Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Белки семян люпина, связывающие молибден, вольфрам и некоторые радионуклиды

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Белки семян люпина, связывающие молибден, вольфрам и некоторые радионуклиды"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н. БАХА РАН

На правах рукописи

Калакуцкий Кирилл Львович

УДК 677.151.33

БЕЛКИ СЕМЯН ЛЮПИНА, СВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛИБДЕН, ВОЛЬФРАМ К НЕКОТОРЫЕ РАДИОНУКЛИДЫ

03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учбиой степени кандидата биологических наук

' МОСКВА 1992

Работа выполнена в лаборатории биохимии ассимиляции нитратов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель -

доктор (5йологических наук профессор Н.П. Львов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук М.С. Крицкмй

доктор химических нвук профессор Г.И. Лихтенштейн

Ведущая организация -Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАИ

часов на заседании Специализированнс . 01) но

присувденш. учёной степени кандидата биологических нвук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН (II707I Москва, Ленинский пр. д. 33, корд. 2)

С, диссертацией мокио ознакомиться в. библиотеке биологической литературы РАН (II707I Москва, Ленинский пр. д. 33, корп. 1)

Защита диссертации .состоится

в 10

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

М.И. Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ А£12§льность_теш. ' Список . молибденсадержащих ферментов к настоящему времени насчитывает более 15 белков, участвующих в метаболизме-'азота, серн, углерода, и продолжает расширяйся. Наибольшее внимание уделялось молибдену как компоненту активных центров нитрогеназы и нитратредуктаэы - ферментов, осуществляющих ассгтляцюо молекулярного и нитратного азота. В последние годя биохимия - молибдена в значительной степени переключается на изучение.пути его метаболизма, в котором существенный интерес представляют форш накопления микроэлементе, так как показано, что.от обеспеченности - организма молибденом зависит активность нитрогеназы и нитратредуктазы, а как следствие,- и выбор источника азота. .

Механизм аккумуляция молибдена до некоторой степени изучен лишь у некоторых микроорганизмов, из' клеток которых выделена белки-аккумуляторы. Для растений этот вопрос практически не изучен, между тем, он особенно интересен в случае симбиотических сообществ, где от количества молибдена зависит функционирование ферментативных систем двух огрэнизмов: растения-хозяина и бактерии-симбионта.

Бобовые известны как "привычные» концентраторы молибдена [Ковальский Í9741, поскольку многие представители семейства Leguminosas накапливают значительные количества этого микроэлемента в семенах. В качестве объекта исследования в настоящей работе был выбран . айлтый люпин, имеющий сельскохозяйственное значение для средней полосы Нечерноземья. В работах, проводившихся ранее в чашей лаборатории [Заболотннй и др. 1937], было показано, что подкормка молибденом люпина, приводит к росту урожайности и, накоплении микроэлемента в

семенах, в которые в конце онтогенеза "перетекает" до 80Ж всего молибдена растения. Растения-, выросшие из таких обогащенных молибденом семян, характеризуются повышенной нитратредуктазной и. нитрогеназной 'активностью и, в .свою., очередь,' дамт прибавку урокал. Таким образом, одна подкормка молибденом- оказываот -положительное влияние на два поколения растений. В "то же время, хотя физиологический эффект применения микроэлемента известен, биохимический механизм его накопления остается неизученным. Последнее определило выбор цели и задач настоящей работы. Ш>ль_и_за£§чи.

Основной целью являлось получение экспериментальных данных способствующих расшифровке механизма аккумуляции молибдена семенами аелтого люпина.' В работе решались следующий задачи

1. Определение формы накопления молибдена в семенах желтого люшша (белковой или низкомолэкуяярной). •

2. Разработка высокочувствительного метода обнаружения молибденсвязывавдих белков, позволяющего выявлять такие белки-в семенах люпина. {

8. Оценка степени специфичности механизма аккумуляции молибдена

по отношению, к втому микроэлементу . Нахчноя_новизна.

1. Разработан новый высокочувствительный метод, позволявший сравнительно быстро обнаружить Но (И)-связыв.ащие белки с использованием радиоактивного изотопа вольфрама (»?*«).

2. С помощью предложенного метода в сешнах желтого люпина обнаружено два белка, связывающих Мо (и).

3. Показано, что изученный механизм аккумуляции Мо (Ю является неспецифичоским по отношению к названным микроэлементам,. .

. \ поскольку упомянутые белки связывают также и некоторые из

радионуклидов, содержащихся в выбросах Чернобыльской АЭС. Практическая ценность.

Обнаружение в,секзнах бобовых белков, способных связывать радионуклида выбросов Чернобыльской АЭС, в какой-то мере, объясняет.известный ранее -значительный вынос бобовыми тяжелых металлов я радионуклидов из загрязнённых почв.

Разработанный высокочувствительный метод мечения «»•* In ' vitro может быть использован для быстрого обнаружения некоторых Мо и Мо-со-содержащих белков. Апробация.

Материалы диссертации докладывались:

на. Всесоюзной конференции "Экологические проблемы накоплений нитратов в окружающей среде" (Пущино, 1989); ,,на респуб^шканском симпозиуме . "ФизяЬлого-биохимическав роль микроэлементов в. управлении адаптивными реакциями и продуктивностьп растений" (Кивинэв, 1989); ' •.

на XI Всесоюзной конференции "Биологическая роль микроэлементов и их применение в сельском хозяйстве и медицине" {Самарканд, 1690); на б Международном симпозиуме по микроэлементам (Jena, 1989}} на 8 Международном конгрессе по азотфаксации (Knoxvile, 1990)«. Материалы работы докладывались такта на конкурсе, института биохимии им» Баха РАН в 1991 г. (отмечена Ш премией).

' ШЙЖШЯ*''•'•'."•. ' ' Г.-' '.••:■•

По материала*! диссертации опубликовано 7 печатных работ (4 статьи и 3 тезисов). . Структура и обгбм диссертаций. , .

. Диссертационная работа - состоит из введения, обзора-литература, посвяиегоого кехвнизму связывания молибдена белками.

- А - ■ •

в также его транспорту и аккумуляции, изложения результатов и их • обсуждения, выводов и списка цитированной . литература' ДЭЗ.' наименования). Объём работы 128 страниц машинописного текста, , включая 26 рисунков и 7 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. Оцвшса преобладающей формы молибдена в сенанах люпина Из литературы известна высокая лабильность Мо-белков, обусловленная легкостью диссоциации микроэлемента в окислительных условиях (авторы многих работ используют анаэробную технику при ■ очистке этих селков).. Чтобы оценить, в какой форме находится большая часть молибдена в семенах, необходимо сравнить распределение микроэлемента между ' высокомолекулярной и низкомолекулярной фракциями 'экстракта из семян в аэробных и анаэробных ус..,->ьиях.

Для решения етого вопроса бил поставлен следуювдй ¡эксперимент: анаэробно приготовленный экстракт из семян люпина фракционировался в- аэробных и анаэробных условиях.' В работе использовались методы, позволявши разделить экстракт на белковую (высокомолекулярную) и небелковую (низкомолекулярную) составляющие: гель-фильтрация через БерНа^ех о 25, высаливание сульфатом аммония и осаясдешга метиловым слиртом. Во.фракциях определялось содержание молибдена.

Полученше результаты (таблица I) позволяют заключить, что при анаэробной экстракции и фракционировании молибден в семенах люпина преимущественно связан с белками, но в окислительных . условиях,диссоциирует от них и обнаруживается в низкомолекулярной фракции.

Таблица I.

Связь молибдена с белками экстракта из семян люпина при аэробном и анаэробном фракционировании (содержания Мо в * от исходного).

условия Фра*.ции- рования варианты фракционирования

гель-хроматография на ЗерЬ»<1ех в 23 высаливание- 70Й от насыщения сульфата аммония осаждение 50!« метиловым спиртом

Уо VI осадок раствор осадок расти.

Аэробные Анаэробные • 15 85 75 25 30 70 90 • 10 и.о. н. о. 75 23

и.о. - не определялось

2. Разработка способа иечения Мо-белков 1п vltro Поскольку показано, что Мо в семенах люпина, преимущественно сияззи и белками, основной дальнейшей задачей работа стал поиск и изучение белков-аккумуляторов молибдена. Однако именно идентификация молибденсодержащих белков, лишенных ферментативной активности, представляет наиболее трудную Методическую задачу, так как единственная возможность обнаружить эти белки - по содержанию микроэлемента, который легко длисоциирует.

Перспективным для целей обнаружения Мо-белков является использование радиоактивной метки; из-за высокой чувствительности метода, даже при потере значительного количества микроэлемента в результате диссоциации, обеспечивается надежная идентификация белка, его содержащего. Изотоп овно, широко используемый для меченая Мо-белков микроорганизмов, для целей биохимии растений, однвко, мало подходит в связи с коротким периодом полураспада <66,7 часов).

Для мечения молибденсодержаишх белков растений используется

подкормка радиоактивным изотопом вольфрама Вольфрам,

также как и молиоден, входит в'состав подгруппы хрома, но имеет •период полураспада 75 суток, что сопоставимо со временем ваготации растений. По-видимому, по причине химического сходства вольфрам замещает молибден в молибденсодержащих белках, приводя при этом к инактивации большинства Мо-ферментов, что и ограничивает область применения этого метода.

■ Таким образом препятствием для изучения молибденсодеркащих белков семян люпина является отсутствие метода, позволяющего недавно идентифицировать эти белки.

Для ряда Мо-ферментов б ила показана способность Мо встраиваться в молекулу Мо-со в результате комплиментации In vltfo [Lee et ai., 1974]. Белок-аккумулятор молибдена из /teoíobacter vtnelandit также монет связывать микроэлемент в условиях tn vttro [Pienoos, Brill, 19S4J. Кроме того, как уже отмечалось, механизм встраивания Мо в белок недостаточно селективен, даже в условиях in vivo. Это свойство используется [Но+, ton, Hewitt, 1971; Deng et al., 1989], например, для инактивации нитратредуктазы введением в питательную среду вольфрамата, что позволяет надеяться на то, что и tn utlro удастся Mo заменить на w.

На основании известных из литературы и упомянутых выше свойств белков, содержащих молибден, был разработан способ нечения белков семян iesw in vitro (схема метода представлена на рис. I). Помеченный 1BSw tn Vitro образец разделяется методом нативного диск-электрофореза. Локализация вольфрамсвязывающих .белков определяется методом радиоавтографии. Для того чтобц снизить воздействие окислительных условий на белки, и разделявшей, и концентрирующий гели содержали дитиотреитол, а

- ? -

перед нанесением образца гель подвергался предфорезу в течений 12 часов.

. ОБРАЗЕЦ

добавление раствора .кя*«да¥ (I МБк на 10-15 иг белка)

ИНКУБАЦИЯ

В UС А Л i В А Н ИЕ tмн,з3,so» 70S от насыщения, 4°С i

ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ

10000 х g, 16 мин.

СУПЕРНАТАНТ • ОСАДОК

(цементируется) -

перерастворяется в малом объеме 25 мМ трис-Н01 буфера рН 7,0 и диали-зуется против того „же буфера (12 часов при 4 С)

Рис. I. Схема процедуры нечвния *8«» tn vitro

Для отработки условий неченяя в качестве (отдельных систем, содержащих молибдобелки, использовались экстракты из проростков пшеницы, ячменя и гороха, содержащих не менее двух Мо-ферментов нитратрэдуктазу (HP) я ксантиндагидрогеназу (КДГ), один из которых (КДГ) может быть легко определен в поливкриламидном геле (ПАГв) после электрофореза с помощью зимограммы. Сравнение радиоавтографов .гелей после электрофореза меченых in vitro экстрактов с зимограммами гелей после электрофореза немеченых ("свежих") образцов позволяет' заключить, что полосам на зимограммэх соответствуют полосы повышенной радиоактивности на

- а -

радиоавтографах (рис. 2), что свидетельствует о возможности включения In vitro в КДГ и-ещб один белок. Из работы [Швецов и др. , 1992] известно, что этот белок неспецифически, то есть и в отсутствие гипоксантина, окрашивается при зимограмме на ксавтиндегидрогеназу, содержит Мо-со, но не является нитратредуктазой.

Л Б В

гИшш -

д .(«_____ ъТттштшщ

I п

Рис. 2. Зимогмммы не ксантиндогидрогеназную активность после електрофореза экстрактов из проростков: А-пшеницы, В-ячмвня, Г-гороха. Радиоавтографы гелей после электрофореза экстрактов, меченных 1Bsw In vitro, из проростков: Б-пшвницы, Г-ячменя, Е-гороха. Обозначения: J Мо-со-содержаишй белок неспецифически, то есть и-в отсутствие гипоксантина, окрашиваемый но зимограммах на ксантиндегидрогеназную активность, Ц ксантиндегидрогеназа.

Интересно, что возможно получить радиоавтограф с зимограммы, если подвергать электрофорезу образец,. меченный 1BSw In vitro (при этом необходимо сникать количество вводимой, метки и увеличивать срок экспозиции при радиоавтографии). Такой результат согласуется С данными работы [Notion et al., 1972], в которой авторы пометили In viva iasw нитратредуктазу листьев шпината, и при изовлектрофокусировашш получили один пик, содержащий и радиоактивность и HP-активность. Таким образом, можно

предполагать, что вольфрам при мечении как In.vitro, так и In vluo включается в Мо-со молибденсодержащих ферментов, приводя к их инактивации, но не изменяя физико-химических свойств. Поэтому, если, мочению подверглись, не все молекулы фермента,, возможно детектировать эти белки как по ферментативной активности, так и по радиоактивности.

В состав молябденсодерЕШЩИх ферментов микроэлемент входит в виде кофакторов двух видов: РеМо-оо, содержащего молибден, агалезо, серу - кофактора нитрогеназы, и птерш-ювого кофактора. (Мо-со) всех остальных ферментов этого типа. Приведенные выше результаты позволяют заключить,- что удайтся пометить ■18In vitro 1СДГ и ещэ один Мо-со-содержащий белок. Для проверки возможности включения iaEv» in nitro в нитрогеназу использовался экстракт из бактероидов,, выделенных из - клубеньков люпина. Известно, что этот образец содержат нитрогеназу, ксантиндегидро-геназу и метилвиологензависимую нитратредуктазу. Радиоавтограф геля после электрофореза меченого экстракта сравнивался- с зимограммами на ЛОТ, метилвиологензависимув HP.. Локализация нитрогеназы в ПАГе определялась окрашиванием геля на железо [Brill et al., 1974J. Результат не оставляет^сомнений Ь том, что нитрогеназу из бактероидов пометить 1Bsw in vitro не удается, в отлячде от двух Мо-со-содераащих ферментов (нитратредуктазы и ксэнтиндегвдрогеназн). '

Для выбора условий введения метки образцы екстрэктов

«

подвергались различным процедурам меченая и после электрофореза сравнивалось интенсивность полос на радиоавтографах. В качестве основы для дальнейшей работы была выбрана схема, обеспечивающая набольшее включение метки. Увеличение времени инкубация образца о-вольфраматом повышает включение метки в болт, используемые в

- ю -

качестве маркеров, но при этом возрастает и интенсивность фоновой радиоактивности за счет носпецйфического связывания другими белками экстракта.

3. В семенах люпина содержится два белка, включающих

In vttro *«VÍ и til vivo *«VI нЧь В образцах семян люпина, используемых в настоящей работе, содержание кофактора весьма невелико (не определяется стандартным методом). С этим результатом согласуются данные о том, что в семенах не удается определить ни нитратредуктазу, ни ксантиндегидрогеназу, ни белок, неспецифически окрашиваемый на аимограммах на КДГ (Швецов и др., 1992). Однако на радиоавтографе геля (рис. 3 В,Г) после электрофореза экстракта из семян люпина, меченного "Bw in vitro, обнаруживаются две интенсивных радиоактивны/, полосы, соответствующих белкам, связавшим в существенно большем количестве, чем другие белки экстракта. Для сравнения на рис. 3 А, Б приведена электрофоре грамма . того хе образца после окраски кумасси ярко синим (и соответствующая денситограмма).

Поскольку связывание *"w некоторыми белками In vitro могло быть следствием артефакта, результаты меченая In vitro нуждались в проверке. В случае включения метки в ксантиндегидрогеназу, контролем служит зимограмма на КДГ; в данном случае, когда нет возможности проверить энзиматическую активность, необходимо • установить,, содержат ли эти белки Mo (w) непосредственно в семенах, то есть проверить результат мечения in vitro мечением (ft vivo. Для решения этого вопроса использовались семена, обогащенные Ко и iD5w в результате подкормки. Для того чтобы снизить неблагоприятное воздействие вольфрама на развитие растений, подкормку проводили вольфраматом с высокой удельной и

невысокой суммарной активностью. После' подкормки растения выращивали в условиях радиологической теплицы. Видимых отклонений от нормального развития не наблюдалось. Платой за "щадящий" режим выращивания были трудности при идентификации радиоактивных белков в ПАГе посла электрофореза: чувствительность радиоавтографии оказалась недостаточной (при разумных сроках экспозиции '- не более периода полураспада используемого изотопа). Окааалось ; необходимым использовать полупрепаративный электрофорез и определять величину радиоактивности во фракциях геля (после сжигания) я дополнительно увеличивать чувствительность за счет времени счета на сцинтилляционном счетчике.

Рис. 3. Обнаружение в экстракте из семяя люпина белков," связыващих iasw tn vitro. Д-гель после электрофореза экстракта из сэшш лшина, окрашенный кумасси ярко с яшм; Б-денситограмма. того же геля; В-радиоавтограф геля после электрофореза экстракта

из семян люпина, меченного 18Sw In vitro; Г-денситограмма того ке радиоавтографа.

Сравнение распределения в геле »"w (рис. 4А) и Мо (рис. 4В) после электрофореза ^экстрактов из семян, обогащенных этими микроэлементами в результате подкормки, и распределения ieew после электрофорезз тех же экстрактов, меченных tn vitro (Рис. 4Б, 4Г), позволяет заключить, что в семенах люпина Мо (W) 'запасается по крайней мере на двух белках, способных tn vivo связывать Mo и 1BSw и In vitro - iesw, поэтому допустимо использовать более долгокивуидй изотоп вольфрама; с практической точки зрения это существенно прошо, а потому привлекательнее.

4. Радионуклиды выбросов Чернобыльской АЭС связываются с теш se Селкаш, которые связывают Мо и и

Один из регионов традиционного • возделывания лшина -Беларуссь - сильно пострадал от последствий Чернобыльской аварии. Суровой необходимостью стало выращивание сельскохозяйственных культур в условиях радиологического загрязнения, и поведение бобовых в атом отношении представляет немалый интерес в силу "предрасположенности" к накоплению тякелых металлов.

В диссертационной работе использовались семена люпина, выросшего в 30 юл зоне Чернобыльской АЭС при экспозиционной дозе излучения на почве 600 мкр/час и плотности загрязнения 40 ки/кв км. После электрофореза экстракта из этих семян, используя схему, примененную для поиска белков, связывающих 18sw In vivo, было определено распределение р-радиоактивности. в ПАГе (рис. 4Д). В качестве контрольного, использовался этот кв образец, меченный ' iosw tn ultra (рис. 4Е). Оказалось, что белки, связывающие Мо (и), такко участвуют и в связывании радионуклидов выбросов

Рис 4. Связывание молибдена вольфрама и радионуклидов в семенах 'люпина. Распред«ленив молибдена и радиоактивности в гела ' после улектрофорвза: Л экстракта из семян, обогащенных 18Ew in vivo (подкормка) Б тиго ira экстракта, мпчрнного losw tn vitro В экстракта из семян, обогащенных Mo In vivo (подкормка) Г того ке экстракта, мечишюго iasw In t>ttro Д экстракта из семян растений, выросших в 30 км зоне

Чернобыльской АЗС Е того se экстракта, меченного 1BSw lit vitro

Чернобыльской АЭС. "V ,

Содержащаяся в литературе информация loilber et el., 1969] о снижении азотфиксации 6 условиях повышенного содержания тяжёлых металлов, косвенно потверждает результаты настоящего раздела. ибо может быть интерпретирована как следствие вытеснения молибдена другими металлами. ' ,

При электрофорезе образцов, меченных н», tn viva, ъ при электрофорезе образца из семян люпина, выросшего в .зове Чернобыльской АЭС, обнаруживается пик радиоактивности (содержания ; Мо) в области высокоподвижных низкомолекулярных соединений, незначительно отстающих от лидирующего красителя. Этот пик отсутствует в образцах, меченных tn vitro, так как при диализе, предусмотренном процедурой мечения, низкомолекулярные вещества теряются. Учитывая, что эти вещества сохраняют связь с W» "¿is, радионуклидами в жестких условиях электрофореза, они являются возможными претендентами и на связывание микроэлементов in vivo.

. Таким образом, использование разработанного метода мечения 18evj In vitro позволило обнаружить в семенах люпина два белка, связывающих Но, lasw и радионуклиды выбросов ЧАЭС in vivo, а также *esw {я vitro. Для удобства изложения далее в тексте менее влектрофоретичебки подвижный белок будет обозначаться Xм белком-аккумулятором, болев подвижный - 2м, белком-аккумулятором, 5. Белки-аккумуляторы молибдена .-присутствуют в сеыензх

различив бобовых культур Механизм аккумуляций, молибдена бобовыми представляет интерес с двух.точек зрения, во-пербнх: из-за участия микроэлементе в регуляции . активности ферментов ассш.тл/цуш 'молекулярного и нитратного',азоте, я, .'во-вторых, . по-,-причине возможного участия этого механизма в' аккумуляции, тяжелых металлов,' в: частности,.

- ■ .

радионуклидов выбросов Чернобыльский АЭС. Поэтому разработанная в настоящей работе схема мечения in и Ci го была использована для обнаружения белков, возможно, принимающих участие в твком связывании в семенах и других бобовых культур. Оказалось, что 1ы® белок-аккумулятор присутствует в семенах не.только люпина, но и гороха, клевера, люцерны.

6. Характеристика Iго белка-аккумулятора молибдена Для изучения некоторых молекулярных характеристик Iго белка-аккумулятора он был получен в частично очищенном виде экстракцией из геля . после полупрепаративного электрофореза экстракта из семян люпина, меченного lesw in vitra. Вольфрам связывается этим белком настолько прочно, что его удабтся идентифицировать и во фракциях после гель-хроматографии и даже после SDS-электрофореза (Для получения радиоавтографа время экспозиции необходимо увеличить до I месяца).

Молекулярная масса нвтивного белка была оценена гель-фильтрацией через калиброванную колонку с Sephaoryi s гоо. При этом время удержания пика; в котором определяется радиоактивность, соответствует бремени удержания белка с молекулярной массой 150-170 кДа.

Сравнением радиоавтографа sus электрофореграммы частично очищенного образца с результатом электрофореза набора белков-метчиков молекулярная масса вольфрамсвязываыцей субъединицы была определена равной 75 кДа (рис. 5) Интересно, что при двущрном электрофорезе (sûs после нативного диск-электрофореза) область ; геля, соответсвующая радиоактивному пятну'на (радиоавтографе iHe окрашивается кумасси ярко синим, что в ¡некоторой степени характеризует чувствительность метода.

;В процессе работы возникло предположение, что минорный пик

Бвлдк I <75 КДЗЭ Птт.п... I V Б

0 0?.00 4.20 '"4.40"'"¿,.60''',4.80'"эйо М

Рис. 5. Определение молекулярной массы вольфрамсвязывагаей субъединицы Iго белка-аккумулятора. 1-денситограмма радиоавтографа геля после Бвз-злоктрофороза " образца, содержащего частично очищенный 1НЙ белок-аккумулятор. Ц-ДОНситограмма геля, окрашенного . кумасси ярко синим, после электрофореза набора белков-метчиков: 1-фосфорилаза, 2-БСА, з-овальбуюш, 4-карбоангидраза, 6-ингибюор трипсина. Ш-калибровочвая кривая для определения молекулярной массы субъединвды Iго белка-аккумулятора. . ■

радиоактивности (содержания Mo) между пиками, соответствующими двум белкам-аккумуляторам (рис. 4), является продуктом протеолиза Iго белка-аккумулятора. Для проверки были приготовлены экстракта из семян люпина с применением ингибитора протеаз широкого спектра действия фенилмвтилсульфонилфторида (ФМСФ) и без него. Эти экстракты были помечены ie*w In vitro и после электрофореза сравнивались радиоавтографы'. Результат, представленный на рис. 6, потверждает указанное предположение; интересно, что продукт протеолиза сохраняет способность удерживать микроэлемент. Отсутствие пика радиоактивности, соответствующего 2МУ белку-аккумулятору на радиоавтографе электрофореграммы экстракта, приготовленного без ФМСФ, скорее всего, может трактоваться как следствие его протеолитической деградации, причем продукт протеолиза не сохраняет способности связывать микроэлемент.

Итак, мелекулярная масса Iго белка-аккумулятора равна 150-170 кДа, а его вольфрамсвязывающей субъединицы - 75 кДа; можно предполагать, что этот белок является димером, 8 проукт его протеолиза сохраняет способность удерживать микроэлемент.

7. Характеристика 2 белка-аккуыулятора молибдена

Пик радиоактивности, соответствующий 2МУ белку-аккумулятору, существенно хуже воспроизводится на радиоавтографах после нативного электрофореза меченных 1Bsw In vitro экстрактов, чем пик, соответствующий Iму белку. Такой результат, вероятнее всего является следствием малой прочности связывания t8sw 2м белком-аккумулятором. Нестабильность связи 2м белком-аккумулятором микроэлемента существенно затрудняет его изучение. Именно непрочность этого белка обуславливает необходимость мер предосторожности при выполнении электрофореза: проведение предфореза, наличие дитиотреитола в геле.

Денситограммы радиоавтографов гелей после даск-влектрофорвзэ экстрактов, меченных In vitro: I-экстрвкт приготовлен о

применением ингибитора протеиназ ШЗФ, Ц-экстракт приготовлен без применения ФМСФ. • ..

В образце, полученном после полупрепаративного электрофореза экстракта, меченного *«w tn vitro, этот белок связан с вольфрамом настолько непрочно, что его не удавтоя идентифицировать по радиоактивности при последующих процедурах. К счастью, на SDS-электрофореграммо этого образца содержится одна полоса, окрашиваемая кумасси ярко синим, с молекулярной массой 19 кДа (Рис. 7). При гель-хроматографии 2го белка-аккумулятора, полученного с помощью очистки электрофорезом, на той ке колонке, что использовалась для определения молекулярной массы Iго белка-аккумулятора, белок элюируется (детектирование по оптической плотности) двумя пиками в области•нулевого объема колонки. *aBw в этих пиках не обнаруживается, поэтому, хотя и мокно предполагать, что нативный белок содержит несколько суб'ьэдишщ (предел исключения используемого геля 250 кДа), потеря »"и но позволяет точно определить молекулярную массу нативного 2го белка-аккумулятора.

После полупрепаративного электрофореза экстракта из семян, меченного 1BIw tn uttro, в экстрактах из фракций геля определялась флюоресценция и радиоактивность. Было установлено, что пику радиоактивности соответствует ник флюоресценции. Учитывая, что эта фракция геля содершт преимущественно 2ой белэк-аккумулятор без заметных г/римесей, можно предполагать что с этим белком связан птерин.

Величина пика Флюоресценции плохо воспроизводится от опыта к опыту и заметно выше в образцах "свежих" вктрактов, не подвергавшихся процедуре мечения. Снижение количества связанных птеринов при мочении экстракта указывает на непрочность связи между пторином и белком, что косвенно потверкдает и вывод о лабильности связи мэвду этим белком и микроэлементом, поскольку

- го - . т

. Л " 1 t \

1г.оо

8.00

4.ÛÙ

III

Ддзоцям

виюк г ils *Д1>

\jterme*Top тряпсю«

КарСояипирам

л ПГ| ччр .....1 li I il и 111 ti 11111 1-lIhii I il 1 ij I1 ; 1 '' .

°-0ЗВ04ЯО +.20 4.40 4.60 4.Э0 5.00 lg M

го

Рис.7. Определение молекулярной массы субединицы 2 белка-аккумулятора. I-декситограмма геля, окрашенного кумасси ярки синим, после SDS-электрофореза 2го белка-аккумулятора, полученного экстракцией из геля после полупрепаративного диск-электрофореза экстракта из семян люпина, меченного *esw vitra. Ц-денситограмма геля, окрашенного кумасси ярко синим, после элктрофорвза набора белков-метчиков: 1-БСА, 2-овальбумин, э-карбоангидраза, 4-ингибитор трипсина, 5-лизоцим. 1Ц-калибровочная кривая для определения молекулярной массы суОъедишщы 2го белка-аккумулятора.

аиСолее вероятным место« связывания Мо (и) является птерин.

Птерин, благодаря специфичесокй флюоресценции, по которой окет быть легко обнаружен, - является удобным маркером, азволякшм оценить и количество связанного с ним белка в азличных образцах семян. В.этом отношении наиболее интересны емёна, различающиеся по , содержанию молибдена. -После лектрофореза экстрактов из этих образцов семян, учитывая плохую сспроизсодимость пика связанных птеринов, сравнение величин этих иков неинформативно. Поэтому для, сравнения количества птерин-одерхащего ■ белка .' был использован более "мягкий" способ ^акционирования:- гель-фил^Грация.

В работе использовался гель Тоуореаг1 ня 40 с целью получить ¡опслнителышй эффект разделения за счбт гидрофобного ¡заимодействия пт'ерина с матрицей. Гели этой серии :врактеризуются высокой гидрофобНостью,. и даже рекомендуются ярмой-провзводителем для этого вида хроматографии. Выбранный тип •еля, с одной стороны, должен был обеспечить такое взаимодействие : наибольшей интенсивностью - по, сравнению с другими гелями той :е серии. С другой стороны, поскольку его предел исключения 10 [Да, предполагалось, что основная масса белков будет элюироваться ; нулевым объемом колонки, а. птеринсодеркащий белок за счйт юспецифического взаимодействия с материалом матрицы будет от них )тставать. Эти предположения оказались верны: действительно, 1елок с молекулярной массой субъедшшци 19 кДв. элюироволся в збъЗме колонки. В результате этого эксперимента (рис. 8) било юказано, что содержание птеринсвязывающего белка выше в семенах з большим содержанием молибдена.

2,00.

-1.00

0.00

г 1.00

£

; Ы

0.50 * ' сс

.*-"..' : -«а-' - ..'.'.. М

' • :. .'«ч м

W

о о

f-0.00

III :

г 1.00

о

: 0.50.

20

"-0.00

/л

10

• ф Р А К Ц И Я ■ 'У ; Рио. 8. Распределение фл»юресценцяи и. молибдена во-фракциях элюата

'.' после гель-хроматографии .екстрактоь из сс-мян люпина,

содержащих: I 17 мкг Мо/г семян 'Ц R,4 мкг Мо/г семян

; III -3»2'мкг Мо/г V^.v.'i.''"-'' "

, л" - 23 -

вывода

1. Установлено, что Мо в сомолах желтого люпина аккумулируется . преимущественно в белковой форме . ■ ,

2. Разработан высокочувствительный метод обнаружения молибден-'.•кизывающих .белков, с использованием мечения In vitro радиоактивным изотопом вольфрама. (1BSw) экстрактов из растительных и микробных клеток и последующим нативным электрофорезом. Локализация молибденсодеркащих белков определяется по их радиоактивнсти с помощью радиоавтогрофии. МОтод позволяет пометить также . и некоторые Мо-содержащие ферменты, кроме нитрогеназц.

3. Применение разработанного метода, а также опыты с обогащением семян Мо, я, in vivo позволило обнаружить в семенах люпина два белка, связывающих Мо и if In vivo и *«w in vitro.

4. Показано, что обнаруженные белки способны также связывать и некоторые другие радионуклиды, что свидетельствует о недостаточной, специфичности механизма аккумуляций;.

5. Один из описанных белков-аккумуляторов, обнаруженный также в семенах гороха, клевера, люцерны, имеет молекулярную массу 160-180 кДа, молекулярную массу субъединицы 75 кДа. Продукт протеолиза этого, белка сохраняет способность удерживать микроэлемент. Другой белок, связывающий Мо (W),содержит птерин, имеет Молекулярную. 'Массу субъединицы 19 1«Да и характеризуется лабильной.связью с Мо (W). Количества белка,

• связанного с птерином, возрастает в семенах пропорционально содержанию молибдена. ,

Список работ, опубликованных по теме диссертации: 1 .Калакуцкий К.Л., Львов. Н.П.' Запасание молибдена /семенами люпина желтого // Тезисы докл. Всесоюзной конф.. "Экологические проблемы накопления нитратов в окружающей среде" Пущино 1989, С. 95.' ''■'..".'.'■"-"'' " -

с.Ъ'чог N.P., Kalakoutskii K.L., Bureakov S.A. Aooumulation о1 molybdenum by plants and mioro'organisms // 6th Intern.' Trace Element Symposium. Proceedings, Jena 1989, Y. 1, P. 239-245. З.Калакуцкий К.Л., Львов Н.П. Обнаружение белков-аккумуляторов молибдена в семенах люпина // Тезисы докл. XI Всесоюзной конф. "Биологическая роль микроэлементов и их применение в сельском хозяйстве и медицине" Самарканд 1990, С. 289-290.. 4vov И.?,, Kaiakoutskii K.L., Bureakov S.A. Accumulation ol fiolybdenua in Lupine Seeilp // Abstraots, Bth intern. Congr. of Nitrogen Fixation. Khoxville USA 1990, T-40.

' 5.Калакуцкий К.Л.,, Львов Н.П., Заболотный А.И. Белки семян люпина, связывающие молибден, вольфрам и-радионуклиды выбросов Чернобыльской АЭС // Биохимия 1991, т. 56, N 7, с. 1220-1227 б.Швецов A.A., Бурсаков С.А., Калакуцкий К.Л., Кильдибёков H.A., Львов H.H. Белок, содержащий молибдокофактор" в листьях пшеницы, ячменя и гороха // Биохимия. В печати

7.Калакуцкий К.Л., Швецов A.A., Бурсаков С.А., Летаров A.B., Заболотный А.И., Львов Н.П. Высокочувствительный метод обнаружения шлибденсодержащих белков // Биохимия. В печати.