Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и иммунохимическая характеристика субклеточных компартаментов из корневых клубеньков люпина желтого

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Выделение и иммунохимическая характеристика субклеточных компартаментов из корневых клубеньков люпина желтого"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ имени К.А.ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

Агибогов Казбек Асшшанопяч

Ввдодапив и т/ууиоы?шч<гскоя характеристика ■ субклеточных ксмпартментов из корневыя клубеньков лшина гзялтого

(03.00.12 - физиология растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Рабата выполнена в Институте физиологии растений иу. К.А.Тимирязева АН СССР.

Научные руководители - доктор биологических наук, профессор

Г.Я.Жизневская - доктор биологических наук, профессор С.Д.Измайлов

Официальное оппоненты: доктор биологических наук, профессор

3.Г.Евстигнеева кандидат биологических наук Вл.В.Кувнецов

Ведущее учреждение - Московский государственный университет им. Ы.В.Ломоносова, кафедра клеточной физиологии и Иммунологии.--

Защита'диссертации состоится << ^ >> 1991г. в

<< ¿О» часов на заседании Специализированного совета по присуждении ученой степени кандидата биологических наук (К 002.45.01)при Институте физиологии растений им.К.А.Тимирязева АН СССР (127276, г.Москва» И-276, Ботаническая ул., 35).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений АН СССР.

Автореферат разослан « » . 1991г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Л.И.Сергеева

-Г/ ?

' » Общая характеристика роботы

гд<эл I

££!££}!!:.! I

Актуальность проблемы. Инфицированная клетка азотфикспрущего корневого клубенька бобовых растений состоит из трех основных макрокомпартментов: цйтозоль растительной клетки,бактероид и пэ-рибактероидное пространства (ПБП), заключенное между перибекте-роидной мембраной (ПЁЭД) и клеточной стенкой бактероида. В бактероидах синтезируется ферментный нйтрогеназный комплекс, осуществляющий восстановление молекулярного взота.'а растительная клетка обеспечивает необходимыми для данного процесоа углеродными субстратами как-источникам! энергий и акцепторами аммиака (Виг-г1в et а1.,19бо). Таким образом» устанавливается истинный симбиоз между эндссймбион?аМи, что явилось основанием называть бактероид, о окруаающэй его ПБМ, симбиосомой (¡¿э11ог»1989Ь

В ходе формирования и функционирования езотфикснрующего клубенька происходит биосинтез вайшх для симбиоза новых клубенвк-специфичных белков, конкретные функции большинства из которых до сих пор не известны (1е£оок1 0t а1.,1981). Клубенек-специфичные белки, Кодируемые растительными генами и присутствующие только в корневых клубвйьквх, но отсутствующие в неинфицированных рйзобй-ями корнях или й других органах растения-хозяина, называются но-

дулинами. Наиболее ярким примером нодулинов является лэггемогло->

.бин (1Ь), благодаря которому создаются микрозарофильцые условия, необходимые для работы китрогеназы <хиЬо»1939)*

Выяснение роли ПБП,' окруженного НЕМ в составе скмбиосомы, является перспективной проблемой клеточной физиологии симбИотичзс-кой фиксации йзота у бобовых. Однако, к Моменту начала нааей работы дайнкё1 характеризующие этот новый компартией!, были немно-гочяслекныш! й противоречивыми, а локализация клуй9нек-спе1щфич-

них балков в ПБП и ЦБМ не Орла известна совсем, за исключением ьь,' наличие которого в ПБД ставилось цод сомнение. В эначитель-ной мара ато было связано с отсутствием надежного метода выдвле-ния симбиосом, окруженных ицтактнымц ПБМ,

Цель и задачи исследования, Основной целью данной работц явились поиск и изучение клубенак-специфичных оелков в ПБМ и ПБП корневых клубеньков люшша. Для реализации этой проблемы было необходимо решить ряд задач: 1) разработать метод, позволяющий выделить Из корневых клубеньков люпина интактныа ПБП и ПБМ, г) на основе разработанного метода приступить к изучению распределения клубенек-специфичных белков, в том числе ьь, в ПБП и ПБМ. Для этого было необходимо: а) получить моноспацифичаскиа антитела к хъ; б) получить и выделить истощенные антитела к ПБП и ПБМ.

Научная ровизна. В результате проведенных исследований разработан новый метод фракционирования оубклеточных. компартментов из корневых Клубеньков люшша (цитозоль растительной клетки клубенька, содержимое ПБП, ПБМ и бактероид ). Показана интактность ПБМ и ПБП с помощью применения разнообразных и независимых тестов. ЬЬ в основном локализуется при эффективном симбиозе в цито-зола растительной клетки клубенька люпина, а его незначительная часть - в ПБП. При неэффективном симбиозе ьь- локализован только в цигозоле растения-хозяина. В ПБП обнаружен один из изофермен-тов пероксидазы. Впервые показана локализация нодулинов в ПБП и ПШ клубаньков люпина. В ПБП присутствует нодулин - ззкД, который отсутствует в цитозоле растительной клетки клуоанька. Ноду-лины ПШ (24,37,53 и 83КЦ ) синтезируются только при аффективном симбиоза. Наряду с нодулинами в ПБП и ПБМ выявляются антигены бактериального и бактероидного происхождения, один из которых липополисахарид - обнаружен в ПБМ.

Практическая значимость. Разработан относительно простой И н8дпкння мэтод шделения бактероидов, эаключетшх в интоктгше ПЕМ, из корневых клубеньков люпина, который может служить основой для широкого изучения свойотв ПБМ и ГГБИ с целью выяснения роли этих пограничных структур в эффективной «абиотической азотфкксации. Полученные результаты, в особенности данные по локализации кодулкнов к липополисахарвда в ПЕП и ПБЫ, должны быть учтены исследователями, занк/лакыямися конструированием искусст-б9шшх бзотфиксиружих систем.

ДПЕОЙЖЭШ 'диссертации. Оскозкые результаты диссертационной работы доложены на II Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Москва,1986), на Международной конференции стран-членов СЭВ ''КИНСОЕЮТХ-дО11 (1990).

Публикации. По томе диссертации опубликовано 3 печатных работ -ЁЭ2ШШ! диссэотэции и рбх-ем диссертации. Работа изложена на 148 страницах и содержит з таблицы и 21 рисунок.Диссертация состоит из введения, 5 глаз и выводов. Библиографический указатель включает 233 источника; из них 46 отечественной и 187 зарубежной литературу.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЙАНИЗ РАБОТЫ

• Материалы и методы исследования Объектом исследования слугяли корневые клубеньки люпина желтого (Ьир1пия Шеив 1.) сорта ''Факел", находившегося в фазе бутонизации. Растения выращивали в песчаной культура при инокуляции эффективным штаммом Вг^.угМгоМип! 1ир1п1 359а и мутантным неаффективным штаммом -400. Б качества питательной среды использовал! макроэлемента по Кнопу-1/2 дозы (азот - 1/30 дозы) и микроэлементы по Риныглсу-1/2 дозы (Рипькяс,1982). Растения люпина

желтого, неинфицированные ризобиями, выращивали до фазы буто* зации_в водной культуре на питательной среда того же состава, с полной дозой азота.

АзотФиксирущую активность клубеньков определяли с помои стандартного ацетиленового метода (Hardy et al., 196В).

Методик? выделения рубклеточных уомпартментов цз корнег рубаньков люпина. разработанная нами, описана в раздела "I зультаты и их обсуждение". Подбор изотонической концентрации с харозы и сорбита осуществляли криоскопическим (Кармодонов,19£ и рефрактометрически»! методами.'

Электтюнно-микроскогтчаски^ рнелиз был выполнен в соавторс1 с Е.З.Федоровой и И.Н.Андреевой (ИФР АН СССР) по описанному f; тоду (Андреева и др., 1934).

Разрушение ультразвуком бактерий и бактероидов BradyrhizobJ lupini производили на установке УЗДН при 44Кгц, Зимин., +4°с.

Активность парокоидазы определяли гваяколовым методом при-г 6.8 (Chanoe»1955).

|¡b рыдзляли по методу, разработанному в лаборатории езотнс обмена ИФР АН СССР (Кудрявцева,197Q).

Иммунизацию кроликов гомогешшм препаратом ib,а также Фраки яш ПБП и ПЕМ клубеньков люпина проводили по следующей схем первая иммунизация йроводилась в конъюктиву глаза кролика в по ном адъюванте Фрзйнда по боомкг белка на кролика? вторая иммун зация - в неполном адъюванте через две недели после второй 500МКГ белка на кролика в 4-6 точек вдоль позвоночника! трет иммунизвция-в фосфатном буфере с 0.9% Nací через одну неделю п ела второй иммунизации в г точки вдоль позвоночника по 500м белка. Через наделю после третьей иммунизации производили отб крови из ушной вейы. Титр полученной антисыворотки проверяли м тодом имыуно-ферментного анализа (Elisa).

нз рис.1 ггеэдставлена схема истощения антител,полученных против фракций ПШ и ПБМ клубеньков. люгоша.Для получения ' аффинного сорбента с целью истощения антител к ПБП и ПБМ от антигенов не-

I этап истощения

I этап истощения

I [♦-♦- АТ к ПБП ИЛИ ПБМ

* *- колонка о аффинным сорбентом

е

«- АГ неинфлцированннх корней

АТ реагирующие с АГ бактероидов, ПБП или ПБМ

АГ бактероидов

•Ь-Л-.

^ ^ \ «.«. нц фильтр

АТ спэцифичныэ к иодуяшам ПБП или ПБМ Рис.1

Схема истощения антител, полученных против фракций ПБП и ПБМ

инфицированных ризобкями корней люпина и бактерий ВгайутМгоМш 1ир1п1 3598 было взято збмг и 15мг белка соответственно фракций ЦП то золя и тотальных цитоплвзматичвских мембран но1шфш"'роввшшх корне»! люпина, а также 5мг бэлка фракщм разрушенных ультразвуком бактерий. Белки раститолышх и бактериальных фракций (каздоП фракшш в отдельности) "пршивали'1 ковалзнтно к сггвг-актшзиро-вашюй сефароз9-4В по инструкции фир:,т "Р1шгто1а" и затем смешивали. Эффективность связывания белка ' с сефарозой составляла ео-85^. Полученный аффинный сорбонт уравновешивали в колонка фосфатным буфером, на которую накосили юомг антител, полученных

против фракции ПБП или ПБМ. Скорость элюции составляла 4мл/час. Полное истощение достигалось после 2-3 нанесений антител на аффинную колонку. Таким же образом производили истощение антител, полученных к ПБМ. Далее антитела дополнительно истощали бактероидами антигенами. Для этого на нитроцеллшгазном фильтре (Щ) иммобилизовали антигены фракщш разрушошшх ультразвуком бакта-роидов из эффективных клубеньков люпина. Затем Щ фильтр инкубировали с антителами К ПБП или ПБМ. После такого дополнительного истсщения оставшиеся антитела реагировали только с нодулинами.

Денатушиующий элакттзафорез о додецилсульфатом нацЕИд (ДЛС-Np ) белков в градиентном (Ю-20Я) полиакриламиднсм геле (ПЛАТ) проводили по Леммли (Laermli,1970) при комнатной температуре.

Натившй диск -sлактpotopeз проводит при 4°о в 7.5£ раздэляк-щем и А% концентрирующем ПАЯ' такю как и донотуркрувйшй злок-трофорез, за исключением того, что на добавляли во все раствора ДЦС-Na.

Иммуноблоттинг. Электропервнос с ПААГ на Щ фильтр проводили по методу Тоубина (Towbin et al.,1979). При проявлении ситчлюв Па НЦ фильтре использовали в качестве вторых антител ЦТ) -ентп-кроличьи ÄT, конъюгированныа с пероксидазой. При прогздзшы: методом Elisa анализа на присутствии в ПБ.'л липополисокпрада (ЛПЗ) использовали в качества первых AT -. моноклоналыше AT ¡с дипиду А Salmonella minnesßota, а В качестве вторых ЛТ - енеди&яашыо ЛТ, конъвгированные с пероксидазой.

ре,гок рпредедялп по Брэдфорд. (Eradiord.,1976).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Описание разработанного метода выделения субклеточных фракций из корневых клубеньков люпина.

В отличие от ранее известных для корневых клубеньков сон и ЛКТПШЯ методов (Robertson et al.,197Э!Verma et al.,1970), ПОСВЯ-щешшх выделению симбкосом, мы уделили особое внимание ключевым этапам фракционирования клубеньков, от которых в большей степени зависит целостность ПЕМ, а именно: 1) подбор изотопической среды зыделенил; 2) оптимизация условий центрифугирования и 3) разработка набора тестов, оценивающих интактность ПБМ.

Первым и обязательным условием при, выделении как клеточных органелл, так и бактероидов, заключенных в ПБМ, является подбор изоосмотической-среды выделения. Однако,в литературе при выделении бактероидов с ПБМ из клубеньков люпина (Robertson et al., 1978), оптимальные изотонические условия не определялись, а концентрация двух наиболее часто используемых осмотиков - сахарозы п некетаболизируемого субстрата в среде выделения колебалось в значительных пределах. Использование рефрактометрического метода позволило установить основной интервал изоосмотических концентраций осмотиков. Для сахарозы он составлял от 0.43-0.46М, а для сорбита 0.45-0.5М. Однако при выделении в присутствии сорбита с рядом концентраций, ле:::зкж в указанием диапазоне, бактероиды, как правило, был; л::"-з;ш ПБМ, что свидетельствовало о разрушении этой мембраны и подчеркивает важность решения вопроса' о выборе осмотака. В связи с этим,наиболее точннм - криоскопическим методом - онло определено значение оптимальной пгютенлчио^ концентрации для сахарозы. На рис.2 видно, что минимальная разница коа-д/ отклонением длины пиков регистрирующего егмописца, соответствующих точке замерзания растворов сахарозы -донной концентрация до и после инкубации высечек или гсмогенста клубеньков,составляла 0.4411, что указывало на изоосмотичпость дашей концентрации сахарозы,которая и была использовано нсми в среде выделения бак-рсидсв, окруженных ПБМ, из корневых клубеньков лкпина.

0.42 0.43 0.44 0.45 0.46

РИС.2 Определенна изоос-мотической концентрации сахарозы кри-оскогшчесюш мето-•дом.дг-разность отклонения длины пи-, ков (мм) регистрирующего самописца, соответствующего точке замерзания растворов сахарозы данной концентрации до и после инкубации высечек клубеньков. М-концент-рация сахарозы.

Гомогенизация клубеньков

центрифугирование 300g, юмин

m

супернатант ■♦■«->

цитоплазма растительной клетки t

центрифугирование, 150000g, 1 .54

i '

цитозоль

^o%

центрифугирование в градиенте плотности парколла 5000g,зомин

бактероиды с ПБП и ПБМ _

10Й

2Ь%

ьо%

гомогенат «

осадок-шок в гипоосмоти-ческой среде

центрифугирование в изотонической среде 5000g,зомин

25Й

458

центрифугирование в градиенте плотности сахарозы

131000g,2.54

бактероиды

Рис.з Схема выделения бактероидов, окрукэнных ПБМ

На рис.э представлена схема разработанного метода выделения бактероидов, ПБП й ПБМ, а также цитозоля растительных клеток из корневых клубеньков люпиНа. Основным этэпом, отличающимся от

Рис.4

3л е к тро ННо-микросКопиче скйй контроль фракций бактероидов, окру^еНных ПБМ (9), и везйкул ПБМ (0).

других методов» описанных в литературе, явилось центрифугирование гоМогената клубеньков в градиента плотности перколла (Ю,25 и 50%). Эта процедура позволила разделить бактероиды, окруженные ПБМ, Цитозольнун фракций растительных клеток клубенька и бактероиды без ПБМ. Использованием градиента перколла достигнуто не только освкдение бактероидов, округешшх ПН?,?» но п изоляция их от цитозольной фраКЩШ растительной клетки, что практически исключало загрязнение бактероидсодержеаего кошартмеята цнтозолем

растительной ¡клетки.

Согласно данным здектронномикроскопических исследований ос-норная'-фракция бактероидов, окруженных ПБМ, локализовалась в интерфазе 25/50% перколла (рис.4а), Фракция цитозоля растительных клеток клубенька оставалась над слоем ЮЯ перколла. Эта фракция цитозоля подвергалась дополнительной очистке от мембран различного происхождения путем ультрацентрифугирования. Для получения фракций содержимого ПБП, ПБМ и бактероидов без ПБМ далее бактероиды, окруженные ПБМ,ресуспендировали в пшоосмотической среда (о.огм-сахароза) для разрушения ПБМ, Гомогенат, полученный после гипоосмотического шока и состоящий из ПБМ.бактероидов, лишенных ПБМ, и из содержимого ПБП, наносили на двухступенчатый градиент сахарозы - 25/40$ и ультрацентрифугировали. Распредалекие гомо-гената по фракциям в градиенте сахарозы было следующим: ПБМ локализовалась в йнтерфазе £5/40% -сахарозы (рис .4(3), фракция содержимого ПБП оставалась над слоем 25% -сахарозы, бактероиды без ПБМ.- в осадке;

Для оценкй Целостности ПБМ симбиосом при выделении из клубеньков люпина был разработан следующий набор тестов (Агибетов и др.(1966,1951I Измайлов,Радккина,Агибетов и др.,1989): а) электронно-микроскопический, позволивший определить, Что 60$ бактероидов сохраняли Целостность после разделения в градиенте плотности Перколла! б) осмотический, показавший, что ПБМ относительно устойчива и выдерживает колебания концентрации сахарозы в интервале от О.эгк до о4$ в) барьерный, свидетельствующий, что ПБМ не проницаема для вкзогенного протеината серебра (45КД); г)внзи-Мблогическйй, учитывающий соотношение активностей специфических для разлйч>01Х КоШартментов клубенька ферментов. -

Результаты проведенных исследований показали¡ что данный метод позволяет выделить бактероиды, окруженные штактной ГШ, из

слубеньков люпина. Все это создало практическую основу для нзу-шния распределения клубенек-специфичных белков в выделенных сомпартментах из корневых клубенькоэ люпина.

2. Характеристика полипоптидного спектра цитозоля растительной клетки клубенька при аффективном и неэффективном симбиозе и цитозоля неинфицированлых корней люпина Одним из методических"подходов, позволяющих раскрыть механизмы, лежащие в основе эффективного функционирования симбиотичвс-ких азотфиксирующих систем у бобовых,.является сравнительное исследование трех систем: 1)корневых клубеньков с высокой азотфйк-сирущей активностью (эффективный симбиоз, fix+), 2) корневых клубеньков с незначительной азотфиксируищей активностью или нб имеющих ее совсем (неэффективный симбиоз, iix~), э) а также корней бобовых, Не инфицированных ризобиями. На рис,5 представлен^ результаты ДЦС-Иа-электрофореза белков фракций цитозоля, выделенных из iix+ клубеньков люпина в сравнении о цитозолями fix" клубеньков и неинфицировэнных ризобиями корней люпина. В клетке корня люпина, прэтерпеввющей существенную структурную и метаболическую перестройку в ходе инфицирования и образования клубенька, происходит как йкспрессия генов, Иодирующих клубенек - специфичные белкй-нодулкны, так и частичное блокирование синтеза Сел-ков, присущих Нб!&фицироввнным клеткам корйя. Так, например, а цитозоле fix+ клубеньков (рис,5, указаны отрелками) нодулинами являются полипэптиды с Молекулярнжи МаССВМЛ 12,51 15(5 (Lb)J 36; зв 'Л В7КД. В то же время в цитозолэ неияфицйровашшх корней люпина имеются з полипептида с молекулярным! массами 16,5: 66 и вскД (рис.5, указаны стрелкой), которые не синтезируются в клубеньках.

Сравнение спектра белков цитозолей эффективных й незффектив-

шх клубеньков (рис.5),значительно различашихся по уровню азот-фиксации (40,3 р 0,093 мкмолей с2н4 на 1гр. сирого веса клу-öeHbKQB за 1 час соответственно) показывает в основном полнуг идентичность соответствующих полипаптидных полос, однако интенсивность всех полос во фракции цитозоля fix" клубеньков значительно шике интенсивности полипаптидных полос цитозоля клубеньков, что ноша объяснить низкой метаболической активность! rix" клубеньков, а такаш Процессами деградации, происходящс/л i Них (Андреева и др.,1989).

а б в

Б

в г

87 КД ... 80КД .}

66кД

зекд „ ЭбкД .>

1й.5кД *

Lb

12.5КД «

Рис.5 Схема элактрофореграммы белков, а) цитозоль неиыфици-рованшх корнейi б) цитозоль растительной клетки fix+ клубенька; в)ЦИтозоль растительной клетки tir.~ клубенька.

33icJ

94КД <. 67КД .» 43кД ^ ЗОкД * 20кД ч, 14кД ч

Рис.6 Схема иммуноблоттиш'Е: клубенек-специфичных белков. Проявление антигенов анти-ГШП антителами (А) поело I этапа истощения и (Б) посла Н этапа истощения (см.рис.1).

А: а) ПБП клубенька; б) бактероиды Нх+ клубаныса.

Б: в) ПЕН iix1 1слубенька; г) ПБП fix" клубенька.

А

1 4

3. ПЕРИБАКТЕРОЩЩОЕ ПРОСТРАНСТВО (ПБП)

3.1 .{{дубецек-сценифцчные белки |ТБПГ При изучении клубенек-специфичных балков ПБП и ПБМ мы воспользовались методическим подходом, с использованием истощенных клубенек-специфичных антител, ранее примененным другими авторами на клубеньках сои и гороха для выявления нодулинов цитозоля растительной клетки (Ьа-доок1, Уепг.а, 1981! В1взо11аз е-Ь а1.,1933). 'Антитела, получешше против ПБП клубеньков люпина, м*. истощали на аффинной колонке, к которой были "пришиты" ковалентно белки гомогената неинфиЦиро-ваншх корней люпина н свободнокивущих бактерий Вгайугп. lupi.nl 359а (см.рис.1). В результате истощения антитела к ПБП, по данным иммуноблоттинга, не реагировали с антигенами цитозоля неинфицированных корней и свободношвуппс бактерий ВгайугЬ.1ир1п1 359а, а твкке с растительными антигенами цитозоля аффективных клубеньков' лвгаша. Последнее указывает на то, что среда балков ПБП отсутствуют нодулшш растительного цитозоля клубеньков. Результаты иммуноблоттищ'а показывает, что истощешшо антитела к ПБП реагируют только с антигенами ПБП и бактероидов (рис.6). При этом в ПЕН выявляются 6 антигенов от 33-57кД,.о в бактероидах -гораздо болыао-от 23-1оокД. Полученные данные свидетельствуй?, что в основном антигены фракции ПБП, использованные для иммунизации, игле ют бактериальное происхождение, а также о тесной этиологической связи этой метаболической зоны с бактероидами.

Истощенные против антигенов неинфицированных корней люпина и свсбодноаивущих бактерий Вгайугп, 1ир1п1, антитела 1« ПБП все кв содержали примсси антител к антигенам бактероидной формы Вгас1у-гЬ. 1ир1п1, что затрудняет обнаружение нодулинов в ПБП. Для окончательного выявления возмопюго присутствия нодулинов в ПБП мы ввели новуа дополнительную стада: истощения антигенами бакте-

роидов, иммобилизованных на НЦ фильтре (см.рис.1). В результате такой процедуры нам удалось полностью истощить антитела от антигенов бактероидов и выявить нодулин с мол.массой ээкД, который специфически локализуется только в ПБП эффективных и неэффективных клубеньков люпина (рис.6).

3.2. Локализация леггемоглобина (Lb) и пероксидазы в ПБП. Наиболее обильным продуктом растительного гена внутри клубенька является нодулин-Lb. В литературе имеются данные о положительной корреляции между азотфиксирующей активностью штаммов (Brady)Rhi-bium и содержанием ЪЪ в клубеньках бобовых растений, включая люпин (Мелик-СаркИСЯН,Кретович,1975; Nash, Bchulman,l975s Jennsen, Paludan.1981). Существуют две гипотезы относительно внутриклеточной локализации Lb. Результаты одних исследований указывают на то, ЧТО Lb локализован В. ПБП (Bergersen, Appleby,1980,19811 Lara et al.,i988i Ливанова и др.,1979). Однако, другие .работы подвергают сомнению локализацию 1Лэ в ПБП (Verma et al., 1976, 1985; Robertson et al. ,1970,1984). Т.о., Botipoo о локализации Lb в ПБП бобовых растений остается до сих пор неясным.

В целях изучения внутриклеточной локализации Lb в клубеньках мы использовали высокоиммунную политональную антисыворотку, Полученную нами против гомогената препарата Lb,выделенного из корневых клубеньков люпина. Результаты иммуноблоттинга (рис.ТА) показали, что полученная антисыворотка была моноспецифичной к Lb поскольку проявлялась единственная полоса преципитации, соответствующая Lb. Lb был обнарукен'в цитозоле и в ПБП fix+ клубенька! люпина, а также в цитозоле fix- клубеньков. В ПБП fix- клубень ков люпина Lb не обнаружен.

Отсутствие Lb в ПБП fix" клубеньках люпина указывает на то что эффективность симбиотической фиксации атмосферного азота за висит от распределения Lb внутри инфицированной растительно

- а

А

б в

- а

Б

а

Рис.7 Распределение Lb (А) и изофермантов пар-оксвдаэы (Б) в инфицированной клетке клубенька. A; a) Lbj б) цитозоль fix+ клубенька; в) ПБП tix+ Клубенька; г) цитозоль fix" клубенька. В; а) ПБП; б) Lb; в) цитозоль rix+ клубенька.

а б

а б в

аэкД

Э7кД

24КД

83КД « 57КД .» 37КД ^

24КД .»

1ЕЯ

сз

в

РИС.8

Сравнение (схема) белков ПБМ из fix+(a) ц fix"(б) клубеньков.

Рис.9

Схема иммуноблоттинга белков. Проявление антигенов анги-ПБН антителами (А) после I этапа истощения и (Б) после Д этапа истощения (см.рио.1).

А: а) ПБМ iix+ клубеньков; б) ПБП iis+ клубеньков; в бактероида клубеньков. Б: ПБМ fis+ клубеньков.

клетки клубенька.

Для содержимого ПБП характерен один единственный изофермер! пероксидазы с относительной электрофоретической подвижность) (ОЭП) - о.го (рис.7Б). В цитозоле растительной клетки клубенька, в отличие от ПБП, обнаружен ряд йзоферментов пероксидазы с 031 0.16-0.70, один из которых с ОЭП 0.6-0.7 соответствует ОЗП ЬЬ который, как известно, обладает псевдопероксидазной активность! (в1втвгв,1978). Т.к., в,ПБП присутствует только один из изофер ментов пероксидазы, соответствующий по ОЭП Одному из изофермен тов пероксидазы цитозоля растительной клетки.клубенька, то оче видно, что обнаруженная нами пероксИдаза в ПБП не Может рас сматриваться как результат загрязнения В процесса выделения пер оксидаэой или 1Ь из растительной Клетки клубенька.

4. ПЕРИБАИТЕРОИДНАЯ МЕМБРАНА (ПВМ) '

4.1. Кодулины ЦВМ. В то время как характер спектра белков ПЕ эффективных клубеньков не отличается от спектра белков ПБП неэ<] фективных клубеньковло В ПЕМ Их" клубеньков можно отметить 01 сутствйе ряда мажорных селкоВ ПБМ Т1х+ клубеньков! 24,37 и 831

(рИС.8);

Для выяснения вопроса локализации нодулинов в ПБМ было проВ( * дано истощение антител, полученных против фракций ПБМ клубень» люпина, по схеме,представленной на рио.1. Как.показывают резул таты иммуноблоттинга (рис.9посла первоначального истощений антигенами гомсгената неинфицированных корней и свободнокйвущ бактерий Вга<1угЬ1ЕоЫш1 1ир1п1, антитела к ПБМ реагировали в о новном с антигенами ПБМ, и в меньшей степени - с антигенами Сё тероидов и ПБП. Во фракциях тотальных мембран наинфицированн корней, свободаокивущих бактерий и цитозоля эффективных клубен

ков полос преципитации на иммунсблотинга не было. Приведенные результаты свидетельствуют о том, что в ПВМ, как и в ИБП, клубеньков люпина присутствуют антигенные детерминанты бактероидно-го происхождения, которые мешают идентификации нодулинов в ПБМ.

Для устранения этого препятствия был проведен второй этап истощения антител к ПБМ с антигенами бактероидов. В результате в ПБМ эФХоктивных клубеньков люпина выявлены нодулшш с мол.массами 24,37,58 и аэкД, которые отсутствуют в ПБП, бактероидах, а также в ПБМ неэффективных клубеньков (рис.9). Среди этих 4-х но-дулинов - нодулин с мол. массой 37кД, не описанный в литературе, является мажорным среди всех белков ПБМ, что указывает на высокую функциональную роль этого мембранного белка в эффективном азотфиксируицем симбиоза.

4.2. Лилополиоахарид (ЛИС) и ПБМ. В связи с тем, что в НЕМ обнаруживаются антигены бактериального характера, возникает вопрос о природе этих(ого) антигенов(а). В процессе злектрошю-мик-роскопических исследований было замечено,что в процессе дифференциации ризобий в азотфикснрущиа бактероиды происходит нслу-щивание" внешней мембраны клеточной стенки бактероида в шде мембранных везикул, одним из компонентов которых является ЛПС. Часть мембранных везикул лизируется в ПБП, з другая часть, транспортиру ясь через ИБП, ассоциируется с ПБМ (Bai et al.,1980; Brad- ley et al.,1986; Андреева и др.,1989).

Для исследования возможности ассоциации мембранных везикул ризобий, содержащих ЛПС, с ПБМ растительного происхождения, нами были использованы моноклоналыше антитела к липиду а грам-отрц-цателышх бактерий Salmonella ninnesaota. Липид А является наиболее консервативной частью ЛПС наружной мембраны у всех граы-отрицательных бактерий, в том числе у ризобий.

Результаты ишуноформантного' анализа (ELISA) показали, что

моноклональные внтитела к липиду А реагировали только с ЛПС ПБ;.1 и фракцией разрушенных ультразвуком бактероидов (рис.ю). специфичность этого взаимодействия подтверадается- отсутствием-иммуно-ферментной реакции антигенов тотальных мембран неинфицированных

О

492пт

Рлс.ю

ИдмуЕСфзр;,;з1шшй енализ (еывл) рзекцж моноклонвлышд он-тпгол к липиду А с фракциями: 1) - бактероиды 11ж+ клубеньков; 2) - ПЕ1.1 Их* клубеньков; 3) - момбраны неинфицирозанных корней лллина. По оси раститровка АН от 1 до 0.015ккг белка/лунка.

корней лепшв с титрующимися моноклональними интителеми к лшиду А, что говорит об отсутствии иммунохимического родства ыззду ли-пидом А н липидами'растительных мембран (А£1Ъс1;оу et а1-,1990;).

В опытах на клубеньках гороха также показано специфической связывание ПБМ с моноклоналышми антителами, полученными против ЛПС бактероидов НМгоМшп 1е2Ш11поаагШ1 (Вге«1п at а1.,19В5; Вга<11еу вt а!., 1986).

Т.о., полученные на люпине дашше подтверждают ранее получение на клубеньках гороха свадеши, что биогенез ПБМ имеет слок-1шй характер и з ее построении пршишаат участие не только зндо-ыомбранная система растительной клетки, но и компоненты наружной мембраны бактероидов.

В Ц В О Д Ц

1. Разработок новый относительно простой и надежный метод выдвг лзшгя бактероидов,заключенных в плтаютгае пэрибактероидныа мемб-ршш {симбнссомы), из корневых клубеньков люпина,включаискЛ систему последовательных операций, основным звеном которых является центрифугирование в градиенте плотности порколла, к позволяющий получить содеркшоо ПБП и изучать состав, структуру и функционирование ПБМ.

г. Разработаш критерии, по которым мскно судить о целостности ПБМ, окруяагсцзй бактероиды, при выделении из клубеньков!

а) электронно-микроскопический, позвол;шшкй определить, что 60;^ бактероидов сохраняла целостность посла разделения в градиенте плотности перколла;

б) осмотический, показавший, что ПЕМ относительна устойчива к ендершпзает колебания концэятрацш; сахарозы в интервале от о.эг" до 0.5М)

в) барьерный, сввдотельствущяй, что ПБМ не проницаема длл экзогенного протоината серебра (45КД);

г) энзнмологичвекий, учнтаваший соотношение активностей специ-

фнческих для различных компартментов клубенька ферментов.

3. На основе разработанного метода установлено, что в клетке корня люпина,претерпевающей существенную структурную и метаболическую перестройку в хода инфицирования ризобиями и образования клубенька, происходит как экспрессия генов, кодирующих клубенек специфичные белки-нодулины, так и частичное блокирование синтеза белков, присущих неинфицированным клеткам:

а) в клубеньках блокируется синтез полипептидов - 16,5: 66 и 80кД, характерных для неинфицированных корней люпине $

б) в то же время в цитозоле корнэвых клубеньков люпина выявляются нодулины 12.5:36; за и 87КД, а также хъ. Последний локализуется в основном при аффективном симбиозе в цитозоле. Незначительная его часть также присутствует в ПБП. При Неэффективном симбиозе ЬЬ локализуется только в цитозоле растения-хозяина, что указывает на связь между еффективностью симбиоза й распределением 1. о. ■

4. Впервые показано, что в эффективных и неэффективных клубеньках люпина синтезируется нодулин- ззкД, который специфически локализуется только в ПБП.

5. Антигены ПБП представлены в основном бактериальными белками что свидетельствует о тесной этиологической связи данной метебо лической зоны с бактероидами.

6. В ПБМ аффективных клубеньков имеются нодулины (24,37,58 аэкД), которые отсутствуют в ПБМ неэффективных клубеньков. Нодз л»щ-Э7кД ПБМ является мажорным компонентом белков ПБМ, что пре; полагает его важную функциональную роль в азотфнксирующем симб) озе.

7. ПБМ, имеющая изначально плазмалеммное происхождение, Модиф цируется в хода эффективного симбиоза нодулинвми. Однако зда такя;е присутствуют антигены бактероидов, один из которых - лиг

полисахарид.

а. Выявлена связь между качественным составом белков ПБМ и эффективностью симбиоза. Это выракается в отсутствии при неэффективном симбиозе нодулинов, что предполагает ведущую роль нодули-нов ПБМ в функционировании азотфиксирувдего симбиоза.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕЗЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Агибатов К.А., Кадыров P.M., Радюкина Н.Л.» Федорова Е.Э. Пе-рибактероидщие мембраны клубеньков лшина йвлтого:зксперимен-тальное выделение и предварительная характеристика.//II Всесоюзная конф. молодых ученых по физиологии растительной клетки, тез. докл.-М.,1986, с.64.

2. Zhiznevskaya G.Ya., Agibotov К.A., at al. Immunochemical study of loghaemoglobin (Lb) localization in the subcellular compartments of yellow lupin root nodules under effective and inef-footive symbiosis.//Abstraots of the 7th International Congress on Nitrogen Fixation. Cologne, F.R.O., N12-25,, 1988.

3. Zhiznevskaya Q.Ya., Agibetov K.A., Oenina O.S., at al. Cytochemistry of lupin nodules.//Abstraota of the 5th International lupin oenfei-ence. Poznan, Poland, V-29,1988.

4. Izmailov S.F., Radukina U.L., Borodenlto L.T., Kadyrov R.U., Agibetov K.A. et al. A study of tha interactions between rhizo-bium baoteroida and the host plant oall3.//Abotraota of the 6th Congress of tha PESPP. Split-Yugoslavia, N11-10, 19S8.

5. Измайлов C.3., Радюкина Н.Л., Агибетов К.А., Кадыров P.ti. з др. Перибактероидноэ пространство клубеньков люпина желтого: выделение содержимого, ннтактность пэрибактероидной мембраны.//Ш-зиология растений,1S89,т.31.ш'.стр.309-317.

6. Oenina O.S., Radukina N.L., Agibetov К.Л. ot al. The iatt

aoid corapoaition oi the peribaoter-oid membrane and of the peri

baoteroid враое matei-ial from Lupinus lutous 1. root nodules. / ■f-ъ

8 International Congress on 1-Iitrogen Fixation, Abstracts. K1102 ville, Tennessee, USA, N 0-06,1990.

7. Agibetov K.A., Zhiznevakaya O.Ya.,ot al. Bacterial lipid А о the peribaoteroid membrane of the lupin noduleo.//Physiol', plan tarum,1990,v.7S,faao.2,part2,p.A-97.

8. Жизневская Г.Я., Дробышева Н.И., Лгибетов К.А., Радакина Н.Л Ганина О.С. Кошартментация пероксадазы в клубеньках люпина. /, Физиолого-биохшическая роль микроэлементов в управлении адаптивными реакциями и продуктивность растений. Мат.Респ.сиш. Ки-rnmieB. 1990, с. 44-50.

9. Агибетов К.А., Генина О.С., и др. Нодулины, бактероидины и ю внутриклеточная локализация в корневых Клубеньках люпина шзлтогс //Физиология растений,1991 ,T.38iBim.i,с.95-105.'