Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональное изучение ДНК топоизомеразы V Methanopyrus kandleri

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белова, Галина Ивановна

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

ПУБЛИКАЦИИ И АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

КЛАССИФИКАЦИЯ И СТРУКТУРА ДНК ТОПОИЗОМЕРАЗ.

1. Топология ДНК: основные понятия.Ю

2. топоизомеразы - ферменты, изменяющие топологическое состояние ДНК посредством разрыва и воссоединения полинуклеотидных цепей.

3. топоизомеразы класса 1А.

3.1. Эубактериальные топоизомеразы 1.

3.2. Эубактериальные топоизомеразы III.

3.3 Эукариотические топоизомеразы III:.:.

3.4. Обратные гиразы.

4. топоизомеразы класса 1В.

4.1. Эукариотические топоизомеразы I.

4.2. Топоизомеразы поксвирусов.

4.3. Топоизомераза V МеМапоругия капсИеп.

5. топоизомеразы класса ПА.

5.1. Эубактериальные топоизомеразы II или ДНК гиразы.

5.2. Эубактериальные топоизомеразы IV.

5.3. Топоизомераза IIфага Т4.

5.4. Эукариотические топоизомеразы II.

6. Общие черты в строении и механизме действия топоизомераз классов 1А и НА.

7. Топоизомеразы класса ПВ.

8. Биологические функции ДНК топоизомераз.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Клонирование.

1.1. Создание библиотеки геномной ДНК МеМапоругш капсИеп на основе фага Я.

1.2. Титрование фаговой библиотеки.

1.3. Блотинг по Саузерну.

2. Методы очистки белков.

2.1. Выделение топоизомеразы V из архебактериалъного микроорганизма Methanopyrus kandleri.

2.2. Выделение рекомбинантных ферментов.

3. Ферментативный гидролиз Tono V и определение N-концевой аминокислотной последовательности продуктов протеолиза.

3.1. Стандартная методика ферментативного гидролиза.

3.2. Определение массового соотношения ДНК: Tono V, при котором образуется нерастворимый комплекс ДНК-фермент.

3.3. Влияние ДНК на протеолиз.

3.4. Гидролиз с помощью трипсина, химотрипсина, термолизина, протеаз V8 и Lys-C.

3.5. Определение N-концевой аминокислотной последовательности продуктов протеолиза.

4. определение топоизомеразной активности.

4.1. Стандартная методика определения топоизомеразной активности.

4.2. Определение единицы активности Tono V, Топо78 и Tonoól.

4.3. Зависимость релаксации отрицательно сверхспирализованной плазмидной ДНК от температуры.

4.4. Зависимость релаксации отрицательно сверхспирализованной плазмидной ДНК от концентрации солей 1С uNa+.

4.5. Релаксация отрицательно сверхспирализованной плазмидной ДНК в присутствие солей

Mg2+ и Са2+.

4.6 Эффект «расплетания цепей».

4.7. Формирование ковалентного комплекса Tono V-ДНК.

Изучение взаимодействия Торо34 с ДНК.

6. Определение лиазных активностей Tono V.

6.1. Приготовление субстратов.

6.2. Стандартная методика определения АР и dRP лиазных активностей Tono V.

6.3. Сопоставление топоизомеразной, АР и dRP лиазных активностей Tono V.

6.4. АР и dRPлиазные активности Tono Vnpu 37°С и 60° С.

6.5. Сравнение лиазных активностей Tono Vu TonoVM226.

6.6. Определение сродства Tono Vк АР и dRP субстратам.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Исследование гена, кодирующего топоизомеразу V Methanop yrus kandleri и получение рекомбинантного белка.

1.1. Клонирование гена, кодирующего топоизомеразу V Methanopyrus kandleri.

1.2. Анализ первичной структуры топоизомеразы VMethanopyrus kandleri.

1.3. Получение и очисткарекомбинантной топоизомеразы V М. Kandleri.

2. Определение структуры и функции доменов топоизомеразы V Methanopyrus kandleri.

2.1. Определение доменной организации топоизомеразы Vметодом ограниченного ферментативного гидролиза.

2.2. Клонирование и выделение рекомбинантных белков, являющихся отдельными доменами топоизомеразы V.

2.3. Изучение функциональных свойств рекомбинантных белков Топо78, Топо61 и Топо34.

3. Изучение активного центра топоизомеразы V Methanopyrus kandleri, обеспечивающего релаксирующую активность фермента.

3.1. Определение тирозина, входящего в активный центр топоизомеразы V.

3.2. Анализ участка Tono V, содержащего тирозин, входящий в активный центр фермента.

4. изучение лиазных активностей топоизомеразы v.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

1. Сравнение биохимических свойств топоизомеразы V и топоизомераз, принадлежащих к классу IB.

2. Клонирование гена tops и и анализ аминокислотной последовательности топоизомеразы V.

3. Доменная организация топоизомеразы V.

4. Определение остатка тирозина, входящего в активный центр топоизомеразы V.

5. Участие топоизомеразы V в эксцизионной репарации ДНК.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональное изучение ДНК топоизомеразы V Methanopyrus kandleri"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

В живых организмах молекулы ДНК, являющиеся носителями наследственной информации, представляют собой либо очень длинные линейные, либо замкнутые в кольцо двухспиральные молекулы. Поэтому практически любой процесс, связанный с передачей или реализацией наследственной информации, приводит к появлению положительной и отрицательной сверхспирализации ДНК, образованию зацепленных молекул - катенанов и узлов. Все эти топологические проблемы, появляющиеся в процессах репликации, транскрипции и рекомбинации успешно решаются особыми ферментами - ДНК топоизомеразами. Наряду с ДНК- и РНК-полимеразами они являются ключевыми ферментами передачи наследственной информации. Клетка, лишенная топоизомераз, не может компенсировать их отсутствия и гибнет. Неудивительно поэтому, что эти белки являются объектом пристального внимания как фундаментальной, так и прикладной науки.

Все ДНК топоизомеразы разделяют на два типа: I и II, каждый из которых включает по два класса - 1А, 1В, НА и ИВ, сильно различающихся по структурной организации и биохимическим свойствам. Ферменты типа I вносят разрыв в одну цепь ДНК, а топоизомеразы типа II - двойной разрыв в обе цепи ДНК. Появление временного разрыва в полинуклеотидной цепи ДНК всегда сопровождается формированием ковалентного комплекса ДНК-фермент. Все известные топоизомеразы образуют эту ковалентную связь с ДНК через остаток тирозина, входящего в активный центр фермента.

В отличие от топоизомераз 1А и НА, которые найдены как у эукариотических, так и прокариотических организмов, ферменты класса 1В до недавнего времени были обнаружены только у эукариот. В этой связи топоизомераза V, выделенная из гипертермофильного архебактериального организма Ме^апоругив капсИеп, представляет особый интерес, поскольку является первой прокариотической топоизомеразой, по своим биохимическим свойствам принадлежащая к классу топоизомераз 1В. Также как и все эукариотические ферменты этого класса, топоизомераза V вносит разрыв в одну цепь ДНК и образует ковалентную связь с 3' концом ДНК, релаксирует как отрицательно, так и положительно су перекрученную ДНК, не требует для своей активности присутствия энергетических кофакторов и ионов двухвалентных металлов. Топоизомераза V является односубъединичным белком с молекулярной массой 112 кДа, что укладывается в интервал 62-165 кДа, определенный для топоизомераз 1В. Фермент вносит разрыв в нуклеотидную последовательность, специфическую для одной из эукариотических топоизомераз и узнается антителами к топоизомеразе I человека. Однако, условия, в которых работают тойоизомераза V и остальные ферменты этого класса, сильно различаются. Топо V М. капс11еп работает при температурах до 122°С и в широком интервале солевых условий от 10 мМ до 3.1 М. Оптимальной концентрацией соли являются 0.35 М №С1 или 1.5 М КФи, что значительно превышает оптимальные концентрации солей, в которых работают известные топоизомеразы типа 1В. Такие экстремальные условия, необходимые для активности топоизомеразы V, легко объяснимы, поскольку МеМапоругив капс11еп живет при высокой температуре и высокой концентрации соли.

Структурно-функциональное изучение топоизомеразы V, выделенной из архебактериального организма, и обладающей биохимическими свойствами, присущими эукариотическим топоизомеразам, позволяет получить новые данные о свойствах этого уникального фермента и внести определенный вклад в исследование эволюционных взаимоотношений эукариот и архебактерий.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью данного исследования являлось структурно-функциональное изучение топоизомеразы V, выделенной из архебактериального микроорганизма МеМапоругив капсЛеп. По своим биохимическим свойствам фермент принадлежит к топоизомеразам класса 1В. Прежде всего, следовало идентифицировать ген, кодирующий топоизомеразу V, попытаться установить родственные связи с другими ферментами на основе анализа аминокислотных последовательностей и сконструировать экспрессионную плазмиду для выделения рекомбинантного белка. Для того, чтобы определить доменную организацию топоизомеразы V, проводили эксперименты ограниченного протеолиза в не денатурирующих условиях. Получение в чистом виде рекомбинантных белков, являющихся отдельными доменами фермента, позволило бы охарактеризовать их функции. Особое внимание было уделено поискам тирозина, входяшего в активный центр топоизомеразы V, образующего ковалентную связь с 3' концом ДНК во время топоизомеразной реакции. Для выполнения этой задачи получили 22 мутантных белка, содержащих одну точечную замену остатка тирозина на фенилаланин. Установление гомологии первичной структуры отдельных районов топоизомеразы V и эукариотической p-полимеразы позволило сделать предположение о том, что топоизомераза V способна осуществлять лиазные реакции эксцизионной репарации ДНК. Для проверки этой гипотезы провели эксперименты по определению АР и dRP лиазных активностей.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

В настоящей работе определен и проанализирован новый ген, кодирующий топоизомеразу V Methanopyrus kandlerí. Первичная структура данного белка имеет мало общего с известными ферментами, контролирующими топологию ДНК. В С-концевой аминокислотной последовательности Tono V обнаружили ДНК связывающие мотивы типа спираль-шпилька-спираль (HhH). Мотивы HhH не встречаются у других топоизомераз, но характерны для многих других ферментов, работающих с ДНК. Особый интерес представляет факт гомологии участка Tono V и домена p-полимеразы, обеспечивающего лиазные реакции этого фермента в эксцизионной репарации ДНК. В данной работе провели эксперименты, которые выявили АР и dRP лиазные активности топоизомеразы V. Таким образом, фермент Methanopyrus kandlerí является первой топоизомеразой, способной осуществлять реакции, относящиеся к эксцизионной репарации ДНК. С помощью точечного мутагенеза определили тирозин, входящий в активный центр фермента, образующий ковалентную связь с ДНК в процессе топоизомеразной реакции. Показали, что топоизомеразная и репарационная функции Tono V разграничены в пределах одного белка и релаксирующая активность фермента не влияет на выполнение лиазных реакций.

Предложено и успешно осуществлено на практике использование Топо V в реакции секвенирования для улучшения определения последовательностей молекул ДНК, имеющих сильно выраженную вторичную структуру или сложное топологическое строение.

ПУБЛИКАЦИИ И АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи. Результаты настоящей работы были доложены на международных конференциях «Термофилы 98» 1998 г. Брест, (Франция), «Малые геномы» 1998 г. Лейк (США), на ме>кдународных семинарах по программе ННМ1 в 1997 г в Варшаве (Польша) и в Вашингтоне (США) в 2000 г.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

КЛАССИФИКАЦИЯ И СТРУКТУРА ДНК ТОПОИЗОМЕРАЗ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Белова, Галина Ивановна

выводы

1) Определена нуклеотидная последовательность гена ¿ор5, кодирующего топоизомеразу V МеМапоругиБ капсИеп. Проведен компьютерный анализ первичной структуры топоизомеразы V. Осуществлена экспрессия гена Ьр5 в Е.соН. Получен рекомбинантный белок, обладающий молекулярной массой и всеми биохимическими свойствами, присущими нативному ферменту, выделенному из М. КапсИеп.

2) В экспериментах ограниченного протеолиза установлена доменная организация топоизомеразы V. Получены рекомбинантные белки, являющиеся отдельными доменами Топо V. Показано, что 1Ч-концевые фрагменты Топо78 и Топо61 обладают специфической топоизомеразной активностью, а С-концевой субдомен Топо34 обеспечивает нековалентное связывание ДНК в растворах, содержащих высокую концентрацию соли.

3) С помощью точечного мутагенеза установлено, что Тугггб входит в активный центр фермента и образует ковалентную связь с ДНК.

4) Показано участие топоизомеразы V в эксцизионной репарации ДНК.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю благодарность моему научному руководителю, кандидату физико-математических наук А. И. Слесареву за возможность пройти настоящую научную школу. Я глубоко признательна руководителю лаборатории, профессору В. А. Ефимову за всестороннюю поддержку и помошь в моей работе. Особую благодарность хочется выразить О. Г. Чахмахчевой.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Belova G. I, Prasad R., Kozyavkin S. A., Lake J. A., Wilson S. H., Slesarev A. I. A type IB topoisomerase with DNA repair activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A (2001), 98 (11), 6015-6020.

2. Slesarev A. I., Belova G. I., Lake J. A., Kozyavkin S. A. Topoisomerase V from Methanopyrus kandleri. Methods Enzymol. (2001), 334, 179-192.

3. Belova, G., Prasad, R., Wilson, S., and Slesarev, A. Domain Organization and New Activities of Methanopyrus kandleri DNA Topoisomerase V. International Conference "Thermophiles' 98", Brest, France, 6-11 September, 1998, Abstracts, p. G-P282.

4. Slesarev, A., Belova, G., Musgrave, D., Kozyavkin, S., Prasad, R., Wilson, S. Studies of Proteins Regulating DNA topology in Hyperthermophle Methanopyrus kandleri. ASM Conference on Small Genomes, Lake Arrowhead, California, USA, 20-24 September,. 1998, Abstracts, p. 16-17.

5. Belova G., Ryazantsev S., Krach R., Lake J., Koozyavkin S., Slesarev A. Study of proteins controlling DNA topology in the hyperthermophile Methanopyrus kandleri. HHMI Meeting of International Research Scholars. Warsaw, Poland, 6-12 June, 1997, Abstracts, p. 78.

6. Belova G., Prasad, R., Wilson, S., Koozyavkin S., Slesarev A. The domain organization and properties of individual domains of DNA topoisomerase V, a type 1B topoisomerase with DNA repair activities. HHMI Meeting of International Research Scholars. Washington, USA, 7-13 June, 2000, Abstracts, p. 96.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белова, Галина Ивановна, Москва

1. Vinograd J., Lebowitz J., Radioff R., Watson R., Laipis P. The twisted circular form of polyoma viral DNA. Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1965), v. 53, 11041111.

2. Worcel A., Burgi E. On the structure of the folded chromosome of E. coli. J. Mol. Biol. (1972), v.71, 127-147.

3. Cook P.R., Brazell I.A. Supercoils in human DNA. J. Cell Sei. (1975), v. 19, 261-279.

4. Crick F.H.C. Linking numbers and nucleosomes. Proc Natl. Acad. Sei. USA (1976), v.73, 2639-2643.

5. Champoux J. J., Dulbeco R. An activity from mammalian cells that untwists superhelical DNA-a possible swivel for DNA replication (polyoma-ethidium bromide-mouse-embryo cells-dye binding assay). Proc Natl. Acad. Sei. USA (1972) v.69, 143-46.

6. Geliert M., Mizuuchi K., O'Dea M. H, Nash H.A. DNA gyrase: an enzyme that introduces superhelical turns into DNA. Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1976) v.73, 3872-76.

7. Bergerat A., Gadelle D., Forterre P. Purification of a DNA topoisomerase II from the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus shibatae. A thermostable enzyme with both bacterial and eucaryal features. J. Biol. Chem. (1994), v. 269, 27663-9.

8. Wang J.C. DNA Topoisomerases. Ann. Rev. Biochem. (1996) v.65, 635-92.

9. Якубовская E.A., Габибов А.Г. Топоизомеразы. Механизм изменения топологии ДНК. Молекулярная биология., (1999), т. 33(3), 368-84

10. Cozzarelli N. R. DNA topoisomerases. Cell (1980) v.22, 327-8.

11. Brown P.O., Cozzarelli N.R. A sign inversion mechanism for enzymatic supercoiling of DNA. Science (1979) v.30, 1081-3.

12. Tse Y. S., Kirkegaard K., Wang J. C. Covalent bonds between protein and DNA. Formation of phosphotyrosine linkage between certain DNA topoisomerases and DNA. J. Biol. Chem. (1980) v.255, 5560-65.

13. Champoux J.J. DNA is linked to the rat liver DNA nicking-closing enzyme by a phosphodiester bond to tyrosine. J. Biol. Chem. (1981) v.256, 4805-9.

14. Rowe T.C., Tewey K.M., Liu L.F. Identification of the breakage-reunion subunit of T4 DNA topoisomerase. J. Biol. Chem. (1984) v.259, 9177-81.

15. Brown P.O., Cozzarelli N.R. Catenation and knotting of duplex DNA by type 1 topoisomerases: a mechanistic parallel with type 2 topoisomerases. Proc. Natl. Acad. Sei. U S A (1981) v.78, 843-7.

16. Kirkegaard K., Wang J. C. Bacterial DNA topoisomerase I can relax positively supercoiled DNA containing a single-stranded loop. J. Mol. Biol. (1985) v.185, 625-37.

17. Tse-Dinh Y.S., McCarron BGH, Arentzen R., Chowdhry V. Mechanistic study of E. coli DNA topoisomerase I: cleavage of oligonucleotides. Nucleic Acids Res. (1983) v.11, 8691-701.

18. Trucksis M., Depew R.E. Identification and localization of a gene that specifies production of Escherichia coli DNA Topoisomerase I. Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1981) v.78, 2164-8.

19. Lynn R.M., Wang J.C. Peptide sequencing and site-directed mutagenesis identify tyrosine-319 as the active site tyrosine of Escherichia coli DNA topoisomerase I. Proteins (1989) v.6, 231-9.

20. Lima C.D., Wang J.C., Mondragon A. Crystallization of a 67 kDa fragment of Escherichia coli DNA topoisomerase I. J. Mol. Biol. (1993) v.20,1213-6.

21. Beran-Steed R.K., Tse-Dinh Y.C. The carboxyl terminal domain of Escherichia coli DNA topoisomerase I confers higher affinity to DNA. Proteins (1989) v.6, 249-58.

22. Yu L., Zhu C.X., Tse-Dinh Y.C., Fesik S.W. Solution structure of the C-terminal single-stranded DNA-binding domain of Escherichia coli topoisomerase I. Biochemistry (1995) v.34, 7622-8.

23. Lima C.D., Wang J.C., Mondragon A. Three-dimensional structure of the 67K N-terminal fragment of E. coli DNA topoisomerase I. Nature (1994) v.367, 13846.

24. Berger J.M. Structure of DNA topoisomerases. Biochim. Biophys. Acta. (1998), v.1400,3-18.

25. Brennan RG, Matthews BW. The helix-turn-helix DNA binding motif. J. Biol. Chem. (1989), 264(4), 1903-6

26. Feinberg H., Lima C.D., Mondragon A. Conformational changes in E. coli DNA topoisomerase I. Nat Struct Biol. (1999) v.6, 918-22.

27. Srivenugopal K.S., Lockshon D., Morris D.R. Escherichia coli DNA topoisomerase III: purification and characterization of a new type I enzyme. Biochemistry (1984) v.23,1899-906.

28. Zhang H.L., Malpure S., DiGate R.J. Escherichia coli DNA topoisomerase III is a site-specific DNA binding protein that binds asymmetrically to its cleavage site. J. Biol. Chem. (1995) v.270, 23700-5.

29. DiGate R.J., Marians K.J. Identification of a potent decatenating enzyme from Escherichia coli., J. Biol. Chem. (1988) v.263, 13366-73.

30. DiGate R.J., Marians K.J. Molecular cloning and DNA sequence analysis of Escherichia coli topB, the gene encoding topoisomerase III. J. Biol. Chem. (1989) v.264, 17924-30.

31. Zhang H.L., DiGate R.J. The carboxyl-terminal residues of Escherichia coli DNA topoisomerase III are involved in substrate binding. J. Biol. Chem. (1994) v.269, 9052-9.

32. Zhang H.L., Malpure S., Li Z., Hiasa H., DiGate R.J. The role of the carboxyl-terminal amino acid residues in Escherichia coli DNA topoisomerase Ill-mediated catalysis. J. Biol. Chem. (1996) v.271, 9039-45.

33. Mondragon A., DiGate R. The structure of Escherichia coli DNA topoisomerase III. Structure Fold Des. (1999) v. 15, 1373-83.

34. Li Z., Mondragon A., Hiasa H., Marians K.J., DiGate R.J. Identification of a unique domain essential for Escherichia coli DNA topoisomerase Ill-catalysed decatenation of replication intermediates. Mol. Microbiol. (2000) v.35, 888-95.

35. Wallis J.W., Chrebet G., Brodsky G., Rolfe M., Rothstein R. A hyper-recombination mutation in S. cerevisiae identifies a novel eukaryotic topoisomerase. Cell (1989) v.58, 409-19.

36. Bouthier de la Tour C., Portemer C., Huber R., Forterre P., Duguet M. Reverse gyrase in thermophilic eubacteria J. Bacteriol. (1991) v. 173, 3921-3.

37. Kikuchi A., Asai K. Reverse gyrase a topoisomerase which introduces positive superhelical turns into DNA. Nature (1984) v.309, 677-81.

38. Confalonieri F., Elie C., Nadal M., de La Tour C., Forterre P., Duguet M. Reverse gyrase: a helicase-like domain and a type I topoisomerase in the same polypeptide. Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1993) v.90, 4753-7.

39. Thrash C., Bankier A.T., Barrell B.G., Sternglanz R. Cloning, characterization, and sequence of the yeast DNA topoisomerase I gene. Proc. Natl. Acad. Sei. U SA(1985) v.82, 4374-8.

40. Lynn R.M., Bjornsti M.A., Caron P.R., Wang J.C. Peptide sequencing and site-directed mutagenesis identify tyrosine-727 as the active site tyrosine of Saccharomyces cerevisiae DNA topoisomerase I. Proc. Natl. Acad. Sei. U S A (1989) v.86, 3559-63.

41. Bjornsti M.A., Wang J.C. Expression of yeast DNA topoisomerase I can complement a conditional-lethal DNA topoisomerase I mutation in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1987) v.84, 8971-5.

42. Lue N., Sharma A., Mondragon A., Wang J.C. A 26 kDa yeast DNA topoisomerase I fragment: crystallographic structure and mechanistic implications. Structure (1995) v. 15, 1315-22.

43. D'Arpa P., Machlin P.S., Ratrie H. 3d, Rothfield N.F., Cleveland D.W., Earnshaw W.C. cDNA cloning of human DNA topoisomerase I: catalytic activity of a 67.7-kDa carboxyl-terminal fragment. Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1988) v.85, 2543-7.

44. Stewart L., Ireton G.C., Parker L.H., Madden K.R., Champoux J.J. Biochemical and biophysical analyses of recombinant forms of human topoisomerase I. J. Biol. Chem. (1996) v.29, 7593-601.

45. Stewart L., Ireton G.C., Champoux J.J. The domain organization of human topoisomerase I. J. Biol. Chem. (1996) v.29, 7602-8.

46. Stewart L., Ireton G.C., Champoux J.J. Reconstitution of human topoisomerase I by fragment complementation. J. Mol. Biol. (1997) v.13, 35572.

47. Redinbo M.R., Stewart L., Kuhn P., Champoux J.J., Hol W.G. Crystal structures of human topoisomerase I in covalent and noncovalent complexes with DNA. Science (1998) v.6, 1504-13.

48. Shuman S. Site-specific interaction of vaccinia virus topoisomerase I with duplex DNA. Minimal DNA substrate for strand cleavage in vitro. J. Biol. Chem. (1991) v.15, 11372-9.

49. Shuman S., Golder M., Moss B. Characterization of vaccinia virus DNA topoisomerase I expressed in Escherichia coli. J. Biol. Chem. (1988) v.5, 16401-7.

50. Shuman S., Kane E.M., Morham S.G. Mapping the active-site tyrosine of vaccinia virus DNA topoisomerase I. Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1989) v.86, 9793-7.

51. Caron P.R., Wang J.C. Appendix. II: Alignment of primary sequences of DNA topoisomerases. Adv. Pharmacol. (1994) v. 29 B, 271-97.

52. Krogh BO, Shuman S. Vaccinia topoisomerase mutants illuminate conformational changes during closure of the protein clamp and assembly of a functional active site. J Biol Chem 2001 Jul 5

53. Sekiguchi J., and Shuman S. Proteolytic footprinting of vaccinia topoisomerase bound to DNA. J. Biol. Chem. (1995) v.270, 11636-45.

54. Sharma A., Hanai R., Mondragon A. Crystal structure of the amino-terminal fragment of vaccinia virus DNA topoisomerase I at 1.6 A resolution. Structure (1994) v.2, 767-77.

55. Sekiguchi J, Shuman S. Identification of contacts between topoisomerase I and its target DNA by site-specific photocrosslinking. EMBO J. (1996) v. 15, , 3448-57.

56. Cheng C., Shuman S. A catalytic domain of eukaryotic DNA topoisomerase I. J. Biol. Chem. (1998) v.273, 11589-95.

57. Cheng C., Kussie P., Pavletich N., Shuman S. Conservation of structure and mechanism between eukaryotic topoisomerase I and site-specific recombinases. Cell (1998) v.92, 841-50.

58. Kwon H.J., Tirumalai R., Landy A., Ellenberger T. Flexibility in DNA recombination: structure of the lambda integrase catalytic core. Science (1997) v.276, 126-31.

59. Hickman A.B., Waninger S., Scocca J.J., Dyda F. Molecular organization in site- specific recombination: the catalytic domain of bacteriophage HP1 integrase at 2.7 A resolution. Cell (1997) v.89, 227-37.

60. Guo F., Gopaul D.N., van Duyne G.D. Structure of Cre recombinase complexed with DNA in a site-specific recombination synapse. Nature (1997) v.389, 40-6.

61. Sekiguchi J., Seeman N.C., Shuman S. Resolution of Holliday junctions by eukaryotic DNA topoisomerase I. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) v.23, 785-9.

62. Esposito D., Scocca J.J. The integrase family of tyrosine recombinases: evolution of a conserved active site domain. Nucleic Acids Res. (1997) v. 15, 3605-14.

63. Slesarev A.I., Stetter K.O., Lake J.A., Gellert M., Krah R., Kozyavkin S.A. DNA topoisomerase V is a relative of eukaryotic topoisomerase I from a hyperthermophilic prokaryote. Nature (1993) v. 19, 735-7.

64. Morham S.G., Shuman S. Phenotypic selection and characterization of mutant alleles of a eukaryotic DNA topoisomerase I. Genes Dev. (1990) v.4, 515-24.

65. Kozyavkin S.A., Pushkin A.V., Eiserling F.A., Stetter K.O., Lake J.A., Slesarev A.I. DNA enzymology above 100 degrees C. Topoisomerase V unlinks circular DNA at 80-122 degrees C. J. Biol. Chem. (1995) v.9, 13593-5.

66. Der Garabedian P.A., Mirambeau G., Vermeersch J.J. Mg2+, Asp-, and Glu-effects in the processive and distributive DNA relaxation catalyzed by a eukaryotic topoisomerase. Biochemistry (1991) v.30, 9940-7.

67. Ma K., Zirngibl C„ Under D„ Stetter K.O., Thauer R.K. N5, N10-methylenetetrahydromethanopterin dehydrogenase (H2-forming) from the extreme thermophile Methanopyrus kandleri. Arch. Microbiol. (1991), v. 156, 43-8.

68. Palmer J.R., Baltrus Т., Reeve J.N., Daniels C.J. Transfer RNA genes from the hyperthermophilic Archaeon, Methanopyrus kandleri. Biochim. Biophys. Acta (1992) v.1132, 315-8.

69. Higgins N.P., Cozzarelli N.R. The binding of gyrase to DNA: analysis by retention by nitrocellulose filters. Nucleic Acids Res. (1982) v.11, 6833-47.

70. Mizuuchi K., O'Dea M.H., Gellert M. DNA gyrase: subunit structure and ATPase activity of the purified enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) v.75, 5960-3.

71. Swanberg S.L., Wang J.C. Cloning and sequencing of the Escherichia coli gyrA gene coding for the A subunit of DNA gyrase. J. Mol. Biol. (1987) v.20, 729-36.

72. Adachi T., Mizuuchi M., Robinson E.A., Appella E., O'Dea M.H., Geliert M., Mizuuchi K. DNA sequence of the E. coli gyrB gene: application of a new sequencing strategy. Nucleic Acids Res. (1987) v.26, 771-84.

73. Reece R.J., Maxwell A. The C-terminal domain of the Escherichia coli DNA gyrase A subunit is a DNA-binding protein. Nucleic Acids Res. (1991) v.11, 1399-405.

74. Ali J.A., Jackson A.P., Howells A.J., Maxwell A. The 43-kilodalton N-terminal fragment of the DNA gyrase B protein hydrolyzes ATP and binds coumarin drugs. Biochemistry (1993) v. 16, 2717-24.

75. Reece R.J., Maxwell A. Reece RJ, Maxwell A Probing the limits of the DNA breakage-reunion domain of the Escherichia coli DNA gyrase A protein. J. Biol. Chem. (1991) v.25, 3540-6.

76. Cabral M.J.H., Jackson A.P., Smith C.V., Shikotra N., Maxwell A., Liddington R.C. Crystal structure of the breakage-reunion domain of DNA gyrase. Nature (1997), v.388, 903-6.

77. Wig ley D.B., Davies G.J., Dodson E.J., Maxwell A., Dodson G. Crystal structure of an N-terminal fragment of the DNA gyrase B protein. Nature (1991) v.351, 624-9.

78. Wigley D.B. Structure and mechanism of DNA topoisomerases. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (1995) v.24, 185-208.

79. Kato J., Suzuki H., Ikeda H. Purification and characterization of DNA topoisomerase IV in Escherichia coli. J. Biol. Chem. (1992) v.267, 25676-84.

80. Crisona NJ, Strick TR, Bensimon D, Croquette V, Cozzarelli NR Preferential relaxation of positively supercoiled DNA by E. coli topoisomerase IV in single-molecule and ensemble measurements Genes Dev 2000 Nov 15;14(22):2881-92

81. Deibler R.,W., Rahmati S., Zechiedrich EL. Topoisomerase IV, alone, unknots DNA in E. coli. Genes Dev, (2001), v. 15, 748-61.

82. Peng H., Marians K.J. Escherichia coli topoisomerase IV. Purification, characterization, subunit structure, and subunit interactions. J. Biol. Chem. (1993) v. 268, 24481-90.

83. Bahng S., Mossessova E., Nurse P., Marians K.J. Mutational analysis of Escherichia coli topoisomerase IV. III. Identification of a region of parE involved in covalent catalysis. J. Biol. Chem. (2000) v. 275, 4112-7.

84. Huang W.M. Nucleotide sequence of a type II DNA topoisomerase gene. Bacteriophage T4 gene 39. Nucleic Acids Res. (1986) v.14, 7751-65.

85. Huang W.M. Virus-encoded DNA topoisomerases. In «DNA topology and Its Biological Effects» (1990) Cold Spring Harbor Laboratory Press, 265-283.

86. Freudenreich C.H., Kreuzer K.N. Mutational analysis of a type II topoisomerase cleavage site: distinct requirements for enzyme and inhibitors. EMBO J. (1993) v.12, 2085-97.

87. Giaever G., Lynn R., Goto T., Wang J.C. The complete nucleotide sequence of the structural gene TOP2 of yeast DNA topoisomerase II. J. Biol. Chem. (1986) v.25, 12448-54.

88. Lynn R., Giaever G., Swanberg S.L., Wang J.C. Tandem regions of yeast DNA topoisomerase II share homology with different subunits of bacterial gyrase. Science (1986) v.233, 647-9.

89. Worland S.T., Wang J.C. Inducible overexpression, purification, and active site mapping of DNA topoisomerase II from the yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. (1989) v.264, 4412-6.

90. Berger J.M., Gamblin S.J., Harrison S.C., Wang J.C. Structure and mechanism of DNA topoisomerase II. Nature (1996) v.379, 225-32.

91. Berger J.M., Fass D., Wang J.C., Harrison S.C. Structural similarities between topoisomerases that cleave one or both DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A (1998) v.95, 7876-81.

92. Liu Q., Wang J.C. Similarity in the catalysis of DNA breakage and rejoining by type IA and IIA DNA topoisomerases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) v.96, 881-6.

93. Keck J.L., Berger J.M. Enzymes that push DNA around. Nat. Struct. Biol. (1999) v.6, 900-2.

94. Bergerat A., de Massy B., Gadelle D., Varoutas P.C., Nicolas A., Forterre P. An atypical topoisomerase II from Archaea with implications for meiotic recombination. Nature (1997) v.386, 414-7.

95. Buhler C., Gadelle D., Forterre P., Wang J.C., Bergerat A. Reconstitute of DNA topoisomerase VI of the thermophilic archaeon Sulfolobus shibatae from subunits separately overexpressed in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. (1998) v.26, 5157-62.

96. Nichols M.D., DeAngelis K., Keck J.L., Berger J.M. Structure and function of an archaeal topoisomerase VI subunit with homology to the meiotic recombination factor Spoil EMBO J. (1999) v.18, 6177-88

97. HO.Buhler C,-Lebbink JH, Bocs C, Ladenstein R, Forterre P. DNA topoisomerase VI generates ATP dependant double-strand breaks with two-nucleotide overhangs. J Biol Chem, 2001,

98. Postow L, Peter BJ, Cozzarelli NR. Knot what we thought before: the twisted story of replication. Bioessays (1999) 21, 805-8.

99. Khodursky A. B., Brian J. P., Molly B. S., DeRisi J., Botstein D„ Brown P.O., and Cozzarelli N. R. Analysis of topoisomerase function in bacterial replication fork movement: Use of DNA microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000), v. 97, 9419-9424.

100. Brill SJ, DiNardo S, Voelkel-Meiman K, Sternglanz R. Need for DNA topoisomerase activity as a swivel for DNA replication for transcription of ribosomal RNA. Nature (1987), v. 326, 812.

101. Yang L, Wold M.S., Li J.J., Kelly T.J., Liu L.F. Roles of DNA topoisomerases in simian virus 40 DNA replication in vitro. Proc Natl Acad Sci USA. (1987), v. 84, 950-4.

102. Brill SJ, Sternglanz R. Transcription-dependent DNA supercoiling in yeast DNA topoisomerase mutants. Cell (1988), v. 54, 403-11.

103. Stewart A.F., Herrera R.E., Nordheim A. Rapid induction of c-fos transcription reveals quantitative linkage of RNA polymerase II and DNA topoisomerase I enzyme activities. Cell (1990) v. 60,141-9.

104. Gilmour D.S., Pflugfelder G., Wang J.C., Lis J.T. Topoisomerase I interacts with transcribed regions in Drosophila cells. Cell (1986) v. 44, 401-7.

105. Schultz M.C., Brill S.J., Ju Q., Sternglanz R., Reeder R.H. Topoisomerases and yeast rRNA transcription: negative supercoiling stimulates initiation and topoisomerase activity is required for elongation. Gen Dev (1992), v. 6, 133241.

106. Choder M. A general topoisomerase l-dependent transcriptional repression in the stationary phase in yeast. Genes Dev (1991), v. 5, 2315-26.

107. Egyhazi E, Durban E. Microinjection of anti-topoisomerase I immunoglobulin G into nuclei of Chironomus tentans salivary gland cells leads to blockage of transcription elongation. Mol. Cell Biol. (1987), v. 7, 4308-16.

108. Hanafi D., Bossi L. Activation and silencing of leu-500 promoter by transcription- induced DNA supercoiling in the Salmonella chromosome. Mol. Microbiol. (2000), v. 37, 583-94.

109. Lewis D.E., Geanacopoulos M., Adhya S. Role of HU and DNA supercoiling in transcription repression: specialized nucleoprotein repression complex at gal promoters in Escherichia coli. Mo.I Microbiol. (1999), v. 31, 451-61.

110. Beaucage S.L., Miller C.A., Cohen S.N. Gyrase-dependent stabilization of pSC101 plasmid inheritance by transcriptionally active promoters. EMBO J. (1991), v. 10, 2583-8.

111. Buchenau P., Saumweber H., Arndt-Jovin D.J. Consequences of topoisomerase II inhibition in early embryogenesis of Drosophila revealed by in vivo confocal laser scanning microscopy. J. Cell Sci. (1993), v. 104,1175-85.

112. Goodwin A., Wang S.W., Toda T., Norbury C., Hickson I.D. Topoisomerase III is essential for accurate nuclear division in Schizosaccharomyces pombe. Nucleic Acids Res. (1999), v. 27, 4050-8.

113. Adachi Y., Luke M., Laemmli U.K. Chromosome assembly in vitro: topoisomerase II is required for condensation. Cell (1991), v. 64, 137-48.

114. Hartsuiker E., Bahler J., Kohli J. The role of topoisomerase II in meiotic chromosome condensation and segregation in Schizosaccharomyces pombe. Mol Biol. Cell (1998), v. 10, 2739-50.

115. Durrieu F., Samejima K., Fortune J.M., Kandels-Lewis S., Osheroff N., Earnshaw W.C. DNA topoisomerase llalpha interacts with CAD nuclease andis involved in chromatin condensation during apoptotic execution. Curr. Biol. (2000), v. 10, 923-6.

116. Christman M.F., Dietrich F.S., Fink G.R. Mitotic recombination in the rDNA of S. cerevisiae is suppressed by the combined action of DNA topoisomerases I and II. Cell (1988), v. 55, 413-25.

117. Kim R.A., Caron P.R., Wang J.C. Effects of yeast DNA topoisomerase III on telomere structure. Proc Natl Acad Sei USA (1995), v. 92, 2667-71.

118. Schofield M.A., Agbunag R., Michaels M.L., Miller J.H. Cloning and sequencing of Escherichia coli mutR shows its identity to topB, encoding topoisomerase III. J. Bacteriol. (1992), v. 174, 5168-70.

119. Wu L., Karow J.K., Hickson I.D. Genetic recombination: Helicases and topoisomerases link up. Curr. Biol. (1999), v. 15, 518-20.

120. Thayer MM, Ahem H, Xing D, Cunningham RP, Tainer JA. Novel DNA binding motifs in the DNA repair enzyme endonuclease III crystal structure. EMBO J. (1995), v. 14(16), 4108-20.

121. Nelson H. C. Structure and function of DNA-binding proteins. Curr. Opin. Genet. Dev. (1995), v. 5(2), 180-9.

122. Doherty A. J., Serpell L. C., Ponting C. P. The helix-hairpin-helix DNA-binding motif: a structural basis for non-sequence-specific recognition of DNA Nucleic Acids Res. (1996), 24, 2488-97

123. Studier F. W., Rosenberg A. H., Dunn J. J., Dubendorff J. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. (1990), v. 185, 60-89.

124. Wilson S. H. Mammalian base excision repair and DNA polymerase beta. Mutat. Res. (1998), 407, 203-15.

125. Prasad R., Beard W. A., Strauss P. R., Wilson S. H. Human DNA Polymerase beta deoxyribose phosphate lyase. Substrate specificity and catalytic mechanism. J. Biol. Chem. (1998), 273,15263-70

126. Piersen C. E., Prasad R., Wilson S. H., Lloyd R. S. Evidence for an imino intermediate in the DNA polymerase beta deoxyribose phosphate excision reaction. J. Bio.l Chem. (1996), 271, 17811-5.

127. Zechiedrich E. L., Osheroff N. Eukaryotic topoisomerases recognize nucleic acid topology by preferentially interacting with DNA crossovers. EMBO J. (1990), 9(13), 4555-62.

128. Madden K. R., Stewart L., Champoux J. J. Preferential binding of human topoisomerase I to superhelical DNA. EMBO J. (1995), 14(21), 5399-409.

129. Rivera M. C., Lake J. A. The phylogeny of Methanopyrus kandleri. Int. J. Sys. t Bacterid. (1996), 46, 348-51.

130. Sandigursky M., Franklin W. A. Thermostable uracil-DNA glycosylase from Thermotoga maritima a member of a novel class of DNA repair enzymes. Curr. Biol. (1999), v. 9(10), 531-4

131. Sandigursky M., Franklin W A. Uracil-DNA glycosylase in the extreme thermophile Archaeoglobus fulgidus. J. Biol. Chem. (2000), v. 275(25), 191469.

132. Greagg M. A., Fogg M. J., Panayotou G., Evans S. J., Connolly B. A., Pearl L. H. A read-ahead function in archaeal DNA polymerases detects promutagenic template-strand uracil. Proc. Nat.l Acad. Sci. USA (1999), v. 96(16), 9045-50

133. Pouliot J. J., Yao K. C., Robertson C. A., Nash H. A. Yeast gene for a Tyr-DNA phosphodiesterase that repairs topoisomerase I complexes. Science (1999), 286(5439), 552-5.

134. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва, «Мир», 1984.

135. Bradford М. М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. (1976), v. 72, 248-54

136. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (1970), 227, 680-685.