Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ДНК-топоизомераза I человека: экспрессия, структурно-функциональная характеристика и влияние на каталитические свойства фермента новых синтетических соединений с потенциальной противоопухолевой активностью

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "ДНК-топоизомераза I человека: экспрессия, структурно-функциональная характеристика и влияние на каталитические свойства фермента новых синтетических соединений с потенциальной противоопухолевой активностью"

На правах рукописи

Суханова Алёна Владимировна

ДНК-ТОПОИЗОМЕРАЗА I ЧЕЛОВЕКА: ЭКСПРЕССИЯ, СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ВЛИЯНИЕ НА КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТА НОВЫХ СИНТЕТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ С ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ.

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1998

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза нуклеиновых кислот Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор, академик РАН ГЛ. ГЕОРГИЕВ

доктор биологических наук, профессор АЛ. ИТКЕС

кандидат биологических наук В.О. РЕЧИНСКИЙ

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Защита диссертации состоится " _1998 г. в час.^ мин. на

заседании Диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984 Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан "/¿С " _1998 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из важнейших проблем, стоящих перед современной молекулярной биологией, является расшифровка механизмов матричных процессов: репликации, транскрипции и рекомбинации, связаных с конформационными изменениями в молекуле ДНК. На сегодняшний день природа и молекулярные механизмы этих процессов изучены недостаточно. Известно, что ДНК эукариотической клетки имеет сложную надмолекулярную структуру и образует сверхспиральные петли с концами, фиксированными на ядерном матриксе. Таким образом, для протекания любого генетического процесса, связанного с разделением комплементарных цепей ДНК, необходимы топологические перестройки такой замкнутой структуры. В этой связи большой интерес представляет изучение ДПК топоизомераз - ферментов, катализирующих топологические перестройки ДНК, включая введение и удаление сверхвитков, узлообразование, образование катенанов и декатенацию, и, таким образом, играющих ключевую роль во всех аспектах метаболизма ДНК, поддержании стабильности генома и регуляции структуры хроматина.

Структурно-функциональные исследования топоизомераз приобрели особо важное значение после обнаружения того факта, что ферменты этой группы являются единственной клеточной мишенью для многих известных соединений с противо микробной и противоопухолевой активностью. Это открытие, вызвавшее интенсивный поиск и изучение природных, а также создание новых синтетических производных, считают одним га основных в противоопухолевых исследованиях последнего десятилетия. В настоящее время признано перспективным изучение соединений, способных специфически взаимодействовать с молекулой ДНК и, тем самым, влиять на каталитическую активность топоизомераз, модулируя узнавание ДНК ферментом и способствуя образованию долгоживущих ДНК-белковых комплексов, разрывов ДНК и клеточной гибели.

Таким образом, данные сравнительного изучения сайт-специфичности топоизомераз по отношению к определенным нуклеотидным последовательностям и особешюстей взаимодействия с ДНК лигандов с различными структурными детерминантами, а также исследование молекулярных механизмов влияния этих соединений на различные стадии ферментативного катализа являются необходимыми для разработки принципов

конструирования адресных селективных ингибиторов топоизомераз и создания новых противоопухолевых препаратов.

В последние годы в области изучения топоизомераз был достигнут значительный прогресс, однако ключевые проблемы, связанные с множественностью функций топоизомераз различных классов и их структурно-функционалысыми различиями, а также с принципиальной сложностью изучения молекулярных механизмов катализа, определяемых конформационными переходами ферментов, остаются открытыми.

Пели и задачи исследования. Основными целями настоящей работы являются:

а) создание эффективной системы экспрессии для получения рекомбинантной топоизомеразы I человека; выделение и очистка фермента в количествах достаточных для структурно-функциональных исследований;

б) биохимическая характеристика и изучение каталитической активности рекомбинантного С-концевого 68-кДа фрагмента топоизомеразы I человека;

в) характеристика структуры рекомбинантной 68-кД топоизомеразы I человека и её комплекса с «суицидным» ДНК-субстратом в растворе методами оптической спектроскопии;

г) сравнительный анализ влияния новых синтетических соединений с потенциальной противоопухолевой активностью (производных Хёхста, антибиотиков нетропсина и дистамицина) на сайт-специфичность и каталитическую активность топоизомеразы I человека,

д) исследование молекулярных механизмов модуляции новыми синтетическими лигандамн процесса образования тройных комлексов с участием ДНК, фермента и каьгготецина - классического специфического ингибитора топоизомеразы I человека. Научная новнзна и практическая ценность работы.

Разработана эффективная система экспрессии, выделения и очистки для получения каталитически активной топоизомеразы I (68 кДа) человека в клетках насекомых линии в© в количествах, необходимых для струкгурно-функщюнальных исследований. Впервые изучены особенности структурной организации топоизомеразы I человека и её комплекса с « суицидным » ДНК-субстратом в растворе с использованием методов оптической спектроскопии.

Создана модельная система для изучения молекулярных механизмов модулирования активности топоизомеразы I человека соединениями, связывающимися по малой бороздке ДНК. Система представляет собой набор сконструированных

плазмид, ДНК которых содержит места связывания различных лигандов, камптотецин-зависимые и камптотецин-независимые специфические последовательности, узнаваемые ферментом, в различных комбинациях и в различной ориентации относительно друг друга.

С использованием созданной системы впервые :

а) изучено сравнительное влияние на специфическую активность топоизомеразы I человека десяти новых синтетических производных Хёхста 33258, антибиотиков нетропсина и дистамицина;

б) обнаружена способность указанных соединений влиять на образование долгоживущих тройных комплексов топоизомераза 1/ДНКУкамптотсцин.

С помощью методов оптической спектроскопии определены молекулярные механизмы связывания синтетических производных нетропсина с ДНК. На основании полученных результатов отобраны наиболее перспективные производные для синтеза селективных ингибиторов топоизомеразы I человека - коньюгатов производных нетропсина и камптотецина. Разработанный экспериментальный подход и полученные результаты представляются перспективными для моделирования и синтеза новых препаратов с потенциальной противоопухолевой акивностью.

Публикации. Основные результаты представленной работы изложены в 8 печатных работах.

Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертацию, были представлены на следующих международных конференциях: «Summer School Biosensing Materials», Pushchino, Russia, July 7-13, 1994; «Methods in Protein Structure Analysis», Snowbird, Utah, USA, сентябрь 1994; «XXIV European Congress on Molecular Spectroscopy», Prague, Czech Republic, август 1998; «16th International Conference on Raman Spectroscopy», Cape Town, South Africa, сентябрь 1998, «6th International Conference of Anticancer Research), Kallithea, Halkidiki, Greece, октябрь 1998.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, описания полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на ^.¿страницах, содержит рисунков, & таблиц и схемы. В списке литературы цитируется /ЗУработ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ,

Создание эффективной системы экспрессии топоизомеразм I человека.

Ключевой проблемой в решении задачи получения больших количеств каталитически-активной ДШС-топоизомеразы I человека (топо I), необходимых для обеспечения запланированной нами развернутой программы структурно-функционального изучения фермента, являлся выбор эффективной системы экспрессии. В связи с этим, первым этапом работы стало детальное сравнение систем экспрессии белка в клетках дрожжей и насекомых.

Экспрессия полноразмерной топоизомеразм I человека в клетках дрожжей.

Клетки дрожжей S. cerevisiae штамма RS 190 с генотипом МЛ'Га ade2-l trpl-1 canl-100 Ieu2-3,U2 his3-ll,15 ura3-ltopl-8:LEU2 и имеющего мутацию по собственному гену топо I (предоставленного Др. Sternglanz R., State University of New York, New York, USA), трансформировали плазмидой рНТИб, несущей селективный маркер URA3 (предоставленной Др. A. Jensen, University of Aarhus, Denmark). В плазмиду вставлен связанный с дрожжевым GAL-промотором геи полноразмерной топо I, содержащий последовательность нуклеотидов, кодирующую пептид Met-(His)6-De-Glu-Gly-Arg в аминоконцевой части белка. Пептид содержит шесть остатков гистидина для упрощения процедуры очистки фермента с использованием метода металло-хелатной хроматографии, а также сайт узнавания протеазы Фактора Ха для удаления в случае необходимости гистидиновой последовательности аминокислот после очистки.

Трансформанты отбирали по способности давать колонии на селективной среде и затем переносили в жидкую среду, в которой источником углеводов была глюкоза, являющаяся репрессором для GAL-промотора. Клетки инкубировали до середины фазы логарифмического роста, переводили в среду, в которой глюкоза была заменена на раффинозу, продолжали инкубацию до достижения поздней логарифмической фазы роста и, далее, индуцировали экспрессию добавлением в среду галактозы до 2%. Оптимальное время экспрессии дшшого гена составляло 6 часов. Более длительная экспрессия приводила к гибели клеток, вследствии токсичности продукта экспрессии. После получения клеточного экстракта методом механического разрушения клеток

стеклянными шариками и предварительной очистки экстракта на колонке с носителем зли с помощью №2+-хелатной хр а б в гдеж зм

Bio-Rex 70 фермент очищали с помощью №2+-хелатной хроматографии.

72 кОз w ^...«¡цшат Ц g7

68kDa ~~ " Г

Б абвгдежзи

rr-iV -V r~f. ц>г ¿-rji -_'— , Л>' --T-- г"."*«?

72 kDa „ -i 97 ^Qg

68kDa тШ " '

Рис. 1. А. Электрофорез в 10% ДСН-полиакриламидном геле активных фракций, элюировавших с активированной №г+-сефарозы (а - в - элгоция буфером, содержащим 10 мМ имидазол, г, д - элюция буфером, содержащим 100 мМ имидазол, е-н - элюция Ш-ацетатным буфером, рН 4.2). Б. Иммунологическое определение иммобилизованных на мембране комплексов топо I с моноклональными антителами к ферменту после электрофореза в идентичных условиях.

Известно, что очистка эукариотической топоизомеразы I из различных источников сопровождается протеолитическим расщеплением аминоконцевой части фермента с образованием набора близких по молекулярному весу продуктов протеолиза, с трудом отделяемых при очистке от полноразмерного белка. Использование металло-хелатной хроматографии позволило решить эту проблему. Во-первых, удалось уменьшить количество стадий выделения, таким образом сократив время и уменьшив процентное содержание продуктов протеолиза. Во-вторых, удалось получить фракцию, содержащую гомогенный препарат топо I 97 кДа, элюирующий с колонки в 0.1 М Ыа-ацетатном буфере, рН 4.0 (Рис.1, А, Б: е,ж,ч,и). После предварительного промывалия 10 мМ раствором имидазола колонки с нанесенным на

нее препаратом, содержащим топоизомеразную активность, элюат содержал продукты протеолитического расщепления топо 1, с молекулярными весами 68 и 72 кДа, сохраняющие каталитическую активность и отвечающие на моноклональные антитела к ферменту (рис. 1, А, Б: а,б,в), в то время как полноразмерный белок оставался связанным с носителем. Характеристика продукта экспрессии.

Каталитические свойства полученной полноразмерной рекомбинантной топо I,

н

Рис. 2. Анализ продуктов реакции релаксации суперскрученной плазмидной ДНК рОЕМ7£Г(+) рекомбинантной топоизомеразой I человека (97 кДа) с помощью электрофореза в 1 % агарозном геле: 1- ДНК плазмиды рОЕМ72Д+), 2-6 - кинетика реакции релаксации 1мкг плазмидной ДНК с 200 нг фермента в течении 0.5,1,2, 5 и 10 минут соответственно.

содержащей последовательность из шести остатков гистидина в аминоконцевой части, были изучены с помощью реакции релаксации суперскрученной плазмидной ДНК (Рис.

2) и реакции образования ДНК-ферментного комплекса с двуцепочечньгм (18 п.о.) олигонуклсотидом, соответствукицим специфическому топоизомеразному сайту (Рис.

3). Анализ этих реакций показал идентичность выделенного нами продукта экспрессии топо I в клетках дрожжей и фермента, выделенного из плаценты человека.

Таким образом показано, что оптимизированная нами система экспрессии полноразмерной топо I человека в клетках дрожжей позволяет получить гомогенный, за счет очистки от продуктов протеолитическок деградации, препарат фермента при

выходе белка до 100-110 мкг на литр культуры. Полученный выход белка в оптимизированной нами системе экспрессии по меньшей мере в 2 раза превосходит выход фермента, полученный согласно протоколам описанным в литературе ранее.

А

5'

+ ДСП нагревание

Б

дли« к ¿ид¿¿и.а.; »л .Д -

топо I + ДНК

топо I (97кДа) топо I (97кДа)

Рис. 3. Л. Схематическое изображение взаимодействия фермента с ДНК. Узнавая ДНК, топо I формирует «расщепляемый» и «нерасщепляемый» комплексы с ДНК, находящиеся в равновесии. После нагревания для диссоциации нековалентносвязанной цепи ДНК ковалентный ДНК-ферментный комплекс и свободный фермент можно разделить с помощью электрофореза в денатурирующих условиях. Б. Электрофорез в 10% ДСН-полиакриламидпом геле смеси топо I и ДНК-ферментного комплекса после взаимодействия с олигонуклеотидом, содержащим специфический сайт узнавания фермента (1) и свободной топо I (2).

Решенная задача оптимизации протокола экспрессии топо I в клетках дрожжей имеет самостоятельное методологическое значение и мы планируем использовать эту систему для экспрессии мутантных форм топо I и отдельных структурных доменов ферментов в нашей будущей работе. В то же время, структурно-функциональное

исследование топо I требовало существенно больших количеств белка, что привело к необходимости использования бакуловирусной системы экспрессии. Использование бакуловирусной системы экспрессии для получения каталитически-активного С-концевого 68-кДа фрагмента топоизомеразы I человека.

Выбор бакуловирусной системы экспрессии определялся тремя основными причинами. Во-первых, в этой системе используется вирус, реплицирующийся независимо от клеток хозяина, что дает возможность получения вирусного стока с высоким титром для инфицирования культуры клеток, адаптированной для роста в суспензии. Во-вторых, клонирование гена под контролем полигидрииового вирусного промотора, активирующегося на поздних фазах инфекции, позволяет получать большие количества рекомбинантного белка без ущерба для жизненного цикла вируса. В-третьих, эта система экспрессии является эукариотической и обеспечивает большинство модификаций белка, характерных для клеток высших эукариотов.

Исследования последних лет показали, что протеолшичсский фрагмент 65-70 кДа топо I из многих источников стабилен и сохраняет все свойства нативного фермента. Более того, при выделении полноразмерной топо I из различных источников, в частности из плаценты человека, а также при использовании дрожжевой системы экспрессии, образуются фрагменты протеолитической деградации аминоконцевой части фермента, что затрудняет очистку белка до гомогенного состояния. В связи с этим был создал рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген топо I с делецией пар оснований, кодирующих аминоконцевую часть белка.

Первым этапом создания такого бакуловируса стало определение аминокислотной последовательности аминоконцевой части стабильного и каталитически-активного продукта протеолиза топо I из плаценты человека. Семь последовательных циклов Эдмана идентификации отщепляемых амипоконцевых остатков обнаружили последовательность Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Lys-Lys-, что свидетельствовало о том, что фрагмент начинался с Lys-191, а молекулярный вес при условии интактности карбоксиконцевой части белка составлял 68 кДа.

Таким образом, для экспрессии С-концевого 68 кДа фрагмента топо I, сохраняющего каталитические свойства полноразмерного белка, рекомбинантный бакуловирус должен был содержать участок reía топо 1,в котором вторым смысловым кодоном являлся кодон для лизина-191.

Для создания вектора, содержащего такой участок гена топо I и способного рекомбинировать с бакуловирусной ДНК были сконструированы две шазмиды -pVLT366 и PVLT191 (Рис. 4). Чтобы сконструировать промежуточную плазмиду, pVLT366, был получен SacII фрагмент, соответствующий области гена топо I человека, кодирующей карбоксиконцевую часть белка. SacII фрагмент получен путем рестрикции плазмиды рНТИб (предоставленной Др. A. Jensen, University of Aarhus, Demaik и содержащей полноразмерпый ген топо I человека) рестриктазой SacII и последующей его обработкой Т4 ДНК-полимеразой с целью получения тупых коцов. Этот фрагмент был далее разрезан рестриктазой ЕсоИ и лигирован с вектором pVL1393 (Invitrogen),

0

GAL TOPO I

SacII

Saal

Smal

EcoRI

KCORI

SacII Sac IX -ч

Ub->

ECORI I T4 DNA-pol

SacII EcoRI PCR L__J

Ligation

В EcoRI BamHI

BamBI SacI

•Wterj

gaticn

Рис. 4. Схема генно-инженерного конструирования вектора, содержащего ген топо I с деленией кодонов для аминоконцевой части белка и способного рекомбинировать с ДНК бакуловируса.

обработанным рестриктазами Бта! и ЕсоШ.

С помощью обработки рестриктазами ВатШ и МЬе1, из полуденной плазмиды рУЬТЗбб был вырезан фрагмент и затем заменен на ПЦР-продукт, соответствующий последовательности ДНК, кодирующей аминокислотные остатки с 191 по 656. Для этого фрагмент ДНК, содержащий кодоны аминокислот 191-765, был амплифицирован посредством ПЦР. При этом 5'-концевой праймер содержал ВатШ сайт, стартовый кодон трансляции (АТв) и имел следующую структуру: 5'- СОСООАТССГОАТОААОАААААОЛАОССОААОАААО - 3';

в то время как второй праймер структуру:

5'- 'ГГГССООААТТСТТААААСТСАТАОТСП'СЛ'ГСАОС - 3'.

Амплифицированный ПЦР-продукт был обработан рестриктазами ВатШ и Мю1

и лигирован с плазмидой рУЬТЗбб, обработанной теми же рестриктазами, с целью получения конечной плазмиды рУЬТ191.

А

Б

В

1 2 М 12 3 4 5 М

1 м

97 £6

45

31

Ю 66

45

87 S6,

45

т я —» 31

Рис. 5. Электрофорез в 10% ДСН-полиакриламидиом геле фракций, содержащих топоизомеразную активность, собранных после инфицирования клеток насекомых рекомбинантным бакуловирусом (А) и в процессе очистки фермента (Б, В). А. 1- 2 мкл ПЭГ-супернатанта, соответствующего 40 мкл суспензии клеток насекомых, 2-2 мкл ПЭГ-супернатанта, соответствующего 40 мкл инфицированной суспензии клеток насекомых, М - маркеры молекулярного веса (Bio-Red). Б. 1-5 - аликпоты активных фракций, элюировавших с колонки Bio-Rex 70, М - маркеры молекулярного веса. В. 1 мкг препарата топо I (68 кДа) после хроматографии на колонке Resource S10 (Pharmacia), М - маркеры молекулярного веса.

Рекомбинаптный бакуловирус, имеющий кольцевую струкуру и способный реплицироваться и инфицировать клеки насекомых, был получен путем ко-трансфекции клеток линии SI9 полученной плазмидой pVLT191 и лианеризованной вирусной ДНК дикого типа (Bac-N-Blue™DNA, Invitrogen). В процессе ко-трансфекции рекомбинация происходила между гомологичными последовательностями вирусной ДНК и вектора pVL1393, в который был заклонирован интересующий нас участок гепа топо I, кодирующий аминокислотные остатки 191-765 полноразмерного фермента (плазмида pVLT191).

А Б

М 1 2 123456789 10

Рис. 6. А. Электрофорез в 10% ДСН-полиакриламидном геле смеси рекомбинантной топо I 68 кДа и ДНК-ферментного комплекса после взаимодействия с олигонуклеотидом, содержащим специфический сайт узнавания фермента (1) и свободной топо I (2). Б. Кинетика реакции релаксации суперскручешюй плазмидной ДНК рОЕМ72Г(+) рекомбинантной топоизомеразой I человека (68 кДа) с помощью электрофореза в 1 % агарозном геле: 1 - ДНК плазмиды р<ЗЕМ72Г(+), 2-10 - продукты реакции релаксации, образующиеся при инкубации 0.3 мкг плазмидной ДНК с 1 нг топо 1 68 кДа в течении 20,40,60, 80,100,120 секунд, 4, 6,10 минут соответственно.

Для получения больших количеств топо I, необходимых для структурно-функциональных исследований, использовали суспензионную культуру клеток насекомых линии БГО. Клетки культивировали в бессьпзороточной среде в спиннерном культуральном флаконе в присутствии 1 % Р1иготс-68 (в/в) при 27°С. 200мл суспензионной культуры клеток 519 (2x10б клетовс/мл) инфицировали 4 мл амплифицированного вирусного стока с титром 5х108 вирионов/мл. Оптимальное время

экспрессии составляло 72 часа. Продукт экспрессии был очищен до гомогенного состояния посредством двустадийной хроматографии (Рис. 5 А, Б. В). Выход 68 кДа топо I составлял 5 мг из литр культуры.

Структурно-функциональная характеристика продукта экспрессии.

Рекомбинантная 68кДа топо I, выделенная из экстракта клеток насекомых, отвечала на моноклональные антитела против полноразмерного белка и обладала каталитическими свойствами, идентичными свойствам нативного белка (Рис 6: А. Б). Для характеристики особенностей структуры рекомбинашного С-концевого 68 кДа фрагмента топо I и её изменений, индуцированных образованием промежуточного продукта катализа (ковалентного ДНК-ферментного комплекса), полученный препарат фермента концентрировали до 9 мг/мл и изучали с использованием методов оптической спектроскопии комбинационного рассеяния (КР) и кругового дихроизма (КД). В качестве специфического суицидного субстрата для топо I, в присутствии которого происходит "замораживание" промежуточного ДНК-ферментного комплекса использовали двухцепочечный олигонуклеотид, соответствующий сайту узнаваиия фермента и име [щй следующую структуру:

5'-САААОАСТТАОААААААААА-3' 3'-ОТТТСТСААТС-5'.

При взаимодействии с таким олигонуклеотидом, имеющим делецию девяти пар оснований на 5'-конце неразрезаемой цепи, топо I связывается и разрезает субстрат с образованием ДНК-ферментного ковалентного комплекса Как показывает изучение электрофоретической подвижности фермента до и после инкубации с олигонуклеотидом, а также анализ продуктов реакции после их обработки протеиназой К, в отличии от обычного топоизомеразного катализа, при взаимодействии с таким суицидным субстратом стадия зашивания разрыва отсутствует. Следовательно, такой ДНК-ферментный комплекс является стабильным и представляет собой удобную модель для изучения конформационных переходов топо I в реакциях связывания и расщепления ферментом своего ДНК-субстрата.

На первом этапе работы особенности вторичной структуры фермента, расчитывали с использованием статистических программ СОЫТШ ЬО (ШЗ), СЬои-БаБшап и 0011-1. Статистическую модель распределения элементов вторичной структуры по первичной последовательности топо 168 кДа корректировали по методу

ßl

ß2_

al

<x2

ai

a EKNIITNLSK CDFTQMSQYF KAQTEARKQM SKEEKLKIKE ENEKLLKEYG FCIMDNHKER IANFKIEPPG LFRGRGNHPK MGMLKRRIMP EDIIINCSKD

б , б?» , Л5 ...... ,_,— «s , Iм, Bs__iL,_Ж*

а AKVFSPPPGH KWKEVRHDNK VIMLVSWTEN IQGSIKYIML NPSSRIKGEK DKQKYETARR LKKCVDKIRN QYREDKKSKE KKVRQRAVAL YFIDKLALRA ö _ B9_ ßlO_ ßli__g8 _ «9 __alO

а GNEKEEGETA DTVGCCSLRV EKINLHPELD GQEYWEFDF LGKDSIRYYN KVPVEKRVFK NLQLFMENKQ PEDDLFDRLN TGIIKKHLQD LMEGLTAKVF all al2 ßl2 ß!3 a!3 ß!4 a!4 al5__al6

а RTYNASITLQ QQLKELTAPD ENIPAKILSY NRANRAVAIL CNHQRAPPKT FEKSMMNLQT KIDAKKEQLA DARRDLKSAK ADAKVKKDAK TKKWESKKK al6 al7 al8 al9

о

765

а AVQRLEEQLM KLEVQATDRE ENKQIALGTS KLNYLDPRIT VAWCKKWGVP IEKIYNKTQR EKFAWAIDMA DE DYE F e al9 a20 a21 a22 a23 a24

Рис. 7.

Рис. 7. а: первичная структура топо I 68 кДа; б: распределение вторичной структуры топо I по первичной последовательности, полученное при рснтгсноструктурном анализе кристалла топо I 70 кДа в комплексе с ДНК (лит. данные); в: распределение вторичной структуры, расчитанное с использованием метода LINK; г: распределение вторичной структуры, расчитанное по методу LINK для свободной топо I 68 кДа в растворе. Последовательности с высоким потенциалом к изменению структуры при образовании комплекса с субстратом обозначены прямоугольной рамкой.

LMK, используя экспериментальные данные методов спектроскопии КР и КД. Показано, что около 59% полипептидной цепи 68 кДа топо I представлено а-сниралью, 24% имеет Р-конформацию, а 17% образует другие структуры.

Далее, методы оптической спектроскопии были применены для анализа конформационных переходов фермента в комплексе с суицидным ДНК-субстратом. Показано, что образование ДНК-ферментного комплекса индуцирует сильные изменения вторичной структуры топо I, включающие переход 15% а-спирали в другие структуры, а также перераспределение дисульфидных связей, значительные изменения водородных связей остатков тирозина и конформации боковых цепей триптофанов. Структура олигонуклеотида, используемого в качестве субстрата, оставалась неизменной. Повторное применение метода LINK, на этот раз при изучении структуры топо 168 кДа в комплексе с ДНК-субстратом, позволило идентифицировать наиболее вероятные участки конформационных переходов (Рис. 7).

Полученные данные представляют первое экспериментальное доказательство конформациошюго перехода топо I в процессе катализа. Изменение конформации фермента при образовании комплекса с суицидным субстратом происходит прсимуществишо в высоко-конссрвативных областях С-концевого каталитического и внутреннего доменов, в то время как конформация линкерного домена практически не меняется. Такое перераспределение вторичной структуры является первым экспериментальным доказательством существующей модели, согласно которой топоизомеразный катализ требует одновременного связывания фермента с двумя участками цепи ДНК, 5'-и 3'- относительно сайта щепления. Исходя из этого мы предполагаем, что индуцированный конформациошшй переход в этих отдельных двух областях (Рис. 7), объясняется взаимодействием фермента с участками цепи ДНК, окружающими сайт шепления.

Влияние повьк синтетических соелипепнй с потеипиальвой нротипоонуколепой активностью па каталитические свойства топоизомеразы I человека.

Характеристика исследуемых в работе новых синтетических соединений, связывающихся по малой бороздке ДНК.

Для изучения механизма модуляции специфической топоизомеразной активности и направленного синтеза новых лигандов, способных модулировать топоизомеразный катализ, был выбран класс неинтеркалирующих высокоспецифичных соединений, связывающихся с АТ-последовательностями в узкой бороздке В-формы ДНК. Известно, что Хёхст33258, беренил, антибиотики нетропсин и дистамицин, принадлежащие к этому классу соединений и обладающие противоопухолевой активностью, способны ингибировать топоизомеразу за счет блокирования связывания фермента с определенными последовательностями ДНК. Ингибирутощая способность этих соединений коррелирует как с их собственными размерами, так и с размером участка, который занимают эти лиганды на ДНК. Разумно предположить, что лиганды, связывающиеся с более протяженными последовательностями оснований, обладают, при прочих равных условиях, более высокой ингибирующей активностью по отношению к ферменту. Исходя из молекулярной модели комплексов нетропсипа и дистамицина с ДНК, согласно которой молекулы антибиотиков располагаются продольно в узкой бороздке двойной спирали ДНК, в Институте Молекулярной Биологии им. В.А.Энгельгарда РАН были синтезированы соединения нового класса, способные «узнавать» определенные последовательности АТ-пар оснований ДНК. Общий принцип конструирования такого рода соединений заключается в связывании блоков, состоящих из одного или нескольких пирролкарбоксамидных фрагментов, гибкими соединительными звеньями. Гибкие звенья позволяют определенным образом ориентировать и фиксировать фрагменты в комплексе с ДНК, обеспечивая специфичное связывание фрагментов с блоками из АТ-пар оснований различной протяженности и ориентации. Использование набора производных состоящих из блоков, содержащих различные структурные детерминанты, представляет большой практический интерес для разработки пргагципов конструирования адресных селективных шп-ибиторов топо I. Структурные формулы соединений, предложенных для исследования А.Л. Жузе и С.Л. Гроховским, представлены на Рис. 8.

Н.

М л И>

ЫН2

^ н

1ЧН2

да к -

№

о

ЛсгуЮуШ

Н* N02 °"\-г н IV

МопоИЖ N /Нз

СускгРШЬШ ^ ^

сад

он

Рис 8 Структурные формулы Хёхста33258, нетропсииа, дистамищша и их синтетических аналогов.

Влияние новых синтетических производных ДНК-специфичных соединений на каталитическую активность ДНКтопоизомеразы I человека

Для изучения особенностей влияния новых синтетических производных ДНК-специфичных соединений на каталитическую активность топо I был создан набор модельных ДНК-субстратов. Эти субстраты представляют собой сконструированные плазмиды, содержащие введенные генно-инженерными методами последовательности пар оснований, узнаваемые топо I, а также последовательности для специфического связывания синтетических производных нетропсина и дистамицина в различной ориентации относительно друг друга. Такие конструкции предоставляют уникальную возможность сравнительного изучения сайт-специфичности Tono I по отношению к определенным нуклеотадным последовательностям, особенностей взаимодействия с ДНК лигандов с различными структурными детерминантами, а также молекулярных механизмов влияния этих соединений на различные стадии ферментативного катализа.

На первом этапе работы было протестировано десять производпых нетропсина, дистамицина и Хёхста 33258 с различными структурными детерминантами в сравнении с исходнымии соединениями. Показано, что способность этих соединений ингибироватъ релаксацию топоизомеразой I супсрскрученной ДНК плазмиды pGEM7Zfl4) (Рис. 9) согласуется с их способностью модулировать картину распределения сайтов расщепления ферментом фрагментов ДНК. Сделан вывод о том, что наиболее сильными ингибиторами топо I среди всех изученных соединений являются специально синтезированные бис-нетропсины, состоящие из двух нетропсиновых фрагментов, расположенных в различной ориентации относительно друг друга и связанных гибкими соединительными звеньями. В зависимости от направления пептидных связей (CO->NH) в молекулах бис-нетропсинов их обозначили как бг/с-Нт(-»<—), бис-Нт(<—>), бис-№(—>—>) (Рис. 8).

На следующем этапе работы была изучена зависимость интенсивности щспления ферментом по каждому отдельному сайту фрагмента ДНК модельной плазмиды, содержащего специфические сайты связывания топо I, от концентрации отобранных бис-нетропсинов (Рис. 10). Анализ интенсивностей расщепления ферментом в присутствии бис-нетропсинов фрагмента ДНК, содержащего сайты узнавания для фермента и введенные в разных ориентациях относительно топоизомеразных сайтов места связывания лигандов показал, что все три бг/с-нетропсина влияют на взаимодействие

топо I с ДНК. При этом степень и особенности влияния бмс-нетропсинов определяются как структурой молекулы лиганда, так и нуклеотидными последовательностями, окружающими сайг топоизомсразного щепления. Так, сайты А, Е и Б (Рис. 10) ослабляются в присутствии всех бис-нетропсинов, сайт Н - только в присутствии бис-Ыт(-><—) и бис-Нт(<—>), а интенсивность щепления в сайге С не изменяется при действии всех трех бис-нетропсинов.

Рис. 9. Сравнительное изучение способности новых синтетических соединений ингибировать реакцию релаксации суперскручешюй ДНК плазмиды рОЕМ72^+) топоизомеразой I человека. Представлены средние значения концентраций соединений, при которых происходит 50%-ное ингибирование релаксации плазмидной ДНК ферментом в стандартных реакционных условиях (К^), полученных в нескольких независимых экспериментах. Количество различных форм плазмидной ДНК определяли с помощью программы "Гель-Лаб", сравнивая интенсивности полос в окрашенном бромистым этидием агарозном геле.

С целью изучения молекулярных механизмов взаимодействия бис-нетропсинов с ДНК и степени их влияния на каталитическую активность топо I нами исследованы особешюсти взаимодействия лигандов с ДНК с помощью метода гигантского комбинационного рассеяния (ГКР).

А ВС О

1 14, 4.

ССТАССАА.САСТТАСААААТТТТСТАА6ТСТТССТЛССССС0СТТТТТААААССССС

ССАТббТТСТСААТСТТТТААААСАТТСАСААССАТСССССССАААААТТТТбСССС

ЕР в НИ К Ь

4, 4, I Ж 14-

АСАСТССАССААТТСССТАСТААСТСТТССТАСССССССТТТТТААААСбСССТТССАААТСС

ТСТСАССТССТТААСССАТОАТТСАСААССАТСССССССАААААТТТТСССССААССТТТАСС

Рис. 10. Сайт-спсцифическое расщепление Д1Ж топоизомеразой I. з:Р- мечешше по 3'-концу рестриктные фрагменты ДНК модельных плазмид 749 (А) и 751 (В) инкубировали с топо I в отсутствии (3) и в присутствии 1 мкМ камптотецина (СРТ) (4). Дорожки 5,7,9 показывают ипгибирование топоизомеразного щепления в присутствии 10 мкМ бис-Нт(-»->), 6/«>Нт(-»<-) и бис-Нт(<—>), соответственно. 6, 8, 10 соответствуют фрагментам ДНК, обработанным топоизомеразой I в присутствии 1 мкМ СРТ и 1 мкМ бые-Нт (->->), бмс-Нт( >< ) и бис-Нт (<—>), соответственно. Образование одноцепочечных разрывов ДНК после шпсубации фермента с фрагментами индуцировали добавлением ДСН до 0.5%, далее обрабатывали продукты реакции лротеиназой К, анализировали в 8% сиквенирующем геле и визуализовали авторадиографически. Дорожки 2, 11 - химическое растепление по А+О Горизонтальные линии указывают положение сайтов расщепления ДНК топоизомеразой I.

Показано, что адсорбция комплексов баонетропсинов и 20-мерного двухцепочечного олигонуклеотида, имеющего структуру:

5' - САААСАСТТАСААААААААА - 3'

3' - оттТ'СТбААТСТТТТТТТТТ -5' и содержащего сайт щепления для топо I, на ГКР-активной поверхности осуществляется через Ы-пропилпиррольные группы. При взаимодействии с протяженной гомо-АТ последовательностью олигонуклеотида вблизи сайта топоизомеразного щепления ориентация пиррольных колец молекулы

бгл>Нт(—>—>) остается неизменной. В то же время ориентация пиррольных колец молекул бис-Нт (-Х-) и бис-Нт (<—>) при связывании лигандов в узкой бороздке ДНК меняется, причем характер и величина угла поворота плоскостей пирролов в обоих случаях разные: при связывании бис-Нт(<—>) в узкой бороздке ДНК доступность Ы-пропилпиррольных групп лиганда к растворителю уменьшается, тогда как связывание бмс-Нт(—><--) сопровождается таким изменением положения молекулы внутри кошшекса, что доступность ее пиррольных фрагментов растворителю увеличивается. Такие отличия в способности к изменению преимущественной ориентации пиррольных колец лигандов при связывании в малой бороздке ДНК по сравнению со свободными молекулами в растворе определяются структурой конкретного бис-нетропсина и подвижностью молекулы в комплексе с ДНК. Полученные дшшые согласуются со способностью этих лигандов ингибировать щеплениеДНК топоизомеразой I: по способности бис-нетронсинов уменьшать интенсивность щепления в специфических для топо I сайтах они располагаются следующим образом: бис-Нт(<—>) > бис-Нт(-м-) > бис-Нт(-»->).

Модуляция образования тройного комплекса топоизомераза 1/ДНК/камптотецин.

Фрагменты плазмидных ДНК, содержащие камптотецин (СРТ)-зависимые и СРТ-независимые сайты щепления ДНК топоизомеразой I, а также последовательности предпочтительные для связывания быс-нетропсинов (5'-ТПТАААА-3' для бис-Нт(<—->) и 5'ААААТПТ-З' для бис-Нт (-><-)), были выбраны в качестве субстратов с целью изучения способности бкс-нетропсинов модулировать образование тройного комплекса топоизомераза 1/ДНК/СРТ. Специфический ингибитор топо I СРТ и его производные способны стабилизировать промежуточный продукт топоизомеразной реакции -ковалентный ДНК-ферментный комплекс. Лиганд взаимодействует и с топо I и с ДНК

А ВС

^ _ I 4-

бСТАССААСАСТТАСАААЛТТТТСТАЛСТСТТССТАСССССССТТТТТАЛААССССС

ССАТ6СТТ6Т6ААТСТТТТЛАЛЛаАТТСАСААССАТССв66ССАААЛЛТТТТССССС

Т Р

ТТССАЛАТСйАТААССТТССАТСССбАСАССТСССААСбСС ААССТТТАССТАТТС6ААССТРССССТСТССАС66ТТСС6С

т т

О N

Рис. 11. Модуляция бг/е-нетропсином(-м-) распределения сайтов щепления топоизомеразой I фрагмента ДНК, идентичного приведенному на рис. 10 (А). 32Р-меченный по З'-копцу нижней (1-10) или верхней (11-20) цепи инкубировали в отсутствии (3, 13) и в присутствии 1 мкМ СРТ(4, 14). Щеплеиие ДНК топоизомеразой I модулировали, добавляя в реакционную смесь бис-Нт(—><-) до коне'пп.тх концентраций 2.5 мкМ (6, 16) и 10 мкМ (5, 15). Дорожки 7, 8, 17, 18 соответствуют образцам ДНК, обработанным топо I в присутствии 1 мкМ СРТ и бис-Нт(-><—) при концентрации последнего 2.5 мкМ (8, 18) и 10 мкМ (7, 17). 9, 19 - фрагменты ДНК, обработанные ДНКазой 1. 10, 20 - фрагменты ДНК, обработанные ДНКазой I в присутствии 10 мкМ бис-Нт(—><—). 1, 11 - интакгные фрагменты ДНК. 2-12- химическое щепление по А+О. Внизу рисунка приведена нуклеотидная последовательность фрагмента, используемого в эксперименте. Вертикальными стрелками отмечены сайты расщепления топо I А-С (мечена верхняя цепь) и М-Р (мечена нижняя цепь). Сайты предпочтительного связывание бас-Нт (-к-) подчеркнуты.

с образованием тройного комплекса в определенных сайтах связывания фермента, в норме обладающих высокой скоростью зашивания. Известно, что одним из факторов, определяющим как скорость зашивания ДНК топоизомеразой I, так и скорость узнавания ферментом определенных последовательностей пар оснований ДНК, является конформация молекулы ДНК в сайте узнавания фермента и в прилежащих последовательностях. Следовательно, лиганды, при связывании которых происходит локальное изменение структуры ДНК, способны модулировать образование и время жизни тройных комплексов. Наши исследования способности бмс-нетропсинов модулировать образование таких тройных комплексов показало, что наличие дополнительных последовательностей для специфического связывания лигандов вблизи от СРТ-зависимых топоизомеразных сайтов изменяет картину распределения образования тройных комплексов в присутствии лигандов (Рис. 11). Так, бис-Нт(-И-) индуцировал возникновение новых сайтов щепления ДНК топоизомеразой, а бис-Нт(*—»), в зависимости от места его связывания, способствовал уменьшению интенсивности щепления или стабилизировал тройной комплекс.

В настоящее время производные камптотецина являются одним из наиболее обещающих классов противоопухолевых препаратов. Два из них - иринотекан и топотекан - уже широко применяются в клюшке, а постоянно растущий поток публикаций, связанных с поиском новых перспективных производных этого класса, показывает возрастающий интерес ведущих фармацевтических компаний. Полученные нами данные по модуляции действия камптоцетшюв аналогами бис-нетропсинов позволяют сделать предположение о перспективности совместного использования этих препаратов.

Таким образом, среди группы изученных нами новых синтетических производных ХСхста, нетропсина и дистамицина по способности эффективно модулировать каталитическую активность топо I были отобраны и детально изучены бис-нстропсины. В дальнейшем планируется моделирование, синтез и изучение молекулярных механизмов действия конъюгатов СРТ с исследованными нами бис-нетропсинами с целью создания высоко-селективных ингибиторов топо I, способных участвовать в образовании тройного комплекса и узнавать определенные протяженные последовательности ДНК.

Выводы.

1. Исследованы возможности системы экспрессии полноразмерной топо I 97 кДа в клетках дрожжей БассИаготусех сегечтае для получения большого количества каталитически-активного фермента. Показано, что оптимизированная нами система экспрессии в клетках дрожжей позволяет получить гомогенный, за счет очистки от продуктов протеолитичсской деградации, препарат фермента при выходе белка до 100-110 мкг на литр культуры.

2. Определена №концевая последовательность аминокислот стабильного каталитически-активного 68-кДа продукта протеолитической деградации топо I, выделенного из плаценты человека. Показано, что С-концевой фрагмент топо I, сохраняющий все ферментативные свойства полноразмерной топо I, начинается с Ьу5-191 и, на основе этих данных, сконструирован вектор, способный рскомбшшровать с ДНК бакуловируса дикого типа.

3. Получена и оптимизирована система экспрессии 68-кДа фрагмента топо I в клетках насекомых линии 819. Препарат рекомбинантной 68кДа топо I очищен до гомогенного состояния с выходом белка 5 мг на литр культуры.

4. Методами оптической спектроскопии определены особенности структуры рекомбинанпюго С-концевого 68 кДа фрагмента топо I в растворе. Показано, что 59% полипептид ной цепи 68 кДа топо I представлено а-спиралью, 24% имеет Р-конформацию, а 17% образует другие структуры. Образование комплекса фермента с суицидным ДНК-субстратом индуцирует конформациотше изменения топо I, причем эти изменения происходят преимущественно в высоко-копсервативных областях С-концевого каталитического и внутрешгего доменов, в то время как конформация линкерного домена практически не меняется.

5. Проведен сравнительный анализ влияния на сайт-специфичность и каталитическую активность топоизомеразы I человека, десяти новых синтетических производных нетропсина, дистамицина и Хёхста 33258 с потенциальной противоопухолевой активностью.

6. Обнаружены различия в ориентации пиррольных колец трех бме-нетропсинов, наиболее сильных среди изучешп.тх соединений ингибиторов топо I, при связывании

с двухцепочечным олигонуклеотидом, соответствующим сайту узнавания фермента i показана корреляция этих отличий со способностью синтетических лигандо1 ингибировать тоноизомеразное щепление. 7. Исследованы молекулярные механизмы модуляции новыми синтетическиш лигаидами процесса образования тройных комлексов с участием ДНК, фермента i камтотецина - классического специфического ингибитора топо L Показан; зависимость влияния быс-неягропсинов на образование таких долгоживущк комплексов от локальной последовательности ДНК в месте расщепления концентрации и структуры бис-нетропсинов, а также от расстояния между сайте» узнавания топо I и местом связывания лиганда.

Основные результаты диссертации изложены в следующих печатных работах;

1. Alyona V.Sukhanova, Sergey L.Grokhovsky, Alexey L.Zhuze, David l.Ropcr, Igor B.Bronstein, Human DNA-Topoisomerase I Activity Is Affected By Bis-Netropsin's Binding To DNA Minor Groove, April 1998, Biochem Mol Biol Int. vol. 44, No. 5, pp. 997-1010.

2. LB. Bronstein, A. Wynne-Jones, A. Sukhanova, F. Fleury, A. Ianoul, J.A. Holden, A.J.P. Alix, G.G. Dodson, J-C. Jardiller, I. Nabiev, A.J. Wilkinson Expression, Purification and DNA-Cleavage Activity of Recombinant 68-kDa Human Topoisomerase I - Target for Antitumor Drugs, 1998. Anticancer Res., vol. 18, No. 6, pp. 1-11.

F. Fleuiy, A. Ianoul, E. Kryukov, A. Sukhanova, I. Kudelina, A. Wynne-Jones, I. Bronstein, M. Maiziercs, M. Beijot, G.G. Dodson, AJ.Willdnson, J.A Holden, A. Feofanov, A.P. Alix, J.-C. Jardillicr, I. Nabiev, Raman and CD Spectroscopy of Recombinant 68-kDa DNA Human Topoisomerase I and Its Complex with Suicide DNASubstrate, 1998, Biochemistry, vol. 37, No 40, pp. 1-13.

Е.Ю. Крюков, A.B. Суханова, C.JL Гроховский, А.Л. Жузе, И.Р. Набиев Исследование Комплексов Бис-Нетропсинов с ДНК Методом Спектроскопия Гигантского Комбинационного Рассеяния, 1998, Молекулярная биология, в печати. 5. Alyona Sukhanova, Sergey Vorob'ev, Alexander Gabibov, Igor Bronstein, The DNA-topoisomerase 1, analysis by limited proteolysis of domain structure and conformational changes, 1994.J ProteinChem.v. 13(51 p541 (Sll).

6. S.MVorob'ev, A.V.Sukhanova, J.Holden, A.V.Timofeev, LB.Bronstein, Monoclonal antibodies as a tool to study structure-function relationships of human topoisomerase 1, S.MVorob'ev, Materials of the Summer School Biosensing Materials. July 7-13, 1994, Pushchino, Russia.

7. Ktyukov, E., Yu., Sukhanova, A., V., Grokhovsky, S., L., Zhuze, A., L., Nabiev, I., R., Comparative Study of Binding of bis-Netropsins to DNA Substrate. SERS Spectroscopy Approach, 1998. Proceeding of the 16* International Conference on Raman Spectroscopy. September 6-11 1998, Cape Town, South Africa, Heyns, A., M., Ed., John Wiley&Sons, Chichester, pp3 88-389.

8. Alyona Sukhanova, Eugeniy Kryukov, Sergei Grokhovsky, Alexei Zhuze, Igor Bronstein, Igor Nabiev, New Bis-Netropsins: Comparative Studies of Their DNA Binding and Modulation of Activity of Human DNA-Topoisomerase /, 1998, Proceeding of the 6th International Conference of Anticancer Research. Kallithea, Ilalkidiki, Greece, October 1998, in press.