Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ассимиляция аммонийного и нитратного азота в бактероидсодержащей и коровой тканевых зонах корневых клубеньков люпина желтого

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Ассимиляция аммонийного и нитратного азота в бактероидсодержащей и коровой тканевых зонах корневых клубеньков люпина желтого"

- з '.ПО 1Г=ся

На правах рукописи

ЧЕЧЁТКА СВЕТЛАНА АНАТОЛЬЕВНА

АССИМИЛЯЦИЯ АММОНИЙНОГО И НИТРАТНОГО АЗОТА В БАКТЕРОИДСОДЕРЖАЩЕЙ И КОРОВОЙ ТКАНЕВЫХ ЗОНАХ КОРНЕВЫХ КЛУБЕНЬКОВ ЛЮПИНА ЖЕЛТОГО

Специальность 03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА -1998

Работа выполнена в лаборатории азотного обмена Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор С.Ф. Измайлов

Официальные оппоненты:

академик РАСХН, доктор биологических наук, профессор Б.А. Ягодин доктор биологических наук, профессор В.Р. Шатилов

Ведущая организация:

МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет

Защита диссертации состоится 21 апреля 1998 г. в Ю30 часов на заседании диссертационного совета К 002.45.01. по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФР РАН.

Автореферат разослан 20 марта 1998 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, ^

кандидат биологических наук

М.И. Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди большого разнообразия азотфиксирующих микроорганизмов — свободноживущих, ассоциативных и симбиотических — основной вклад в биологический баланс азота биосферы вносит функционирование бобово-ризобиального симбиоза. В связи с актуальностью проблемы дефицита пищевого и кормового белка, а также необходимостью увеличения плодородия почв путем обогащения их биологическим азотом, все более настоятельно на первый план выдвигается изучение механизмов функционирования и регуляции симбиотической азотфиксации. В то же время, выращивание бобовых сельскохозяйственных культур часто требует внесения азотных удобрений. В связи с этим возникает проблема не только действия нитрата, как наиболее усвояемой формы азота, на симбиотическую фиксацию азота растениями, но и возможности его усвоения клубеньками по аналогии с корнями, с которыми они этиологически родственны.

Многочисленными исследованиями выявлена активность нитратредуктазы (HP) в клубеньках большинства бобовых (Randall et al.,1978; Vezina et al., 1988; Minchin et al., 1989) и ее индукция под действием нитрата (Becana, et al., 1989), что дает основание говорить об участии клубеньков в ассимиляции этого иона. Имеются также данные, которые ставят под сомнение наличие у клубеньков нитратассимилирующей функции (Streeter, 1982; Becana et al., 1985; Sprent et al., 1987). Кроме того, по мнению ряда авторов, 95% HP активности клубеньков приходится на фермент бактероидов (Hunter, 1983; Stephens, Neyra, 1983), который по своим функциям является диссимиляторным и отличается от растительного по физиологическому значению и свойствам.

Таким образом, единого мнения относительно ассимиляции нитрата как функции клубеньков до сих пор не сложилось. Возможно, это связано с тем, что клубенек, с точки зрения его основных метаболических свойств, до сих пор мало исследовался как сложная, интегрированная система со всей спецификой, присущей его клеточной и тканевой организации. Актуальным является и вопрос об организации азотассимилирующей функции в системе целостного растительного организма с учетом наличия ее не только у

клубеньков, но и у других органов. Изучение регуляции этой функции за счет донорно-акцепторных отношений при распределении фотоассимилятов, необходимых для фиксации молекулярного и ассимиляции связанного азота, также представляет собой актуальную и малоразработанную проблему.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении потенциальной способности двух основных тканевых зон клубенька — коровой и бактероидсодержащей, к ассимиляции связанного (аммонийного и нитратного) азота и возможности реализации этой функции на основе их взаимодействия в нативных клубеньках, а также ее регуляции посредством донорно-акцепторных отношений в системе целостного растительного организма.

В связи с этим решались следующие задачи:

1. Выявить реальную нитратаккумулирующую емкость и определить нитрататтрагирующую роль клубеньков и их основных тканевых зон в нитратном балансе различных органов растительного организма.

2. Изучить возможность реального усвоения нитратного азота на примере регуляции нитратредуктазы, глутаминсинтетазы, глутаматдегидрогеназы и аспарагинсинтетазы в указанных тканевых зонах клубеньков люпина желтого при одновременном и раздельном усвоении симбиотически фиксированного и нитратного азота.

3. Изучить особенности тканевых взаимоотношений в нативных клубеньках с учетом реализации их азотфиксирующей и нитратассимилирующей функций за счет углерода главного транспортного продукта - сахарозы.

4. Исследовать донорно-акцепторные отношения в системе целостного растительного организма сои при распределении 14С - фотоассимилятов по органам в процессе усвоения симбиотически фиксированного и нитратного азота.

Научная новизна. В работе впервые исследована тканевая организация процесса усвоения аммонийного и нитратного азота на уровне бактероидсодержащей и коровой зон корневых клубеньков люпина желтого. Показано, что в цепи метаболических превращений кора зависима от притока из инфицированной зоны сахарозы и первичных аминокислот, на основе которых синтезируется собственный пул аминокислот и амидов, необходимых

клубенькам и растению. Выявлена депонирующая функция коры по отношению к аминокислотам, синтезируемым в обеих тканевых зонах клубенька. Инкубирование растений и тканевых зон клубеньков на среде с 14С-сахарозой, а также определение активности ключевых ферментов ассимиляции нитратного и аммонийного азота показало, что нитратассимилирующая функция не реализуется в активно функционирующем клубеньке. Определена специфика донорно-акцепторных отношений в системе целостного растительного организма при распределении фотоассимилятов в условиях одновременного и раздельного усвоения симбиотически фиксированного и нитратного азота.

Практическая значимость работы. Результаты исследования существенно дополняют представления об организации и характере взаимодействия тканевых зон клубенька при осуществлении его азотассимилирующей функции и помогают понять природу процессов, происходящих как в клубеньках, так и в целом растительном организме, при наличии в среде нитрата, в концентрациях, ингибирующих и неингибирующих азотфиксацию клубеньков. С практической точки зрения, полученные результаты дают возможность разработать научно-обоснованные подходы применения различных форм азотных удобрений с целью повышения продуктивности бобовых культур, избегая при этом ингибирующего действия связанного азота на азотфиксацию.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на II Международном симпозиуме " Стресс и ассимиляция неорганического азота" (Москва, , 1996), II! ежегодном симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология" (Москва, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, 3 главы экспериментальной части), заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертационная работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 7 рисунков и 7 таблиц. Список цитируемой литературы включает 359 публикаций, из них 292 зарубежные.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследований служили растения люпина желтого (Lupinu; luteus L.) сорта Брянский - 27 и сои культурной (Glycine max Merr.) сортг Спутник. Люпин желтый выращивали в песчаной культуре, семена пере; проращиванием инокулировали штаммом Bradyrhizobium lupini 359 а. После появления всходов на 7 и 21 сутки проводили две корневые подкорма растений, внося по 1/2 дозы модифицированной среды Кнопа (Гродзинский Гродзинский, 1973) и 1/2 дозы микроэлементов - по Уайту (Смирнов, 1970). Для опытов использовали растения в фазе бутонизации - начала цветения, когда азотфиксация клубеньков была максимальной (Андреева и др., 1992). В зависимости от задачи эксперимента, часть растений дополнительно подкармливали нитратом в концентрации 11,2 мМ (KN03 и Са(МОз)г) для выявления нитратассимилирующей способности.

Растения сои выращивали в водной культуре на питательной среде Харпера и Николаса (Harper, Nickolas, 1978). Семена перед проращиванием инокулировали штаммом Bradyrhizobium japonicum 2496. Перед началом фазы цветения, за трое суток до проведения эксперимента, в состав питательной среды для одной половины растений вносили дозу нитрата 2 мМ (KNO3), а для второй половины растений — 20 мМ с целью ингибирования азотфиксации в клубеньках (Streeter, 1985).

Расчленение клубеньков люпина желтого на тканевые зоны. Клубеньки разделяли на наружную коровую зону, в дальнейшем именуемую корой, и бактероидсодержащую ткань вместе с элементами' проводящей системы и клетками внутренней коры, именуемую в дальнейшем бактероидсодержащей зоной (рис. 1). Инфицированная ткань была видна благодаря наличию в клетках красного пигмента - леггемоглобина. В изолированных тканевых зонах измеряли содержание нитрата, активность ферментов, метаболизацию 14С-сахарозы в продукты азотного обмена и др.

Определение содержания нитрата в тканевых зонах клубеньков и органах люпина проводили титрованием с салициловой кислотой согласно общепринятой методике (Cataldo et al., 1975). Содержание нитрата выражали в мкмолях на 1 г сырой массы.

Рис. 1. Схема поперечного среза клубенька люпина желтого

Условные обозначения: НК - наружняя кора, ВК - внутренняя кора, ПП -проводящие пучки, БСТ - бактероидсодержащая ткань, К - корень. Граница разделения тканевых зон показана пунктиром. Соотношение бактероидсодержащей зоны и коры в клубеньке по сырой массе варьировало от 1:1,5 до 1:2.

Активность НР определяли по методике /л vivo (Streeter, Bosler, 1972). Реальную активность фермента измеряли без внесения, а потенциальную — при внесении 0,1М KNO3 в среду инкубации, где экспонировали тканевые зоны клубеньков. Ферментативную активность выражали в мкмолях нитрита, образовавшегося за 1ч в расчете на 1 г сырой массы.

Активность ГС определяли "гидроксаматным" методом (Евстигнеева и др., 1971). Ферментативную активность выражали в нмолях у-глутамил-гидроксамовой кислоты, образовавшейся за 1 мин в расчете на 1 г сырой массы и на 1 мг белка.

Активность ГДГ определяли спектрофотометрически при 340 нм при восстановительном аминировании а-кетоглутарата (Яковлева и др., 1964). Активность фермента выражали в нмолях НАДН2, окисленного за 1 мин в расчете на 1 г сырой массы и на 1 мг белка.

Активность АС определяли предварительно осаждая ферментный белок сульфатом аммония (40% насыщения) с последующим концентрированием в 10 раз и гель-фильтрацией через Сефадекс С-25. Активность измеряли по количеству 14С-аспарагина, образовавшегося из 1_-[11-14С]аспарагиновой кислоты в течение 40 мин инкубации. Низкомолекулярные компоненты разделяли с помощью ионообменной хроматографии на колонках со смолой Ооууех-1. Активность АС выражали в нмолях аспарагина, образовавшегося за 1 мин, в расчете на 1 г сырой массы и на 1 мг белка.

Содержание белка определяли по методу Лоури (1_о\му е( а\„ 1961).

Инкубирование изолированных тканевых зон на среде с 14С-сахарозой. Коровую и бактероидсодержащую тканевые зоны клубеньков люпина желтого (навеска 1 г) инкубировали в 3,0 мл среды инкубации в течение 1, 2 и 3 ч. Среда инкубации содержала [11-14С]сахарозу радиоактивностью 30 мкКи/мл, элементы среды Кнопа (1/2 нормы), микроэлементы среды Уайта (1/2 нормы). В первой серии опытов среда инкубации не содержала источников азота, а во второй серии опытов среда инкубации содержала нитрат в виде солей «N03 и Са(Шз)г в концентрации 7,3 мМ.

После инкубации тканевые зоны отмывали от радиоактивной сахарозы водой и фиксировали 80%-ным кипящим этанолом.

Инкубирование растений на среде с 14С-сахарозой и нитратом. Растения люпина, находящиеся на стадии бутонизации (10 штук), погружали корнями в 70 мл среды инкубации. Инкубирование проводили в факторостатной камере в течение 5 и 24 ч. Клубеньки радиоактивной среды не касались. Среда инкубации для предварительно подкормленных нитратом растений содержала [11-14С]сахарозу — 1,0 мкКи/мл, нерадиоактивную сахарозу — 2 мМ, элементы среды Кнопа, в том числе КЫОз и Са(М03)2, (1/2 нормы), микроэлементы среды Уайта (1/2 нормы). Для растений, служивших контролем, среда инкубации вместо нитрата содержала компенсирующие количества КгБОд и Са304. После окончания инкубации корни отмывали от радиоактивной сахарозы и отделяли от них клубеньки. Последние быстро расчленяли на кору и бактероидсодержащую зону и фиксировали 80%-ным кипящим этанолом.

Экспонирование среднего листа сои в атмосфере с 14СО?. Третий зрелый лист растений экспонировали в токе воздуха с 14СОг в течение 10 мин.

№Н14СОэ служил источником 14СОг, исходная радиоактивность №Н14СОз в установке составляла 20 мкКи/мл. После поглощения листом 14СОг растения выдерживали на свету в течение 2 и 24 ч. При этом корни находились на питательной среде Харпера и Николаса с различными дозами нитрата (2 мМ и 20 мМ). Затем растения расчленяли на стебли, листья и цветки поярусно, а также корни и клубеньки. Органы измельчали для последующей экстракции спирторастворимых веществ 80%-ным кипящим этанолом. Затем проводили постинкубационную обработку полученных образцов.

Постинкубационная обработка. Фиксированный этанолом растительный материал 3-х кратно экстрагировали 80%-ным кипящим спиртом в течение 2 сут. Полученный общий экстракт спирторастворимых веществ далее разделяли на сахара с органическими кислотами и на свободные аминокислоты с амидами методом ионообменной хроматографии на колонках со смолой Оошех • 50 W [Н*-форма]. Радиоактивность веществ в трех указанных фракциях определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике ЯаскЬе(а 1219 ("УУаПас", Финляндия). При употреблении в тексте термина "сахара" имели в виду суммарную фракцию Сахаров с органическими кислотами, а в случае "аминокислоты" — фракцию аминокислот с амидами, соответственно.

Азотфиксирующую активность клубеньков сои определяли ацетиленовым методом по восстановлению ацетилена в этилен клубеньками корневой системы растения (Васильева, Жиэневская 1988) на газовом хроматографе "Хром - 4" ('{.аЬогаЬитн Рпэ^о^е", Чехия). Объем вводимой в хроматограф пробы газа - 1см3. Ацетиленвосстанавливающую активность выражали в мкмолях образовавшегося этилена на 1 г сырой массы клубеньков в 1 ч.

Для определения содержания аминокислот в тканевых зонах клубеньков изолированные коровую и бактероидсодержащую зоны (навеска по 1 г) фиксировали 10 мл 80%-ного кипящего этанола. После 3-х кратной экстракции образцов и упаривания в общем экстракте спирторастворимых веществ количественно определяли содержание аминокислот на газожидкостном хроматографе ААА - 339М ("М^гс^есЬпа", Чехия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. МЕТАБОЛИЗМ НИТРАТА В КЛУБЕНЬКАХ 1.1. Нитратный статус клубеньков люпина желтого

Для изучения данного вопроса цветущие растения люпина инкубировали на средах с различными концентрациями нитрата в течение 5 сут. Данные по содержанию нитрата во всех органах представлены в таблице 1.

Таблица 1. Содержание нитрата в органах люпина после инкубирования растений на средах с различными концентрациями нитрата

Органы растения мкмоль N01/1 г сырой массы

Концентрация нитрата в среде, мМ

0 11,2 22,5

5 суток

Корень 2,34 ± 0,86 13,27 ±1,26 18,33 + 0,68

Клубеньки 1,62 + 0,04 3,98 ± 0,45 3,63 ± 0,29

Стебель следы 15,15 ±1,31 30,43 ±2,58

Листья 1,55 ±0,07 5,40 ± 0,67 8,39 ± 0,29

Инкубирование растений на среде, содержащей 11,2 мМ нитрата, привело к увеличению его содержания во всех органах. Но больше всего его аккумулировалось в стебле и корнях. Меньшее всего — в клубеньках. Инкубирование растений на среде с 22,5 мМ нитрата сопровождалось дальнейшим накоплением иона в клетках стебля, корня и листьев. В клубеньках количество нитрата и на этой дозе было невысоким. В нативном клубеньке нитрат накапливался главным образом в коре из-за ее большей массы по сравнению с бактероидсодержащей зоной (табл. 2). Таким образом, кору можно . рассматривать как депонирующую емкость для нитрата, поступающего в клубенек. Тот факт, что клубеньки обладали наименьшей нитратаккумулирующей способностью на фоне всех органов растения, наводит на мысль о существовании структурных и (или) метаболических барьеров, ограничивающих его импорт в клубенек.

Таблица 2. Содержание нитрата в клубеньках и изолированных из них тканевых зонах после 5 суток инкубирования люпина желтого на средах с различными концентрациями нитрата

Клубенек масса, г мкмоль N03/ сырую массу

Концентрация нитрата в среде, мМ

0 11,2 22,5

0,3 0,48 ±0,01 1,19 ± 0,03 1,09 ± 0,08

Кора 0,2 0,34 ± 0,06 0,93 ± 0,03 0,86 ± 0,04

Бактероидсодержащая зона 0,1 0,15 ±0,02 0,32 ± 0,08 0,30 ± 0,01

Примечание. Корневая система растений, включая клубеньки, была полностью погружена в раствор, содержащий нитрат.

1.2. Ассимиляция нитратного и аммонийного азота.

Для выявления способности тканевых зон клубенька к восстановлению содержащегося в них нитрата в обеих тканевых зонах определяли активности нитратредуктазы (HP), глутаминсинтетазы (ГС), глутаматдегидрогеназы (ГДГ) и аспарагинсинтетазы (АС) после проведения предварительной нитратной подкормки растений в концентрации 11,2 мМ. Контролем служили растения, не получившие нитрат.

В отсутствие нитрата (контроль) обе тканевые зоны имели низкие и сравнимые значения реальной нитратредуктазной активности (PHP) (табл. 3). В то же время, по уровню потенциальной активности (ПНР) бактероидсодержащая зона почти в 7 раз превосходила кору. По-видимому, инфицированная ткань является основной зоной клубенька, где может осуществляться восстановление нитрата.

Присутствие нитрата в среде выращивания привело к заметному возрастанию PHP, обе тканевые зоны стали близкими по этому показателю. Однако разница между ПНР активностью и PHP сохранялась, причем она была особенно велика в бактероидсодержащей зоне.

Таблица 3. Активность нитратредуктазы в изолированных тканевых зонах клубеньков через 3 суток после нитратной подкормки растений

Тканевые зоны мкмоль N02 /(1 г сырой массы • ч)

Концентрация нитрата, мМ

0 11,2

Реальная НР Потенциальная НР Реальная НР Потенциальная НР

Кора 0,22 ±0,01 9,26 ± 0,59 2,56 ± 0,09 6,28 ± 0,29

Бактероид-содержащая 0,10 ± 0,02 64,62 ±2,68 2,02 ± 0,08 30,54 ±1,09

Таким образом, потенциальные возможности обеих тканевых зон, и в особенности инфицированной, по восстановлению нитрата реализовались в ограниченной степени. Учитывая тот факт, что нитрат сосредоточивался в основном в коре, можно заключить, что важным фактором, лимитирующим процесс восстановления нитрата в бактероидсодержащей зоне, является минимизация его содержания, а в коре - низкий уровень ПНР. Кроме того, нитрат оказывал ингибирующее действие на саму НР. На последний факт указывает снижение уровня ПНР в обеих тканевых зонах после нитратной обработки.

Анализ активности аммиакассимилирующих ферментов в условиях нитратного питания показал, что активность ГС в бактероидсодержащей зоне была в 2 раза выше, чем в коре (табл. 4). Иными словами, инфицированная зона являлась основным местом ассимиляции аммиака в клубеньке. В присутствии нитрата была отмечена тенденция снижения активности ГС как в коре, так и в инфицированной зоне. Обе тканевые зоны принципиально не различались по активности ГДГ, а нитратная обработка привела к ее частичному ингибированию (табл. 4). Следовательно, несмотря на присутствие нитрата в среде, активность ГДГ в качестве альтернативного пути ассимиляции аммиака также отчетливо не проявлялась. Активность АС в бактероидсодержащей зоне клубеньков была в 5 раз выше, чем в коре, что видно из данных таблицы 4. После внесения нитратной подкормки отмеченная закономерность сохранялась, хотя в данном случае наблюдалось снижение ее

уровня в обеих тканевых зонах. Таким образом, синтез в клубеньках главного транспортного азотсодержащего продукта — аспарагина был локализован в их инфицированной зоне, и нитрат в концентрации 11,2 мМ оказывал ингибирующее действие на этот процесс.

Таблица 4. Активность глутаминсинтетазы, глутаматдегидрогеназы и аспарагинсинтетазы в изолированных коровой (I) и бактероидсодержащей (И) тканевых зонах клубеньков после 3-х дневной нитратной подкормки растений

нмоль/мин на 1 г сырой нмоль/мин на 1 мг белка

массы

Тканевые Ферменты Концентрация нитрата, мМ

зоны 0 11,2 0 11,2

I ГС 732,0 656,0 12,2 10,8

II 1654,0 1504,0 28,5 28,1

I ГДГ 332,4 202,9 5,4 3,0

II 427,9 345,6 5,7 5,6

I АС 5,3 1,0 0,1 0,02

II 26,6 17,2 0,5 0,32

Примечание. Активности выражены: ГС — в нмолях у-глутамилгидроксамовой кислоты, ГДГ — в нмолях НАДНг, АС — в нмолях аспарагина.

На основании приведенных данных можно заключить, что наибольшая активность всех исследуемых ферментов была связана с азотфиксирующей функцией, а не депонированием нитрата в коре. Полученные результаты также подтверждают высказанное выше предположение о существовании структурных или физиологических барьеров, ограничивающих доступ нитрата в клубенек, исключая таким образом дополнительный источник азота для ферментативных систем.

1.3. Характеристика пула аминокислот тканевых зон

Определение содержания свободных аминокислот показало, что бактероидсодержащая зона практически в 2 раза превосходила кору по данному показателю (рис. 2). Этот факт обьясняется тем, что именно здесь происходило образование аммиака в результате фиксации N2, а высокая активность ГС и АС обеспечивала его ассимиляцию. Присутствие нитрата в среде хотя и не изменяло отмеченную закономерность, однако приводило к снижению суммарного содержания аминокислот в бактероидсодержащей зоне (рис. 2). В то же время, в коре этот показатель практически не изменялся. Это является аргументом в пользу того, что кора в клубеньке может представлять собой депонирующую емкость не только для нитрата, но и для аминокислот и амидов, синтезируемых в обеих тканевых зонах.

Рис. 2. Суммарное содержание аминокислот в тканевых зонах клубеньков люпина желтого после внесения нитратной подкормки (11,2 мМ) О- кора, бактероидсодержащая зона

Нитрат различным образом влиял на содержание индивидуальных аминокислот. Уровень конечных продуктов азотфиксации — аспарагина и глутамина заметно снизился в обеих тканевых зонах. Уровень других (аланин, глутамат, гамма-аминобутират, аспартат) — упал главным образом в бактероидсодержащей зоне. Содержание таких аминокислот как серии, лизин,

валин, фенилаланин, гистидин, треонин, аргинин, пролин, изолейцин, напротив, увеличилось в обеих тканевых зонах. Последний факт может свидетельствовать о возможном импорте вторичных аминокислот в клубеньки из других органов. Исходя из данных по содержанию индивидуальных аминокислот, можно предположить, что в активно функционирующем клубеньке обильно синтезируются только те аминокислоты и амиды, которые затем транспортируются в побег, тогда как аминокислоты, поступающие в клубенек по флоэме, вероятно, образуются в нем в относительно небольших количествах.

Подводя итог полученному материалу, можно заключить, что в ходе формирования и функционирования симбиотической системы в клубеньках создается ряд защитных механизмов, которые ограничивают негативное действие нитрата на азотфиксацию. Одним из них является лимитированный импорт нитрата в клубенек, особенно в его бактероидсодержащую зону. Не исключено, что система располагает и другими механизмами, ограничивающими проявление активности нитратредуктазы при наработке N0^ — ингибитора нитрогеназы. В результате потенциальная нитратассимилирующая активность клубеньков проявляется в относительно невысокой степени. На основании этого можно сделать вывод о том, что нитратассимилирующая функция не является типичной (одной из основных) для нормально функционирующих клубеньков.

2. БИОСИНТЕЗ АМИНОКИСЛОТ В ТКАНЕВЫХ ЗОНАХ КЛУБЕНЬКОВ ИЗ '"С-САХАРОЗЫ

Для изучения сравнительной способности тканевых зон клубенька люпина желтого к усвоению аммонийного азота с использованием углерода сахарозы изолированную кору и бактероидсодержащую зону инкубировали на среде, содержащей 14С-сахарозу, в течение 1, 2 и 3 ч. Из данных, представленных на рис. 3, А, видно, что обе зоны поглощали метку из раствора с близкой интенсивностью. Процесс метаболизации ее в аминокислоты имел прямую зависимость от времени экспозиции и проходил активнее в клетках коры (рис. 3, Б). Следовательно, кора обладала достаточно высокой потенциальной метаболической активностью. Этому способствует наличие в

коре высокоактивных сахарозосинтазы и инвертазы, а также гликолитических ферментов, обеспечивающих наработку углеродных скелетов, необходимых при ассимиляции азота (5иее{ег, 1991).

Рис. 3. Радиоактивность фракций спирторастворимых соединений в тканевых зонах клубенька после их инкубирования на среде с 14С-сахарозой

А - общий экстракт, Б - аминокислоты и амиды; -О- кора, -□- бактероидсодержащая зона.

Аналогичные результаты были получены при изучении метаболизма 14С-сахарозы в тканях нативного клубенька (рис. 4). Для этого растения инкубировали на среде с 14С-сахарозой, и выявляли динамику новообразования аминокислот в каждой зоне клубенька, полученной после его расчленения. За 24 ч инкубирования уровень метки во фракции Сахаров в бактероидсодержащей зоне оказался выше, чем в коре, что свидетельствовало о преобладающем аттрагирующем потенциале инфицированной зоны (рис. 4, А). Однако новообразование меченых аминокислот в коре за этот период было почти в 2 раза выше (рис. 4, Б).

^ 0 300

кора

бактероедсо держащая зона

200

2 100

КОра бактероидсо

держащая зона

гщ

24

А

250 ■■

кора

бактероидсо держащая зона

кора бактероидсо держащая зона

5 24

Продолжительность инкубации, ч

Рис. 4. Радиоактивность фракций спирторастворимых соединений в тканевых зонах клубеньков после инкубирования растений корнями на среде с 14С-сахарозой в присутствии нитрата (7,3 мМ) или без него

А - сахара и органические кислоты, Б - аминокислоты и амиды □ - "-N03", ■ -N07

Представлены результаты анализа средней пробы клубеньков с 10 растений.

Следовательно, кора, наряду с инфицированной зоной, принимает активное участие в биосинтезе аминокислот, создавая некоторый резерв биологического азота для дальнего транспорта. Вероятно, из бактероидсодержащей зоны в кору проходил быстрый радиальный транспорт сахарозы, на основе которой и происходил биосинтез аминокислот. Невысокая активность ГС и АС, и в то же время, более значительный уровень новообразованных аминокислот из 14С-сахарозы в коре по сравнению с бактероидсодержащей зоной, позволяет заключить, что в первой зоне азотный обмен был направлен не столько на первичное связывание аммиака, сколько на превращение уже образованных в бактероидсодержащей зоне аминокислот и амидов. Таким образом, усвоение связанного азота, образующегося при симбиотической фиксации N2, можно рассматривать как пространственно организованный процесс, осуществляемый при взаимодействии обеих тканевых зон.

Из данных рис. 5, А, Б видно, что присутствие нитрата в среде не увеличивало интенсивность поглощения сахарозы и образования аминокислот в обеих тканевых зонах. В то же время, нитрат не являлся и явным ингибитором этих процессов, поскольку уменьшения образования аминокислот с участием 14С-сахарозы не наблюдали (рис. 5, БI, И).

Рис. 5. Радиоактивность спирторастворимых соединений в тканевых зонах клубеньков после их инкубации на среде с 14С-сахарозой в присутствии нитрата (7,3 мМ) или без него

А - общий экстракт, Б - аминокислоты и амиды; -О- кора, -О- бактероидсодержащая зона на среде без нитрата (I); кора, -*■ бактероидсодержащая зона на среде с нитратом (П).

Принципиально иная картина была обнаружена при экспонировании на среде с 14С-сахарозой и нитратом (7,3 мМ) целых растений (рис. 4), после того, как они получили предварительную нитратную подкормку (14,6 мМ). Последующий анализ ,4С-метки в выделенных после инкубации из клубеньков тканевых зон показал, что присутствие нитрата в питательной среде уменьшало поступление а клубенек Сахаров и образование из них аминокислот в обеих тканевых зонах (рис. 4, А, Б). Степень подавления синтеза de novo аминокислот в тканях положительно коррелировала с уменьшением притока к ним сахарозы из , корней. Отсюда следует, что именно последнее обстоятельство явилось основной причиной снижения интенсивности

образования аминокислот. Поскольку поступление сахарозы в бактероидсодержащую зону за 24 ч ослабевало сильнее, чем в кору, а снижение биосинтеза аминокислот в последней было выражено в большей степени, следует допустить, что метаболический потенциал коры находился в прямой зависимости от интенсивности поступления источников углерода в инфицированную ткань. На основании этого можно заключить, что кора по отношению к бактероидсодержащей зоне выполняет подчиненную, вторичную функцию. Это в метаболическом отношении ее принципиально отличает от этиологически родственной коры корня, в которой протекают основные процессы ассимиляции нитратного и аммонийного азота.

3. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ 14С-ФОТОАССИМИЛЯТОВ У СОИ ПРИ УСВОЕНИИ СИМБИОТИЧЕСКИ ФИКСИРОВАННОГО И НИТРАТНОГО АЗОТА

Для изучения специфики межорганных взаимодействий в целостном растительном организме при одновременном усвоении симбиотически фиксированного и нитратного азота была проведена серия опытов, в которых одной половине цветущих растений сои за 3 суток перед и во время экспонирования их среднего листа в атмосфере с 14СОг в состав питательной среды вносили дозу нитрата 2 мМ, а для второй половины растений — 20 мМ. Нитрат оказывал интобирующее действие на азотфиксирующую активность клубеньков (табл. 7).

Таблица 7. Влияние различных доз нитрата на азотфиксирующую активность

клубеньков сои

Концентрация нитрата, мМ

Азотфиксирующая активность клубеньков

мкмоль этилена / (г сырой массы ■ ч)

%

0 2 10 20

15.7 ± 0.9 12.4 ± 1.1 6.2 ± 0.4 0.9 + 0.05

100 79 39.5 5.7

В зависимости от дозы нитрата в среде распределение радиоактивных фотоассимилятов по органам имело различный характер. Как видно из табл. 8, при концентрации нитрата в среде 2 мМ, слабо воздействовавшей на азотфиксацию в клубеньках, основной поток фотоассимилятов был направлен к вершине побега, молодым листьям и цветкам, а также в клубеньки и корни. За 24 ч экспозиции корни и клубеньки в сумме содержали больше всего радиоактивных метаболитов в растении. Корни почти в 2 раза превосходили клубеньки по уровню общей радиоактивности. Но если учесть, что масса клубеньков в 7-8 раз меньше массы корней в целом растении, то расчет радиоактивности на 1 г сырой массы показывает, что приток фотоассимилятов в клубеньки в 5 раз превосходил их поступление в корни.

Таблица 8. Распределение радиоактивности 14С-фотоассимилятов по органам после экспонирования 3-го листа растений сои в атмосфере с 14С02 в присутствии различных концентраций нитрата в питательной среде (в % от радиоактивности целого растения)

Направ пение оттока Органы Концентрация нитрата

2 мМ 20 мМ

Экспозиция

2ч 24 ч 2ч 24 ч

Вверх листья 0.30 4.84 0.46 16.20

стебель 9.10 6.12 7.68 6.63

цветки 1.14 1.69 2.08 2.93

Донорный лист 88.04 57.76 79.72 23.42

Вниз листья 0.27 0.95 0.33 1.04

стебель 0.61 13.78 9.49 15.87

цветки 0.23 2.17 0.40 3.00

клубеньки 0.07 7.24 0.14 7.86

корни 0.21 11.44 2.27 23.20

Радиоактивность

целого растения 873 ± 18 708 ± 77 3097 ±278 1043 ±25

(тыс.расп./мин)

Таким образом, анализ характера распределения метки по растении позволяет заключить, что вследствие невысокой аккумулирующей емкосп цветков преимущественное накопление 14С-фотоассимилятов происходило I азотассимилирующих органах, которые по величине акцептирующе* способности можно расположить в следующем убывающем ряду: клубеньки : корни > листья.

При концентрации нитрата в среде 20 мМ, угнетающей азотфиксацик клубеньков (табл. 7), усиливалась нитратассимилирующая функция корней у листьев. При этом происходило снижение потока фотоассимилятов е клубеньки, и увеличивался их транспорт в корни и листья. На последний фаю указывает как резко увеличившееся отношение радиоактивности 14С-фотоасси-милятов корней к их радиоактивности в клубеньках, так и возрастание радиоактивности 14С-метаболитов в верхних листьях. Следовательно, увеличение дозы нитрата в среде вызывало перестройку в распределении фотоассимилятов по растению в связи с разной интенсивностью протекающих процессов его ассимиляции в различных органах.

На основании приведенных данных можно сделать два основных вывода. Первый состоит в том, что активность ассимиляции азота в различных органах определяет векторность транспорта углеродсодержащих продуктов. Второй — в условиях разной обеспеченности нитратом растения между его органами устанавливаются сложные конкурентные взаимоотношения, от которых зависит характер донорно-акцепторных связей при распределении фотоассимилятов. При этом главный азотассимилирующий орган можно рассматривать как основную углеродаттрагирующую зону в растении.

ВЫВОДЫ

1. В работе экспериментально обосновано представление о тканевой организации азотассимилирующей функции клубеньков люпина желтого. Одним из путей регуляции усвоения аммонийного и нитратного азота в клубеньках является реализация метаболического потенциала коры и бактероидсодержащей тканевых зон в процессе их взаимодействия.

2. Коровая тканевая зона, наряду с бактероидсодержащей, участвует в процессах метаболизма аминокислот в клубеньках:

а) В изолированной из клубеньков коровой зоне выявлены глутаматдегидрогеназа, глутаминсинтетаза и аспарагинсинтетаза, активность двух последних ниже, чем в бактероидсодержащей зоне. Это говорит об ограниченном участии коровой зоны в процессах первичной ассимиляции аммиака;

б) 14С-сахароза поглощается коровой зоной с той же интенсивностью, что и бактероидсодержащей, однако биосинтез на ее основе 14С-аминокислот проходит эффективнее, чем в инфицированной зоне.

Можно заключить, что метаболическая специализация коровой зоны направлена не столько на первичные процессы ассимиляции аммонийного азота, сколько на биосинтез аминокислот на основе продуктов этой ассимиляции, образованных в бактероидсодержащей зоне;

в) Выявлена депонирующая функция коровой зоны по отношению к аминокислотам, образованным в обеих тканевых зонах целостных клубеньков, на основе 14С-сахарозы, поглощенной корнями растений.

3. Биосинтез аминокислот в коре нативного клубенька находится в прямой зависимости от особенностей метаболизма в инфицированной зоне. От того, в какой степени реализуются основные азотфиксирующая и азотассимилирующая функции внутренней зоны, зависит и дополняющая роль коры в усвоении азота.

4. В присутствии в окружающей среде нитрата нитратассимилирующая активность нативных клубеньков реализуется в ограниченной мере по ряду причин:

а) Клубеньки обладают наименьшей нитратаккумулирующей емкостью по сравнению с другими органами растения. Вследствие этого нитратредуктаза инфицированной зоны, имеющая высокую потенциальную активность, является субстратлимитированной;

б) Б'ольшая часть нитрата, поступившего в клубенек, сосредоточивается в коре. Однако невысокий уровень потенциальной нитратредуктазы этой зоны не обеспечивает в полной мере реализацию нитратвосстанавливающей активности клубенька;

г) Низкий нитратный статус клубеньков и невысокая реальная активность нитратредуктазы в обеих тканевых зонах дает основание предположить наличие структурных или метаболических барьеров, ограничивающих доступ нитрата в клубенек.

5. На уровне целостного растительного организма активность ассимиляции азота в различных органах определяет векгорность транспорта углеродсодержащих продуктов в растении. В сложной системе конкурентных взаимоотношений главный азотассимилирующий орган можно рассматривать как основную углеродаттрагирующую зону растения:

а) При симбиотическом типе азотного питания и усвоении 14СОг средним листом сои аттрагирующий по отношению к фотосинтатам потенциал азотассимилирующих органов может быть представлен следующим убывающим рядом: клубеньки > корни > верхние листья > нижние листья;

б) В случае присутствия в среде нитрата главным фактором, лимитирующим метаболический потенциал нативного клубенька, является снижение поступления в клубенёк фотоассимилятов, вследствие возрастания аттрагирующего и нитратвосстанавливающего потенциалов других органов, главным образом корней и листьев.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Chechetka S.A., Bruskova R.K., Piskorskaya V.P., Izmailov S.F. Distribution of the Carbon from <14)СОг and (14)C-Sucrose at Nitrate Nutrition or Symbiotic Nitrogen Fixation by Soybean and Yellow Lupin. II Abstr. 2nd Intern. Symp. on Stress and Inorg. Nitrog. Assimilât. Moscow, September 17-21,1996. P. 17.

2. Чечётка С.А., Никифорова T.A., Кирнос C.B., Измайлов С.Ф. Ассимиляция нитрата тканевыми зонами корневых клубеньков люпина желтого. // 3-й ежегодный симпозиум "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология". Тез. докл. Москва., 1997. С. 106.

3. Чечётка С.А., Пискорская В.П., Брускова Р.К., Троицкая Г.Н., Измайлов С.Ф. Распределение 14С-фотоассимилятов у сои при усвоении симбиотически фиксированного и нитратного азота // Физиология растений. 1998. Т. 45. Вып. 2. С. 241-247.