Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КОФАКТОР ОБЩИЙ ДЛЯ МОЛИБДЕНСОДЕРЖАЩИХ ФЕРМЕНТОВ: НИТРАТРЕДУКТАЗЫ БАКТЕРОИДОВ КЛУБЕНЬКОВ ЛЮПИНА И КСАНТИНОКСИДАЗЫ МОЛОКА

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "КОФАКТОР ОБЩИЙ ДЛЯ МОЛИБДЕНСОДЕРЖАЩИХ ФЕРМЕНТОВ: НИТРАТРЕДУКТАЗЫ БАКТЕРОИДОВ КЛУБЕНЬКОВ ЛЮПИНА И КСАНТИНОКСИДАЗЫ МОЛОКА"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А, Н. БАХА * ;

Х2- У -

' • • - На правах рукописи

АЛИКУЛОВ Зерекбай Аликулович

КОФАКТОР, ОБЩИЙ ДЛЯ МОЛИБДЕН СОДЕРЖАЩИХ ФЕРМЕНТОВ:^ НИТРАТРЕДУКТАЗЫ БАКТЕРОИДОВ -КЛУБЕНЬКОВ ЛЮПИНА И КСАНТИНОКСИДАЗЫ МОЛОКА

(03.00.04 — биологическая химия)

Автореферат'

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1979

л

Работа выполнена в лаборатории энзимологии ордена Ленина Института биохимии им. А. Н. Баха АН СССР.

*

Научные руководители:

члей-корреспондент АН СССР В. Л. Крегович

доктор биологических наук Н. П. Львов

Официальные оппоненты: , .

доктор химических наук, профессор Г. И. Лихтенштейн

доктор биологических наук В. В. Мосолов

Ведущее учреждение: ордена Трудового Красного Знамени Институт физиология растений им. 1С А; Тимирязева АН СССР. . 1

Защита диссертации состоится « 1980 г.

в час. на заседании специализированного совета-

К 002.96.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А. Н. Баха АН СССР (Москва, 117071, Ленинский пр., 33, корп. 2): - ,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Отделения биологических наук АН СССР (Москва, 117071, Ленинский пр., 33, корп. 1).

Автореферат разослан « ^ » 19<Р«э г.

Ученый секретарь специализированного

совета, кандидат биологических наук М. И. Молчанов

ОНЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА PAEÜTU

Актуальность проблемы. Молибденсодероащие ферменты (нитроге-наза, яитратредуктаза, ксантиноксидаза, сульфмтоксвдаза, альдегид-оксида за и форматдепщрогеназа) являются одной из важнейших- групп окислительно-воостаиовдтелъгах ыетадлофериентов, с участием которых происходи* восстановление молекулярного'азота, нитратов, окисление пуринов, альдегидов, сульфитов и-других соединений. Большинство Мо-ферыентов содержит 2 атома молибдена ва одев моль фермента. В настоящее время почти ничего неизвестно о строении Мо-содернаиих центров, о формах связи Мо с белком н о функции этого металла в каталитическом акте.

В 70-х годах работами американского исследователя А.Нейсона обнаружено существование общего для Ио-ферментов кофактора и найдены подходы джя его биохимического изучения.

Эти работы быстро привлекли внимание биохимиков а физиологов и в изучение кофактора включили, ряд лабораторий .в США (ШКетчум, К. Раджагопален, Д.Макгрегор, £. Эллиот, Р.ДовнеЙ), Англии (Е.Хыштт, Дж.Постгейт), ФРГ (В.Цунфт), 1ДР (Р.Мендель), Венгрии (А.Кондороши, Т.Шик). ■ *

Такой интерес к изучению Мо-кофактора вполне объясним, поскольку кофактор значительно более удобный объект для изучения функции молибдена в ферменте ж связи етого металла с белком, чем высокомолекулярный ферментный комплекс.

В последние годы У.Бридлу удалось показать, что существует два кофактора: один - для нжтрогепазы (felloKo), другой - для всех остальных Мо-фериентов (МоКо)t а также ввделить в очищенном виде кофактор ддя нитрогвнаэы {FteüoKo) ж изучить его'свойства. Что же касается другого кофактора (ИоКб), то.он до сих пор в чистом вида не выделен, и нет сколько-нибудь определенных данных, указывающих ва его природу х свойства.

Начиная с 1973 года. лаборатория • ензимолоют нашего Института сосредоточила вникание на изучение МоКо, общего доя нитратредук-тазы и ксантиноксидазы. Кроне того, било обращено внимание на сходства различных Ыо-ферыентов, вытекающее из наличия у них "общего кофактора.

Пели и задачи исследования. Цель» данной работа явилось исследование свойства н структуры Мо-кофактора из нитратредуктазы и ксантшюксвдаэы. Исходя из цели работы, были': доставлены следующие задачи: ____—

Ri я iL^a.u _ .i Düjj и 5teií.

f^zL,Сг.ихоз.

::;■. IL, Д, Tiiwpmcs

1. Разработать метод выделения, очистки до гомогенного соо-тояния нитратредуктазы из бактероидов клубеньков лишша в изучить .. свойства данного фермента о тем .чтобы использовать его для выделения МоКо.

2. Найти метод выделения из гомогенных препаратов нитратредуктазы и ксантиноксидазы молока* очистки и стабилизации низкомолекулярного Мо-кофактора (МоКо), общего для этих ферментов и изучить его свойства.

3. Исходя из факта существования обоего кофактора у нитратредуктазы и ксантиноксидазы проверить, не обладают'ли эта ферменты обоими активностями.

4..Изучить влияние засолешш на нитратредуктазную активность корней гороха.

Научная новизна работы. Разработан универсальный количественный метод выделения ЫоКо из (хроме нитрогенаэы)Цо-ферлентов. С помощью втого метода впервые получены очищенные высокоактивные , препараты МоКо из нитратредуктазы и ксантиноксидазы, установлено сходство выделенных кофакторов, изучены-их свойства и условия стабилизации» получены первые сведения о структуре МоКо. '

Обнаружены нитрат— и нитритредуктазные активное»! у ксантиноксидазы в установлены оптимальные условия ta проявления.

Дано объяснение явленна снижения ниграгредуктазной активности растений про засолении.

Практическое значение работы. Выделение МоКо и установление ряда его свойств позволяет понять механизм каталитического действия большой группы Мо-ферыентов и создать модельные системы имитирующие юс работу.

Установление факта непрочной связи молибдена с кофактором и белком фермента позволил предложить схему, объясняющую механизм включения молибдена в белок фермента и стимуляцию молибденом роста растений и микроорганизмов, широко используемую в сельскохозяйственной практике.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на IX Международном ботаническом конгрессе (Ленинград, 1975), И Менделеевском съезде по общей и прокладной химии (Алма-Ата, 1975)» УП и УШ Всесоюзном совещаниях по микроэлементам (Рига. 1975; Ивано-Франковск, 1978), У Всесоюзном Баховском коллоквиуме по биохимии азот^иксаши (Канев, 1976), Конференции молодых ученых Казахстана (Алма-Ата, I97&), I и П совещаниях

Академха наук Социалистических стран со генетике азотфиксации .. (Венгрия, 1977; Польша, 1979), Ш Иеадународнои симпозиуме по азотфиксации (Ыадисон, США), Международном симпозиуме'"Самосборка биологических ж предбиологических' структур" (Москва, 1979),' 17 Всесоюзном биохимической съезде" (Ленинград, 1979),' заседаниях Всесоюзного биох!шетеского общества.* Ш теме диссертации опубли- _ ковано ö работ.

ОсНем работы. Диссертация состоит из введения, вести глав -и выводов. Работа содержит i У& страниц машинописного* текста,. 20 рисунков к 15 таблиц. 'Библиография вшшяает 114 наименований, в той числе 95 нностражных работ.

' ЩТЕШШ Z IKKfflW

Получение препарата;бактероидов. Клубеньки желтого люпина, растущего в полевнх условия!, раэрупали в соковыхнмадке и затем гомогенат суспендировали в 0,1 U натриВ-фос£етпом буфере (pH 6,6) содержащем 15 г/л сахарозу. Полученный препарат дважды центрифугировали: при 2000 xg, 20, шнут для удаления растительных тканей и 15000 xg в течение 30 минут для удаления лемглобина. Осадок клеток бактероидов хранили в кедром азоте.' Бесклеточный экстракт из бактероидов получади разруиением жх в прессе (Любимов, Львов, i960) ж последующим центрифугированием при 15000 % 30 минут. ■".

Определение активности ритратрелпгктаэы бактероидов люпина. ; Нитратредуктазную активаооть препаратов определяли по модифицированному нами методу (Kennedy et al„ 1975). Определение проводили в- аэробных условиях (30°) в реакционной смеси, содержащей в объеме 0,5 вд (в мкмолях): натрий фосфатный буфер рН 6,5 - 50, натри! азотнокислый - 2,5; метвлвкологев хлорид - 0,35; гидросульфит натрия (дитдонит) 40Q мкг; ферментный препарат,, в объеме 50-100 мкл. Реакцию вачивалж добавлением шприцем раствора дятионита, который готовили растворяя 48 мг дятионита в 6 ни раствора бикарбоната натрия (95 idl) в склянке, заполненной водородом. Пооле 30 минутной инкубашш синий цвет реакционной смеси, вызванный восстановлением кетйлвиологева удаляла встряхивание» пробирок ж к реакционной смеси добавляли реагенты на нитриты: 0,5 мл сульфаниловой кислоты (6 г на I л 20£ HCl) в 0,5 ил N -I-аафтилэтилендиамида солянокислого (1,23 г на I л диет.воды).

После 10-15 кинут, необходимых дня развития окраски измеряли Eg^g на спектрофотометре и количество образовавшихся нитритов расчитывали пользуясь калибровочной кривой, построенной ва основании использования дважды перекристадлвэованвой соли азотистокио-лого натрия в качестве стандарта. Активность нитратродуктааы выряжали в ныодях нитрата, восстановленного в I мая. ва 1мг белка, Процедура определения активности МоКо.. Эта процедура состояла из двух последовательных операций:

а) Комплементация UoKo о экстрактом мутанта nlt H«uroe-рога сгояеа.К 0,2 ил экстракта nlt-I (5-7 мг бедка в I мл), к. ' которому предварительно добавлено 25 мкл раствора НАДФН (2*1СГт1), пршшвали 0,2 wi препарата ИоКо и оотавляли при комнатной температуре на 30 мин.

0) Определение активности образовавшейся In xitro цитрат» редуктазы. К смеси для комцдеыентают добавляли SO мкл раствора ФДД (1СГ~%) и 50 мкя раствора HallOj (ОД К) в оставлшш пржкои-натной температуре на 30 мкл. Затем пробирки со сиесьс для комплементации помещали ва 15 мин. в кипящую водяную баня для разрушения избытка НДДФН. Ранее было показано (ИакКежна, Львов к др., 1974), что тот атап необходим, поскольку присутствие избытка НАДФН резко уменьшает. интенсивность окраски Л-1-нафгил8ТКЛен- -диамина (НЭДА) с' нитритами. Посла прогревания и охлаждения к смеси для комплементация добавляли реагенты ва нитрита: 0,5 мл раствора сульфиниловой кислота и 0,5 жж раствора НЭДА.- Через 10-15 ш. необходимых для развития окраски, осадок денатуриро- ■ -вавшего белка удаляли центрифугированием н интенсивность окраски измеряли на спектрофотоые тре при 548 вы.

Ксантиноксидаэную активность измеряли спектрофотометрическн при 295 нм по превращению ксангина в иочевув кислоту*

Ксантшщещцрогеказную активность определяли по методу Менделя и Миллера_( Kaller,1976).

Количество молибдена в дробях определяли полярографпеским (Кузнецов, Якушев а, Львов, 1972) к масо-спектрометрзгческими методами, железаво методу Рамзея (Romear, 1953).

Аминокислоты определялись на анализаторе ttarron" »-500.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Поскольку главной целью данной работы было выделение а. изучение общего для Мо-фермевтов кофактора» ыы выбрали два,различного происхождения,молибденсодержшгсих фермента: ксантино-ксидазу' молока к нитратредуктаэу бактероидов клубеньков люпина.

Ксантинокеидазу очищали до гомогенного состояния (рис.1) из коровьего молока со методу Харта (Hart et al., 1970) в модификации Л.Г.Нагдер и Л.С.Вартаняи (Наглец, Бартанян, 1973).

Выделение и изучение нитратредуктазы бактероидов клубеньков люпина. Очистку нитратредуктазы, как объекта выделения МоКо, начали йонообмекной хроматографией грубого экстракта бактероидов клубеньков люпина на ДЭАЭ - целлюлозе, уравновешенной с 0,025 М трис-HCl буфером (pH 7,0), содержащим 0,1 Ы МаС1, 2 Ш дитионит и 0,2 »Äi дитиотрейтол, При разделении грубого экстракта на ДЭАЭ-целлшозе нами обнаружены, по крайней мере, четыре молибденсо-дерхащих белка; катратредуктаза, ксантивдегэдрогеказа, нитрогеназа и белок, не . обладающий активностью какого-либо Mo-Фермента, но воссталавливагщий активность дефектной нитратредуктазы мутанта nit -I. В экстракте также найден малибденсодержащаЗ нехггад. Вероятно, последние два молибденсодержащие компонента экстракта входят в систему белков, осуществлянцих включение и перенос молибдена в клетке, фракция, обладавшая активностью ксантинцегидро-геназн использовалась в наших опытах как частично очищенный препарат этого фермента.

Фракцию нитратредуктазы, полученную хроматографией экстракта ■ на ДЭАЭ-целлюлозе, далее очищала по указанной ниже схеме (табл.1). Нитратредуктаза очищалась в 169 раз и была электрофоретически гомогенной (рисЛ). ..'..<-■ ■;■,: ..,

' Свойства нитратредуктазы. Молекулярный вес выделенной нитратредуктазы составлял 67000, pH оптимум для нитратредуктазы бактероидов люшгаа 6,5. В опытах с ингибиторами цианид калия е азад натрия при концентрации Ю-2М ингибировали активность нитратредуктазы (на 85 в 69^ пнгибирования, соответственно), а пШБ почти не влиял на ее активность при такой же концентрации.

Дня нитратредуктазы бактероидов люпина самым эффективным донором электронов оказался восстановленный метилвиоло ген, тоща " как с НДДФН ({ЩЩ) ш не обнаруживали заметной активности.

щ

'AJÍL

Î p

Еаз.З. Щхазатвля гомогенност* юдтчевша-дрегарагов ксантхн-оксддвзы я штратредуЕтазн:

' А - &

OKcjtgasa

_ксантжн-

« 3 ыг/ш,

червэ ° "— *

Б- 8Лвятро4дрвгра»а а ШАГ (7.ЗД; i - коантжяонсжиаза 250 ккг Ottxxa на гель, 2 - нятратредтатма баяте-

^ОВ

vsr бадха sa гш

Таблица I.

Очистка НР бактероидов клубеньков люпина

-■ ' ■!" |..........-1 ■1 I ■' ■1 ]■ ' ., —. | - . . _ . - I ■'■ | ; ........ —

I Ойъри * Ьшж ' I 06т ' ЙПГОД ! ул.акт.! Вшмттн_.{Кратность

__1 • • I ¡1 МИН. I_!_I_!_;

Экстракт ■ 20 40 800 100 13,3 0,075 10666 100

ДШ-аеллюлоза^ 10 10 100 12,5 3,5 0,029 3446 32,3

Прогреваро 1Сг шш, при 50°С 10 • 7'2 72 . .9 50 0,02 3600 33,7

Высшгаванне с <Ш4)2304, 40-Й0Э6 4 5 20 1,25 70 0,014 1428 13,4

Рехромагографи ва ДЕАВ-целлшозе 3 2 6 0,75 720 0,0013 4615 43,3

Хроматографам на • гвдроксашшатеге 3 6.7 2,1 0,125 2178 0,0004 5250 49,2

I

.со г

! '

Действие ишлбиторов и опыты с различными донорами электронов показывают* что нятратредуктаза бактероидов клубеньков люпина откосится к типу терминальных нитратредуктаз, лишенных дяафоразной активности.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ШЭШШШДЯИЮП) КОФАКТОРА ИЗ ШТРАТРЕДУКТАЗЫ И КСА1ШШ0КСЩАЗЫ

Подбор оптимальных условий для выделения и стабилизации МоКо. В наших исследованиях ниэкомолекулярного МоКо можно выделить два этапа. Первоначально для изучения ИоКо мы использовали экстракт бактероидов люпина и гомогенный препарат ксантиноксидазы молока. Ксантиноксвдаза воссталавливала активность дефектной нитратре-дуктазы только после кислотной обработки (в 0,1 Ы КаС1,

рН 2,3). В противоположность этому, Ыо-ферменты экстракта бактероидов проявляли активность МоКо и без Предварительной обработки, 1 хотя кислотная обработка резко увеличивала их МоКо-актавность. По-видимому, Мо-ферменпбактероидов частично деградирован« (при,,. разрушении клеток) или же л едко меняют свою конформащю в условиях реакции комплементации,. увеличивал доступ дефектной витрат-редуктазе к содержащему МоКо участку активного центра фермента.

После кислотной обработки способность МоКо к комплементации быстро падает к через час хранения ври 4-5°С составляет не более 30% от исходной активности.. Наши эксперименты также показали, что присутствие молибдата натрия в концентрациях КГ3;— 1СГ2 М в течение реакции комплементации значительно повышало активность новообразованной нитратредуктаэн Как мы далее установили,

это является результатом восстановления потерянного молибдена во время обработки при кислых значениях рН н содержания значительного количества безмолибденовых предшественников Мо-ферментов. Установленный факт стимуляции активности МоКо молибдатом натрия -сыграл важную роль в наших дальнейших опытах со выделению МоКо,

Следуишш этапом была разработка метода частичного выселения МоКо из ксантиноксидазы после осавдения бедка ацетоном.! •Шсде кислотной обработки ксантиноксидазы (рИ 2,2) белок осаждали холодным ацетоном. Денатурировавшие белки после осазденст центрифугировали я ресуспендировали в 0,1 М натрий-фосфатном буфере (рИ 6»8, о КГ4 М аДТА и 0,1 МНаС1), Полученный повторным цеытри-

фугированием супернатант обладал активностью МоКо, которая была нестабильной и полностью терялась в течение 40 минут.

Выделенный препарат МоКо представлял собой смесь двух компонентов, которые могли быть разделены гельфильтрацией на сефадексе 3-10. Второй, более низкомолекулярный компонент, выделенный с сефадекса 0-40 не обнаруживал МоКо-актавности в отсутствие модиб-дата. • т-

• Однако, этот метод был пригоден лишь для ксантиноксядазы и выделяемый данным методом МоКо составлял незначительную часть его,' содержащегося в ферменте. Несмотря на указанные недостатки, проведенные исследования убедила нас в том, что МоКо имеет низкомолекулярную природу;

Выделяемый данным методом препарат МоКо проходил через диализную мембрану в1 экстракт мутанта и восстанавливая актив-, ность дефектной нитратредуктазы. Однако,, при диализе такого препарата против 0,1 М натрий-фосфатного буфера (с М На^00^ мы не обнаружили в буфере активности МоКо. Бщга предположено, что в стабилизации МоКо участвует какое-то низкомолекулярное вещество, диалиэуемое из экстракта ю±*-А.-Наши опыты'по так называемому "двойному диализу" существенно продвинули нас в понимании некоторых важных свойств ЫоКо'и подтвердили эти предположения. •

В целлофановую гильзу для диализа помещали экстракт мутанта содержащий НАДФН (2.10Г4 М^молибдат латрия (КГ2 М). Затем ее вставляли в другую более широкую гильзу^ с 0,1 Ы натрий-фосфатным буфером и такой же концентрацией молибдата ("промежуточный буфер"). Наконец, эти гильзы вставленные одна в другую, погружалн'в препарат МоКо, полученный вышеописанным методом. В "промежуточном буфере" по времени возрастало содержание МоКо, который при добавлении к экстракту восстанавливал актив-

ность дефектной нитратредуктазы.- Во внутренней гильзе (в экстракте вза-1) также по времени возрастала активность новообразованной нитратредуктазы п1*-1.

Результаты этих исследований привели нао к следухщим выводам:

1. МоКо представляет собой ниэкомолекулярное вещество и его можно отделить от белка фермента.

2. £ экстракте мутанта шг-Х существует, низкомолекулярное вещество, • стабилизирующее МоКо,

- и -

Иэ вышесказанного вытекали задачи последулщих исследования:

1. Разработать - метод количественного выделения КоКо о тем, чтобы этот метод мог быть использован дан любого Ио-ферыевта,

2.- Выделить предпологаемый."стабилизатор" ЫоКо или'найти его заменитель.

Количественный метод выделения МоКо из Мо-фетментов« Как известно, Мо-ферменты хорошо выдерживают прогревание при 50-60°С в течение 10 минут. При. прогревании в течение 30 ш, от китро-геназы, например, молибден почти полностью диссоциирует в виде ниэкомолекулярного компонента (1Ъоздев,1967)» В то же время: другие исследователи. (к^сЬш»» 5оу111а, 1973) показали, что МоКо очень лабилен при высокой температуре и мгновенно теряет активность при прогревании. Исходя из этих данных можно было предположить, что ЫоКо может быть отделен от белка фермента при нагревании последнего, но при этом может потерять свою активность. Поэтому прежде всего надо было найти условия, обеспечиванию стабильность ЫоКо при отделении от белка при высокой температуре,, Поскольку по нашим данным и данным Нейсона (Навои »г а1., 1974) важнейшей.причиной инактивации ИоКо является его окисление кислородом воздуха, то такими условиями могли быть: строго анаэробные условия в присутствие - отабилизатора во время очистки. Эту функции» могли выполнять различные восстановители.

В ходе дальнейших исследований т установили, чтофуикцию специфического стабилизатора ЫоКо может выполнять лишь асяорби-нат натргя. В присутствии аскорбшата (0,1 «г/мл) анаэробное прогревание^Мо-фермента при 80°С в течение 8 минут, приводило' к полному выходу МоКо из фермента. Важно подчеркнуть, что'в результате такой обработки активность ЫоКо увеличивается.в 3-4 раза: по-сравненн» с активностью исходного препарата и этот метод о каузален универсальным для любых Мо-ферментоз (нитратредуктвзы, ксантяндегидрогеназы и коантинокеидази) за исключением нитрогена зы, . которая имеет другой Ыо-кофактор.

Первая стадия выделения МоКо (термическая обработка). I объем Мо-фвривнта:(белок около 5 мг/мл) обрабатывается 10 объемами.^киолотного раствора. (0,1 Н НаС1, рН 2,2) в строго' анаэробных условиях. Смесь выдерживают в течение 3-4 минут, затеи; -нейтрализуют 0,1 Н. натрий-фосфатным буфером (рН 7,5) и добавляю? раствор аскорбнната натрия в конечной концентрации 0,1 мг/мя. ■

Смесь тщательно откачивается, заполняется аргоном в прогревается при 80°С в течение 7-8 минут в водяной бане. После- прогревания бистро охлаждают в ледяной воде (4°С) и центрифугирует при. 14000 хв в течение 10 шнут. Супернатант анаэробно переносят в заполненный аргоном сосуд для упаривания под вакуумом. Упаривание (концентрирование) до I мл проводят на роторном испарителе при температуре 30-35°С.

Фракционирование препарата МоКо на сеФадексад й-75 и 0-15. Сконцентрированный препарат МоКо, содержащий молибдена исходного ферментного препарата анаэробно наносили на колонку с сефа-дексом Сг-75 (1,2x48 см), уравновешенную 0,01 М натрий-фосфатным буфером (рН 7,0) с аскорбинатом натрия (ОД мг/мд) (рис.2). Гельфильтрацию проводили анаэробно и на холоду. Из каждой фракции отбирали 0,3 мя 'и добавляли к порции экстракта мутанта содержащей молибдат натрия (Ю-2 11). Как видно из рисунка 2 препарат ЫоКо разделился на два активных компонента: белковый в ниэкоиолекуляркый, причем от активности исходного препарата МоКо обнаруживалась во втором компоненте. Результаты гельфильтрации

г

я i 1

ы

« .«• д

/ \ *

/V /Р V И ' гЙ * / \ \/ \ *

* ' > \ 1 ч ... вп -- ь ¡4 » ял

* »

«л

Рис. 2 . Гельфильтрапдя препарата МоКо, полученного после прогревания Мо-фермента, на сефадексе С-75.

Обозначения: _активность моКо,--

столбиками укЗЗЗкб содержание нолибдена в % к его содержанию в исходном препарата после прогревания.

показывают, что низкомолекулярная фракция МоКо элшруется за фракцией солей, в которой злпирозался в виде■молиЯдата практически весь молибден исходного фермента.

Для дачьне&пей очистки ни зкомолекудярнуя фракцию МоКо концентрировали упариванием и наносили анаэробно на колонку с сефа-дексом 0-15 (1,3x21 с к), уравновешенную вышеуказанным буфером (рис* За). Результаты опытов представленные на рисунке 3 показывают, что и в данном случае МоКо специфически отставал от фракции солей, его активность сохранялась ыа этой стадии очистки на весьма высоком уровне. Для удаленна из препарата МоКо аскорби-ната и фосфатов проводили регельфильтрацш» на сефадексе 4-15,' уравновешенным настенной аргоном бидисталлированной водой. При этом МоКо злюировался с таким же объектом как и при гельфильтра- ■ ции в натрий-фосфатном буфере* однако, активность его резко падала в результате отделения от аскорбината.

Последним этапом очистки.была тонкослойная хроматография на пластинке с силикагедем ("Силуфол", ЧССР) (рис.Зб). Хроматография проводилась в нейтральном растворителе взопропанод-вода (70:30) на холоду, под аргоном. ,Цри такой очистке остаточные примеси — ароматические аминокислоты и ФАД вшиваются из препарата МоКо, который судя по определению его активности остается на линии нанесения. -

Следует особо отметить, что на всех этапах очистки препараты МоКо выделенные из нитратредуктазы, ксантивдегидрогенаэы бактероидов люпина и.ксантиноксадазн молока вели себя совершенно идентично.

Таким образом, общая схема очистки МоКо выгладит' следупцим образом (все этапы.очистки проводятся в строго анаэробных условиях). Схема очистки представлена на стр. 14. /

Белковый компонент МоКо выделяемый из нитратредуктазн и ксантивдегидрогенаэы был очищен по указанной в общей схеме последовательности до гомогенного состояния и он имел молекулярный -вес 25000.

Свойства МоКо. выделенного из нитратредуктазн и ксантшю-кс^даэа.. Как показали результата гальфвдьтрации МоКо на сефадексе £-75 (рис.2) дри прогревания молибден полностью отделяется от МоКо, который,однако,сохраняет способность координировать этот металл и про добавлении молибдата натрия (1СГ2 М) обнаруживает

Мо-фермент

Кислотная обработка в 0,1 М»аС1, рН 2,2

Нейтрализация 0,1 М натрий-фосфатным буфером рН 75 добавление аскорбината ^0,1 мг/мл в конечной концентрации)

Аиаэртбное прогревание (80°С)

Удаление денатурировавших белков центрифугированием (14000 хв , 10 мин.)

Супернатант ^ Осадок

Концентрирование упариванием - -

Гельфильтрация на сефадексе Й-75 (0,01 И натрий-фосфатный буфер с аскорбянатом)

Низкомолекулярный компонент МоКо

Белковый компонент

I

Ультрафильтрация через мембрану Нй-10 (Лт1соп)

Концентрирование упариванием

^ш/на сефадексе

Гельфильтрация на сефадексе £-15 в 0,01 М натрий-фосфатном буфере (о аскорбинатом)

Гельфильтрашм на сефадексе 0-15 в бидистилляте

4

Тонкослойная хромат на пластинке

высокую активность. Было необходимо выяснить, в каких условиях происходит связывание молибдена с МоКо. Эксперименты показали, что №>Ко сам не может связывать молибден. МоКо инкубировали с стабильным изотопом Ыо^О^ М) затем хроматогра^ировала ■

на сефадексе &-15 и во фракциях МоКо не обнаруживали.активности в отсутствии молябдата натрия, также и следов Мо95, связанного с МоКо. Апобелок дефектной нктратредуктазы мутанта п1«-1 также не может связывать молибден. Включение стабильного изотопа Мо в новообразованную нитратредуктаэу происходило в присутствии

О

Ш

Я

2 «о

(А

О О

о 40

о

О йо

Гель фшрацм МоКо на сефадексе 0-15

20 22 24 26 28 50 32 34 фракции, мл

Хгаматографмя МоКо «а пластике с силикагслем($ииГо1) и?опропанол - вода - 70-ю

• й 5 А 6 7 8 9 ю

1'} 1 31 в> 11 «¡г

> г |!

|| э о 3 л 4 р

Рис.3. Очистка МоКо на сефацексе в —15(А) и тонкослойной хроматограф« е й {Е)

апобелка дефектной нитратредуктаз а в МоКо, Эти эксперименты показывают, что молибден в Mo-ферменте координируется не только МоКо, но и какими-то группами апобелка дефектной нитратредуктазы. Однако, в дальнейших опытах нам удалось связать молибден с МоКо в восстановленных условиях при отсутствии экстракта nlt-I. Препарат МоКо предварительно инкубировали в течение 20 минут на холоду с шлибдатом натрия (1СГ2 М) в присутствия - дитконита. Затем проводили гельфильтращш смеси на сефадексе 6-15, уравновешенном 0,01 М натрий-фосфатным буфером, pH 7,0, содержащем аскорбинат 0,1'мг/мл, метилвиологен (I мЮ и дитионит (2 Ш). Во фракциях МоКо его активность обнаруживалась в отсутствии мо-либдата в реакционной смеси, а добавление модибдата незначительно увеличивало активность МоКо - это указывает на то, что молибден связался о МоКо. По-видимому, такой комплекс образовывается в ходе внутриферментпого переноса электронов от доноров к субстрату через МоКо и молибден.

Структурная функция МоКо. Как ранее было показано (Lewis, Scazzacchio, 1977) у "cm" мутантов AJBp.aldulene, дефектных по МоКо молекулярный вес апобелка ксантиндегидрогеназы был в два раза ниже, чем таковой у дикого штамма. Мы предположили, что МоКо может объединять субъединицы дефектной нитратредуктазы в олигомерный комплекс. Для проверки этого предположения мы провели следухщае опыты, в которых к частично очищенной дефектной нитрат-редуктазе добавлялись различные препараты МоКо, При гельфильтра-даи на ультрагёле АсА-04 обнаружили, что датохром "с" редуктаза апобелка дефектной нитратредуктазы nit-I элюпруется значительно позже, чем белок обладающий аналогичной активностью у дикого штамма (рис.4). В наших опытах, после комплементации с МоКо цито-хром "с" редуктаза (новообразованная нитратредуктаза) nlt-I элшроваласъ с тем же объемом, что в фермент дикого штамма, т.е. происходило объединение двух субъедшшц апобелка дефектной ■ нитратредуктазы nlt-I. Такое объединение происходило и в отсутствии мэлибдата натрия, но при этом нитратредуктаза не обнаруживала активности. Интересно, что инактивировашшй на воздухе МоКо также обладал структурной функцией.

Далее нам удалось показать, что МоКо объединяет две'идентичные с^ъедкшщы апобелка нитратредуктазы. При аффинной хроматографии экстракта nlt-I на голубой сефарозе только фракция, злюи-

Рис.4. Гельфильтрандя на ультрагеле АсА-34 препарата дефектной нитратредуктазы мутанта п1-ь-1 Н.огаява I - без добавления МоКо, с добавлением; Л - активного МоКо (цитохром "с" редувтаэная вктивнооть); 3 — активного ЫоКо с Мо05 (нптратредуктазная активность); 4 - инакти-вировакного МоКо (цитохрсм "с" редуктазная активность).

руемая с 0,1 мЫ НАДФН обнаруживает штратредуктазную активность, после комплементации с МоКо в присутствии молибдата натрия, Таким образом, обе субъединицы дефектной нитратредуктазы обладают диа-форазной активностью. <

Возникает вопрос - каким образом связывается МоКо с апобел-ком низкомолекулярных нитратредуктаз, где фермент представлен одной полипептидной цепью (¡ЗвЫ-ЗМЬо, 1аМт»«о, 1977). Как мы показали, МоКо связывает - две субъедашицы нитратредуктазы. Можно предположить,' что каждая субъедакица нитратредуктазы имеет два идентичных участка связывания МоКо, т.е. в высокомолекулярной ассишляторной нитратредуктазы (состоящей из двух субъединиц) имеются четыре места связывания МоКо и четыре молибдев-связыьанцие участка. Следовательно, субъединицы такой нитратредуктазы между собой связываются двумя МоКо, и соответственно, содержат два атома молибдена,' как это в настоящее время хорошо усгановлено. У низкомолекулярных ("терминальных") нитратредуктаз , не имеющих четвертичной структуры, по-видимому, один МоКо связывает два таких участка

одной полипептидной цепи, образуя активную кон$ормацию фермента, и.соответственно,такая витратредуктаза должна иметь один атом молибдена, как это бшго установлено для низкомолекулярных нитрат-редуктаз (ЗеЭД-ЗДИэо, 1еЫтого, 1977).

Каталитическая функция МоКо и молибдена. Для рода Мо-ферментов установлено, что молибден входит в состав субстратсвязывао-цего участка активного центра. Наши данные подтверждает это соложение. Добавление молибдата в реакционную смесь после комплементации МоКо с дефектной нитратредуктазой мутанта аИ-1 не приводило к появлении активности нитратредуктазы. Наша опыты показали, что МоКо связывает субъедишищ дефектной нитратредуктазы так, что после их объединения молибден уже не может проникнуть внутрь молекулы фермента, к активному центру. Чем позже после начала комплементации добавлен молибден, тем меньше образуется активных молекул нитратредуктазы п1*-1.,Эти эксперименты, а также образование комплекса МоКо-молибден в восстановленных условиях показывает, что МоКоне только играет важную структурную роль объединяя две субьединицы Ио-фермента, но и выполняет каталитическую функцию, участвуя в связывании субстрата и в переносе к нему электронов.

Структура МоКо. Как мы указывали-выше, при очистке на сефа-дексах 0-75 и 0-15 МоКо сильно отставал от~солей.

Рядом исследователей было установлено, что вещества, содержащие ароматические соединения имеют высокое сродство к.гелю сефздекса и злюируются после солей. (Св1о«в, 1960; науее е« а1., 1964 ; е-Ь &1., 1965). Также было показано, что степень

сродства этих соединений-к,геля зависела от количества ароматических колец, содержания-кислых или щелочных трупп, связанных ■ с ароматическим кольцом. Такие вещества не подчиняются закону гальфильтрации и'это делает невозможным определение их мадавдияр-ного веса гельфильтрацией. Абсорбция на сефадексе несомненно указывает на содержание ароматического вещества в составе МоКо. На это же указывает и флуоресценция (максимум 445 км при длине волны.возбуждения 370 им), соцрововдавдая НоКо по ходу очистки, а также наличие.поглощения при:260 нм в спектре МоКо.

■ Вторым компонентом МоКо-являются аминокислотные остатки. На их присутствие указывает тот факт, что при аэробном хранении очищенных препаратов МоКо обнаруживаются ряд нингадршположитель-№ соединений.

Анализ аминокислотного состава МоКо с гидролизом в 6 н HCl и без него показал, что в обоих случаях обнаруживаются пять аминокислот; аспарапшовая кислота, треонин, серии, глжшн и аланин (соотношение 2:Х:5:ЗН, если принять за I аканин, содержание которого минимально),

Шскольку некоторыми авторами (Gutteridge «t al., 1978) было высказано, предположение, что одни» из лигавдов молибдена в нсан-тиноксидазе является персульфадная сера, мы провели обработку этого фермента цианидом калия, что должно. было привести, как это показали упомянутые авторы, к-удалению серы из фермента. Для этого к раствору ксаятиноксидазн (0,5 »41) добавляли раствор цианида калия (3Q i&f) и смесь инкубировала; ъ течение суток. После удаления избытка цианида и sor гельфмьтрацвей из ксантикокси-дазы ввделвли ЫоКо, имеющий одинаковую активность с контрольным вариантом, где ксантиноксидаза не подвергалась цианодизу. Это свидетельствует о том, что.сера не связана о МоКо,

Стабильность МоК0> НоИо проявляет активность только в нейтральной среде. ГГри щелочных, особенно кислых pH МоКо мгновенно теряет активность и последующая нейтрализация не приводит к реактивации.

Лучшим способом сохранения активности МоКо является его высушивание в присутствия аскорбината в анаэробных условиях и хранение при -20°С; при атом активность ЫоКо почти не изменяется до четырех суток. При хранении в 0,1 Ы натрий-фосфатном буфере с аскорбинатом активность сохранялась при 5°С до 18 часов. Аэробные. условия (5°С) приводят к волной потере активности через 4-5 часов.

Проверка МоКо активности МоРе-белка шггрогеназы. Мы попытались, использовать разработанный нами метод для выделения Мо-кофактора из кристаллического UoPte-белка нитрогеназы, любезно предоставленного нам Р.И.Гвоздевым (Ин-т химической физики АН СССР), Однако нам не удалось обнаружить активности МоКо . у кислотообра- ' ботанного МоРе-белка нитрогеназы а препарат полученный по нашей методике не восстанавливал активность нитратредуктазы мутанта nlt-I, хотя и содержал молибден, что указывает на большую, по-сравнению с МоКо прочность связи молибдена в молекуле РеМоКо.

; Сравним свойства двух типов Мо-кофакторов (табл.2) для чего используем наши данные и данные американских исследователей ( Shah, Brill, 1977( Weiütoe et al.,1977).

Таблица 2.

Сравнительная характеристика Мо-кофакторов

Свойства

ïeMoKo

МоКо

Для каких ферментов

Тесты на кофактор

Структура

Чувствительность к кислороду

Прочность связи Mo с кофактором

Прочность связи кофактора с белком

Растворимость в воде

Собственная каталитическая; активность

функции

Репрессия аммиаком

нптрогеназа

нитратрадуктаза, ксанти-ноксидаза, альдегидохск-даза, сульфитоксидаза, ксантиндегидрогеназа

восстановление актив- восстановление активности ности дефектной нитроге- дефектной HP мутанта назы мутанта аэотобак- н.сгалв» nit-l» *-кр и тера ow-45 и »-нитро- w-сульфатоксвдазы-геназы,

TetStMo кластер (8:6:Х) соединенный'с полипептидно а цепь»

очень высокая

связь прочная, активность кофактора ио-либдатом не стимулируется

нековаленгная, разрывается при изменении рН, прогревании

не растворяется

ацетиленвос с тан ашли-* вающая,.8% от активности нигрогеназы

каталитическая (суб-стратсвязывают а центр) и.структурная (объединение мономеров Цо-Ре--белка в димеры)

репрессируется

ароматическое соединение, связанное с 5-аминокис-лотными остатками

высокая

связь непрочная, молибдат легко диссоциирует - от кофактора, его активность стимулируется молибдатои

нековалентная, разрывается при изменении рН, прогревании

хорошо растворяется не имеет

каталитическая (суб-стратсвязиваиоий центр) и структурная {объединение субъединиц фермента в слигомерный

З(ОМПЛЗКС)

не репрессируется

Анализируя литературные данные последних лет и.результаты полученные нами, мокко представить картину включения молибдена в Мо-ферменты азотфиксируицих микроорганизмов (рис.5). Система ассимиляции и переноса молибдена в клетке состоит,, по-видимому.

(ЛаглМ'ака

Цидуртзтсо 'иОЛвКМВМЫМ ■

ем* »КИЙ Mofa-(елок

HUT POre НЭДЫ

Рис.S.Предполагаемая последовательность включения молибдена в Мо-ферыеиты в клетке

из ¡Ло-пермеазы, Ыо-аккумулирукщего белка, Мо-переносящего пептида и Мо-трансферазы. Дефицит молибдена или цугадия в этой системе приводит к образованию неактивных безмолибденовых.предшественников ферментов, содержащих МоКо.-

Несмотря на различие Мо-кофакторов нитрогенаэы и нитратре-дуктазы (ксантищегцдрогеназы) для этих ферментов вышеуказанная система переноса является обсей. Однако, как недавно было показано (Мелков а1., 19?"?; Начата, НазеХкогп, 1978), включение молибдена в тгтрогенаэу представляется более сложным. По-видимому, в образовании активной нитрогеназы участвует фермент,. синтезирующий РеМоКо из серы,железа я молибдена. Этот фермент ("РеМоКо-синтетаза") синтезируется шесте с предшественниками нитрогенаэы п!Г -опероном, независимо от присутствия молибдена и репрессируется, как и нитрогеназа, аммонием*

СХОДСТВО РАЗЛИЧНЫХ МОЛИШЕНСОДЕтяЩ ФЕШЕНТОВ .

Нитра^- и нитритредуктаэная активность ксантиноксидазы. Как мы показали выше, - Мо-кофакторы являются сходными со крайней мере для трех Мо-ферментов: нитратредуктазы и ксантандепццроге-назы бактероидов люпина и ксантиноксидаэы молока и играют струк-, турную роль в этих ферментах. Следовательно, можно пологать,. что МоКо-связывающие участки субъединиц этих ферментов одинаковы. -Далее ш показали, что молибден координационно связывается не только с МоКо,.но и с определенными группировками субъединицы, т.е. координационное окружение молибдена в белке также должно быть идентичными у указанных ферментов. И наконец, факт существования общего полипептида (с молекулярным весом 25000) для этих-ферментов привел нас к предположению о том, что они обладают. . активностями: друг друга

Ранее было показано (№ва**г£в]д е* , . 1959), что ксанти-нокевдаза может в анаэробных условиях в присутствии гишкеантина восстанавливать нитраты.. Нами было обнаружено, что ксантинокси-даэа молока обладает нитрат- в нитритредуятазной активностью, причем как видно из данных таблицы 3 фермент может использовать для вышеуказанных 'активностей не только гапоксантин, но и рад других доноров электронов в аэробных условиях. Наиболее эффективным донором электронов для нитрат- и нитритредуктазной активности ксантиноксидаэы, как и для "терминальных" нитратредуктаз

Таблица 3.

; Доноры электронов .для нитрат- и нитритредуятазиой активности коантикоксидазы-

Доноры электронов

Вое ст.метилвио-логен

Дитиокит

Гилояоантин

НАДН

шден

I Жпяпйятт«»—(1Ш™ ратредуктвзввя ак-нмолш, обра-!ЦИ доно- эошшегосяно;иин/мг

?Ра'ю-Зм __

; натявный {дефаавоксан { фермент [тшюксндаза

Натршредук-тазная активность ныоли, восстановлен, 80? - мщ/мг белка

0,7 380 380 625

2,0 175 190 . 613

3,0 250 ■ не о пр. .14

2,0 190" 12 405

2,0 38 15 II

микроорганизмов оказался восстановленный метилвиологен. Интересно, что сам дитионит мог служить донором электронов для нитрат-и иитритредуктазноа активное ти ксантиноксидазц, б то время как восстановлен®} нитратредуктазы (и нитритредуктазы) микроорганиэ-моэ дптионитом,.в отсутствии субстрата,.сильно ингибирует их активность. НАДЙ также служил донором электронов для обоих активностей, а удаление ФАД1, из фермента прекращает перенос электронов от ВДДН к нитрату .и нитриту.

йнгиби^оры^ циаш® калия и азид натрия, одинаково подавляли нвтратредуятазну» активность ксантишжсидазы в присутствии всех доноров, электронов, а ПХМБ не оказывал икгибирупцего действия. Полученные наш результаты позволяет представить схему переноса электронов у кс антинокеидазц в следующем виде;

дитионит--- метшгоиологен но, но?

Ч ^ У

. миеши-»-МоКо-^Рв/з--щиохром

альдегиды феррицпанид

НАДН-— ФАД----->0?

Таким образом, перенос' электронов на нятрат и нитрит осуществляется с молибденсодержащего а Ув/З центров ксантвнокси- ^ дазы, • * ' _ _

' Представляется интересный различие в оптимуме рН различных активностей одного фермента: рН оптимум 5-S для нитрат- н штрит-редуктазной активности ж 8-9 для ксантиноксидазной... * .'.„."

Таким образом, нитрат— л нитритвосстанаиднвавдей активностью обладает высокомолекулярный Мо-фермент животного происхождения - ксантиноксидаза. Как можно объяснять эволюционное происхождение этого пооферыентного комплекса? Вероятно » , Uo-фермевтн бактероидов хмшва имеют сравнительно низкие молекулярные веса, и являются самыми простыми формами Ыо-ферыентов, находящиеся на низкой эволшеокной ступени, Пэ-видоюку, в хода эволшии три фермента : нитратредуктаза, ксавтпндегядрогеназа н нитритредуктаза постепенно претерпевали изменения, ' усложнялись и в животных клетках гена жх слилась,в результате чего в животных тканях начал синтезироваться "сложный ферментный комплекс', ойла-дanry.fi несколькими активностями и имеший два центра — Гв/З в' Мо-оодержащий. Наглер (Наглер, 1976) также высказывает предположение о той, что"ксантиноксидаза представляет собой солиглобу-дярный фермент, образухщийся в результате слияния нескольких генов. •

Известно, что попадание избыточных количеств нитратов к нитритов в человеческий и животный организм вызывает различные заболевания. Возможно, что нитрат- ж нжтритредуктазйая активность ксантнноксхдаэы способствует самоочищению молока от вредных

примесей нитратов и нитритов, ' ■*'-■. ■■'■■"

■ - * *

ИСйИЕОйАШЕ ПШИН ШШШ ШТРАТГВДЖГАЗНОЙ АКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ,. РАСТУЩИХ В УСЛОВИЯХ.ЗАСОЛЕНИЯ* -

Засоление, как известно, значительно снижает активность нитратредуктазы в растениях, однако этот эффект носят обратимый характер — при переносе растений в нормальные условия активность нитратредуктазы полностью восстанавливается. Причины этих явлений до сжх пор неясны, Мы сделали попытку применять ваш знания о ■ ИоКо ж методы работы о ним для оценки структурного ж функционального состояния нитратредуктазы растений при.засоления.*•

Ни изучили нитратредуктазяую активность экстрактов,_ полученных;« корней гороха, выращенного в обычных условиях Еди'о до* Примечание: работа выполнена совместно«лабораторжеИ бжохюии растении Института ботаники АН КяэССР

бавлением 0,6$ или 3,0% хлористого натрия. Активность нитрат-редуктазн экстрактов засоленных раотений, составляющая 4С(6 от активности контрольных растений снижалась еще 'значительнее при гельфильтрации экстракта через сефадекс вг-25. У Экстракта контрольных растений активность нитратредуктазы при этом не изменилась. Для того, чтобы изучить это яавение мы поставили ' сери» опытов, в которых х белковой фракции нитратредуктазы, полученной из растений, выросших в различных условиях засоления добавляли ыолибдат тех различные препараты кофактора (рис.6).

Полученные данные позволили предположить, что при засолении в растениях происходит ступенчатая деградация нитратред^ктазы, причем при слабом засолении от апобелка отделяется прежде всего молибден и при более сильном вся молекула НоКо, •

|80 ¡60

520

jsQ

ï 2 S.4 9 I St i * S 12 i A 5 12 5 I23A

Рис.6. Стимуляция нитратредуктазной активности экстрактов корней гороха в присутствие молибдата натрия и препаратов Ыо-кофактора.

А - контроль (без засоления). Б - 0,6? a NaCl in vivo, Jü - 3$ jüaCl la Vivo, Г - ü,6% HaCl m vitro, Д - рассоление (растения выращиваются в течение 6 дней на ч среде с 3» HaCl, а затем - в течение 6 дней на воде). .

1 - стимуляция молибдатом натрия (10"% конечная концентрация) активности исходного экстракта; 2 - тоже что в ко для диалиаованного экстракта (белковая фракция с в—25) ; 3 - стимуляция активности диализованного экстракта препаратом ИоКо из ксантиноксидазн; 4 — стимуляция активности диализованного экстракта добавлением низко^олеяулярной фракции с сефадексa G-25 (источник МоКо), определено о НАДН; 5 - тоже, что в # 4, но определено с восстановленным бензилвиологеном.

- 26- В заключении вам хочется подчеркнуть, что полученные данные по структуре и\функциях МоКо будутнами развиты в направлении полной расшифровки структуры МоКо и . прежде всего структуры ароматического! компонента в связи молибдена и аминокислотных остатков о' ним. \

Установление полной структуры ЫоКо позволит объяснить механизм каталитического, действия большой группы Ыо-ферментов.

ВЫВОДЫ

I

1. Из бактероидов клубеньков люпина выделена и очищена до гомогенного состояния нитратредуктаза, отнесенная.по совокупности свойств к "терминальному" типу, использующему в качестве источника электронов ферредокоин или его аналог - метилвиологен.

2. Разработан количественный метод анаэробного выделения, низкомолекулярного кофактора, восстанавливавшего активность дефектной нитратредуктаэн мутанта гриба н.огаяаа 'из гомогенных препаратов нитра-хредуктазы бактероидов клубеньков люпина, в ксантиноксидазы молока. Установлена защитная функция аскорбата натрия, как специфического стабилизатора МоКо в процессе его выделения в очистки. Предлагаемый метод выделения МоКо является универсальным в дожег быть использован для любых препаратов, содержащих Мо-фермент^. - .

3. Установлено сходство свойств МоКо выделенного из нитрат-редуктазы а ксантиноксидазы. МоКо состоит из ароматического соединения и пяти аминокислотных остатков*.На воздухе МоКо. инактивируется и при этом аминокислотные остатки диссоциируют

от ароматической части.

4* Показано, что' молибден связан с белком (МоКо) Ыо-фермен-тов непрочно и легко/диссоциирует от ал об елка при изменениях ,рН, ионной сипы в прогревания ферментного препарата. С^нако фермент при этом ве теряет способности связывать молибден, о чем связано восстановление активности фермента (МоКо) в присутствие , молибдата.

5. МоКо выполняет в ферментах, по крайней мере две функции: каталитическую (участие в субстратсвязыващем центре) и структурную (связывание субъединиц фермента). Показано, что последнюю функцию способен выполнять также МоКо, инактивированный окислением на воздухе* Проведен сравнительный анализ свойств МоКо и ЕеМоКо нитрогеназы.

6. Гомогенная ксантиноксидаза молока обладает нитрат- и китритредуктазной активностью в аэробных условиях и в присутствии восстановлению: форм НАД и ыетидвиологена, Установлены оптимальные условия для проявления 'этих активностей ксантжноксидазы, . обсуждается их возмохный механизм, его эволюционное происхожде- . > ниеи возможности практического использования для очистки молока от нитратов и нитритов. .

■ 7. Одной из причин - снижения активности нитратредуктазы в. . условиях засоления является диссоциация молибдена или МоКо от апобелка фермента. Это явление носит, однако, обратимый характер -после переноса растений на среду без соли активность нитратре-духтазн полностью.восстанавливается. В качестве возможного объяснения механизма атого явления предложена- гипотеза студен- . чатой деградации молекулы нитратредуктазы растений при засоления.

1Ь теме диссертации опубликованы следующие работы;

1. Львов Я.О., Ганелин В.Л,, Аликулов З.А., Кретович В.Л. 1975. О природе низкомодекулярного фактора; общего для молябден-содериащих ферментов. Изв. АН СССР, сер.биол. 3, 371. 2/ Львов Н. П. , Ганелин В.Л., Аликулов З.А., Кретович В.Л, 1975. Механизм включения молибдена в состав молибденсодержапцсс ферментов^ Рефераты П Пенделеевского Съезда по общей и прикладной химии. П., Наука, секция, 6, 67.

3. Львов И.П., Ганелин В.Л., Аликулов 3.1., Кретович В.Л. 1975.

Еизкомолекудярный фактор, общий для моллбденоод ержащкх-ферментов. Тезисы ХП Международного Ботанического конгресса, Л., 450."

4. Львов Н.П., 1Ънадин'В.Л,, Аликулов З.А., Кретович В.Л. 1976.

Низкомолекулярный фактор,, общий для .молибденсодвркаших ' ферментов. В кн.: "Физиологическая роль и практическое применение микроэлементов"» Риге, "Зинатне", 101.

5. Аликулов. З.А. , Кабишева Т. 1976. Нивкомолекуляркый кофактор

_ молжбденоодёркащих ферментов.'Тезисы докладов конференции . " молодах учеинх Казахстана, посвященной 217 съезду ШЗС,. I. .:

6. Львов Н.П., Аликулов З.А., - Сергеев Н.С,, Кретович B.JI. 1978. ' О сходстве двух молибденссдержащих ферментов:, нлтрогенаэн и натратредуктазы. Тезисы докладов Ж Всесоюзной конференции "Биологическая ролькикро элементов и их применение в сельской хозяйстве и медицине", Ивано-Франковск, I, 105. 7„ Х*от Я.Р.( AlikulOT Г., bretovlch T.l. 1976, Molybdenum

cofactor of nltrog«nae» end воине other Мо-еssyues. Ргоо. 3-rd StAeaboek-KetterlngHrttSyu on Vitrogen Fixation (Ed. Orme-Jolumon *. Bevton V.) liadioon, USA, £1.

8. Аликулов З.А.Львов Н.П., Кретович В.Л. 1979. Низкомолеку-

лярвый кофактор у молябденсодержящих ферментов. Тезисы 17 Всесоюзного биохимического съезда. Д., Наука, 3, 181.

9. Аликулов'З.А., Львов H.H., Кретович В.Л.. 0 нитратредуктаз--

ной активности ксантиноксидазы молока. В сб.: "Биологическая роль микроэлементов", М,, Наука, (в печати),.

Т 04188 от 2Г-Н1-79 г. 3да.. 1350 Тир. 150 ПНП ВНИЭС1

с

J