Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ АЗОТФИКСИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ КЛУБЕНЬКОВ ЛЮПИНА В СВЯЗИ С ДИНАМИКОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ ПРОЦЕССА АЗОТФИКСАЦИИ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ АЗОТФИКСИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ КЛУБЕНЬКОВ ЛЮПИНА В СВЯЗИ С ДИНАМИКОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ ПРОЦЕССА АЗОТФИКСАЦИИ"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ни. А. Н. БАХА

£ 5л*>авах рукописи

ШАПОШНИКОВ Григорий Леонидовкч

АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ АЗОТФИКСИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ КЛУБЕНЬКОВ ЛЮПИНА 8 СВЯЗИ С ДИНАМИКОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ ПРОЦЕССА

АЗОТФИКСАЦИИ

(Биологическая химия — 03.00.04)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва —

1 977

Работа выполнена в лаборатории энзимологии ордена Ленина Института биохимии имени А. Н, Баха АН СССР.

Научные руководители — члеи-к9рреспондент АН СССР, профессор В. Л, Кретович и доктор биологических наук 3. Г. Евстигнеева.

Официальные оппоненты:

Профессор, доктор биологических наук

А. Б. ВАКАР

Кандидат биологических наук

Т. А. КАЛИНИНСКАЯ

На официальный отзыв работа направлена на кафедру микробиологии Московского Государственного университета имени М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан _^ _^977- г>

Защита состоится ., «__• 197Б г. на

заседании Специализированного СЪвета (Д.002.96.01) по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте биохимии им. А. Н. Бпха АН СССР (И7071, Москва, В-71, Ленинский проспект, 33, корп. 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологич*-.кого отделения АН СССР (Москва, Ленинский проспект, 33).

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат биологических наук

И. И. Дьячков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ .

Актуальность .проблемы. Первичяш источником белка на вашей планете являются растительные организмы с их способностью синтезировать белок из углекислоты, воды и не органических ес: точнгаов азота. В связи о этим возрастает интерес к проблеме -биологической фиксации азота. Исследование механизма азотфик-сапии и« в особенности, изучение нитрогеназы (К.Ф.1.7.9Э.2.), фермента, катализирушего реакцию восстановления молекулярного азота, может позволить резко увеличить приток фиксированного азота из воздуха, а следовательно, и повысить продуктивность сельскохозяйственны! культур. В связи с тем, что синби-отхческие аэотфиксаторы вносят наиболее значительный вклад в связывание атмосферного азота, особый интерес представляет ^ исследование нитрогеназы я других белковых компонентов, вхо-

дящих в сиыбиотическуп азотфиксируюцую систему бобовых растений - клубенек. Весьма важным является исследование состава свободах аминокислот бактероидов и пито золя растительной част клубеньков, тая как первый стабильней продукт фиксации молекулярного азота-аммиак, ассимилируясь, превращается в даинокяслоты, из которых синтезируется белок и которые могут играть роль аллостерических эффекторов нитрогеназы.

Рель к задачи исследования, Изучение нитрогеназы, лего-гдобииа ж целоЗ симбиотической системы - клубенька, прежде всего предполагает получение очищенных препаратов фермента & белковых компонентов клубеньков люпина, образовавшихся при эффективной и не эффективном симбиозе, а такке изучение связи I иеиду интенсивностью процесса азотфиксапии и содержанием сво-

бодных аминокислот. Поэтому, первой задачей нашей работы была . разработка методов выделения и очистки белковых коьшонентов и анаэробной техники измерения уровня азотфикеащга. В задачи работы входило исследование содержания свободных аминокислот и аммиака в клубеньках лшина в течение суток, аминокислотного состава белковых компонентов клубеньков лшина, .а также изменения содержания белка и свободных аминокислот в бактероидах . БМгоЫш 1ор1п1 в вегетационном цикле развития люпина.

Кроме того был проведен подбор условий для шшобилизашш бак-

'ИД. М. а. Д. У«^,-«

тероидов с целы) создания долго живуще а модельной азотфиксирую-щай системы, которая может быть использована для изучения этого процесса, поскольку фермент нитрогеназа необычайно лабилен.

Научная новизна работы. Установлено наличие суточного ритма в изменении интенсивности азотфиксацаи и содержания свободных gmhíiokzcjiot в бактериальной и растительной части к лу~-Сенька люпина. Показано, что резервной формой азота в цитозо-ле растительной частя кдубенька в период интенсивной азотфик-сации является ^-аыиноыасдяная кислота. Установлена корреляция мезду. интенсивность»,процесса-азотфиксацаи в клубеньках с фазой развития растения - хозяина. Изучен шинояислотяыЭ состав lio-ре и ге компонентов штрогевазн. Определена изоэлек-трлческая точка гомогенного Мо-тв компонента нитрогеназн из бактероидов Eh.leptnl . и его в -концевая аминокислота. Изучен аминокислотный состав стдату рних компонентов легоглобзна. Подобраны условия и впервые осуществлена ишобилиэация бактероидов йь. luplnl путем вшшче ния их в подиадрялзмщтнй гель. Разработаны я модифицированы некоторые методы и приспособления, использованные в работе.

Практическая nensoyr^i.t>a6oytj..Сведения о корреляция между интенсивносты» азотфиксашга в клубеньках люпинаи фазой развития растения - хозяина, о влиянии погодных условна на процесс азотфпксация, о суточной динамике интенсивности азот-фиксадаи и содержания свободных аминокислот могут икать большое значение дія интенсификаопг процеоса азотфиксации в при- -родных условиях.■Значительный потерев представлявт иммобилизация целых бактероидов, с целью получения долго живущей азот-фиксирушей системы и создания модельных систем для изучения фиксации молекулярного азота, имея в виду ре гуляют этого процесса различении метаболитами, а такие изменение параметров средн. Разработанные и нодкфицврованше нами ыетрдк (герметичный блок, контроль за уровнем C¡2 в газовых средах, количественное определение состава свободных аминокислот и др.) нашли црименение в лабораторной практике.

Ачгрлґіагрія работа. Основные положения диссертационной работы докладывались на 3 и 4 Всесоюзных Баховских коллоквиумах по биохимия азотфагсшия (Москва, 1970,1971гг), на конференции

молоды! ученых Института- биохимии им.А.Н.Баха АН СССР (1974)* 3 Всеооизяоы биохимическом съезде (Рига,1974), 9 Кеждународ-ном ботаническом конгрессе (Ленинград,1975), на 5 Всесоюзном Баховсхса) коллоквиуме по биохимии азотфиксагош (Канев,1Э76). В конкурсе ва лучшую работу Института биохимии им,А.Н.Баха АН СССР в 1974 г. (работе присуждена вторая прения).

Цубликдсрид. По полученным результатш работы опубликовано : 14 печатяьд работ.

Структура и объем тгтлпяггтяцид. Диссертация состоит es введения, S глав в выводов. Работа содержит/^í страниц маши— яописного текста, Z5 рисунков, «У exeu, i? таблиц. Библиография включаетУ наименования, в тем числе иностранных работ.

МАТЕРИМЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования являлись клубеныш люпина ( mplutia lutacs i. ), сорт "Быстрорастущий* (внокулпрованного эффективным 359а и неэффективным 400 штаммами вь. lttpinl , полученными из ШИИ c/i микробиологии. Растения вырагогаали в поле на песчаной почве. В опытах, где проводилось сравнение эффективных и неэффективных клубеньков, растения выращивали в вегетационных дптпгят В сосудах со стеряльнш кварцевым песком с добавлением смеси Прянишникова, с уменьшенной в 30 раз стартовой дозой азота.

Г^шетгротД rtjrn* тгдя проведения опытов,„в анаэробных условиях. Дли проведения опытов по изучению фиксации атмоофер-иого азота целыми клубеньками, бактероидами, а также при определения активности витрогеназы нами была разработана конструкция герметичного блока. Блок, представленный на pzc.I, позволяет одновременно проводить 24 варианта опыта. В качестве реакционных сосудов использовали флаконы объемом II мл.

Эвакуация воздуха из сосудов, промывание инертным газом к последующее .введение компонентов опытной смеси осуществляется через прокладку из вакуумной резины, при помощи киьекдаов-' но го шприца* Блок после заполнения сосудов закрепляется на стержне лабораторное мешалки к вращается в горизонтальном положении со скоростью 250 об/шн.

Чертеж гедаетгчкого блока Аля проведения опытов в анаэробны! условиях

РаоЛ

.. !

Метод определения Од в газовых смесях. В связи о ингаби-рухшшм действием Og на процесс фиксации ваш был валахах цетод определения кислорода в газовых смесях, используемых в опытах. Определение содержания Og в ацетилене а аргоне проводили на колонка из нержавешей стали 4 х 2000 мм, заполненной молекулярным ситом 5А, 60-80 ыеш. Температура обогрева колонки 40°С. В качестве газа-носителя использовали аргон со скоростью протекания через колонку 50 мл/час.

^атиленоуцдЦ м^'рэд определения азотДдксяртшей актдвно^уи. Для количественного определения азотфиксирушей активности дае тиле новым методом этилен и ацетилен определяли на газокид-костном хроматографе Хром-тЗ! о пламенно-ионизациокным детектором. Колонку 3x2000 заполняла Соралаком п , 100-120 ыеш. Температура обогрева колонки 90°С. Давление газа носителя на входе составляло 1,5 аты. Бремя удерживания ацетилена 2,2 кин, этилена 1,6 мин..

Определение азотФиксирттоей активности клубеньков. Навеску клубеньков, отделенных от растения с часты) корея, помещали в сосуда герметичного блока. После герметизации сосуд» про-иывали аргоном и заполняли газовой смесью, состоявши из 10 % ацетилена,' 20? кислорода и 70% аргона. Инкубацию проводили в течение 20 минут ери 28°С при непрерывном вращении блоха. Реакцию останавливали, ввоон I мл 30£ раствора TU. За единицу активности принимали количество вавомолей образовавшегося этилена в минуту на I г сырого веса клубеньков. Измерения проведали в ІО-кратной повторносте.

Определение азотбяясиртоцей .активности бактероидов. Бактероида, отмытве от лвгоглобива, суспендировали в трпс-НС1 буфере pH 7,2, содержащем сукцииат натрия (100 мкмалей на мл), s качестве питательного субстрата ж ионы магния (I ыкмодь IteCIg ■ ЄЕ^О/іиг. Суспензии бактероидов, из расчета I мл в пробе, содержащей 90кг бактероидов, помещали в сосуда герметичного блока. После герметизации и промывка аргоном сосуд» заполняли газовой смесью, содержащей IQÍ ацетилена, 0, кислорода в 84$ аргона. Инкубацию проводили 20 минут при 28°С. Реакция останавливали введением I мл 30% раствора ТІУ. Объем измеряв-ной проби I мл. За единицу активности принимали количество ианоыолей образовавшегося этилена в минуту на I.г сирого веса бактероидов. Определение азотфиксирукцей активности проводили в 5-7-кратной повторяоети.

Получение нитрогеназы и определение ее азотФиксиртадей активности. Активность нитрогеназы в беекдеточных экстрактах бактероидов, полученных согласно схеме I.""определяли ацетиленовым метолом, для чего их помещали в ге{иетичные сосуды, которые предварительно деаэрировали, как было ошеаво ранее. Опытную к газовую смеси вносили шприцем. Опытная смесь объемом I ил состояла из следушкх компонентов: трис-HCI буфер рВ 7,2 - 100 мкмолей, u gC^.eHgO - 5 мкмолей, аденозинтри-фосфат На соль - 10 шшолей, креатинфосфат Na соль - 35 мкмо-лейі к ре атифо сфокип аза - 2 иг, дитионпт ( jra^ s2 0¿) - 20 ккмолей, феріентгай препарат - 3-7 мг белка. Проводила предвв-кубадаю, дія чего в сосуд вводили ингредиенты опытной смеси за исключением ферментного препарата и ацетилена и прогревали

5 шн, при 28°С. Реакцию начинала, вводя шприцем ферментнкї препарат. Инкубацию проводили в герметичном блоке opa 26°С. Объем исследуемой газовой сыесп I мл, За единицу активности принимали количество нааомолей образовавшегося этилена за минуту, Измерения проводили в 5-кратной повтораоети..

Определение амзнокдслотноуо со става бд л?;ов. растительной я бактапоидной фракций клубеньков люпина. Количественное оп -ределеаиа содержания аминокислот проводили на автоматическом аминокислотном анализаторе Хитачи КДА - 3 (Япония) в. Ш-І200В (ЧССР), Гидролиз белков проводили в эапаяных ампулах, в отсутствия кислорода в 5,7н ВСІ, соотношение белок-кислота 1:10000, Разделение компонентов основного характера проводили на смоле . Атіпвж 15 З(США) с помощью цитрат-натриевого буфера рН 5,28. Кислве и нейтральные аминокислота разделяли на колонке высотой 56 см, наполненной ионообменной смолой . ostión ICES 0802, с помощью трех цитрат-натриевых буферов. Первый — 0,2 н раствор с рН 3,25; второй - 0,2нрасгвор о рН 3,25; третий - 0,35в буфер хй 5,38. Температура обогрева колонок 55°С, Скорость протекания буферов у анализатора ІШ.-3 60 tu/чае, У HA-I200B 30 мд/час.

Определение состава свободна аминокислот бактетаалъно^ и растительной фракций клтбед&ков лгаргад. Анализ свободны! аминокислот проводили на автоматической аминокислотном анализаторе Хитачи КЯА-3 по методу Бенеона < вепвоп et al,,1967), который бил модифицирован нами применительно к вашим условиям к аппаратуре. Основные аминокислоты разделяли на колонке 0,9x21 см, заполненной ионообменной смолой ostión хсхз -№03, с помощью цатрат-натриевого буфера рЯ 4,26 при температуре обогрева колонки 31°С до.окончания записи гистидина, где температура переключалась на 54°С. Разделение кислых и нейтральных аминокислот осуществлялось на колонке 0,9x60 cu, наполненной ионообменником 2615 (Хитачи, Япония) ели oetion щез 0803 (ЧССР). Анализ начинали цитрат-литиевым 0,3 а буфером с jH 2,82. После выхода на хроматограмые пиха алашна проводили алицию цитрат—литиевым 0,3я буфером с рН 4,12. Температура обогрева колонки 37°С, Скорость протекания буфера 60 мд/час, нижтидріна 30 мл/чао. Образш для определения в li-ooun

растворяли в цитрамитиевом буфере рй 2,2. В буфера добавляли тиодигллколь, имеющий как аятиокаслительяое, тая в хроыатогра-фическое действие. Без тщдшглижода задергивается элиция глу-ташшовой кислоты и пролит, а глишш, аланин, ^-амино-н-мао-дявая кислота влшрукггся раньше.

Йрлрнгдянд бескдеточного экстракта из бактероидов и трипове нто:р нитроге^дзц. Процесс получения препаратов нгтрогена-зы на всех этапах проводиш в токе инертного газа, пропуская, его через все пспйльзуекые объема и буферные раствори. Бактероиды разрушали а прессе Хьюза-Итона (Любимов, Львов,1963}» центрифутировали при 22000 об/мин в течение 20 минут. Надоеа-дочную жидкость использовали в качестве ферментного препарата нктрогеназы после прогревания при 56°С в течение 5 мгнут. Сле— душим этапом было анаэробное Фракционирование на. колонке о ДЭАЭ -целлюлозой (ДБ-52 фирлн "Міа-Ьюп* , Англия). Для регистрации белковых фракций применяли денситометр Увикорд-2 фнрьш ЛКБ (Швеция). Белковые фракции после проточной кюветы собирали с помощью описанного выше герметичного блока.

Определение я зо электрической ТОЧКИ Мо-Тд компонента натрогеназы. Проводила на аналитической колонке ЛКБ 8100 (Швеция), объемом 110 ыл, в диапазоне рИ с использованием ем- . фолииов фирлн ЖБ 1809-116. Определение проводили в линейной градиенте плотности сахарозы (0-40?). Условия фокусировки: температура колонки 4°С, напряжение 960 вольт, продолжительность 56 часов. Анодный раствор 1% раствор НдР04, катодный раствор - 1$ раствор Н аШ.анод в нижней части колонки. Для предотвращения преципитации беяка-использовали концентрации амфолинов 2,55». В колонгу вносили II иг іиофпльво высученного белкового препарата. Объем собираемых фракций 1,5 мл. Регистрация белковых зон веди при 276 ни на денситометре Увикорд-2 ЖЕ (Швеция). Оптическую плотность индивидуальных фракций ол- ' ределяли на спектрофотометре СФ-4А щи 280 нм, а значення рй-с помощью поте'вдиоыетра прН-262". ■ .

ОЧ^едрлаше и -цощевоВ Мо-?в компоненту

нктрогеназы проводили во методу Грея ( сгеу алй Нат*1еу , 1963), Дансилпроивводные аминокислот идентифицировали о по-мощьв двухмерной хроматографии по Беленькому (Беленький с

C08BT.,1967).

Диск-электроФорвз (Маттер.1971) и электрофорез с дода- . шлсульЬато» н а( тгвЪвг and Oeborn ,196 э ) использовали для аналитического исследования Ио-ї е компонента.

Разработка условий для годдобядз^г^ А?ктероияов rh. iti&ioi . Для иммобилизации бактероидов юпользовалв систему, состоящую кз акриламииа в сшивающего агента Я,н* -метилен басакридамида в соотношении 62:18. . Катализаторами-служили н,н,н}Я'- твтрамвтилэтилвндиаиан (Теивд) я персульфат симония. К водному раствору ЫЕЛ и еярилашда доОавляли суспензию бактероидов. К подученной cueca добавляли указанные коталнзатогы. Полимеризацию провожали при 24-26°С в течение 2-5 ш. Полученный Опок геля механически фрагаеитировалн продавливанием . через сито и промывали декантацией до удалении невключивтится клеток. Общая продолжительность получения гранул с имюбвлизо-ванными бактероидами составляла примерно 30 мин. Все операции по получению бактероидов н ах иммобилизации в полаакриламадиом геле проводили под током аргоном или в специальной камере в атмосфере аргона. : ■

геалЕШты исшвдсшний

Азотфиксищшай аппарат клубеньков бобовых растений представляет собой комплекс тканеЗ корня растения-хоашша к микроорганизма - бактероидаой формы RMiobitm luplnl.

Нами проведено исследование аминокислотного состава структурных и функциональных.белков эффективных и неэффективных клубеньков люпина в эффективных клубеньков оон. Для этого были получены отдельные белковые фракции (схема I). Фракция "нитро-генаэа" характеризуется высоким содержанием глутакиновей и аспарагиновоЗ кислот, аланина, глицина и лейцина. Фракция белков растительной часта клубенька, содержащая легоглобан, резко отличается по аминоксилотнону составу от других белков аз эффективных и неэффективных клубеньков сои. Она обладает бо -лее высокш содеряанием лизина. Кроме того, обнаружены значительные различия в аминокислотном составе легогдобановоЗ фракции эффективных и неэффективных клубеньков люпина, заключающиеся в том, что неэффективные клубеньки содержат больше

- 10а -

Фракпионгтованиэ клубеньков люпина сои^адя опретгдлддия аминокислотного состава

Растирание клубеньков я|и замораживании .

Экстракция фосфатным буфером 0,Ш рй 7,4

Отжатиезй^^аейлон 100 неш

Осадок отбросит^ ШнтрифуЗЪроввнне щш 5000хв 10 мин

Бактероида Растительная часть

Промывание 0.1М фоофат- Центрифугирование щи 22000 х в вым буфером рН?,4 25 минут

Суслендирование в 0,1М &-фракций*^^ фосфатной буфере рН 7,4 . субклеточных | мембран

Разруше иие^преосе

Центрифугирование при : 144000хв 30 минут

'ас творимая фракция-4

.1

ЙСвЛНВбНИв

ян4) 2ЭО 4

а) 0-5в(% (ш4) 2304

2-фрайция.. прогревание мембран ■ центшйггата бактероидов при 50^0 5 иш

фракционирование на ДЭ&Э-целдюлозе -

Ио-19-кшпонвят гв-кошюнент иэовле]трофокусировавие /

ШЯН0КИСЛ0Т1 аааляэ

б) 84-ЮдаЛ1Я4) 2 ео4

в) 58-84^ (Ш4) 2 304

1

Колонка с биогелем Р-30

легоглобив

Фракционирование на ДЭАЭ-целлюло зе

компонент ^кЬшкшент

шиаок&слотвнЗ . анализ

треонина, серина, пролиза, глшяна, лейцина я тирозина» Coi4-ласно данным, полученный для легоглобива лшияа (Медяк-Сараи-ояа в др. ,1969), Сои ( EUiolb .1960) а бобов ( Broughton, Bllwortb ,1971), этот гемопротеад состоит из двух основних компонентов, разделяемых как эле ктрсфоретическиш, так а хро-матографиче скици ыетодгши. Функциональные свойства легоглобива могут быть связаны кав со структурой« так в о. взаимодействием "его компонентов.. . .".' В таблице I приведены данные по аминокислотному составу -двух основных компонентов легоглобина-І я легоглобина-П, полу, чанных ори хроматографии ва ДЭАЭ-цедлвдозе, яегоглобина, ва-деленного из клубеньков лвпива.

При этой полно видеть, что аминокислотные состава обоих, белков очень близки. Различия были обнаружена в суммарном содержании треонина и серина, а таяжв в оодержании глипина ж. алавина. Однако в составе легоглойина-2 было обнаружено более высокое содержание глутдаиновой кислота, что, оо-виднмоыу. . придает этому балку более кислые свойства, обуслашшващне поведение іэтого компонента .при хроматографии (Медик-Саркисян н др., 1969). ■■■■

. .. . Для легоглобива люпина так же, как и для легоглобина сон (Пейве и др.,1967) характерно полное отсутствие серусокержа-. дох аминокислот, небольшое содержание гимвдгаа и относительно высокое содержание гидрофобных амивокиолот, таких, как . аланан в валин.

Кая видно вз схемы I, конечным этапом исследования белков бактероидов явилось выделение нитрогеназы. Запооледшегодн был получен ряд данных о физико-химичеоких свойствах высокоо-чвщенных препаратов нитрогеназы из A.irin»Xan&ll ( кіеіввг ud Cton .1974)pneumonía® ( Ваву *t al» ,1972), СІ, рмісвгіашш ( Т»о ,1974) И бактероидов сои ( Itcr»»l *t al. ,

" Uokho говорить о сходстве отроения втих белков, выделенных из разных источников, В связи о этим большой интерес пред' ставллет исследование аминокислотном состава компонентов нитрогеназы, выделенной из клубеньков люпина и подвергнутой затем-хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. '

- И^а -

Таблица I 1

Аминокислотный состав компонентов л его глобина лшина желтого

Аминокислоты i Количество ос; татков в г : в 100 г белка Количество остатков 2 молекуле

I ЬЬ -I 1 :ьъ-Л ' ЬЪ -I : ЬЪ-Л • *

Три 3,67 3,26 3(3,43) 3(3,04)

Лиз 10,07 10,36 14(13,68) 14(14,06)

Гис 2,75 2,99 3(3,11) 3(4,06)

Арг 0,83 0,69 1(0,85) 1(1,00)

Асп 9,09 9,58 13(13,25) 13(13,40)

Тре 4,02 4,73 8(8,14) 8(8,32)

Сер 4,93 3,87 9(8,75) 9(9,01)

Глу 9,58 11,28 14(14,53) 17(17,20)

Про 2,49 2,51 4(4,48) 5(4,92)

Гли 3,18 2*33 10(9,76) 8(7,57)

Ала. 9,31 8,96 22(21,8) 20(20,31)

Цио 0 0 0 0 •

Вал. 7,64 7,69 13(13,42) 14(13,80)

Иат 0 0 0- 0

Идей 3,36 4,05 6(6,23) 6(5,94)

Лей 8,54 8,56 12(12,01) 13(12,37)

Тир 1,75 1,93 2(1,87) 3(2,76)

Фен 4,47 3,84 6(5,67) 6(6,03)

Сумма 100,21 101,97 140 142

Вычисленный ью-лекулярннй вес * 14888 15258

Хайлвда.г

Аминокислотные состав компонентов нитрогеназн после разделения га колонка с ЛЭАЭ - аелдалозой,

Аыйно-' ш- • іїе-коа- ;Дісшо-:Мо-їе ком-^Те-кои-

кислота : Ц<?вет_-понент иоиецт_ipoHegr

¡количество остатков : ¡количество остатков __■;____:_в_Г_аа 100. j белка _ ± _а__:в £ на_100_г_б$Л£а_

Три 2(1,96) 0,00 Гли . 5(4,84) 5(4,89)

Лаз 10(9,73) 9(9,04) Аха 8(7,51) 7(6,86)

Гио 2(2,25) 3(3,18) Вал 6(6,23) 7(6,89)

АрГ 8(7,96) 7(6,56) Кет. 2(2,24) 3(2,97)

Асп " 9(9,37) . 9(8,95) Илей 6(5,66) 5(4,89)

Тре 5(4,49) 4(3,98) Лев 6(5,вб) 8(7,77)

Сер 5(4,85) 4(3,79) Тир 2(2,37) 5(4,69)

Глу 14(13,46) 12(11,88) Фен 5(4,92) 7(7,22)

Про 4(3,78) 3(3,49) Цяс,к-та 2(2,35) 2(1,89)

суша 99,63 98,94

При рассмотрении результатов шиногаслотного анализа,, представленных в таблице 2, обращает на себя внимание высокое содержание в молибдсферредокеиве лизина, арпшина, треонина, серсна и низкое содержание тирозина и фенил адалина. В свое очередь, азоферредоксин отличается более высоки» содержанием . именно тирозина в фенидаланина, а такие гидрофобных: амянокио-лот - лейщва и вадина, Оба компонента нитрогеаазы отличает высокий уровень содержания деяарбоноввх аминокислот - гдутамн-вовой и аспарагановой кислот и алакина.

Для полученного после хроматографии на ДЭАЭ-деллюлозе ыо-лабдоферрадоксина была определена изозлектрическая точка. Определение проводили в аналитической колонке для изозлектрофо-кусироваяая белков ЛКЕ 8100 ь градиенте сахароза с использованием аы$олянов в диапазоне pH 4-6. Из результатов фокусировки, представленных на рнс.2 ■ , видно, что било получено два белковых компонента с pl 4,47 и 4,92 соответственно* По реакции с джшрадилоы ( Ватэау ,1953) было определено со-.

Рис.2

ПРОФИЛЬ ЭЛШРОВАНЙЯ кошю-НШОВ КОЖШФЕРРЕДОШША ШТРОГЕНАЗЫ ДОСЛЕЭЛЕКГРО-Ф0К7СИР0ВМИЯ В ЗОНЕ рН 4-6

,_поглощение при 280 ки,

--- градиент Ш

держание нвгеыкнового юлеза в обоих компонентах. Содержащий негекивовое железо Ыо-*е-белон имеет р! 4,92. Второй полученный компонент, не содержащий негеминового железа, нухно рассматривать какбалластннй белок. .

3 полученном методомизоалектрофокусярования Ыо-к-белке были олределены Н-концевне аминокислоты. Результаты хроматографии дадсилышх производных аминокислот, представленные ва рас.З, доказывает, что я -концевой шяиопиолотой Ыо-»-компонента является глутаминоваякислота.

Полученный этим хе методом Мо-в-компонант быд подвергнут ТвЕХе электрофоре8у Р тцгдягирт1гяр<1>цш|М т«»*^ в результате чего била получена одна полоса(гио.4).

На основании нзоэлект!шческого фокусирования а алзктрофо-реэа в полиакрилямидном геле мохно заключить, что мы получили гомогенный препарат Ио-Ге-белка. Прв электрофорезе с додегил-сульфетсм ватрш, получена также одна полоса, (рве,4). Нохно сделать вывод, что полученный наш Ыо-ЗД-белок состоят, из одинаковых субьеданиц, о чем говорит так не и анализ Н-кон-певых аминокислот Ыо-Уе-белка, показавший присутствие только одной I -концевой аминокислоты - глутаияновой кислоты.

см«сь 2

сикь I

г:

Рио.3 ■

двумерная хршатогрмия продуктов полного кислотного шроуша дшжирогшного тшщошшжаш яитро-

ГЕШЗЫ НА ПЛАСТИНКАХ 6x6 см, С ЗАКЕ0ШННШ СЛОЕМ СШШКШШ

Смесь I - ацвтон:язопропанод:аы1пшя (6:7:0,5)

сывсь 2 - хлороформгбвнзиловыЗ сотрт:&тилацетат:иетанол

(6:4:5:0,2) смесь 3 - адетоя:азопроданод:шмиш (9:7:2) смесь 4 - хлороформ: бензоловый спирт:мэтаяол:уксусная кислота (5:4:1:1)

Вю.4

ЭЛОТРОИРЕГРАША Мо-ИЧ-КОМ-ПОНЕНТА НИТРОПЕНАЗЫ ПОСЛЕ ИЗОЭЛЕШИЧЕСКОГО ФОКУСИРОВАНИЯ

I - с додацалвульфатоы натрия П - без додещлсуль$гг а

. Содеркавие аминокислот в Мо-їе-компоненте штрогеназн из различии: объектов (в % от суммы аминокислот)

Амияо- Бактероиды Аыино- Бактероида

Кис- Rh.Jaao- Bh.lnn Kl. КИС- Rh.Je.po- KL.

лота пісш^ рЫ^о- ш піошД рілі2 pnemonlee'

Три 1,6 .:" ІД ■ - Про 4,8 4,6 4,6

Лиз 6.5 7,3 : 5,г . Гли 9,2 . 9,0 ?»7

Гис 2,8 2,9 2,4 Ала 8,7 10,3 8,0

Арг 5,0 6,2 5,1 Вал 6,8 7,2 6,3

фс.я-та 1,2 0,9 1.9 Нет 2.Í , 2,0 3,8

Асп 9,8 9,8. 10,6 Илей 6,0 4,8 5,0

Тре 4,8 4,9 5,2 Лей .■■' 7,3 6,1 9,2

Сер 5,9 6,4 5,5 Тир . 3,5 1.3 3,4

Глу 9,6 Н.6 10,4 Феи 4,6 4,2 4,8

^ersel al.,1974 , 2 Собственные данные ^ady ana £oetgate,I9T4.

В таблице 3 представлены данные по аминокислотному соо-таву гомогенного Wo-ї е-кошоневта нитрогеиазы. из бактероидов Eb.Xaplnl . При сравнении его с даязши. долученныш да« нитрогеназа из бактероидов Eh, j apealo™ , обретает внимание более высокое содержание кислых аминокислот, что, возможно, и определяет к более низкое значение изоэлектрнческой точка гош нитрогеназы из бактероидов вь. lupmi.

Проведя исследование аминокислотного состава компонентов азотфкксирутеей системы клубенька - бактероидов (нитрогеназа) , л растительной части (легоглобин). мы поставили - своей цель» исследовать связь динамики интенсивности процесса азотфиксации с изменением состава и количества свободных аминокислот в бактероидах и оттозоле растительной фракции клубенька. Исследования бали проведены в течение суток и в ходе вегетации

Оггытнне образца отбирали с растений, находщихся в фазе бутонизации, т.е. в период, когда процесс .фиксации молекуляр-ыого азота происходит наиболее интенсивно. Отбор проб производился в течение суток о 6-часовым интервалом.

Как видно из рис.5, активность процесса азотфгксапш, определяемая ацетиленовом методом, изменяется в течение суток. Наиболее высокая активность наблюдалась в 12-часовой пробе, в 6-ти и 19-часовой пробах активность была не значит ельной; в клубеньках, собранных в полночь, практически не удалось обнаружить какой-либо активности нитрогеназы.

Как известно, первым природным продуктом азотфпксеши. является аммиак, образующийся в бактероидах. Однако, как поено видеть из рис.. , в период наиболее интенсивной фиксации азота С12-часовая проба) в бактероидах не наблюдается накопления амииака. Что касается растительной части клубенька, « уровень ешиаза в течение суток практически не изменяется. Таким образом, поскольку уровень аммиака как в бактероидах, так и в растительной части в. период азотфиксаши не поднимается, так как его ассимиляция строго регулируется, бадо важным изучить д^яямииу содержания свободных аминокислот. Суточ—

Рио.5

сутотная данйикд. шгев-сиш0ота30кжсши (А) и ссцщешия ашиака в бшершш (б) и в рас-титешой частй юршшц (с)

-1--г

Ргс.б

СУТОЧНАЯ ДИНАМИКА ЛИКАРБОНОШХ ЯШОИГСШТ И ИХ ЙЩОВ, • АЛАНИНА В ЕАКТБРОИ^ШЦд) ^РАСХИТЕИЛШ ЧАСТИ ИСУЕЕНЖОВ

1-глу.к-та, 2-глутшин, шипом асл, к-та, 4-аланин, 5-еспарагин, 6-асп.к-та

нал динзылна свободных аминокислот как в бактероидах, так а в растительной часта клубенька представляет интерес с точки зрения регуляции нитрогенаэн, поскольку наши было показано, что некоторые аминокислоты являются ингибиторам этого фермента ( Асеева, Евстигнеева, Мартынова, Шапошников, Радюняна, Крето-вач, 1973). Из данных рис.6 можно видеть, что содержание глу-тамияовой кислоты, глутамина, асларапина и аланина в течение суток изменяется незначительно, в то время как количество ас-парагиновой кислотылодэе рже но больший колебаниям. Следует отметить, что наиболее высокий уровень ее наблюдается в ночные часа.'

Диншика содержания ГШ в бактероидах и растительной части клубенька различна: в то время как в бактероидах оаа никак ве коррелирует с интенсивностью процесса фиксации азота, в растительной чаоти клубенька, напротив, наблюдается прямая корреляция накопления ГАЫК а интенсивности процесса азотфик-сации, В 12 часов дня ее содержание увеличивается примерно в 3 раза по сравнению с другим временем суток.

Следует также отметить, что количество ГДМК в растительной часта клубенька значительно выше, чей содержание других аминокислот.

Содержание ароматических шинокислот (рис.6) в бактероидах и растительной часта клубенька изменяется в течение суток по-разному. Следует отметить, что в период интенсивной азот-фикс ашш в бактероидах накапливается фениладашш. Известно, что фенилаланин в бактериях так же, как и в других организмах, образуется путем перееминаровакия его беэазотистого предшественника — фенилгшрувата с глутаминовой кислотой.

Дополнительные опыты показали, что как растительная . часть клубенька, так и бактероида содержат глутаматдекарбо-ксзлаэу, активность которой в растительной части выше, чей в. бактероидах (рис.7). Наличие этого фермента говорит о возможности образования ГАЫК путем дэкарбоксшшрования глутаминовой КИОЛОТН.

Таким образом, в часы интенсивной азотфиксации ГйШС, возможно, является основной ра зерваой формой аммиака, образующегося в этом процессе. До данным Кретошча с сотр.(1967), ГАМК

валяется весьма активным метаболитом, обмвнкоторого тесно связан с превращениями дпкарбоновнг аминокислот, иг амидов ш аланина, ' ."..". ..

В заключение следует отметить', что низкий уровень всех аминокислот в бактероидах и отсутствие накопление дикарбояовнх аминокислот в их' амидов-ингибиторов нитрогеназы в период интенсивной азотфиксашш как в бактероидаой, так я в растительное части клубенька создает оптимальные условия дня,протекания этого процесса в дневные часы, когда бактероиды, могут получать от фотосиитвзирующего растения различные соединения углерода.

- Из данных, имеющихся в литературе, известно, что азотфик-сирувдая активность клубеньков сои изменяется в зависимости от фазы развития растений, Вонг и Эванс установили, что максимальная активность обнаруживается в клубеньках 35-дневных растений сои ( Wod£ andBraas, 1Э71). Рядом авторов { Berg«гвen, 1958; Мэнорин, 1970) отмечается, что максимальная активность . аэотфиксации совпадает с фазой бутонизация растений, ■■..■■■.. 1£в определили азотфиксирущуц активность целых клубень— . ков люпина и препаратов нитрогеназы,. выделенных из бактероидов на различных фазах развития растений, а также выяснила жщрое о связи изменения активности N2- фиксации в течение вегета- ='

циоиного цикла растений люпина с изменением содержания белка а свободных. аминокислот в бактероидах.

На рас.8 (кривая А) представлены результаты определенен азотфикснруввдей. активности целых клубеньков лшива, окрузиидщх в виде муфты кусочек корон. Ранее было показано (Кретовяч я др. 1969), что клубеньки люпина, полностью отделенные от корня, теряют свою азотфиксдрующуп активность, поэтому в ооггах с клубеньками люпина необходимо использовать их в виде целой муфты с КУСОЧКЕШ корня внутри нее.

Тсс.8

ИШЕЕШМБ ИНТЕНСИВНОСТИ АЗОТФИКСАЩИ У ЦЕЛЫХ КЛУБЕНЬКОВ (А) И ШТРО-ГЕЯАЗЫ (£) В ПРОЦЕССЕ ВЕГЕТАЦИИ ЛЮШНА

Из проведенных данных мошо видеть, что максимальной азотфиксикуодей активностью обладают клубеньки растений люпина в возрасте 38 дней. Растения этого возраста находились а фаза бутонизацга.

Кривая В на рисунке отражает изменение азотфаксидощей активности препарата китрогенаэы в течение тех же фаз развития растений* Она характеризуется резко выраженными максимумом, который во времени несколько сдвинут на более поздний срок, чем макетцгы аэотфиксирушеЯ активности целых клубеньков. На основании этих давиых можно предполагать, что в то время как витрогеяаза бактероидов еще сохраняет высокую активность, целые клубеньки как азатфкксирущая система симбяотичесиой фиксации азота уде начинают деградировать.

На рис.9 (кривая I) представлены результаты определекия азотфиксируюшей активности клубеньков в течение вегетации люпина (другой сезон). Максимум активности процесса набяпдаатся, когда растения лшпна находятся в стадии бутонизации, что подтверждает результаты, полученные ранее для люпина (Кретович и соавт.,1973) к для сои Бергерсенон ( В®ге«гв*п, ,1968). Обильше осадки (рис.9, кривая 2),увеличение влажности (рве.9 кривая 4) и понижение температуры (рис.9, кривая 3), наблюдавшиеся во второе половине июля, вызвали резкое понижение интенсивности процесса азотфянсашш. ; '

1"

# I

?вс.9

ИЗМЕНЕНИЕ АЗОШВССИЕШЩЕЙ -АКТИВНОСТИ КЛУБЕНЬКОВ в СВЯЗИ С ЦЕНадДОМ ШШТАЛИИ ДШИНА и погодными УСЛО- -ШЯЩ-

I. Интенсивность азотфик-

2. Количество осадков

3. Температура

4. Влажность .

Вани бвяа исследована также динамика содержания бедка в бактероидах, выделенных из исследуемых клубеньков (рис.10). Сопоставляя эти дднни* 5 р£ ООЛр16ВЯ&Н2 цри ОПрвДв™

лении азотфикеярушей активности тех же клубеньков, можно видеть, что интенсивность азотфиксадаи начинает снижаться раньше, чем начинается процесс деградации белка в бактероидах. Это согласуется с ранее полученными нами данными (Кретович, Асеева, Евстигнеева, Шапошников, Радгжина, Романов, Мартынова 1973), свидетельствующими о том, что в периоды бутонизации я • начала цветения нитрогеназа сохраняет высокую активность. По-видимому, снижение активности - фиксации в этот пецтод связано с начинающейся деструкцией легоглобина клубеньков.

1 , Ь .

30 Ю » Я)

Рис.10

изменение солешнйя

белка в бактероида! из клубеньков яшина в ПРОцессе вегетации

Количество свободных ароматических аминокислот мало изменяется в процесса вегетации, однако, кривая содержания фенил аланина, динамика которого в суточном роте коррелирует с интенсивностью азотфиксащш, повторяет вегетационный ритм фиксации азота.

Из данных таблицы 4 ыоино видеть, что в период нарастания активности азотфиксации и количества растворимого белка наблюдается увеличение содержания некоторых аминокислот, главным образом, аланина, глуташгоовой кислоты, глутамина, валяна и лейцина.

Таблица 4

Динамика содержания (некоторых вданокислот) в бактероидах клубеньков лжгина в течение вегетации (шол аминокислоты на I г бактероидов)

Аминокислота

Дата

о о н т а

Глутаминован кислота

Гдуташга

Алании

Валин

Лейцин

0,33 0,69 0,74 0,81 0,83 0,61

0,26 0,39 0,49 0,47 0,43 0,55

0,91 1,44 1,81 1,79 1,84 1,94

0,41 0,53 0,57 0,55 0,54 0,60

а,27 0,33 0,34 0,36 0,37 -

В период постепенного снижения интенсивности азотфикса-вд2 н содержания растворимого белка наблюдаются менее значительные изменения в содержании свободных аминокислот, что, по-видимому, отражает некоторую стабилизацию соотношения процессов их синтеза и утилизации. В конце исследуемого периода, когда количество белка в бактероидах заметно снижается, происходит нарастание количества некоторое свободных аминокислот, связанное, очевидно* о начинавшейся деструкцией.белка.

Кая показали опыты, нитрогеназа.из бактероидов люпина так se,*как и нитрогеназа из бактероидов СОИ ( Bergereen апЗ Тихпег , 1963) быстро теряет активность после ее выделения и очистки, особенно в присутствии даже незначительного количества кислорода (Мартынова и соав. ,1976). ■'

При необходимости иммобилизации лабильных федоентов, требующих для проявления активности нескольких кофакторов, применяют метод иммобилизации не ферлеата, а содержащих его ан-тактных бактериальных клеток. Предварительные опыты показали, что бактероиды Bb.lnplni обладают высокой аэотфпксирующей активностью, значительно более стабильной, чем выделе нныйфер-мент. ■

В качестве опытного материала были использованы бактеро-. иды клубеньков люпина, выраженного из семян, инокулированных эффективным штшмом Rh. lupial 359а.

Из таблиш 5 можно видеть, что при данном методе иммобилизации активность иммобилизованных бактероидов составляет 23% от активности бактероидов в суспензии. Гранулы геля беа бактероидов оказывают незначительное, ингибируидее действие на активность добавленной к ним суспензии бактероидов, а семи по себе гранулы геля не обладает способностью восстанавливать ацетилен. Из данных варианта 5 можно видать, что в аэробных условиях иммобилизованные в геле бактероиды полностью терян? актив-' ность. Следовательно, кислород легко проникает в гранулы, и икмобилизованйые бактероиды для сохранения их азотфиксируюшей, активности должны находиться в газовой среде с содержанием кис- . лорода не выше 6 Jt. • '

Таблица^

Дзотфаксирующая активность бактероидов иммобилизованных в шышакриламидном геле

Варианты опытов

;нммш Су^ :ммоли

'на пробу :на 100 «г :бактероидов

1. Суспензия бактероидов 236,5 139,1

2. Гранулы геля с иммобилизованными бактероидами 6,2 32,6

3. Суспензия бактероидов + гранулы геля без бактероидов . 188,1 110,6

4. Гранулы геля без бактероидов О О

5. Гранулы геля о иммобилизованными бактероидами + .0 О

X)

В опыте использованы бактероида, хранившиеся в замороженном состоянии. Бактероида выделены из клубеяьков лмшна в стадии бутонизации растений.

ЬЫ ; -

Я

Рис.II ГРАНУЛЫ ШШАКРИШИД-НОЮ ГЕДЯ С ЕШЯЕНШШ БАКТЕРОИДАМ Вй.ЮрКИ

ш

На рис.XI представлены гранулы геля с включенными в них бактероидами.

Таким образом, полученные в этой работе данные свидетельствуют о возможности иммобилизации активных бактероидов1

Вами получены предварительные данные о полном сохранения азотфиксирушей активности бактероидов в течение 7 суток.

Кроие того, получены данные, указывающие на. важную роль

в стабилизация а уваличешш активности иммобилизованных бактероидов.

выводы;

1. Получены белковые фракции клубеньков лввищ, образовавшихся при эффективном и неэффективном симбиозе. Определены оптимальнее параметры н разработаны режимы и аппаратура для определения азотфиксирующей активнооти клубеньков, бактероидов

и нитрогенаэы в анаэробных условиях.

2. С использованием анаэробной техники выделена активная нитрогеваза и разделена на составляющие ее белковые кршоаенты: Иэ-1^-компонент и ге-коыпоневт. Определена изо электрическая точка алектрофоретичесии гомогендаго Мэ-Яэ-компоневта нитрогенаэы, равная 4,92, ж я -концевая аминокислота этого белка -глутаминовая кислота.

3. Доказано различие в аминокислотном составе Мо-Ре- и Fe-компоне нтов нитрогеназы. Для молибдоферредоксина характерно высокое содержание дикарбоновых аминокислот, лизина, ала-шша и наличие триптофана. Азоферредоксин отличает более высокое содержание тирозина и федалаланина и отсутствие триптофана.

4. Исследован аминокислотный состав легоГлобина и его компонентов* Характерной особенностью является отсутствие серусодержащих аминокислот, небольшое содержание гистидина и высокое содержание аланина и валена.

5. Установлено наличие суточного ритма в изменении интенсивно ста ^-фиксации и содержании свободных аминокислот в бактериальной и растительной частях клубенька. Показано, что

в период минимальной активности процесса фиксации молекулярного азота (ночные чаев) в бактероидах накапливаются дикарбо— новые аминокислоты, аяанин и амид», показанные как ингибиторы нитрогеназы в период максимальной ¿зотфиксации ,( полдень ) жх содержание резко уменьшается, а резервной формой аммиака в

цатозоле растительных клеток клубенька в период интенсивной к ^-фиксации в дневные часы является ^«аминомасляная кислота.

6. Установлена корреляция между интенсивность!) процесса азотфиксациа в клубеньках с фазой развития растения-хозяина. В период максимальной активности процесса - аа стадии бутонизации растений люпина, наблюдали увеличение содержания алани-на. глутампновой кислоты, глутаыияа, валина, лейцина. Кривая содержания свободного фенилаланина повторяет вегетационный ритм фиксации азота.

7. Подобраны условия и впервые осуществлена иммобилизация активных бактероидов из яывоЪ±пв 1прШ1 путем включения их в полиакриламидный гель.

СПИСОК

работ, опубликованных со материалам диссертации

1. К.Б.Асеева, Г .Л .Шапошников, Н.А.Шчаддвва, Б. Ы. Мартынова, 3.Г.Евстигнеева. Некоторые кинетическяе характеристики а аминокислотный состав частично очлщенной иатрогеназы из бактероидов лшина и сои. - Тезисы Всесоюзной кодере вика по механизму биологической фиксации азота. Москва,декабрь 1971, стр.15.

2. С.С.Медик-Саркисян, Г.П.Кардиленно, Г.Л.Шапошников. Сравнительное исследование I и 2 компонентов легоглоблва велтого лтина. - Тезисы Всесоюзной конференции по механизм биологической фиксации молекулярного азота, стр.19, Шсква, декабрь 1971 г.

3. 3.П.Львов,Ш.Сергеев, М.К.Вейяова, Г.Д.Шапошников, В.Л.Кретович. - Регулирующая роль аммония в восстановлении азота и ацетилена, бесклеточного экстракта Atotobsotex Tinelandil. . Доклады Академии наук СССР 201, № 6,1493-1495, 1971.

4. В.Л.Ганелня, Н.П.Львов, Ц.С.Сергеев, Г.Л.Шапошников, В.Л.Кретович. - Выделение и свойства Ш-содерхашего пептида аз компонента I, азотфиксируицего комплекса JLzo-tobact«r Ttoeloniii . Доклады Академии ваук СССР, 206, M 5, 1236-1238, 1975.

5* К.Б.Асеева, 3, Г.Евстигнеева, Е.Ы. Мартынова, Г.Л.Шапошников, Н.А.Раддкина. В.Л.Кретович. Некоторые свойства нитрогеназы из бактероидов люпина. - Известия Академии наук СССР, ВВП.5, 751-755, 1973.

6. В.Л.Кретович, К.Б.Асеева, 3,Г. Евстигнеева, Г.Л.Ша-пошкивов, Н.А.Радюкяна, В.И.Романов, Е.М.Мартынова. Изменение интенсивности симбаотической фиксации азота в процессе вегеташш лтщва. - Физиология растений, 20, вап.6, I209-I2II, 1973.

7. Г.Л.Шапошников, К.В.Асеева, Е.М. Мартынова, Н.А.Ш-чзлкина, З.Г.Евстигнеева, В.Л.Кретович. Ааднокжсшотный состав белков клубеньков ленива я сон. - Доклада ва Всесоюзной конференции по механизму биологической фиксации азота /4 Ба-ховский коллоквиум/ стр.40-44, Черноголовка, 1973.

8. С.С.Мелик-Саркясяв, Г.П.Карпилекко, ГЛ.Шапошников. Сравнительное исследование I а 2 компонента легоглобнна люпина. - Доклада на Всесоюзной конференции по механизму биологической фиксации молекулярного азота <4 ЕаховскяЙ коллоквиум) стр.53-Є4, Черноголовка, 1373.

9. Г.Л.Шапошников. Герметичный блок для проведения orm-тов в анаэробных условиях яли в заданной среде. - Доклады ва Всесоюзной конференции по механизму биологической фиксации молекулярного азота (4 Ваковский коллеквиум) стр.140-143,, Черноголовка, 1973.

10. З.Г. Евстигнеева, К.В.Асеева, Е.М.Мартынова, Г.Л.Ша-поаников. Регуляция витрогеназы при симбаотическсй фиксации азота. - Третий Всесоюзный биохимический съезд (Рига, октябрь 1974). Тезисы сшщозиальных докладов, стр.147.

11. С. С. № лик-Саркисян, В.В.Яровзнко, Г. Л. Шапошников,

Л.О.Еяадзневская, В.Л.Кретович. Хроматография в аминокислотный состав легоглобина люпина. - Биохимия, 39, шп.4, стр.711 -718, 1974.

12. Г • Л • Шапошников, 3.Г.Евстигнеева, К.В.Асеева, В.Л.Кре тович. Изменение интенсивности фиксации молекулярного азота, содержания свободных аминокислот и аммиака в клубеньках люпин в течение суток. - физиология растений, 22, вып.4, стр.786-79 1975.

13. З.Г.Евстигнеева, К.В.Асеева, Г.Д.Шапошников, В.Д.Кре тович, Г.М.Мэгилъниикий, К.А.Кощеевко, Г.К.Скрябин. - Иммобилизация бактероидов Ehirotitnn inptni в полаав риламвдном геле. - Доклады Академии наук СССР, 222, № 2, стр.489-491, 1975. _

14. Г.Д.Шапошников, К.Б.Асеева, З.Г. Евстигнеева. Изманее содержания аминокислот в бактероидах RMtobitca luplni

в вегетационном шише. - Физиология растений, 23, вш.З, стр.620-622, 1976. *

Г-КІЗЛЛР* W«-_Тир. *SO з«,. 2S2Z

Предпрнчие »ПАТЕНТ», Москь», Г-59, Бережковсмя и«0,, 24