЗаооПаготуоев сегеухваае гибрид Р-12 продуцируют спирт до тех пор, рока в среде есть меласса.

Изучение роста смешанной культуры свободных я иммобилизованных

клеток дрожжей и мялстнокиелых бактерий на молочной сыворотке

' .щ'-'стло, что молочная сыворотка может использоваться в ь-гь-г п<в исходного сырья для получения различных напитков. Им«« рапрпботаны условия иммобилизации и режимов культипироряпля клр-иж дрояж»?й и молочнокислых бактерия в '•«(•ки-'н ,й культур) на молочной сцворотно. Каэдая серия опытов йилч^а четыре варианта : I - свободные клетки г«»™».—» культуры ТогчТпг.^- ГН_ ^¡;ииоп1,ио Т"-4:!;

« 1«»ич>оаг.1ч-— сиЪвр. Ьи1^щ\1еив 221, В

соотношении 1:3:3; 2, 3 и 4 - эти не культуры иммобилизованные включением в гель альгинэта кальция и сорбцией на полимершх носителях. Закваски, вносили в субстрат в соотношении 1/10. Согласно полученным данным, при росте смешанной культуры молочнокислых бактерий и дрожжей на молочной сыворотке, как и при росте монокультуры дрохжей, этанолообразование заметно нарастало в течение 72 часов и в последующие часы сохранялось пя доотегнутом уроки*. К концу зксперимонто концентрация спирта г> культурольиой яидкости составляла 3,0%. Молочнокислое бродаякя» протекало меаее интенсивно. Конверсия лактозы активно протекали в нервыо сутки, затем етот процесс несколько стабилизировался.

Иягдстно, что сушарпая октгааюсп. сдашэшшх культу) повисит от соотношения в них различных гидов и ятамюв гакрооргшмзмов Шаткуль, )Э8П; Хрлкаов, Г 590; Гурешп ДЯЦ; Дуяеня, Сатторяк., 1991; Фуряева, 1981; Щелокова и др'., 1988: Эгамбердиев, 1981: л»11»«д,1087}. В нпглг-: пкспорям.знтпх. н '••угори количрг'п-ошЮ" соотпокенн'- культур ггмю-оккгясяи ."Икгчрпй * лр^'чз:! а закваске составляло 5:1 к 120 часам ферментации активно функционировали все культуры.

Установлено, что иммобилизация заквасочных культур яэ сникает их фияяотгтгосксЯ октиняостк. Кашд9итра1д;п спирта в средь к концу аксимрчионта составляла 3,3«, иалоч.пс^ кислота -лчктозн осталось 10*.

Такяк образом, хотя при формонтатш шлопно.1 сцвсроткк имшбшпг*оя81вяяя1 ¡йнь чкпад дроггой и молочнокислых бактерий в смешанной культуре активно протекают процессы и сплртового, я молочнокислого брожения, наблюдается некоторое смешение их

интенсивности в сторону кислотообразования. Возможно, иммобилизация изменяет характер взаимоотношений используемых культур.

Для изучения влияния условий культивирования и сроков внесения закваски на органолептические показатели напитков эксперименты ставились в 3-х вариантах, отличающихся по времени внесения в молочную сыворотку сусла и заквасочных культур.

Вариант 1-молочная сыворотка и сусло (8°В) в соотношении 3:1 (общий объем 100мл). Закваска - культуры. Тоги1орз1в кеГуг уаг. киш.8 Т-17 В объеме 5мл И БаооЬагомуоев еегеУ1в1ае гибрид Р-12 в объеме Бмл, внесенные одновременно. Культивирование при температуре 28°С. Вариант 2 - 75мл молочной сыворотки загсвашвали 6мл культуры Тоги1орв1в кеГуг уаг. кивив Т-17 и выдерживали при температуре 28°С в течение 24 часов. Затем в культуральную среду добавляли 25мл сусла (8°Б) и вносили культуру дрожжей ЗаооЬагогауойв оегеугегае гибрид Р-12 в объеме бмл. Затем снова культивировали при температуре 28°С. Вариант 3 - 50мл молочной сыворотки заквашивали культурой Тоги1ор»:а кеГуг уаг. кит!в Т-17 в объеме Бмл и инкубировали при температуре 28°С в течение 24 часов. Затем добавляли 50мл сусла (8°Б) и вносили культуру дрожжей ЗаооЬаготуоев оегеу!з1ав гибрид Р-12 в объеме 5мл. Культивирование при температуре 28°С.

Таблица 2

Содержание спирта в модифицированных напитках

Варианта \ часы 24ч 48ч 72ч

Вариант I 1,62+0,13 3,00+0,20 4,55+0,20

Вариант 2 1,58+0,13 4,05+0,20 4,25+0,20

Вариант 3 1,95+0,20 4,25+0,20 4,35+0,20

Как видно из приведенных данных таблицы 2, во всех вариантах содержание спирта возрастает на протяжении всего эксперимента (120ч). Максимальные значения содержания спирта наблюдаются к 72 часам культивирования. Это означает, что обе культуры работают хорошо. Дегустация полученных напитков показала, что образовавшиеся продукты обладают приятными

>,,:•,<и л k'i vi'^'inM,', по ькуоу н .¿riii-!ty идниирвманно и кумыо и rnw, тшпт сяоообрш'ный г.ук. - г вкус;« м ■Ч-шт> 11 ГМЮ'ЛНн могут 01Ш. рОК^МиНДОКЧ1Ш К у»ОТр*бЛи)|ИЫ в иН'Ж'ГЛ If, IKtiitl ГКС-Ь. Получи ЦШЬ Продукта ПОЛУЧИЛИ ПОЛО»ЯТвЛЫ!7У)

~;г,пху 1'. lliii"! и гу;-ч шимнил ИДЯ !К.

Изучение роста и физиологической активности клеток двойкой

Нами изучалась физиологическая активность свободных и иммобилизованных клеток д ронже Я Torulopeie kefyr var. la mils T-i7 и молочнокислых бактнрий Laotooocoua laotie 40 и Laolobaoillus delbrueokii eubsp. bulgarious 221, растущих на молочной сыворотке в присутствии препарата салищшшата сахарозы (СЭС).

сзс - полусинтйтичпокий прсттарят, иядучлвииЯ а

riv.i чя'ПИ j -V "1. .Hi'!' Н HXli H.'iH I'К. НИ cuiKjF-i. > pHO'bvr'.-iJSL'.OJX •о . ikooio.iH. , ••ю or > h-WfC [•»«• окэзиммт стим.у.|:к'1'у»;!,,'кй

о|<ток', !,'-: 5-•(••!• 'Ijr.Xi'fl'' ;-.,-¡nciial" г^оч.ч , i;jv i i: i 16 ГИ'рИД Онй Ц "0,p.iA I i «¡p , кот./j хй ч./кчт бить ..пуглисвлиа Ti-н, что

•"•.'•. • <-..«:i.v.« ■ г еь.йетмпми И"И'-1(Н,а%) ШЛ sW«i »ии и др., 1091; Лимита, •ivo-iii^Pc), 19irM ; Жубанова, ¡i<ib).

ОЧИНИ СТЬ'Ч1Л,"0, н Чн'Ш]")( !'Я[ И'!!П .,К : ] (У.риннт- смешанная ку.'а. I ура сноСгоишх кде.гчк Т^гчК.рм i и ke-Гуг v»r. kuais Т-17 о мчличникислыми бактериями; 2, 3 и 4 - клетки Torulopaie kefyr var. kum-in Т-Т^" »г-.д.--;н k.^vkix ? iii т ■; {■■ и И, ичмобили;?сч»ашш<> в

'оо , НЧЧ! ,'И)1 л л ос -я i ,..<:и. Фо^вНТйИИ») м'.'ЛмЧисЕ

iwioiKtiMH микроорганизмов . осуществляли в условиях периодического культивирования в • колбах Эрленмейера при температуре 38°С в течение 6-7 суток. Закваски, представляющие cvsoft смоет. им свободных и иммо'тлизошшлих клеток культур I.-io tо ¡o.v.mih IhiHh 4U, i»U' ti t;ao i 1 i ufi delbrueokii . aubep. bulgarioua ¿21 И Torulopsin kefyi4 var. .'kumio T-17 S соитношидаи 3:2:1, вносили в субстрат в гоотнокенив 1/10. "робы сггоирали ужйдновно л подвергали физико-химическому анализу. • • • • •

Для изучения влияния препарата . СЭС на: ' бродильную активность клеток молочнокислых бактерий-и дрожжей в. свободном и иммобилизованном состоянии эксперименты проводились ■ в ■ двух

сериях, различающихся по времени и способу контакта клеток макроорганизмов с препаратом СЭС.

1. Препарат СЭС вносили в среду при получении накопительных культур до конечной концентрации 1мкг/мл на 24 часа. Клетки отмывались, одна порция подвергалась иммобилизации. Затем свободные и иммобилизованные клетки

•микроорганизмов помещались для дальнейших экспериментов в 500мл молочной сыворотки в тех же соотношениях, что и ранее.

2. Препарат СЭС вносился в молочную сыворотку вместе с закваской в »концентрации 1мкг/мл. Такая постановка экспериментов позволила выяснить, на каком этапе целесообразнее вносить стимулятор.

Согласно полученным данным, как и в предыдущих экспериментах, спиртовое брожение протекает более интенсивнее при использовании иммобилизованных клеток. Так, если в обоих сериях опытов при выращивании свободных клеток концентрация спирта к концу эксперимента составила 3,6& и 3,25%, то с иммобилизованными клетками - 3,65% и 4,4% соответственно. Относительно кислотообразовакия в двух вариантах опытов данные не столь однозначны. Так, молочнокислое брожение в I серии протекает более интенсивно со свободными клетками, чем с иммобилизованными и содержание молочной кислоты к концу эксперимента увеличивается до 4.24Ж и 3,82% соответственно. В оштах 2-й серии, напротив, молочнокислое брожение интенсивнее в среде с иммобилизованными клетками когда концентрация молочной кислоты после 120 часов культивирования в присутствии СЭС составляет 3.G4S и 4,24%, соответственно. Скорость утилизации лактозы значительно выше во 2-й серии когда к концу .экспериментов концентрация неутшшзированной лактозы в среде составляет 5 - 6%. Таким образом, препарат СЭС стимулирует утилизацию субстрата, интенсивность спиртового и молочнокислого брожения как для свободных, так и для иммобилизованных клеток, причем внесение препарата в среду с инмобшшзовакними клетками более эффективно, чем со свободными в отношении утилизации субстрата и спиртообрззования. Предварительная стимуляция клеток (до иммобилизации) влияет на эти процессы незначительно. Это можно объяснить тем, что как показано ранее (Доаанова, 1989) препарат СЭС не производит глубоких сдвигов в метаболизме дрожкей - сахаромицетов,

и :->'!'• >му Ц.'!Я ^рояр.ЛаЧИЛ д;-Й':(»ИЯ ему НйОбХОДИМ постоянный

«••H ruKt с кодныш. иоращает на селя внимание тс

• «0'.:tî>ИТ>»Л1»'/ТЬ0, что молочнокислоо бромало подвержено дийотш!» нрипарата CiQ. Кго интчисиыюсть, напротив, несколько

птпклвч'ся после контакт» клеток молочнокислых бактерий

ПI. ! - 31! L • Г >М.

liai« изучены закономерности роста и метаболическая активность клеток Torulopsia kefyr var. Kumia T-I7, иммобилизованных в ПААГ, каррагинан и альшнат кальцин. Установлено, что процент включения клеток в матрицу носителя зависит от свойств геля и составляет для ПААГ - 89,1+3,2Ж, для каррагинана - 90,0+3,6%, для альгината - 95,0+3,6%. Показатель жизнеспособности клеток дрояжей в этих вариантах рчьзн 70,0+2,."it, 70,0+2,19, и Г«>,0+2и'г» сск-тъчтотв>;)то, т.е. iil для ь.яьт.-ж, ьклмч^шшх в [¡ЛАГ, но сравнении с клеткам», имм«'-»»«.■•С'Ь'ичадав в иолчю'члгфшошч гранулы, в дна ¡¡аза мышиу. Ня1ь.'«>я«,....,кая активность иммооилизппашшх кл.-ток того зависит

мТ I B'iili'U! ГОЛОВОЙ М»ТрИ5Ш. Так, Ь КЛиТ;<«Х Д{к>Ю»Й îi/I'Ul ори j fi kr.Vr var. kuiiiia T -17, зштншх H ПААГ, и дыхшше, и ор^ялшо протекают вяло,

Нлнгки i|y Инй TV>ru 1 > if i h kt-fyr v.w. ki uni h ï-IV, iwm ь альгинатшй гель, показали высокую

физиологическую активность кат: ттрп шик.--, так и цри

MIC'lVKÎ'iKH И X 111:1)' ,'.11 .ЧОнаШЧ! ди. ф)рМ«НТЙЩП1 M ОЛЧЧНОЙ

- : j j j - " кн. 1.4h, '^х.од jraikJJi а л Ча часам культивирования и при повторных пассажах составлял 3,7-3,9%. Это означает, что включение клеток в гранулы этого геля не создает диффузионных ограничений пля субстратов и продуктов ф.-рментатиышх реакций и " рчоушис.ся гранулы обладают .достаточно высокой мохаш1Чнг;к.и прочностью. Анализ литературных дагашх показал, что выход этанола ¡три ферментации молочной снгоротки культурой лп.п-'.а T-'-ruloim!» k у с у г var. Kiunits T-I7 как в свободном, так и в иммобилизованном состоянии сопоставим, а в ряде случаев и выше С таковым для культур Kluyveromyoea fraqiiis, Candida pseadotropicalis и Zymomonas mobilis. Поэтому нами на основании полученных результатов были разработаны способы

Q А "

. м л П il

получения этанола из молочной сыворотки с помощью свободных и иммобилизованных дртжжей.'

Адсорбционная иммобилизация клеток кумысных дрокхей на полишр/шх носителях также приводит к интенсификации процессов ^ утилизвщш лактозы молочной сыворотки и образования спирта, "независимо от типа носителя.

Заметное влияние на иммобилизованные клетки оказывает стимулятор роста микроорганизмов - СЭС. Так, внесение этого препарата в среду стимулирует процессы спиртового брожения протекающие в иммобилизованных клетках дрожжей и в конце эксперимента концентрация этанола в среде составляет 154% от контроля. Но, для проявления такого аффекта необходимо присутствие препарата СЭС в сроде на всем протяжении ферментации.

Изучение роста смешанной культуры свободных и иммобилизованных меток дрожжей и молочнокислых бактерий на молочной сыворотке показало, что, смешанные культуры МОЛОЧНОКИСЛЫХ бактерий Laotooooous laotis 40, Laotobaoillus delbrueokii виЬвр. bulgariouu 221 И дрогшей Torulopsis kefyr var. kumiE T-I7 в соотношении 3:2:1 активно ферментируют молочную сыворотку с образованием этанола и молочной кислоты, причем иммобилизация заметно увеличивает скорость этого процесса. Например, к концу эксперимента с иммобилизованными клетками количество остаточной лактозы составляет 10%, для свободных клеток - 2IS. Взаимоотношения мезду молочнокислыми бактериями и дрожжами могут быть не только симбиотическюш, но и антагонистическими. Так, Г.Л.Селибер и А.Л.Бычковская (1985) возрастаицую активность кислотообразовашя молочнокислых бактерий с дрожжами рассматривают как проявление их антагонистических свойств к дроикам. Иммобилизация клеток микроорганизмов изменяет их взаимоотношения. Так, если при использовании свободных клеток, содержание молочной кислоты в среда к 120 часам достигало 3,80%, то в случае агдоОилизоваших клеток - 5,025. Это ыозкет Сыть связано с ток, что голевая оболочка создает барьер, препятствующий прямому контакту дрокетП н молочнокислых бактерии и способствует смешил интенсивности этих процессов в сторону кисдотообразованпя.

Изучение вкусовых свойств продуктов, полученных при

п ; -¡дни :s.,ji.}4ih>(i cuf<ц • svkh смешанными культурами ■ ».и f.iv:.:ii>. '.чм.фий Jaotv-c^cjuj laotia 40, Laotobaoillua ¿»Ifcmactcit fo.l,np. bulgAfioiui 2iîI и дрожкай Tomlopeis kn?yr л-н , T-17 в соотнощинии .1:2:1 ыжшшо, что образующийся

продукт обладает приятным внугом и яапяхом, нагюмукавдим куш. tî ¡к« f ч^улыагпм и^диаритильной йксшлртизы Института питания )Aiî ) 'К мпжчТ ОЫТЬ pùlCOMdiiAObÉiH к употреблению. Следует отмэтить, что наиитки, полученные с плмппи.ш «•»'""^"""с;::.^

«IIUW» лиокпт-j- . j И , ninoui IIИ п I IJlHm«!/_ Т-КЛХ

стабильность оьойитн, стерильность и низкая стоимость.

Как и следовало ожидать, увеличшшо концентрации углеводов в среде тепловим сгущением сыворотки до уманъшвния ое объема вдвое, заметно повышает выход этанола при использовании для ферментации как свободных, так и иммобилизованных клеток дрожжей Torulopsia kelyr var.kumie T-I7.

В U ii I) д H

1. Ныявлбно влиянии природных. и синтетических гелей и но'.итнллй Hri ¡лет » физиологическую активность клеток дрожжей T.H'iiiuptiis kefуг var. Kunia T 17. Установлено токсическое д»й,.:тыт пааг ни клетки данной культуры.

2. Показано, что физиологическая активность имм.лилвдоыишых клиюк кумысных дрожжей Torulopsia Itefyr var. komiR T-17, »«.зависимо от шш vùjm или носителя, при noBTopraix пассажах остается на исходном уровня,

.'к Нияьлинч, что при фпрм'-нтнции молочной сыворотки имм> •сплизогмннмчи клиткыми дрокжий Tox-ulcpuia kaiyr »hp. Jaunie T-17 выход этанола составляет - 3,9%, свободными - 3,6%. На основе этих данных, нами разработаны способы получения этанола свободными и иммобилизованными клетками дрожжей Torulopeis k^ryi- var. kumiв T- 17 сбраживанием молочной сыворотки, на который получены положительные решения Латентного ведомства РК.

4. Установлено, что прннарат салицилинат сахарозы (СЗС), ооладпкший свойствами но«отк<го ПАВ, стимулирует метаболическуи активность свободных й иммобилизованных клеток дрожжей ïorulopais kefyr var. kumie T-17 и молочнокислых бактерий Laotooooous laotle 40 и Laotobaoillue Aelbrueokii виЬвр. buigarlous штамм 221 ттри их росте на молочной сыворотке

в смешанной культуре.

Б. Показано, что продукт ферментации молочной сыворотки иммобилизованными клетками смешанных культур молочнокислых бактерий Laotooooous laotis 40, Laotobaoillus delbrueokii Bubsp. bulgarioue штамм 221 И дрожжей Torulopsie kefyr var. kurnio T-I7 в соотношении 3:2:1 обладает хорошими "органолептическими показателями. Его преимуществами по сравнению с таковыми, полученными свободными клетками является стабильность свойств, стерильность и низкая стоимость, t

Публикации: По результатам исследований опубликованы следующие работы:

1. Едалова O.A., Щупшибаев К.К., Дощанова Б.К. Использование микроорганизмов для переработки молочной сыворотки. // Новости науки Казахстана. Выпуск 2. Алма-Ата, 1991, с.38-39.

2. Жубанова А.А;, Шигавва М.Х., Дощанова В.К., Шушибаев К.К. Иммобилизация молочнокислых бактерий в различных носителях. // V Конференция биохимиков республик Средней Азии и Казахстана. Тезисы докладов. Ташкент, "Фан". 1991. С.361.

3. Щупшибаев К.К., Костюк Т.П. Влияние растительных ПАВ на дцханиэ и брокэние клеток дрожжей. Тезисы биол-кой мегззузовской конф. молодых ученых и студентов КазГУ. Алма-Ата, 1991. 0.30.

4. Шигаева М.Х., Бузурбаев Г.Г., Дощанова Б.К., Жубанова A.A., Шушибаев К.К. Полярографнчоский метод определения активности сушроксиддисмутазы микробных клеток. Всесоюзная конфзр. биотвхн. и биофиз. микробных попул. Тезисы докл. Алма-Ата, 1991. С.131.

6. Жубанова A.A., Щупшибаев К.К., Шигаева М.Х. Изучение взаимоотношений дрожжей и молочнокислых бактерий в смвшзнной культуре. Вестник КазГУ. Серия биологическая. Выпуск 2, Алмати. 1995. с. 27-32.

6. Нубаноза A.A., Шутишбаов К.К., Шагаева М.Х. Физиологическая активность клеток дроякей и молочнокисла бактерий, включенных в альпшатшй гель. Вестник КазГУ. Серия биологическая. Выпуск 2, Алмати. 1995. C.20-2S.

7. . Жубанова A.A., ШУгайбаев . К.К., Шигавва И.Х. Сшгртообрззущая активность дрогшей рода Torulopsie, шгобшшэовгшйх' в альпшатшй гель и сорбированных на

TQ

; i''-' ителнх. - Дон. в КпзгосЮГГИ CB.Il.«4, * 5474

-Ка»4. /Доноиироьинны« научные работы. Гб^иратиышД cCopiuut.

ÄJ'MHTU, 1994. Выпуск М. -О.оЬ. Ч. Шигаева М.Х., Жубанова A.A., Шутштпаев К.К. Способ нокуч'-ния отполз из молочной совс-ротки п тажкж л ит-.г.вли:К)ШН)НД дри»э«»Я. Заявки » 940!.'¿V.). I . от 29.oe.94. решение формальной экспертизы от 29.U8.94.

О nhiT.urtua Ii Y '«'■' л t.iií, и и А А ШишгшЛйяп ]Г IÍ ПппппЛ

•innminiTiin ПЯ.ГИ1 глпп un ИП ИП1ША!» OUlí/lTV"PVlI ЧП0№0 « ЧЛ1 IbHI | I ПТ

29.06.94. решение формальной экспертизы от 29.08.94.

10. Шигаова М.Х., Яубанова A.A., шупшибаев К.К. Способ получет^я молочной кислоты. Заявка Л 940797.1. от 27.07.94. решение формальной экспертизы ог 29.08.94.

11. Шигаева М.Х., Жубанова A.A., Шуплщбаев К. К. Способ получения молочной кислоты. Заявка Я 940798.1. от 27.07,94. решение формальной экспертизы от 29.08.94.

Щитом М.Х., Жубанова A.A., Шупшибгюл К.К., Лобанова !;.К., Кунчич A.B. Разработка способон. получения этанола и молочной кислоты ферментацией молочной сыворотки иммобилизованными клетками дроккпй и молочнокисл«* бактерий. Новости ичуки Казахстана. Выпуск 4, Алмати. 19^5. с.51 54.

Шопш1бай Казыбек Кдмэли-улы

Бос хине иммобшшзденген ашитку жене суткишкылшьщ 6акте-риясы клеткалардын сут сарысуында есуШц эавдылыгыныц верттеу

Бос иене иммоСилизденген лактоза аштатын ашытцн Torulopsis kefyr var. kumls T-17, ашыт^ы - Saccharomyces cerevisíae гибрид P-12, ко не сут кдацылыныц бактериясы Lactococcus lactis 40 жане Lactobacillus delbrueckii subsp. bul gar i с us 221 сут сарысуында ecyíH зерттеуШе осы кумыс арна-лынган.

ПААГ-ке иммобилизация мен крсилган ашытку клеткапары бул гельдШ токсикалик эсер ету!н, сонда табигаттыц гелмен жэне полимера! носителмен сорбция мен ^осылгак ашткы клеткаларыньщ коне сут кдакылы бактериясыныч ecyiH жане метаболист!к белсен-Д1л1г1н улгайтатынын керсет1лд1. Бос жэне де иммобилиздепгеи калпыидаш ашытцы клеткагары мен сут цыазкылы Сактерипсьшьщ ара-ласкаи культурасында ерекеттест1г! верттел!нген.

The study of the yeast and lactic acid bacteries freo and imnobilizied cells growth appropriatenesses on a milk whey

The present work is devoted to the study of the growth appropriatenesses of the Torulopsis kefyr var. kumls T-17 yeasts, Saccharomyces cerevisiae hybrid P-12 and lactic acid bacteries Lactococcus lactis 40 and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulftaricus 221 free and imnobi 1 izied cells on a milk uhoy.

It has been shown that entrapped in PAG yeast cells were exposed to toxycal effect, but cells introbilization cn the nature gel and polymer 'adsorbents significantly activated growth and metabolytic activity of yeasts cells and bacteries. Interaction cf yeasts cells and lactic acid bacteries in fixing culture in both conditions as free aid intnobilizated was

ТУЙ1Н1

Schupschibaev Kazbek Kamalievich

SUÍ&5ARY