Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка эффективных систем экспонирования белков на поверхности клеточной стенки дрожжей Yarrowia lipolytica для создания продуцента клеточно-связанной липазы

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Разработка эффективных систем экспонирования белков на поверхности клеточной стенки дрожжей Yarrowia lipolytica для создания продуцента клеточно-связанной липазы"

На правах рукописи

Юзбашева Евгения Юрьевна

Разработка эффективных систем экспонирования белков на поверхности клеточной стенки дрожжей Уагготи Иро1уйса для создания продуцента клеточно-связанной липазы

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 ФЕБ 2011

МОСКВА-2011

4854387

Работа выполнена в лаборатории Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Синеокий Сергей Павлович

ФГУП «ГосНИИ генетика»

Официальные оппоненты:

кандидат химических наук ФГУП «ГосНИИ генетика»

доктор биологических наук, профессор ЗАО «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика»

Ведущая организация:

Залунин Игорь Арсеньевич

Машко Сергей Владимирович

Институт Молекулярной Генетики РАН

Защита состоится « февраля 2011 года в часов на заседании

Диссертационного совета Д 217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика»

Автореферат разослан «7^ » января 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук, доцент

Т.Д. Воюшипа

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В век высоких технологий человечество стремится заменить энергоёмкие и вредные для окружающей среды производства процессами, использующими потенциал природы. В то время как человечество делает свои первые шаги, создавая наноматериалы, живая клетка уже давно имеет их в ассортименте. Белки - природные молекулы нанометровой величины, которые выполняют в клетке все необходимые функции, начиная от структурной и заканчивая транспортной и каталитической.

Всё большее число современных производителей переходит на использование ферментов в качестве катализаторов, имеющих ряд преимуществ по сравнению с химическим синтезом. Ферментативные реакции отличаются стереоспецифичностью, не требуют высоких температур, и, что более важно, не образуют не встречающихся в природе вредных побочных продуктов -ксенобиотиков.

Однако производство ферментных препаратов представляет собой сложный процесс, включающий дорогостоящий этап очистки. Для возможности оптимизации свойств и повторного использования ферменты часто наносят на специальные носители (иммобилизация ферментов), что является одним из вариантов использования иммобилизованных на носителях белков.

В научной и прикладной литературе в последнее время все большее внимание привлекает к себе перспектива закрепления белков на поверхности клеток микроорганизмов. Иммобилизация ферментов in vivo имеет ряд преимуществ по сравнению с иммобилизацией на сорбентах. Фермент, продуцируемый клеткой, оказывается связанным с ней сразу после транспортировки его наружу, что сводит трудоемкий процесс очистки белка к простому отделению клеток фильтрацией. Более того, отпадает необходимость как в связывании фермента с сорбентом, так и в сорбенте как таковом. Таким образом, получение клеток-биокатализаторов с экспонированными на поверхности клеток ферментами открывает перспективу новых технологических решений для производственных нужд.

Помимо этого, необходимо отметить, что иммобилизация in vivo представляет собой интерес не только для создания клеточных биокатализаторов с закреплёнными на поверхности ферментами. Во-первых, на поверхности клетки рационально вести процессы биотрансформации, особенно если субстрат или продукт реакции являются токсичными для клетки. Во-вторых, можно моделировать проведение нескольких последовательных реакций, закрепив на клетке катализирующие их ферменты. В-третьих, взаимодействие белков на поверхности клеточной стенки происходит в пределах тонкого слоя, что предоставляет возможность сборки полимерных белковых структур образующих мономолекулярный слой. Так как, полифункциональность белковых молекул

позволяет им взаимодействовать с молекулами как биологического, так и синтетического происхождения, разумно предположить, что дальнейшее развитие данного направления исследований позволит использовать клеточную стенку в качестве платформы для сборки надмолекулярных полимерных структур разнообразной химической природы.

Исходя из этого, перед нами была поставлена задача, заключающаяся в поиске подходов для эффективного экспонирования белков на поверхности клеточной стенки микроорганизмов. В качестве перспективного объекта нами были выбраны дрожжи Yarrowia lipolytica, как реципиент с высоким потенциалом экспрессии и секреции рекомбинантных белков, в качестве модельного белка липаза У. lipolytica Lip2.

Цели и задачи работы. Данная работа посвящена разработке систем для эффективного экспонирования белков на поверхности клеточной стенки дрожжей У. lipolytica.

В связи с этим ставились следующие задачи:

1. Анализ генома дрожжей У. lipolytica для выявления ранее не охарактеризованных предполагаемых белков клеточной стенки, пригодных для экспонирования белков на поверхности клетки.

2. ' Изучение способности ранее охарактеризованного белка клеточной стенки Y. lipolytica YlPirl закреплять белки на поверхности клетки на примере красного флуоресцентного белка.

3. Изучение основных способов экспонирования белков на поверхности клеточной стенки для in vivo иммобилизации липазы У. lipolytica Lip2. Сравнение способности раннее охарактеризованных и найденных предполагаемых белков клеточной стенки закреплять липазу на поверхности клеток дрожжей.

4. Изучение свойств клеточно-связанной липазы.

5. Получение штаммов-продуцентов клеточно-связанной липазы.

Научная новизна. В работе разработаны подходы для экспонирования белков на поверхности клеточной стенки дрожжей У. lipolytica. Посредством анализа генома найден ряд новых предполагаемых белков клеточной стенки. Было показано, что добавление их аминокислотной последовательности к аминокислотной последовательности фермента липазы приводит к эффективному закреплению полученного рекомбинантного комплекса на поверхности клеток.

В представленной работе впервые в дрожжах У. lipolytica были изучены два способа экспонирования липазы. В первом случае закрепление осуществлялось с помощью С-концевых участков (доменов) белков клеточной стенки, обладающих сигналом прикрепления гликозилфосфатидилинозитола (GPI), что обусловливает ковалентное связывание с р-1,6-гликанами клеточной стенки. Были проанализированы С-домены шести новых предполагаемых белков клеточной

стенки, а также ранее охарактеризованного белка Ylcvvpl на способность экспонировать липазу Lip2 на поверхности клетки. Второй способ - присоединение белка клеточной стенки или его N-домена к N-концу фермента. Белок YlPirl, который связывается через дисульфидные мостики с гликопротеинами клеточной стенки, а также N-домен выявленного предполагаемого гликопротеина YALI0C09031p, участвующего в адгезии, впервые были использованы для изучения второго способа экспонирования липазы. Следует отметить, что проведённое исследование позволило среди проанализированных вариантов выбрать лучшую систему для ¡n vivo иммобилизации. Полученные штаммы обладают высокой активностью клеточно-связанной липазы, варьирующей от 3200 до 18800 ед/г сух веса, в зависимости от используемой для иммобилизации аминокислотной последовательности белков клеточной стенки.

Практическая значимость. Липаза - фермент, относящийся к классу гидролаз, катализирует расщепление сложноэфирных связей в липидах. Липазы используются для гидролиза молекулы триацилглицеридов с образованием диглицеридов, моноглицеридов, жирных кислот и глицерина. Помимо этого, липаза способна катализировать этерификацию и переэтерификацию. Эта многофункциональность делает липазу весьма привлекательной для практического использования в пищевой, фармацевтической, кожевенной, текстильной, косметической промышленностях, в производстве ПАВ и бумаги и других отраслях промышленности.

Закрепление такого промышленно-важного фермента как липаза на поверхности клеточной стенки дрожжей является актуальным направлением в современной биотехнологии. Однако, несмотря на большой интерес получения подобных клеток-биокатализаторов, достигаемые до настоящего времени уровни активности клеточно-связанной липазы были недостаточно высоки для их промышленного применения.

В представленной работе получены штаммы, наибольшая активность клеточно-связанной липазы у которых составляет 18800 ед/г сух веса, что соответствует экспонированию 1,2х 10G молекул на поверхности каждой клетки. Достигнутые уровни сопоставимы с уровнем продукции секретируемого фермента штаммом-продуцентом липазы (примерно 0,1 г/л при ферментации в пробирках) и в 70 раз превышают лучшие ранее опубликованные результаты. Клеточно-связанная липаза обладает значительно более высокой термостабильностью, чем свободная форма фермента, сохраняя 57% активности при инкубации на протяжении 6 часов при 45°С, тогда как свободная липаза полностью теряет каталитическую активность в этих условиях. Полученные клетки-биокатализаторы с экспонированной на поверхности липазой сохраняют 86-98% активности после трёх повторных раундов использования, что в разы превосходит уровень остаточной активности фермента, иммобилизованного на сорбентах.

Структура работы. Диссертация изложена на листах машинописного текста, включая рисунка и >Р таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает <7^ работ отечественных и зарубежных авторов.

Апробация работы. Материалы исследования по теме диссертации опубликованы в четырёх печатных работах, в том числе одной статье и одном патенте. Диссертационная работа была изложена на международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» и семинаре секции «Генетика микроорганизмов» Учёного Совета ФГУП «ГосНИИгенетика».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Выявление новых потенциальных белков клеточной стенки

В дрожжах Y. lipolytica на настоящий момент охарактеризовано несколько белков клеточной стенки, среди которых только для двух Ylcwpl и YlPirl известен механизм закрепления на поверхности клетки. Ylcwpl (çell wall protein) является гликопротеином, на С-концевой части которого расположен сайт прикрепления гликозилфосфатидилинозитола (GPI), что обеспечивает ковалентное прикрепление к Р-1,6-гликанами клеточной стенки. Его С-домен размером 110 аминокислот ранее использовался для экспонирования на поверхности клетки зелёного флуоресцентного белка EGFP, гемолизина Vibrio harveyi, щелочной протеазы Aureobasidiumpullulons и кислой протеазы Saccharomycopsis fibuligera.

Белок клеточной стенки YlPirl, хотя и является гомологом белка клеточной стенки Saccharomyces cerevisiae Pirlp, не обладает внутренними повторами PIR (protein internai repeats) и прикреплён не к р-1,3-гликанам клеточной стенки (как группа белков S cerevisiae Pir-CWPs), а связан дисульфидными мостиками с гликопротеинами клеточной стенки дрожжей Y. lipolytica.

Одной из задач данной работы было осуществление эффективной иммобилизации липазы Lip2 на поверхности клеточной стенки Y. lipolytica. Активный центр липазы находится на С-конце, поэтому использование наиболее изученного способа — присоединение С-домена белков клеточной стенки, может нарушить работу фермента. В настоящей работе мы постарались решить данную проблему двумя способами. С одной стороны, впервые в дрожжах Y. lipolytica разработать систему N-концевого способа закрепления на поверхности клетки с помощью охарактеризованного белка YlPirl и N-домена нового выявленного гликопротеина, участвующего в процессе адгезии. С другой стороны, внедрить

синтетический глицин-серинового мотив (спейсер) 08800800800808 между липазой Ыр2 и С-доменом белка клеточной стенки. Данный мотив обеспечивает пластичное соединение двух функциональных доменов в иммобилизованном ферменте. Из литературных данных, приведённых для 5. сегем'шае, известно, что не все С-домены белков клеточной стенки одинаково эффективно экспонируют белки на поверхности клетки. Вследствие этого мы изучали способность белка У1с\ур1 и шести выявленных предполагаемых гликопротеинов иммобилизовать липазу с целью выбрать лучший вариант и получить наибольшую активность клеточно-связанного фермента.

1.1. Выявление гомологов белка клеточной стенки дрожжей К Нро1уЫса У1с\ур1

С помощью компьютерной программы ВЬАЭТр (http://bla.sl.ncbi.nlm.nih.gov/) по гомологии к белку клеточной стенки У. Иро1уИса У1сшр1 были выявлены белки УАЫ0С22836р, УАЫ(Ю27214р, УАШЕ! 1517р, УАШЕЗП08р и УАЫ0Р18788р. Эти белки обладают гидрофобной С-терминальной частью, в которой расположен предполагаемый сайт ОРЬприкрепления - аминокислотный мотив ЫвА (Рис. 1). Помимо этого, четыре белка из пяти выявленных (УАЬШС22836р, УАЫ(Ю27214р, УАЦ0Е31108р и УАЫ0Р18788р) также имеют в составе С-домена аминокислотный мотив У8(2ГС(М)ВО(31С)А. Эта особенность была ранее показана и для белка У1с\ур1. Данный аминокислотный мотив является частью внутренних повторов РЖ, которые характеризуют некоторые белки клеточной стенки 5. сеггу 'шае - С\ур1, С\ур2, Эгр1, а также группу белков Р1Г-С\УР5.

У1сыр1 ----------------еАУУТОКазсоюАРРЭАРРА-------аркоа!Я8Вукупуяда 210

УАЫ0С22836р----------------ТАУУТОХЯХЗОМАРРЗТ----------АААОАЙНЭААТ.ПУ.ЧАА 55

УАЫ0Т)2121Ар УААРКЯКААДГ;АНАТАПАТУ801МР13010&РНЯТГ;РАОАР!<А';АРРАОА!Я8ВАТТ,Г;УЯАУ 24 2

УАЫ0Е11517р----------------Т6ЕР30Р-"А0АТЕРТТС-----------РАОАЯЗЗлАгеУЯУА 213

УАЫ0Е31Ю8р ТАААА5РАРАРАКТТРОА1УЗ<21вП<3<21С2АРР5Т----------ОРАОДШ^ААМПУКАУ 225

УАЫ0П8282р------ТМРАРЗБЫМСАУУвОХервОХОАРРЗА----------АРЕОАШ^ААТ.ПУ.ЧАА 223

У1сыр1 АЪСУААААЬЫ 221

УАЫ0С22836р ААСУУУУААЫ 66 УАЫ 0027214р АС-АУАУАМЫ 252

УАЫ0Е2 1517р ААСУААААЬЫ 224 УАЫ 0Е31108р АСУУУАААМЬГ 236 УАЫ0И8282р ААСУУАААМЬГ 234

Рис. 1 Фрагмент (С-концевой участок) множественного выравнивания выявленных предполагаемых гликопротеинов и белка клеточной стенки У1с\ур1. Выравнивание проводили с помощью программы С1из1а]\¥ (http://www.ebi.ac.uk/ciustaKv/). Черным цветом обозначен сайт узнавания 0Р1, серым цветом обозначен мотив внутренних повторов РЖ.

Длина предполагаемого белка клеточной стенки УА1Л0С22836р составляет всего 66 аминокислот. Он состоит из предполагаемой сигнальной

последовательности, частичного PIR мотива, предполагаемого сайта прикрепления GPI и 19-ти гидрофобных С-концевых аминокислот. Белок YALI0C22836p характеризуется 25% гомологией к белку клеточной стенки S. cerevisiae Cwp2, вместе с которым включен в группу гликопротеинов, участвующих в поддержании устойчивости клеточной стенки к низким значениям pH (http://www.genolevures.org/farn/GL3C3785). Поэтому данный белок YALI0C22836p был обозначен как YIcwp2.

Гликопротеины YALI0D27214p, YALI0E11517p, YALI0E31108p и YALIOF 18282p вместе с белком Ylcvvpl составляют группу белков клеточной стенки, гомологичных гликопротеину S. cerevisiae Cvvpl. Эти белки были обозначены как Ylcwp3, Ylcwp4, Ylcwp5 и Ylcwpô, соответственно.

Аминокислотное выравнивание пяти новых предполагаемых белков клеточной стенки с уже охарактеризованным YIcwpl показало, что белки Ylcwp2, Ylcwp3, Ylcwp4, YIcwp5 и Ylcwp6 обладают к нему гомологией, равной 16,7%, 31,5%, 32,9%, 30,1% и 37,3%, соответственно.

Анализ распределения гидрофобных/гидрофильных аминокислот в гликопротеинах YIcwpl, YIcwp2, YIcwp3, Ylcwp4, Ylcwp5 и Ylcvvpô проводили, используя разработанную для этих целей программу «The Kyte-Doolittle plot» (http://fasta.bioch.vireinia.edu/fasta vvww2/fasta www.cgi?rm=misc I ). Исходя из полученных результатов, были выбраны последовательности С-доменов белков YIcwpl, Ylcwp2, Ylcwp3, Ylcwp4, Ylcwp5 и Ylcwp6 размером 94, 34, 121, 129, 168 и 139 аминокислот, соответственно (Рис. 2).

1.2. Выявление ближайшего гомолога белка клеточной стенки S. cerevisiae Flolp в дрожжах Y. lipolytica

С помощью компьютерной программы BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.govA по гомологии к белку клеточной стенки S. cerevisiae Flolp (гликопротеин, ответственный за флоккуляцию) был выявлен ряд белков Y. lipolytica, среди которых только один белок YALI0C09031p обладал наибольшей гомологией, равной 20%. YALI0C09031p входит в группу гликопротеинов, участвующих в процессе адгезии (http://www.genolevures.org/fam/GL3M4590'). Он состоит из 1347 аминокислот и обладает предполагаемым сайтом GPI-прикрепления -аминокислотный мотив NSA. Исходя из распределения гидрофобных/гидрофильных аминокислот, была выбрана последовательность С-домена данного гликопротеина размером 667 аминокислот (Рис. 2).

N-домен белка YALI0C09031p в своём составе имеет множество аминокислотных повторов: 7 повторов аминокислотного мотива PTTSEEP, 9 повторов SVEPT, которые вместе образуют 3 повтора мотива PTTSEEPTSSVEPTTSEEP. Мы предположили, что по аналогии с N-доменом Flolp, аминокислотные повторы которого обусловливают функцию белка, отвечающую за флоккуляцию клеток, повторы в YALI0C09031p также обеспечивают способность

последнего к нековалентному связыванию с клетками посредством адгезии. Для построения вектора для экспонирования белков на поверхности клеточной стенки был выбран Ы-домен Р1о1р гомолога размером 662 аминокислоты.

Рис. 2 Распределение гидрофобных/гидрофильных аминокислот в (предполагаемых) гликопротеинах клеточной стенки («The Kyte-Doolittle plot»)

2. Экспонирование красного флуоресцентного белка ТигЬоРР635 на поверхности клеток дрожжей К Иро/у11са

ura3d4

Pstí

1ох71

hp4d

zeta

YIPIR1

На примере красного флуоресцентного белка TurboFP635 была разработана система для иммобилизации in vivo на поверхности клетки с помощью N-концевого присоединения белка клеточной стенки YlPirl. Для этого был сконструирован вектор pY-YlPIRl-TurboFP635 (Рис.3), содержащий находящиеся в рамке

считывания ген YIPIR1 (без стоп 1ох66 кодона) и нуклеотидную

последовательность, кодирующую красный флуоресцентный белок.

Экспрессионный вектор также содержал участки транспозонных повторов zeta для негомологичной рекомбинации, синтетический промотор hp4d, терминатор гена XPR2 и дефектный маркер ura3d4 для отбора трансформантов с многокопийной интеграцией в геном, фланкированный сайтами узнавания рекомбиназы Сге фага Р1 (1ох66 и 1ох71). Полученный вектор обрабатывали

эндонуклеазами рестрикции Cpol и Pstl, высвобождая экспрессионную кассету Y-YIPIRI-TurboFP635, которую использовали для трансформации штамма Polf (Leu+). Трансформанты отбирали на агаризованной среде YNBD - минимальная дрожжевая среда YNB с добавлением глюкозы (2%) по комплементации ауксотрофности по урацилу. Примерно половина трансформантов приобретала красное окрашивание после 5-ти дневного хранения при 4°С. Длины волн, при которых белок TurboFP635 поглощает и испускает излучение, составляют 588 нм и 635 нм. соответственно, и находятся в диапазоне видимого света. Вероятно, накопление избытка данного белка приводит к красному окрашиванию культуры (Рис. 4). Разный уровень экспрессии белка, вследствие использования вектора для многокопийной трансформации, может объяснить наличие или отсутствие окраски культуры разных трансформантов. Флуоресцентная микроскопия данного штамма показала неравномерное распределение красного флуоресцентного белка (Рис. 5). Однако оставалось неясным, располагался ли избыток красного флуоресцентного белка локусами на поверхности клетки или же накапливался внутриклеточно.

ТигЬоРР635

Рис. 3 Экспрессионный вектор рУ-У1Р1Ш-ТигЬоРР635 для экспонирования красного флуоресцентного белка на поверхности клеток дрожжей У. Иро1уИса

Рис. 4 Фенотипы штамма, экспрессирующего клеточно-связанный красный

флуоресцентный белок (а), и контрольного штамма Ро1Г (Ьеи+ига+) (Ь)

Рис. 5 Фазово-контрастная (а) и флуоресцентная (Ь) микроскопия штамма.

Рис. 8 Локализация белка клеточной стенки се№1$1ае Р1г 1 р по данным 8шпПаТ. е! а1. CFW - окрашивание клетки калькофлуором белым; Р!г] р-тЛРР - флуоресценция клетки, экспрессирующей Рц1р-тК.РР;

содержащего конструкцию YlPirl-TurboFP635 CFW Pir1p-mRFP merged

Merged - совмещённая фотография.

Для выяснения локализации избытка красного флуоресцентного белка была измерена внутриклеточная флуоресценция. Для этого клетки разрушали стеклянными шариками, клеточный дебрис отделяли центрифугированием и измеряли флюоресценцию в образованном лизате. Как видно из Рисунка 6, внутриклеточная флуоресценция составляет всего 5% от общего уровня.

Рис. 6 Флуоресценция суспензии клеток и в клеточном лизате, образованном в результате разрушения клеток и отделения клеточного дебриса

Было изучено влияние обработки клеточной суспензии протеиназой К. При инкубации суспензии клеток с протеиназой К на протяжении 4 ч при 37°С флуоресценция практически полностью исчезает (Рис. 7). В качестве контроля использовали такую же суспензию клеток в таких же условиях, к которой вместо фермента добавляли воду.

Рис. 7 Обработка клеточной суспензии протеиназой К

Эти данные являются аргументом в пользу того, что красный флуоресцентный белок не накапливается во внутриклеточных органеллах, а неравномерно иммобилизуется на поверхности клетки.

Полученные результаты согласуются с литературными данными по изучению локализации гомолога У1Р1г1 в дрожжах 5. сет-еушае Ри1р. Было

показано, что Pirlp располагается внутри хитиновых колец точек почкования, а не распределён равномерно по поверхности клеточной стенки (Рис. 8).

Далее локализация YIPirl на поверхности клетки была подтверждена сшивкой с липазой Lip2 и измерением активности фермента, ассоциированного с клетками

3. Экспонирование липазы Lip2 на поверхности клеточной стенки дрожжей У. lipolytica с помощью N-концевого способа закрепления

Для изучения иммобилизации липазы на поверхности клеточной стенки с помощью N-концевого способа прикрепления нами были выбраны две аминокислотные последовательности - белка клеточной стенки YIPirl и N-домена Flo 1 р гомолога YALI0C09031р.

На примере красного флуоресцентного белка TurboFP635 мы показали, что YIPirl может быть использован для закрепления белков на поверхности клеточной стенки дрожжей Y. lipolytica.

Мы предположили, что, как и гликопротеин клеточной стенки S. cerevisiae Flolp, его найденный гомолог YALIOC09031p обладает двумя доменами прикрепления к клеточной стенке. С помощью С-домена данный белок сам ковалентно связывается с клеточной стенкой, а N-домен же способствует нековалентному связыванию с другими клетками, образуя клеточные агрегаты (Рис. 9). Вероятно, рекомбинантный комплекс Ndom-Lip2 сначала может секретироваться в среду культивирования, а потом связываться с клеткой с помощью механизма адгезии.

На Рисунке 9 представлено схематическое изображение рекомбинантных комплексов, сконструированных для in vivo иммобилизации липазы Lip2 с помощью N-концевого способа закрепления, и экспонирование их на поверхности клеточной стенки.

А

Б

КЛЕТОЧНАЯ ПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ СТЕНКА МЕМБРАНА

гликопротеин

\ р-гликановый р-гликановый слой + хитин слой

ЦИТОПЛАЗМА

Рис. 9 Схематическое изображение рекомбинантных белковых комплексов, сконструированных для иммобилизации липазы in vivo с помощью N-концевого способа закрепления (А), и экспонирование их на поверхности клеточной стенки (Б). Предположительная экспозиция и функция потенциального гликопротеина гомолога Flolp YALI0C09031р (В).

3.1. Скрининг полученных трансформантов

Для экспонирования липазы Lip2 на поверхности клеточной стенки с помощью белка YlPirl и N-домена гомолога Flolp были сконструированы экспрессионные вектора pY-YlPIRl-LIP2 и pY-Ndom-LIP2, соответственно (Рис. 10). Данные вектора обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Muni и Xbal, полученные кассеты Y-Y1PIR1-LIP2 и Y-Ndom-LIP2 использовали для трансформации штамма Polf (Leu+).

Flolp гомолог (YALI0C09031g) N-домен 662аа

UP2

urt3d4 —Я pY-YIPlR1-LIP2 i_zeta

Muni

Рис. 10 Экспрессионные вектора для иммобилизации липазы на поверхности клетки с помощью М-концевого способа прикрепления

Трансформанты отбирали на среде УКВБ по комплементации ауксотрофности по урацилу. Для эффективной экспрессии в настоящей работе мы использовали вектор, обладающий дефектным маркером игаМ4. Данная система позволяет отбирать трансформанты с разным числом копий, встраиваемых в геном, поэтому мы всегда проверяли по 20 трансформантов для каждой изучаемой конструкции и наблюдали разные уровни активности липазы. В дополнение к разному числу копий, разброс величин активностей можно объяснить также влиянием так называемого «эффекта положения» - достаточно вероятностным встраиванием части копий в неудачный, «молчащий» участок генома.

Ферментацию трансформантов проводили в среде YNBDO - минимальная дрожжевая среда УЫВ с добавлением глюкозы (5%) и оливкового масла (5%) в

пробирках (50 мл) с рабочим объёмом 10 мл при 30°С и постоянном перемешивании (250 об/мин). Во время культивирования контролировали рН среды, если рН опускался ниже значения 4.5, добавляли мел в концентрации 10 г/л. В качестве контроля использовали дикий штамм Polf (Leu4Jra+), а также штамм-продуцент секретируемой липазы Y-3260. Штамм Y-3260 был получен путём трансформации штамма Polf(Leu+) экспрессионной кассетой Z-ura3d4-hp4d-LIP2, аналогичной кассетам для иммобилизации липазы in vivo, однако не содержащей нуклеотидной последовательности, кодирующей фрагмент или весь белок клеточной стенки.

Активность липазы измеряли на 5 сутки ферментации методом, основанным на гидролизе п-нитрофенилбутирата с образованием бутирата и п-нитрофенола. Суспензию клеток (400 мкл) осаждали центрифугированием, промывали дважды изотоническим раствором и разводили в 100-10000 раз, в зависимости от активности. Для определения сухой биомассы клеток I мл суспензии клеток осаждали центрифугированием и лиофилизировали в сушильном шкафу.

На Рисунке 11 представлена активность клеточно-связанной липазы, закреплённой на поверхности клетки с помощью белка YlPirl и N-домена гомолога Fio 1р. Следует отметить, что у всех трансформантов активность фермента, ассоциированного с клетками, намного превышала таковую контрольных штаммов.

Активность липазы, иммобилизованной с помощью YlPirl, варьировала от 1400 до 17200 ед/г сухого веса. Активность липазы, экспонированной на поверхности клеточной стенки с помощью N-домена YALI0C09031p, находилась в диапазоне 1300 - 9170 ед/г сухого веса. Клеточно-связанная активность липазы штаммов Polf(Leu+Ura+) и Y-3260 составляла 25 и 667 ед/г сухого веса, соответственно.

Рис. 11 Скрининг трансформантов, продуцирующих клеточно-связанную липазу, закреплённую на поверхности клетки с помощью белка клеточной стенки У1Рн1 и М-домена гомолога Р1о1р (УАШС09031р)

Для дальнейшего изучения были выбраны трансформанты, обладающие наибольшим уровнем активности клеточно-связанной липазы, и депонированы в коллекции ВКПМ под номерами У-3600 и У-3601.

3.2. Ферментация лучших штаммов

Ферментацию штаммов У-3600 и У-3601, продуцирующих клеточно-связанную липазу, закреплённую на поверхности клетки с помощью У1Рп1 и >1-домена УАЫ0С09031р, соответственно, проводили в трёх повторностях в среде УЫВОО в пробирках (50 мл) с рабочим объёмом 10 мл. Для поддержания рН добавляли мел (10 г/л). Активность клеточно-связанной липазы определяли на 3, 4 и 5 сутки культивирования, как описано выше. Активность секретируемой формы липазы измеряли аналогично. Как видно из Рисунка 12, наибольшее наблюдаемое значение активности клеточно-связанной липазы, иммобилизованной с помощью белка клеточной стенки У1РЙ1 достигалось на 5 сутки культивирования и составляло 17200 ед/г сухого веса (1050 ед/мл). При этом около 84% липазной активности обнаружено в закреплённой на клетках форме. Активность липазы в среде культивирования была равной 200 ед/мл. Полученный результат соответствует экспонированию 1 ^ 106 молекул фермента на поверхности одной клетки. Следует отметить, что активность секретируемой липазы штамма-продуцента У-3260 в аналогичных условиях составляет 1200 ед/мл , что характеризует продукцию равную 0,1 г/л фермента [РосПатент 2355754].

О Активность клеточно-связанной липазы О Активность секретируемой липазы □ Биомасса

500 100

>

450 5 90

400 | 80

350 § 70 5

г о

зоо д 250 Ц 60 1 О

50 2

200^ 40 о

»< «<

150 5 30 х

о 100 * ш 20 8

а 50 1 01

и

0 г ■ 0

100 120 140 160

Рис. 12 Ферментация штамма У-3600, продуцирующего липазу 1лр2, закреплённую на поверхности клетки с помощью У1Рн1

При использовании М-домена белка клеточной стенки УА1Л0С09031р для иммобилизации липазы наибольшая активность клеточно-связанного фермента составляла 9200 ед/г сухого веса (Рис. 13), что соответствует экспонированию 6><105 молекул на поверхности одной клетки. В среде культивирования было обнаружено около 37% от общей активности (300 ед/мл).

О Активность клеточно-связанной липазы О Активность секретируемой липазы □ Биомасса

60 80 100 Время (ч)

500 >

450 | а

400 g

350 р

зоол8

■fD.25

250^8 гн

- 200 i-o

150 100

50

160

100 90 80

70 |

60 о о

50 '

30 О о о

го а.

а

10"

Рис. 13 Ферментация штамма У-3601, продуцирующего липазу 1лр2, закреплённую на поверхности клеточной стенки с помощью М-домена УА1Л0С09031р

4. Экспонирование липазы Lip2 на поверхности клеточной стенки дрожжей К lipolvtica с помощью С-доменов белков клеточной стенки

С целью изучения способности С-доменов ранее охарактеризованного гликопротеина У1с\ур1 и выявленных предполагаемых белков клеточной стенки гомолога БЫр (УА1ЛОС09031р), У1с\\р2. YlcwpЗ, У1с\\р4, У1с\ур5 и У1с\\р6 иммобилизовать липазу \Лр2 на поверхности клетки был получен ряд рекомбинантных белковых комплексов, в которых липаза 1лр2 присоединена своим С-концом к М-концу С-доменов изучаемых гликопротеинов. На Рисунке 14 представлено схематическое изображение полученных рекомбинантных белковых комплексов и их экспозиция на поверхности клеток дрожжей.

Были сконструированы экспрессионные вектора для микробиологической иммобилизации рУ-1ЛР2-Сс!от, рУ-ЫР2-У1С\УР1-94, рУ-1ЛР2-У1С\УР2-34, рУ-ПР2-У1С\УРЗ-121, pY-LIP2-YlCWP4-129, pY-LIP2-YlCWP5-168 и рУ-1ЛР2-У1С\УР6-139, соответственно (Рис. 15).

С-домены белков клеточной стенки

сигнальная последовательность

Ylcwpl 94аа Ylcwp2 34аа^ Ylcwp3 121а ^^¡ипаза (Jícwp4 129аа)

N

(Vlcwp5 168аа_) (YÍcwp6 139аа)

КЛЕТОЧНАЯ ПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ СТЕНКА МЕМБРАНА

ЦИТОПЛАЗМА

гликопротеины

■гликановыи

слой + хитин

Рис. 14 Схематическое изображение рекомбинантных белковых комплексов, сконструированных для иммобилизации липазы in vivo с помощью С-доменов белков клеточной стенки (А), и экспонирование их на поверхности клеточной стенки (Б)

С-домены белков клеточной стенки

YICWP1- 94аа

С

YICWP2- 34аа

СП YICWP3-121 аз

С

YICWP4- 129аа

YICWP5- 1в8аа

YICWP6- 13 9аа

Плазмиды PY-LIP2-YICWP1 -94 PY-LIP2-YICWP2-34 pY-LIP2-YICWP3-121 pY-LIP2-YICWP4-129 pY-LIP2-YICWP5-168 pY-LIP2-YICWP6-139 pY-LIP2-Cdom

экспрессионных

ura3d4

lox66 zeta

Рис. 15 Конструкция векторов для экспонирования липазы 1лр2 на поверхности клеток с помощью С-доменов гликопротеинов клеточной стенки

4.1. Скрининг полученных трансфопмантов

В работе было проверено 7 пулов по 20 трансформантов, полученных в результате введения в геном штамма Polf (Leu+) экспрессионных кассет для иммобилизации липазы с помощью С-доменов белков клеточной стенки (Y-LIP2-Y1CWP1-94, Y-LIP2-Y1CWP2-34, Y-LIP2-Y1CWP3-I21, Y-LIP2-YICWP4-I29, Y-LIP2-Y1CWP5-168, Y-LIP2-Y1CWP6-13 9 и Y-LIP2-Cdom). Ферментацию и измерение липазной активности проводили, как описано выше для N-концевого способа микробиологической иммобилизации. Как для N-концевого способа экспонирования липазы, в случае использования С-доменов для иммобилизации in vivo наблюдался разброс величин активностей клеточно-связанной липазы в пределах одной выборки трансформантов, связанный с разным уровнем экспрессии белка (Рис. 16).

О 20000

Í 18000

g га-16000

s g 140KI

Ó « 12000

g Jf 10000

6 1 8000

5 — 6000

£ n 4000

Íj ra

O | 2000

O ^ 0

s

S <

♦

♦

| Ylcwp I I 1-94

| Ylcwp ' ! 2-34 i

Ylcwp 3-129

♦ ♦

♦V

Ж ж

-éfh—

Ylcwp 4-129

Ylcwp 5-168

Ylcwp 6-139

Flolp гомолог-667

Po1f (Leu+Ura+)

Рис. 16 Скрининг трансформантов, продуцирующих клеточно-связанную липазу, иммобилизованную с помощью С-доменов гликопротеинов клеточной стенки

Все изучаемые С-концевые последовательности гликопротеинов были способны экспонировать липазу на поверхности клетки. Однако следует отметить, что использование разных С-доменов приводило к получению разных активностей клеточно-связанного фермента, что согласуется с ранее опубликованными результатами, полученными для дрожжей £ сегега/ае. Возможно, данный феномен связан с разным предельным количеством молекул гликопротеинов клеточной стенки, которое потенциально может быть экспонировано на поверхности клетки.

При использовании С-домена гомолога Р1о1р (УАЫ0С09031р) наибольшая наблюдаемая активность иммобилизованной липазы составляла 3200 ед/г сухого веса, что соответствует экспонированию 2х 10' молекул фермента на поверхности одной клетки. Активность клеточно-связанной липазы, закреплённой с помощью С-домена У1с\ур4, у лучшего клона составляла 7854 ед/г сухого веса (экспонирование 5х 105 молекул/клетку). Относительно большие активности равные 13100 и 13360 ед/г сухого веса были получены при использовании С-

доменов гликопротеинов Ylcwp2 и Ylcwp5, соответственно. Эти результаты указывают на экспонирование около 9х 105 молекул/клетку.

Однако лучшие наблюдаемые значения активности клеточно-связанной липазы были достигнуты с использованием С-доменов YIcwpl, Ylcwp3, и Ylcwpö и составляли 16300, 18800 и 17700 ед/г сухого веса, соответственно (экспонирование 1-1,2х 106 молекул/клетку).

4.2. Ферментация лучших штаммов

В ходе проведённого скрининга были отобраны лучшие трансформанты, продуцирующие клеточно-связанную липазу, иммобилизованную с помощью С-доменов YIcwpl, Ylcwp3 и Ylcwpö (Рис. 16). Данные штаммы заложены в коллекцию ВКПМ под номерами Y-3592, Y-3593 и Y-3594, соответственно. Ферментацию штаммов Y-3592, Y-3593 и Y-3594 проводили в трёх повторностях, как описано выше для штаммов Y-3600 и Y-3601.

Как видно из Рисунка 17, активность клеточно-связанной липазы штамма Y-3592 была наибольшей на 5 сутки ферментации и составляла 16300 ед/г сухого веса. Культура дорастала до 40 г сухого веса/л, а активность секретируемой липазы была 550 ед/мл.

Рис. 17 Ферментация штамма У-3592, продуцирующего липазу 1лр2, закреплённую на поверхности клеточной стенки с помощью С-домена У1сшр1

Штамм У-3593 продуцировал клеточно-связанную липазу с активностью 18800 ед/г сухого веса на 5 сутки ферментации, в культуральной жидкости при этом обнаружено 670 ед/мл липазной активности, а биомасса составляет 43 г сухого веса/л (Рис. 18).

¡' л

1 п 20000,

1 5

1 С 18000

1 >5

1 о 16000

1 X

, «о •514000

1 К и

1 СО 1 О § 12000

! § ' т >10000

0 1 8000 о 6000-

л

н 4000-

1 о

[ т 2000-

1 5

. 6

: <

1

О Активность клеточно-связанной липазы О Активность секретируемой липазы □ Биомасса

100 90

го 5;

70 I

О

60 ^; 50 о I

X ,

40 п:

п

зо 2 20 10 о

60 80 100 Время (ч)

Рис. 18 Ферментация штамма У-3593, продуцирующего липазу Ыр2, закреплённую на поверхности клеточной стенки с помощью С-домена У1с\урЗ

Активность клеточно-связанной липазы штамма У-3594 достигала наибольшего уровня также на 5 сутки ферментации - 17700 ед/г сухого веса. Секретируемая липазная активность составляла 630 ед/мл и биомасса - 38 г сухого веса/л (Рис. 19).

О Активность клеточно-связанной липазы О Активность секретируемой липазы □ Биомасса

60 80 100 Время (ч)

1000

900 >

800 | а ; 700 ! °

м ¡г 600 £ *

500 а | те

400 | х З-о

- 300 | 200 100

160

100 90 80

Ш

70 й

О

60^ 50

Ж

40 5 о

30 ~ 20 10 о

Рис. 19 Ферментация штамма У-3594, продуцирующего липазу Ыр2, закреплённую на поверхности клеточной стенки с помощью С-домена У!с\ур6

Несмотря на наблюдаемый высокий уровень активности клеточно-связанной липазы, закреплённой с помощью С-доменов У1сир I, У1с\урЗ и У1с\\р6 (экспонирование 1-1,2х106 молекул/клетку), только 55-60% ферментной активности обнаружено в ассоциированной с клетками форме. Данный результат, кажется, неожиданным, так как использование С-доменов с сайтами прикрепления гликозилфосфатидилинозитола позволяет белку прочно ковалентно связываться с гликанами клеточной стенки. Связь данного белкового комплекса и клеточной стенки стабильна при действии горячих растворов щелочей, 808 и р-меркаптоэтанола и разрушается только при действии таких ферментов как гликозидазы. Белковый электрофорез в разделяющем геле культуральной жидкости показал, что белок, секретируемый в среду, обладает массой меньшей, чем размер ожидаемого рекомбинантного комплекса (данные не показаны). Из этого мы можем предположить, что данная секреция может быть результатом литической активности неких протеаз У. Иро1у!1са.

Проведение ферментаций отобранных штаммов У-3600 и У-3601, а также У-3592, У-3593 и У-3594, продуцирующих клеточно-связанную липазу, закреплённую с помощью У1Рн1 и М-домена Р1о1р гомолога, а также С-доменов У1с\ур1, У1сирЗ, У1с\ур6, показало существование общих тенденций. Так рост культуры характеризовался затянутой логарифмической фазой, штаммы достигали стационара в среде УЫВБО только на 5 сутки культивирования (Рис. 12,13,17-19). Максимум продукции липазы также приходился на этот период, что может быть объяснено наибольшим уровнем экспрессии промотора Ир4с1 в конце логарифмической - начале стационарной фазы роста

Изучаемые способы иммобилизации на поверхности клеток (с помощью Л- и С-концевого закрепления) были успешно применены для экспозиции липазы. Добавление аминокислотных последовательностей белка У1Рп1 и С-доменов У1с\ур1, У1си'рЗ, У1с\\р6 к липазе 1лр2 позволило получить штаммы с высокой активностью клеточно-связанной липазы, сравнимой с активностью фермента, секретируемого штаммом-продуцентом липазы У-3260 (1200 ед/мл; 0,1г/л), атакже мировому аналогу продуцента липазы на базе дрожжей У. Иро1уИса. В дополнение, полученные данные примерно в 70 раз превосходят лучшие опубликованные в литературе результаты по иммобилизации липазы на поверхности клеточной стенки дрожжей.

Однако, несмотря на такой высокий уровень активности клеточно-связанной липазы, в большинстве случаев значительная часть активности фермента обнаружена и в среде культивирования. Необходимо проведение дальнейших исследований с целью изучения секреции полученных рекомбинантных комплексов.

5. Изучение термостабильности клеточно-связанной липазы

Для изучения термостабильности клеточно-связанной липазы были выбраны штаммы У-3600 и У-3593, на поверхности которых фермент закреплён с помощью белка клеточной стенки У1Р1г1 и С-домена предполагаемого гликопротеина У1с\\рЗ. Клетки дрожжей ресуспензировали в 50 мМ Трис-НС1 буфере (рН 8.0) и инкубировали при 45"С на протяжении 1-6 часов. Остаточную липазную активность измеряли каждый час спектрофотометрически по гидролизу п-нитрофенилбутирата. В качестве контроля использовали секретируемую липазу, продуцируемую штаммом У-3260. Сравнение термостабильности клеточно-связанной и свободной форм липазы показало, что иммобилизация на поверхности клетки приводит к значительному повышению данного свойства фермента (Рис.20). Клеточно-связанная липаза сохраняет около 98-100% активности при инкубации на протяжении 1 часа и 57% после 6 часов, тогда как остаточная активность свободной липазы спустя 1 час составляет 66%, а после 6 часов инкубации фермент полностью теряет свою активность.

Рис. 20 Сравнение термостабильности клеточно-связанной липазы, иммобилизованной с помощью У1Р1'г1, а также С-домена У1с\\рЗ, и свободной секретируемой липазы

6. Получение клеток-биокаталтаторов и изучение их стабильности

Штаммы У-3600 и У-3593 были использованы в качестве примера для получения клеток-биокатализаторов. Для этого культуры дрожжей растили в среде \ТЧВОО на протяжении 5 суток, клетки осаждали центрифугированием, дважды промывали водой и лиофилизировали. Следует отметить, что экспонированная на клетках липаза сохраняет активность после лиофилизации (Таблица 1).

Для определения стабильности полученных клеток-биокатализаторов с иммобилизованной липазой лиофилизированные клетки ресуспензировали в 50мМ Трис-НС1 буфера (рН 8.0) и измеряли активность фермента. Далее клетки осаждали центрифугированием, отделяли супернатант, ресуспензировали в Трис-НС1 буфере и опять измеряли активность клеточно-связанной липазы. Эту процедуру осаждения и ресуспензирования клеток проводили ещё один раз и в третий раз измеряли активность фермента. Таким образом, был смоделирован процесс повторного трёхкратного использования клеток-биокатализаторов для реакции гидролиза. Из Таблицы 1 видно, что после трёх раундов использования лиофилизированные клетки штаммов У-3600 и У-3593 сохраняют 86% и 98% от начальной активности, соответственно. Следует отметить, что, по литературным данным, после трёх раундов использования для реакции гидролиза липазы К Иро1уИса, иммобилизованной на носителях хитозане и алыинате, сохраняется только 35% и 30% от начальной активности.

Таблица 1. Сравнение активности клеточно-связанной липазы до и после лиофилизации; повторное использование лиофилизированных клеток для реакции гидролиза

Штамм Активность клеточно-связанной липазы до лиофилизации (ед/г сухого веса) Активность клеточно-связанной липазы после лиофилизации (ед/г сухого веса) Повторное использование Остаточная активность, %

1 раунд 2 раунд 3 раунд

У-3600 17000 ± 800 15900 ±700 100 93 86

У-3593 18785 ±1130 18900 ±1000 100 99 98

Подводя итог, можно заключить, разработанные подходы позволили получить штаммы-продуценты клеточно-связанной липазы, что предполагает возможность разработки новых технологий ферментативного катализа на их основе.

выводы

1. В дрожжах У. Иро1упса на примере липазы Ыр2 разработаны основные способы экспонирования белков на поверхности клетки - М-концевой способ иммобилизации и прикрепление с помощью С-доменов гликопротеинов клеточной стенки.

2. Выявлены ранее не охарактеризованные белки клеточной стенки, аминокислотные последовательности которых были успешно использованы для экспозиции липазы на поверхности клеток.

3. Было показано, что все изучаемые фрагменты белков клеточной стенки способны закреплять липазу на поверхности клеток. Однако разные белки клеточной стенки позволяют получить разные наблюдаемые активности клеточно-связанного фермента.

4. Было продемонстрировано, что липаза, иммобилизованная на поверхности клеток с помощью М- и С-концевого способов закрепления, обладает значительно более высокой термостабильностью, чем свободная форма.

5. Впервые были получены штаммы-продуценты клеточно-связанной липазы, продуктивность которых сравнима с продуктивностью промышленно-значимых штаммов У. Иро1уИса продуцентов секретируемой формы липазы.

Список публикаций по теме диссертации

1. Синеокий С.П., Юзбашев Т.В., Лаптев И.А., Юзбашева Е.Ю., Выборная Т.В.. Соболевская Т.И. Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцент липазы. Патент РФ №2355754. Дата приоритета 25.12.2007.

2. Юзбашева Е.Ю., Юзбашев Т.В., Лаптев И.А., Ларина A.C., Синеокий С.П. Генетическая конструкция для экспозиции белка на поверхности клеточной стенки дрожжей Yarrowia lipolytica. Заявка на Патент РФ №2010146280. Дата приоритета 13.11.2010.

3. Юзбашева Е.Ю., Юзбашев Т.В., Константинова Т.К., Лаптев И.А., Перковская Н.И., Синеокий С.П. Способность N- и С-доменов гомолога белка клеточной стенки Saccharomyces cerevisiae Flolp экспонировать липазу Lip2 на поверхности клеток дрожжей Yarrowia lipolytica. 2011. Биотехнология (Москва), т. 1, стр. 23-29.

4. Тихонова Е.Ю. (Юзбашева Е.Ю.), Синеокий С.П. Разработка эффективных продуцентов липаз. 2007. Материалы международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», март 12-16, стр. 310.

Подписано в печать: 13.01.2011

Заказ № 4821 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11 -й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Юзбашева, Евгения Юрьевна

I. ВВЕДЕНИЕ.

1. Актуальность темы.

2. Цели и задачи работы.

3. Научная новизпа.

4. Практическая значимость.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Разработанные системы для экспонирования белков на поверхности клеточной стенки дрожжей.

1.1. Общая характеристика подхода.

1.2. Гликопротеины, ковалентно связанные с ß-1,б-гликанами клеточной стенки, и С-концевой способ закрепления белков на поверхности клеток дрожжей.

1.3. N-концевой способ иммобилизации белков на поверхности клеточной стенки.

2. промышленно-ценный фермент липаза.

3. Существующие подходы к экспонированию липаз на поверхности клеточной стенки дрожжей.

4. аскомицетные дрожжи yarrowia lipolyt1ca.

5. Белки клеточной стенки и иммобилизация на поверхности клеток дрожжей

Y. lipolytica.

III. МАТЕРИАЛЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Штаммы, среды и условия культивирования.

2. Выявление новых потенциальных белков клеточной стенки к lipolytica.

2.1. Выявление гомологов белка клеточной стенки дрожжей Y. lipolytica Ylcwpl.

2.2. Выявление ближайшего гомолога белка клеточной стенки S. cerevisiae Flolp в дрожжах Y. lipolytica.

3. Конструкция экспрессионных векторов.

3.1. Создание вектора для суперэкспрессии липазы Lip2.

3.2. Конструкция вектора для in vivo иммобилизации красного флуоресцентного белка с помощью белка клеточной стенки YlPirl.

3.3. Конструкция вектора для in vivo иммобилизации липазы Lip2 с помощью белка клеточной стенки YlPirl.

3.4. Конструкция вектора для in vivo иммобилизации липазы Lip2 с помощью N-домена предполагаемого гликопротеина клеточной стенки YALI0C09031p.

3.5. Создание векторов для in vivo иммобилизации липазы Lip2 с помощью С-доменов гликопротеинов клеточной стенки.

4. Методы генетической трансформации дрожжей.

5. Микроскопия штамма с экспонированным на поверхности клеточной стенки красным флуоресцентным белком.

6. Ферментация штаммов, продуцирующих липазу.

7. Измерение липазной активности.

8. Определение термостабильности свободной и иммобилизованной на клетках липазы.

9. Получение клеток-биокатализаторов и изучение стабильности закреплённой на их поверхности липазы.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Экспонирование красного флуоресцентного белка TurboFP635 на поверхности клеток дрожжей Y. lipolyt1ca.

2. Получение штамма-продуцента секретируемой липазы Lip2.

3. Экспонирование липазы Lip2 на поверхности клеточной стенки дрожжей

Y. lipolytica с помощью N-концевого способа закрепления.

3.1. Скрининг полученных трансформантов.

3.2. Ферментация отобранных штаммов.

4. экспонирование липазы Lip2 на поверхности клеточной стенки дрожжей

Y. lipolytica с помощью С-доменов белков клеточной стенки.

4.1. Скрининг полученных трансформантов.

4.2. Ферментация отобранных штаммов.

5. Изучение термостабильности клеточно-связанной липазы.

6. Получение клеток-биокатализаторов и изучение стабильности закреплённой на их поверхности липазы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка эффективных систем экспонирования белков на поверхности клеточной стенки дрожжей Yarrowia lipolytica для создания продуцента клеточно-связанной липазы"

1. Актуальность темы

В век высоких технологий человечество стремится заменить энергоёмкие и вредные для окружающей среды производства процессами, использующими потенциал природы. В то время как человечество делает свои первые шаги, создавая наноматериалы, живая клетка уже давно имеет их в ассортименте. Белки — природные молекулы нанометровой величины, которые выполняют в клетке все необходимые функции, начиная от структурной и заканчивая транспортной и каталитической.

Всё большее число современных производителей переходит на использование ферментов в качестве катализаторов, имеющих ряд преимуществ по сравнению с химическим синтезом. Ферментативные реакции отличаются стереоспецифичностыо, не требуют высоких температур, и, что более важно, не образуют не встречающихся в природе вредных побочных продуктов - ксенобиотиков.

Однако производство ферментных препаратов представляет собой сложный процесс, включающий дорогостоящий этап очистки. Для возможности оптимизации свойств и повторного использования ферменты часто наносят на специальные носители (иммобилизация ферментов), что является одним из вариантов использования иммобилизованных на носителях белков.

В научной и прикладной литературе в последнее время все большее внимание привлекает к себе перспектива закрепления белков на поверхности клеток микроорганизмов (Lee et al. 2003). Иммобилизация ферментов in vivo имеет ряд преимуществ по сравнению с иммобилизацией на сорбентах. Фермент, продуцируемый клеткой, оказывается связанным с ней сразу после транспортировки его наружу, что сводит трудоемкий процесс очистки белка к простому отделению клеток фильтрацией. Более того, отпадает необходимость как в связывании фермента с сорбентом, так и в сорбенте как таковом. Таким образом, получение клеток-биокатализаторов с экспонированными на поверхности клеток ферментами открывает перспективу новых технологических решений для производственных нужд.

Помимо этого, необходимо отметить, что in vivo иммобилизация представляет собой интерес не только для создания клеточных биокатализаторов с закреплёнными на поверхности ферментами. Во-первых, на поверхности клетки рационально вести процессы биотрансформации, особенно если субстрат или продукт реакции являются токсичными* для клетки. Во-вторых, можно моделировать проведение нескольких последовательных реакций, закрепив на клетке катализирующие их ферменты. В-третьих, взаимодействие белков на поверхности клеточной стенки происходит в пределах тонкого слоя, что предоставляет возможность сборки полимерных белковых структур образующих мономолекулярный слой. Так как, полифункциональность белковых молекул позволяет им взаимодействовать с молекулами как биологического, так и синтетического происхождения, разумно предположить, что дальнейшее развитие данного направления исследований позволит использовать клеточную стенку в качестве платформы для сборки надмолекулярных полимерных структур разнообразной химической природы.

Исходя из этого, перед нами была поставлена задача, заключающаяся в поиске подходов для эффективного экспонирования белков на поверхности клеточной стенки микроорганизмов. В качестве перспективного объекта нами были выбраны дрожжи Yarrowia lipolytica, как реципиент с высоким потенциалом экспрессии и секреции рекомбинантных белков, в качестве модельного белка липаза Y. lipolytica Lip2.

2. Цели и задачи работы

Данная работа посвящена разработке систем для эффективного экспонирования белков на поверхности клеточной стенки дрожжей Y. lipolytica.

В связи с этим ставились следующие задачи:

1. Анализ генома дрожжей Y. lipolytica для выявления ранее не охарактеризованных предполагаемых белков клеточной стенки, пригодных для экспонирования белков на поверхности клетки.

2. Изучение способности ранее охарактеризованного белка клеточной стенки Y. lipolytica YIP ir 1 закреплять белки на поверхности клетки на примере красного флуоресцентного белка.

3. Изучение основных способов экспонирования белков на поверхности клеточной стенки для in vivo иммобилизации липазы Y. lipolytica Lip2. Сравнение способности раннее охарактеризованных и найденных предполагаемых белков клеточной стенки закреплять липазу на поверхности клеток дрожжей.

4. Изучение свойств клеточно-связанной липазы.

5. Получение штаммов-продуцентов клеточно-связанной липазы.

3. Научная новизна

В работе разработаны подходы для экспонирования белков на поверхности клеточной стенки дрожжей Y. lipolytica. Посредством анализа генома найден ряд новых предполагаемых белков клеточной стенки. Было показано, что добавление их аминокислотной последовательности к аминокислотной последовательности экспрессируемого белка приводит к эффективному закреплению полученного рекомбинантного комплекса на поверхности клетки. В качестве модельного белка для иммобилизации был выбран фермент липаза. До настоящего времени множество попыток получить клеточно-связанную липазу как в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, так и в Pichia pastoris приводили к созданию штаммов с очень низкой активностью иммобилизованного фермента (Liu et al. 2010b; Suet al. 2010).

В представленной работе были изучены два» основных способа экспонированиям липазы. В первом случае закрепление осуществлялось с помощью С-концевых участков (доменов) белков клеточной стенки, обладающих сигналом прикрепления гликозилфосфатидилинозитола (GPI), что обусловливает ковалентное связывание с р-1,6-гликанами клеточной стенки (Kapteyn et al. 1999). Были проанализированы С-домены шести новых предполагаемых белков клеточной стенки, а также ранее охарактеризованного белка YlcwpT (Jaafar and Zueco 2004) на' способность экспонировать липазу Lip2 на- поверхности клетки. Второй способ — присоединение белка клеточной стенки или его N-домена к N-концу фермента. Белок YIPirl, который связывается через дисульфидные мостики с гликопротеинами клеточной стенки (Jaafar et al. 2003), а также N-домен потенциального гликопротеина YALI0C09031p, участвующего в адгезии, впервые были использованы для изучения второго способа экспонирования липазы. Следует отметить, что- проведённое исследование позволило выбрать лучшую систему для микробиологической иммобилизации in vivo. Полученные штаммы обладают высокой активностью клеточно-связанной липазы, варьирующей от 3200 до* 18800 ед/г сухого веса, в зависимости от используемой для иммобилизации* аминокислотной последовательности белков клеточной стенки.

4. Практическая значимость 4 Иммобилизация ферментов на поверхности клеток микроорганизмов является одним из приоритетных направлений современной биотехнологии.

Данный способ закрепления фермента обладает всеми преимуществами стандартной иммобилизации на носителях — возможность повторного использования, в ряде случаев повышенная термостабильность фермента. Однако экспонирование на поверхности клеточной стенки является природным вариантом иммобилизации, при этом отпадает наиболее затратные стадии в производстве ферментных препаратов — очистка фермента и связывание его с сорбентом. Сама клетка выступает в данном случае в качестве носителя, поэтому приготовление препарата с иммобилизованным ферментом сводится только к отделению клеток фильтрацией после ферментации и (или) лиофилизации.

Липаза - фермент, относящийся к классу гидролаз, катализирует расщепление сложноэфирных связей в липидах. Чаще всего липазы используются для гидролиза молекулы« триацилглицеридов с образованием диглицеридов, моноглицеридов, жирных кислот и глицерина. Помимо этого, липаза способна катализировать.этерификацию и переэтерификацию. Такая многофункциональность делает липазу ; весьма привлекательной для практического использования в пищевой, фармацевтической, кожевенной, текстильной, косметической промышленностях, в производстве ПАВ и бумаги и других отраслях промышленности (Рапёеу & а1. 1999).

Закрепление такого промышленно-важного фермента как липаза на поверхности клеточной стенки дрожжей является актуальным направлением в современной биотехнологии. Однако, несмотря на большой интерес получения подобных клеток-биокатализаторов, достигаемые в настоящий момент уровни активности клеточно-связанной липазы недостаточно высоки для их промышленного применения.

В представленной работе разработаны системы, для эффективного экспонирования липазы 1лр2 на поверхности клеточной стенки дрожжей У. Иро1уйса. Получены штаммы, наибольшая активность клеточно-связанной липазы у которых составляет 18800 ед/г сухого веса, что соответствует экспонированию 1,2 х 106 молекул на поверхности каждой клетки. Достигнутые уровни сопоставимы с уровнем продукции секретируемого фермента штаммом-продуцентом липазы (примерно 0,1 г/л при ферментации в пробирках) (Синеокий и др. 2007) и в 70 раз превышают лучшие ранее опубликованные результаты (Tanino et al. 2009; Liu et al. 2010b; Su et al. 2010). Клеточно-связанная липаза обладает значительно более высокой термостабильностью, чем свободная форма фермента. Так, иммобилизованная на поверхности клеток липаза сохраняет 57% активности при инкубации на протяжении 6 часов при 45°С, а свободная липаза полностью теряет каталитическую активность в этих условиях. Полученные клетки-биокатализаторы с экспонированной на поверхности липазой сохраняют 86-98% активности после трёх повторных раундов использования, что в разы превосходит уровень остаточной активности фермента, иммобилизованного на сорбентах (Alloue et al. 2008).

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Юзбашева, Евгения Юрьевна

VI. выводы

Из проделанной работы можно сделать следующие выводы:

1. В дрожжах У. Иро1уИса на примере липазы 1лр2 разработаны основные способы экспонирования белков на поверхности клетки - Ы-концевой способ иммобилизации и прикрепление с помощью С-доменов гликопротеинов клеточной стенки.

2. Выявлены ранее не охарактеризованные белки клеточной стенки, аминокислотные последовательности которых были успешно использованы для экспозиции липазы на поверхности клеток.

3. Было показано, что все изучаемые фрагменты белков клеточной стенки способны закреплять липазу на поверхности клеток. Однако разные белки клеточной стенки позволяют получить разные наблюдаемые активности клеточно-связанного фермента.

4. Было продемонстрировано, что липаза, иммобилизованная на поверхности клеток с помощью К- и С-концевого способов закрепления, обладает значительно более высокой термостабильностью, чем свободная форма.

5. Впервые были получены штаммы-продуценты клеточно-связанной липазы, продуктивность которых сравнима с продуктивностью промышленно-значимых штаммов У. \ipolytica продуцентов секретируемой формы липазы.

У. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе на примере липазы Lip2 были изучены принципиально возможные варианты * экспонирования белков на поверхности клеточной стенки дрожжей Y. lipolytica. В качестве модельного белка была выбрана липаза, как, во-первых, высоко значимый фермент в промышленности и, во-вторых, фермент, активный центр которого расположен на С-конце молекулы, что значительно затрудняет использование наиболее изученного способа in vivo иммобилизации с помощью С-доменов гликопротеинов клеточной стенки. Следует отметить, что до настоящего момента не было получено штаммов с высокой активностью клеточно-связанной липазы (Su et al. 2010; Liu et al. 2010b).

Для N-концевого способа in vivo иммобилизации были выбраны аминокислотные последовательности белка клеточной стенки YlPirl (Jaafar et al. 2003) и N-домена выявленного гликопротеина клеточной стенки

YALI0C09031p, участвующего в процессе адгезии. Были получены i рекомбинантные белковые комплексы, в которых липаза Lip2 своим

N-концом присоединена к С-концам белка YlPirl и N-домена

YALI0C09031р. Наибольшая наблюдаемая активность клеточно-связанной липазы, закреплённой на поверхности клеток с помощью YlPirl и N-домена гликопротеина YALI0C09031р, составляла 17200 и 9200 ед/г сухого веса, соответственно.

Для изучения С-концевого способа in vivo иммобилизации сравнивали С-домены охарактеризованного гликопротеина клеточной стенки Ylcwpl (Jaafar and Zueco 2004) и шести новых выявленных белков Ylcwp2, Ylcwp3, Ylcwp4, Ylcwp5, Ylcwpó и YALI0C09031p. Были получены рекомбинантные белковые комплексы, состоящие из липазы, к С-концу которой присоединены своим N-концом С-домены изучаемых гликопротеинов клеточной стенки. Для разделения функциональных полипептидов в иммобилизованном ферменте (липазы и С-домена) использовали аминокислотный глицин-сериновый мотив (Washida et al. 2001). В зависимости от используемого белка клеточной стенки наибольшие активности клеточно-связанной липазы варьировали от 3200 ед/г сухого веса (при закреплении с помощью С-домена YALI0C09031p) до 18800 ед/г сухого веса (при экспозиции с помощью С-домена Ylcwp3). Лучшими вариантами для in vivo иммобилизации липазы оказались С-домены гликопротеинов Ylcwpl, Ylcwp3 и Ylcwpó, позволившие получить клеточно-связанный фермент с наибольшей наблюдаемой активностью.

Сравнение термостабильности клеточно-связанной липазы, иммобилизованной как N-, так и С-концевым способами, со свободной формой фермента показало, что экспонирование на поверхности клеточной стенки значительно повышает данное свойство. После 6 часов инкубации при 45°С клеточно-связанная липаза сохраняет 57% от начальной активности, тогда как секретируемый фермент полностью теряет свою каталитическую активность.

Липазная активность, ассоциированная с клетками, сохраняется на прежнем уровне после процесса лиофилизации клеток. Полученные таким образом клетки могут быть повторно использованы в качестве клеточных биокатализаторов. Было показано, что после трёх раундов использования данных клеток-биокатализаторов для процесса гидролиза остаётся 86-98% активности фермента. По литературным данным известно, что в аналогичных условиях липаза, иммобилизованная на нерастворимых носителях, сохраняет только 30-35% от начального уровня активности.

Таким образом, в работе было продемонстрировано, что оба способа иммобилизации (N- и С-концевые) могут быть эффективно использованы для экспонирования липазы на поверхности клеток Y. lipolytica. Однако наибольшие наблюдаемые значения активности клеточно-связанного фермента варьировали в зависимости от используемого белка клеточной стенки. Продуктивность штаммов, в которых липаза закреплена на поверхности клеточной стенки с помощью белка YlPirl и С-доменов Ylcwpl,

У1с\урЗ и У1слур6, сравнима с продуктивностью отечественного и мирового штаммов-продуцентов секретируемой липазы на базе дрожжей V. Иро1уйса (Синеокий и др. 2007; №саис1 е! а1. 2002). Повышенная термостабильность и высокая активность клеточно-связанной липазы, а также возможность эффективно повторно использовать полученные клеточные биокатализаторы открывают перспективы для промышленного использования данных штаммов и разработки новых технологических подходов на их основе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Юзбашева, Евгения Юрьевна, Москва

1. Bankar AV, Kumar. All, Zinjarde SS (2009)- Environmental and industrial applications of Yarrowialipolytica. Appl Microbiol- Biotechnol 84 (5):847-' : 865

2. Barth G, Gaillardin C (1997) Physiology and; genetics of the dimorphic fungus

3. Yarrowia lipolytica. EEMSiMicrobibl Rev 19 (4):219-237 Bidard F, Bony M,. Blondin B, Dequin S, Barre P (1995)= The Saccharomyces cerevisiaeFL0I flbccuLatiomgene:encodes:-fdr. a cell?surface^protein: Yeast 11 (9):809-822 , •

4. Hanefeld U, Gardossi L, Magner E (2009) Understanding enzyme immobilisation.

5. Chem Soc Rev 38 (2):453-468 Hardwick KG, Boothroyd JC, Rudner AD, Pelham HR (1992) Genes that allow yeast cells to grow in the absence of the HDEL receptor. Embo J 11 (11):4187-4195

6. Hernandez-Martin E, Otero C (2008) Different enzyme requirements for the synthesis of biodiesel: Novozym 435 and Lipozyme TL IM. Bioresour Technol 99 (2):277-286 ,

7. Kapteyn JC, Van Den Ende H, Klis FM (1999) The contribution of cell wall proteins to the organization of the yeast cell wall. Biochim Biophys Acta 1426 (2):373-383

8. Klis FM (1994) Review: cell wall assembly in yeast. Yeast 10 (7):851-869

9. Kopecny D, Pethe C, Sebela M, Houba-Herin N, Madzak C, Majira A, Laloue M (2005) High-level expression and characterization- of Zea mays cytokinin oxidase/dehydrogenase in Yarrowia lipolytica. Biochimie 87 (11): 10111022

10. CF, Kurjan J, Lipke PN (1994) A pathway for cell wall anchorage of Saccharomyces cerevisiae alpha-agglutinin. Mol Cell Biol 14 (7):4825-4833

11. Madzak C, Gaillardin C, Beckerich JM (2004) Heterologous protein expression and secretion in the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica: a review. J Biotechnol 109 (l-2):63-81

12. Murai T, Ueda M, Kawaguchi T, Arai M, Tanaka A (1998) Assimilation of cellooligosaccharides by a cell surface-engineered yeast expressing beta-glucosidase and carboxymethylcellulase from aspergillus aculeatus. Appl Environ Microbiol 64 (12):4857-4861

13. Pignede G, Wang H, Eudalej F, Gaillardin C, Seman M, Nicaud JM (2000) Characterization of an extracellular lipase encoded by LIP2 in Yarrowia lipolytica. J Bacteriol 182 (10):2802-2810 • v

14. Ramon AM, Montero M, Sentandreu R, Valentin E (1999) Yarrowia lipolytica cell wall« architecture: interaction of Ywpl, a mycelial protein; with other wall components and the effect of its depletion. Res Microbiol 150 (2):95-103«

15. SubcellBiochem<26:165-185 Sambrook J, Maniatis T, Fritsch E (1989) Molecular cloning: a laboratory manual.