Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Множественные молекулярные формы рибофлавинкиназы у дрожжей

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Множественные молекулярные формы рибофлавинкиназы у дрожжей"

^ л

г4

Нац1ональна Академ1я наук Укра1ни В1дц1лення регуляторних систем кл1тини Гиституту 61ох1м11 1м. 0. В. Паллад1на

На правах рухопису

ФШРк ЛЙБОВ РОМАН1ВНА

КН0ХИНН1 М0ЛЕКУЛЯРН1 ФОРМИ РИБОФЛШШНАЗИ У ДР1КДК1В

03.00.04 - 61ох1м1я

АВТОРЕФЕРАТ дисертацП на здобугтя вченого ступеня кандидата б!олог1чних наук

Льв1в - 1997

Дисертац1ею е рукопис

Робота виконана у в!дд1л1 б!ох1м1чно1 генетики В1дд1лення регуляторних систем кл1тини 1нстатуту CioxiMil 1м.0.В.Паллад1на HAH Украгни

Науковий кер1вник - кандидат б!олог1чних наук

Кащенко В-С. 0ф1ц1йи1 опоненти - доктор б!олог1чних наук Стойка P.C.

кандидат б1олог!чшх наук, доцент Кучерас Р.В.

Пров1дна орган!зац1я - 1нститут м1кроб1олог11 та в!русолог1х

спец1ал1зовано1 Вчено! ради Д.04.13.01 при В1дд1ленн1 регуляторних систем юйтини 1нстатуту öioxiMÜ 1м.О.В.Паллад1на HAH Укра!-ки (290005. вул.Драгоманова, 14/16).

3 дисертац1ею мохна ознайомитись у 61бл1отец1 В1дд1лення регуляторних систем кл!тини 1нституту öioxiMil 1м„0.В.Паллад1на HAH Укра1нн.

Автореферат роз!сланий " ^ *. ^ 1997 р.

Вчений секретар

спец1агйзовано1 Вчено!

1м. Д.К.Заболотного

Захист в!дбудеться 25 лютого 1997 року о 1(&год на зас!данн!

М.В.Гончар

ЗАГАЛЪНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Лтуальн1сть проблеш. Особливе значения у метабол!зм! кл1тинн мають флав1нов1кофериента FNN i FAD. якi входять до складу ба-гатьох окисно-в!дновних б1олог!чних катал!затор1в - флавопроте!-híb. Флав1нов1 коферненти утворюються з рибофлав!ну (в!там!ну Вг).0станн!м часом досягнут1 значн! ycnixn у досл1дхенн! б!осин-тезу рибофлав!ну (РФ) у м!кроорган!зм!в. що привели до створення продуцентов цього в1тан!ну. У той самий час б!осинтез флав!нових кофермент!в вивчений недостатньо 1 це перешкоджае створению теоретично! концепц! i координацИ синтезу апофермент!в i кофермент!в у м!хроорган!зм!в. Тону досл1даення Фермент1в. цо катал!зують ре-акц!! синтезу флав1нових нуклеотнд1в, е вахливоя проблемою сучас-

HOÍ ÓiOXlMlí.

Першу реахц1» перетворення РФ до жоферментних форм катал!зуе РФ-к!наза - фермент, який фосфорилюе РФ з утворенням FMH. Хоча РФ-к1наза описана у деяких м1кроорган1зм1в. проте не описан! мно-жинн! молехулярн1 фор»« цього ферменту, не отриман! його гоыоген-н1 препарата. в1дсути1 в1домост! про термостаб!льн! РФ-к!нази.

1нтерес до досл1дження РФ-к1нази 1 иожливост! II використан-ня в б!отехнолог!чному процес! отримаиня FHM пом!тно зр!с п!сля публ!кац1! даних про неспроможн!сть отримати чистий РФ-5' -фосфат за допомогою xiHi'&oro синтезу.

Мета та заедания досМдхення. Метою робота було вивчити процес фосфорилювання РФ у др!жд*!в та можлив!сть використання !ммобШ-зовано! РФ-к!нази для отримаиня чистих препарат!в FMH. Для досягнения поставлено! мети у робот! ставили так! ochobhí завдання: -досл1дити термо!нактивац1» РФ-к!нази у безкл!тинних екстрактах др1*дх1в Pichla guillienaondll:

-розробити метода розд!лення та очистки виявлених форм РФ-к!нази та вивчити IX властивост1:

-досл1дити субстратну специф1чн1сть диг!дро-РФ-к1нази i РФ-к!нази до ряду структурних аналог1в РФ;

-вивчити наявн1сть множннних молекуляряих форм РФ-к1нази у р1зних м1кроорган!зм1в;

-досл!дити мохлив1 механ1зми регуляцИ синтезу виявлених форм РФ-к1нази у др!ад*ов!й kjiíthhí;

-отримати !ммоб!л!зован! препарата др!жджово! РФ-к!иази, вивчити !х властивост!. а також иожливост! використання у процес! фермен-

- г -

тативного синтезу FHH.

Наукова новизна робот. Вперше показано, що у др!ждж!в процес фосфоршповання РФ е складаим i катал!зуеться двома суггево в!д-м1нними за сво1ми властивостями ферментами - РФ-к1назою та диг!д-ро-РФ-к!назок>. Множинн! молекулярн1 форми РФ-к!нази виявлен! у деяких представник!в р!зних систематичних груп м1кроорган1зм!в. Наукоео-пршапцчне значения. ДослШення фермент1в, що синтезують флав!нов! нуклеотиди, е важливим з точки зору фундаментально! науки. оск!льки законом!рносг1 б!осинтезу FMN i FAD у м!кроорган1з-м!в вивчен! недостатньо. 3' ясуваиня механ!зм!в синтезу флав1нових кофермент!в е необх!даою умовога для створення продуценте кофер-ментних форм в1там1ну Вг.. Розробка иетод!в !ммоб!л!зац!1 РФ-к1на-зи, отримання нерозчинних препарат!в ферменту та досл1даення 1х властивостей може бути використане б!отехнолог!чною промислов1стю для Ферментативного синтезу FKH. Основн1 положения, "ях! ешюсяться на захисто.

1.У др!хд*1в. на в!ди1ну в1д 1снуючих ран1ше уявлень, процес фосфорилювання РФ е складаим i катал!зуеться двома суттево в!дм!нни-ми за своами властивостями ферментами - РФ-к1назою та даг1д-ро-РФ-к!назою.

2.Множинн! молекулярн! форми РФ-к1нази виявлен! у представник!в м1крооргандзм!в р!знихсистематичних груп.

3.1ммоб!л!зоваиа шляхом включения до структура пол!акрилам!дного гелю РФ-к1наза иоже бути викормстана в реакторах пер1одичного i неперервного типу д!1 для отримання лрепарат!в FMN високого ступени чистота.

Ипробац1я робопм.Матер1али дисертац!! допов!далися !'обговорюва-лися на IV Всесо»зн!й конференцИ "Биосинтез ферментов микроорганизмами " (Ташкент.1988). VI з!зд! Украхнського м!кроб!олог1чного товариства (Ки1в,1Э89), Всесоюзн1й конференцИ "Проблемы микробного синтеза витаминов и их производных " (Ташкент.1990). Всесо-юзн1й конференцИ "Методы получения, анализа и применения ферментов" (Рига. 3990), 15 Шзшародному симжтум! по др1ждаах (Рига. 1991). 7 Всесоюзному сиипоз1ум1 "Инженерная энзимология" (Москва.1991). 6 Свропейському конгрес1 по б1отехнолог!1(Флорен-ц1я.1993). 35 1нтернац1ональному конгрес! по прикладной xiMil (IUPAC) (Стамбул.1995).

Пи5л1ксцгг. Оснозк! результата досл!джень представлен! в 11 дру-ылакнх працях.

Структура ma об' ем робот: Дисертац1я складаеться з вступу, огля-ду л1тератури. опису матер!ал!в i метод!в досл!дкеиь, викладення резульгат!в досл!джень га 1х обговорення. висновк1в 1 списку л!~ тератури (200 першодхерел). Робота викладена на стор1нках друковаяого тексту, 1люстроваиа 44 рисунками i 17 таблицями.

МАТЕР1АЛИ I МЕТОДИ ДОСЛШЕНЬ

У робот1 використовували: - др1ждж! Saccharomyces cerevislae раса Xll.S.cerevisiae K1V-U16, S.cerevislae 71В-1122. S.bayanus EC-1118, Kluyveromyces lactis. Candida faraata BKM 18, Candida pseudotroplcales, параф1нутил1зуюч1 дpiжджi Pichia guillienrondii ATCC 9058, Candida naltosa В СБ 774, штамп метанолзасвоюючих др!ждж1в Hansenala polymorpha BKIM Y-201, H.polymorpha ML9, Candida.boidinii T2A, Pichia pinus 1031:

- бактерП Escherichia coll K-12, ауксотрофн! по РФ штами Bacillus subtills ВКПМ B-5101. Bacillus subtilis R-32:

- актином!цети Streptomyces llvidans T2. Sacharopolyspora erythraea Tl;

- гриби Erenotheclum ashbyii 1906 - продуцент РФ, Penicilllum vltale - продуцент глюкозооксидази.

М1кроорган1зми культивували на в1дпов1дних середовищах [Burkholder. 1943:Splzizen,1958:Yagi.1956]. Безкл1тинн1'екстракти отримували руйнуванням кл!тин за допомогою бал1стичного методу. Концентрац1в б!лка у препаратах визначали за методом Lowry 1 1н.[19513.

Активн1сть РФ-к1нази визначали за методом Кащенка та iH.[1976]. Визначення активност! РФ-к1нази по в1дношенню до ди-г!дро-РФ проводили за моди^кованим методом [Kearney et al., 1979). Активи1сть FAD-синтетази визначали за методом Schrecker i Kornberg [1950]. Активн1сть лужно! фосфатази визначали за но дисковании методом Струговщиково! га 1и.11973].

Фракц1онування безкл1тинних екстракт1в сульфатом амон!к> та орган!чними розчинниками зд1Яснивали за загальноприйнятими методиками [Скоупс,1995]. Гель-хроматограф1м безкл!тинного екстракту проводили на колонках, наповнених сефадексаш G-25, G-75, G-100. Для ЮнообмГнно! хроматограф1£ використовували СМ-сефадекс С-50. а для аф1нно! - сини сефарозу CL-6B (Pharmacia. Пвец1я).

Вертикальний електрофорез за неденагуруючих умов проводили на пластинах у 1% пол!акрилам1дному гел! (ПААГ) у тр1с-гл!циново-

му буфер1. pH 8,3 при температур1 4° С протягом 4 год при напруз1 200В.Електрофорез у присутност! 0,1* DS-Na проводили в 15% ПААГ у тр1с-гл1цииовому буфер! pH 8,3 за методом Лемл1 [19701.

Молекулярну масу ферменПв визначали методом гель-ф!льтрац!х на сефадекс! С-75 [Детерман.1970] i електрофорезу в 15% ПААГ tLaemraly,1970].

1ммоб!л!зац!ю РФ-к!нази ыляхом ii включения до структури ПААГ проводили при концентрацП ионоиер1в в гел! в!д 10-20% та в!д-носн1й концентрацП б!с-акрилам!ду в1д 2 до

Константи Ы!хаел!са (Км) визначали за методе») Llneweaver 1 Burk [1934]. Енерг1ю активацИ реакц11 фосфорилюваяня РФ визначали за величиною кута нахилу прямо! на граф1ку залежноет! швидкос-т1 синтезу FMH в1д температур« [Диксон. Уебб, 1982]. Константу швидкост! термо!нактивацИ (К1я) визначали граф!чно за кутом нахилу кривих заледаост! In Vo/V в1д тривалост! пре!нкубац!х ферменту. Енерг1ю активацИ процесу 1нактивац1х (Еа*) розраховували граф!чно за кутои нахилу прямих зале*ност1 1пК1н в1д оберненох величини температуря 1/Г. Розрахунок термодинам1чних параметр!в активацИ процесу теплово! 1нактивац11 ферменту проводили на основ! отриманих величин К}|| за ран!ше описании методом Шерезин.1976].

константу швидкост! процесу 1нактивац11, операц!йну стаб!ль-н1сть РФ-к1нази п1д час роботи реактора безперервнох д!х. а такох п!впер!од зберехення ахтиваост! розраховували за методом Варфоло-меева i Берез!на [1976]. Ефектнвн!сть 1ммобШзац11 оц1нювали за величиною ферментативное активност1 в к!нц! процесу. Цей по-казник вирахали як процентне сп1вв!даошення к!лькост1 ферменту, що зв'язався з нос!ем. до Bciei к1лькост! ферменту в препарат!, використаному для 1ммоб!л1зац1х.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОШДЯЕНЬ ТА 1Х ОБГОВОРЕННЯ 1.Вйявлення двох форм РФ-к!нази у др!жда!в Досл1джували прочее термо1нактивац!1 РФ-к!нази в безюитин-них екстрактах др!здк!в P.gullliermondii. На рис.1 наведен! KiHe-THSHi Kpiißi термо1нактивац!1 фермента при р!зних ф!ксованих температурах. Вирахуван! значения К;н для обидвох стад!й 1нактивацх1 Р^инази е суттево в1дм1нними (табл.1). Виходячи з ч!тко вираже-ного двохфззного характеру !нактивацхйних кривих припустили, ¡цо в клпняах цих др!ждж1в присутн! два фермента, що катал1зують реак-

ц1ю фосфорилзовання РФ. !йактивац!я яких описуеться в!дпов1дно швидкою 1 пов!льнсю стад1ями. На корисгь цього прнпущення св!д-чить в!дсутн!сть впливу субстрат!з (РФ i ATP), активаторio (Mg2*) та речовин б1лково! природа на двосгад1йний характер !нактивац!й-них кривих, а також агрегацИ чи автол!зу РФ-к!нази в процес! термо!нактивац!I.

Розрахован1 ефективн! активацШ! параметра процесу теплово! !нактивац!1 для двох Форм фермента також вказують на !снування двох форм РФ-к1нази (табл.2). На п1дстав! цих даних мохна стверд-жувати, цо 1нактквац1я двох форм РФ-к1назн в!дбуваеться за р!зни-

Рис.1. Нал!влогари£м!чн1 анаморфози залежлост! ак- 4,6 тивност! РФ-к!нази в!д о часу термо!нактивац!1 > *'2 безкл!тииного екстракту 5 3 , др!ждж!в P.guilliermondii при температурах 75°С (1). 3 4 80°С(2).85°С{3). 90°С (4).

3,0

2,6

Т~'—Г-Г-—5-Й-ГГТ?

Табл.1. Залеан!сть величини К1я в1д температур« для двох стад!й терио!нактивац!1 Р0-к1нази

Температура К, х 10* с-.*1

Швндха стад!я Пов!лы;а стад!я

75 82 7.2 ~

80 135 7.8

85 225 9.1

90 400 11.2

ми механ!змами [Юли, 1958) . цо, в свои чергу, могло саХдчитн про певн! в!дм!нност! у структур! термостаб1льного 1 термолаб!льного фермент!в.

При електрофорез! натавного безкл!тинного екстракту. попе-

редньо очищеного в!д низькомолекулярних речовин шляхом гель-ф!ль-трацЦ на сефадекс1 С-25, выявлено два в1дм!нних за електрофоре-тичною рухлив!стю компонента, цо волод1ють РФ-к1назною актнвн1стю (рис.2). "Швидкнй" РФ-к1назннй компонент в1дпов!дае термостаб1ль-н!й форм! ферменту. "пов1льний" - 1дентичний терыолаб!льн1й РФ-к1наз1.

Вивчення РФ-к1назно! активност! п!д час фосфорилювання окислено! 1 повн1стю в1дновлено! форми РФ (1,5-диг1дрорибофлав1ну) у

Табл.2. Акгивац1йн1 термодинам1чн1 параметри процесу термо-1нактивацП термостаб1льио! 1 териолаб1льно! РФ-к1наз

Форма рибофла-в!нк1нази Енгальп1я лН' кДк/моль Ент|0п1я Дх/моль К В1льна ене-рг1я ^1бса кДж/иоль Енерг1я активацП Ек кДж/моль

Стаб1льна 30.3 -241.0 114.3 33.2

Лаб1льна 109.6 30.3 98.8 112.5

Рис.2. Схема електрофореграми нативного 6езкл1тинного екстра-кту др}ждж!в Р.§иШегооп(111; о.ов активн!сть РФ-к1нази до (А) 1 п!сля (Б) термо1нактивац11. 0/04

0,08 0,04

Оезюйтикних екстрактах термо!нактивованих р1зн! промЛжки часу при 90'С показало, що на к!нетичн1й крив1й термо1нахтивац1! при эизначеш1 активност1 РФ-к1нази за диг!дро-РФ ч1тко вирахена лише по?.1льна ста. .я 1нактивацН ферменту.

Анал!з отрютшх результат!в дозволив зробити припущення. що терлостябЬина РФ-к1наза е 61льи спецнф!чна до даг1дро-РФ. тод1 як ■гер',.ола61лькиЯ фермент - до окислено! форми флав1нового субс-

J -г ■ Г 1

Б Л '

15 Й ТО ПЙГ

Номер фраки!1

трату. Виходячи !з субстратно! специф!чност!. термостаб1льну Фор иу ферменту мохна назвати диг!дро-РФ-к1назою.

2. Розд1лення та очистка РФ-к1нази та диг!дро-РФ-к!нази Досл1дасували мохлив!сть розд!лення та очистки терностаб!ль-но! i термолаб!льно! Форм РФ-к!нази за допомогсю р1зних метод1в. Ц!е! мети вдалося досягти при аф1нн!П хроматограф!! попередньо очищеного в!д низькомолекулярних речовин безкл!тинного екстракту на син!й сефароз! CL-6B. що н!стить у якост! л1ганд?. цибакрон си-н1й F3 GA. Найб!льш оптимальннй результат з розд1лення двох форм ферменту та !х компактн!й елюц!! був отриманий при град1ентн!й елюц!! АТР !з зм!ною швидкост! протоку елюента в друг!й стад!! десорбц!! (рис.ЗА).

Термо!нактивац1я проф!ли елюц!! показуе, що перший nix РФ-к!-назно! активност!. який вимиваеться при б!льи низьких значениях концентрацП АТР. в!доов!дае термолаб!льн!й форм! РФ-к!нази. Зб!льшення концентрац!! АТР в елкючому буфер! призводить до елк>-ц!! термостаб!льного ферменту.

При цьому Фракц!я термолаб!льно! РФ-к!нази проявллг бйпьиу активн!сть при фосфорилввани! РФ. Термостаб!льний фермент значно краще фосфорилюе диг!дро-РФ (риаЗБ). Необх!дно в1дзначити, що обидв1 форми ферменту здати1 в р!зп!й м!р! фосфорилювати як окислений. так i в!дновленкй флав!новий субстрат. У niKOBiix точках ферментативное активност1 на проф!л! елюц!! б!лк1в активн!сть термолаб!льно! РФ-к!нази по в!дноиенню до диг!дро-РФ складала 45-5055 в!д активност! по в!дноыешв до РФ. Здатн!сть термоста-б!льного ферменту фосфорилювати диг!дро-РФ на 30-35% перевищувала здатн!сть до фосфорнлювання окислено! форми РФ. Таким чином, метод аф!нно! хроматограф!! дозволю розд!лити да! форми ферменту та отримати високоахтивн! препарата РФ-к!гази (1.5 мЕ/.мг) 1 ди-г!дро-РФ-к!нази (0,9 мЕ/мг).

Результата гель-хроматограф!! безкл!тииного екстракту др!хд-ж!в P.gullliennondii на колонц! 1.5 х 120 см. заповнен!» сефадек-сом G-75, наведен! на рис.4А. При досл!даенн! здатпоет! глюйова-них б!лк!в фосфорилюзати диг1дро-РФ виявлено п1к ферментатшзио! активност!, який не сп!впадав з п!ком активност! РФ-к1нази.

3 метою зб!льиення розд!льно! здатиост! методу було викорис-тано поеднання нисх!дко! i висх!дао! гель-хроматограф!1 за допо-могов двох колонок (2 х 200 см), заповнених сефадексом G - 75. Як

видно з рис.4Б основн1 п1ки РФ-к1назно1 1 диг1дро-рф-к1назно! активностей в1дпов1длкть Илкам в!дпов1дно з б!львюю 1 ментою моле-кулярними масани.

Вклад активностей цих фермент!в у загальну РФ-к1назну актив-н1сть цитозолю складае 65-7ОХ для РФ-к1нази 1 30-35% для диг!д-ро-РФ-к!нази. Тод! як диг!дро-РФ-к1назна активн1сть цитозолю кл1-тини Р.^ППелюпШ ш 75-802 представлена активн!стм диг1д-ро-РФ-к!нази I 20-25* - активн1стю РФ-к1назн.

Молекулярн! маси Рф-к1назн 1 диг!дро-РФ-к1нази визначен! ме-

Р5>-к1нази Леля гель-ф1льтрац11 на сефадекс! С-25: А - активист:- у фракц1ях до (1) I п!сля (2) 1х прогр!вання при 80°С на прогяз! 3 хз. Б - ахтган1сть у фракц!ях за РФ (1) 1 за диэдре-РФ (2): концектраЩя б1лху (3). Стр1лкоа в!дм1чено зм!ну сгидкост! з 30 до 6 мл/год.

• - э -

толом гельльградII становлять в1дпов1дно 28 1 24 кДа.

3 метою отриманкя високоочищених препарат1в диг1дро-РФ-к!на-зи проводили очистку ферменту за схемою представлено» в табл. 3.

При нативному елекгрофорез! отриманого препарату диПд-ро-РФ-к1нази нами внявлено лиие один компонент, що волод!в диг1д-ро-РФ-к!назнок> ахтивн1сп> в 1.35 раз б1льао», н1» РФ-к1назною (Л(«0.36). При електрофорез1 очищеного препарату Ферменту в ПААГ у присутност1 РЭ-Ка ии ке виявиля супутн1х б1лк1в (рис.5). Молеку-лярна маса диг1дро-РФ-к!нази, ¿изначена за допомогою методу електрофорезу, становить 24 кДа.

Рис. 4. Гель-хрокатограф1я безкл1тинного екстракту др!ждз1в Р.еШШегаопсШ на сефадехс! (3-75 на колоиц! 1,5x120 см - А. 2x400см - Б; 1-аггквн1сть Р0-к1нази, 2 - активн!сть днг1д-ро-РФ-к1нази; 3-концентрац1я б!лху.

- 10 -

3. Вивчення властивостей двох форм РФ-к1нази Отринан! препарата фермент1в використовували для досл1даення властивостей двох форм РФ-к1назн при фосфорилюванн1 РФ га диг1д-ро-РФ.

Досл1джен1 значения температурнях оптнмум!в д11 для РФ-к1на-зн 1 днг1дро-РФ-к1нази дещо в1дм1нн1 1 не залежать в1д форми фла-в!нового субстрату фермеитативно! реакцП (табл.4). Енерг1я акти-вац11 реакцП фосфорилювання даг1дро-РФ диг1дро-РФ-к1назою в 1.3 рази е нихчов, н1х при фосфорилюанн! РФ. тод1 як цей параметр для РФ-к1нази при фосфоршвданн! диг1дро-РФ дещо зростае пор!вня-

Табл.З. Очистка диг1дро-РФ-к1нази 1з др!ждж!в Р.еиПНеппопсШ

Етап очистки Б1ЛОК. мг Ахтиви1сть ферменту Вих1д.Х Ступ1нь очистки

Загальна нЕ Питома мЕЛп-

1.Безкл1тиннкй 3800 247 0.065 100 1

екстракт

2.Лоф1л1зац1я 3040 № 0.1 123 1.54

3. Сефадекс С-75 49.8 216 4.33 87.5 66,7

4. Синя сефароза 0.3 36.8 122.5 14.9 1884,6

5.Л1оф1л1зац1я О.16 25.4 140.9 10.3 2168,0

Рис. 5. Електрофорез у ШГ у присутност! ВЗ-Ка пргпарат!в яй-Пдро-РФ-к1нази на р1ахша етаяах очистки: 1-бёзкл1тшша екстра&т. 2-п1сля гель-ф1льтрацИ на се$а-Декс1 6-75.3-п1слл яфШю! хроматограф! 1 на сия1й се£ароз1, 4-маркерн1 б1лки.

I■ '

кий • * -

«аде»

1 2

-.------- кДа

*—94

еанЗ 6743

«®ж> 20,1 3 4

- 11 - .

ко 1з РФ. спосгер1гаеться незначшШ зсув рН-оптимуму д11 у лусту сторону для диг1дро-РФ-к1нази 1 - у ккслу для Р0-к1назк при зан1-н! в1дновлено! форм« Олаз J нового субстрату на окислен/.

Особливий 1нтерес стаковлять дгн1, отриман1 при вивченн1 спор1дненост1 диг1дро-РФ-я1нази до субсграт1в. а такох активато-р!в Серпенту - IohIb Hg2* 1 Zn2*. Значения Ки. виявлен! для ди-г1дро-РФ-к1нази як до РФ; 1. особягао, до днг1дро-РФ. е дуге низькикн i знаходяться на р!вн1 значения Км для РФ-к1нази 1з 8.subtllis, яка здатаа фосфоршэвати лизе вШгазлену форму флав!-нового субстрату [Kearney et al.'. 1979]. При фос5орилюаанн1 днг1д-Табл.4. Властивост1 РФ-к1нази 1 диг1дро-р0-к1нази при фосфо-рилввакн! РФ га даг1дро-РО,

Властивост!

РФ-к1наза

"ро ( Диг1дроР0

Диг1дро-РФ-к1наза

РФ Диг1дроРФ

t-оптимум. С рН-оптимум Енерг1я актн-вацП. ккал/ноль Флаа1н АТР ADf

К.

К .тМ для

Стаб1-лън1сть при 0s С

1Н t.

с

♦ДТТ +ДГТ

44 9.0

15.0 10,0 €.7 50,0 12.5

4.16x10"® 3.04x10*6 48.0 S3.0

44 9.2

15,9 20.0 10.0 100.0 6.0 12.5

Кодекулярна маса.кДа 28. Q

47

9.0

20.0 0.65 0.7

9.1 11.Q

3 3 3.47X10," 8.89x10" 5.5 21.8 24.0

47 8.8

15.5 0.5 0.5 50.0 26.0 2.8

ро-РФ спор1днен1сть диг!дро-?£-х1нгза до АТР в 20 раз. а до фла-в1нового субстрату - у 40 роз 1а первенцу« цей показкик для РФ-к1-нази. Використання в яхост1 субстрату диг1дро-РО пр1Ш0Д!ггь ло зменвення спор1диеност1 днг1дро-РФ-х1!гази 1 РО-гЛнази до ADP ?1л~ пов!дно в 5.1 12 рази. His при. фосфорияазаrai РФ. У" той re час при фосфорияаванн! даг!дро-РФ спср1днен1сть до ADP для даПд-ро-РФ-к!назн е в 2 рази 61льеои. His для РФ-к1назн.

Досл1дхення ахгизукчого вгшгау. ахтиватор1в ферментатпзко!. реакцП на дв1 форот Р0-к1назн показало.с;о-фермента при сосфори-люзакн! дш^дро-РФ значно в1др!зяяються за спор!днен1сти до кат!-

OHiB Zn2* 1 Kg2*.

Вивчення стаб!льност1 досл!джувашх фермент!в при 0°С показало. «о п1впер!од збереження активнот! (t1/2) РФ-к!нази в 8,6 раз геревищуе цей показник для диг!дро-РФ-к1нази. ОстаннШ фермент значно (сраще эбер!гав свою активн1сть у присутност1 в1днов-люючого агенту - 4 мМ дит1отре1толу (ДП).

Отже, показано, цо у др1ждж!в, на в!дм!ну в1д !снуючих ран1-ше уявлень [Kearney et al. 1951: Кащенко 1 !н.,197б,). процес фосфорилювання РФ е складам 1 катал!зуеться двома суттево в1д-м1нними за сво1ми властивостямк ферментами - РФ-к!назою та диг1д-ро-РФ-к!назою.

В1домо. «о у кл!тинах др1жд«1в за р1зних умов культивування концентрац!я попередник!в флав!новнх кофермент!в мохе зм1ниватись у значних межах (¡Павловеький 1 !н.. 1959; Gancedo et al., 1989]. Очевидно, ею присутн!сть у др!ждж!в двох РФ-к1наз. як1 значно в!др!зняються специф!чн!стю дЦ 1 спор!днен1стю до субстрат1в, забезпечуе постачання метабол1чного апарату кл!тини флав1новими коферментами: no-перше - незалежно в1д фо.рми. в як1й флав!новий субстрат присутн1й у кл!тин!; по-друге - у широкому д1апазон1 концентрац1й флав1нового 1 нуклеотидного субстрат!в.

4. Досл1дженкя субстратно! спефф1чност1 РФ-к1нази 1 диг1дро-РФ-к1нази

Ензннатичне фосфорилювання РФ-к!назсмо в!дновленнх форм аналоги РФ до тепер!шього часу не вивчалось. Для досл1дження субстратно! спецнф1чност1 РФ-к1нази 1 диг!дро-РФ-к1нази використову-вали аналоги РФ. структуры! характеристики яких приведен! в табл. 5.

Бисоксо субстратно» аггивн1стю для обох форм ферменту воло-д1лн окислен! ! в1даовлен1 аналоги, що и!стили в положенн! 8 С1-, CFa-. дииетилам!но- . йиетилам!но-. карбоксипентилам!но- , кар-боксиметилал^когрупи.

Обидса фермента перетворювали у в!дпов1дн! пох!да! окислен! та вшювлен! аналоги РФ !з зам!ценнями рдночасно обох СН3-груп у 7 i 8 положениях на CF,- i С1-зам!сники. Досл!джуваи! ферненти не фосфорилювади rioxiflHi !зоалоксазику та диг!дро!зоалоксазину. цо Mi стели при НЮ залншок метилу, оксиетилу. ам1ноетилу.

Взлома, цо субстратами РФ-к!нази е 0-риб!тильн! аналоги в!-Ti!«ii:y в.. як! не м!стять у положенн! 8 !зоалоксазинового к!льця

об'емних зам!сник1в. причому наявн1сть 5-вуглецевого полЮльно-го залишку при N 10 ввахалась обов'язково» умовою для катал1тич-ного перетворення аналогу з утворенням 5' -фосфорильованого пох1д-ного 1МсСош1с1с еЬ а!.. 1962; Кащенко 1 1н..1978].

Табл.5. Субстратна специф1чн1сть РФ-к1нази та диг1дро-РФ-к1нази по в1дношенн» до аналог1в РФ у форм1 х1нону та днг!дро-х!нону

N п/п Положения зам!сника Швидк!сть фосфорнлювання.икМ/хв

ю 7 | 8 РФ-к!наза даг1дро-РФ-к!наза

х!нон г!дрох1нон х!нон г!дрох!нон

1.0-Риб!тил 2. - " -

3.

4. - " -

5.

6. - " -

7.

8.

9.

10. - " -И. - " -12.

13. - " -Ш-Галактитил СН

СН3

СН3,

сг

СН

С13

С1

СН3 СН

н3 н н н

15.

16.

17.1>-Сорб1тиЛ

С13 Н

сг

18.2' -Охсиетил СН?

19.

20, 21. 22.

23.

24. .25.2-

СГ, С13 СООН

СН. СГ*

СН? СН?

-АМноетил С1

СН

СГ"

СН?

с13

СН,

с13 н(сн )

мнсн?сЬой НН(СЙ,),С00Н Ы-п1рол1дил М-п1перидил СН,

Н-п!перидил С1 СН, СН?

СУ? Н 3

тнсн,.

С13 С1 СГ„

,)20Н

0,38 0,13 0,37 0.43

0,25 0.26 0,27 0,28

0,29 0.14 0, 30 0.38

0.31 0.17 0,32 0.35

0,35 0,27 0,34 0.40

0,22 0,30 0,23 0.25

0,30 0,37 0,31 0.37

0,23 0,17 0,21 0.23

0,22 0,17 0,13 0,20

0,24 0.15 0,15 0.16

0,22 0.14 0,12 0.16

0,07 0.20 0,06 0,08

0 . 0.03 0 0,03

0 0,03 0 0.03

0 0,25 0 0. 22

0 0 0 0.15

0 0.15 0 0.11

0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0-

0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0

Досл1даення субстратно! активност! Ю-О-галактитильних 1 10-0-сорб!тильного аналоПв у форм! г1дрох!ноиу показало, цо ц! ди-г1дро!зоалохсазини е в б!льо!й чи менш!й м!р! активними субстратами як РФ-к1нази, так 1 диг!дро-РФ-к!нази. Швидк!сть фосфорилю-вання г1дрох1конно! фории аналогу РФ, що м!стив у положены! 8 об' еиний занхсник - Н-п1рол1дил теас була б!лызою, н1ж для окислено! форми цього аналогу. Тод! як К-п!перидильний аналог Рф фосфо-рилмвався виключно у форм! г!дрох!нону.

Табл.6. Значения Кв РФ-к!нази до аналогов 1 пох!дних диг!дро-РФ.

N

п/п

Положения зан!сника

10

7

Значения К . ихй "

1.

г.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

Риб

ТИП

Галактитил

сн В

и н

С1 С1

сн.

. писк сбой ш(сяг> сода

п1рол1дил

Рис.6. За^ежн1сть евидкост! фосфорилввання РФ-к!иазов 7-. 8- 1 10-зам1цених да-. Г1дро1зоалоксаз1ш1в в!д кон* центрацИ аиалог1в (в обер-нених координатах): номерн аиалог!в наведен! в табл.6.

г . «1/[5],м*м В!до!4о. цо для 1.5-диг1дро®лав1н!в характерна иеплакарна структура молекули. яха складеаа по ос1 5-Я - 10-Н п1д кутом 140-160° м!е пловднамн. бензольного 1 п1рим!динозого цнкл!в [НеЕэег1сЬ е1 а1..1Э75]. Шхша припустит«, що взаемод!я Ферменту

з б!льа об1 емкими зам!снкшл! у полсвек-чях 8 1 10 диг1дро!зоалох-сазн»!в е полегсана пкасл1дох усуиекия стеричних перепой за раху-нок зм1яи коаф!гурац11 кодехуса диг!дро5л2в!н!в.

Лосл!да:ен1ш фосфориязгакня Р©-к1игзогз в!дновлгних форм дея-ких аналог!в в!там1иу Вг (рис. б) попало, що воно в!дп6з!дае к!-

8

нетиц1 Н1хаел1са-йеитена. Спор1днеи1сть РФ-х1нази до пох1дних ди-г1дро1зоалоксазин!в (табл.6) залеаять в!д иаявност1 та характеру зам1сник!в у положениях 7.8 I 10. Величина Ки для 8-зам1щених субстрат!в зростае в ряду:

-Н(СИ,)г

-Н(С2Н5>г.

-Н-п1рол1дил.

СГ3-. -NH-CH.-C00H.

-НН-(СН2)5-С00Н.

5.Досл1даення активност1 РФ-к1нази та диг1дро-РФ-к1нази у др!хд-х1в р1зно! видово! налехност! та 1нших н1крооргаи1зи1в Bei досл1дхен! вида 1 атаки др!ад»1в (табл.7) та 1нших н!кро-

Табл.7.Активн1сть Р<Э-к1иази 1 диг1дро-РФ-к1нази у ехстрахтах деяких вид1в 1 втам1в др1ждз!в .

бе-;кл1тинних

Вид др1хдж1в

РФ-к1наза.юсЕ/нг диг1дро-РФ-к1назз.мхЕ/кг

P.gullliermondii

АТСС 9058 124.0

S.cerevislae 34,0

раса XII

S.cerevislae 71В-1122 9.0

S.cerevislae KIV-1116 11,0

C.maltosa ВСБ 774 186.0

H. polyrorpha ВШ Y-20S 135,0

H.polymorpha ML-9 94,0

C.boldlnil T 2A 84.0

P.pinus 1031 85.0

S.bayanus ЕС-Ш8 16.0

C. iamata ВШЫ8 75.0

K. lactis 10,5

C.pseudotropicales 18.5

96,0 18,0

6,8 7.8 178.0 116,0 86,0 68,0 74,0 9.8 39,0 9.5 18,5

opnaiisMiB (табл.3) волод1ля ях РФ-к1иазкоэ. так i диг1дро-РФ-к1-назио» активностями. При цьему треба в1дзначнти. що у др!зда1в, актзшон1це'т!в та гр«б1з р1ве:п> Р0-к1назно1-актившст1 переваяав р!вень активкост! дог1дро-РФ-к1наз>1.

До цього часу практично иг выявлено наявкост! диг!дро-РФ-к1-назно! активкост1 у и1крооргаи1зм1в.У B.subtilis було описано лине РФ-к1назну актишйсть [Ереслср i 1н..1977].а згодом - лише ди-г1дро-РФ-к1иазиу [Kearney, 1979]. У безклДтшшх енстрактах досл1-даених нами двох гтредстазнгайз роду Bacillus визкачнла РФ-к1назну та даг1дро-РФ-к1нззну зхптност! (табл.8). Сл1д зазначитн, цо ди-г!дро-РФ-к1назна активн!сть у цих втамах в 1.3-1,6 раз iß переви-цувала РФ-к1назау.У E.coli актавн1сть диг1дро-РФ-к1иази в 3.5 рази перевнцувала акпгвн1сть РФ-к1нази. Таким чином, показано, що у

6актер1й днг!дро-РФ-к1назна ахтиви!сть е вищои. н1х РФ-к!назна.

При аф1нн1й хроматограф^ безюп1тинних екстракт1в др1жд*1в 5.сегеу!з!ае раса XII. Н.ро1уоогр11а ВКПМ У-201. С.ЬоШЩ! Т2А та 6ахтер1й В.зиЬиШ Й-32 виявлено дв1 форми РФ-к!нази. одна з якмх була б!льв специф!чною до РФ. а друга - до диг1дро-РФ.

Досл1дхення р!вн1в РФ-к!назно1 та диг!дро-РФ-к!назно1 активностей у безкл!тинннх екстрактах др1кда!в Р.§иШ!егтогШ! в р!з-н1 фази росту не виявнло 1х супевих зм1н, що св!дчить про збере-ження у процес! росту цнх др!ждж1в постШно! ввидоост! синтезу цих фермент1в.

Табл.8. Ахтивн1сть РФ-к1нази та даг!дро-РФ-к!нази у 6езкл1танних екстрактах деяхих вид1в 1 штам!в бактер1й. актином!цет!в та гри61в.

РФ-к1иаза, юсЕ/нг ]диг1дро-РФ-к1наза.мх£/мг

Втами

B.subtills ВКПМ В-5101 14.9 25.0

B. subtllls R-32 3.2 4.3 E.coll К-12 2.0 7.0 St.llvidans Т2 51,0 37.0 S.erythraea TI 209.9 172.5 P.vitale 173,0 137.0 E.ashbyll 1906__185.0_128.0

P.gulllienBondil в1явосктьсг до др1ждж1в. y яхих б1осинтез РФ значно зростае при виродуваин1 на середовищ! з низьким bmíctom зал1за [Шавловський та 1н.. 1969]. Проте ки не внявили впливу концентрацН 1он!в Fez* у кулътуралънону середовищ! на синтез 1 сп!вв!дношення в кл!тнн1 деох Форм РФ-к1нази.

Досл!джуваян РС-к!назну та диг!дро-РФ-к!назну актнвност! у 6езкл!тнкиих екстрактах д>!здж!в P.gulllierBondll в залежност! в1д кош4ентрад1! хиснау культурадьиому середовищ!. Культнвування др!ждж1в P.gullllertsondli s уиовах д!м1туваняя киска приводило до зростання в 2,5-3,0 разя даг1дро-Р&-к1назно1 активно«!.

Визчали також srams дхерел вутдецевого жиалення на р!вн1 РФ-к!назно£ i даг1дро-Р©-х!кгзно1 активностей у деяких вид!в др1ждж!в. У параф1изасЕоэз«ак др1ждаг1в P.gullllennondli та

C. cal tosa зам!на дгервла вуглецэ з глкжози на параф!ни в культу-

ральному середовищ1 приводила до кайже пропорц!йного зростаиня обох вид!в РФ-к1назно1 активност! (табл.9).

При використанн! як дхерела вуглец» глюхози у вс!х досл!дху-ваних штам1в метанолутил1зуючих др!хдх!в Hanrenula polyroorpha ВЮТМ Y-201. H.polymorpha HL9. Candida boldinl! T2A, Plchla plnus 1031 р1вень питомо! активност! РФ-к1нази перевищував диг1д-ро-РФ-к!назний, тод! як у кл1тин, культивоваиих на метанол!, диг!д-ро-РФ-х!назна ахтнвн!сть у деяких штам1в майхе в 1,5 рази була

Табл.9. Рф-к1назна 1 диг!дро-РФ-к!назна ахтивност* в безхл!тинних екстрактах деяких вид!в i птам!в др1хдх!в у залехност! в!д дхерела вуглецевого хивлення

Штами РФ-к!наза, ккЕ/мг диг!дро-РФ-к!наза.мкЕ/мг

глюкоза пара-ф1нн метанол глюкоза парафин мета-кол

P.guilliernmdil

АТСС 9058 124.0 164.0 76,0 98,0

С.maltosa ВСБ 774 186.0 226.0 178,0 194,0

H.polymorpha BKTOIY-201 135,0 301.0 116,0 384,0

H.polymorpha HL-9 94,0 428,0 86.0 567,0

C.boldinil T 2A 84.0 172,0 68.0 244.0

P.plnus 1031 85,0 136,0 74.0 142,0

б!льшою в!д РФ-к1назно1. Розд1ленкя двох форм РФ-к!нази !з др!хд-х!в H.polymorpha ВЮШ Y-201 за допомогоя методу аф!ннох хроматограф! ï на колон1д1, наповнен1й сииьою сефарозо» С1-6В показало, що загальне зростання рф-фосфор&шачох активност! у кл1тинах др!ад-ж!в, вирощених на метанол!, головнии чином вШуваеться за раху-нок зб!льиення х!лькост! диг1дро-РФ-к1наза. б.Використання 1шоб!л!зоваио1 РФ-к!нази в процес! Синтезу FMN

Досл1даували кожлив1сть вихористання розчиниих та !ммобШ-зованих препарат!в РФ-х1нази з др1хда!в для отримання препарат!в FMH. Як джерело РФ-к!нази використовуваля б1омасу промислового птаму метанолутил1зуючих др!жда!в H.polymorpha EKILM Y-201. Препарата РФ-к1нази (1.6 мЕ/мг) отримували □ ляхом фракц!онування безк-л1тинних екстракт1в сульфатом амон!ю.

Найвищий вих!д ферментативное активност! при 1ммобШзац1х РФ-к1нази аляхои включения в структуру ПААГ досягав 182 ! спосте-р!гався при кокцентрацН нономер1в у пол1меризац!йн1й сум!ш1 20% 1 BiflHOCHifl концентрацП зшиваычого агенту 4%. Питома активн!сть

одерханих 1ммоб1л1зованих препарат1в ферменту складала Q, 34 мЕ/мл гели.

Сиачали яластивост! як !имоб!л!зованох (ПААГ-РФ-к!наза). так i нативнох формн ферменту. Отриман! експеримеатальн! дан1 вказу-ють на те, njo при !ммоб!л1зац!1 РФ-к1нази з H.polymorpha включениям у ПЛАТ практично не зм1нюються ochobhI властивост! ферменту (температурннй та рН-оптимуми д11. енерг!я активацП реакцП фос-фориливання Р«*. спор1днен!сть ферменту до субстрат1в реакцИ - РФ 1 АТР. Розчинна та 1ммоб1л1зована РФ-к!назн волод!ють високою спор!днен!стю до РФ (20 мкМ) i АТР (90 мкМ). що Rae можлив!сть у npoueci ферментативнох трансформацИ РФ зд!йснювати глибоке пе-ретворення субстрату и продукт - FMH.

При вивченн1 стаб!льност! розчинно! та !миобШзоанох РФ-к1-назн при збер1ганн1 препарат!в на холод! (0-4°С) встановлено. що за таких умов для розчинного ферменту п1впер1од збереження актив-ност1 складае 29 i-од. Для ПААГ-РФ-к1нази виявлено появу двох ста-д!й !нактивац!х - швидку 1 пов!льну з п!впер!одами збереження ак-тивност1 131год 1 17,4 д1б. що значно перевицуе ц! параметри для розчинного ферменту

0перац1йну стаб1льн!сть ПААГ-РФ-к1нази досл!даували у реакторах пер!одичного 1 неперераного типу jjii. У реакторах пер1одич-ного типу д11 при 1нкубац11 ПААГ- РФ-к1нази в умовах р1зних температур 1 концентраций флав!нового субстрату виявлено, що оптимальна трансформац1я субстрат!в в продукт реакц!! спостер!галась при температур! 37°С 1 конценграцЦ РФ 0.2 мМ (рис.7). У цьому випадку продуктнвн!сть реактора складала 34 нмоль/год х мл на протяз! 4 год робота реактора. Прн поннхенн! температуря 1нку6а-ц1х час безв!даовнох робота реактора, коли ступ!нь конверсИ субстрату залишаеться пост!йним, зб1лыаувався до 14 год. алё при цьому продуктивн!сть реактора падала. Швидк1сть нагромадження FMN ¡у реакторах пер!одичнох дЦ починала зменшуватись при трансформа-ц!х не пейте 2/3 всього РФ сум!ы1.

0перац!йну стаб1дьн!сть ПААГ-РФ-к1нази при пост1йних кон-центрац!ях флав1нового ! нуклеогидного субстрат!в вивчали у реактор! безперервно! д1х (табл.10). При ступен! конверсИ 0,6 1 швидкост! протоку 1 мл/год через реактор (об* ем 8 мл) швидаисть синтезу FM11 на протяз! 12 год заливалась незм!нною, зменшувапась у 3 рази на протяз! настутших 28 год робота реактора; в сл1дукт 60 год - 12вид!с!сть синтезу FUN впала лише на 5,6 % (рис.8).П1впе-

в ПААГ РФ-к!назою при температур1 37" (1.2) 1 20° с (3). . Концентрами РФ - 0.1 мМ (1). 0.2 иМ (2,3).

Рис.8. Зм1на активност1 ферменту у реактор! безперервно! д!1 з ПААГ-РФ-к!назою. А - в прямих координатах; Б - в координатах залежност! 1п Ео/Е в!д часу роботи реактора.

Табл.10. 1нактивац!я ПААГ-РФ-к1нази при збер!ганн! ! в процес! синтезу ПШ у реактор! безперервного типу д!1

1нактивац!я препарату ферменту в процес! Значения констант 1нактивац!1. год"1 В!дношення

швидка стад!я «а«1 • пов!льна стад!я

Збер!гання на холод! 6,10 х 10"3 Безперервний синтез РМЫ 7.72 х 10"2 1.67 х 10"3 1,58 х 10"2 3.7 4.9

р!од збереження активност! ПААГ-РФ-к1нази складав 26,5 год.

Отже, вклмчення РФ-к!нази в ПААГ створюе можливост! застосу-зання цього ферменту в безперервному процес! синтезу РМН.

- 20 -БИСНОВКН

1. Показано. цо реакц!» фосфорилювання РФ у др!ждг!в Р. gu i11lerraondIi катал!зують дв1 РФ-кЛнази - термолаб!льна i тер-мостаб!льна - з константами термо1нактивац11 при 90°С в1дпов!дно 4.0 х 10'2 1 11.2 х 10"4 с Ц1 фермента суттево в1лм1нн! за значениями термодинам!чних активац!йних параметр1в процесу тепло-во! 1нактивац!! ( Ei.&G' ,ЛН' .¿S*). ТермостабЛльна i термолаб1льна РФ-к1кази розд1ляються при електрофорез! в пол1акрилам1дному гел1.

2. Розроблено процедуру розд1лення та очистки двох форм ферменту за допомого» метод 1в гель-хроматог-раф!I на сефадекс! G-7S та аф!нно! хроматограф!i на снн!й сефароз! CL-6B. Отримано гомоген-ний препарат термостаб!льно! РФ-к!нази др!ждж!в P.gullliermondii.

3. Вивчен! властивост1 двох форм РФ-к!нази у процесах фосфорилювання РФ 1 диг1дро-РФ. Термостаб!льний 1 термолаб!льний фермента р1зняться Mix собов за температурннм i рН-олтимумами, енерг!е» активац!! реакц!i фосфорилювання РФ. спор!днен!стю до активатор1в (Kg2* 1 Zn2*). Термостаб1льна РФ-к!наза мае значно вищу. н!ж тер-молаб!льний фериент. спор1днен!сть до субстрат!в реакц!I - РФ (Ки»0,65мкМ). ДИГ1дро-РФ (Кв»0.5мкН) ! АТР (Км«0.7мкМ. Ки«0,5мкМ). Молекулярна иаса териостаб1льного ферменту становить. 24 кДа. а термолаб!льного - 28 кДа.

4. Термолаб!льна РФ-к!наза за сво!ми властивостями та пр!оритет-ним субстратом в!дпов1дае раи1ше описан!й РФ-к!наз! др!хдж!в P. guill lermondil. Термостаб1льна РФ-к!наза в!дпов!дно до свое! субстратно! специф1чност! названа диг1дро-РФ-к1назо».

5. Досл!дхена субстратна специф!чн!сть диг!дро-РФ-к!нази ! РФ-к!-нази до ряду аналог1в РФ з заы1сникани у положениях 7. 8 1 10 1зоалоксазиновоп> к1льця у форм! х!нону ! диг!дрох!нону. Виявле-ний факт розшфення субстратно! спсциф1чност! двох фермент!в п!д час фосфорилювання пох!дних даг!дро-РФ.

6. Показана наявн1сть множинних молекулярних Форм РФ-к!нази у представник!в др!хда!в р!зно! видово! налеотост1 та деяких !кших м!крооргая!зм!в.

7. Встановлено. цо р!вень активност! РФ-к1нази 1 диг!дро-РО-к!на-зи не залекить в!д фази росту i вм1сту Гег* у культуральному се-редовшц!. Культивування др!жда1в за умов л!м!тування кисню супро-водхуеться зростанням диг!дро-РФ-к!назно! активност1. Вирощування метанол- та параф1нзасвоюючих др!ждг!в на альтернативних джерелах вуглецю (метанол, параф!ки) веде до зростання активност! обох

досл1дхуваних фермент1в.

8.Вивчен1 властивост1 розчинних та 1ммоб1л1зованих шляхом включения до структури ПААГ препарат1в РФ-к1нази. Доведено, що основ-н! катал1тичн1 характеристики РФ-к1нази п1сля ïï 1ммоб1л1зац11 практично не зм1нюються. Нерозчинн! препарати виявляли в 14 раз б!льшу стаб1льн!сть, н1х роэчинн1. Показана мохлив1сть викорис-тання 1ммоб1л1зовано1 РФ-к1нази др1«дх1в H.polynorpha у реакторах пер1одичного та безперервного типу дП для отримання чистих препарат^ FMN.

СПИСОК НАУКОВЙХ РОБ IT. 0ПУБЛ1К0ВАНИХ ПО TEMI ДИСЕРТАД11

1.Кащенко В.Е.. Преображенская E.H.. Погорилко Л.Р. Иммобилизация дрожжевой рибофлавинкиназы включением в полиакриламидный гель //Прикл. биохим."микробиол.. 1991. 27. 5, 789-796

2.Кащенко В.Е.. Фаюра Л.Р., Сибирный A.A. Обнаружение у дрожжей Pichia guillleraondli термостабильной рибофлавинкиназы и исследование ее свойств // Биохимия, 1996, 61. 9. 1586-1595.

3.Фаюра Л.Р.. Кащенко В.Е.. Термостаб1льна рибофлав1нк1наза у др1ждж1в Pichia gullliernondli // Укр.б1ох1м.хурн., 1997, 69. 1. 21-25.

4. Кащенко В.Е.. Преображенская E.H.. Федорович Д.В..Погорилко Л.Р.. Шавловский Г.М. Очистка.свойства.иммобилизация и применение ферментов, синтезирующих флавиновые нуклеотиды //Биосинтез ферментов микроорганизмами.Тезисы докл.IV Всесоюзн. конф.-Ташкент. 1988.-с.83-84.

5. Кащенко В. Е.. Погорилко Л. Р. ; Преображенская E.H. Получением свойства дрожжевой рибофлавинкиназы, иммобилизованной на гелях полиакриламида/ZV11 съезд Укр. микробиол. об-ва. Тезисы докл. -Киев-Черновцы. 1989.-ч. 1-е. 61.

6. Кащенко В.Е., Погорилко Л.Р.. Преображенская E.H. Обнаружение и свойства термостабильной рибофлавинкиназы - нового фермента синтеза флавинмононуклеотида у дрожжей//Проблемы микробного синтеза витаминов и их производных.Тезисы докл. Всесоюзн. Конф.-Ташкент, 1990.-с. 60-61.

7. Кащенко В.Е.. Преображенская E.H., Погорилко Л.Р. Получение очищенных и иммобилизованных препаратов рибофлавинкиназы и их использование в процессе ферментативного синтеза флавинмононуклеотида //Методы получения, анализа и применения ферментов.Тезисы

- 22 - . докл. Всесоюзн.конф.-Рига.1990.-с. 57-58.

8.Kashchenko V.E.. Preobrazhenskay Е.Н., FayuraL.R.. Bryk R.M., Slblrny A. A. Enzymatic preparation of flavin mononucleotide using yeast riboflavin kinase // Proc. 15-th Internal. Specialized Symp. on Yeast.- Riga. 1991.- p.61.

9. Kashchenko V.E.. Preobrazhenskay E.H.. Fayura L.R., Bryk R.M., Sibirny A.A. Preparation of flavin mononucleotide by riboflavin enzymatic phosphorylation //Enzyme engineering. Proc. 7-th All-Union Synsp. - Moscow, 1991.-p. 17.

10. Kashchenko V.E.. Preobrazhenskaya E.N.. Fayura L.R., Bryk R.M., Sibirny A. A. Preparation of flavin mononucleotide in batch and continuous flow enzyae reactors with soluble and immobilized riboflavin kinase. 6-th European Cong, on Biotechnology. Abstract books. Firenze. 1993, v. 11 p.TU223

11.Kashchenko V.E.. Preobrazhenskay E.H.. Fayura L.R.. Bryk R.M., Sibirny A.A. Preparation of flavin mononucleotide by riboflavin enzymatic phosphorylation //Abstracts 1 of 35th IUPAC Congress, 14-19 Aug.. 1995. Istanbul, Turkey, section 1-3, P.112.

Fayura L.R. Multiple molecular forms of riboflavin kinase in yeasts. The Candidate Thesis for a Master s Degree of Biological Science in the speciality 03.00.04 - biochemistry. Div. of Inst.of Biochemistry national Academy of Sciences of Ukraine. Lviv. 1997. 11 published works including 3 full-length articles on enzymatic phosphorylation of riboflavin in yeasts have been presented to obtain the candidate degree. It has been shown that in contrast to the widespread opinion, yeasts possess a complicated system for phosphorylation of riboflavin which consists of two functionally different forms of the enzyme, named riboflavin kinase and dihydroriboflavln kinase. These forms of enzyme have been shown to be present in many taxonomic groups of microorganisms. Hie possibility of the use or immobilized form of riboflavin kinase in batch and continuous flow enzyme reactors to produce FMH preparation of high purity has.been demonstrated.

Фаюра л.P. Множественные молекулярные формы рибофлавинкнназы у дрожжей. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. Отд. регуля-торных систем клетки Кн-та биохимии им.А.В.Палладина НАН Украины,

Львов. 1997. Зачищаются 11 работ, которые содержат результата изучения процесса фосфорилирования рибофлавина у дрожжей. Показано, что в отличии от существующих представлений, у дрожжей процесс фосфорилирования рибофлавина является сложным и катализируется двумя существенно отличающимися по своим свойствам ферментами - рибофлавинкиназой и дигидрорибофлавинкиназой. Множественные молекулярные формы рибофлавинкиназы обнаружены у представителей разных систематических групп микроорганизмов. Показана возможность использования иммобилизованной рибофлавинкиназы в реакторах периодического и непрерывного типа действия для получения препаратов ПМ высокой степени чистоты.

Ключов1 слова: рибофлав!н, флав1нмононуклеотнд, рибофлав1нк1на-за, множинн! молекулярн! форми фермент!в.