Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

In situ / ex situ идентификация микроорганизмов фильтрационных вод полигона твёрдых бытовых отходов

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "In situ / ex situ идентификация микроорганизмов фильтрационных вод полигона твёрдых бытовых отходов"

На правах рукописи

ШАРАВИН Дмитрий Юрьевич

IN SITU / EX SITU ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ФИЛЬТРАЦИОННЫХ ВОД ПОЛИГОНА ТВЁРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ

03.02.03 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

28 ОКТ 2015

005563785

Пермь-2015

005563785

Работа выполнена в лаборатории водной микробиологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Пермь

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Саралов Александр Иванович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой биологии ГБОУ ВПО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава России

Соловых Галина Николаевна

кандидат биологических наук, начальник отдела учебно-методического и научного обеспечения ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Минздрава России Чемурзиева Наталья Вадимовна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук (460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11).

Защита состоится "26" ноября 2015 г. в 12-00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс: (324)280 92 11.

Автореферат диссертации размещён на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://www.vak.ed.gov.ru) и сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЭГМ УрО РАН и на сайте ИЭГМ УрО РАН (http://www.iegm.ru).

Автореферат разослан 2015 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук/цг^^// Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Основную часть твердых бытовых отходов (ТБО) городов подвергают захоронению на специально оборудованных полигонах (ПТБО). В России на ПТБО ежегодно производится захоронение около 40 млн. т ТБО (Вайсман и др., 2003). Вследствие интенсивной анаэробной деструкции биополимеров в «теле» полигона температура варьирует от 30°С до 60°С. Деградация органических субстратов анаэробными микроорганизмами сопровождается высвобождением простых органических соединений таких как ацетат, бутират, лактат, пируват, пропионат, пропанол, этанол, метанол и формальдегид. Органические компоненты залежи ТБО разлагаются микроорганизмами с образованием биогаза, состоящего на 50-70% из СШ и на 3050% из СОг (Ножевникова и др., 2006; Kurniawan, 2010). ПТБО являются важным источником атмосферного метана, их вклад в глобальную эмиссию этого парникового газа оценивается в 6-12% (Bogner, Spokas, 1993). Максимальная эмиссия СН4 наблюдается ранней весной и поздней осенью, особенно на «молодых» участках ПТБО (Ножевникова и др., 2006). Кроме эмиссии метана, ПТБО оказывают негативное влияние на окружающую среду даже после их закрытия, в частности, из-за продолжающегося стока загрязненных фильтрационных вод (Вайсман и др., 2003). Однако многие вопросы экологии и функциональной роли водных микроорганизмов на ПТБО остаются неизученными (Bjerg et al., 1995; Van Breukelen, Griffioen, 2004; Kurniawan et al., 2010).

Разнообразные представители филума Proteobacteria широко распространены в природе и могут быть изолированы из различных источников разных климатических зон Земли, они часто доминируют в пресноводных и морских экосистемах (Amann et al., 1990, 1995; Snaidr et al., 1997; Rabus et al., 1999; Layton et al., 2000; Giovannoni et al., 2005; Heylen et al., 2006; Kalyuzhnaya et al., 2009; Lau et al., 2013). В сточных водах и активных илах городских и промышленных биологических очистных сооружений они могут быть эффективно идентифицированы с помощью групп-специфических зондов методом флуоресцентной in situ гибридизации - FISH (Manz et al., 1992; Wagner et al., 1993; Crocetti et al., 2000, 2002; Juretschko et al., 2002). Тем не менее, современные методы молекулярной экологии, не требующие культивирования микроорганизмов, до сих пор не использовались для изучения структуры микробных сообществ ПТБО. Представляется перспективной параллельная оценка разнообразия микробных сообществ непосредственно в природных образцах (in situ идентификация) и на изолированных культурах (ex situ идентификация) (Черноусова и др., 2008; Heylen et al., 2006; Kalyuzhnaya et al., 2009).

Цель настоящей работы - молекулярная in situ детекция микроорганизмов доменов Bacteria и Archaea и ex situ идентификация культивируемых представителей Proteobacteria фильтрационных вод обводного канала ПТБО.

Основные задачи исследования:

1. Провести общий сравнительный анализ фильтрационных вод «холодноводной секции» старого южного участка и «тепловодной секции» на свежем изливе из «тела» ПТБО (Пермь, Россия) в его молодой северной части.

2. Оценить таксономическое разнообразие представителей доменов Bacteria и Archaea в холодноводных и тепловодных секциях обводного канала in situ, используя метод FISH и анализ библиотеки клонов генов 16S рРНК и метанолдегидрогеназы mxaF.

3. Изолировать культуры аэробных хемоорганотрофных нитрат-восстанавливающих и метилотрофных a-, f¡- и y-Proteobacteria, провести идентификацию на основе изучения их морфологических особенностей, субстратной специфичности, профилей клеточных жирных кислот, содержания Г+Ц в ДНК и 16S рРНК сиквенсов.

4. Дать предварительное описание выделенных новых таксонов метилотрофных денитрификаторов, изолированных из фильтрационных вод ПТБО.

Научная новизна. Впервые на примере ПТБО г. Перми осуществлена параллельная оценка разнообразия микробных сообществ фильтрационных вод непосредственно в природных образцах (in situ детекция с использованием современных методов молекулярной экологии) и на изолированных культурах (ex situ идентификация на основе совокупности генотипических и фенотипических признаков). В пробах фильтрационных вод выявлено 12 филумов прокариот. В противоположность ранее изученным разнообразным сточным водам, активным илам городских и промышленных биологических очистных сооружений, на исследованном ПТБО микробные сообщества доменов Bacteria и Archaea оказались более разнообразны (вследствие пространственно-временной изменчивости гетерогенной среды). С другой стороны, полученные данные подтверждают, что, как и в аналогичных сообществах микроорганизмов сточных вод и биореакторов, на ПТБО явно доминируют протеобактерии, которые сравнительно полно детектируются и современными молекулярными in situ методами, и стандартными методами водной микробиологии. Показано, что филогенетическое разнообразие метаногенных архей в анаэробной зоне ПТБО, а также метано- и метилотрофных протеобактерии в покрывающей почве, в ассоциации с растениями и в фильтрационных водах не имеют аналогов в природных экосистемах.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты выполненного исследования in situ/ex situ расширяют представления о разнообразии Bacteria и Archaea в районах техногенного загрязнения отходами жизнедеятельности городов. Полученные данные позволяют заключить, что археям филумов Euryarchaeota, Thaumarchaeota, Crenarchaeota и грамотрицательным бактериям филума Thermotogae принадлежит ведущая роль в процессах деструкции биополимеров и метаногенеза внутри полигона ТБО. В фильтрационных водах ведущая роль в биохимических процессах круговоротов углерода и азота, в частности, в нитратредукции, в метано- и метилотрофии, принадлежит а-, /?- и y-Proteobacteria. Выделенные штаммы метано- и метилотрофов представляются перспективными для биотехнологических целей. Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК 9 штаммов бактерий, выделенных из фильтрационных вод полигона ТБО «Софроны», депонированы в базе данных GenBank под номерами: KF371656 — K.F371658, КС577607 -КС577612. Клоновые последовательности генов 16S рРНК и mxaF полученные в этом исследовании депонированы в базе данных GenBank под номерами: КМ870428 - КМ870474 (архейные 16S рРНК); КМ870230 - КМ870309, КМ870310 - КМ870395 (бактериальные 16S рРНК); КМ870396 - КМ870427, КМ870475 - КМ870503 (ген mxaF).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Фильтрационные воды муниципального ПТБО, особенно «молодой тёпловодной секции», очень сильно загрязнены соединениями биогенных элементов.

2. В противоположность с изученными ранее муниципальными и промышленными системами очистки сточных вод, сообщества микроорганизмов ПТБО отличаются гетерогенностью популяций и большим разнообразием Bacteria и Archaea.

3. За период многолетних исследований 2010-2013 гг. создана коллекция из более 100 накопительных культур экологически значимых видов протеобактерий. Из них 20 нитрат-восстанавливающих штаммов изолированы в чистые культуры и идентифицированы. Дано предварительное описание двух новых таксонов пресноводных и умеренно галофильных метилотрофных денитрификаторов.

Апробация работы и публикации. Всего по теме диссертации опубликовано 7 научных работ: 3 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ, и 4 тезиса. Материалы диссертации доложены на Всероссийских и международных конференциях молодых учёных: I Всероссийской с международным участием школе - конференции молодых учёных «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии», Пермь, 2011; V Всероссийском с международным участием медико-биологическом конгрессе молодых учёных «Симбиоз - Россия 2012», Тверь, 2012; VI Всероссийской конференции молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой», Саратов, 2012; IX молодёжной школе - конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2013; Школе-конференции «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах», Оренбург, 2014 и II Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии», Пермь, 2015.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах, включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, 3 главы экспериментального исследования, обсуждение, выводы, список цитируемой литературы из 182 наименований: 47 на русском и 135 на английском языках и приложения.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора. Работа поддержана Программой фундаментапьных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», проект (№ 01200963684), Грантом для молодых учёных и аспирантов Уральского отделения Российской академии наук (№ 11-4-НП-255) и молодёжным научным грантом по программе УМНИК (948ГУ2/2013).

Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора.

Благодарности. Автор выражает благодарность научному руководителю д.б.н. А.И. Саралову, сотрудникам лаборатории водной микробиологии ИЭГМ УрО РАН (Н.П. Ковалевской, В.В. Галяминой, Е.М. Реутских, П.Г. Беляевой и А.П. Соломенному) за помощь при подготовке диссертации, а также руководителю ЦКП Центра «Биоинженерия» РАН, Москва, к.б.н. Б.Б. Кузнецову за помощь при выполнении молекулярно-генетических исследований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В период с мая по октябрь 2010 - 2013 годов исследовали «старую холодиоводную секцию» ирригационного канала в южной части полигона твёрдых бытовых отходов «Софроны» (г. Пермь). В течение зимы вода на этом участке промерзала от поверхности до дна. В середине марта 2013 года исследовали «молодую тепловодную секцию» в северной части ПТБО. На этом специфичном участке из «тела» полигона истекал горячий тёмно-коричневый водный раствор, поэтому температура в придонном слое канала составляла +23,1°С, в то время как температура на открытом воздухе не превышала минус 13°С.

Пробы отбирали в стерильные бутыли объёмом 1,5 л, использовали на гидрохимические, микробиологические анализы и для экстракции тотальной ДНК (Рис. 1). Результаты in situ и ex situ идентификации микроорганизмов использованы для идентификации микробных сообществ ПТБО.

Рисунок 1. Схема эксперимента.

Гидрохимические анализы выполняли согласно практическому руководству по изучению состава промышленных сточных вод (Лурье, 1975). Содержание растворенного метана в пробах оценивали по результатам анализа газовых смесей на хроматографе Chrom-5 (Чехословакия), металлы - в гексановых и хлороформных экстрактах на атомно-абсорционном спектрометре Shimadzu АА-6300 (Япония). Состав органических веществ фильтрационных вод и жирнокислотный состав определяли на хромато-масс-спектрометрической системе Agilent 6890/5973N (США). Идентификацию метиловых эфиров ЖК осуществляли с использованием автоматизированной системы обработки масс-спектральных данных AMDIS с поиском целевых компонентов по библиотеке NISTEPA, MSL (США) с фактором сходства не менее 80%.

Способность к денитрификации микрофлоры сточных вод и культур протеобактерий оценивали по накоплению N2O в газовой фазе с N2 и ацетиленом. Анализ газовых смесей производили на хроматографе Chrom-5 (Чехословакия) с применением катарометра, колонки длиной 2,4 м и диаметром 6 мм с абсорбентом PorapakN (США) (Stewart et al., 1967; Yoshinari, Knowles, 1976; Галямина, 2011).

Численность аэробных и анаэробных бактерий определяли методом предельных разведений на жидких и агаризованных средах. Посевы инкубировали

при 25-37°С в течение 2-14 сут до появления отдельных колоний на плотных средах или клеточных суспензий на жидких средах.

Общую ДНК выделяли, используя набор для экстракции ДНК из почвенных образцов (MolBio, Laboratories, USA) в соответствии с инструкцией производителя. Очищенную ДНК получали используя Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega, USA) и хранили при -80°C. Из выделенных культур микроорганизмов ДНК выделяли по стандартной методике (Булыгина и др., 2002). Содержание Г+Ц-пар оснований оценивали по температуре плавления ДНК по общепринятому методу (Marmur, Doty, 1962).

Фрагменты тотальной ДНК из нативных образцов, кодирующие бактериальные гены 16S рРНК, были амплифицированы с использованием ПЦР с универсальными эубактериальными праймерами: 27f и 1492r (Lane, 1991), для архей использовали системы праймеров: A8F, A800R, и A1041R (Kolganova et al., 2002). Ген метанолдегидрогеназы был амплифицирован в полимеразной цепной реакции, используя пару праймеров (mxaF): F1003 и R1561, для метилотрофов и метанотрофов (McDonald and Murrell, 1997; Lau et al., 2013). Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов Wizard PCR Preps (Promega, США), согласно рекомендациям производителя. Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% агарозном геле при напряженности электрического поля 6 В/см.

Секвенирование полученных ПЦР-фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК, проводили по методу Сэнгера (Sanger et al, 1977) с помощью набора реактивов Big Dye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, Inc.,USA) на автоматическом секвенаторе ABI PRIZM 3730 (Applied Biosystems, Inc.,USA) согласно инструкциям производителя.

Первичный сравнительный анализ полученных последовательностей проводили с помощью программного пакета BLAST

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Затем эти последовательности анализировали с помощью пакета программ Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.isp). Филогенетический анализ проводили по методу Maximum-Likelihood (Tamura et al., 2011) и алгоритмов, реализованных в пакете программ TREECON и MEGA 4.

Очищенные ПЦР фрагменты гена 16S рРНК (выделенные в марте 2013 года из образцов «холодноводной» и «тепловодной» секций для in situ-анализа) длиной = 1500 п.н. были клонированы в вектора pGEM-3Zf (+) или pGEM-T (Promega, США). Клоны несущие схожие ПЦР-фрагменты были сгруппированы на основании рестрикционного анализа. После этого, было отобрано по 3—4 клона от каждой группы и отсеквенировано на автоматическом секвенаторе DNA Analyzer ABi3730 (Applied Biosystems, США). Дендрограммы филогенетического родства архейных и бактериальных генов 16S рРНК были построены, используя алгоритм Maximum-Likelihood (Tamura et al., 2011).

Общее количество жизнеспособных клеток бактериопланктона определяли, используя эпифлуоресцентную микроскопию и окрашивание 4'6'-диамино-2-фенилиндолом (ДАФИ) (Amann et al., 1990, 1995). Определение структуры микробного сообщества фильтрационных вод ПТБО проводили посредством флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) согласно протоколу детекции и идентификации планктонных бактерий (Manz et al., 1992; Glockner et al., 1996). Фиксацию клеток проводили 3%-ым параформальдегидом. После дегидратации с 50, 80 и 96% этанолом клетки были перенесены на тефлоновые плашки и

иммобилизованы высушиванием на воздухе. Затем они были гибридизованы с флуоресцентно-мечеными рРНК-специфичными олигонуклеотидными зондами. Для детекции целевой группы организмов домена Archaea использовали зонд ARC 344 (Raskin et al., 1994), для домена Bacteria - EUB 338, HGC69a (Amann et al., 1990, 1995), Deltaproteobacteria - SRB385Db (Rabus et al., 1999), Alphaproteobacteria - ALFlb, Betaproteobacteria - BET42a, Gammaproteobacteria -Gam42a (Manz et al., 1992), для филогенетической группы Cytophaga -Flavobacterium - Bacteroides - CFB560 (O'Sullivan et al., 2001). СуЗ-меченые зонды были синтезированы компанией «Синтол» (Москва, Россия). После гибридизации зонды были окрашены по ДАФИ (концентрация 1 мг/мл) и определены на микроскопе Zeiss Axiolmager DI (Carl Zeiss, Иена, Германия), оснащённом ртутной лампой HBO 100-W Hg, необходимым набором фильтров для СуЗ и ДАФИ флуоресценции. Обсчитывали от 300 до 500 объектов на пробу, окрашенных по ДАФИ. Полученные результаты определения численности клеток корректировали по зонду NON338, который не обладает сходством ни с одним из участков гена 16S рРНК (Wallner et al., 1993). Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ MS Excel 2007.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Общая характеристика фильтрационных вод ПТБО. Слабощелочные (рН 8,0-8,3) фильтрационные воды бикарбонатного типа «молодой тёпловодной секции» полигона характеризовались высоким уровнем загрязнения по аммонию, нитратам, нитритам, фосфору, железу, хрому, никелю и метану (Табл. 1). В «старой холодноводной секции» наблюдалось резкое снижение цветности раствора (в 40-60 раз), концентрации метана (32-260 раз), общего фосфора (35-56 раз), хрома (19-56), железа (7-20 раз) и натрия (6-14 раз) по сравнению с «тёпловодной секцией».

Таблица 1. Гидрохимическая характеристика фильтрационных вод обводного канала ПТБО «Софроны» в течение 2010 — 2013 гг. в «старой холодноводной секции» и в марте 2013 г. в «молодой тёпловодной секции» (значения приведены в скобках).

Параметр Поверхностная вода : Придонная вода

Температура, °С 15±14 (3) i 15±14 (23)

рН 8,3±0,3 (8,2) 8,0±0,3 (8,3)

Содержание метана, мл/л 0,23±0,18 (13,0) 1,51±0,66 (15,1)

Минеральные вещества, мг/л: Общий фосфор 0,35±0,08 (15,2) 2,5±0,6 (16,4)

Аммоний 39,2±18,3 (272,1) ! 48,7±17,7 (265,3)

Нитраты 47,6±14,6 (537,2) ; 45,1±15,3 (829,9)

Нитриты 1,9±0,5 (53,6) i 2,2± 1,1 (76,6)

Гидрокарбонаты 803±120 (8540) i 842±105 (9760)

Натрий 582±224 (5054) 645±266 (5954)

Железо 0,41 ±0,20 (4,28) 3,23±1,45 (3,71)

Никель 0,12±0,02 (0,50) 0,14±0,03 (0,47)

Хром 0,02±0,01 (0,56) 0,02±0,01 (0,67)

Подсчёт количества клеток и филогенетических групп методом FISH.

Общее количество жизнеспособных клеток, определённое при использовании окрашивания по ДАФИ, в двух секциях сточных вод было приблизительно одинаковым (98,9±2,7 х 106 в мл) с доминированием представителей домена

Bacteria (65,0±1,2%) и филума Proteobacteria (83,8±8,5% от Bacteria по FISH) (Табл. 2). Наиболее распространёнными были представители Gammaproteobacteria: 58,5% от Eubacteria в «тёпловодной секции» и 32,2% от Eubacteria в «холодноводной секции». В то время как доля Alphaproteobacteria увеличилась с 6,8% до 21,4%, количество Betaproteobacteria также возросло с 10,0% до 27,3%, тогда как содержание Deltaproteobacteria снизилось с 8,2 до 3,3%, а домена Archaea с 6,3 до 0,6%. Представители филумов Actinobacteria и Bacterioidetes составляли 24% от Eubacteria, идентифицированных по FISH.

Таблица 2. Количество клеток (N*107 в мл) определённое по ДАФН и детектированное по FISH в пробах обводного канала ПТБО «Софроны».

Филогенетическая группа Общее количество клеток (от окрашенных по ДАФИ) Тёплая секция 10,16±0,12 Холодная секция 9,62±0,10

Archaea (%, ДАФИ) 0,64±0,03(6,3) 0,06±0,01(0,6)

Bacteria (%, ДАФИ) 6,58±0,13(64,8) 6,27±0,11(65,2)

Proteobacteria (%, Eub) 5,50±0,52(83,4) 5,28±0,60(84,2)

Alphaproteobacteria (%, Eub) 0,45±0,05(6,8) 1,34±0,16(21,4)

Betaproteobacteria (%, Eub) Gammaproteobacteria (%, Eub) Deltaproteobacteria (%, Eub) 0,66±0,08(10,0) 3.S5:0.34(58.5) 0,54±0,07(8,2) 1,71±0,18(27,3) 2.0210.23(32,2) 0.21:0.03(3.3)

Bacteroidetes (%, Eub) Actinobacteria (%, Eub) 0,25±0,04(3,8) 0,12±0,03(1,8) 0,27±0,04(4,3) 0.20:0.03(3.2)

Анализ последовательностей генов 16S рРНК.

Из «холодноводной секции» не удалось получить ПЦР-продукты архейных клонов, используя систему праймеров A8F, A800R, и A1041R, хотя на выделение ДНК бралось до 100 мл пробы. Из другой «тёпловодной секции» были получены ПЦР-продукты с используемыми Archaea-специфичными зондами, причём для ДНК-экстракции достаточно было только 5 мл пробы. Из общего количества полученных архейных клонов на секвенирование и построение филогенетического дерева был отобран 41 клон (Рис. 2).

0,02

100I г-

-Candidatus Methanomethylophilus alvus Мх1201 (СР004049)

<10 clones

i ■ ' 'Candidatus Methanomassiliicoccus intestinalis lssoire-Mx1 (CP005934) 10? clones

i-Methanomicrococcus blatticolus DSM 13328T (NR_028184)

О* «4 clones

99 inn i—Clone WWA-E10 (KM870444)

^Candidatus Nitrosotalea devanaterra Nd1 (JN227488)

—Igntsphaera aggregans DSM 17230' (NR_102869) —<4 clones

Thaumarchaeota

Crenarchaeota

Рисунок 2. Филогенетическое дерево, основанное на секвеннрованни гена 16$ рРНКи показывающее связи между штаммами домена АгсЬаеа и археальиымн клонами, выделенными из пробы «тепловодой секции».

Согласно филогенетическому анализу один клон был определён как неклассифицированный представитель ТИаитагсИаео1а точнее к "СапсИйЫт

Nitrosotalea devanaterra" - облигатному аммоний-окислителю (Lehtovirta, 2011). Четыре клона были отнесены к Ignisphaera aggregans анаэробному гетеротрофу в Crenarchaeota (Niederberger et al., 2006). 36 клонов оказались метилотрофными метаногенами принадлежащими Euryarchaeota, которые сформировали три самостоятельных кластера: 28 клонов "Candidatus Methanomethylophilus alvus", 4 клона "Candidatus Methanomassiliicoccus intestinalis" и очень гомогенная филогенетическая группа клонов Methanomicrococcus blatticola, метанол- и метиламин-восстанавливающий метаноген (Sprenger et al., 2000; Boreil et al, 2012; Boreil et al, 2013). В отношении архей мы наблюдали большее разнообразие среди клонов, чем это было показано в ранее исследованиях сточных вод (Neef et al., 1996; Schrenk et al., 1998; Chouari et al., 2005).

На сиквенс гена 16S pPHK и построение филогенетического дерева домена Bacteria было отобрано значительно большее количество бактериальных клонов, чем архейных. Суммарно было детектировано 135 эубактериальных клонов: 103 клона (76,3%) были отнесены к Proteobacteria, 59 клонов (43,7%) к Gammaproteobacteria (46 клонов к группе Pseudomonas caeni) и 32 клона (23,7%) к Betaproteobacteria (23 клона к группе Advenella kashmirensis) (Рис. 3).

В пробе «тёплой воды» был обнаружен гетерогенный кластер с клонами Pseudidiomarina taiwanensis PITl (DQ 118948), нитрат-редуцирующим гетеротрофом, и Pseudomonasmaricurvus alkylphenoliticus KU41G (AB 809181), аэробным гетеротрофом с оптимумом роста при pH 8,0 (Jean et al., 2006; Iwaki et al., 2014) (рис. ЗБ). Также, в «тёплой пробе» 15 клонов формировали гомогенный кластер, связанный с Advenella (Tetrathiobacter) kashmirensis WTOOl (AJ 864470), Eoetvoesia caeni PB3-7B и Pusillimonas noertermannii BN9 (A Y 695828). Значительное число клонов (19-21% сиквенсов бактериальных клонов) представляют высоко-гомогенную филогенетическую группу и отнесены к Defluviitoga tunisiensis DSM 203805 (FR850164), связанную с Thermotogae -термофильной бактерией, адаптированной к низкой температуре и микроаэрофильным условиям сточных вод (Hania et al., 2012). «Тёплая» и «холодная» пробы содержали по 2^4 клона Delta- и Epsilonproteobacteria отнесённых к Desulforomonas thiophila NZ27 и Acrobacter skirrowii DSM7302 (LI 4625). Только в «холодной» пробе были обнаружены группа клонов, принадлежащая Bacterioidaceae (2 клона), Clostridia (2 клона), гаммапротеобактерия Thiomicrospira sp. NP20 (2 клона) и альфапротеобактерия Roseovarius sp. SS 16.20 16S (1 клон) (Рис. ЗА).

Аналнз сиквенсов генов метанолдегидрогеназы mxaF.

Ген mxaF, кодирующий метанолдегидрогеназу, был обнаружен во всех исследованных пробах из сточных вод полигона. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей mxaF клонов показал, что последовательности формировали три основных кластера (Рис. 4). Из образца «тёплой воды» 29 сиквесов клонов mxaF определены принадлежащими к гаммапротеобактериальному метанотрофу Methylobacter luteus и 2 клона -альфапротеобактериальным метанотрофам Methylosinus trichosporium/Methylocystis parvus. Из пробы «холодной секции» 30 клонов демонстрировали принадлежность к бетапротеобактериальному метилотрофу Advenella kashmirensis W13003 (Wang et al., 2014).

100

—^^^^^'Advenetla kashmirensis' group

(117 clones) 'Pseudomonas caeni' group (20 clones)

100

■'Thiomicrospirasp. NP2Q' group (2 clones)

■Roseovarius sp SS16 20 (KC160941) loneCWB-H09 (KM 870304)

100

m'Desulforomonas thiophila'group (2 clones) |'C/osrnd/a'group(2clones) ^'Arcobacter skirrowiP group (4 clones) ^^т^т/^^^Ш Bacteroidaceae' group (2 clones)

i'Defluiivitoga tunisiensis' group(12 clones)

] Beta proteo bacteria

Gammaproteo bacteria

Al phaproteo bacteria De Ita proteo bacte ría Firmicutes

Epsilonproteobacteria Bacte róldete s

Jíhermotogae

I'Pseudomonas caeni' group (26 clones)

CPseudomancurvus alkylphenohcus KU41GT (AB809161) rClone WWB-A11 (KM870386) 1t^CIone WWB-H01 (KM870387)

•Pseudidiomahna taiwanensis' group (9 clones) Advenella kashmirensis' group (6 clones) I'Pusilimonas noertemani' group (4 clones) I'Eoetvoes/a caeni' group (5 clones)

j^'Adv

в71ф

VDesutfuromonas thiophila' group (3 clones)

i-s

ob-"го

70l-CIO

lone WWB-C10 IKM870384I

■Arcobacter skirrowii DSM 7302T (L14625) lone WWB-D07 (KM870385)

—iDefluviitoga tunisiensis' group (16 clones)

Gammaproteobacteria

Betaproteobacterla Delta proteobacteria Epsilonproteobacteria Thermotogae

Рисунок 3. Филогенетическое дерево, основанное на секвенировании гена 16S рРНК и показывающее связи между штаммами домена Bacteria и бактериальными клонами, выделенными из пробы «холодноводной» (Л) и «тепловодной» секций (Б).

-Methylocystis parvus ОВВР (U70515) -Methylosinus trichosporium ОВЗЬ (U70516)

-Clone CWM-C12 (КМ870396) -Clone CWM-C10 IKM870397)

Alphaproteobecleria

-Advenella kashmirensis W13003 (АУХТ01000014Ц

-Methylobacter luteus (JX312967)

- Clone WWM-F05 (KM870503) |28 clones

BetapmfobactBria

Gammaproieobacleria

Рисунок 4. Филогенетическое дерево, основанное на секвенировании гена тхаГ и показывающее связи между штаммами филума Рго1еоЬас1епа и бактериальными клонами метано- и метилотрофов, выделенными из «холодноводной» (С\\'М) и «тепловодной» (\V\VM) секций.

Тем не менее, некоторые результаты филогенетического анализа mxaF гена оказались довольно неожиданными. Согласно предварительным анализам по данным детектирования методом FISH и секвенирования гена 16S рРНК представители Gammaproteobacteria явно доминировали в «тепловодной секции» (58,5% от Eub.). Однако в пробе «холодноводной секции» практически не было обнаружено репрезентативных клонов Gammaproteobacteria, несущих mxaF-ген. Напротив, и по гену mxaF и по результатам детектирования методом FISH здесь стали доминировать представители Betaproteobacteria. Таким образом, каждый из последующих анализов, использовавших молекулярные методы, предоставлял дополнительную информацию о составе анализируемых гетерогенных сообществ.

Ex situ исследования «культивируемых» бактерий.

По данным за 2010 - 2013 гг. в «старой холодноводной секции» общая численность бактериоподобных клеток по методу прямого счета (Nf>) в придонных водах мелководного обводного канала ПТБО (700 - 1640 млн. кл/мл) оказалась в среднем в 90 раз выше, чем в поверхностных слоях воды (6-20 млн. кл/мл). Повышение численности N5 обычно происходило весной в пробах надиловой воды, содержащих много растворенного метана (1,6 - 2,2 мл СН.»/л), черной взвеси и анаэробных сульфатвосстанавливающих бактерий (СВБ). В то же время численность СВБ в воде у поверхности была в среднем в 5000 раз ниже (0,01% от Ne), чем у дна (15-22% от N5). При этом массовое распространение СВБ было обусловлено преимущественным развитием анаэробных грамотрицательных Deltaproteobacteria, по морфотипу сходных с Desulfovibrio desulfuricans и Dv. vulgaris.

В сообществе микроорганизмов фильтрационных вод ПТБО были широко представлены условно патогенные Gammaproteobacteria, выявляемые на лактозо-пептонном агаре Макконки с солями желчи и кристалвиолета.

Практически все 20 чистых культур аэробных a-, ß-, у-протеобактерий, выделенных из образцов сточных вод ПТБО, существенно отличаясь по содержанию Г+Ц в ДНК (43,9 - 70,5 мол.%), обладали способностью к нитратредукции и 15 культур - к денитрификации на пирувате и метаноле (Табл. 3). При этом изоляты Alphaproteobacteria (включая типично гетеротрофные, метилотрофные и метанотрофные) относились к родам лишь одного порядка Rhizobiales: Rhizobium, Agrobacterium, Ochrobactrum, Methylobacterium и Methylosinus. В их жирнокислотных профилях явно преобладала октадеценовая C18:1 кислота (60-80% в сумме ЖК). В частности, штамм RS-V2 (КС577610) представлял собой розово-пигментированную факультативную метилобактерию, способную к денитрификации на метаноле и, особенно, на пирувате. Подвижные палочки размером 0,8-1,4 х 1,0-3,0 мкм со слабо выраженной каталазной и оксидазной активностью. Содержание Г+Ц в ДНК составляло 70,5 мол.%. Согласно результатам филогенетического анализа последовательностей генов 16SpPHK, изолят имел высокий уровень сходства (99,3%) с Methylobacterium radiotolerans и, следовательно, являлся штаммом указанного вида: Mb. radiotolerans RS-V2 (Рис. 5).

Штамм альфапротеобактерии RS-MM6 (KF371658) по последовательностям нуклеотидов в гене 16S рРНК на 99,7% оказался схож с Methylobacterium hispanicum DSM 16372т (AJ635304), штамм RS-X6 на 97,7% сходен с гетеротрофом Ochrobactrum cytisi, a RS-Mol - с метанотрофом Methylosinus trichosporium.

Таблица 3. Описание нитратредуцирующих протеобактерий, изолированных с ПТБО

Штамм Дени триф икац ия г+ц, мол.% Основные жирные кислоты Ближайшие соседи по фено- и генотипичееким признакам й

RS-V2 + 70,5 С,,-,. Си Methylobacterium radiotolerans .5

RS-MM6 + 68.5 Cm i,Ci8 Methylobacterium hispanicum

RS-Mol - 62,6 Cis 1, C16 1 Methy/osinu.s trichosporium

RS-R - 62,5 С|8 1, C|9cvc Rhizohium massiliae 1

RS-Xl - 62,3 "" С1 я 1, Cifi I, (Г 16 Agrobacterium albertimagni

RS-X6 + 57,0 С|8 1, Clfi, С|9с\с Ochrobactrum cytisi

RS-X3 Рр2013 + 66,4 Ci6, С,6 1, Ci7cvc A chromobacter xylosoxidans С

RS-MT7 + 65,9 Cifi. Ci6 1, Си» 1 ('astellaniella denitrificans

RS-XM, RS-Xl, RS-X2 + + + 64,2 65,1 64,8 ^Ci6itC,6 Melhyloversalilis universalis §■

RS-M7, RS-X3 + + 57,4 58,2 Cl6, Cl61 Новые виды нового рода сем. Methylophilaceae =3

RS-MT8 + 68,2 С|б, С15, С18 1 1 Чеudoxanthomonas tawanensis .2

RS-X5 + 65,8 : Си, Ci61, Ci6 Stenotrophomonas ma/tophila

RS-B, RS-H RS-V3 + + 61.3 59,8 56,0 C18 1, С-i, C|2 C]6:Ii С161 С18 1 Shewanella putrefaciens Enterobacter asburiae с s

RS-Mo2 - 52,4 C|ft 1, C|6 Methylomonas methanica .5

RS-MM3 + 43,9 , Сi61, Ci6, Ci81 Новый вид рода Methvlophaga

В исследованных фильтрационных водах численность метанотрофов, учитываемых на элективных средах под газовой фазой с 15% СН4 при 25°С, была значительно ниже (в 10 - 100 раз) численности метилобактерий на плотных и жидких средах с 2-5 мл/л метанола: от 4 до 60% от Ыб в поверхностных пробах и 0,3-0,7% от N5 в придонной воде. Среди культивируемых метанотрофов доминировали альфапротеобактерии рода Methylosinus (Ms. trichosporium) и гаммапротеобактерии рода Methylomonas (Mm. methanicä). Среди метилобактерий доминировали бетапротсобактерии рода Melhyloversalilis (Mv. universalis) порядка Rhodocyclales (сходство сиквенсов 16S рРНК изолятов RS-XM, RS-Xl, RS-X2 с типовым штаммом составило 99,4-99,7%), RS-MT7 с Castellaniella denitrißcans -99,1% и представителей двух таксономически неопределённых изолятов (RS-X3, RS-M7) порядка Methylophilales. Изолят RS-XM филогенетически был наиболее близок к типовому штамму Melhyloversalilis universalis (99,7%) и к метилобактерии Burkholderia phymatum и Rh. denitriflcans (92,2%), но значительно удален от изолятов RS-X3, RS-M7 (90,8-91,0%) и от альфапротеобактерии Methylobacterium radiotolerans RS-V2 (78,6%). Два филогенетически близких изолята RS-X3, RS-M7 примыкали к группе родов семейства Methylophilaceae: Methylolenera, Methylovorus, Methylobacillus и Methylophilus (сходство лишь 93,0-95,5%). По совокупности гено-и фенотипических признаков изоляты RS-X3, RS-M7 идентифицированы как представители нового вида нового рода семейства Methylophilaceae.

100

92j Castellaniella defragrans DSM 1214Г (AJ005447) 74[t Castellaniella denitrificans RS-MT7 fKF371657) Castellaniella denitrificans DSM 11046T (U82826) Castellaniella caeni LMG 23411т (AB166879) Castellaniella hirudinis LMG 26910T (JQ319891) Achromobacter xyiosoxidans ssp. denitrificans DSM 30026T (AJ278451) Achromobacter xvlosoxidans RS-X3PP2013 (KC577608) 971 Achromobacter xyiosoxidans DSM 10346т (У14908) Burkholderia phymatum STM815T (AJ302312)

С

69

- Burkholderia denitrificans DSM 24336T (GU171384)

_, Methvloversatilis universalis RS-XM (KC577607)

1001 Methylovereatilis universalis FAM5T (DQ442273)

-Thiobaciiius denitrificans NCIMB 9548T (AJ243144)

[— Methvlotrophic bacterium RS-X3 gen.nov. sp.nov. IKC577612) - Methvlotrophic bacterium RS-M7 gen.nov. sp.nov. (KC577611) ggj— Methylotenera mobilis JLW8T (CP001672)

Methyiotenera versatile 301T (CP002056) 98i Methylophiius methylotrophus DSM 46235т (AB193724) Methylophilus flavus DSM 23073 T (FJ872108) Methylophiius glucosoxydans Вг (HM001269) 1001 Methylovorus glucosotrophus DSM6874T (FR733702) I Methylovorus mays CT (AY486132) [— Methyiobacillus giycogenes DSM5685T (FR733701) "93!-Methyiobacillus pratensis F31T (AY298905)

98J

98П-Lmi

89

-Methylophaga marina DSM 5689т (X95459)

- Methylophaga thiooxydans DSM 22068 T (DQ660915) 4qi—Methylophaga sp. RS-MM3 sp.nov. IKF371656)

57

81

rrI-

Methylophaga lonarensis VKM B-2684T (JF330773) Methylophaga nitratireducenticrescens DSM 25689T (CP003390) Methylophaga alcalica DSM 14953' (AF384373)

100] Methvlobacterium hispanicum RS-MM6 (KF371658) 191 I Methylobacterium hispanicum DSM 16372T (AJ635304)

Methylobacterium organophilum ATCC 278861 (AB175638)

Gammaproteobacteria

-Ц Methylobact

1001 Methvlobactf

культурами ПТБО u

Methylobacterium radiotolerans JCM 2831 T (D32227) Methvlobacterium radiotolerans RS-V2 (KC577610)

Рисунок 5. Филогенетические отношения между чистыми денитрифицирующих метилотрофов из фильтрационных вод представителями а-, //-, у-протеобактерий. Дерево построено на основе секвенированных последовательностей генов 16S рРНК длиной 1250 п.н. используя алгоритм Maximum-Likelihood. Число над ветвью обозначает Bootstarp значения выше 50%. Масштаб соответствует 2% дивергенции. Последовательности, полученные в данном исследовании, выделены жирным шрифтом.

У всех метилотрофных изолятов из фильтрационных вод /З-протеобактерий (в отличие от а- и у-протеобактсрий) в жирнокислотном профиле преобладали Ci6, C161 (70-75% в сумме ЖК), содержание Г+Ц в ДНК составляло 57-66 мол.%. Все они являлись пресноводными нейтрофилами и мезофилами, росли на широком спектре органических субстратов, в анаэробных условиях в качестве терминальных акцепторов электронов использовали нитраты и нитриты.

Накопительные культуры изолятов RS-X3 и RS-M7 представляли собой ассоциации метилотрофоных и сапротрофных /i-протеобактсрий. Из ассоциаций RS-X3 и RS-M7 были выделены чистые культуры Betaproteobacteria порядка Burkholderiales с высокой каталазной активностью: из RS-M7 - сапротрофный Comamonas sp. RS-M7Pp2013 (на 96,5% сходен с Comamonas terrigena), из RS-X3 -сапротрофный и метилотрофный денитрифицирущий Achromobacter xylosoxidans RS-X3Pp2013 (99,6% - с Achromobacter xylosoxidans ssp. xylosoxidans и 99,1% - с Ab. xylosoxidans ssp. denitrißcans).

Изоляты Gammaproteobacteria по морфо-физиологическим,

хемотаксономическим и генетическим признакам представляют довольно гетерогенную группу. У них в очень широком диапазоне варьирует и содержание Г+Ц в ДНК (44 - 68 мол. %). Большинство из них являются сапротрофными, хорошо растут на пептоне, обладают значительным сходством с известными видами. У изолятов RS-V, RS-H сходство последовательностей гена 16S рРНК достигает внутривидового уровня с Shevanella putrefaciens (98,1 - 98,8%), у RS-МТ8 с Pseudoxanthomonas taiwanensis (98,5%), у RS-X5 со Stenotrophomonas maltophila (97,8%) и у RS-V3 с Enterobacter asburiae (97,7%). Однако у умеренно галофилыюго метилотрофного денитрификатора RS-MM3 филогенетическое сходство с различными видами рода Methylophaga достигает лишь межвидового уровня (95,3 - 96.7%). Фенотипически сходный умеренно галофильный штамм М1К рода Methylophaga был выделен из техногенно-засоленной ризосферной почвы на территории г. Соликамска. Он обладал способностью продуцировать биологически активные соединения, способствующие росту растений. При обработке семян яровой пшеницы препаратами умеренно галофилыюго метилотрофного штамма Methylophaga sp. М1К отмечено стимулирование ростовых процессов, синтеза растительных пигментов и массы корней (Табл. 4).

Таблица 4. Влияние бактериальных препаратов Ме1Иу1орИа§а ер. М1К на концентрацию хлорофиллов, каротиноидов и массу корней (в % от контроля).

Добавка в среду Хлорофиллы Каротиноиды Масса корня

0,5%NaCl 135 100 160

1.0% NaCl 207 153 176

Детекция метаполдегидрогеназы mxaF культур метилотрофов. Для

подтверждения способности выделенных штаммов метилотрофных бактерий утилизировать метанол был проведён ПЦР-анализ по обнаружению функционального гена метаполдегидрогеназы, используя стандартные праймеры F1003 и R1561 для mxaF (McDonald and Murrell, 1997). На электрофореграмме продуктов ПЦР отчётливо видны полосы специфического продукта реакции длиной 550 п.н. (Рис. 6). Ген метаполдегидрогеназы детектирован у новых видов метилотрофных денитрификаторов рода Methylophaga RS-MM3 и RS-M7 -представителя семейства Methylophilaceae. Продукт реакции не зафиксирован у активного гетеротрофного денитрификатора Ochrobacterium cytisi RS-X6 не способного к росту на метаноле.

Далее, было проведено секвенирование полученных ПЦР-продуктов гена метанолдегидрогеназы. BLAST-анализ показал, что не у всех культур результаты сиквенса гена 16S рРНК совпадают с результатами сиквенса mxaF гена (Табл. 5).

Рисунок 6. Электрофореграмма продуктов ПЦР гена mxaF F1003. Штаммы: 1-МТ7

(Castellaniella denitrißcans); 2-Х2

(Methyloversatilis universalis); 3 - MM6 (Methylobacierium hispanicum); 4 — V2 (Methylobacterium radiotolerans); 5 - X3 Pp2013 {Achromobacter xylosoxidans); 6 - X6 (iOchrobactrum cytisi); 7 - M7 (gen. nov., sp. nov. Methylophilaceae); 8 - MM3 (Methylophaga sp.nov.); "+"— положительным контроль; M — маркер молекулярных весов.

В частности, изоляты RS-MT7 (Castellaniella denitrificans) и RS- ХЗ Рр2013 (Achromobacter xylosoxidans) показали наибольшее сходство не с типовыми штаммами, а с некими невапидными видами Burkholderiales bacterium RZ18-153 и Pseudomonas sp. СВМБ 18, соответственно. В остальных случаях сиквенсы генов mxaF и 16S рРНК однозначно подтвердили систематическое положение изолированных культур.

Таблица 5. Результаты BLAST-анализа сиквенсов гена mxaF у изолятов метилотрофов и сопоставление с сиквенсами гена 16S рРНК.

Штамм RS-X6 Номер в Генбанке для 16SpPHK нет BLAST-аналт 16S рРНКгеиа Ochrobactrum cx'tisi BLAST-аналт mxaF гена Нет продукта

RS-X3 Рр20I3 RS-MT7 RS-V2 КС577608 KF371657 КС5776Ю Achromobacter xvlosoxidans Castellaniella denitrificans Methylobacterium radiotolerans Pseudomonas sp. CBMB18 (EU439305.1), 86% Burkholderiales bacterium RZ18-153, (EU548067.1), 98% Methylobacterium radiotolerans JCM 283 /(CPOO1001.1), 99%

RS-M7 КС577611 сем. Methvlophilaceae Methylophilus sp. (FJ872110.1), 83%

RS-MM6 KF371658 Methylobacterium hispanicum Methylobacterium hispanicum DSM 16372 , (EF562468.1), 99%

RS-MM3 KF371656 Methylophaga sp. Methylophaga nitratireducenticrescens JAMl (CP003390.1), 90%

Активность денитрификации выделенных штаммов. Ряд культур изолятов а-, /?- и у-протеобактерий из образцов фильтрационных вод полигона «Софроны», независимо от типа обмена веществ, обладали способностью к нитратредукции и интенсивной денитрификации на пирувате (Табл. 6). На метаноле активность денитрификации оказалась в десятки раз слабее даже у метилобактерий и отсутствовала у штаммов 5Ъе\чапе11а рШге/ас1еп.ч и ОсИгоЬас1гит суи$1 RS-X6. На средах с метанолом или пируватом диссимиляционная нитратредукция до N20 и N2 не была обнаружена только у МеШу1о5ши5 \richosporium RS-Mol и .\1elhylomonas те^апюа RS-Mo2, несмотря на их способность использовать нитраты в качестве источника азота, а метан и метанол - в качестве источника углерода и энергии.

Таблица 6. Интенсивность денитрификации у изолятов а-, //- и у- протеобактерий на средах с пнруватом и метанолом___

Штамм Организм Денитрификация, мг N/л в сут

на метаноле на пирувате

RS-V2 Methylobacterium radiotolerans 5,1 52

RS-XM Methyloversatilis universalis 2,2 83

RS-M7, RS-X3 Неклассифицированные представители порядка Melhylophilales 1,3-1,5 97-110

RS-X5 Stenotrophomonas maltophila 0,9 106

RS-B, RS-H Shewanella putrefaciens 0 91-128

RS-X6 Ochrobactrum cytisi 0 121

Для определения активности денитрификации при благоприятных окислительно-восстановительных условиях в слабощелочной придонной воде из обводного канала ПТБО в пробы вносили органические вещества и минеральные соединения азота (Табл. 7). После введения метанола и пирувата процесс денитрификации активировался слабо, преимущественно за счет усиления потребления нитритов. Введение метанола совместно с нитратами (по сравнению с добавками одних нитратов) существенно активировало только процесс накопления нитритов. Следует отметить, что добавление пирувата совместно с нитратами и, особенно, с нитритами, резко усиливало интенсивность денитрификации. При этом азот добавленных нитритов (5 мг N-N02/11) уже через 1 сутки практически полностью переходил в N20 (при ингибировании ЫзО-рсдуктазы ацетиленом).

Таблица 7. Повышение интенсивности денитрификации под влиянием добавок органических и азотсодержащих веществ (при 24°С) в образцах придонной воды обводного канала пермского НТБО ______

Добавка в 1 л пробы Контроль, вода без добавок Денитрификация, мкг N/л в сут 340±5 Содержание нитритов, мкг №л 60±5

Метанол, 1 мл 380±10 15±5

Пируват Ыа, 0,5 г 450±15 0

Ыа1МОз, 5 мг N 1430±50 360±15

ЫаЫОз, 5 мг N + метанол, 1 мл 1480±35 480±25

ЫаМОз, 5 мг N + пируват N8, 0,5 г 3840±40 250±10

№>Ю2, 5 мг N + пируват Ыа, 0,5 г 4850±80 460±35

Примечание. Пробы отобраны 4 октября 2012г. Температура природной воды составляла 2 °С, рН 7,9, содержание (мг Ы/л): нитриты - 0,3, нитраты - 7,8, аммоний -34,6.

Предварительное описание новых метилотрофных денитрифнкаторов, изолированных из фильтрационных вод ПТБО.

Ме111у1ор1щ£а К8-ММЗ «р. поу. Колонии на среде с агаром и метанолом бледно-розовые, круглые, выпуклые до 1-2 мм в диаметре. Клетки грамотрицательные аспорогенные подвижные палочки (0,3-0,5 х 1,0-2,0 мкм), умеренно гапофильные, нейтрофильные и мезофильные. Растёт в среде с 0,02-5% СНзОН (оптимум 0,6-0,8%) и 0,2-10% №С1 (оптимум 3-5%), при 1(М(ГС

(оптимум 28-33°С) и рН 6,0-9,5 (оптимум рН 7,5-8,2). Аэроб или факультативный анаэроб, оксидазо- и катапазо-положителен. Активную денитрификацию осуществляет в среде с пируватом, но значительно слабее с метанолом, лактатом, малатом и ацетатом. Факультативный метилотроф; метанол, метиламин, фруктозу и сахарозу использует в качестве источников углерода и энергии. Содержит mxaF ген, кодирующий метанолдегидрогеназу. Метан, глюкозу, дрожжевой экстракт не утилизирует. Продуцирует кислоты из метанола, но не из фруктозы и сахарозы. Гидролизует крахмал, но не казеин или желатин. В качестве источников азота использует аммоний, нитрат, триптон и метиламин. Добавка витамина В12, дрожжевого экстракта (0,005%) и микроэлементов ускоряет рост. Чувствителен к эритромицину (15 мкг /диск) и стрептомицину (10 мкг /диск), но устойчив к ампициллину (10 мкг/диск) и новобиоцину (30 мкг/диск).

При оптимальных условиях роста (30°С, рН 7,8) в среде с метанолом (5 мл/л, 30 г/л NaCl, 20 мкг/л витамин В12), преобладают следующие жирные кислоты (% от общего количества ЖК): С|б1ш7с (40,5), Cieo (35,2), и Ci8 iaj7c (18,7). Содержание Г+Ц в ДНК составляет 43,9 мол.%. Основываясь на секвенировании гена 16S рРНК (GenBank No KF371656) организм филогенетически близок к ограниченно-галоалкалофильным метилотрофам рода Methylophaga (95,3-96,7% сходства). Новый штамм идентифицирован как Methylophaga RS-MM3 sp. nov.

Methylotrophic bacterium RS-M7 gen. nov., sp. nov. Колонии на среде с агаром и метанолом оранжевые, выпуклые, круглые до 1-2 в диаметре. Клетки грамотрицательные аспорогенные подвижные палочки (0,6-0,7 * 0,8-1,5 мкм), пресноводные, нейтрофильные и мезофильные. Растёт в среде с 0,01-1,5% СНзОН (оптимум 0,3-0,5%) и 0 - 2% NaCl, при 15-40°С (оптимум 30-35°С) и рН 5,5-8,5 (оптимум рН 7,0-7,5). Аэроб или факультативный анаэроб не способный к ферментации, каталазо-положителен. Нитрат восстанавливает до NO2", N2O, и N2. Денитрификацию осуществляет на среде с пируватом, но слабее на метаноле. В качестве источников углерода и энергии использует метанол, метиламин, формальдегид, формиат, глюкозу и фруктозу. Содержит mxaF ген, кодирующий метанолдегидрогеназу. Ни из глюкозы, ни из фруктозы кислот не производит. В качестве источников азота использует аммоний, нитрат, пептон, глутамат и метиламин.

При оптимальных условиях роста (30°С, рН 7,0) в среде с метанолом (5 мл/л,) преобладают следующие жирные кислоты (% от общего количества ЖК): С160 (41,3), Ci6ил (39,5), и С[8:1ш7с (6,8). Содержание Г+Ц в ДНК составляет 57,4 мол.%. Основываясь на секвенировании гена 16S рРНК (GenBank No КС577611) организм филогенетически близок к видам четырёх родов внутри семейства Methylophilaceae (93,0-95,1% сходства). Штамм RS-M7 идентифицирован как новый вид нового рода семейства Methylophilaceae.

Круговорот углерода и азота в обводном канале ПТБО.

На ПТБО анаэробная биодеградация биополимеров происходит в четыре последовательных этапа (Рис. 7). Начальной стадией разрушения биополимеров является их гидролиз до мономеров с помощью экзоферментов разных видов грибов и бактерий. Сюда относятся представители филумов Firmicutes, Bacterioidetes, Fibrobacteres, Proteobacteria, Actinobacteria, Thermotogae (Defluviitoga turtisiensis), гидролизующих целлюлозу, пектин, лигнин, белки, липиды, полисахариды, крахмал и другие глюканы до моно- и олигосахаридов,

пептидов, мочевины, аминокислот, пуринов и пиримидинов, глицерина, фенольных соединений. Практически не поддаётся микробному разложению полимерная основа пластмасс типа полиэтиленовых пакетов.

На второй стадии анаэробного разложения OB продукты гидролиза биополимеров - мономеры сбраживаются с образованием ряда более простых соединений - низших кислот (ацетат, лактат, пируват, сукцинат, формиат, пропионат, бутират) и спиртов (этанол, пропанол, бутанол). Эту стадию осуществляют термофильные археи филума Crenarchaeota (Ignisphaera aggregans), мезофильные бактерии филумов Firmicutes, Bacterioidetes и многочисленные представители Alpha-, Beta-, Gamma-, Delta-, Epsilonproteobacteria.

На третей, ацетогеноой или водородогенной стадии, различные не полностью окисленные и восстановленные продукты брожения превращаются в ацетат, водород и СО2. На ПТБО этот процесс осуществляют преимущественно группа облигатно анаэробных сульфатвосстанавливающих бактерий (СВБ) Deltaproteobacteria родов Desulfovibro и Desulfobulbbus, восстанавливающих сульфаты до H2S и

ПОКРЫВАЮЩАЯ ПОЧВА ПТБО (Фотосинтез травянистой и кустарниковой растительности, продукция СН3ОН при метаболизме растений и распаде пектинов, метано- и метилотрофия в почве, ризосфере)

=>

СН„ нд со,

Сульфатредукция Метаногенез

Н2 ,С02, ацетат, формиат, метанол /1 Лактат, пропионат, пируват, этанол, пропанол,бутанол

/ Ацето- и se од о род ore не з

\J

со

МОНОМерЫ (моно- и олигосахариды, пептиды и аминокислоты, пурины и пиримидины, фенольные соединения, глицерин, метанол)

л s з

s в £

<Ǥ s

lía*

<f U ГО 0)

Р Ii §

_ 5 *

OP Sic

1|И

m m ro ct

о e V о

Pit

S 111

UJ О. У

9- «

о S

* о

35 I 8 te

Säg-,

-ü q_ m s IF«* ф i о. о

sill

zr о I TO

<c Í ® s

_u s ч- ro С О. 3 S ^ г- О c; 5 . to о

0 Q. С

.«- X Q.IO Q)

fSäja

с С j ¿ s.o. CN crt.

ТБО ПОЛИГОНА (древесные и бумажные материалы, старые вещи и бытовые приборы, строительный и городской мусор). БИОПОЛИМЕРЫ (целлюлоза, пектин, лигнин, белки, нуклеиновые кислоты, липиды, хитин, крахмал и другие полисахариды)

Ф

ЗАХОРОНЕНИЕ

(стеклообразующие,

керамические,

синтетические

полимерные материалы,

высокомолекулярный

лигнина-гумусовый

комплекс)

Рисунок 7. Анаэробная биодеградаиня биополимеров с образованием метана в «теле» ПТБО г. Перми со стоком концентрированного «водного гумуса» в обводной канал.

окисляющих лактат и пропионат лишь до ацетата, а также термотога Deßuviitoga tunisiensi, обладающая способностью и гидролизовать биополимеры, и сбраживать мономеры, и восстанавливать элементарную серу до сероводорода при использовании Сахаров с образованием ацетата, IЬ и СОг. Вторая группа сероредуцирующих (Desulforomonas thiophilä) и сульфатвосстанавливающих (Desulfobacter) Deltaproteobacteria осуществляет полное окисление лактата и ацетата до СОг.

Анаэробная деструкция мономеров завершается образованием СШ, сероводорода и СОг. Небольшие концентрации сульфатов в ТБО лимитируют процесс сульфатредукции, интенсивность накопления сульфидов невелика. Здесь распад OB идёт в основном с образованием СН4 и СОг. Облигатно анаэробные метанобразующие архебактерии для своего роста используют ограниченный набор субстратов, включающий Нг + СОг, ацетат, формиат, метанол, метилированные амины. На ПТБО современными методами молекулярной in situ детекции архей выявлены описанные в последние годы представители трёх различных кластеров метилотрофных метаногенов филума Euryarchaeota "Candidatus Methanomethylophilus alvus", "Candidatus Methanomassiliicoccus intestinalis", Methanomicrococcus blatticola, а также культивируемые ex situ морфотипы Methanosarcina, метаболизирующие Нг, ацетат, метанол, метиламины. В итоге, образование метана из сложных полимерных веществ - комплексный процесс, осуществляемый при участии различных групп микроорганизмов, с которыми метаногены вступают в синтрофные взаимоотношения.

Также в донных отложениях обводного канала трудногидролизуемая часть осевшего детрита примерно на 50 - 60% подвергается анаэробному распаду с образованием метана, лишь некоторая часть захоранивается и выпадает из круговорота углерода в водоёме с зарегулированным стоком. Основная масса метана, образовавшегося в илах и поступающего из тела ПТБО в обводной канал со стоком концентрированного «водного гумуса», окисляется метанотрофными Alpha-и Gammaproteobacteria. Идентифицированные нами виды метанокисляющих бактерий Methylobacter luteus, Methylomonas methanica, Methylocystis parvus, Methylosinus trichosporium были обнаружены ранее в покрывающих почвах других ПТБО (Ножевникова и др., 2006). Причём в тёплый весеннее-летний период численность почвенных метанотрофных Gammaproteobacteria родов Methylomonas и Methylobacter достигала 40 - 56% от общей численности бактерий.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что фильтрационные воды обводного канала ПТБО («Софроны», г.Пермь) характеризуются высоким уровнем загрязнения по аммонию, нитратам, нитритам, фосфору и тяжёлым металлам. В придонных водах реализуются интенсивные процессы денитрификации. Исключительно высокое содержание растворённого метана, соединений углерода, азота, фосфора и бикарбонатов натрия поступает с фильтратом из «тела» ПТБО (в составе тёплого тёмноокрашенного «водного гумуса»).

2. Установлено, что в сообществе микроорганизмов явно преобладают представители филума Proteobacteria (83,8±8,5% от общего количества домена Bacteria, детектируемых методом FISH). Представители домена Archaea сравнительно многочисленны лишь в тёплых анаэробных водах (6,3% от общего количества жизнеспособных клеток, выявляемых окрашеванием ДАФИ) при доминировании метилотрофных метаногенов филума Euryarchaeota (36 клонов трёх разных кластеров), Crenarchaeota (4 клона) и Taumarchaeola (1 клон).

3. Определено, что по мере охлаждения, деминерализации и насыщения кислородом фильтрационных вод после их смешения с водами поверхностного стока в микробных сообществах наблюдается эндодинамическая сукцессия: выпадают представители домена Archaea, снижается доля Delta- и Gammaproteobacteria, особенно метанотрофов подобных Methylobacter Intens, но увеличивается доля Betaproteobacteria, особенно метилотрофов подобных Advenella kashmirensis.

4. Из коллекции 103 накопительных культур было изолировано и идентифицировано 20 штаммов аэробных хемоорганотрофных нитрат-восстанавливающих a-, ß- и y-Proteobacteria, включая 15 денитрификаторов и 13 метилотрофов. По совокупности гено- и фенотипических признаков 17 изолятов обладали значительным сходством с известными видами протеобактерий.

5. Два штамма пресноводных метилотрофных денитрификаторов с Г+Ц в ДНК 57,4 - 58,2 мол.% отнесены к неидентифицированным Betaproteobacteria: по гену 16S рРНК они имеют уровень сходства с представителями четырёх родов семейства Methylophilaceae лишь 93-95%. Штамм умеренно галофильного метилотрофного денитрификатора с Г+Ц в ДНК 43,9 мол.% идентифицирован как Gammaproteobacteria нового вида рода Methylophaga (филогенетическое сходство соответствует межвидовому уровню 95,3-96,7%).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ

1. Шаравин, Д.Ю. Взаимодействие галотолерантных метилотрофных бактерий с растениями в условиях солевого стресса / Д.Ю. Шаравин, Н.П. Ковалевская // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. -Т.38. -№4(1). - С. 119-120.

2. Шаравин, Д.Ю. Применение ассоциативных метилотрофных бактерий в агротехнологии как стимуляторов роста пшеницы на засолённых почвах / Д.Ю. Шаравин, Н.П. Ковалевская // Аграрный вестник Урала. - 2015. - № 1(131). - С. 17-20.

3. Шаравин, Д.Ю. Молекулярная in situ детекция микроорганизмов в фильтрационных водах полигона захоронения твёрдых бытовых отходов / Д.Ю. Шаравин, П.Г. Беляева, А.И. Саралов, Б.Б. Кузнецов // Российский иммунологический журнал (Тематический выпуск по микробиологии, иммунологии и биотехнологии). - 2015. - Т. 9 (18). - №2 (1). - С. 620-622.

Публикации в других журналах и сборниках

1. Шаравин Д.Ю. Распространение галотолерантных метилотрофных бактерий на растениях техногенно-засолённых почв / Д.Ю. Шаравин //Материалы V Всероссийского с международным участием медико-биологического конгресса молодых учёных «Симбиоз - Россия 2012». - Тверь - 2012 - С. 356-357.

2. Шаравин Д.Ю. Генетический потенциал галотолерантных метилотрофных бактерий в ассоциативном фитосимбиозе / Д.Ю. Шаравин // Материалы VI Всероссийской конференции молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой»,- Саратов,-2012 - С. 131.

3. Шаравин Д.Ю. Выделение и идентификация денитрифицирующих метилотрофов из сточных вод полигона захоронения твердых бытовых отходов / Д.Ю. Шаравин // Материалы IX молодёжной школы - конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». -Москва.-2013,-С. 117-120.

4. Шаравин, Д.Ю. Разнообразие культивируемых протеобактерий в фильтрационных водах полигона захоронения твёрдых бытовых отходов / Д.Ю. Шаравин // Бюллетень Оренбургского научного центра. - Оренбург - 2014. - № 3.

Список сокращений

ДАФИ - 4'6'-диамино-2-фенилиндол; OB - органическое вещество;

ПТБО — полигон захоронения твёрдых бытовых отходов;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

СВБ - сульфатвосстанавливающие бактерии;

ТБО - твердые бытовые отходы;

FISH - флуоресцентная in situ гибридизация;

N6- общая численность бактерий.

ШАРАВИН Дмитрий Юрьевич

Ш$1Ти / ЕХБ1Ти ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ФИЛЬТРАЦИОННЫХ ВОД ПОЛИГОНА ТВЁРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ

03.02.03 Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать . Формат 60х90/16.

Усл.печ.л. 1. Тираж 120 экз. Заказ Набор компьютерный

Отпечатано в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13