Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ ЭФФЕКТИВНОСТИ НА ОСНОВЕ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ БАКТЕРИЗОВАННЫХ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ ЭФФЕКТИВНОСТИ НА ОСНОВЕ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ БАКТЕРИЗОВАННЫХ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи Светлана Викторовна РОДИОНОВА

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИИ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ ЭФФЕКТИВНОСТИ НА ОСНОВЕ ФЙЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ БАКТЕРИЗОВАННЫХ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ (Специальность 03.00.07 — микробиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени ' кандидата биологических наук

МОСКВА — 1980

Работа выполнена на. кафедре микробиологии Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

Научный руководитель — доктор биологических наук профессор В. К. Шильникова.\

Официальные оппоненты: доктор биологических ' наук Е. Х.-Ремпе, кандидат биологических наук В. И, Романов. . *'

Ведущее учреждение—Всесоюзный научно-исследовательский институт бакпрепаратов. " е

■ Защита диссертации состоится « . , . » ТТ^. . . 1980 г. в" 15 час. на заседании Специализированного совета; К-120.35.06 в Московской сельскохозяйственной академии им.. К. А. Тимирязева. ; .

Адрес: 127550, г. Москва, И-550, ул. Тимирязевская, 49:

. Сектор защиты диссертаций ТСХА, " ■■

Автореферат разослан « /У, . . 1980 г.-

Ученый секретарь " Специализированного совета . кандидат биологических .нау»?'- V

доцент "',:*- V-'!'.- " ;

В. Г. Марьенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Для производства нитрагина необходимы штаммы клубеньковых бактерий высокой специфичности, вирулентности, эффективности, конкурентной способности. Поэтому вопрос о быстром и надежном методе отбора таких штаммов имеет значение в проблеме снмбнотнче-ской азотфмксацин. Уровень и интенсивность процесса сим-б нот и чес кой азотфнксации определяется во многом использованием активных штаммов, которые способствуют также и улучшению качества белков бобовых культур. Определение критериев эффективности, позволяющих отличить активные штаммы от неактивных и малоактивных как в чистой культуре, так и симбиозе имеет большое значение для отбора и селекции штаммов высокой эффективности. В связи с этим, а также учитывая, что достоверных критериев эффективности клубеньковых бактерий, несмотря на проведение большого количества исследований, до сих пор не выявлено, мы считали необходимым изучить метаболизм бобовых растений в симбиозе с клубеньковыми бактериями разной степени эффективности с тем, чтобы выявить закономерности или особенности обмена, которые могли бы быть использованы при отборе эффективных штаммов клубеньковых бактерий.

Цель н задачи исследований. Цель работы — выявление показателей влияния ризобин разной степени эффективности на метаболизм растения-хозяина. Задачи исследования — найти простые и надежные косвенные критерии в результате сравнительного изучения в растениях эффективного и неэффективного симбиоза ряда метаболитов, в частности тех, которые связаны с азотфиксирующей активностью ризобий, а нменно: 1) установить характер накопления алкалоидов растениями люпинов; 2) способность последних синтезировать лизин и триптофан; важно было также получить дополнительную информацию о зависимости биосинтеза аминокислот н алкалоидов в бактеризованных растениях люппна; 3) изучить содержание общего фосфора у растений люпинов и гороха в динамике; 4) выявить акустическим методом воз-

I Центр, научазя £;1йл::отш 1

Кося. о?д. йс!;;;::а оздьш.

!К5Д. 53. {{. Д. исавииа

можные различия по леггемоглобину в водных вытяжках разных по активности клубеньков растений люпина, кормовых бобов и гороха.

Научная новизна результатов. Впервые у растений люпинов эффективного симбиоза установлено повышение содержания алкалоидов в тканях растения-хозяина и предложено использование этого показателя для оценки эффективности рнзобнн. Выявлены зависимости между синтезом аминокислот и алкалоидов н бактеризованных растениях люпина и уровнем синтеза алкалоидов от степени эффективности штаммов ризобнй. Подтверждена гипотеза об образовании лулино-вых алкалоидов из лизина и триптофана. Показано снижение процентного содержания общего фосфора в бобовых растениях при инокуляции нх эффективными клубеньковыми бактериями по сравнению с неэффективными. Впервые, используя высокочувствительный импульсный метод переменного расстояния, в водных вытяжках клубеньков обнаружена корреляция между азотфикспрующей активностью штаммов ризобнй и акустическими параметрами — скоростью и коэффициентом поглощения ультразвука.

Практическая ценность работы. При оценке активности клубеньковых бактерий люпина рекомендуется определять алкалоиды в надземной массе в фазу цветения люпина. Явление накопления разного количества алкалоидов в растениях люпина одного сорта при заражении различными по активности штаммами клубеньковых бактерий следует учитывать при селекции безалкалоидных сортов люпина. Повышенное (в 2 раза) содержание лизина н триптофана в надземной массе растений люпина, процентное содержание общего фосфора в надземной массе бактеризованных растений и определение скорости и коэффициента поглощения ультразвука (акустических характеристик) высокочувствительным импульсным методом переменного расстояния в клубеньках бобовых растений в фазы бутонизации и цветения предлагается для предварительной оценки эффективных клубеньковых бактерий при отборе производственных штаммов в качестве косвенных критериев эффективности.

Апробация работы. Результаты работы доложены на научной конференции молодых ученых ТСХЛ (7—10 июня 1977 г.), на 2 рабочем совещании по проблеме биологической азотфик-сации, организованном Научным советом по проблеме молекулярной биологии и Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР в г. Пущино на Оке (11 —13 октября 1979 г.), а также на заседаниях кафедры микробиологии ТСХА.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи.

Объем работы. Диссертация состоит из ПО страниц машинописного текста, 15 таблиц, 2 рисунков. Список литературы содержит 210 наименований, в т. ч. 51 зарубежных авторов. Приложение включает 1о таблиц.

Объекты и методы исследовании

Растения люпина желтого сортов Быстрорастущий 4 н Академический 1, люпина узколистного сорта Немчиновскнй 846, гороха сорта Рамонский 77, кормовых бобов сорта Хсрц Френя выращивали в симбиозе с клубеньковыми бактериями разной степени эффективности. Для инокуляции использовали эффективные (эф.) и неэффективные (неэф.) штаммы клубеньковых бактерий коллекции культур ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Пушкин Ленинградской области): КЫгоЫит 1ир1т — штаммы 359а (эф.),, 363а (эф.), 306а (эф.) н 400 (неэф.), ИЬ. 1едигш поза гит— штаммы 245а (эф.), 2246 (неэф.), 96 (эф. для кормовых бобов), НЬ. теШоН — штамм 87 (эф. для люцерны, слабоэффектнвный для кормовых бобов).

Проростки инокулировали из расчета 20—30 тыс. клеток риз об ни на 1 семя; норму ннокуляшш определял» методом посева. Растения люпинов, гороха и кормовых бобов выращн-нал» в 12 вегетационных опытах (Журбнцкий, 1968) в Лаборатории искусственного климата ТСХА и на Опытной станцнн полеводства ТСХЛ в сменных полных (8 опытов) и песчаных культурах (4 опыта) на среде Кнопа. Уровень азота снижен до 0,25 нормы. Предварительно семена растений стерилизовали (Ми1шап, 1949) и проращивали в термостате. Повтор-ность опытов 10—16-кратная. Об эффективности рпзобнй в симбиозе судили по содержанию общего азота (определяли методом Кьельдаля),- а также по продуктивности растений с проведением математической обработки (Доспехов, 1972).

Алкалоиды определяли нефелометрнческим методом в модификации В. Ф. Бойко (Методика Государственного сортоиспытания сельскохозяйственных культур, 1970) в 4-кратной понторностн; лнзнн — согласно методике микробиологического определения аминокислот в кормах, тканях животных и продуктах обмена (Томмэ, Скоркпн, 1969); триптофан — по методу Ермакова с соавт. (1972); общий фосфор—методом К. Е. Гинзбург, Г. М, Щегловой (1960); леггемоглобнп — спектральным методом (Мелнк-Саркнсян с соавт,, 1975) в Институте биохимии им. А. Н. Баха АН СССР под руководством С. С. Мелик-Саркнсян. Акустические исследования в водных вытяжках, подготовленных в соответствии с методом Е. А. Федорова (1955), и в леггемоглобнновых фракциях проводили с помощью ультразвуковой импульсной установки на кафедре физики ТСХА (Белинская с соавт., 1972).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Содержание алкалоидов и аминокислот лизина и триптофана в растениях люпина, бактеризованных разными по эффективности клубеньковыми бактериями

С повышением содержания алкалоидов в люпине связано ухудшение кормовых качеств этой культуры. В связи с этим важно было установить, влияет ли инокуляция разными по эффективности клубеньковыми бактериями на синтез алкалоидных соединений и растениях люпина. Исходя из существующих представлений о возможной связи образования алкалоидов с обменом белковых веществ (в частности, с аминокислотами) н учитывая зависимость синтеза белковых веществ бобовым растением с микросимбионтами, мы стремились проследить и установить эти связи в растениях при инокуляции различными по эффективности ризобиями. В качестве объектов были взяты лизни н триптофан, которые могли служить предшественниками алкалоидов. Представления о том, что растения синтезируют их из аминокислот или продуктов их превращений основаны чаще не на прямых наблюдениях. а на сопоставлении строения отдельных аминокислот н ' алкалоидов. Указанные аминокислоты интересовали нас не только как предшественники алкалоидов, но и как возможные показатели эффективности симбиоза, поскольку азотный состав бактеризованных растений достаточно надежно коррелирует с эффективностью клубеньковых бактерий. Литературные данные по вопросу .места синтеза алкалоидов в растении противоречивы, В связи с этим при изучении особенностей метаболизма алкалоидов и аминокислот лизина и триптофана у ипокулнрованпых растений люпина было обращено внимание и на данный вопрос.

В наших опытах растения эффективного симбиоза имели более темно-зеленую окраску по сравнению с растениями неэффективного симбиоза, большую высоту, болей крупные клубеньки, значительно большую сырую и сухую надземную массу (табл. 1; данные представлены на примере люпина желтого сорта Быстрорастущий 4; водные культуры). Инокуляция эффективными штаммами способствует также раннему созреванию семян, большему их размеру, массе. Масса 1000 семян растении эффективного симбиоза люпина желтого сорта Быстрорастущий 4 была 82,9, 'неэффективного — 68,7 г. Во всех органах растений эффективного симбиоза преобладает количество общего азота на всем протяжении развития (табл. 1). Подобные различия наблюдаются н у других изученных растений. Содержание алкалоидов в надземной массе увеличивается по мере развития растений люпина 4

Влияние клубеньковых бактерии на растения люпина сорта Быстрорастущий 4 (водные культур и; среднее по 2 опытам; .Чв.Чг 1, 2)

Активный симбиоз Не актив ни П симбиоз

общий N. %/сухая масса . <*« §1 к . О? ГЗ общий М, %/сухая масса « . Я г Е Е- « гГ 2 =

надземная масса корневая система 8 3 д Я к — о [корневая масса |с»стема п « и ¡<4 5; >, я 2 и ™ л ё а з с* 2 в Я с, о

Фаза бутонизации

2,80

1.80

5,1

47,5

1.63

1,80

3,3

НСР«=0.[ г; НСРсв-8,4 см

Фаза иветення

1,73

2.14

8,2

НСРс5 = 0,8 г; НСР<в=9.9 см

0.75

1.94

8,3

83,8

Уборка

80.0

1,20

0,75

1,56 4,4

1,64 5,0

37,8

67,5

69,7

В среднем на сосуд.

(табл. 2) от фазы бутонизации к фазе полного цветения н достигает максимума в фазу созревших семян, что согласуется с результатами ряда исследователей (Годнее, Мироненко, 1953; Майсурян, Эдельштейн, 1961; Заболотный, 1974). В фазу бутонизации содержание алкалоидов в надземной массе растений разных по эффективности симбиозов виравиено. Содержание алкалоидов у растений неэффективного симбиоза в фазу цветения не меняется. Инокуляция активным штаммом значительно увеличила содержание алкалоидов в фазу полного цветения у растений в надземной массе по сравнению с растениями неэффективного симбиоза. Особенно резкая разница в содержании алкалоидов отмечена в семенах люпина. В дополнительных опытах (табл. 2), включающих варианты с инокуляцией растений люпина штаммами 363 а и 366 а рн-зобий, оказавшимися более активными, чем 359 а, накопление большего содержания алкалоидов при эффективном симбиозе (и по сравнению с бактеризацией штаммом 359 а) в интересующую нас фазу полного цветения подтвердилось на всех нсследовагшых сортах люпина и при бактеризации разными активными штаммами (табл. 2). Поскольку в практике возделывания люпина имеются случаи увеличения содержания

Содержание алкалоидов и общего азота в надземной массе и зерне растений люпина при инокуляции клубеньковыми бактериями

(в % на сухую массу)

Фазы развития

Сорт растения Штамм клубеньковых бактерий бутонизация полное цветение начало образования бобиков зерио полной спелости

алкалоиды обшнй азот алкалоиды общий азот алкалоиды общий азот алкалоиды общий азот

Люшш желтый Быстрорастущий 4 {водные культуры)

Люпин желтый Быстрорастущий 4 (песчаные культуры)

Люпнн желти Г| .Академический I (водные культуры)

Люшш узколистный Немчшювскнй 846 (водные культуры)

Среднее по 2 опытам (№№ 1, 2)

активный 359а 0,046 2,80 0.072 1,73 0,064

неактивный 400 0,048 1,63 0.048 1,26 0,040

1,26 0,99

0,215 0,181

5,78 4,82

активный 350а активный 363а неактивный 400

активный 359а активный 363а неактивный 400

(№№ 3, 4)

0.041 2,33

0,052 2,56

0,028 1,22

(М>№ 5, 6)

0,083 2,62

0,094 2.84

0,062 1,73

Среднее по 2 опытам (№.\г1 7, 8)

активный 359а 0,045 1,95

активный 363а 0,054 2,18

активный 366а 0,058 2,29

неактивный 400 0,030 1,60

ЧАСТОТНАЯ ЗАВИСИМОСТЬ ДЛЯ ВОДНЫХ ВЫТЯЖЕК КОРНЕЙ И КЛУБЕНЬКОВ ЛЮПИНА ПРИ ТЕМПЕРАТУРАХ 10, 20 И 30°С

А — А КЛУбЕНЬКИ ЛЮПИНА, БАКТЕРИЗАЦИЯ РИЗОбИЯМИ, ШТАММ 359а X — X КЛУБЕНЬКИ ЛЮПИНА, 6АКТЕРИЗАЦИЯ рИЗОбИЯМИ, штаац 40*0 О —О КОРНИ НЕИНОКУАИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ ЛЮПИНА

1.0 .

А •

•

А

*

ж - Л

' ■ X о

X а «мм

1 О г 0 ч|о 8 0 -1 60

1.3

1.6

1.9

ио.мгц

й*

«}30'

2.2

алкалоидов в 5 раз и даже больше по сравнению с первоначальным их уровнем, в связи с полученными нами данными, можно сделать предположение о причине этого явления. Большее накопление алкалоидов в растениях при эффективном симбиозе, по-видимому, следует объяснить реакцией растения-хозяина на внедрение рнзобий; Возможно, в этом проявляется защитная реакция растения на инокуляцию (см, Мн-шустнн, Шнльннкова, 1973). Не исключено также, что реакция проявляется в большей степени п случае эффективного симбиоза, когда деятельность клубеньковых бактерий более активна (М а медов, 1979). 11сли в целях получения менее алкалоидных люпинов селекционерам предлагается усиливать чрезвычайно трудоемкую работу по сбору материала люпина из разных географических пунктов, где удается обнаруживать образцы с пониженным содержанием алкалоидов, то на основании наших исследований мы можем, учитывая остро стоящую проблему вырашивання безалкалоидного люпнна, предложить селекционерам вести поиски с учетом ннокуляшш определенным штаммом активных клубеньковых бактерий.

Нами проведены также исследования, позволяющие решить, имеется ли заинспмост!, между накоплением аминокислот лизина и триптофана н тканях растения-хозяина и действием разных по активности штаммов клубеньковых бактерий на растения люпнна и существует ли связь между содержанием аминокислот с уровнем в тканях растений алкалоидов. Литературные данные по этому вопросу ограничены. К тому же в имеющихся работах определялся главным образом состав аминокислот белка разных сортов люпнна п целях установления их кормовых достоинств.

Из табл. 3 видно, что динамика синтеза лнзнна и триптофана в надземной массе уменьшается к концу вегетации, снижаясь в фазу цветения. Для лнзнна это падение в 2, для триптофана— в 3 раза. Максимальное накопление указанных аминокислот идет в зерне. Такой характер накопления лнзнна н триптофана у растении люпина согласуется с результатами работ многих исследователей (Доросннский с соавт., 1960, 1961; Гукова, 1974). В фазы бутонизации и цветения в надземной массе растений при эффективном симбиозе лизин н триптофан накапливаются в количествах, в 2 раза превышающих нх содержание в растениях при неэффективном симбиозе. В корневой системе содержание лнзнна и триптофана практически одинаково п фазу бутоннзашш в обоих случаях симбиоза. В фазу полного цветения наблюдается превышение нх содержания при эффективном симбиозе над неэффективным. К концу вегетации идет выравнивание их содержания в надземной массе и корневой системе в обоих случаях симбиоза. Из табл. 3, п как уже указывалось ранее, .можно видеть,

Динамика алкалоидов, лизина, триптофана и белка (с % на сухую массу) в бактеризованных растениях люпина желтого сорта Быстро расту ший 4 (водные культуры; среднее по 2 опытам; 1, 2)

Активный симбиоз Неактивный симбиоз

Показатели

надземная корневая надземная корневая

масса система масса система

Алкалоиды Лизин Триптофан Белок

Алкалоиды

Лизин

Триптофан

В ело к

Лизин

Триптофан

Белок

Алкалоиды Триптофан Белок

Фаза бутонизации

0,046 1,001 0,121 17,50

0,542 0,090 11,23

Фаза полного цветения

0,072 0,649 0.038 10,81

0.030 0,670 0,112 11,38

0,156 0,052 4,69

0,215 0,248 36,13

0,663 0,095 12,13

Зерно

0,048 0,518 0,064 10,19

0.048 0,320 0,020 7,88

Уборка (надземная масса)

0.159 0,048 4,69

0,181 0,200 30,12

0,588 0,0% 11,25

0,023 0,426 0,091 9,75

0,012 0,083 10,25

что в надземной массе люпина эффективного симбиоза в фазу полного цветення максимально повышается накопление алкалоидов, в это же время резко падает содержание в надземной массе лнзина н триптофана. Исходя из полученных данных и существующих в настоящее время представлений о связи образования алкалоидов в растениях люпина с лизином и триптофаном, можно утверждать об участии последних в биосинтезе алкалоидов люпина. Принимая во внимание вывод о роли лнзина и триптофана в биосинтезе алкалоидов и данные наших опытов (табл. 3), можно утверждать отсутствие какого-либо значительного участия аминокислот корневой системы в синтезе алкалоидов, что согласуется с данными А. В. Мнроненко с соавт. (1959),

Разный характер накопления алкалоидов в растениях лю-

пина одного сорта при ннокуляцнн различными по эффективности ризобиями должен учитываться при селекции безалкалоидных сортов люпина. На основании различий в содержании алкалоидов в надземной массе растений люпина при бактеризации эффективными и неэффективным клубеньковыми бактериями можно выработать рекомендации для оценки активности штаммов.

Динамика общего фосфора в бактеризованных растениях люпинов и гороха

Как известно, фосфорный обмен бобовых растений имеет специфику, связанную с их способностью фиксировать в симбиозе молекулярный азот. Литература по вопросу влияния азотного питания на фосфорный обмен бобовых растений обширна, но противоречива. Что же касается обмена фосфора у бобовых растений, инокулнрованных клубеньковыми бактериями разной степени эффективности, то встречаются лишь единичные сообщения.

Результаты исследования процентного содержания общего фосфора, изученного у разных видов сортов инокулнрованных люпинов и гороха, представлены в табл. 4. Растения анализировали также на содержание общего азота (табл. 1, 5). Наиболее высокий процент общего фосфора в надземной массе всех растений наблюдался в ранние фазы развития (начало бутонизации) в период максимального роста корневой системы (табл. 4). С возрастом он постепенно снижался. Распределение общего фосфора в наибольшей степени зависело от влияния штаммов. Растения люпинов и гороха, независимо от степени эффективности симбиоза, в фазу бутонизации энергично поглощали фосфор из среды, вместе с тем процентное содержание фосфора у растений различной эффективности симбиозов как в фазу бутонизации, так и во все последующие фазы неодинаково: наиболее им обогащены растения неэффективного симбиоза. Так, процентное содержание фосфора при неэффективном симбиозе постоянно было выше на 0,2—0,7 при эффективном симбиозе, Повышение процента общего фосфора, очевидно, связано с менее интенсивным расходом его у растений неэффективного симбиоза на процессы синтеза. Вместе с тем, если проводить расчет общего фосфора на вынос его надземной массой растения, то содержание фосфора оказывается практически равным у растений эффективного и неэффективного симбиоза. Так, у растений люпина сорта Быстрорастущий 4 (водные культуры) при активном симбиозе в фазу бутонизации вынос фосфора составляет 56, при неактивном 50 мг/сосуд Р205 на сухую надземную массу, в фазу цветения — 50 и 53 мг соответственно. У растений горо-

Таблица 4

Содержание фосфора н азота в надземной массе бактеризованных растений гороха н люпинов (вод ни с культуры; с % на сухую масу)

Культура Эффективность симбиоза Фазы развития

начало бу-тонизашш полное цветение начало образования бобиков уборка (надземная масса)

РА N PiOs N PiOj N PlOs : N

Среднее но 2 опытам (МЛ; 9, 10)

Горох активный (245а) 1,00 3,75 _ 1 - 0,80 2,48 0,70 о 27

Ра мокши! 77 неактивны ¡i (2216) 1,20 2,90 — 1 ~ 0.90 2,32 1,00 1,53

Среднее по 2 опытам (ЛУй 1, 2)

Люпин желтый активный (359а) 1,09 2,80 0.72 1,73 — — 0,69 0,75

Быстрорастущий 4 неактивный (100) 1,52 1,63 1,20 1,26 1,10 0,75

Среднее по 2 опытам (Л»Лг 5, 6)

Люпин желтый активный (359а) 1,87 2.02

Академический 1 неактивный (400) 2,59 1,73

Среднее по 2 опытам (ЛгЛг 7, 8)

Люпин узколистный активный (350а) 1,00 1,95

Нсмчинооский 846 неактивный (400) 1,20 1,66

Влияние клубеньковых бактерий на содержание общего азота и белка (в % на сухую массу) в растениях гороха сорта Рамонский 77 (водные культуры: среднее по 2 опытам; № 9, 10)

Активный симбиоз

Неактивный симбиоз

надземная масса корневая система зерно надземная масса корневая система зерно

«Е 3 а о \о ^ о л •2 * \о 3 о 15 «г 1* о я *о 5 о ю 1 5 чг си О СЧ я о || .я О ел О «ч *= * Ю О! о хо (Я 5 о ° о п ■5 * Ш § о & о «5 15 Ю т О сз '= и о о ^

Фаза бутон из а пин

3.73

2.48

23,44

15,50

3,90

3,12

24,38

2,90

18,12

3,46

Фаза начала образования бобиков

19,50

2,32 Уборка

\H.Sq

3,00

1,62

18.75

2.27

11,19

4,53

28,31

1,53

9,50

3,60

22,50

ха сорта Рамонскин 77 эффективного и неэффективного симбиоза в фазу бутонизации 42 н 43, в фазу цветения 51 и 47 мг/сосуд Р203 на сухую надземную массу соответственно. Полученные нами данные по изучению особенностей фосфорного питания бобовых растений, показывающие, что имеется определенная взаимосвязь между процентным содержанием фосфора и эффективностью симбиоза, и их сопоставление с литературным» данными позволяют утверждать, что процентное содержание фосфора в надземной массе может служить основанием для рекомендации этого показателя в. качестве критерия эффективности в фазы бутонизации н цветения.

Возможности использования акустического метода для выявления различий между активными и неактивными клубеньковым» бактериями люпина, кормовых бобов, гороха, обусловленных разным содержанием в клубеньках леггемоглобина

Результаты работ, в которых устанавливалась связь содержания леггемоглобнна с азотфпкенрующей активностью бобово-рнзобиального симбиоза, противоречивы. Известные

случаи отсутствия корреляции между содержанием леггемоглобнна в полных вытяжках клубеньков и степенью их азот-фиксацнн (Moustafa, 1908; Калмыков, Маркелова, 1969) С. С.-Мелнк-Саркнсян с соавт. (1975) связывают с существующими методами определения. Мы считали, что это замечание существенно, и при использовании более высокочувствительных методов исследования можно предполагать, что результаты будут иными. Г. Н. Троицкая с соавт. (1979) также показывают, что содержание леггемоглобнна не всегда коррелирует с высокой азотфиксирующей активностью клубеньков и в то же время может свидетельствовать об эффективности симбиоза в процессе вегетации растения.

В последнее время широкое распространение получили физические методы исследования, Важное место среди них занимают методы молекулярной акустики, дающие возможность получить информацию о кинетике быстропротекаюшнх процессов, а также о структуре жидких сред. Основные информационные параметры акустического метода — скорость распространения звука в среде и коэффициент поглощения акустической энергии (отношение коэффициента поглощения к квад-. рату частоты), измеряемые при прохождении звуковых полн через жидкую среду. В нашей работе сделана попытка применить импульсный метод переменного расстояния для установления различий между активными и неактивными снмбио-тическнми системами бобовое растение — ризобии в водных суспензиях клубеньков, где основное вещество леггемогло-бнн. Известно, что этот метод с успехом применяется для характеристики физических особенностей гемоглобина млекопитающих (Carstensen, 1960; Евдокимов, 1966). С целью получения доказательств, что именно леггемоглобин ответствен за возможные различия, исследования акустическим методом сопровождались исследованиями леггемоглобнна в клубеньках тех же растений спектральным методом.

В результате проведения анализов с клубеньками люпина желтого сорта Быстрорастущий 4 (водные культуры) выявлены значительные отличия по акустическим свойствам при инокуляции 359 а и 400 штаммами, Отличия были и по другим показателям (табл. 1). Поскольку скорость ультразвука меняется в зависимости от температуры, опыты проводили при 10, 20 и 30° С. На рис. 1 и в табл. 6 представлена зависимость скорости звука при прохождении через водный экстракт клубеньков люпина разных по эффективности симбиозов и корней неннокулн-ропапных растении от температур, при которых проводились измерения. С увеличением температуры скорость звука линейно возрастает. Закономерности в различиях сохраняются для всех вариантов при всех температурах измерений. При бак-12

Скорость ультразвука в водных вытяжках клубеньков и корней люпина желтого сорта Быстрорастущий 4 в зависимости от температур

(водные культуры)

Скорость ультразвука. и-сек-1

Варианты 10° С 20° С 30" С

Активный симбиоз...... 1460 1489 1522

Неактивный симбиоз..... 1448 1475 1502

Корни неинокулированных расте- 1408

ний ............ 1446 1472

теризацин активным штаммом (вар, 1) скорость звука при всех температурах выше, чем при бактеризации неактивным штаммом (вар. 2) и в корнях неинокулированных растений люпина (вар. 3); при этом максимальные различия наблюдаются при 30° С. Это говорит о том, что скорость ультразвука (точность метода 0,5 м/сек) может быть использована п качестве критерия эффективности ризобнй. В связи с тем, что на определение коэффициента поглощения ультразвука (отношение коэффициента поглощения к квадрату частоты), который также был использован нами как акустический параметр, влияет частота релаксационного процесса, исследования проводили в разных частотных диапазонах. На рис. 2 и табл. 7 представлены зависимости коэффициента поглощения ультразвука от частоты тех же вариантов при 10, 20, 30° С. При бак-

Таблица 7

Коэффициент поглощения ультразвука для водных вытяжек клубеньков и корней люпина желтого сорта Быстрорастущий 4 при разных частотах и температурах (водные культуры)

цЛ'ХЮ- -"см-1 сек1

Варианты Температура при при при

7 мгц 21 мгц 35 мгц 49 мгц

Активный симбиоз . . 10* С 108 53 43 41

20' С 08 37 32 31

30* С 49 27 22 22

Неактивный симбиоз . . 10*С ■ 47 41 38 38

2{У С 36 31 30 28 ■

30* С 25 21 21 19

Корни неинокулирован- 10° С 45 38 36 36

ных растений .... 20* С 35 30 28 27

30* С 22 20 20 19

теризацин люпина неэффективным штаммом и для корней неннокулнрованных растений зависимости коэффициен-

та поглощения ультразвука от частоты совпадают в пределах ошибок измерений, что свидетельствует о подобии их молекулярного состава, точнее тех компонентов, которые, главным образом, определяют, избыточное поглощение. По данным ряда авторов (СагБ^епэеп, 1960; Евдокимов, 1966) в крови избыточное поглощение определяется в основном протеинами. Поведение коэффициента поглощения ультразвука в водных вытяжках клубеньков люпина с бактеризацией активным штаммом отличается от его поведения при бактеризации неэффективным штаммом и в корнях неннокулнрован-ных растений; при этом максимальные различия наблюдаются при измерениях на пнзких частотах и при 10° С (рис, 2, табл. 7). Это указывает на налгите в клубеньках люпина при бактеризации активным штаммом некоторого компонента, который либо отсутствует в клубеньках с бактеризацией неактивным штаммом и в корнях неннокулированных растений, либо его содержание в них существенно меньше, чем в первом случае. Как следует из биохимических исследований состава веществ клубеньков бобовых растений, а также учитывая метод специальной подготовки вытяжки для анализа, таким компонентом является леггемоглобнн. Таким образом, можно было заключить, что аномальное поглощение ультразвука в клубеньках растений эффективного симбиоза, по-видимому, определяется в основном присутствием в нем леггемоглобина и что коэффициент поглощения ультразвука (отношение коэффициента поглощения к квадрату частоты; точность метода 3%) может быть использован в качестве критерия эффективности рнзобнй при измерениях его на низких частотах.

В результате проведения анализов с клубеньками кормовых бобов также выявлены отличия по акустическим свойствам при инокуляции эффективными и неэффективными штаммом» рнзобнй (табл. 8, 9). Скорость (измерения вели при 10, 20, 30° С) и коэффициент поглощения ультразвука (измерения вели при тех же температурах в интервале частот Ъ—19 мгц) в водных вытяжках клубеньков растений эффективного симбиоза выше по сравнению с растениями неэффективного симбиоза. Исследуемые растения также довольно четко отличались по акустическим свойствам леггемогло-бнновой фракции из клубеньков кормовых бобов, бактеризованных активными и малоактивными штаммами (табл. 10). Измерения скорости звука вели при 30, коэффициента поглощения при 10° С, поскольку ранее было выявлено, что в этих условиях проявляются максимальные различии. Данные по эффективности инокуляции представлены в табл. 11.

При постановке опытов для выявления корреляции содержания леггемоглобина с акустическими свойствами оказа-14.

Ю 20 " зо 40

Температурная зависимость скорости

УЛЬТРАЗВУКА в ВОДНЫХ ВЫТЯЖКАХ

вариантов 1, 2 и 5 (^21 МГЦ).

Скорость ультразвука в водных вытяжках клубеньков кормовых бобов сорта Херц Фрейя в зависимости от температур

Скорость ультразвука, м X сек -1

Варианты 10° С 20" С 30° С

Активный симбиоз...... 1442 1482 1525

Малоактивный симбиоз .... [436 1170 1507

Таблица 9

Коэффициент поглощения ультразвука для водных вытяжек клубеньков кормовых бобов сорта Херц Фрейя при разных частотах и температурах

Тем- н/с3ХЮ-|7см-1сек*

Варианты иера- при при при при

тура 7 мгц 21 мгц 35 мгц 49 мгц

Активный симбиоз . . 10е С 115 75 62 59

20'С 72 49 45 43

30° С 52 42 ЗЭ 37

Малоактивный симбиоз . 10° С 82 47 42 41

20" С 54 40 39 39

30° С 43 32 31 31

Таблица 10

Скорость (при 30® С) и коэффициент поглощения ультразвука при разных частотах (при 10° С) для леггемоглобиновых фракций клубеньков кормовых бобов сорта Херц Фрейя

а/о'Х 10 см- 1 сек2

Варианты Ш о. гг о 2 4 при 10 мгц при 14 мгц при 22 мгц ири 30 мгц при 42 мгн при 51 мгц

Активный симбиоз , . 1473 78 66 56 51 42 41

Малоактивный симбиоз , 1460 СЗ 56 47 43 38 37

лось, что содержание его в клубеньках растений люпина эффективного симбиоза было 0,34 мг в 1 г сырой массы клубеньков, в случае неэффективного симбиоза леггемоглобнн отсутствовал (табл. 12). Такие различия вполне объяснимы, так как эти штаммы (359 а и 400)—классические по четкости проявления эффекта в отношении растения-хозяина, н они вели себя аналогично во всех опытах. В клубеньках кормовых бобов в фазу конец бутонизации — начало цветения лег-

Влияние разных по активности штаммов ризобий на растения кормовых бобов Херц Фрейя (песчаные культуры; среднее по 2 опытам;

11, 12)

Показателя Конец бутонизации — начало цветения Начало образования бобиков

96-ак-тивный 87-мало-активный 96*а к-тинный 87-малоактивный

Сырая надземная масса, г/сосуд 33,4 30,1 45,6 34,1

Высота рстений, см...... 48,5 39,5 72,3 59.5

% в сухой надземной массе:

общий азот........ 2,50 1,61 1,81 1,60

общий белок ........ 15,62 10.06 11,50 10,00

НСРМ=2,0 г НСРм-3,6 г

НСРЯ=6,2 см НСРИ=8,4 СМ

Таблица 12

Содержание леггемоглоСика в клубеньках люпина и кормовых бобов в фазу конец бутонизации — начало цветения

Растение Штамм клубеньковых бактерий Содержание леггемоглобнна, мг/1 г сырой массы клубеньков

Люпин 359 а (активный) 0,34

Люпин 400 (неактивный) не установлено

Кормовые бобы 06 (активный) 1,65

Кормовые бобы 87 (малоактивный) 1,50

гемоглобин обнаруживали в клубеньках того и другого симбиозов. В опытах с растениями гороха, проводимых в осенний и зимний периоды, при бактеризации даже эффективными штаммами леггемоглобин не выявлен, В зимний период клубеньковые бактерии находятся в состоянии меньшей активности. Не было установлено различий и по результатам акустических исследований клубеньков . растений, отличающихся по эффективности симбиоза. Вместе с тем на всем протяжении развития отмечались различия по содержанию азота в надземной массе п корневой системе (табл. 5). Данные позволяют сделать вывод, что между количеством леггемогло-бнна в клубеньках и азотом в надземной части люпина, в меньшей степени кормовых бобов, существует функциональная зависимость. В этом плане мы подтвердили исследования ряда авторов. Вместе с тем сравнение полученных данных с результатами других авторов по изменению содержания лег-гемоглобина при неэффективном симбиозе в клубеньках растений показывает, что содержание леггемоглобнна не всегда

может служить признаком разной эффективности симбиозов. Во всяком случае, очевидно, для растений перекрестнозара-жающнхся групп, к каким относятся кормовые бобы, особенно горох, он менее применим, чем для таких растений, как люпин, заражающихся только ризобннмн люпина. К тому же, очевидно, не всегда леггемоглобнн может накапливаться до размеров, находящихся в пределах чувствительности биохимических методов, как, например, при проведении опытов в осенне-зимний сезон,-когда формирование симбиотнческого аппарата весьма затруднено. Приведенные результаты позволяют предположить перспективность акустического метода для предварительной оценки штамон рнзобнй наряду с определением легггемоглобнна.

Выводы

1. У растений люпина, бактеризованных высокоэффективными штаммами клубеньковых бактерий, в фазу полного цветения в надземной массе возрастает синтез алкалоидных соединений (в среднем на 0,02% к сухой массе) но сравнению с растениями неэффективного симбиоза. Явление накопления разного количества алкалоидов в растениях люпина одного сорта при заражении различными по активности штаммами клубеньковых бактерий следует учитывать при селекции безалкалоидных сортов люпина.

2. Различия в содержании алкалоидов в надземной массе растений люпина в фазу цветения при бактеризации разными по эффективности штаммами клубеньковых бактерий могут служить основанием рекомендовать определение алкалоидов для оценки штаммов клубеньковых бактерий люпина.

3. Повышенное {в 2 раза) содержание лизина и триптофана в фазу бутонизации и цветения в надземной массе люпина в случае эффективного симбиоза можег быть использовано в качестве критерия эффективности при предварительном отборе высокоэффективных штаммов клубеньковых бактерий.

4. Резкое снижение содержания лизина и триптофана в надземной массе в фазу цветения растений люпнпа, коррелирующее с максимальным накоплением алкалоидов в этот период, служит подтверждением гипотезы об образовании луппновых алкалоидов нз данных аминокислот. Подтверждено, что синтез алкалоидов происходит в зеленых, активно растущих частях растений люпина; аминокислоты корневой системы в этом отношении, очевидно, играют незначительную роль.

5. Процентное содержание общего фосфора в надземной массе растений люпина (разных видов и сортов) и гороха, начиная с фазы бутонизации, при бактеризации пеэффективиы-

2 17

ми штаммами клубеньковых бактерий, выше (на 0,2—0,4% к сухой массе), чем при бактеризации эффективными штаммами. На основании установленного факта в качестве косвенного критерия эффективности штаммов рнзобнй предлагается использовать анализ процентного содержания общего фосфо- . ра в надземной массе бактеризованных растении в фазы бутонизации и цветения.

6. Подтверждена прямая зависимость между содержанием леггемоглобина в клубеньках кормовых бобов, особенно люпина, и содержанием азота в их надземной части. Вместе с тем показано, что содержание леггемоглобина в клубеньках .растений, в частности перекрестнозаражающнхся групп — гороха, кормовых бобов, не всегда коррелирует со степенью влияния ризобий.

7. В водных вытяжках и леггемоглобиновых фракциях клубеньков люпина и кормовых бобов, инокулированных высокоэффективными клубеньковыми бактериями, в фазу бутонизации— начало цветения скорость и коэффициент поглощения ультразвука (отношенне коэффициента поглощения к квадрату частоты) всегда выше. Рекомендуемая температура измерения для скорости ультразвука 30° С. Режим измерения коэффициента поглощения — температура 10°С, низкие частоты 7—Ю мгц. Установлено, что причиной аномального погло-. щения ультразвука в клубеньках растений, инокулированных эффективными штаммами, является содержание леггемоглобина. Определение указанных акустических характеристик высокочувствительным импульсным методом переменного "расстояния в клубеньках бобовых растений в фазу бутонизации— цветения впервые предлагается для предварительной оценки эффективных клубеньковых бактерий при отборе про-нзводствеиноншнных штаммов.

Список статей, опубликованных по теме диссертации

1. Белинская Л. Г., Шнльников Л. К., Родионова С. В., Шильникова В. К. Акустический метод выявления различий между активными и неактивными клубеньковыми бактериями люпина. Известия ТСХА, 1975, № 2, 193—197.

2. Родионова С. В., Шильникова В. К. Влияние клубеньковых бактерий разной степени эффективности на биосинтез алкалоидов у люпина. Известия ТСХА, 1979, Ка 1, 17—21.

Л 51598 29/11—80 г. Объем 1'Л п, л. Заказ 353. Тираж 100

Типография Московской с.-х. академии нч. К. А. Тимирязева 127550, .Москва И-550, Тимирязевская ул., 44