Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Диссимиляционная нитратредукция у представителей серобактерий рода Thiothrix

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Диссимиляционная нитратредукция у представителей серобактерий рода Thiothrix"

На правах рукописи

005554728

Трубицин Иван Васильевич

А

ДИССИМИЛЯЦИОННАЯ НИТРАТРЕДУКЦИЯ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕРОБАКТЕРИЙ РОДА ТНЮТНШХ: ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА РЕСПИРАТОРНОЙ НИТРАТРЕДУКТАЗЫ, СКРИЩ1НГ ГЕНОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В ПРОЦЕССАХ ДЕНИТРИФИКАЦИИ

03.01.04 Биохимия

6 НОЯ 2014

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж — 2014

005554728

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент

Грабович Маргарита Юрьевна

Официальные Хайлова Людмила Самуиловна

оппоненты: Доктор биологических наук, старший

научный сотрудник. Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова; Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, старший научный сотрудник

Рогожин Евгений Александрович

кандидат химических наук, ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, научный сотрудник.

Ведущая организация: ФГБУН Институт биохимии и физиологии

растений и микроорганизмов РАН

Защита диссертации состоится «25» декабря 2014 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д.212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006 г. Воронеж, Университетская пл. 1., комната 59. С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета и на сайте http://www.science.vsu.ru

Автореферат разослан «2_?» -/О 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Грабович Маргарита Юрьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Процесс анаэробного дыхания на нитратах был широко распространен среди микроорганизмов древней Земли еще до появления в атмосфере свободного кислорода. Впоследствии, аэробное дыхание стало доминирующим типом, однако немало микроорганизмов сохранили способность к дыханию на нитратах, которые выполняют роль терминального акцептора электронов в электронтранспортной цепи. На сегодняшний день помимо облигатных аэробов существует немало организмов - факультативных анаэробов, сохранивших способность к анаэробному дыханию в случае создания соответствующих условий в окружающей среде.

Бесцветные серобактерии занимают водные экологические ниши, где устанавливаются динамические градиенты молекулярного кислорода, или он отсутствует. Подавляющее большинство бесцветных серобактерий принадлежит к аэробам, но, оказавшись в микроаэробных или анаэробных условиях, эти организмы испытывают кислородный' стресс, при котором индуцируются альтернативные дыхательные системы (Ройб^ е/ а!.. 1995; Мс НаИоп е/ а/., 1996). Установлено, что факультативно аэробные серобактерии, такие как Beggiatoa, ТИюрЬса, Thiomargarita, содержащие вакуоли, в которых накапливаются нитраты в высокой концентрации, выполняющие роль терминального акцептора электронов, часто являются инициаторами существенной доли общей морской нитратредукции (Ровзи^ е/ а!., 1995; Мс НаИоп сЧ я/.,1996). В связи с этим бактерии этих родов оказались важным связующим звеном между циклами серы, азота и углерода. Для представителей серобактерий рода ТЪШИгЬс способность к анаэробному дыханию в присутствии нитратов ранее не была показана. Однако возможность этого процесса не исключена, так как местообитание представителей рода ТЬШЬпх характеризуется регулярным суточным ритмом смены аэробно-анаэробного режима в приливно-отливной зоне морской литорали или в проточных водных экосистемах с высоким содержанием сульфида. Процесс смены аэробного типа дыхания на анаэробный в этом случае будет иметь глубокий экологический адаптационный смысл. В связи с этим особого внимания заслуживает процесс анаэробного дыхания денитрификации, в котором активность ферментов, участвующих в восстановлении нитратов до газообразных продуктов, индуцируется в анаэробных условиях, т.е. в условиях стресса, которым часто подвергаются прокариоты в сероводородных биотопах. Несмотря на широкий спектр прокариот, способных к анаэробному дыханию в присутствии нитратов, данных по изучению свойств респираторных нитратредуктаз, катализирующих начальную реакцию денитрификации, недостаточно вследствие трудности работы с ними. Так, для представителей рода ТЫо1]тх. которые, в соответствии с результатами недавних исследований, способны к анаэробному дыханию на нитратах, каких-либо данных об очистке респираторной нитратредуктазы нет ни в отечественной, ни в зарубежной литературе. В этой связи изучение респираторной нитратредуктазы ТЫо1ИгЬс, её очистка и характеристика выглядят интересными и актуальными задачами в области современной биохимии и микробиологии.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было выявление и изучение процесса анаэробного дыхания у представителей серобактерий рода Thiothrix, выделение и характеристика ключевого фермента диссимиляционной нитратредукции - респираторной нитратредуктазы.

Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:

1. Выявить способность к анаэробному нитратному дыханию

(NCV —> N02") среди представителей рода Thiothrix и изучить динамику процесса восстановления нитратов при анаэробном культивировании.

2. Установить структуру гена narG, кодирующего а-субъединицу респираторной нитратредуктазы, у представителей рода Thiothrix и оценить уровень его экспрессии в различных условиях культивирования.

3. Выделить респираторную нитратредуктазу в электрофоретически гомогенном состоянии из Т. lacnstris AS, изучить физико-химические свойства и кинетические характеристики этого фермента.

4. У представителей серобактерий рода Thiothrix (Т. lacustris BLT, AS: Т. caldifontis G17, G3; Т. unzii A1T, TN; T. eikelboomii AP3T; T. nivea JP2T) провести скрининг на основе идентификации функциональных генов, участвующих в процессах денитрификации (NCV —» NO —» N20 —> N2): nirS и nirK, кодирующих нитритредуктазы, qnorB и спогВ, кодирующих N0 - редуктазы, и nosZ, кодирующего N20 - редуктазу.

5. Исследовать экспрессию гена rtirS у Т. lacustris AS в аэробных и анаэробных условиях культивирования и верифицировать способность к полной денитрификации у представителей рода Thiothrix на основе синтеза N2 de novo в присутствии нитрата и закиси азота.

6. Выяснить эволюционные пути появления генов narG, nirS и спогВ у представителей рода Thiothrix.

Научная новизна

Для представителей серобактерий рода Thiothrix, считавшихся ранее облигатными аэробами, впервые показана возможность анаэробного дыхания в присутствии нитратов в качестве терминального акцептора электронов. Процесс смены аэробного типа дыхания на анаэробный имеет глубокий экологический адаптационный смысл.

Разработана схема очистки респираторной нитратредуктазы из серобактерии Thiothrix lacustris AS, позволяющая получить фермент в электрофоретически гомогенном состоянии. Изучены ее основные физико-химические и кинетические характеристики. Показано сходство фермента по температурному и рН оптимумам, термостабильности и кинетическим характеристикам с респираторными нитратредуктазами близких таксономических групп бактерий.

Установлены структуры функциональных генов (narG, nirS и спогВ) ферментов денитрификации — нитрат-, нитрит- и NO-редуктаз. Показан высокий уровень их

экспрессии в анаэробных условиях, что говорит об активной работе обнаруженных метаболических путей восстановления соединений азота. Идентифицированные в ходе выполнения данной работы гены были депонированы в ОспВапк.

Показано, что способность к денитрификации («полной» или «усеченной») может варьировать в пределах разных штаммов одного и того же вида и коррелирует с физико-химическими параметрами их среды обитания, такими как концентрация нитратов, а также сероводорода и кислорода.

Согласно филогенетическому анализу установлено, что у исследованных представителей рода ГЛ/о/Лт отсутствуют случаи горизонтального переноса генов пагО и тгБ, тогда как ген спогВ был подвергнут горизонтальному переносу перед отделением современных видов ГЛ/о/Лт от общего предка рода.

Научно-практическая значимость

Разработана схема очистки респираторной нитратредуктазы из бактерий рода ТЫоЛпх, позволяющая получить фермент в электрофоретически гомогенном состоянии. Данная схема отработана, оптимизирована с учетом особенностей изучаемого фермента и может быть использована без существенных изменений для очистки респираторной нитратредуктазы из других представителей рода 77н'огАга.

Подобраны родоспецифичные праймеры для гена пагО, что может позволить для каждого нового штамма и вида рода ТкМЪпх быстро и достоверно определить наличие или отсутствие в геноме гена а-субъединицы респираторной нитратредуктазы ЫагОШ. Также разработаны родоспецифичные праймеры для генов п\гБ и спогВ.

Полученные в ходе выполнения данной работы материалы были использованы при написании методического пособия по метаболизму соединений азота у прокариот. Учитывая новые возможности представителей рода ТЫоАлпх — способность к анаэробному дыханию на нитратах, их можно использовать для очистки водных экосистем не только от органических веществ и токсичных соединений серы, но и от нитратов.

Полученные в работе результаты могут быть использованы для чтения курсов лекций по микробиологии в высших учебных заведениях, в справочных изданиях по микробиологии.

Основные положения, выносимые па защиту:

1. Некоторые представители серобактерий рода Т1ио1Иг1Х, которых ранее относили к облигатным аэробам, способны к анаэробному дыханию в присутствии нитратов: нитратному дыханию и денитрификации. Способность к денитрификации («полной» или «усеченной») может варьировать в пределах разных штаммов одного вида и коррелирует с физико-химическими параметрами их среды обитания.

2. Нитратное анаэробное дыхание свойственно большинству представителей рода ТЪШЬпх и осуществляется при участии респираторной нитратредуктазы, которая кодируется геном пагй; последний экспрессируется в анаэробных условиях.

3. Выделенный гомогенный препарат респираторной нитратредуктазы NarGH из T. laciistris AS представляет собой гетеродимер с молекулярной массой отдельных субъединиц NarG - около 100 кДа и NarH - около 80 кДа.

4. У исследованных представителей рода Thiothrix, способных к денитрификации, из трех альтернативных нитритредуктаз (NirS, NirK и NrfA) функционирует редуктаза, которая кодируется геном nirS; восстановление окиси до закиси азота осуществляет цитохром с зависимая NO-редуктаза, которая из двух альтернативных генов (qnorB и спогВ) кодируется геном спогВ.

5. Согласно филогенетическому анализу, у исследованных представителей рода Thiothrix отсутствуют недавние случаи горизонтального переноса генов narG и nirS, тогда как ген спогВ был подвергнут горизонтальному переносу перед отделением современных видов Thiothrix от общего предка рода.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 4-х международных и российских мероприятиях: 15-ая и 16-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2011; 2012), IV Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011), 5,h FEMS Congress of European Microbiologists (Leipzig, Germany, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 4 статьи в рецензируемых изданиях, входящих в список ВАК.

Конкурсная поддержка работы. Проведенные исследования поддерживались грантом Российского фонда фундаментальных исследований № 12-04-00920а «Новые направления в исследовании метаболизма и таксономии бесцветных серобактерий: диссимиляционная нитратредукция в семействе Thiotrichaceae и новые таксоны в семействе Spirochaetaceae» и в рамках проекта Госзаказа Минобрнауки РФ № 959 «Исследование роли ферментов и альтернативных метаболических путей в адаптивных реакциях клеток эукариотных и прокариотных организмов».

Структура и объём работы. Диссертация состоит из 8 разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы, приложения. Работа изложена на 135 страницах, содержит 14 таблиц и 47 рисунков. Библиографический указатель содержит 155 источников литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектами исследования служили 9 представителей 2 групп бактерий рода Thiothrix: представители группы «Т. nivea» (Т. nivea JP2T DSM 5205, Т. laciistris BLT DSM 21227, Thiothrix laciistris AS "UNIQEM" 905 , T. caldifontis G1T DSM 21228, T. caldifontis G3 "UNIQEM" 981, T. unzn A1T ATCC 49747, T. unzii TN "UNIQEM" 959), и группы «Eikelboora type 02 IN» (T.ßexilis EJ2M-BT DSM 14609 и T. eikelboomii AP3T ATCC 49788).

Состав сред и условия культивирования. Для культивирования бактерий использовали среду Амбрустера (Armbruster, 1969) с модификациями. При культивировании Т. laciistris AS в среду перед посевом вносили NaCl в концентрации 10 г/л. Бактерии культивировали в диапазоне температур 22-27 °С. Для анаэробного культивирования использовались два подхода: а) культивирование в пробирках Хангейта, которые полностью заполняли свежеприготовленной стерильной прокипяченой средой с добавлением 0,5 г /л NaNCb; б) культивирование в пробирках Хангейта, где соотношение среды и газовой фазой составляло 1:1. Газовая фаза была создана путем продувки аргоном (если нитрат акцептор электронов) или закисью азота (если закись азота акцептор электронов). Газы стерилизован! фильтрацией (Millipore, 0,2 мкм).

Выделение геномной ДНК представителей рода Thiotb-ix производили при помощи набора Genomic DNA Purification Kit (Fermentas) согласно протоколу производителя. Качество выделенной геномной ДНК определяли электрофоретически в 0,8 % агарозном геле с бромистым этндием (1 %).

Реакцию обратной транскрипции проводили в соответствии с протоколом фирмы изготовителя (Fermentas, Литва).

ПЦР амплификацию ДНК проводили в смесях для ПЦР с добавлением матрицы ДНК (0,25 мкг/мл) и олигонуклеотпдов (5 мкМ каждый). ПЦР в реальном времени проводили на амплификаторе ДТ-322 (ДНК-Технология) с использованием интеркалнрующего в двуцепочечную ДНК флуоресцентного красителя Sybr Green I.

Очистку ПЦР-фрагментов производили при помощи электрофореза в 0,8 % геле легкоплавкой агарозы в однократном ТВЕ-буфере. В качестве маркера использовали коммерческий набор маркеров HyperLadder IV (Fermentas). Электрофорез проводили при напряжении 140 В, силе тока до 110 мА в течение 20-25 мин. В качестве красителя использовали 1 % бромистый этидий. Выделение и очистку ДНК из геля проводили с использованием коммерческих наборов DNA Extraction Kit (Fermentas) и Wizard SV Gel и PCR Clean-Up System (Promega) согласно инструкциям производителей. Эффективность выделения, а также концентрацию полученных фрагментов ДНК анализировали электрофоретически.

Определение нуклеотидной последовательности проводили в НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН ГУ на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL ("Beckman Coulter", США) в соответствии с протоколом изготовителя.

Для построения филогенетических деревьев использовались выровненные в программе ClustalW2 (http://www.genome.ip/tools/clustalw/) аминокислотные последовательности. В качестве референсных использовались частичные и полные последовательности генов narG, nirS и спогВ, 150 бактериальных и архейных изолятов, которые были получены из базы данных FGPR. Деревья были построены в программе MEGA 5 (Tamura et al., 2011).

Диализ анионов. Концентрацию нитрита определяли модифицированным методом Грисса-Илосвая (Уильяме, 1982), с использованием в качестве красителя нафтилэтилендиамин ацетата, концентрацию нитрата - методом титрования хромотроповой кислотой в присутствии H2SO4 (Уильяме, 1982) и с помощью нитратомера ИТ-1201 ООО «Измерительная техника» (Россия). Ионы аммония определяли с реактивом Несслера при длине волны 400 нм (Milner and Miller, 1948) на спектрофотометре UV-1650

PC (Shimadzu, Япония). Молекулярный азот определяли на газовом хроматографе Хроматек Кристалл 5000.1 (Россия).

Для определения активности ннтратредуктазы использовали следующую реакционную смесь: 0,2 М натрий-фосфатный буфер (pH 7,3), 0,01 М NaNCb, 0,01 М метилвиологен. К 800 мкл смеси добавляли 5 мкл пробы. Реакцию инициировали внесением в реакционную среду 100 мкл 0,1 М дитионита натрия. Продолжительность экспозиции — 10 мин. О наличии активности фермента судили по концентрации образовавшихся нитритов.

Очистку респираторной ннтратредуктазы из бесклеточного экстракта Thiothrix lacustris AS проводили по следующей схеме:

Стадия 1. Гель-фильтрация на колонке HiLoad 26/60 Superdex 200 (GE Healthcare, Швеция). Препарат фильтровали через бумажные фильтры Whatman GD/X (диаметр пор 0,2 мкм) и наносили на колонку, предварительно уравновешенную буфером А (50 мМ Трис-НС1 - pH 7,35, 100 мМ NaCl). Скорость потока 1 мл/мин. Детектирование поглощения осуществляли при /,=280 нм.

Стадия 2. Анионообменная хроматография. Далее препарат белка наносили на колонку Mono Q HR 16/10 (GE Healthcare, США), предварительно уравновешенную буфером А без NaCl. Затем через колонку пропускали четырехкратный объем буфера А без NaCl для удаления несвязавшихся с неподвижной фазой колонки компонентов. Вещества элюировали в линейном градиенте концентрации NaCl (150 - 350 мМ) за 20 минут, измерения проводили при /.=280 нм.

Стадия 3. Препаративный электрофорез в полиакриламидном геле с градиентом концентрации 4-10 % в системе для кислых белков. Локализацию ннтратредуктазы в пластинке геля определяли, проведя специфическое окрашивание: пластинку геля выдерживали в смеси Б [0,2 М натрий-фосфатный буфер (pH 7,3), 0,01 М NaN03, 0,01 М метилвиологен] 7-15 мин при 60 °С до появления бесцветной полосы на синем фоне. Участок геля, содержащий фермент, вырезали, измельчали механически, смешивали с 50 мл буфера А и экспонировали 18 часов при 4 °С для перехода белка в раствор.

Стадия 4. Повторная анионообменная хроматография. Раствор белка в буфере А после препаративного электрофореза был повторно нанесен на колонку Mono Q, предварительно уравновешенную тем же буфером. Фермент элюировали в линейном градиенте концентрации NaCl 0 - 1 М за 10 минут, измерения проводили при >.=280 нм.

Молекулярную массу нативного фермента определяли по результатам нативного электрофореза в полиакриламидном геле с использованием набора маркеров High Molecular Weight Native Marker Kit (GE Healthcare). Белковые полосы проявляли по Fairbanks (1971) с модификациями. Окрашивание проводили с помощью красителя Serva BlueR.

Для определения субъединичного состава респираторной ннтратредуктазы и массы отдельных субъединиц использовали денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле по методу Laemmli (1970) с 0,1 % SDS в 10 % полиакриламидном геле (ПААГ) с помощью аппарата Mini-Protean (Bio-Rad, США). Пробы, содержавшие белок, перед нанесением смешивали с двумя объемами буфера для образцов и кипятили на водяной бане в течение 10 мин. Окрашивание проводили с помощью нитрата серебра (Покусаева и др, 2012).

Значения Km и Vm„ определяли с помощью графика зависимости активности фермента от концентрации субстрата. Расчеты проводили в двойных обратных координатах (1/V и 1/[S]) по графику Лайнувера-Берка (Диксон и Уэбб. 1982: Лакин. 1990). Измерения проводили спектрофотометрически.

Концентрация белка была определена по методу Braadford в соответствии с рекомендациями производителя, а также по методу Лоури (Lo\vry et al. 1951). В качестве стандарта использовали BSA.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

На сегодня для прокариот показаны следующие пути диссимиляционного восстановления нитратов при анаэробном дыхании:

Ñrf

Группы ферментов: Nar / Nir Nor Nos

N03- ->NOy _»NO N,0 -> N, NH4*

1. Анаэробный рост н динамика восстановления нитратов и образования

нитритов.

Способность к анаэробному дыханию была проверена у 7 представителей двух групп Thiothrix. В качестве контроля использовали штаммы, для которых ранее был получен геномный сиквенс Т. nivea JP2T (Lapidus et al., 2011), T.Jlexilis EJ2M-B7 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/14260) и T. disciformis B3-1T (http://www.ncbi. nlm.nili.gov/genome/14257).

- Концентрация тиосульфата натрия мм

- Концентрация белка (мг)

Продолжительность инкувиромиил (ч)

■ -о- - Концентрация ионов нитрита мМ - -» — Концентрация ионов нитрата ММ

Рис. 1. Динамика окисления тиосульфата, восстановления нитрата, накопления нитрита и прироста белка при анаэробном культивировании Т. ¡асшичз АБ.

Все исследованные штаммы в присутствии доноров электронов: органического субстрата (лактат + ацетат) и тиосульфата (миксотрофный рост) были способны к росту в анаэробных условиях в присутствии нитратов в качестве терминального акцептора электронов. Максимальный прирост белка составил для разных штаммов от 10,6 до 15,0 мг белка/л (табл. 1, рис. 1) и был отмечен через 72 ч. Анаэробный рост у данных микроорганизмов сопровождался убылью нитратов в среде культивирования и накоплением нитритов, концентрация которых составила

9

81-85 % от восстановленных нитратов (рис.1). В отсутствии нитратов, но в присутствии органического субстрата и тиосульфата, роста бактерий в анаэробных условиях не происходило. Накопления ионов аммония в среде культивирования обнаружить не удалось. При накоплении в среде выше 0,3-1,3 мМ нитритов было отмечено их ингибирующее влияние на бактериальный рост.

Так же была определена суммарная активность нитратредуктаз в аэробных и анаэробных условиях роста. При аэробном росте активность нитратредуктазы у разных штаммов не превышала величин 3,91-11,08 нмоль • мин-1 ■ мг белка-1. При анаэробном росте активность фермента возрастала до 21,08^13,47 нмоль • мин-1 • мг белка-1, т.е. суммарная активность нитратредуктаз была в 5 раз выше.

Можно предположить, что у исследованных штаммов в анаэробных условиях столь существенное увеличение суммарной активности нитратредуктаз происходит за счет синтеза респираторной нитратредуктазы.

2. Очистка и характеристика респираторной нитратредуктазы Т. lacustris AS

Разработанная схема очистки мембраносвязанной нитратредуктазы включала следующую последовательность из 5 этапов: ультразвуковую дезинтеграцию биомассы, гель-фильтрацию на колонке HiLoad 26/60 Superdex 200 (GE Healthcare), анионообменную хроматографию на колонке Mono Q HR 16/10 (GE Healthcare), препаративный электрофорез в градиентном полиакриламидном геле (табл. 1).

Таблица 1. Таблица очистки респираторной нитратредуктазы.

Стадия очистки Общий объём, мл Белок, мг Общая активность, Е Удельная активность, Е/мг Выход % Степень очистки

Гомогенат 18 626,4 780,84 1,24 100 1

Гель-фильтрация на 8ирег<1ех 200 29 200,1 538,82 2,69 69 2,2

Анионообменная хроматография на Мопо<2(0,15-0.45М ЫаС1) 3 25,2 195,78 7,76 25 6,3

Препаративный электрофорез в ПААГ 21 2,1 86,94 41,4 11 33,4

Анионообменная хроматография на МопоСЗ (0-1М ЫаС1) 1,5 0,36 35,19 97,75 4,5 78,8

В качестве конечной стадии очистки повторно использовали анионообменную хроматографию на колонке Mono Q HR 16/10 в широком градиенте NaCl, что позволило дополнительно сконцентрировать препарат белка для дальнейших исследований. Предварительные исследования термостабильности белка показали возможность использования препаративного электрофореза и колоночной хроматографии при температуре 20-22 °С.

3. Свойства респираторной нитратредуктазы

По данным денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле показано, что очищенная нитратредуктаза ЫаЮН представляет собой гетеродимер с молекулярной массой субъединиц ЫаЮ - около 100 кДа и №гН - около 80кДа (рис. 2 А). Молекулярная масса очищенного препарата фермента, определенная с помощью нативного электрофореза, составила 170 кДа (рис. 2 Б)

Рис. 2. ПААГ-электрофорез очищенного препарата нитратредуктазы.

А - денатурирующий электрофорез в 10 % ПААГ; Ml - Белки-маркеры: Protein Marker, Broad Range (New England Biolabs). M2 - Prestained Protein Molecular Weight Marker (Fermentas): Окрашивание нитратом серебра. Б - нативный электрофорез в" ПААГ с градиентом концентрации 4-10 %; МЗ - Белки-маркеры: High Molecular Weight Native Marker Kit (GE Healthcare); окрашивание проводили с помощью красителя Serva Blue R. 1— очищенный препарат нитратредуктазы; специфическое окрашивание препарата нитратредуктазы на активность.

Влияние рН. Исследование зависимости скорости окисления доноров электронов. таких как метилвиологен. бензилвиологен и бромфеноловый синий (для восстановления донора электронов использовали дитионит натрия) от рН среды показало, что оптимальное значение рН для работы нитратредуктазы - 7.2 - 7.3. 6.0 - 6.2 и 8,4 - 8.6. соответственно (рис. 3).

5 6 7 В 9 10 11

■ Метилвиологен —•— Бензилвиологен Рн буфера —о— Бромфенол

Рис. 3. Зависимость активности нитратредуктазы от рН среды.

Влияние температуры. Изучение влияния температуры на активность нитратредуктазы выявило, что температурный оптимум фермента лежит в пределах от 63 °С до 65 °С (рис. 4). при повышении температуры вплоть до 100 °С активность фермента падала. При этом в температурных границах от 5 °С до 25 °С, в которых живёт Т. 1аыШг15 А8, активность нитратредуктазы составила менее 2 % от максимального значения.

Рис. 4. Температурный оптимум респираторной нитратредуктазы.

Исследование термостабильности фермента показало, что при инкубировании нитратредуктазы при 50 °С фермент терял 50 % своей начальной активности за 2 часа, при повышении температуры до 60 °С происходило снижение активности до 30 % от начального уровня в течение 1 часа экспозиции (рис. 5).

О 50 100 150 200 250

—•— 50 гаадусов —о—60 гоадусов Время тин

Рис. 5. Термостабильность респираторной нитратредуктазы.

Кинетические характеристики фермента были определены с использованием №N03 в качестве субстрата в стандартной реакционной смеси при 60 °С. Величина Кга по нитрату составила 0,234 мМ; Утах - 0,945 Е/мг белка, Утах/Кт- 4,03

Ингибиторный анализ. Бета-меркаптоэтанол и азид натрия уже в концентрации 10-50 мМ существенно ингибировали нитратредуктазу (рис. 6), в то время как ЭДТА, диэтилдитиокарбамид натрия и фенантролин оказывали слабый ингибирующий эффект.

Рис. 6. Влияние ингибиторов (А - азида натрия, Б - бета-меркаптоэтанола) на активность респираторной нитратредуктазы, выраженное через зависимость оптической плотности реакционной смеси от концентрации ингибитора.

4. Идентификация и изучение экспрессии гена пагС, кодирующего респираторную нитратредуктазу.

Для подтверждения способности представителей рода 77мо/йг/х к нитратному дыханию, в результате которого нитраты восстанавливаются до нитритов при участии респираторной нитратредуктазы (2ишй, 1997), была проведена идентификация гена пагй\ выделена геномная ДНК. проведена ПЦР-амплификация с использованием пары вырожденных праймеров. подобранных к гену пагй (пага960 ¥/пагС2659К). У 7 исследованных штаммов ТИЫИпх были выявлены ампликоны ожидаемой величины - около 650 п.н. Нуклеотидные последовательности ПЦР-продуктов были определены и помещены в ОепВапк под номерами .1X267821 (Т. саШ'фШЫ вГ), .1X267822 (Т. еШЬооти АРЗТ), .1X267823 (Т. ити А1т). 1X267824 (Т. Iасиэ/то ВЬТ), 1X267825 (Т. 1асШш Ав), КР926097 (Т. са/сН/опШ 03). К1-039721 (Т. ипш ТЫ).

Сравнение полученных нуклеотидных последовательностей с последовательностями, имеющимися в базе данных Т\!СВ1, показало, что они имеют высокую степень гомологии с фрагментами гена пагО других прокариот, в частности, На\отопа$ 1га1ойепИпАсат №0 14912 (номер в ОепВапк АВ076402.2). Степень гомологии составила 75,5-76.3 %. Ген пен-й не был обнаружен у Т.тчеа .ТР2т и Т. (Иб^огппб ВЗ-11. Для представителей Т. ¡асгШт АЭ, В|/. Т. саМтропШ О Г, 1. ипш А1Т, та и Т. еИсеШоотИ АРЗТ, была выделена тотальная РНК, получена кДНК и проведена ОТ-ПЦР. При проведении ОТ-ПЦР в пробах, содержащих кДНК, полученную из мРНК культуры, растущей в анаэробных условиях, наблюдался интенсивный синтез ампликонов (детекция начиналась на 26-27 циклах ПЦР). При аэробном росте культуры синтеза ампликона ожидаемого размера не наблюдалось (рис.7) или же он был очень слабым.

° * # ^ ^

Концентрация ингибитора мМ

Рис. 7. Анализ уровня экспрессии гена narG у Т. lacustris AS при культивировании в анаэробных условиях относительно аэробных.

1 - аэробные условия культивирования,

2 - анаэробные условия культивирования, треугольниками показано увеличение концентрации кДНК в пробе (2 мкл, 4 мкл). М -маркеры ДНК FastRuler DNA Ladder Mix (Fermentas).

5. Исследование метаболических путей восстановления нитрита при анаэробном дыхании у представителей рода ТИШИт

Для того, чтобы выявить способность представителей рода ТЪШкгЫ, имеющих ген пагО, к дальнейшему восстановлению нитритов, мы проверили их способность к образованию N2 при анаэробном росте в присутствии нитратов и закиси азота. В этом эксперименте бактерии культивировали в анаэробных условиях во флаконах с газовой фазой: газовую фазу при анаэробном росте в присутствии нитратов создавали вытеснением воздуха аргоном, а газовую фазу при анаэробном росте в присутствии Ы20 создавали вытеснением воздуха N20. Удалось зафиксировать увеличение концентрации молекулярного азота (концентрация N2 возрастала в 3-4 раза в % от газовой фазы) при росте на нитратах у Т. са1сИ/опИя С1 и вЗ, Т. ипгИ А1, Т. 1асшМя Ав, а при росте в присутствии - у Т. са1сИ/опИ8 и ОЗ, Т. иши А1 и ТК, Т. ¡асияичв А8. Процесс роста сопровождался увеличением концентрации белка (до 10 мг/л) и окислением тиосульфата (до 1 мМ). Полученные предварительные данные свидетельствуют о возможности денигрификации с восстановлением нитратов до молекулярного азота. Для выяснения этого процесса в дальнейшем мы использовали молекулярные методы исследования.

6. Скрининг функциональных генов, участвующих в диссимнляцнонпых реакциях восстановления нитритов, окиси и закиси азота Детекция нитритредуктты. Для подтверждения наличия нитритного дыхания, в результате которого нитриты восстанавливаются до ЫН4+ (ген пг/А) или N0 (гены тгБ или тгК) была проведена идентификация соответствующих генов у представителей рода ТЫо^тх. Реакцию восстановления нитритов до аммония осуществляет нитритредуктаза №1А. По результатам амплификации с праймерами пг/А^\/пг/А1К.\ наличие ПЦР продукта ожидаемой длины в 520 п.н. ни у одного из зучаемых организмов не было выявлено, что согласуется с отсутствием в среде культивирования ионов аммония.

М (H.H.)

Для идентификации гена nirS использовалась пара праймеров nirS lF-E7/nirS 6R-F7. ПЦР амплификация геномной ДНК штаммов Thiothrix дала продукт ожидаемой величины (850-870 п.н.) только для штамма Т. lacustris AS. Секвенирование полученного продукта подтвердило его специфичность. Нуклеотидная последовательность фрагмента гена nirS Т. lacustris AS была помещена в GenBank под номером КС855765.

На основе полученной нуклеотидной последовательности фрагмента гена nirS из штамма Т. lacustris AS, а также последовательностей генов nirS, доступных в базе данных NCBI (Alphaproteobacterium 4N: JX827176, Paracoccus sp. R-26466: AM230902, Halomonas denitrificans A113: GQ384047, Uncultured bacterium clone M-E6: HQ427982) была разработана пара специфичных праймеров. Последовательности были выровнены с использованием программы Alibee -Multiple Alignment Tool (www.genebee.msu.su/services/malign reduced.html). были идентифицированы консервативные участки, имеющиеся практически во всех выровненных последовательностях. К данным участкам были подобраны специфичные праймеры: nirS_AS-F и nirS_AS-R. позволяющие амплифицировать фрагмент гена nirS величиной 412 пар нуклеотидов. Г1ЦР со специфичными праймерами показала наличие продуктов ещё у трёх штаммов: Т. unziiM1, Т. caldifontisGl1, Т. caldifontis G3 (рис. 8).

п.м Ml 2 3 i 5 6 7 8 « 10 М

1000 $00 — да--- .

100

Рис. 8. Электрофорез в агарозном геле (1,2 %) продуктов ПЦР-амплификации, полученных с использованием специфичных праймеров (nirS_AS-F и nirS_AS-R) к гену nirS.

1 - Т. eikelboomii АРЗТ; 2, 3 -Т. imzii А1т; 4 -Т. unzii TN; 5 — Т. nivea JP2T; б -Т. flexilis EJ2M-BT; 7 — Г. lacustris AS; 8- Т. Lacustris BLT; 9- Т. caldifontis G1T; 10-Г. caldifontis G3. M - маркеры ДНК O'GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas).

Продукты были очищены и определены их нуклеотидные последовательности, которые были помещены в GenBank под номерами КС855767 (Т. unzii Al1), КС855768 (Т. caldifontisG\\ KF926096 (Т. caldifontisGl). У других исследованных штаммов рода Thiothrix: Т. nivea JP2 , Т. lacusti ■is BL , Т. unzii TN. Т. eikelboomiiAP3T, Т. Flexilis EJ2M-BT не были обнаружены продукты гена nirS.

Для Т. 1асш1г15 АБ из клеток, выросших как в аэробных, так и в анаэробных условиях, была выделена тотальная РНК. С помощью обратной транскрипции со специфичными для гена пггЗ праймерами была получена кДНК и проведена ОТ-ПЦР. Сравнительный анализ показал, что в пробах, содержащих кДНК. полученную из мРНК культуры, растущей в анаэробных условиях, наблюдался интенсивный синтез ампликонов. тогда как в пробах, соответствующих аэробному росту, синтеза данного продукта не было (рис. 9). Следовательно, при анаэробном культивировании наблюдается экспрессия гена тгБ, а результаты ОТ-ПЦР в пробах из аэробной культуры указывают на отсутствие экспрессии гена nirS при аэробном культивировании.

1 2 м (мкл кДНК)

Рис. 9. Анализ уровня экспрессии гена nirS у штамма Т. lacustris AS при культивировании в анаэробных условиях относительно аэробных.

1 - аэробные условия культивирования.

2 - анаэробные условия культивирования. М -маркеры ДНК 100 bp DNA Ladder (New England Biolabs).

Реакцию восстановления нитритов до окиси азота, как известно, могут осуществлять взаимоисключающие диссимиляционные нитритредуктазы, кодируемые генами nirK и nirS (Smith et al., 2007). По результатам амплификации участка гена nirK с праймерами (nirKlF/nirK5R) наличие ПЦР продукта ожидаемой длины (514 п.н.) ни у одного из изучаемых организмов не было выявлено.

Детекция NO-редуктазы и N20-редуктты. Для обнаружения генов спогВ и qnorB, кодирующих цитохром-с и хинол-зависимые NO-редуктазы, использовались вырожденные праймеры cnorB2F/cnorB6R и qnorB2F/qnorB7R, соответственно. По результатам амплификации участка гена спогВ продукты ожидаемой длины (390 п.н.) были получены для штаммов Т. unzii TN, Т. lacustris AS и Т. caldifontis G3.

Продукты были очищены, определены их нуклеотидные последовательности. Полученные последовательности гена спогВ были помещены в GenBank под номерами KF977407 (Т. unzii TN), KF926095 (Т. lacustris AS), KJ419278 (Т. caldifontis G3). У других исследованных штаммов рода Thiothrix - Т. nivea JP2T. Т. lacustris BLT, Т. caldifontis G1T, Т. eikelboomii AP3T. Т. flexilis EJ2M-BT с вырожденными праймерами не были обнаружены продукты гена спогВ.

На основе полученных нуклеотидных последовательностей фрагментов генов спогВ из штаммов Т. lacustris AS, Т. caldifontis G3 и Т. unzii TN была разработана

пара специфичных праймеров: cnorBThF/cnoi'BThR, позволяющих амплифицировать фрагмент гена спогВ величиной 208 пар нуклеотидов. ПЦР амплификация геномных ДНК штаммов Thiothrix с использованием специфичных праймеров показала наличие продуктов еще у двух штаммов (рис. 10). Полученные фрагменты генов спогВ были помещены в GenBank под номерами KJ748493 (Т. unzii А1Т), KJ748494 (Т. caldifontis Gl1).

Рис. 10. Электрофорез в агарозном геле (1.2 %) продуктов ПЦР-амплификации. полученных с использованием специфичных

праймеров cnorBThF/cnorBThR. 1 -Т. eikelboomii АРЗТ; 2 -Т. unzii А1Т; 3 -Т. unzii TN; 4 -Т. nivea DSM 5205т; 5 - Т. lacustris AS; б —Т. lacustris BL1; 7 — 7". caldifontis G1T; 8 -Т. caldifontis G3. M -маркеры ДНК O'GeneRuler DNA LadderMix.

Для обнаружения одного из генов (nosZ), кодирующих Ы20-редуктазу (NosRZDFYLX), были использованы вырожденные праймеры Nos661F/Nosl773R (1112 п.о.) и nosZF/nosZR (700 п.н.). По результатам амплификации участка гена nosZ продукты ожидаемой длины ни у одного из изучаемых организмов не были выявлены. Однако, учитывая способность некоторых представителей рода Thiothrix при анаэробном дыхании образовывать молекулярный азот при росте на нитратах и закиси азота (см. раздел 5), мы можем предположить наличие гена nosZ у этих бактерий. Вероятно, использованные праймеры не подходят для данной группы бактерий.

7. Филогенетический анализ

В результате проведения филогенетического анализа аминокислотных последовательностей субъединиц NarG, NirS и СпогВ бактерий рода Thiothrix были построены филогенетические деревья. Последовательности NarG (рис. 11 А) и NirS штаммов рода Thiothrix тесно сгруппированы и являются частью филогенетического кластера. объединяющего большинство представителей класса Gammaproteobacteria.

Филогенетический анализ субъединиц СпогВ показал, что последовательности из представителей Thiothrix плотно сгруппированы, но эта группа окружена последовательностями в основном, принадлежащими представителям Betaproteobacteria (рис. 11 Б).

Полученные результаты могут означать, что ген спогВ был подвергнут горизонтальному переносу генов перед разделением современных видов рода Thiothrix от последнего общего предка этого рода, гены narG, и nirS были изначально представлены в геноме Thiothrix и горизонтальному переносу не подвергались.

РлитЬсаегЪкгог

■ йе1:орлхеоЬоспгю П Г/гтктЛо

■ А1рЬаргыеоЬааег1а Ш ВеюргогеоЬосгег и

■ Е>фтг1Ьосигть

■ С атт аршеоЬсаег1а 0 ЕитуагсЬаеоЮ

й СггоогсЛоеЛо

■ Ас<1поЬааег1а 13) СЫуХ1одепаея

■ Мпососаа-ТЪсгппа

НетЫпрМЧат, СаШ'орю

РоеЫЬосг11иг. Ярогтип/пи. ихтЬисШи*. Опи1рюЫк<г-*шп

~~ТЬеттасгае

Пгкгт/Ьопггасеог

и ЛСМЭ934 СгЫжПт кгЪу'

■ А1рЬарго;еоЫ>аег1а

■ Вехарг&еоЬсаепа

■ всттаргокЫюаегю

Б

I____________Ж*—

■ ЗЛ1.ЭД62 №МпЧС1 дгМтп

(ЩЙ-ЯАОМ15Я

кжвы ММ

ЯЛАУПЗМ кодекс ауг'тг! .«И^ШЕЛУЛЮэ ибтом едпчо»

_Е5,-ШЕД013М МгМлИнхяг аЛсИрНкв

■САШЯ05 КГЯММЫУ* ОгМ/кхт

Рис. 12. Филогенетические деревья, построенные на основе сравнительного анализа аминокислотных последовательностей альфа-субъединицы дыхательной нитратредуктазы [ЫагО (А)] и Ы0-редуктазы субъединицы В. (спогВ).

Цифрами показана достоверность ветвления (представлены значения более 50 %). Масштаб соответствует 10 % различию между аминокислотными последовательностями.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Особенности полученного препарата белка. В данной работе для выделения респираторной нитратредуктазы из Т. ¡асихичх А8 была применена специально разработанная схема быстрой четырехстадийной очистки фермента. В результате был выделен и очищен до электрофоретически гомогенного состояния ключевой фермент процесса диссимиляционной нитратредукции - респираторная нитратредуктаза №гО! I. Респираторная нитратредуктаза является комплексом из 3 субъединиц: №Ю, №г11, №г1. Выделенный препарат респираторной нитратредуктазы КагвН из Т. 1аси.<Иг1.ч Ав представляет собой гетеродимер с молекулярной массой субъединиц ЫаЮ - около 100 кДа и №гН - около 80 кДа. Потеря субъединицы №г1 вероятно произошла в процессе очистки фермента, что иногда встречается в процессе очистки респираторной нитратредуктазы (2ишй, 1997). Субъединица Ыаг1 закрепляет весь комплекс на внутренней стороне мембраны и осуществляет транспорт электронов к активному центру, тем самым не влияя непосредственно на каталитическую активность нитратредуктазы.

В лабораторных условиях нитратредуктаза получает электроны от восстановленного метилвиологена, что позволило исследовать все основные физико-химические параметры и кинетические характеристики фермента без вспомогательной субъединицы №г1.

На полученном препарате белка были изучены физико-химические и кинетические характеристики респираторной нитратредуктазы, выявлены сходства и различия с нитратредуктазами других прокариот. Одним из отличий данного фермента от изученных ранее является величина субъединицы ЫагН - 80 кДа, при том, что у большинства организмов молекулярная масса №гН не превышает 70 - 75 кДа.

Анаэробное культивирование Т. 1асиз1г1з А8 характеризуется низким относительным приростом биомассы. С другой стороны, применяемая в данной работе схема очистки нитратредуктазы требовала большого объема биомассы (по причине низкого выхода белка, в связи с особенностями примененных методов очистки). Для решения этой проблемы была разработана специальная схема культивирования, при которой бактерии культивировались в ферментере в аэробных условиях с непрерывным перемешиванием и аэрацией. В таких условиях объем биомассы возрастал в 20 - 40 раз за 72 часа культивирования. При достижении максимального прироста биомассы аэрацию прекращали и культивировали бактерии еще 24 часа в анаэробных условиях, что приводило к индукции синтеза респираторной нитратредуктазы. Таким образом, удалось в короткие сроки получить большой объем биомассы, содержащей исследуемый фермент.

Разработка схемы очистки фермента и обоснование использования конкретных методов. В данной работе для очистки фермента были использованы методы колоночной хроматографии и препаративного электрофореза в полиакриламидном геле. Остановимся подробнее на каждой ступени очистки.

Первым этапом после получения супернатанта стала гель-фильтрация на Superdex 200. Предварительно посредством постановки электрофореза в ПААГ и специфического окрашивания на активность нами была определена масса искомого фермента, она составила 170 - 180 кДа. Это позволило посредством гель-фильтрации отделить все фракции с белком молекулярной массой менее 150 кДа.

Таким образом, удалось более чем в 3 раза снизить общий объем белка без существенной потери активности. Анионообменная хроматография на колонке Mono Q HR 16/10 помимо разделения белков по заряду позволила сконцентрировать белковый препарат. Предварительно была экспериментально рассчитана концентрация NaCl, необходимая для элюции нитратредуктазы. Белок элюировали в узком градиенте NaCl, что позволило снизить общий объем белка в 8 раз. На выходе мы получили концентрированный препарат белка в небольшом объеме, что позволило использовать в качестве следующего этапа очистки препаративный электрофорез. Для проведения электрофореза использовали полиакриламидный гель с градиентом концентрации разделяющего геля 4 - 10%. Это позволило получить узкую полосу целевого белка.

Целесообразность применения препаративного электрофореза в ПААГ в качестве этапа очистки фермента является спорной, так как в процессе электрофореза неизбежен нагрев разделяющего геля даже при использовании дополнительного охлаждения. Кроме того, по завершении процесса может возникнуть ряд проблем с выделением белка из геля. В нашем случае данный метод был выбран по двум причинам. Во-первых, респираторная нитратредуктаза NarGHI из Thiothrix lacustris AS является термостабильным ферментом. Термостабильность нитратредуктазы была определена ранее на частично очищенном препарате. Во-вторых, при использовании электрофореза удалось снизить общий объем белка в 1112 раз. Для перехода белка в растворенное состояние полоску геля, содержащую белок вырезали, измельчили и смешали с большим (30-кратным) объемом буфера для облегчения процесса диффузии.

Таким образом, был получен большой объем препарата белка с низкой концентрацией и степенью очистки 33. Завершающим этапом очистки была повторно выбрана анионообменная хроматография на колонке Mono Q. Для элюции использовали более широкий градиент NaCl, сократив при этом продолжительность элюции, что привело к концентрированию препарата белка. Для дальнейшей работы была отобрана фракция, соответствующая не всему пику белка, а лишь его центру. Это позволило получить гомогенный препарат респираторной нитратредуктазы в концентрации, достаточной для дальнейшей работы по изучению свойств фермента.

Недостатком примененной схемы очистки можно назвать большие потери целевого белка на стадии электрофореза и повторной анионообменной хроматографии. Однако в целом считаем данную схему очистки оптимальной для выделения респираторной нитратредуктазы из Thiothrix.

Особенности дисснмиляцноннон нитратредукции у представителен рода Thiothrix. Впервые у широкого круга представителей рода Thiothrix исследована

способность к анаэробному дыханию в присутствии нитратов. Были исследованы семь видов из девяти, поддерживаемых в международных коллекциях микроорганизмов (Т. nivea JP2T, Т. lacustris BLT, Т. lacustris AS, Т. caldifontis G1T, Т. umii A1T, T. unzii TN, T. eikelboomii AP3T, T. disciformis ВЗ-Г, T.flexilis EJ2M-BT). У восьми штаммов пяти видов (Г. lacustris BL\ AS, Т. caldifontis G1 T, G3, T. unzii A1T, TN, T. eikelboomii AP3T, T. flexilis EJ2M-BT) обнаружена способность к анаэробному нитратному дыханию.

Показано, что при анаэробном росте на нитратах последние восстанавливаются до нитритов. У исследованных представителей рода Thiolhrix выявлено наличие в клетках гена narG, кодирующего альфа-субъединицу респираторной нитратредуктазы NarGHI, и показана его экспрессия при анаэробном культивировании бактерий. Вопрос о дальнейшем восстановлении нитритов оставался открытым. С целью выяснения этого вопроса у 4 видов из 9, поддерживаемых в международных коллекциях микроорганизмов, нами была исследована способность к денитрификации, т.е. к восстановлению оксидов азота до газообразных продуктов (табл. 2).

Таблица 2. Способность к денитрификации у представителей рода Thiothrix

Этапы денитрификации и параметры, указывающие на их наличие сл < С J я so и н < 2 н f— 0 1 sa 0 с н го

.2 .д S CJ

н н Е-; к;

Ген nar G + + + + + +

no,->no2- Продукт + + + + + +

Ген nirS + - + - + -

NCV--NO Продукт но но но но но но

Ген спогВ + - + + + -

NO — N.O Продукт но но но но но но

Ген nosZ

n2o — n2 Продукт + но + +* + но

Примечание: но - не определяли; * - N2 был обнаружен только при росте с N¡0

Оказалось, что 5 штаммов из 3 видов обладают способностью к денитрификации. Т.1ас¡«/га АБ, Т. саЫ'фп/й 01т, Т. саЫ'^оМ'к ОЗ, Т. ипга А1т способны восстанавливать нитрит до окиси и закиси азота (обнаружен ген кодирующий нитритредуктазу и показана его экспрессия в анаэробных условиях, спогВ,

кодирующий цитохром-с зависимую N0-peдyктaзy), тогда как у Т. шпИ ТЫ не был обнаружен ген тгБ, но выявлен ген спогВ. Таким образом, Т. шиИ ТТЧ не способен к нитритному дыханию (не обнаружены геиы ш>5, тгК и пг/А), но способен к нитратному дыханию (обнаружен рост в анаэробных условиях в присутствии нитратов и ген па/ в) и к анаэробному дыханию в присутствии N0 (N03" —► N02; N0 —► N20), т.е. у него наблюдается «усеченная» денитрификация.

У двух штаммов 2 видов, способных к нитратному дыханию (T.lacustris BLT, Т. eikelboomii АРЗТ), способности к денитрификации не было обнаружено. Эти данные подтверждены отсутствием генов соответствующих ферментов, участвующих в этом процессе. Это можно утверждать и для Т. nivea JP2T (Lapidus el al., 2011), Т. flexilis EJ2M-B7 (http://vwvw.ncbi.nlm.nih.gov/genome/14260). Т. disciformis B3-1T (http://www.ncbi.nlni.nih.gov/genome/14257) на основе анализа геномного сиквенса (в геноме отсутствуют гены ферментов, участвующие в денитрификации).

Ни один из исследованных представителей рода Thiothrix не обнаружил способности к диссимиляционному восстановлению N02" до NH3, что подтверждается как отсутствием гена nrfA, так и отсутствием накопления NH3 в среде культивирования в качестве конечного продукта при анаэробном росте. Из двух альтернативных нитритредуктаз - NirS и NirK, ответственных за восстановление NCV ДО NO, у всех исследованных штаммов ген nirK не был обнаружен. Также ни у одного штамма не был выявлен ген qnorB, кодирующий хинолзависимые NO-редуктазы. Полученные результаты подтверждают общую закономерность, в соответствии с которой гены, кодирующие ферменты одного и того же участка метаболического пути обычно взаимоисключают друг друга (в нашем случае гены спогВ и qnorB, а также nirS и nirK).

Для штаммов, у которых обнаружен ген nirS или спогВ, среди конечных продуктов анаэробного восстановления закиси азота, было зарегистрировано образование N2 (4-х кратное увеличение по сравнению с исходным содержанием). Однако процесс восстановления закиси азота не был проанализирован количественно. Полученные предварительные данные свидетельствуют о возможности протекания дальнейшего восстановления закиси азота до N2. Детальное исследование этого процесса у представителей рода Thiothrix представляет важнейшую задачу изучения анаэробного метаболизма этой группы серобактерий.

Для представителей рода Thiothrix при реконструкции аминокислотных последовательностей субъединиц NarG и NirS на родовом уровне не было обнаружено значительных отклонений от общепринятой филогении этого рода, что свидетельствует об отсутствии недавних случаев горизонтального переноса соответствующих генов у исследованных представителей рода Thiothrix. Однако филогенетический анализ аминокислотных последовательностей субъединицы СпогВ показал, что представители Thiothrix, относящихся к Gammaproteobacteria, плотно сгруппированы, но окружены бактериями, в основном принадлежащими к Betaproteobacteria. Это может означать, что ген спогВ был подвергнут горизонтальному переносу перед отделением современных видов от общего предка представителей Thiothrix.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показана способность к анаэробному нитратному дыханию для большинства представителей серобактерий рода Thiothrix на биохимическом и

генетическом уровнях: изучена динамика восстановления нитратов до нитритов; обнаружена активность респираторной нитратредуктазы; обнаружен функциональный ген пагй, кодирующий а-субъединицу респираторной нитратредуктазы ЫаЮН1, и показана его экспрессия в анаэробных условиях.

2. Выделен и очищен до электрофоретически гомогенного состояния ключевой фермент процесса диссимиляционной нитратредукции - респираторная нитратредуктаза ЫагОН, для чего была применена специально разработанная схема быстрой четырехстадийной очистки фермента. Степень очистки составила 78,3, удельная активность фермента - 97,75 Е/мг.

3. Выделенный препарат респираторной нитратредуктазы ЫагОН из Т. 1аст1г1з Л8 представляет собой гетеродимер с молекулярной массой субъединиц ЫаЮ - около 100 кДа и №г! I - около 80 кДа.

4. Определены физико-химические параметры респираторной нитратредуктазы из Т. 1аси.ч!г1х А8: температурный и рН оптимумы фермента, составили 63 °С и 7,25, соответственно; исследована термостабилыюсть при 50 °С и 60 "С; ингибиторами фермента являются азид натрия и бета-меркаптоэтанол; оптимальный донор электронов — метилвиологен.

5. Определены кинетические характеристики изучаемого фермента: Кт по нитрату составила 0,234 мМ; Утах - 0,945 Е/мг белка, Утах/Кт - 4,03 в отношении нитрата.

6. Способность к денитрификации у представителей серобактерий рода ТИШИгЫ подтверждена по способности образовывать N2 с1с по\'о при анаэробном дыхании в присутствии оксидов азота и на молекулярном уровне: ген ш'гЗ, кодирующий нитритредуктазу, обнаружен у Т. 1ас1Шг13 А8; Т. саЫУопИя 01', 03; Т. ипгИ А1т; показана экспрессия гена я;>5 для Т. ¡асияи-'и А8; ген спогВ, кодирующий цитохром-с зависимую ЫО-редуктазу, обнаружен у Т. ¡асшМя Ав; Т. сакИ/оп!'^ 01', 03: Т. ипгиА1Т, ТЫ.

7. Показано, что ген спогВ был подвергнут горизонтальному переносу перед отделением современных видов рода ТЫойичх из последнего общего предка этого рода, в то время, как гены пагО и и/>5 были изначально представлены в геномах изучаемых микроорганизмов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность к.б.н. Антипову А.Н., к.б.н. Тутукиной М.Н., к.б.н. Колгановой Т.В. за методическую и практическую помощь в проведении биохимических и молекулярно-биологических исследований, а так же Меркель АЛО. за помощь в проведении филогенетического анализа. Автор глубоко признателен д.б.н. Грабович М.Ю. за помощь в подготовке настоящей работы и плодотворное обсуждение ее этапов. Особую благодарность автор выражает всему коллективу кафедры биохимии и физиологии клетки ВГУ, лаборатории микробной энзимологии ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН за предоставленное научное оборудование и методическую помощь в выполнении работы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, рекомендованных ВАК

1. Трубицын И.В.. Андреевских Ж.Г., Баркалова Е.В., Антипов АН. Биохимические и генетические аспекты диссимиляционной нитратредукции у представителей рода Thiothrix // Вестник Уральской медицинской академической науки. -2011. - Т 38. - Вып. 4/1. - С. 58 - 59.

2. Трубииын И. В., Андреевских Ж. Г, Юревич Л. И., Белоусова Е. В., Туптукина М. Н„ Меркель А. Ю.. Дубинина Г. А., Грабович М. Ю. Способность к нитратному дыханию как новый аспект метаболизма нитчатых серобактерий рода Thiothrix // Микробиология. -2013.-Т. 82, №1,- С. 19-26.

3. Грубииин И.В.. Грабович МАО., Тутукина М.Н. Респираторная нитратредуктаза из Thiothrix lacustris AS: очистка, физико-химические свойства и каталитические характеристики // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2014. -Т. 14. - Вып. 2. - С. 65-73.

4. Trubitsvn I. V.. Belousova Е. V., Tutukina M.N., Merkel A. Yu., Dubinina G. A., and Grabovich M.Yu. Expansion of ability to denitrification within the filamentous colourless sulfur bacteria of the genus Thiothrix // FEMS Microbiology Letters. - 2014. - V. 358. - P. 72-80.

Статьи в сборниках научных трудов, тезисы докладов

5. Трубииын И.В.. Антипов А.Н., Андреевских Ж.Г.. Баркалова Е.В., Грабович М.Ю. Выделение и физико-химические свойства нитратредуктазы Thiothrix sp. штамм AS, участвующей в анаэробном дыхании // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - 2011. - Вып. 13. - С. 184-189.

6. Трубииын И.В.. АндреевскихЖ.Г.. Белоусова Е.В., Сапельцева Ю.О.. Грабович М.Ю. Молекулярно-биологические аспекты диссимиляционной нитратредукции у представителей рода Thiothrix // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - 2012. - Вып. 14. - С. 206-210.

7. Грабович М.Ю., Белоусова Е.В., .Трубииин ИВ. Роль микроорганизмов в круговороте азота: учебное пособие. Воронеж: ВГУ. - 2014. - 65 с.

8. Андреевских Ж.Г., Трубииын И.В.. Тутукина М.А.. Баркалова ЕВ. Первый представитель рода Thiothrix, способный к диссимиляционной нитратредукции. Тезисы 15 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века». - Пущино, 2011. С 343 - 344.

9. Трубииын ИВ. Диссимипяционная нитратредукция, как альтернативный путь энергетического метаболизма в анаэробных условиях, впервые установленная для представителя рода Thiothrix / ИВ. Трубицын, Ж.Г. Андреевских, М.А. Тутукина, Е.В. Баркалова, М.Ю. Грабович // Симбиоз Россия 2011: материалы IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов. — Воронеж. - 2011. -С. 49-50.

10. Сапельцева Ю.О., Юревич Л.И., Трубииын И.В.. Андреевских Ж.Г. Диссимиляционная нитратредукция у представителей рода Thiothrix. Тезисы 16 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 -го века». - Пущино, 2012. - С 36 -37.

11. Grabovich М„ Trubits\n /.. Yurevich L„ Belousova E„ Tutukina M„ Merkel A., Dubinina G. Capacity for nitrate respiration as a new aspect of metabolism of the filamentous sulfur bacteria of the genus Thiothrix / 5th FEMS Congress of European Microbiologists: book of abstracts. Leipzig, Germany. 2013.

Подписано в печать 21.10.2014 Формат 60x84 1/16 . Бумага офисная. Усл. печ. л. 1,4 Тираж 100 экз. Заказ №2525

Отпечатано в типографии Воронежский ЦНТИ - филиал ФГБУ «РЭА» Минэнерго России 394036, г. Воронеж, пр. Революции, 30