Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние факторов стресса на свойства нитратредуктаз микроорганизмов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние факторов стресса на свойства нитратредуктаз микроорганизмов"

на правах рукописи

Морозкива Елена Владимировна

ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ СТРЕССА НА СВОЙСТВА НИТРАТРЕДУКТАЗ МИКРООРГАНИЗМОВ.

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2005

Работа выполнена в лаборатории биологического окисления Института биохимии им А.Н. Баха РАН

Научные руководители: доктор биологических наук.

профессор

Н.П. Львов

доктор биологических наук, профессор Р.А. Звягильская

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Г.И. Эль-Регистан кандидат биологических наук О.В. Королева

Ведущая организация: Институт фундаментальных

проблем биологии РАН, г. Пущино

Защита состоится 2005 г. в часов на заседании

диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «/£>> сал^г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

/О

А.Ф. Орловский

10U5

SLAMQbV

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние десятилетия огромный интерес исследователей вызывает изучение действия факторов стресса на рост и развитие микроорганизмов. Согласно современным представлениям стрессогенными факторами считают не только экстремальные значения pH, температуры, высокие концентрации солей, но и другие факторы, не являющиеся традиционными для жизнедеятельности данного вида микроорганизмов. Особого внимания заслуживает ключевой фермент азотного обмена - нитратредуктаза (НР-аза), поскольку понимание механизмов его функционирования в "нормальных" условиях и условиях стресса (которым часто подвергаются микроорганизмы и растения), имеет не только фундаментальное, теоретическое, но и большое практическое значение. Несмотря на разнообразие форм HP-аз и различную локализацию в клетке, все до сих пор исследованные HP-азы микроорганизмов и растений, выращенных в "нормальных" условиях, содержали в активном центре молибден в виде молибденового кофактора (Moco). Лишь в самое последнее время появились первые указания на то, что "необычные" условия жизнедеятельности микроорганизмов (высокие концентрации железа, ванадата и др.) могут приводить к структурной модификации HP-азы, связанной с перестройкой ее активного центра. Так, из диссимиляторной ванадат-восстанавливающей бактерии Pseudomonas isachenhovii, выращенной на среде с ванадатом и нитратом, в нашей лаборатории вперые были выделены две HP-азы (периплазматическая и мембранносвязанная), не содержащие молибден и молибденовый кофактор [Antipov et al., 1998]. Периплазматическая НР-аза содержала в активном центре ванадий, что могло быть связно с условиями обитания микроорганизма. Из железовосстанавливающей бактерии Geobacter metallireducens, выращенной на среде, содержащей нитрат или железо, был выделен гем-содержащий мембранный ферментный комплекс, способный восстанавливать нитраты и не содержавший в своем составе молибден [Murillo et al., 199 ение влияния

факторов стресса на азотный обмен в целом и, в частности, на его ключевой фермент - HP-азу, является актуальной проблемой.

Дель и задачи исследования. Целью настоящей работы стало изучение влияния факторов стресса на свойства и структуру HP-азы у прокариот (галоалкалофильные бактерии Halomonas sp. штамм AGJ 1-3) и эукариот (гриб Fusarium oxysporum от ассимиляторного аналога, солетолерантные дрожжи Rhodotorula glutinis). Спектр стрессогенных факторов включал высокие концентрации солей, щелочные значения pH, смену условий культивирования (аэробиоз-анаэробиоз).

Научная новизна.

• Обнаружено, что гриб F. oxysporum штамм lldnl способен к денитрификации в анаэробных условиях, что выделяет его среди других эукариотических организмов. Гриб синтезирует de novo активную диссимиляторную HP-азу, существенно отличающуюся по своим свойствам от ассимиляторного фермента.

• Показано, что солетолерантные дрожжи Rhodotorula glutinis в ответ на воздействие 1 мМ вольфрамата способны синтезировать вольфрам-связывающий белок, сорбирующий до 4,6-9,9 мкг вольфрама /мг бежа. Синтезируемая при этом HP-аза характеризуется необычной устойчивостью к высоким концентрациям вольфрама (сохранение 100 % -ой активности при воздействии 1 мМ вольфрамата).

• Обнаружено, что HP-аза галоалкалофильной денитрифицирующей бактерии Halomonas sp. штамм AGJ 1 -3 не содержит молибден и Moco, характеризуется высоким температурным оптимумом (70°С), повышенной термостабильностью и широкой субстратной специфичностью, что дает основание предполагать существование целого класса альтернативных безмолибденовых НР-аз, обладающих сходными свойс^вад^и.'

Научно-практическое значение. Полученные данные позволяют существенно расширить представление о влиянии факторов стресса на свойства ключевого фермента азотного обмена - HP-азу. Настоящая работа является фундаментальным исследованием, однако уникальные свойства исследуемых HP-аз (высокий оптимум температуры, высокая стабильность и термостабильность) создают предпосылки для их практического применения в качестве биологических компонентов для очистки различных техногенных объектов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на XIII международной конференции молодых ученых по химии и химической технологии "МКХТ-99" (Москва, 1999), на школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), на III Съезде биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002), на школе-конференции "Биология -наука XXI века" (Пущино, 2004).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ, в числе которых 5 статей в ведущих российских журналах. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на /fC7 страницах. Список цитируемой литературы включает £2$ наименований, в том числе JJM на иностранных языках. Иллюстративный материалы содержит Л9 рисунков и £~ таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объекты исследования.

В работе использовали прокариотические (галоалкалофильные бактерии Halomonas sp. штамм AGJ 1-3) и эукариотические (микроскопические грибы Fusarium oxysporum штамм lldnl и солетолерантные дрожжи Rhodotorula glutinis) микроорганизмы. Условия выращивания микроорганизмов.

Fusarium oxysporum штамм lldnl выращивали, как описано ранее [Kurakov et al., 2000]. Для создания анаэробных условий среду продували аргоном в течение 2 мин.

Солетолерантный штамм дрожжей Rhodotorula glutinis выращивали на среде, не содержащей молибден, с добавлением высоких (0,33 г/л) концентраций Na2W04*2H20 [L'vov et al., 2000]. В качестве контроля использовали среду аналогичного состава, не содержащую вольфрамат натрия. Клетки галоалкалофильной денитрифицирующей бактерии Halomonas sp.. штамм AGJ 1-3. культивировали анаэробно в течение 2-3 дней при 30 °С в 5-литровых бутылях в среде, содержащей (г/л): Na2C03-20; NaHC03-10; NaCl-5; К2НР04-1; KN03-1; MgS04*7H20-0,1; дрожжевой экстракт-0,2; CH3COONa*3H20-l,0; Na2S203*5H20-0,25, pH 10,5, и микроэлементы (1мл/л) по Пфенигу [Pfennig and Lippert, 1966] Получение бесклеточного экстракта.

Мицелий гриба F. oxysporum отделяли фильтрованием от культуральной среды, промывали дистиллированной водой, суспендировали в 0,1 М Na-фосфатном буфере, pH 7,2, содержащем 1 мМ ЭДТА и 0,5 мМ PMSF (ингибитор протеаз), замораживали в жидком азоте и растирали в ступке в течение 5-7 мин. Полученный гомогенат центрифугировали при 12 000 g в течение 30 мин и использовали супернатант для дальнейшей очистки.

Клетки дрожжей Rh. glutinis и бактерий Halomonas sp. осаждали центрифугированием при 7 ООО g и 4°С в течение 15 минут, суспендировали в 25 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,0, содержащем 0,5 мМ Na-ЭДТА и 0,3 мМ PMSF, и разрушали с помощью Френч-пресса при давлении 200-220 атм. Гомогенат центрифугировали при 15 000 g в течение 30 мин и полученный супернатант использовали для выделения гомогенных препаратов НР-аз.

Для выделения и очистки НР-аз использовали ионообменную хроматографию, гель-хроматографию и препаративный электрофорез. Определение активности НР-азы.

Для определения метилвиологен-зависимой активности НР-азы в качестве донора электронов использовали восстановленный дитионитом метилвиологен (или бромфеноловый голубой). Реакционная смесь содержала: 80 мМ Na-фосфатный буфер, рН 7,0, 0,8 мМ метилвиологен (или 0,5 мМ бромфенол); 20 мМ KN03; 2,0 мМ дитионит натрия и исследуемый препарат (20-100 мкл). Реакцию инициировали добавлением дитионита и останавливали встряхиванием до исчезновения голубой окраски. Содержание нитритов в реакционной смеси определяли, как описано ранее [L'vov et al., 2000].

NADH - и NADPH - зависимую НР-азную активность определяли при 30 °С в течение 15 мин, используя реакционную смесь, содержащую: 60 мМ Na-фосфатный буфер, рН 7,0; 0,15 мМ НАДФН; 0,01 мМ; 10 мМ KNO3 и 2,5 мМ NaMo04*2H20. Реакцию начинали добавлением NADH (NADPH) и останавливали кипячением в течение 15 минут для удаления избытка NADH (NADPH), мешающего окраске на нитриты. За единицу активности НР-азы принимали количество фермента, катализирующего образование 1 нмоль N02~ за 1 мин при оптимальной температуре.

Определение активности Moco основано на использовании мутанта nit-l гриба

Neurospora crassa, содержащего дефектную по Moco НР-азу. При комплементации

Moco с апоНР-азой мутанта nit-l происходит сборка функционально активного

фермента. Мутант nit-l гриба N. crassa выращивали и получали из него

5

бесклеточный экстракт, как описано ранее [Nason et al., 1970]. Комплементацию исследуемых нами образцов с мутантом nit-1 гриба N. crassa проводили по методике, указанной в протоколе [Hawkes and Bray, 1984]. Активность вновь образовавшейся in vitro HP-азы определяли используя NADPH в качестве донора электронов.

Молекулярную массу белков оценивали методом гель - хроматографии на колонке Toyopearl HW-55 (2,9 х 61 см), уравновешенной 50 мМ Na-фосфатным буфером, pH 7,0, содержащим ОД М NaCl и 1 мМ ЭДТА. Элюцию белков проводили при температуре 4°С. Использовали следующие стандартные белки-метчики: ферритин (470 кДа), алкагольдегидрогеназу (150 кДа), бычий сывороточный альбумин (67 кДа), цитохром С (12,3 кДа).

Нативный (неденатурирующий) электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ-ЭФ) проводили, используя градиент (5-15% в пластине размером 11x11см и толщиной 1 мм в буфере Tris-HCl, pH 8,8, по методу Дэвиса [Davis, 1965]. Для определения молекулярной массы гомогенного препарата HP-азы использовали высокомолекулярные белки-стандарты (Pharmacia Electrophoresis HMW Calibration Kits).

Субъединичный состав белков определяли методом электрофореза в денатурирующих условиях по методу [Laemmli, 1970] в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия и при концентрации разделяющего геля 5-20%. Белковые полосы окрашивали серебром по методу [Nesterenko, 1994]. Определение ферментативной активности в ПААГ проводили, используя в качестве хромогена раствор, содержащий: 0,1 М Na-фосфатный буфер, pH 6,8, 20 мМ KN03 (или 1мМ NaNCb, 1мМ КС103), 1 мМ метилвиологен и 5 мМ дитионит натрия. Гель инкубировали в растворе хромогена при 70°С до появления на синем фоне геля прозрачных полос, образующихся вследствие окисления метилвиологена ферментом. Для фиксации окраски использовали 0,05% раствор трифенилгетразолийхлорида и 5% уксусную кислоту.

Содержание металлов в гомогенных препаратах HP-аз определяли методами плазменной атомно-эмиссионной спектрометрии и плазменной масс-спектрометрии на приборах Optima 2000 DV (PerkinElmer, США) и ELAN 9000 (PerkinElmer, США).

Содержание вольфрама определяли с помощью разработанного нами кинетического метода, основанного на способности молибдена и вольфрама катализировать реакцию окисления рубеановодородной кислоты. Диапазон измеряемых концентраций составил 0,05 до 0,4 мкг вольфрама/мл. MALDI масс-спе1сгрометрия. Масс-спектры гомогенного препарата НР-азы получали на MALDI-TOF-масс-спектрометре Reflex Ш ("Bruker", США) с УФ-лазером (336 нм) в режиме положительных ионов в диапазоне масс 500-8000 Да. Идентификацию белков проводили с помощью программы Mascot, Peptide Fingerprint ("Matrix Science", США), с точностью определения массы МНГ, равной

0.01%, и по базам данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI). Данные, приведенные в таблицах и на рисунках -средние арифметические значения из трех и более повторностей; стандартное отклонение которых не превышало 5%

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. Изучение свойств НР-азы гриба Fusarium oxysporum штамм lldnl при смене условий аэрации мицелия.

Из 50 изученных нами видов микроскопических грибов только Fusarium oxysporum, штаммы lldnl и 301, Fusarium solani 302 и Dr echsler a sp. 22dnl оказались способными осуществлять процесс денитрификации на среде с нитратом в анаэробных условиях, при этом у них наблюдалось резкое увеличение активности НР-азы. Наиболее выраженное увеличение активности НР-азы (в 14 раз), связанное с изменением условий аэрации, наблюдали у штамма 1 ldnl гриба F oxysporum, который и был выбран для дальнейших исследований.

Мицелий, выращенный аэробно на среде, содержащей 5 мМ аммоний (репрессор синтеза ассимиляторной НР-азы) в течение 72 часов, переносили на среду с нитратом (10 мМ) и последовательно инкубировали сначала в анаэробных (22 ч), а затем в аэробных (32 ч) условиях. Перенос мицелия из аэробных в анаэробные условия сопровождался резким увеличением активности НР-азы через 5 часов, высокая активность фермента сохранялась в ходе всего периода инкубации мицелия в анаэробных условиях, но резко снижалась до исходного уровня после смены анаэробных условиий на аэробные (Рис. 1). Активность НР-азы в контрольном варианте мицелия, выращенного на среде с аммонием, перенесенного на нитрат-содержащую среду и инкубированного в аэробных условиях, изменялась незначительно, в пределах 20-22 нмоль/минмг (Рис. 1).

Время, ч

Рис. 1. Активность НР-азы Р. охузрогит 11 с1п1 при смене условий аэрации.

К-контрольный вариант (аэробные условия в течение всего эксперимента).

НР-азы из "аэробного" и "анаэробного" вариантов мицелия гриба Р.охузрогит 11с1п1 различались по удельной активности, молекулярной массе и температурному оптимуму (Таблица 1), что позволило предположить существование двух различных форм НР-аз, ассимиляторной, синтезируемой в аэробных условиях, и диссимиляторной, синтезируемой в анаэробных условиях.

Таблица 1. Сравнение свойств НР-аз из мицелия гриба К охуярогит 1Ып1, инкубируемого в аэробных и анаэробных условиях

Свойства Аэробный мицелий Анаэробный мицелий

Удельная активность НР-азы,

мкмоль Ж)27мин*мг белка 0,01-0,1 0,4-1,1

Молекулярная масса НР-азы, кДа 265 355

Доноры электронов MVH, ВРВН, MVH.NADPH,

NADPH, NADH ВРВН, NADH

Температурный оптимум, °С 20 35

рН оптимум 6,0-7,0 6,0-7,0

Кофактор Moco Moco

Влияние на синтез НР-азы Ингибирует Не влияет

Тип НР-азы Ассимиляторный Диссимиляторный

Добавление циклогексимида (ингибитора синтеза белка на цитоплазмагаческих рибосомах), к мицелию, выращеннему на аммоний-содержащей среде и затем перенесенному в анаэробные условия, предотвращало увеличение активности НР-азы, что указывало на синтез диссимиляторной НР-азы de novo. Исследование активного центра при помощи классического теста с апоНР-азой мутанта nit-1 гриба N. crassa, дефектной по Moco показало, что

9

дяссимиляторная НР-аза, как и ее ассимиляторный аналог, содержала в активном центре Moco. НР-аза "анаэробного" варианта мицелия F. oxysporum lldnl является вторым примером существования диссимиляторной НР-азы у эукариот. Впервые диссимиляторная НР-аза была обнаружена у штамма МТ 811 гриба F. oxysporum [Uchimura et al., 2002].

П. Изучение НР-азы солетолерантного штамма дрожжей Rhodoíorula glutinis, выращенного в присутствии 1 мМ вольфрамата.

Для оптимального роста микроорганизмов необходимы и достаточны низкие (микромолярные) концентрации молибдена (соли молибдена входят в стандартный набор микроэлементов). Вольфрам, обладая сходными с молибденом физико-химическими свойствами, способен замещать его в ферментах, образуя при этом каталитически неактивные аналоги, причем ингибирующее действие наблюдается уже в присутствии микромолярных концентраций [Afshar et al., 1998, 2002]. Высокие концентрации молибдена и вольфрама могут рассматриваться в качестве факторов стресса. Наши исследования показали, что солетолерантный штамм дрожжей Rh. glutinis, в отличие от несолеустойчивого штамма, способен расти на среде, содержащей высокие (1 мМ) эквимолярные концентрации вольфрама и молибдена, при этом наблюдалось значительное увеличение скорости роста дрожжей на нитрат-содержащей среде и увеличение уровня синтеза НР-азы.

Добавление 1 мМ вольфрамата к среде, содержащей нитрат и лишь следовые количества Мо (<0,001 %), хотя и приводило к появлению длительной (40-60 ч) лаг-фазы, но не ингибировало рост полностью (Рис. 2). Методом гель-хроматографии в бесклеточном экстракте выращенных таким образом дрожжевых клеток были обнаружены два пика с НР-азной активностью, что указывало на наличие двух изоформ фермента с различными молекулярными массами (НР1 ~ высокомолекулярная и НР2 - низкомолекулярная изоформы) (Рис. 3).

При комплементации препаратов НР1 и НР2 с апоНР-азой мутанта nit-1 гриба N. crassa в обоих вариантах было обнаружено совпадение НР-азной активности с активностью Moco, что указывает на наличие Moco в активном центре ферментов. Анализ металлов в составе ферментов показал, что НР2 содержала лишь молибден, тогда как в НР1 - присутствовали как молибден, так и вольфрам.

Время, ч

Рис. 2. Кривые роста КИ^иОпю на модифицированной (не содержащей молибден) среде Рид ер а, в отсутствие добавленного молибдена (1) и в присутствии 1 мМ Na2W04 (2). Столбики - активность НР-азы, нмоль Ы027мин на мг белка.

При выращивании дрожжей на среде, содержащей 5 мМ ИН/ (репрессор синтеза НР-азы) и I мМ вольфрамат, также присутствовала высокомолекулярная

11

фракция НР1, которая не обладала ферментативной активностью, но содержала вольфрам (Рис. 4).

Анализ полученных данных позволил предположить, что пик НР1 вероятнее всего состоял из вольфрам-связывающего белка и высокомолекулярной НР-азы (однако, нельзя исключить возможность существования неспецифической поверхностной сорбции вольфрама на НР1).

С 0,0

№ фракции

Рис. 3. Гель - хроматография на колонке Toyopearl HW-55 экстракта из клеток дрожжей Rh. glutinis, выращенных в присутствии 1 мМ вольфрамата: 1 -поглощение при 280 нм; 2 - активность НР-азы, нмольЖ>27мин; 3 - активность Moco, нмольЬЮг'/мин; 4 - содержание W, мкг/мл.

В дальнейшем мы сосредоточили свое внимание на изучении

низкомолекулярной фракции НР2, поскольку ее вклад в общую клеточную НР-

12

азную активность составлял 75,0 - 85,6% (в зависимости от метода разрушения клеток) и, по-видимому, изменение структуры и свойств именно этого фермента

А.

1,2 |

£

Si

№ фракции

Рис 4. Гель - хроматография на колонке Тоуореаг1 Н\У-55 экстракта из клеток солетолерантного штамма дрожжей Як 21иНт$, выращенных на аммоний-содержащей среде в присутствии 1 мМ вольфрамата: 1 - поглощение при 280 нм; 2 - содержание вольфрама, мкг/мл. Активность НР-азы во фракциях отсутствовала.

предопределили возможность существования данного штамма дрожжей в условиях стресса. В результате разработанной схемы очистки бесклеточного экстракта, включающей осаждение сульфатом аммония (0-40%), ионообменную хроматографию на DEAE-Toyopearl 650 М, гель-хроматографию на Sephacryl S-200 и ионообменную хроматографию на DEAE- cellulose DE-52, из бесклеточного

13

экстракта солетолерантного штамма дрожжей Rh. glutinis был получен электрофоретически гомогенный препарат НР-азы (Рис.5). Свойства фермента суммированы в Таблице 2. Фермент представлял собой гомодимер с массой субъединиц 65 кДа, содержал в активном центре Мо в виде Moco, обладал достаточно высоким температурным оптимумом (35-45°С), что не характерно для ферментов, выделенных из мезофильных организмов Исследуемый фермент не ингибировался добавлением 1 мМ вольфрамата (сохранял 100%-ную активность).

Рис. 5. Нативный (1,2) и вОБ (3,4) электрофорез гомогенного препарата НР-азы из солетолерантного штамма дрожжей ДА. glutims. 1,3 - белки-стандарты; 2,4 -гомогенный препарат НР-азы.

Устойчивость дрожжей Rh. glutinis к вольфраму, по-видимому, обусловлена

защитными механизмами, ранее описанными для некоторых микроорганизмов и

растений, - синтезом металлсвязывающих белков и пептидов Как уже

упоминалось ранее, фракция НР1 содержала вольфрам-связываюппш белок (с

14

содержанием вольфрама - 4,6-9,9 мкг/мг), причем его синтез не зависел от источника азота и индуцировался высоким уровнем вольфрама в среде. Попытки выделения вольфрам-связывающего белка традиционными методами (использование детергентов - Triton Х-100, Твина 80, Твина 85, гексадецилгриметиламмониум-бромида, холата Na, мочевины; очистка при помощи ионообменной, аффинной и гель-хроматографии) были безуспешными из-за быстрой потери белком вольфрама. Факт, что при действии липолитических ферментов так же происходила диссоциация вольфрама, а при использовании растворителей белок обнаруживался во фракции хлороформа, указывал на высокое содержание липидов в белке.

Таблица 2. Свойства гомогенного препарата HP-азы дрожжей Rh. gluiinis

Удельная активность, мкмоль >Ю27мин*мг 1,3

Субъединичный состав Гомодимер

Молекулярная масса субъединиц, кДа 65

Металл в активном центре Мо

Кофактор Мосо

Температурный оптимум, °С 35-45

рН оптимум 6,5-7,5

Км, мМ 0,74 ±0,08

Влияние ингибиторов:

мкМ 44,0

/0.5(СК),мкМ 9,4

N^04 (1 мМ) Не влиял

Известно, что солеустойчивые штаммы дрожжей имеют повышенное содержание белков теплового шока №р26р и №р12р и (или) белкового фактора с молекулярной массой 140 кДа, способного связываться со з^евв-элементом в

промоторе генов, кодирующих разные ферменты, что обуславливает их устойчивость к различным факторам стресса. Способность дрожжей Rh. glutinis расти на 1 мМ вольфраме может быть связана именно с такой устойчивостью солеустойчивого штамма к воздействию стресса.

Ш. Изучению свойств и структуры НР-азы галоалкалофильной бактерии Halomonas sp. штамм AGJ1-3.

В предварительных опытах нами было показано, что при анаэробном выращивании клеток Halomonas sp. штамм AGJ 1-3 в присутствии 1 мМ вольфрама не наблюдалось ингибирования процесса денитрификации. Подобная устойчивость к воздействию фактора стресса могла быть обусловлена синтезом НР-азы, отличающейся по своим свойствам (например, повышенная устойчивость фермента к вольфраму, как в случае с Rh. glutinis) и/или структуре (перестройка активного центра) от ферментов, синтезирующихся в "нормальных" условиях.

Методом 2-стадийного препаративного электрофореза в неденатурирующих условиях был получен гомогенный препарат НР-азы штамма AGJ, представляющий собой мономер с молекулярной массой 130 кДа (Рис. 6). Удельная активность гомогенного препарата НР-азы достигала 250 мкмоль N02" /мин на мг белка, что позволило оценить ее как высокую для данного класса диссимиляторных ферментов. Активность выделенного фермента уступала только активности НР-азы из гипертермофильной археи Pyrobaculum aerophilum, измеренной при 70 °С (326 мкмоль N02"/mhh на мг бежа) [Afshar et al., 2001]. Свойства фермента представлены в Таблице 3.

Методом MALDI-спектроскопии показано, что НР-аза штамма. AGJ -неизвестный ранее фермент, полная аминокислотная последовательность которого не имеет гомологии с первичной структурой известных редуктаз. Комплементация исследуемого препарата НР-азы с дефектной по Moco НР-азой мутанта nit-1 гриба N. crassa не приводила к появлению активной НР-азы, что указывало на

16

отсутствие молибдена и Moco в составе активного центра фермента (Таблица 3) Прямое определение металлов методами плазменной атомно-эмиссионной спектрометрии и плазменной масс-спектрометрии также показало отсутствие молибдена Полученные данные указывают на то, что НР-аза, выделенная из штамма AGJ, является новым ферментом и принадлежит к классу альтернативных НР-аз, не содержащих молибден и Moco.

Рис. 6. вББ (1, 2) и нативный (3-6) -электрофорез гомогенного препарата НР-азы из клеток Но1отопаз яр. штамм А01 1-3. 1 - белки-стандарты; 2 - гомогенный препарат НР-азы; Полианионредуктазная активность: 3 - контроль (окраска на белок); в присутствии: 4 - ЫОз~; 5 - N02"; 6 - С10з~.

Фермент характеризуется достаточно высоким содержанием "стрессорных"

аминокислот - глицина (15%) и аланина (13,6%), характерных для участков а -

спирали полипептидной цепи. Согласно данным металлоанализа и спектрометрии

(характеристическое плечо в области 410 нм на спектре поглощения), фермент

содержит ионы железа, однако пока остается неясным, в какой именно форме. Для

17

установления природы активного центра, содержащего железо, необходимо проведение дальнейших исследований.

Несмотря на высокую щелочность среды роста клеток (рН 10,5), фермент имел четко выраженный оптимум при рН 7,0, что позволило высказать предположение о наличии в клетках высокоэффективных механизмов поддержания внутриклеточного рН-гомеостаза.

Таблица 3. Свойства гомогенного препарата НР-азы из клеток НоЪтопав яр. штамм Ав11-3.

Удельная активность, мкмоль М027мйн*мг 250

Субъединичный состав Мономер

Молекулярная масса, кДа 130

Металл в активном центре Fe

Наличие Moco отсутствует

Температурный оптимум, °С 70-80

Термостабильность (Io.s при 70 оС), мин 35

рН оптимум 7,0

Влияние ингибиторов:

hs (N3"), мкМ 36,0

I0,s (CN"), мкМ 110,0

Субстратная специфичность: No3-, CKV, NO2-

Необычным свойством фермента является достаточно высокий температурный оптимум, составляющий 70 - 80 °С, и высокая термостабильность (галоалкалофильные бактерии, отнесенные к роду НаЬтопаэ, являются мезофилами). Повышенный температурный оптимум наблюдался у всех выделенных до сих пор безмолибденовых НР-аз и, по-видимому, является их отличительным признаком.

Причины высокой термостабильности и повышенного температурного оптимума НР-азы пока остаются неясными. Существует гипотеза, согласно которой содовые озера, являющиеся экологической нишей современных алкалофильных микробных сообществ, представляют собой модель жизни на континентах в докембрии (около 4 млрд. лет назад) и могут рассматриваться как центры происхождения микробного разнообразия [Заварзин и Жилина, 2000}. Поскольку этот геологический период сопровождался активной вулканической деятельностью, адаптация алкалофилов к существованию при высокой температуре окружающей среды являлась необходимым условием их выживания, обеспечивая тем самым развитие всей прокариотной биосферы, и сохранилась в их биологической памяти.

НР-аза штамма А01 восстанавливала не только нитрат, но и нитрит и хлорат (Рис. 5, Таблица 3). Активность с нитритом составляла приблизительно 5 % от НР-азной активности и проявлялась только в случае отсутствия нитрата в реакционной смеси. Способность к восстановлению ряда анионов была впервые показана для гем с-содержащего мембранного ферментного комплекса железовоссганавливающей бактерии ОеоЬааег те1аШге<1исет [Мип11о ег а)., 1999], катализирующего превращение нитратов, нитритов, хлоратов, селенатов, фумаратов и тиосульфатов. Не исключено, что именно перестройка активного центра, связанная с отсутствием в нем молибдена, обуславливает способность фермента к восстановлению ряда анионов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В результате проведенных исследований было обнаружено, что ответ микроорганизмов на воздействие факторов стресса зависит от особенностей метаболизма данного организма и природы фактора стресса. Выращивание гриба Fusarium oxysporum lldnl в условиях варьирования концентраций кислорода вызывало кардинальную перестройку метаболизма организма - переход от ассимиляторного типа азотного обмена к диссимиляторному. Рост дрожжей Rhodotorula glutinis на среде с высокими концентрациями вольфрама (антагониста молибдена), приводил к синтезу новой вольфрам-устойчивой формы НР-азы, одновременно синтезировался(лись) и вольфрам-связывающий(ие) белок(и), способствуя уменьшению внутриклеточной концентрации вольфрама. Рост бактерий Halomonas sp. в экстремальных условиях (высокая концентрация солей, pH 10,5) сопровождался синтезом альтернативной (безмолибденовой) НР-азы, отличающейся от "нормальных" HP-аз не только по строению активного центра, но и по своим физико-химическим свойствам (высокий оптимум температуры -70°С, полианионредукгазная активность и др.).

выводы.

Изучено влияние факторов стресса (изменение концентрации кислорода, влияние высоких концентраций солей тяжелых металлов, щелочные значения pH) на эукариотические (гриб F. oxysporum штамм lldnl, солетолерантный штамм дрожжей Rhodotorula glutinis) и прокариотические (галоалкалофильные бактерии Halomonas sp. штамм AGJ 1-3) организмы.

Показано, что смена аэробных условий на анаэробные при культивировании гриба Fusarium oxysporum штамм приводила к индукции синтеза высокоактивной диссимиляторной HP-азы, отличавшейся от ассимиляторного аналога не только активностью, но и молекулярной массой, температурным оптимумом.

В ответ на высокие концентрации вольфрама (в отсутствии молибдена в среде выращивания) клетки солетолерантного штамма дрожжей Rhodotorula glutinis синтезировали вольфрам-связывающий белок, сорбирующий до 4,6-9,9 мкг вольфрама/мг белка. Выделенный из клеток дрожжей, выращенных в таких условиях, электрофоретически гомогенный препарат HP-азы обладал повышенным температурным оптимумом (35-45°С) и необычной устойчивостью к вольфраму (сохранение 100 % -ой активности HP-азы при воздействии 1 мМ вольфрамата). Рост галоалкалофильных бактерий Halomonas sp., штамм AGJ 1-3, в щелочных условиях (pH 10,5) в присутствии высоких концентраций солей сопровождался синтезом альтернативной HP-азы, не содержавшей молибден и молибденовый кофактор. Выделенный электрофоретически гомогенный препарат HP-азы характеризовался высоким температурным оптимумом (70°С), повышенной термостабильностью и широкой субстратной специфичностью.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

Статьи

1. Носиков А.Н., Чичикало Е.В., Голубева Л.И., Звягильская P.A., Львов Н.П. (2000) Стимуляция ннтратредуктазной активности в солетолерантных дрожжах Rhodotorula glutinis вольфрамом в присутствии молибдена. Биохимия, 65(2), 245-249

2. Носиков А.Н., Чичикало Е.В.. Львов Н.П. (2001) Кинетический метод определения вольфрама в вольфрам-содержащих ферментах. Прикл. Биохимия и микробиология, 37(6), 739-741

3. Морозкина Е.В., Носиков А.Н., Звягильская P.A., Львов Н.П. (2005) Выделение, очистка и характеристика нитратредуктазы из клеток солетолерантного штамма дрожжей Rhodotorula glutinis, выращенных в присутствии вольфрамата. Биохимия, 70(7), 980-986

4. Антипов А.Н., Морозкина Е.В., Сорокин Д.Ю., Голубева Л.И., Звягильская P.A., Львов Н.П. (2005) Характеристика не содержащей молибден нитратредуктазы галоалкалофильной бактерии Halomonas sp, штамм AGJ 1-3. Биохимия, 70(7), 968-973

5. Морозкина Е.В., Кураков A.B., Носиков А.Н., Сапова Е.В., Львов Н.П. (2005) Свойства нитратредуктазы гриба Fusarium oxysporum lldnl, выращенного в аэробных и анаэробных условиях. Прикл. Биохимия и микробиология, 41 (3), 298-302.

Тезисы

1. Чичикало Е.В., Оводов П.В., Носиков А.Н. Нитратное питание солетолерантных дрожжей: влияние засоления и тяжелых металлов. Тезисы докл. XIII Международной конференции молодых ученых по химии и химической технологии "МКХГ-99", Москва, 1999, с. 44.

2 Носиков А.Н., Чичикало Е.В., Звягильская P.A., Львов Н.П. Влияние вольфрама на нитратредуктазу солетолеран-гаых дрожжей Rhodotorula glutinis. Тезисы докл. на школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии", 28 мая - 2 июня, Пущино, 2000, с. 317-318.

3. Антипов А.Н., Салипа Е.Г., Болтянская Ю.В., Чичикало Е.В. Особенности нитратредуктаз алкало фи льных микроорганизмов. III Съезд биохимического общества России, 26 июня -1 июля, Санкт-Петербург, 2002, с. 62

4. Морозкина Е.В., Антипов А.Н. (2004) Нитратредуктаза, не содержащая молибден и молибденовый кофактор из алкалофильной бактерии Halomonas sp. Штамм AGJ 1-3. Тезисы докл. на школе-конференции "Биология - наука XXI века", 17-21 мая, Пущино, 2004, с. 62.

1 ;

Принято к исполнению 13/09/2005 Исполнено 14/09/2005

Заказ № 1035 Тираж 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш. 36 (095) 975-78-56 (095) 747-64-70 www autoreferat ru

ИМ4 3 97

РЫБ Русский фонд

2006-4 20225

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Морозкина, Елена Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Микроорганизмы и условия стресса.

1.1.1. Температура как фактор стресса.

1.1.2. рН среды роста как фактор стресса.

1.1.3. Высокие концентрации солей как фактор стресса.

1.1.4. Изменение концентрации кислорода как фактор стресса.

1.1.5. Давление как фактор стресса.

1.1.6. Влияние химических факторов.

1.1.7. Влияние радиации.

1.2. Биотехнологическое применение организмов, выращенных в 21 условиях стресса.

1.3. Нитратредуктаза - ключевой фермент азотного метаболизма.

1.3.1. Ассимиляторная нитратредуктаза бактерий (Nas).

1.3.2. Дыхательная мембранносвязанная нитратредуктаза 30 бактерий (Nar).

1.3.3. Диссимиляторная периплазматическая нитратредуктаза 33 бактерий (Nap)

1.3.4. Ассимиляторная нитратредуктаза (Euk-NR) эукариот.

1.3.5. Дисимиляторная нитратредуктаза эукариот.

1.4. Строение активного центра нитратредуктазы.

1.5. Изменение свойств и структуры нитратредуктазы под воздействием 41 факторов стресса.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Реактивы, используемые в работе.

2.2. Объекты исследований и условия их выращивания.

2.2.1. Fusarium oxysporum штамм 11 dn 1.

2.2.2. Дрожжи Rhodotorula glutinis.

2.2.3. Бактерии Halomonas sp. штамм AGJ 1-3.

2.3. Получение бесклеточного экстракта.

2.4. Выделение и очистка нитратредуктазы дрожжей Rhodotorula glutinis, 47 выращенных в присутствии 1 мМ вольфрамата.

2.5. Определение активности нитратредуктазы. 48 2.5.1. Определение активности метилвиологензависимой нитратредуктазы

2.5.2. Определение активности NADH- и NADPH- зависимой 49- нитратредуктазы.

2.6. Определение наличия молибдокофактора.

2.7. Определение молекулярной массы белков методом гель- 50 хроматографии.

2.8. Определение молекулярной массы и субъединичного состава белков 50 методом электрофореза.

2.9. Определение ферментативной активности в ПААГ.

2.10. Определение вольфрама кинетическим методом.

2.11. Аналитические методы. 53 V 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

J 3.1. Влияние парциального давления кислорода на свойства i нитратредуктаз гриба Fusarium oxysporum 11dn1.

3.1.1. Изменение функциональных характеристик HP-азы у микро- 57 скопических грибов при стрессовых условиях (снижение парциального давления кислорода).

3.1.2. Физиолого-биохимические характеристики гриба F. oxysporum 60 11dn1 в аэробных и анаэробных условиях.

3.1.3. Сравнение свойств НР-аз мицелия гриба F. oxysporum 11dn1, 62 инкубируемого на нитрате в аэробных и анаэробных условиях.

3.1.4. Влияние циклогексемида на активность HP-азы гриба . 66 F. oxysporum 11dn1, инкубируемого в аэробных и анаэробных условиях на среде, содержащей нитрат.

3.2. Выделение, очистка и характеристика нитратредуктазы из клеток 69 солетолерантного штамма дрожжей Rhodotorula glutinis, выращенных в присутствии вольфрамата.

3.2.1. Влияние высоких (1 мМ) концентраций вольфрамата на рост 69 дрожжей Rh. glutinis

3.2.2. Характеристика препарата нитратредуктазы из экстракта клеток 70 дрожжей Rh. glutinis, выращенных на 1 мМ вольфрамате.

3.2.3. Выделение и очистка нитратредуктазы.

3.2.4. Структура и свойства выделенной нитратредуктазы.

3.2.5. Защитные механизмы, обеспечивающие устойчивость дрожжей 82 Rh. glutinis к 1 мМ вольфрамату.

3.3. Выделение и характеристика новой, не содержащей молибден 84 нитратредуктазы из галоалкалофильной бактерии Halomonas sp. штамм AGJ 1-3.

3.3.1. Выделение и очистка HP-азы из клеток галоалкалофильной бактерии Halomonas sp. штамм AG J 1-3.

3.3.2. Физико-химические свойства HP-азы из клеток 86 галоалкалофильной бактерии Halomonas sp. штамм AG J 1-3.

3.3.3. Спектр ферментативной активности HP-азы бактерии 89 Halomonas sp. штамм AG J 1-3.

3.3.4. Анализ структуры HP-азы бактерии Halomonas sp. 93 штамм AG J 1-3.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние факторов стресса на свойства нитратредуктаз микроорганизмов"

Актуальность темы. В последние десятилетия огромный интерес исследователей вызывает изучение действия факторов стресса на рост и развитие микроорганизмов. Согласно современным представлениям стрессогенными факторами считают не только экстремальные значения рН, температуры, высокие концентрации солей, но и другие факторы, не являющиеся традиционными для жизнедеятельности данного вида микроорганизмов. Особого внимания заслуживает ключевой фермент азотного обмена - нитратредуктаза (НР-аза), поскольку понимание механизмов его функционирования в "нормальных" условиях и условиях стресса (которым часто подвергаются микроорганизмы и растения), имеет не только фундаментальное, теоретическое, но и большое практическое значение. Несмотря на разнообразие форм НР-аз и различную локализацию в клетке, все до сих пор исследованные HP-азы микроорганизмов и растений, выращенных в "нормальных" условиях, содержали в активном центре молибден в виде молибденового кофактора (Мосо). Лишь в самое последнее время появились первые указания на то, что "необычные" условия жизнедеятельности микроорганизмов (высокие концентрации железа, ванадата и др.) могут приводить к структурной модификации HP-азы, связанной с перестройкой ее активного центра. Так, из диссимиляторной ванадат-восстанавливающей бактерии Pseudomonas isachenhovii, выращенной на среде с ванадатом и нитратом, в нашей лаборатории впервые были выделены две НР-азы (периплазматическая и мембранносвязанная), не содержащие молибден и молибденовый кофактор [Antipov et al., 1998]. Периплазматическая НР-аза содержала в активном центре ванадий, что могло быть связно с условиями обитания микроорганизма. Из железо-восстанавливающей бактерии Geobacter metallireducens, выращенной на среде, содержащей нитрат или железо, был выделен гем-содержащий мембранный ферментный комплекс, способный восстанавливать нитраты и не содержавший в своем составе молибден [Murillo et al., 1999]. Следовательно, изучение влияния факторов стресса на азотный обмен в целом и, в частности, на его ключевой фермент - HP-азу, является актуальной проблемой.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы стало изучение влияния факторов стресса на свойства и структуру НР-азы у прокариот (галоалкалофильные бактерии Halomonas sp. Штамм AG J 1-3) и эукариот (гриб

Fusarium oxysporum от ассимиляторного аналога, солетолерантные дрожжи Rhodotorula glutinis). Спектр факторов стресса включал высокие концентрации солей, щелочные значения рН, смену условий культивирования (аэробиоз-анаэробиоз). Научная новизна.

• Обнаружено, что гриб F. oxysporum штамм 11dn1 способен к денитрификации в анаэробных условиях, что выделяет его среди других эукариотических организмов. Гриб синтезирует de novo активную диссимиляторную HP-азу, существенно отличающуюся по своим свойствам от ассимиляторного фермента.

• Показано, что солетолерантные дрожжи Rhodotorula glutinis в ответ на воздействие 1 мМ вольфрамата способны синтезировать вольфрам-связывающий белок, сорбирующий до 4,6-9,9 мкг вольфрама /мг белка. Синтезируемая при этом НР-аза характеризуется необычной устойчивостью к высоким концентрациям вольфрама (сохранение 100 % -ой активности при воздействии 1 мМ вольфрамата).

• Обнаружено, что НР-аза галоалкалофильной денитрифицирующей бактерии Halomonas sp. Штамм AG J 1-3 не содержит молибден и Мосо, характеризуется высоким температурным оптимумом (70°С), повышенной термостабильностью и широкой субстратной специфичностью, что дает основание предполагать существование целого класса альтернативных безмолибденовых НР-аз, обладающих сходными свойствами.

Научно-практическое значение. Полученные данные позволяют существенно расширить представление о влиянии факторов стресса на свойства ключевого фермента азотного обмена - HP-азу. Настоящая работа является фундаментальным исследованием, однако уникальные свойства исследуемых НР-аз (высокий оптимум температуры, высокая стабильность и термостабильность) создают предпосылки для их практического применения в качестве биологических компонентов для очистки различных техногенных объектов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на XIII международной конференции молодых ученых по химии и химической технологии "МКХТ-99" (Москва, 1999), на школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), на III Съезде биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002), на школе-конференции "Биология -наука XXI века" (Пущино, 2004).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ, в числе которых 5 статей в ведущих российских журналах. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 122 страницах. Список цитируемой литературы включает 231 наименование, в том числе 213 на иностранных языках. Иллюстративный материал содержит 29 рисунков и 7 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Морозкина, Елена Владимировна

5. ВЫВОДЫ.

1. Изучено влияние факторов стресса (изменение концентрации кислорода, влияние высоких концентраций солей тяжелых металлов, щелочные значения рН) на эукариотические (гриб F. oxysporum штамм 11dn1, солетолерантный штамм дрожжей Rhodotorula glutinis) и прокариотические (галоалкалофильные бактерии Halomonas sp.штамм AGJ 1-3) организмы.

2. Показано, что смена аэробных условий на анаэробные при культивировании гриба Fusarium oxysporum штамм приводила к индукции синтеза высокоактивной диссимиляторной НР-азы, отличавшейся от ассимиляторного аналога не только активностью, но и молекулярной массой, температурным оптимумом.

3. В ответ на высокие концентрации вольфрама (в отсутствии молибдена в среде выращивания) клетки солетолерантного штамма дрожжей Rhodotorula glutinis синтезировали вольфрам-связывающий белок, сорбирующий до 4,6-9,9 мкг вольфрама/мг белка. Выделенный из клеток дрожжей, выращенных в таких условиях, электрофоретически гомогенный препарат НР-азы обладал повышенным температурным оптимумом (35-45°С) и необычной устойчивостью к вольфраму (сохранение 100 % -ой активности НР-азы при воздействии 1 мМ вольфрамата).

4. Рост галоалкалофильных бактерий Halomonas sp., штамм AGJ 1-3, в щелочных условиях (рН 10,5) в присутствии высоких концентраций солей сопровождался синтезом альтернативной НР-азы, не содержавшей молибден и молибденовый кофактор. Выделенный электрофоретически гомогенный препарат НР-азы характеризовался высоким температурным оптимумом (70°С), повышенной термостабильностью и широкой субстратной специфичностью.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

Статьи

1. Носиков А.Н., Чичикало Е.В. Голубева Л.И., Звягильская Р.А., Львов Н.П. (2000) Стимуляция нитратредуктазной активности в солетолерантных дрожжах Rhodotorula glutinis вольфрамом в присутствии молибдена. Биохимия, 65(2), 245-249

2. Носиков А.Н., Чичикало Е.В., Львов Н.П. (2001) Кинетический метод определения вольфрама в вольфрам-содержащих ферментах. Прикл. Биохимия и микробиология, 37(6), 739-741

3. Морозкина Е.В., Носиков А.Н., Звягильская Р.А., Львов Н.П. (2005) Выделение, очистка и характеристика нитратредуктазы из клеток солетолерантного штамма дрожжей Rhodotorula glutinis, выращенных в присутствии вольфрамата. Биохимия, 70(7), 980-986

4. Антипов А.Н., Морозкина Е.В. Сорокин Д.Ю., Голубева Л.И., Звягильская Р.А., Львов Н.П. (2005) Характеристика не содержащей молибден нитратредуктазы галоалкалофильной бактерии Halomonas sp, штамм AGJ 1-3. Биохимия, 70(7), 968-973

5. Морозкина Е.В., Кура ко в А.В., Носиков А.Н., Сапова Е.В., Львов Н.П. (2005) Свойства нитратредуктазы гриба Fusarium oxysporum 11dn1, выращенного в аэробных и анаэробных условиях. Прикл. Биохимия и микробиология, 41 (3), 298-302.

Тезисы

1. Чичикало Е.В., Оводов П.В., Носиков А.Н. Нитратное питание солетолерантных дрожжей: влияние засоления и тяжелых металлов. Тезисы докл. XIII Международной конференции молодых ученых по химии и химической технологии "МКХТ-99", Москва, 1999, с. 44.

2. Носиков А.Н., Чичикало Е.В., Звягильская Р.А., Львов Н.П. Влияние вольфрама на нитратредуктазу солетолерантных дрожжей Rhodotorula glutinis. Тезисы докл. на школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии28 мая - 2 июня, Пущино, 2000, с. 317-318.

3. Антипов А.Н., Салина Е.Г., Болтянская Ю.В., Чичикало Е.В. Особенности нитратредуктаз алкалофильных микроорганизмов. Ill Съезд биохимического общества России, 26 июня - 1 июля, Санкт-Петербург, 2002, с. 62

4. Морозкина Е.В., Антипов А.Н. (2004) Нитратредуктаза, не содержащая молибден и молибденовый кофактор из алкалофильной бактерии Halomonas sp. Штамм AGJ 1-3. Тезисы докл. на школе-конференции "Биология - наука XXI века", 17-21 мая, Пущино, 2004, с. 62.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В результате проведенных исследований было обнаружено, что ответ микроорганизмов на воздействие факторов стресса зависит от особенностей метаболизма данного организма и природы фактора стресса. Выращивание гриба Fusarium oxysporum 11dn1 в условиях варьирования концентраций кислорода вызывало кардинальную перестройку метаболизма организма -переход от ассимиляторного типа азотного обмена к диссимиляторному. Рост дрожжей Rhodotorula glutinis на среде с высокими концентрациями вольфрама (антагониста молибдена), приводил к синтезу новой вольфрам-устойчивой формы НР-азы, одновременно синтезировался(лись) и вольфрам-связывающий(ие) белок(и), способствуя уменьшению внутриклеточной концентрации вольфрама. Рост бактерий Halomonas sp. в экстремальных условиях (высокая концентрация солей, рН 10,5) сопровождался синтезом альтернативной (безмолибденовой) НР-азы, отличающейся от "нормальных" НР-аз не только по строению активного центра, но и по своим физико-химическим свойствам (высокий оптимум температуры - 70°С, полианионредуктазная активность и др.).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Морозкина, Елена Владимировна, Москва

1. Андреищева Е.Н., Звягильская Р.А. (1999) Адаптация дрожжей к солевому стрессу. Прикл. Биохим. Микробиол., 35(3), 243-256

2. Андреищева Е.Н., Исакова Е.П., Сидоров Н.Н., Абрамова Н.Б., Ушакова Н.А., Соарес М.И.М., Звягильская Р.А. (1999). Адаптация клеток солетолерантного штамма дрожжей Yarrowia lipolytics к солевому стрессу. Биохимия, 64(9), 109-116.

3. Антипов А.Н., Ляликова Н.Н., Хижняк Т.В., Львов Н.П (1999) Некоторые свойства диссимиляторных нитратредуктаз, не содержащих молибден и молибденовый кофактор. Биохимия, 64, 581-586

4. Бурсаков С.А., Гвоздев Р.И., Кильдибеков Н.А., Львов Н.П. (1987) Высокочувствительный кинетический микрометод определения молибдена в растительном материале. Прикл. Биохимия и микробиология, 23, 284-287

5. Заварзин Г.А. (1993) Эпиконтинентальные содовые водоемы как предполагаемые реликтовые биотопы формирования наземной биоты. Микробиология, 62, 789-800

6. Заварзин Г.А., Жилина Т.Н., Кевбрин В.В. (1999) Алкалофильное микробное сообщество и его функциональное разнообразие. Микробиология, 68, 579-599

7. Заварзин Г.А., Жилина Т.Н. (2000) Содовые озера природная модель древней биосферы континентов. Природа, 2, 45-55

8. Звягильская Р.А., Вартапетян Б.Б., Львов Н.П. (1996) Диссимиляция нитратов у эукариот. Прикл. Биохимия и микробиология, 38(2), 179-184

9. Калакуцкий К.Л., Львов Н.П., Заболотный А.И. (1991) Белки семян люпина, связывающие молибден, вольфрам и радионуклиды выбросов Чернобыльской АЭС. Биохимия, 56(7), 1220-1227

10. Кураков А.В., Пахненко О.А., Костина Н.В., Умаров М.М. (1997) Образование закиси азота микроскопическими грибами на питательных средах и в стерильной почве. Почвоведение, 30, 1344-1349.

11. Львов Н. П. (1989) Молибден в ассимиляции азота у растений и микроорганизмов. 43-е Баховские чтения. М. "Наука"

12. Львов Н.П., Носиков А.Н., Антипов А.Н. (2002) Вольфрам-содержащие ферменты. Биохимия, 67(2), 234-239

13. Носиков А.Н., Чичикало Е.В., Голубева Л.И., Звягильская Р.А., Львов Н.П. (2000) Стимуляция нитратредуктазной активности в солетолерантных дрожжах Rhodotorula glutinis вольфрамом в присутствии молибдена. Биохимия, 65(2), 245-249

14. Носиков А.Н., Чичикало Е.В., Львов Н.П. (2001) Кинетический метод определения вольфрама в вольфрам-содержащих ферментах. Прикл. Биохимия и микробиология, 37(6), 739-741

15. Панталер Р.П. (1963) Кинетический метод определения следов вольфрама и молибдена. Аналит. химия., 18, 603-609

16. Сорокин Д.Ю., Митюшина Л.Л. (1998) Особенности ультраструктуры алкалофильных гетеротрофных бактерий, окисляющих серные соединения до тетратионата. Микробиология, 67, 93-101

17. Сорокин Д.Ю. (2003) Окисление соединений серы облигатно органотрофными бактериями. Микробиология, 72, 725-739

18. Adams, М. W.W., and Kelly, R. М. (1995а). Enzymes from microorganisms from extreme environments. C&ENews, 73, 32-42.

19. Adams, M. W.W., Perler, F. B. and Kelly, R. M. (1995b). Extremozymes: expanding the limits of biocatalysis. BioTechnology, 13, 662-668

20. Alvarez-Ossorio, M., Muriana, F. J. G., de la Rosa, F. F. and Relimpio, A. M. (1992). Purification and characterization of nitrate reductase from the halophile archaebacterium Haloferax mediterranei. Z. Naturforsch. 47, 670676

21. Afshar, S., Kim, C., Monbouquette, H. G. and Schroder, I. (1998). Effect of tungstate on nitrate reduction by the hyperthermophilic archaeon Pyrobaculum aerophilum. Appl. Environ. Microbiol., 64, 3004-3008

22. Afshar, S., Johnson, E., de Vries, S. and Schroder, I. (2000) Properties of a thermostable nitrate reductase from the hyperthermophilic archaeon Pyrobaculum aerophilum. J. Bacteriol., 183, 5491-5495

23. Amaar, Y.G., Moore, M.M. (1998) Mapping of the nitrate-assimilation gene cluster (crnA-niiA-niaD) and characterization of the nitrite reductase gene (niiA) in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Curr. Genet., 33, 206-215

24. Antipov, A.N., Lyalikova, N.N., Khijniak, T.V., L'vov, N.P. (1998) Molybdenum-free nitrate reductases from vanadate-reducing bacteria. FEBS Lett., 441, 257-260

25. Antipov, A.N., Lyalikova, N.N. and L'vov, N.P. (2000) Vanadium-binding protein excreted by vanadate-reducing bacteria. Life, 49, 137-141

26. Antipov, A.N., Sorokin, D.Y., L'vov, N.P. and Kuenen, J.G. (2003) New enzyme belonging to the family of molybdenum-free nitrate reductases. Biochem. J., 369, 185-189

27. Bates, D.M., Lazazzera, B.A. and Kiley, P.J. (1995) Characterization of FNR* mutant protein indicates two distinct mechanisms for altering oxygen regulation of the Escherichia coli transcription factor FNR. J. Bacteriol., 177, 3972-3978

28. Battista, J.R. (1997). Against all odds: the survival strategies of Deinococcus radiodurans. Annual. Review of Microbiology, 51, 203-224.

29. Battista, J. R., Earl, A.M. and Park, M.-J. (1999) Why is Deinococcus radiodurans so resistant to ionizing radiation? Trends in Microbiol., 7, 362-365

30. Bedzyk, L., Wang, Т., Ye, R. W. (1999). The periplasmic nitrate reductase in Pseudomonas sp. strain G-179 catalyzes the first step of denitrification. J. Bacteriol., 181,2802-2806

31. Ben-Amotz, A. and Avron, M. (1990) Dunaliella bardawil can survive especially high irradiance levels by theaccumulation of b-carotene. Trends Biotechnol. 8,121-126.

32. Belak, S. and Thoren, P. (2001). Molecular diagnosis of animal disease: some experiences over the last decade. Expert Review of Molecular Diagnostics, 1,434-443.

33. Bell, L. C., Richardson, D. J. and Ferguson, S. J. (1990). Periplasmic and membrane-bound respiratory nitrate reductases in Thiosphaera pantotropha.

34. The periplasmic enzyme catalyses the first step in aerobic denitrification. FEBS Lett, 265, 85-87

35. Berks, В. C., Richardson, D. J., Reilly, A., Willis, A. C. and Ferguson, S. J. (1995a). The napEDABC gene cluster encoding the periplasmic nitrate reductase system of Thiosphaera pantotropha. Biochem. J., 309, 983-992.

36. Berks, В. C., Ferguson, S. J., Moir, J. W. and Richardson, D. J. (1995b). Enzymes and electron transport systems that catalyse the respiratory reduction of nitrogen oxides and oxyanions. Biochim Biophys Acta 1232, 97173

37. Berks, В. CM Sargent, F. and Palmer, T. (2000) The Tat protein export pathway. Mol. Microbiol., 35, 260-274

38. Bickel-Sankotter, S., and Ufer, M. (1995). Properties of a dissimilatory nitrate reductase from the halophilic archaeon Haloferax volcanii. Z. Naturforsch., 50, 365-372

39. Blasco, R., Castillo, F. and Martinez-Luque, M. (1997) The assimilatory nitrate reductase from the phototrophic bacterium, Rhodobacter capsulatus E1F1, is a flavoprotein. FEBS Lett., 414,45-49

40. Blochl, E., Rachel, R., Burggraf, S., Hafenbradl, D., Jannasch, H. W. and Stetter К. O. (1997). Pyrolobus fumarii, gen. and sp. nov., represents a novel group of archaea, extending the upper temperature limit for life to 113°C. Extremophiles, 1,14-21.

41. Boyington, J. C., Gladyshev, V. N., Khangulov, S. V., Stadtman, Т. C. and Sun P. D. (1997) Crystal structure of formate dehydrogenase H: catalysis involving Mo, molybdopterin, selenocysteine and an Fe4S4 cluster. Science, 275, 1305-1308

42. Bradford, M. A (1976) rapid sensitive method for quantitation of micrograrr quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding Anal.Biochem., 72, 248-254

43. Brim, H., McFarlan, S.C., Fredrickson, J.K., Minton, K.W., Zhai, M., Wackett, L.P. and Daly, M.J. (2000). Engineering radiationresistant bacteriafor metal remediation in radioactive mixed waste environments. Nature Biotechnology, 18, 85-90.

44. Brondijk, T.H.C., Fiegen, D, Richardson, D.J. and Cole, J.A. (2002) Roles of NapF, NapG and NapH, subunits of the Escherichia coli periplasmic nitrate reductase, in ubiquinol oxidation. Molecular Microbiology, 44, 245-255

45. Brown, S. H., and Kelly, R. M. (1993) Characterization of amylolytic enzymes, having both x-1,4 and x-1,6 hydrolytic activity, from the thermophilic archaea Pyrococcus furiosus and Thermococcus litoralis. Appl. Environ. Microbiol., 59, 2614-2621

46. Bull, А. Т., Ward, A. C., Goodfellow, M. (2000). Search and Discovery Strategies for Biotechnology: the Paradigm Shift. Microbiol Mol Biol Rev, 64, 573-606

47. Carter, J. P., Richardson, D. J. and Spiro, S. (1995) Isolation and characterisation of a strain of Pseudomonas putida that can express a periplasmic nitrate reductase. Arch. Microbiol. 163, 159-166

48. Campbell, W. H. (1999) Nitrate reductase structure, function and regulation: bringing the gap between biochemistry and physiology. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 50, 277-303

49. Campbell, W.H. (2001) Struature and function of eukaryotic NAD(P)H : nitrate reductase. Cell. Mol. Life Sci., 58, 194-204

50. Carmody, R.J. and Cotter, T.G. (2001) Signalling apoptosis: a radical approach. Redox. Rep., 6(2), 77-90

51. Crain, B.R. and Getzoff, E.D. (1996) The relationship between structure and function for the sulfite reductases. Curr. Opin. Struct. Bio., 6, 744-756

52. Crawford, N.M. and Glass, A.M.D. (1998) Molecular and physiological aspects of nitrate uptake in plants. Trends Plant Sci., 3, 389-395

53. Cummings, S.P., and Black, G.W. (1999) Polymer hydrolysis in a cold climate. Extremophiles, 3, 81-87.

54. Czjzek, M., Dos Santos, J. P., Pommier, J., Giordano, G., Mejean, V. and Hase,r R. (1998) Crystal structure of oxidized trimethylamine N-oxide reductase from Shewanella massilia at 2.5 A resolution. J. Mol. Biol., 284, 435-447

55. Daly, M.J. (2001). The emerging impact of genomics on the development of biological weapons. Threats and benefits posed by engineered extremophiles. Clinics in Laboratory Medicine, 21, 619-629.

56. Daniel-Vedele, F., Filleur, S. and Caboche, M. (1998) Nitrate transport: a key step in nitrate assimilation. Curr. Opin. Plant Biol., 1,235-239

57. Darwin, A. J., Ziegelhoffer, E. C., Kiley, P. J. & Stewart, V. (1998). Fnr, NarP and NarL regulation of Escherichia coli K-12 napF (periplasmic nitrate reductase) operon transcription in vitro. J Bacteriol 180, 4192-4198

58. Davis, B.J. (1965) Disk electrophoresis: Method and application to human serum protein. Ann. N.Y. Acad. Sci., 121, 404-407

59. Deckert G., Warren P. V., Gaasterland Т., Young W. G., Lenox A. L., Graham D. E. et al. (1998) The complete genome of the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. Nature, 392, 353-358

60. DeLong, E. F., Franks, D. G. and Yayanos, A. A. (1997) Evolutionary relationships of cultivated psychrophilic and barophilic deep-sea bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 63, 2105-2108

61. Deming, J.W. (2002). Psychrophiles and polar regions. Current Opinion in Microbiology, 5, 301-309.

62. Deng, M., Moureax, Т., and Caboshe, M. (1989) Tangstate, a molybdate analog inactivating nitrate reductase, deregulates the expression of the nitrate reductase structural gene. Plant Physiol., 91, 304-309

63. Dennis, P. P. and Shimmin, L. C. (1997). Evolutionary divergence and salinity-mediated selection in halophilic Archaea. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 61, 90-104

64. Dilks, К., Rose, R. W., Hartmann, E., Pohlschroder, M. (2003). Prokaryotic utilization of the twin-arginine translocation pathway: a genomic survey. J. Bacteriol., 185,1478-1483

65. Dobao, M. M., Martinez-Luque, M., Moreno-Vivian, C. and Castillo, F. (1994). Effect of carbon and nitrogen metabolism on nitrate reductase activity of Rhodobacter capsulatus E1F1. Can. J.Microbiol., 40, 645-650

66. Doemel, W. N. and Brock, T. D. (1971) The physiological ecology of Cyanidium caldarium. J. Gen. Microbiol., 67,17-32.

67. Driessen, A.J.M., Van de Vossenberg, J.L.C.M and Konings, W.N. (1996) Membrane composition and ion-permeability in extremophiles. FEMS Microbiol. Rev., 18, 139-148

68. Duckworth A.W., Grant W.D., Jones B.E., Meijer D., Marquez M.C., Ventosa A. (2000) Phylogenetic diversity of soda lake alkaliphiles. Extremophiles, 4, 53-60

69. Eichler, J. (2003) Facing extremes: archaeal surface-layer (glyco)proteins. Microbiology, 149, 3347-3351

70. Engle, M., Li, Y., Woese, C. and Wiegel, J. (1995). Isolation and characterization of a novel alkalitolerant thermophile, Anaerobranca horikoshii gen. nov., sp. nov. International J. Syst. Bacteriol., 45, 454-461.

71. Eser, M., Ehrmann, M. (2003). SecA-dependent quality control of intracellular protein localization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A,. 100, 13231-13234

72. Fekkes, P., and A. Driessen, J.M. (1999). Protein targeting to the bacterial cytoplasmic membrane. Microbiol. Mot. Biol. Rev., 63,161-173

73. Feller, G. and Gerday, C. (1997) Psychrophilic enzymes: molecular basis of cold adaptation. Cell. mol. life sci., 53, 830-841

74. Ferreira, A.C., Nobre, M.F., Moore, E., Rainey, F.A., Battista, J.R. and da Costa, M.S. (1999) Characterization and radiation resistance of new isolates of Rubrobacter radiotolerans and Rubrobacter xylanophilus. Extremophiles 3, 235-238.

75. Fariss, M. W., Chan, С. В., Patel, M., Van Houten, B. and Orrenius, S.2005) Role of mitochondria in toxic oxidative stress. Mol. Interv., 5(2), 94-111

76. Flanagan, D.A., Gregory, L.G., Carter, J.P., Karakas-Sen, A., Richardson, D.J. and Spiro, S. (1999) Detection of genes for periplasmic nitrate reductase in nitrate-respiring bacteria and in community DNA. FEMS Microbiol. Lett,, 177,263-270

77. Forde, B. (2000) Nitrate transporter in plants: structure, function and regulation. Biochim. Biophys. Acta, 1465, 219-235

78. Frias, J. E., Flores, E. and Herrero, A. (1997) Nitrate assimilation gene cluster from the heterocyst-forming cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol., 179, 477-486

79. Fujiwara, S. (2002) Extremonhiles: developments of their special finctions and potential resources. J. Biosci. Bioeng., 94, 518-525.

80. Galimand, M., Gamper, M., Zimmermann, A. and Haas, D. (1991) Positive FNR like control of anaerobic arginine degradation and nitrate respiration in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol., 173,1598-1606.

81. Galinski, E. A. (1993). Compatible solutes of halophilic eubacteria: molecular principles, water-solute interaction, stress protection. Experientia, 49, 487-496.

82. Galinski, E. A. (1995). Osmoadaptation in bacteria. Adv. Microb. Physiol., 37, 273-328

83. Galvan, A. and Fernandez, E. (2001) Eukaryotic nitrate and nitrite transporters. CMLS, Cell. Mol. Life Sci., 58, 225-233

84. Gandbhir, M., Rashed, I., Marliere, P. and Mutzel, R. (1995). Convergent evolution of amino acid usage in archaebacterial and eubacterial lineages adapted to high salt. Res. Microbiol., 146,113-120

85. Gangeswaran, R., and R. A. Eady. (1996) Flavodoxin of Azotobacter vinelandii: characterization and role in electron donation to purified assimilatory nitrate reductase. Biochem. J., 317,103-108

86. Gavira, M., Roldan, M. D., Castillo, F. & Moreno-Vivian, C. (2002). Regulation of nap gene expression and periplasmic nitrate reductase activity in the phototrophic bacterium Rhodobacter sphaeroides DSM158. J Bacteriol 184, 1693-1702

87. Grass, G., Grobe, C. and Nies, D.H. (2000) Regulation of the cnr cobalt/nicel resistance determinant from Ralstonia sp. CH34. J. Bacteriol., 182, 13901398.

88. Gregory, L.G., Bond, P.L., Richardson, D.J. and Spiro, S. (2003) Characterisation of a nitrate respiring bacterial community using the nitrate reductase gene (narG) as a functional marker. Microbiology, 149, 229-237

89. Gregory, L.G., Karakas-Sen, A., Richardson, D.J. and Spiro, S. (2000) Detection of genes for membrane-bound nitrate reductase in nitrate-respiring bacteria and in community DNA. FEMS Microbiology Letters, 183, 273-279

90. Gomes, J. and Steiner, W. (2004) The biocatalytic potential of extremophiles and extremozymes. Food Technol. Biotechnol. 42, 223-235.

91. Guerrero, M.G. and Gutierrez, M. (1977) Purification and properties of the NADPH: nitrate reductase of the yeast Rhodotorula glutinis. Biochim. Biophys. Acta., 482, 271-285

92. Hall, N and Tomsett, A.B. (2000) Structure-function analysis of NADPH:nitrate reductase from Aspergillus nidulans: analysis of altered pyridine nucleotide specificity in vivo. Microbiology, 146,1399-1406

93. Herrero, A Muro-Pastor, A. M., and Flores, E. (2001) Nitrogen control in cyanobacteria. J. Bacteriol. 183,411-425

94. Hille, R., Retey, J., Bartlewski-Hof, V., Reichenbechen, W. and Schink, B. (1999) Mechanistic aspects of molybdenum-containing enzymes. FEMS Microbiol. Rev., 22, 489-501

95. Hille, R. (2002) Molybdenum and tungsten in biology. TRENDS in Biochem. Sci., 27(7), 360-367.

96. Hochstein, L. I., and Lang, F. (1991) Purification and properties of a dissimilatory nitrate reductase from Haloferax denitrificans. Arch. Biochem. Biophys., 288, 380-385

97. Horikoshi, K. (1999) Alkaliphiles: some applications of their products for biotechnology. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63,735-750

98. Horikoshi, К. (1998) Barophiles: deep-sea microorganisms adapted to an extreme environment. Curr. Microbiol., 1, 291-295

99. Horner, R.D. (1983) Purification and comparison of nit-1 and wild-type NADPH: nitrate reductase of Neurospora crassa .Biochim. Biophys. Acta, 744, 7-15

100. Hough, D.W. and Danson, M.J. (1999). Extremozymes. Current Opinion in Chemical Biology; 3, 39-46.

101. Irwin, J. A. and Baird, A. W. 2004 Extremophiles and their application to veterinary medicine. Irish Veterinary Journal, 57, 348 354

102. Isken, S. and de Bont, J. A. M. (1998) Bacteria tolerant to organic solvents. Extremophiles, 2, 229-238.

103. Ito, S., Kobayashi, Т., Ara, K., Ozaki, K., Kawai, S. and Hatada, Y. (1998). Alkaline detergent enzymes from alkaliphiles: enzymatic properties, genetics and structures. Extremophiles, 2, 185-190.

104. Joseph-Horne, Т., Hollomon, D.W. and Wood, P.M. (2001) Fungal respiration: a fusion of standard and alternative components. Biochim Biophys Acta, 1504, 179-195

105. Jormakka, M., Byrne, B. and Iwata S. (2003) Protonmotive force generation by a redox loop mechanism. FEBS Lett., 545, 25-30

106. Jones, В. E., Grant, W. D., Duckworth, A. W. and Owenson, G. G. (1998) Microbial diversity of soda lakes. Extremophiles, 2,191-200.

107. Johnson, D.B. and Hallberg, K.B. (2003). The microbiology of acidic mine waters. Research in Microbiology, 154, 466-473

108. Kato, С. and Barlett, D.H. (1997) The molecular biology of barophilic bacteria. Extremophiles, 1,111-116.

109. Kato, C., L. Li, Y. Nakamura, J. Tamaoka, and K. Horikoshi. (1998). Extremely barophilic bacteria isolated from the Mariana Trench, Challenger Deep, at a depth of 11,000 meters. Appl. Environ. Microbiol., 64, 1510-1513

110. Kempe, S. and Degens, E.T. (1985) An early soda ocean? Chem. Geol, 53, 95-108

111. Kerschen, E. J., Irani, V. R., Hassett, D. J., Rowe, J. J. (2001). snr-1 gene is required for nitrate reduction in Pseudomonas aeruginosa PA01. J. Bacteriol., 183,2125-2131

112. Kiley, P.J. and Beinert, H. (1998) Oxygen sensing by the global regulator, FNR: the role of the iron-sulfur cluster. FEMS Microbiol Rev., 22(5), 341-52

113. Kim, K.K., Kim, R. and Kim, S.H. (1998) Crystal structure of a small heat-shock protein. Nature, 394, 595-599

114. Kletzin, A. and. Adams, M. W.W (1996) Tungsten in biological systems. FEMS Microbiol. Rev., 18, 5-63

115. Kobayashi, M., Matsuo, Y., Takimoto, A., Suzuki, S., Maruo, F., and Shoun, H. (1996) Denitrification, a novel type of respiratory metabolism in fungal mitochondrion. J. Biol. Chem. 271,16263-16267

116. Kurakov, A.V, Nosikov, A.N., Skrynnikova, E.V., L'vov, N.P. (2000) Nitrate reductase and nitrous oxide production by Fusarium oxysporum 11dn1 under aerobic and anaerobic conditions. Curr. Microbiol., 41,114-119.

117. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T-4. Nature (London), 227, 680-685

118. Laksanalamai, P., Maeder, D.L. and Robb, F.T. (2001) Regulation and mechanism of action of the small heat shock protein from thehyperthermophilic archaeon Pyrococcus fuhosus. J. Bacteriol., 183(17), 51985202.

119. Laksanalamai, P. and Robb, F.T. (2004) Small heat shock proteins from extremophiles. Extremophiles, 8, 1-11

120. Lin, J. Т., and V. Stewart. (1996) Nitrate and nitrite-mediated transcription antitermination control of nasF (nitrate assimilation) operon expression in Klebsiella pneumoniae M5a1. J. Mol. Biol., 256, 423-435

121. Lin, J. T. and Stewart, V. (1998) Nitrate assimilation by bacteria. Adv. Microb. Physiol., 38, 1-30.

122. Lin, J. Т., Goldman, B. S. and Stewart ,V. (1994) The nasFEDCBA operon for nitrate and nitrite assimilation in Klebsiella pneumoniae M5a1. J. Bacteriol., 176, 2551-2559

123. Llamas, A., Igeno, M., Galvan, A.and Fernandez, E. (2002) Nitrate signalling on the nitrate reductase gene promoter depends directly on the activity of the nitrate transport systems in Chlamydomonas. Plant J., 30(3), 261-271.

124. Madern, D., Ebel, C. and Zaccai, G. (2000) Halophilic adaptation of enzymes. Extremophiles, 4, 91-8.

125. Maeda S. and Omata T. (2004) A novel gene (narM) required for expression of nitrate reductase activity in the cyanobacterium Synechococcus elongatus strain PCC7942. J. Bacteriol. 186(7), 2107-14.

126. McAlpine, A. S., McEwan, A. G. and Bailey, S. (1998) The high resolution crystal structure of DMSO reductase in complex with DMSO. J. Mol. Biol., 275, 613-623

127. Mikami, В., and Ida, S. (1984) Purification and properties of ferredoxin-nitrate reductase from the cyanobacterium Plectonema boryanum. Biochim. Biophys. Acta 791, 294-304

128. Minagawa, H. and Yoshimoto, A. (1984) The in vivo inactive nitrate reductase from Hansenula anomala. Argon. Biol. Chem., 48, 557-559

129. Moir, J.W. and Wood, N.J. (2001) Nitrate and nitrite transport in bacteria. Cell. Mol. Life. Sci., 58, 215-224

130. Moreno-Vivian, C., Cabello, P., Martinez-Luque, M., Blasco, R. and Castillo, F. (1999) Prokaryotic nitrate reduction: molecular properties and functional distinction among bacterial nitrate reductases. J. Bacteriol. 181, 6573-6584

131. Nason, A., Antoine, A.D., Ketchum, P.A., Frazier, W.A., Lee, D.K. (1970) Formation of assimilatory nitrate reductase by in vitro inter cistronic complementation in Neurospora crassa. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 65, 137144

132. Nesterenko, M.V., Tilley, M. and Upton, S.J. (1994) A simple modification of Blum's silver stain method allows for 30 minute detection of protein in polyccrylamide gels. J. Biochim. Biol., 28(3), 239-242.

133. Niehaus, F., Bertoldo, C., Kahler, M. and Antranikian, G. (1999) Extremophiles as a source of novel enzymes for industrial application. Appl. Microbiol. Biotechnol., 51,711-729

134. Nies, D. H. (1999) Microbial heavy-metal resistance. Appl Microbiol Biotechnol., 51 (6),730-50.

135. Nies, D. H. (2000) Heavy metal-resistant bacteria as extremophiles: molecular physiology and biotechnological use of Ralstonia sp. CH34. Extremophiles 4, 77-82.

136. Ogawa, К. I., Akagawa, E., Yamane, K., Sun, Z. W., LaCelle, M., Zuber, P. and Nakano, M. M. (1995) The nasB operon and nasA gene are required for nitrate/nitrite assimilation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol., 177, 1409-1413

137. Okamoto, P.M. and Marzluf, G.A. (1993) Nitrate reductase of Neurospora crassa: the functional role of individual aminoacids in the heme domain as examined by site direct mutagenesis. Mol. Gen. Genet., 240, 221-230.

138. Omata, T. (1995) Structure, function and regulation of the nitrate transport system of the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC7942. Plant Cell Physiol., 36, 207-213

139. Oren, A. (1999). Bioenergetic aspects of halophilism. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 334-348.

140. Oren, A., Heldal, M., Norland, S., and Galinski, E. A. (2002). Intracellular ion and organic solute concentrations of the extremely halophilic bacterium Salinibacter rubber. Extremophiles, 6, 491-498.

141. Pao, S.S., Paulsen, I.T. and Saier, M.H. (1998) Major facilitator superfamily. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62,1-34

142. Peeples, T. and Kelly, R.M. (1995) Bioenergetic response of the extreme thermoacidophile Netallosphaera sedula to thermal and nutritional stresses. Appl. Environ. Microbiol.,61, 2314-2321

143. Pfennig, N. and Lippert, K.D. (1966) Uber das vitamin B12-bidurfnis phototropher schwefelbacterian. Arch. Microbiol., 55, 245-256

144. Pfluger, K. and Muller, V. (2004) Transport of compatible solutes in extremophiles. J.Bioenerg. Biomembranes., 36,17-24.

145. Philippot, L. and Hojberg, O. (1999). Dissimilatory nitrate reductases in bacteria. Biochim Biophys Acta, 1446, 1-23

146. Philippot, L. (2002). Denitrifying genes in bacterial and Archaeal genomes. Biochim Biophys Acta 1577, 355-376

147. Potter, L., Angove, H., Richardson, D. and Cole, J. A. (2001) Nitrate reduction in the periplasm of Gram-negative bacteria. Advances in Microbial Physiology, 45, 51-112

148. Potter, L. C. and Cole, J. (1999a) Essential roles for the products of the napABCD genes, but not napFGH, in periplasmic nitrate reduction by Escherichia coli K-12. Biochem. J., 344, 69-76

149. Ramirez-Arcos, S., Fern&ndez-Herrero, L. A. and Berenguer, J. (1998) A thermophilic nitrate reductase is responsible for the strain specific anaerobic growth of Thermus thermophilus HB8. Biochim. Biophys. Acta, 1396, 215-227

150. Ramos, F., Blanco, G., Gutierrez, J. C., Luque, F. and Tortolero, M. (1993) Identification of an operon involved in the assimilatory nitrate-reducing system of Azotobactervinelandii. Mol. Microbiol., 8, 1145-1153

151. Richardson, D. J. (2000). Bacterial respiration: a flexible process for a changing environment. Microbiol., 146, 551-571

152. Richardson, D. J., Berks, В. C., Russell, D. A., Spiro S. and Taylor C. J. (2001) Functional, biochemical and genetic diversity of prokaryotic nitrate reductases. Cell. Mol. Life Sci., 58, 165-178

153. Rubio, L. M., E. Flores, and A. Herrero. (1998) The narA locus of Synechococcus sp. strain PCC 7942 consists of a cluster of molybdopterin biosynthesis genes. J. Bacteriol., 180,1200-1206

154. Rubio, L. M., E. Flores, and A. Herrero. (1999) Molybdopterin quanine dinucleotide cofactor in Synechococcus sp. nitrate reductase: identification of mobA and isolation of a putative moeB gene. FEBS Lett., 462, 358-362

155. Rubio, L. M., E. Flores, and A. Herrero. (2002) Purification, cofactor analysis, and site-directed mutagenesis of Synechococcus ferredoxin-nitrate reductase. Photosynth. Res., 72,13-26

156. Russell, N. J. (1990) Cold adaptation of microorganisms. Phil.Trans. R. Soc. London., B326, 595-611

157. Rothschild, L.J. and Mancinelli, R.L. (2001). Life in extreme environments. Nature, 490, 1092-1101.

158. Santini, C. L., Ize, В., Chanal, A., Miiller, M., Giordano, G. and Wu, L. F. (1998). A novel Sec-independent periplasmic protein translocation pathway in Escherichia coli. EMBOJ., 17,101-112

159. Sargent, F., Bogsch, E. G., Stanley, N., Wexler, M., Robinson, C., Berks, В. C. and Palmer, T. (1998). Overlapping functions of components of a bacterial Sec-independent protein export pathway. EMBO J., 17, 3640-3650

160. Sawers, R.G. (1991) Identification and molecular characterization of a transcriptional regulator from Pseudomonas aeruginosa PA01 exhibiting structural and functional similarity to the FNR protein of Escherichia coli. Mol. Microbiol., 5,1469-1481.

161. Schindelin, H., Kisker, C., Hilton, J., Rajagopalan, К. V. and Rees, D. C. (1996) Crystal structure of DMSO reductase: redox-linked changes in molybdopterin coordination. Science, 14, 1615-1621

162. Schiraldi, C. and DeRosa, M. (2002). The production of biocatalysts and biomolecules from extremophiles. Trends in Biotechnology, 20, 151-521

163. Schleper, C., Puhler, G., Kuhlmorgen, B. and Zillig, W. (1995a) Life at extremely low pH. Nature, 375,741-742.

164. Schumacher, K., Heine, E. and Hocker H. (2001). Extremozymes for improving wool properties. J. Biotechnol., 89, 281 -288. Seckbach, J., Baker, F.A. and Shugarman, P.M. (1970) Algae survive under pure C02. Nature, 227, 744-745.

165. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. and Mann, M. (1996) Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem., 68, 850-858

166. Siverio, J.M. (2002) Assimilation of nitrate by yeasts. FEMS Microbiol. Rev., 26, 277-284

167. Shoun, H., Kim, D.-H., Uchiyama, H., and Sugiyama, J. (1992)

168. Denitrification by fungi. FEMS Microbiol. Lett. 94, 277-282

169. Stetter, К. O. 1996. Hyperthermophilic procaryotes. FEMS Microbiol. Rev.18,149-158

170. Stetter, K.O. (1999) Extremophiles and their adaptation to hot environments. FEBS Letters, 452, 22-25

171. Stewart, V., Lu, Y. and Darwin, A.J. (2002). Periplasmic nitrate reductase (NapABC enzyme) supports anaerobic respiration by Escherichia coliK-12. J. Bacteriol., 184, 1314-1323.

172. Stewart, V., Bledsoe, P.J. and Williams, S.B. (2003) Dual overlapping promoters control napF (periplasmic nitrate reductase) operon expression in Escherichia coli K-12. J. Bacterid., 185, 5862-5870.

173. Stolz, J.F. and Basu, P. (2002) Evolution of nitrate reductase: molecular and structural variations on common function. ChemBioChem., 3,198-206

174. Takaya N. (2002) Dissimilatory nitrate reduction metabolisms and their control in fungi. J. Biosci. Bioeng., 94(6), 506-510.

175. Takaya, N., Kuwazaki, S., Adachi, Y., Suzuki, S., Kikuchi, Т., Nakamura, H., Shiro, Y. and Shoun, H. (2003) Hybrid Respiration in the Denitrifying Mitochondria of Fusarium oxysporum. J. Biochem, 133, 461-465

176. Tomlinson, G. A., L. L. Jahnke, and L. I. Hochstein. 1986. Halobacterium denitrificans sp. nov., an extreme halophilic denitrifying bacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 36, 66-70

177. Tsugita, A. and Scheffler, J. (1982) A rapid method for hydrolysis of protein with a mixture of trifluoroacetic acid and hydrochloric acid. Eur. J. Biochem., 124, 585-588

178. Tsuruta, S., Takaya, N., Zhang, L., Shoun, H., Kimura, K., Hamamoto, M., and Nakase, T. (1998) Denitrification by yeasts and occurrence of cytochrome P450nor in Trichosporon cutaneum. FEMS Microbiol. Lett. 168, 105-110).

179. Uchimura, H., Enjoji, H., Seki, Т., Taguchi, A., Takaya, N. and Shoun, H. (2002) Nitrate reductase-formate dehydrogenase couple involved in the fungal denitrification by Fusarium oxysporum. J. Biochem., 131, 579-586

180. Van Montfort, R.L., Basha, E., Friedrich, K.L., Slingsby, C. and Vierling, E. (2001) Crystal structure and assembly of a eukaryotic small heat shock protein. Nat Struct Biol., 8, 1025-1030

181. Van de Vossenberg, J.L.C.M, Driessen, A.J.M., and Konings, W.N. (1998) The essence of being exstremofilic: the role of the unique archaeal membrane lipids. Extremophiles, 2,163-170

182. Van de Vossenberg, J.L.C.M, Albers, S.-V., Driessen, A.J.M., and Konings, W.N. (2001) Bioenergetics and solute uptake under extreme conditions. Extremophiles, 5,285-294

183. Ventosa, A., Nieto, J. J. and Oren, A. (1998). Biology of moderately halophilic aerobic bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62, 504-544

184. Vetriani, C., Speck, M.D., Ellor, S.V., Lutz, R.A. and Starovoytov, V. (2004) Thermovibrio ammonificans sp. nov., a thermophilic, chemolithotrophic,nitrate-ammonifying bacterium from deep-sea hydrothermal vents Int J Syst Evol Microbiol., 54, 175-181

185. Vieille, C. and Zeikus, G.J. (2001) Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 65, 1-43

186. Vieille, C., Burdette, D. S. and Zeikus, J. G. (1996). Thermozymes. Biotechnol. Annu. Rev., 2,1-83

187. Volkl, P., Huber, R., Drobner, E., Rachel, R., Burggraf, S., Trincone, A. etal. (1993) Pyrobaculum aerophilum sp. nov., a novel nitrate-reducing hyperthermophilic archaeum. Appl. Environ. Microbiol., 59, 2918-2926

188. Vollack, K., Xie, J., Hartig, E., Romling, U. and Zumft, W. G. (1998) Localization of denitrification genes on the chromosomal map of Pseudomonas aeruginosa. Microbiology, 144, 441-448

189. Wang, H., Tseng, C.-P. and Gunsalus, R.P. (1999) The napF and narG nitrate reductase operons in Escherichia coli are differentially expressed in response to submicromolar concentrations of nitrate but not nitrite. J. Bacteriol., 181, 5303-5308.

190. Watsuji, Т., Takaya, N., Nakamura, A. and Shoun, H. (2003) Denitrification of nitrate by the fungus Cylindrocarpon tonkinense. Biosc. Biotech. Biochem., 67, 1115-1120

191. Weiner, J. H., Bilous, P. Т., Shaw, G. M., Lubitz, S. P., Frost, L., Thomas, G. H., Cole, J. A. and Turner, R. J. (1998). A novel and ubiquitous system for membrane targeting and secretion of cofactor-containing proteins. Cell, 93, 93-101

192. Wharton, D.A. and Ferns, D.J. (1995) Survival of intracellular freezing by the Antarctic nematode Panagrolaimus davidi. J. Exp. Biol., 198,1381-1387.

193. White, C., Sayer, J.A. and Gadd, G.M. (1997) Microbial solubilization and immobilization of toxic metals: key biogeochemical processes for treatment of contamination. FEMS Microbiol. Rev., 20, 503-516

194. Wu, Q., and Stewart, V. (1998). NasFED proteins mediate assimilatory nitrate and nitrite transport in Klebsiella oxytoca (pneumoniae) M5al. J. Bacteriol., 180,1311-1322

195. Wu, S. Q., Chai, W., Lin, J. Т., Stewart, V. (1999). General nitrogen regulation of nitrate assimilation regulatory gene nasR expression in Klebsiella oxytoca M5al. J. Bacteriol. 181: 7274-7284

196. Ye, R.W., Haas, D., Ka, J.O., Krishnapillai, V., Zimmermann, A., Baird, C. and Tiedje, J.M. (1995) Anaerobic activation of the entire denitrification pathway in Pseudomonas aeruginosa requires Anr; an analog of Fnr. J. Bacteriol., 177, 3606- 3609.

197. Yoshimatsu, К., T. Sakurai, and T. Fujiwara. (2000) Purification and characterization of dissimilatory nitrate reductase from a denitrifying halophilic archaeon, Haloarcula marismortui. FEBS Lett., 470,216-220

198. Zhou, J.-J., Fernandez, E., Galvan, A. and Miller, A.J. (2000) A high afinity nitrate transport system from Chlamydomonas requires two gene products. FEBS Lett., 466, 225-227.

199. Zhou, Z., Takaya, N., Nakamura, A., Yamaguchi, M., Takeo, K. and Shoun, H. (2002) Ammonia fermentation, a novel anoxic metabolism of nitrate by fungi. J. Biol. Chem. 277, 1892-1896

200. Zhou, Z., Takaya, N., Sakairi, M.A.C., and Shoun, H. (2001) Oxygen requirement for the denitrification by the filamentous fungus Fusarium oxysporum. Arch. Microbiol. 175, 19-25

201. Zumft., W.G. (1997) Cell biology and molecular basis of denitrification. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 61, 533-616.