Оптическая спектроскопия в исследовании молекулярных механизмов действия и создании новых противоопухолевых препаратов-ингибиторов ДНК топоизомеразы 1 человека

Олейников, Владимир Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оптическая спектроскопия в исследовании молекулярных механизмов действия и создании новых противоопухолевых препаратов-ингибиторов ДНК топоизомеразы 1 человека
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Оптическая спектроскопия в исследовании молекулярных механизмов действия и создании новых противоопухолевых препаратов-ингибиторов ДНК топоизомеразы 1 человека"

На правах рукописи

ОЛЕЙНИКОВ Владимир Александрович

Оптическая спектроскопия в исследовании молекулярных механизмов действия и создании новых противоопухолевых препаратов - ингибиторов ДНК топоизомеразы I человека

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

» ,

- 7'

- "-у^

Санкт-Петербург ' ^ 2003 год

- J

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Москва

Официальные оппоненты:

Бункин Федор Васильевич, академик РАН, доктор физ.-мат. наук, директор Научного центра волновых исследований Института общей физики им. А.М. Прохорова РАН

Баранов Александр Васильевич, доктор физ.-мат. наук, ФГУП «ВНЦ Государственный оптический институт им. С.И. Вавилова», г. Санкт-Петербург

Тимковский Андрей Леонидович, доктор физ.-мат. наук, Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН, Отделение молекулярной и радиационной биофизики, лаборатория биополимеров.

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра биофизики.

Защита диссертации состоится н "_ 2003 года в часов на

заседании диссертационного совета Д 212.229.25 при Санкт-Петербургском государственном политехническом университете по адресу: 195251, Санкт-Петербург, ул. Хлопина, д.5, физико-медицинский факультет СПбГПУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.

Автореферат диссертации разослан" "_2003 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук

О. Л. Власова

- А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

ДНК топоизомераза I (топо1) - фермент, катализирующий топологические перестройки ДНК, жизненно необходим для функционирования клеток эукариот. Он играет ключевую роль во всех аспектах топологических изменений структуры ДНК, обеспечивая релаксацию суперскрученной ДНК для ее репликации и транскрипции.

Структурно-функциональные исследования топо1 приобрели особое значение, когда стало ясно, что фермент является основной клеточной мишенью для многих известных соединений с противоопухолевой и противомикробной активностью. Это открытие вызвало интенсивный поиск природных и создание новых синтетических соединений, способных специфически взаимодействовать с молекулой ДНК и/или фермента и тем самым влиять на каталитическую активность топо1. Это влияние может проявляться путем либо модулирования узнавания ДНК ферментом (так называемые супрессоры топо1), либо одновременного взаимодействия с ферментом и с ДНК, приводящего к образованию долгоживущих ДНК-белковых, так называемых "расщепленных" комплексов, провоцирующих образование разрывов ДНК и гибель раковых клеток (так называемые яды топо1).

Изучение молекулярных механизмов действия ДНК-специфичных лигандов на ферментативный катализ с участием топо1 необходимо для разработки принципов направленного конструирования селективных ингибиторов топо1 как новых противоопухолевых препаратов. Такой подход делает реальным приложение результатов исследования в медицине. Поэтому решение указанной проблемы актуально не только с фундаментальной, но и с практической точки зрения.

регистрировать малые структурные изменения, индуцированные межмолекулярными взаимодействиями. Основным недостатком метода спектроскопии КР в его "традиционной" форме является низкая чувствительность, что вызывает необходимость применения спектроскопии резонансного КР и разработки новых методических подходов, основанных на спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (ГКР). Построение корректных моделей взаимодействия лиганд - мишень требует комбинированного подхода, основанного на использовании методов оптической спектроскопии и сопоставления получаемых результатов с теоретическими данными и данными биохимических исследований.

Экспериментально-методической основой настоящей работы стало развитие комплексного подхода с использованием спектроскопии флуоресценции и поглощения, кругового и линейного дихроизма, а также спектроскопии КР, резонансного КР и ГКР. Совокупность данных, полученных этими методами, позволяет охарактеризовать структурные предпосылки молекулярных механизмов образования комплексов противоопухолевых ингибиторов топо1 с ДНК, выработать подход к направленному синтезу новых ингибиторов с улучшенными I

свойствами, синтезировать ингибиторы нового типа и предложить структурную

(

модель их взаимодействия с ДНК и ферментом. Параллельные эксперименты по анализу цитотоксичности позволяют провести корреляцию структурно-функциональных данных с противораковой активностью новых соединений.

Цель и задачи работы

Цель настоящей работы - исследование молекулярных механизмов действия противоопухолевых препаратов - ингибиторов ДНК топоизомеразы I человека, действующих по принципу супрессоров либо ядов фермента, и создание на основе понимания этих механизмов новых агентов, объединяющих достоинства обоих классов соединений.

Задачи работы включают:

- повышение чувствительности анализа методом КР, разработку методик формирования структурированных поверхностей, выявление связей геометрических характеристик и оптических свойств таких поверхностей, создание новых ГКР-активных систем, усиливающих преимущественно по электромагнитному механизму;

- исследование молекулярных механизмов действия ядов фермента (на примере соединения из класса камптотецина - топотекана):

- исследование молекулярных механизмов действия супрессоров фермента топо1 (на примере производных нетропсина - бис-нетропсинов различной структуры);

- определение принципов построения соединений, совмещающих достоинства ядов и супрессоров фермента, синтез и исследование таких соединений.

Научная новизна

В настоящей работе впервые

(1) Исследованы нелинейно-оптические свойства нового типа ГКР-активных поверхностей, реализующих усиление сигнала КР по дальнедействующему электромагнитному механизму и позволяющих улучшить • предел детекции биологических молекул на 2-3 порядка.

(2) Исследованы молекулярные механизмы действия ингибиторов ДНК топоизомеразы I человека: типичного яда фермента (клинически важного аналога камптотецина - топотекана), а также типичных супрессоров (производных нетропсина - бис-нетропсинов). В частности, определена геометрия взаимодействия топотекана с ДНК и показано, что связывание с ДНК стабилизирует активную форму топотекана; выявлены молекулярные детерминанты, определяющие действие топотекана, предложена молекулярная модель комплекса топотекан-ДНК.

(3) Выявлены основные механизмы ингибирования активности топо1 производными нетропсина - бис-нетропсинами разной структуры. Показано, что ключевую роль в ингибировании топо1 играют изменения структуры ДНК, индуцированные связыванием производных нетропсина. Показано, что присутствие бис-нетропсинов способно стимулировать формирование тройного комплекса ДНК/топо1/камптотецин, усиливая, таким образом, ингибирующее действие камптотецина.

(4) Предложен новый подход к конструированию противоопухолевых соединений нового типа, обладающих комбинированными свойствами супрессоров топо1 и соединений, специфически связывающихся в тройной комплекс. Синтезированы и исследованы свойства гибридного соединения камптотецин-нетропсин.

Практическая значимость:

- разработаны новые методы усиления сигнала КР, повышающие чувствительность анализа биологических объектов при минимальном искажении их структуры;

- разработаны модельные системы для изучения особенностей взаимодействия биологических объектов, основанные на использовании методики ГКР;

- на основе полученных данных о молекулярных механизмах действия ингибиторов топо1 из семейства камптотецина и производных бис-нетропсинов сконструировано, синтезировано и исследовано новое соединение, объединяющее достоинства супрессоров и агентов, специфически фиксирующих ДНК-ферментный комплекс на стадии щепления ДНК; на примере клеточной линии аденокарциномы яичников показана перспективность нового соединения.

На защиту выносятся следующие положения и результаты

(1) Комплексный подход к изучению молекулярных механизмов действия ингибиторов ДНК топоизомеразы I человека, основанный на применении комбинации 'методов оптической спектроскопии, методов расчета структуры, электронных и колебательных состояний биологических молекул в сопоставлении с биохимическими данными.

(2) Модели молекулярных механизмов действия соединений - супрессоров ДНК топоизомеразы I человека

(3) Молекулярная модель взаимодействия производного камптотецина -топотекана, ингибитора ДНК топоизомеразы I человека с ДНК. Методика интерпретации линий в спектрах КР топотекана, основанная на использовании разных ионных состояний топотекана; методика оценки степени димеризации молекулы в растворе и в комплексах с ДНК по данным спектроскопии ГКР и флуоресценции.

(4) Подход к конструированию противоопухолевых соединений нового типа, обладающих комбинированными свойствами супрессоров топо1 и соединений - ядов фермента, специфически связывающихся в тройной комплекс.

(5) Методика приготовления структурированных ГКР-активных поверхностей нового типа; выявленные закономерности, связывающие геометрические и электрические характеристики структурированных поверхностей с их оптическими свойствами; механизмы усиления эффекта КР на таких поверхностях; новый класс

ГКР-активных подложек, позволяющих записывать спектры КР пикограммовых количеств биологических молекул.

Публикации

По проблеме, рассмотренной в настоящей диссертации, опубликовано 63 работы. Основные приведены в списке публикаций.

Апробация работы

Результаты настоящей работы представлены:

- на 8-й Всесоюзной конф. по электронной микроскопии (Москва, 1987);

- на 20-й Всесоюзной конф. по эмиссионной электронике (Киев, 1987);

- на 9-м семинаре "Методы расчета электронно-оггтич. систем" (Ташкент, 1988);

- на 12-й Европейской конф. по кристаллографии (Москва, 1989);

- на 3-й Межд. конф. по применению лазеров в науках о жизни (Москва, 1990);

- на Всесоюзной конференции по люминесценции (Москва, 1991);

- на 1-й (1991), 2-й (1992) и 3-й (1993) Межд. конф. "Трековые капиллярные мембраны и их применения" (Польша);

- на 17-й Межд. конф. "Ядерные треки в твердом теле" (Дубна, 1994);

- на Российской конф. по мембранам и мембранным технологиям (Москва, 1995);

- на Межд. конф. "Биология и химия сиаловых кислот" (Москва, 1994);

- на 3-м Международном конгрессе по биоорганичекой химии (Дагомыс, 1995);

- на Международном конгрессе по аналитической химии (Москва, 1997);

- на 10-м Феофиловском симп. по спектроскопии кристаллов, активированных ионами редкоземельных и переходных элементов (С.-Петербург, 1995);

- на 15-й (Питсбург, США, 1996), 16-й (Кейптаун, ЮАР, 1998) и 17-й (Пекин, Китай, 2000) Международных конференциях по Рамановской спектроскопии;

- на 24-м (Прага, Чехия, 1998), 25-м (Коимбра, Португалия, 2000) и 26-м (Лилль, Франция, 2002) Европейских конгрессах по молекулярной спектроскопии;

- на 5-й (Лоутраки, Греция, 1993), 6-й (Лилль, Франция, 1995), 7-й (Мадрид, Испания, 1997), 8-й (Энсхеде, Нидерланды, 1999) и на 10-й (Зегет, Венгрия, 2003) • Европейских конференциях по спектроскопии биологических молекул;

- на 4-м Международном симпозиуме по ионам металлов в биологии и в медицине (Барселона, Испания, 1996);

- на 3-й Международной конференции "Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии" (С.-Петербург, Россия, 2001);

- на 12-м Съезде по биомолекулярной стереодинамике (Албани, США, 2001);

- на конф. "Роль топоизомераз в раковых заболеваниях", Международный инст. по противораковым исследованиям (Афины, Греция, 2001);

- на 1-й Межд. конф. по колебательной спектроскопии (Турку, Финляндия, 2001);

- на 2-й (1997), 3-й (1999) и 4-й (2001) конф. по молекулярной биологии (Москва, Ярославль, С.-Петербург);

- на II съезде биофизиков России (Москва, 1999);

- на 3-ем съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002);

- на Межд. конф. по спектроскопии и применению спектр, методов (Киев, 2003);

- на Межд. конф. по физике лазеров и их применениям (Минск, 2003).

Экспериментальные и теоретические материалы, представленные в диссертации, получены непосредственно автором или под его руководством.

Объем и структура работы

Работа состоит из введения, шести глав и выводов. Работа изложена на 266 страницах, включает в себя 8 таблиц и 59 рисунков. Библиография содержит 247 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение

Во введении сформулированы направления работы, ее цели и задачи, представлен материал, характеризующий актуальность данных исследований.

Глава 1. Современное состояние проблемы

В главе дан обзор современных представлений о структуре и функционированию ДНК топоизомеразы I, описаны известные методы ингибирования фермента, рассмотрены проблемы разработки новых противоопухолевых соединений. Проанализированы известные механизмы усиления эффекта комбинационного рассеяния света молекулами, локализованными вблизи специально подготовленных поверхностей, - эффекта гигантского комбинационного рассеяния. Сформулированы задачи исследования.

Глава 2. Новые технологии в приготовлении поверхностей с регулируемыми неоднородностями. Разработка новых типов ГКР-акгивных поверхностей

Несмотря на то что эффект гигантского КР был открыт еще в 1973 году, не прекращаются поиски новых КР усиливающих поверхностей. С одной стороны, привлекательно создание поверхностей для исследования структурных особенностей макромолекул, обеспечивающих усиление сигнала ГКР только определенных веществ или групп атомов, то есть поверхностей с дистанционнозависимым усилением. Для этой цели подходящими являются ГКР-активные поверхности с сильной связью адсорбент-адсорбат, обеспечивающие так называемый "молекулярный" механизм усиления. С другой стороны, существует возможность создания универсальных ГКР-акгивных поверхностей, усиление КР на которых не зависит от свойств нанесенной пробы, а связано только со свойствами металлической поверхности. Усиление КР молекул, находящихся вблизи поверхности таких подложек, обусловлено электромагнитным механизмом усиления и не зависит от химической природы адсорбента. Такие поверхности представляют значительный интерес в плане создания универсальных систем детектирования и исследования микроколичесгв биомолекул с высокой чувствительностью.

Усиление интенсивности излучения молекулой по электромагнитному механизму определяется выражением*.

С = <£) = {|1Ч®-П)£И3) ' (1)

где Цоз) - фактор локального поля, выражающий отношение напряженности .электрического поля в падающей световой волне и поля, модифицированного близостью металлической поверхности, Ь'((о-П) - фактор локального поля, учитывающий изменение, излучения поля молекулой, <и - частота падающей световой волны, ¡1 - частота внутримолекулярных колебаний, определяющая комбинационный сдвиг. Угловые скобки означают усреднение по облучаемому участку поверхности. Точный расчет факторов локального поля Ца>) и коэффициента усиления О для реальных шероховатых поверхностей не представляется возможным, поэтому основные закономерности электромагнитных механизмов усиления исследуются на простых моделях. Для экспериментальной проверки могут быть использованы наноструктуры, состоящие из повторяющихся элементов. Повторяющийся характер неоднородностей позволяет создавать

одинаковые условия усиления на каждом из элементов и, таким образом, получать значительное усиление сигнала КР. В настоящей работе для создания таких структур использована оригинальная методика - техника трековых мембран.

Основой приготовления наноструктур являются так называемые трековые мембраны - полимерные пленки, облученные пучком высокоэнергетичных ионов (с энергией ~ 1 - 2 МэВ/нуклон) и обработанные затем химическим реагентом, воздействующим на полимер в области треков для получения пор, однородных по форме, размерам и ориентации. Поверхности с выступами заданной формы готовили путем снятия металлических реплик с системы пор трековых мембран. Для приготовления систем металлических нанотрубок на поверхность трековых мембран напыляли металл, причем условия напыления подбирались так, чтобы внутренняя поверхность пор была покрыта слоем металла. Использованная методика позволяла варьировать плотность элементов, их форму, размер и ориентацию, а также металл, из которого они были изготовлены.

Рис. 1. Микрофотографии металлизированной поверхности трековой мембраны (А) и структурированной металлической поверхности (серебро) с выступами конической формы (Б), полученные на сканирующем электронном микроскопе. Изображение вершины конического выступа (В) получено на просвечивающем электронном микроскопе.

ГКР-активные поверхности на основе острийных структур

Локальное поле Е^ вблизи неоднородностей на поверхности металла определяется двумя факторами: (1) резонансным возбуждением светом локальных поверхностных плазмонов и (2) "эффектом светящегося острия", связанным с концентрированием силовых линий электрического поля вблизи поверхности ■ высокой кривизны. Резонансные эффекты наблюдаются только в той области частот, где действительная часть диэлектрической проницаемости подложки е - ё + i-e"

отрицательна (е' < 0). Возрастание напряженности локального поля Ei« зависит от затухания в металле, определяемого мнимой частью е". Для эллипсоида вращения, помещенного во внешнее световое поле Е0, вектор напряженности которого направлен вдоль его оси, локальное поле вблизи его вершины определяется выражением

где А - зависящий от геометрических параметров фактор деполяризации. Оценки показывают, что для серебряной сферы резонансная длина волны X = 355 нм. Создание вытянутых структур и возбуждение продольной моды колебаний смещает резонанс в длинноволновую область. Нерезонансный "эффект светящегося острия" определяется радиусом кривизны вершины выступа и значением модуля диэлектрической проницаемости металла |е|. Уменьшение радиуса кривизны вершины такой неоднородности ведет к дополнительному усилению напряженности локального поля, мало влияя на резонансные эффекты усиления. Таким образом, можно ожидать, что максимальный вклад электромагнитного механизма усиления может быть достигнут путем создания вытянутых металлических структур с минимальным радиусом кривизны их вершины.

Роль материала острый

Электромагнитные механизмы приводят к возбуждению отраженной второй гармоники оптического излучения. Эффективная нелинейная поляризация поверхностного слоя на удвоенной частоте Pt¿2a) определяется выражением:

Рe¡(2cu) = L '(2(o)-[fJ2) + N-p\L\a})-Ea\co) , (3)

где /т(" - эффективная нелинейная восприимчивость поверхности металла; N и ft2) поверхностная плотность и нелинейная поляризуемость адсорбированных молекул соответственно. Нелинейная поляризация Ре1(2а>) и, следовательно, интенсивность второй гармоники не обращаются в нуль при N - 0, поэтому этот эффект был использован для изучения свойств собственно подложки.

Как уже отмечалось, техника трековых мембран позволяет формировать геометрически идентичные поверхности из разных металлов. На рис. 1 показаны микрофотографии таких структурированных поверхностей с выступами конической формы и радиусом острия 6,5 нм. Сравнивались характеристики идентичных

Таблица 1. Электрические характеристики материала и усиление второй гармоники оптического излучения на поверхности с коническими неоднородностями_

Х= 1064 нм Х= 532 нм Усиление

Металл е' + ге" И £' + ¡-е" |е| Оъа

А8 -58,1 +И),61 58 -11,8 + 10,37 12 (5-10)-103

Си -49,1 +1-4,9 49 -5,5 + 15,8 8 102

А1 • -100 + 1-26 104 -36,6 +И 1,5 38 103

Поверхностная плотность острийных структур 10 см , диаметр оснований 0,2 мкм, отношение высоты к диаметру оснований 2/1. Вторую гармонику возбуждали лазером УАО:Ы(1, Хщ = 1064 нм, частота повторения 10 Гц, длительность импульса 15 не, плотность мощности 100 кВт/см2.

поверхностей из серебра, меди и алюминия (табл. 1). Наименьшее значение усиления второй гармоники С2ш было на подложке из меди С?2а>Си= Ю:. Увеличение значения усиления на алюминии определяется нерезонансным механизмом: в обоих случаях е" > 1, следовательно, эффект резонансного усиления мал. Но модуль |е| у алюминия существенно больше, чем у меди, что и обусловило большее значение коэффициента С2ам = Ю5. Значения модуля |е| для серебра и меди примерно одинаковы, но значения мнимых частей £" существенно отличаются. Таким образом, примерно два порядка усиления 02шА* = (5-10)103 по сравнению с усилением 02шСи= 102, определяются резонансным эффектом.

Возбуждение продольных и поперечных мод колебаний в острийных структурах На рис. 2А и 2Б представлены зависимости отражения д- и р-поляризованного света от длины волны и угла его падения. При малых углах падения (близких к нормали) р-поляризованный свет возбуждает преимущественно поперечную компоненту плазмонных колебаний с длиной волны А„0„ = 350 нм. Увеличение угла падения ведет к росту продольной компоненты колебаний (то есть колебаний, направленных вдоль главной оси конических выступов), определяемой отношением высоты конуса к его диаметру (фактор деполяризации А в выражении (2)). Это обусловливает появление длинноволнового минимума в спектре отражения около Ащхщ-бООнм. В случае ¿-поляризованного света возможно возбуждение только поперечной компоненты, поэтому в спектре отражения наблюдается только коротковолновый минимум. Возможность преимущественного возбуждения поперечных или продольных резонансов, а также управления резонансной частотой

путем изменения геометрических параметров выступов позволяет направленно создавать подложки с желаемыми резонансными характеристиками и оптимизировать условия получения максимальных сигналов ГКР (рис. 2В и 2Г).

{ "V,

/ 15® Л

Р-поляримция V

// V N. 15°' •

4 ¡»-поляризация

400 500 ООО 700

Длина волны, нм

500 550 600 65&

Длина волны возбуждения, >

Рис. 2. Спектры отражения серебряных острийных наноструктур при р- (А) и .г-поляризации (Б). Диаметр оснований конусов 80 нм, отношение высоты конусов к диаметру их оснований 2/1, поверхностная плотность острий 8-Ю8 см"2.

Спектры возбуждения ГКР молекул бипиридина, осажденных на те же поверхности при р- (В) и ^-поляризации (Г) Количество вещества соответствует одному монослою молекул, мощность возбуждения 20 мВт. Спектры возбуждения записаны с использованием спектральной линии бипиридина 1296 см"1.

ГКР-активные поверхности на основе полых нанотрубок

Метод приготовления таких структур - напыление металла на вращающуюся трековую мембрану под углом к ее поверхности.

Запишем в электростатическом приближении выражения для напряженности поля внутри полости нанотрубки, в металле нанотрубки (ориентированной вдоль оси г) и вне ее:

а-Ео, г < Г]

Е10с(г)= РЕ0 + (2(Й1Г)Г-^1)/г4,Г1<Г<Г2

Е0 + (2(<Ьг)г-ЛЬ)/г4, г2<г

где г - проекция радиуса-вектора точки, в которой вычисляется Е,^ на плоскость, перпендикулярную оси цилиндра; Г1 и г2 - внутренний и внешний радиусы цилиндра. Отсюда с учетом граничных условий для локального поля внутри нанотрубки получим:

Е^да ) = Цв)Е,(®) =

;Е0(«>), (5)

(е, + е2Хе2 + е3) - (г, / гг)2 (ег - г,)(е2 -ег) где с, » 6) ■ диэлектрические проницаемости среды в областях внутри и вне металлического цилиндра соответственно, а е2 = е\ + ¡- е"2 - диэлектрическая проницаемость металла.

Частотные зависимости для £| = е3 = 1 и е2(о>) = 1 - (ор2/со (со + / у) в случае серебра (плазменная частота со9 = 1,3-1016 с'1 и декремент затухания у = 1,Н014 с'1) имеют ярко резонансный характер (рис.3). В частности, при (т^)2 = 0,7 фактор локального поля во внутренней полости цилиндра достигает максимального значения Цю) = 40 при X = 520 нм. В реальных системах отношение внутреннего и внешнего радиусов увеличивается по направлению в глубь поры, что приводит к уширению резонансной линии и снижению усиления.

100-

10-

л ©

300 400 500 Длина волны, нм

Рис. 3. Частотная зависимость

фактора усиления локального поля ¿(X) = ¿(2яс/со) = а во внутренней полости цилиндра из серебра при (п/гг)2 = 0,1 (а); 0,5 (б) и 0,7 (в).

Для экспериментальной оценки усиления по электромагнитному механизму был использован эффект генерации второй гармоники (условия даны в разделе, посвященном осгрийным структурам). Показано, что суммарная мощность второй

гармоники от структурированной поверхности в (5-10)102 раз превышает интенсивность зеркальной второй гармоники, полученной на неперфорированном участке (то есть в отсутствии нанотрубок), что соответствует значению усиления сигнала КР по электромагнитному механизму. По сравнению с острийными наноструктурами усиление на нанотрубчатых структурах примерно на два порядка ниже, что обусловлено отсутствием усиления по нерезонансному механизму. С этим же связано ухудшение в 10-100 раз предела детекции сигнала ГКР на нанотрубчатых структурах по сравнению с острийными. Достоинством нанотрубчатых структур является возможность накопления исследуемого вещества в порах при создании проточных аналитических систем [Авт. св. 1673929].

Поверхностные наноструктуры в получении спектров ГКР

Возможности ГКР-активных поверхностей, приготовленных по технологии трековых мембран, исследованы на примерах окрашенных (родамин 60, тстрапорфирин цинка) и прозрачных в видимой области (фенилаланин,. лизоцим, бипиридин, аденин) соединений (рис.4).

Рис. 4. Спектры. ГКР белка лизоцима; записанные с помощью серебряного электрода (/) и острийной поверхности (2); спектр КР лизоцима

(3). Для сравнения в той же шкале приведен спектр ГКР фенилаланина

(4). Содержание лизоцима и фенилаланина на острийной поверхности и лизоцима на электроде 1 пг вещества в пробе. Концентрация лизоцима в водном растворе 25 мг/мл.

электрода (/)

ГКР-активная острийная поверхность приготовлена по технологии трековых мембран (серебро, диаметр выступов ¿/=30 нм, отношение высоты выступов к их диаметру Ь/ё = 2/1, поверхностная плотность острий 10" см'2)

Длина волны возбуждения 514,5 нм при мощности 20 мВт для спектров ГКР и 250 мВт для спектров КР.

1500

юоо

Волновое число, си"'

500

Показано, что уменьшение размера острий при одновременном увеличении их поверхностной плотности приводит к значительному увеличению коэффициента усиления КР. Это позволяет регистрировать спектры пикограммовых количеств веществ. При этом спектры, получаемые с использованием острийных наноструктур, приготовленных по технологии трековых мембран, сходны со спектрами КР тех же соединений, но отличаются от спектров ГКР, записанных на системах, в которых эффект усиления определяется молекулярным близкодействующим механизмом. Этот факт подтверждает превалирующую роль дальнедействующего электромагнитного механизма усиления, реализуемого на поверхностях, приготовленных по технологии трековых мембран.

Глава 3. Взаимодействие ДНК топоизомеразы I с ДНК: методы спектроскопии КР, ГКР и кругового дихроизма в исследовании структурных особенностей взаимодействия

В живых организмах молекулы ДНК, являющиеся носителями наследственной информации, представляют собой очень длинные или замкнутые в кольцо двухцепочечные молекулы. Поэтому любой процесс, связанный с передачей наследственной информации, должен наталкиваться на серьезные топологические проблемы, связанные с возникновением положительной или отрицательной сверхспирализации ДНК. Решение этих проблем обеспечиваются ДНК-топоизомеразами - ферментами, изменяющими топологию ДНК. Они относятся к ключевым ферментам передачи наследственной информации. Клетка, лишенная топоизомераз, не может компенсировать их отсутствие и гибнет. Поэтому, топоизомеразы являются объектом пристального внимания как фундаментальной науки, так и разработчиков антибактериальных и противоопухолевых препаратов.

Действие топоизомераз базируется на формировании временной связи между Туг фермента и одним из концов разрезанной цепи ДНК. За время существования ковалентного промежуточного комплекса ДНК изменяег свою топологию, после " чего целостность ДНК восстанавливается. Виды фермента, разрезающие одну цепь ДНК и формирующие связь с 3'-концом фосфатной цепи, относятся к классу 1В. ДНК топоизомераза I человека (топо1) относится к этому классу. Топо1 является основной клеточной мишенью многих противораковых соединений. Поэтому

предметом настоящего исследования является ДНК топоизомераза I человека и механизмы ее ингибирования агентами разных типов.

По принципу действия ингибиругощие агенты разделяются на две основные группы: (1) супрессоры, то есть соединения стерически препятствующие взаимодействию топо1 с ДНК, и (2) яды фермента - соединения, фиксирующие промежуточный ДНК-ферментный комплекс. Супрессоры, как правило, - агенты, обладающие высоким сродством к ДНК и связывающиеся с ней по малой бороздке, ингибируют действие не только топоизомеразы, но и других белков, взаимодействующих с ДНК. Их применение особенно эффективно, когда концентрация топоГ в раковой клетке невелика и наряду с воздействием на топо1 необходимо подавить действие других ферментов. Наоборот, яды топо! специфически взаимодействуют с промежуточным ДНК-ферментным комплексом. Их единственной мишенью является топо1, поэтому применение этих агентов целесообразно в тех клеточных линиях, где концентрация и активность этого фермента велика. Это определяет различия в терапевтических действиях двух классов противоопухолевых соединений.

Структура топо1 в комплексе с 22-мерным фрагментом ДНК известна. Она определена методом рентгеновской кристаллографии. Чтобы получить кристаллы комплекса, авторы (Redinbo and Stewart, 1998) инактивировали фермент путем замены Туг713 —► Phe (нековалентный комплекс) или введением в разрезаемую фосфодиэфирную цепь фосфотиатной группы, связывающейся с Туг723 ковапентно и фиксирующей промежуточный комплекс (ковалентный комплекс). Сформированные таким образом комплексы оказались достаточно устойчивыми для выращивания кристаллов и определения структуры топо1 в комплексе с ДНК. Кристаллы свободного фермента до настоящего времени не получены. Как показано в настоящей работе методом атомно-силовой микроскопии, это вероятно, обусловлено высокой относительной подвижностью двух структурных частей фермента в не связанном с ДНК состоянии. То есть детали структурных изменений в процессе взаимодействия-топо1 с ДНК неясны. Эту информацию можно получить только в условиях, при которых фермент не теряет своей активности. Поэтому для изучения взаимодействия топо1 с ДНК в настоящей работе использованы методы спектроскопии KP, ГКР и кругового дихроизма (КД).

Время записи спектра KP с достаточно высоким отношением сигнал/шум достигает 40 часов. Отсутствие разрушения образца доказано сопоставлением первого и последнего сканов. Тем не менее столь долгое экспонирование образца

может исказить получаемые результаты. Поэтому значительная часть спектров записана с использованием разработанных в настоящей работе ГКР-активных подложек. Время записи при этом сокращается примерно в 10 раз. Во всех случаях корректность использования ГКР проверялась записью контрольных спектров КР.

Анализ спектров КР проводился разностным методом. Для этого из спектра комплекса вычитался спектр, представляющий собой сумму отдельных компонентов. Такой подход позволяет выявить даже небольшие спектральные изменения, вызванные взаимодействием компонентов. Пример получения разностного спектра показан на рис. 5.

Полученные спектральные данные указывают на то, что в результате взаимодействия вторичная структура фермента заметно изменяется (табл. 2).

Рис. 5

а - Спектр КР 68 кДа комплекса (1:1) ДНК топоизомеразы I человека с олигонуклеотидом: 5' -ТТТТСАТСС-АССАТТС- З1 3' -ААААСТАСС т ТССТААС- 5' (стрелкой показано место разреза)

Ь - Сумма КР спектров компонентов.

с - Разностный спектр: "а" минус "Ь".

1000 1200 Волновое числа см"1

Обозначения колебаний атомных групп: - олигонуклеотида: G, Т, А, С -нуклеотиды, bb - фосфодиэфирная цепь и

-фермента: Phe, Туг, Тгр - остатки аминокислот, Amide I и Amide П1 -полипептидная цепь.

Таблица 2. Вторичная структура рекомбинантной 68 кДа топо1 в растворе, в комплексе с олигонуклеотидом и в тройном комплексе

Структура Tonol ТопоУолиго-нуклеотид Tonol/олиго-нуклеотид/топотекан

а-спираль (%) 45±1 (44) 38±1 41±2

{5-лист (%) 28±2 (31) 36±2 36±3

Неупорядоченные структуры (%) 27±2 (25) 26+2 23 ±3

В то же время олигонуклеотид в целом сохраняет В-форму. Существенным структурным изменением ДНК является выход гуанина (основание в положении +1 относительно места разреза) из цепи ДНК в результате атаки фермента. Этот результат представляется важным, поскольку является экспериментальным подтверждением одной из гипотез, выдвинутых для объяснения молекулярного механизма действия камптотецина - ингибитора' фермента. Обнаруженные структурные изменения происходят в отсутствие камптотецина, достаточным является лишь наличие гуанина в положении +1 (камптотецин-специфичный сайт). Формирование тройного комплекса с участием производного камптотецина -топотекана не приводит к структурным перестройкам фермента (табл. 2). Таким образом, в физиологических условиях полость, в которую встраивается молекула камптотецина (или его аналога), формируется уже на этапе взаимодействия топо1 -ДНК. Но собственно камптотецин-специфичный сайт активизируется лишь в присутствии камптотецина или его аналогов.

Глава 4. Методы оптической спектроскопии в исследовании молекулярных механизмов действия топотекана - типичного яда ДНК топоизомеразы I

Камптотецин (сатрюШест, СРТ) относится к классу соединений, фиксирующих промежуточный ДНК-топо1 комплекс и тем самым ингибирующих действие фермента (рис.6). Препятствием на пути клинического использования СРТ является его низкая растворимость, поэтому до сих пор не прекращаются поиски его водорастворимых аналогов. Некоторые из них, в частности топотекан (Юро1есап, ТРТ), показали хорошие клинические характеристики. В то же время, молекулярные механизмы действия соединений этого класса оставались до последнего времени во многом неясными.

В данной части работы на основе использования спектроскопии КР и ГКР разработан метод определения участия молекулярных групп ТРТ в межмолекулярных взаимодействиях. Соответственно полученным данным предложена модель взаимодействия ТРТ с ДНК. Разработан метод определения степени гидролиза лактонного кольца молекулы как в свободном состоянии, так и в комплексе с ДНК, что является одним из ключевых моментов, так как позволяет оценить содержание активной формы молекулы ТРТ.

Молекула ТРТ представляет собой сопряженную хромофорную систему, в которой я-электроны, обусловливающие длинноволновый переход, распределены по всей системе колец, поэтому основной вклад в спектр КР дают колебания практически всех атомов кольцевой системы (рис. 6В). Боковые группы, не включенные в сопряженную систему хромофора, вклада в спектр КР не дают, что подтверждается сопоставлением спектров ряда аналогов СРТ, различающихся боковыми группами. Однако структура и состояние боковых групп влияют на положение и интенсивность основных спектральных линий. Задача, таким образом, сводится к определению спектральных линий, чувствительных к изменениям в боковых группах, связанных с их участием во взаимодействиях. Для решения этой задачи должны быть определены силовые постоянные молекулы ТРТ, то есть необходимо было решить обратную спектральную задачу.

Рис. 6. Химическая структура молекул камптотецина и топотекана в закрытой (А) и в открытой (Б) формах. Пространственная структура .и распределение плотности я-электронов верхнего заполненного уровня молекулы ТРТ в лактонной форме (В). Для расчетов использован метод AMI.

Особенность ее решения в данной работе - использование различных ионных состояний ТРТ. Поэтому первым этапом решения было определение структуры ионов ТРТ в разных условиях. Для этого сопоставлены данные спектроскопии поглощения ТРТ при различных рН и результаты расчетов электронных уровней этой молекулы (табл. 3). В итоге получена детальная информация об изменении ионного состояния молекулы ТРТ в зависимости от рН раствора.

Таблица 3. Сопоставление расчетных и экспериментальных данных по положению длинноволновых полос поглощения молекулы ТРТ в зависимости от рН

раствора.

№ Ионное состояние молекулы ТРТ Положение длинноволновых полос поглощения, им

Расчет* Эксперимент**

1 Протонированы атомы азота диметиламинометиленовой группы и N-1*" и атом кислорода при С-16а. Заряд молекулы 0 = +3. 388 257 420 267

2 Протонированы атом азота диметиламинометиленовой группы и атом кислорода при С-16а. Заряд молекулы <3 - +2. 348 313 380 327

3 Протежирован атом азота диметиламинометиленовой группы. Заряд молекулы 0 = +1 . 352 301 382 327

4 Протонирован атом азота диметиламинометиленовой группы. Депротонирована гидроксильная группа при С-10. Заряд <2 = 0. 420 351 412 340

5 Депротонирована гидроксильная группа при С-10. Молекула находится в карбоксилатной форме. Заряд молекулы О = -2. 435 352 421 345

♦Расчеты выполнены по методу INDO/S без учета влияния растворителя. Рассматривались 19 заполненных и 19 свободных орбиталей. Общее число конфигураций 723. ♦♦Измерения выполнены при концентрации [ТРТ] = 10"6 М. ♦♦♦Нумерация атомов молекулы ТР1 дана на рис.6.

Спектры КР молекулы, находящейся в различных ионных состояниях, а также спектры дейтерированных и агрегированных форм ТРТ составили массив экспериментальных данных для решения обратной спектральной задачи.

Математически ее решением был поиск минимума функционала:

-*,<'•>42

1 N.

F = — Z

Ne,

+ P,

(6)

Где Ие число уточняемых параметров, совпадающее с числом экспериментальных данных); х'/* и х]к) сравниваемые характеристики экспериментального и теоретического спектров (положения максимумов полос); 5 - параметр погрешности вычисления; Р - штрафная функция:

р =

Ь, - хА'лх,}2 + ь - лУАйГ (7)

здесь ^ - параметры, варьируемые при решении обратной спектральной задачи (силовые постоянные).

Далее, путем вариации параметров молекулярных групп - вероятных участников межмолекулярных взаимодействий (варьировались массы атомов боковых групп и/или длины и силовые постоянные некоторых связей в боковых группах), выявлены спектральные линии, положение которых изменяется в результате изменений в боковых группах. То есть определены спектральные признаки участия конкретных фрагментов ТРТ в межмолекулярных взаимодействиях и структурных изменений молекулы, индуцированных этими взаимодействиями.

В результате показано, что лактон-карбоксилатный переход молекулы может быть зарегистрирован по смещению линии 1437 см"1 к положению 1424 см"! (рис. 7). Для наиболее важной лактонной формы молекулы, активной биологически, низкочастотное смещение линий около 1563 и 1623 см'1 указывает на участие во взаимодействии гидроксильной группы при атоме углерода С-20, а смещение положения Ферми-резонансного дублета 1652/1660 см"1 - на образование

1300 14)0 1500 1600 Волновое число, см"1

Рис. 7. Спектры КР лактонной и карбоксилатной форм ТРТ (А). Вид нормальных колебаний (Б), соответствующих линии КР, чувствительной к лактон-карбоксилатному переходу (1437/1424 см* ).

водородной связи с участием карбонильного кислорода лактонного кольца. Изменение положения линии около 1308 см'1 говорит об участии во взаимодействии

гидроксильных групп как при С-20, так и при С-10. При этом депротонирование гидроксила при С-10 регистрируется по изменению спектра поглощения ТРТ.

Зависимость рК депротонирования гидроксила при С-10 от концентрации ТРТ свидетельствует о формировании димерной формы ТРТ. При этом в формировании димеров участвует атом водорода гидроксильной группы при С-10. Представляется наиболее вероятным, что в формировании водородных связей участвует атом азота N-1, поскольку расчеты показывают, что вблизи этого атома локализована область огрицательного потенциала (рис. 8). Это позволяет предположить, что димеры стабилизируются двумя водородными связями, образующимися между гидроксильной группой при' С-10 одной из молекул димера и атомом азота N-1 другой (рис. 8). Структура димера поддерживается также стекинговым взаимодействием колец А молекул ТРТ. Существенно меньшее перекрытие кольцевых систем молекул ТРТ по сравнению с молекулами СРТ (согласно рентгеноструктурным данным при агрегировании СРТ перекрываются кольца А-Б) обусловливает существенно меньший сигнал кругового дихроизма ТРТ по сравнению с СРТ.

Рис. 8. Структуры двух наиболее вероятных конформаций димеров (А). Тонкими линиями показаны водородные связи между атомами N-1 одной молекулы и гидроксильными группами при С-10 другой.

Распределение электростатического потенциала (Б) в плоскости, перпендикулярной плоскости кольцевой системы молекулы и проходящей через атомы С-7 и N-1. Значения потенциала даны в А'1.

П-■-1-1-г

1300 1400 1500 1600

ТРТ/ДНК

(Calf Thymus)

TPT/dG

TPT/dl

TPT/dA

TPT/dT

TPT/dC

Гуаноэин

Deoxyriboi«

Частота, см

Рис. 9. Спектры КР комплексов ТРТ с ДНК (спектр 1) и с нуклеозидами (спектры 2-6). Спектр 7 - карбоксилатная форма ТРТ.

Использование спектроскопии КР позволило показать, что взаимодействие ТРТ с ДНК стабилизирует лактонную форму молекулы. При сопоставлении спектров КР комплексов ДНК/ТРТ и нуклеозид/ТРТ (исследовались взаимодействия ТРТ с дезоксинуклеозидами dA, dC, dG, dT и dl) обнаружено, что эффект стабиличации лактонной формы наблюдается только при взаимодействии ТРТ с dG (рис.9). Важно, что ближайший аналог гуанина - инозин, отличающийся лишь отсутствием аминогруппы N-2, такого эффекта не дает. То есть можно полагать, что доминирующую роль во взаимодействии ТРТ/ДНК играет гуанин, причем взаимодействие идет с участием аминогруппы N-2 гуанина, локализованной в малой бороздке ДНК. Следовательно, молекулы ТРТ локализуются в малой бороздке ДНК.

Рис. 10. Спектр ГКР водного раствора ТРТ (слева): [ТРТ] = 5-10"4М (а); 5- 10's М (б) и 5-10"6 М (в);

Отношение интенсивностей полос 1540 и 1412 см'1 (правая ось) и положение пика около 1540 см"1 (левая ось) в зависимости от относительных содержаний в растворе димеров и мономеров Сг/См •

1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 Частота, см"'

12 £

[СЫ/[СУ

Обнаружено, что вид спектров ГКР зависит от степени димеризации ТРТ, причем изменяются как положения линий, так и их относительная интенсивность (рис.10). Использование найденных спектральных признаков дает возможность оценивать содержание димеров ТРТ как в растворе, так и в связанном состоянии. В результате по данным спектроскопии ГКР было установлено, что связывание с ДНК индуцирует димеризацию ТРТ. Модель димеров, несущих на противоположных концах молекулярные группы (рис. 8), способные взаимодействовать с ДНК, и обнаруженный эффект димеризации ТРТ, индуцированной связыванием с ДНК, позволили объяснить известные данные по способности ТРТ связывать отдаленные фрагменты ДНК и предложить молекулярную модель комплексов вида ДНК-ТРТ-ТРТ-ДНК.

Глава 5. Молекулярные детерминанты, определяющие функции соединений • супрессоров фермента. Производные нетропсина - бис-нетропсины

Нетропсин (Нт) и его производные являются соединениями, нековалентно связывающимися с ДНК в ее малой бороздке. Эти соединения способны ингибировать целый ряд взаимодействующих с ДНК ферментов, однако противоопухолевый эффект Нт невелик. Это определяет необходимость поиска его новых, более эффективных производных. В настоящей работе методами спектроскопии КР и ГКР и сопоставлением полученных результатов с биохимическими данными исследован ряд производных Нт - бис-нетропсинов (бис-Нт), представляющих собой две молекулы Нт, связанные гибким спейсером (рис. 11). Эти соединения обладают существенно большей специфичностью связывания с ДНК и показывают бблыную биологическую активность в отношении ингибирования действия топоизомеразы.

Для оценки структурных особенностей комплексов бис-Нт с ДНК была использована спектроскопия ГКР с усиливающей ГКР-активной системой "серебряный цитратный золь". Обнаружено, что спектры ГКР очень сходны со спектрами КР этих соединений. Это означает, что усиление на этой ГКР-активной системе определяется преимущественно электромагнитным механизмом. В то же время относительная интенсивность некоторых спектральных линий заметно больше, чем относительная интенсивность аналогичных линий в спектрах КР. Теоретический анализ колебательной структуры этих соединений показал, что усиленные линии чувствительны к взаимодействиям указанных молекул, в которых участвуют атомы водорода пиррольных колец. Кроме того, все усиленные линии относятся к плоскостным колебаниям молекул. Таким образом, показано, что бис-Нт взаимодействуют с ГКР-активной системой со стороны пиррольных колец, причем плоскость молекулы ориентирована перпендикулярно ГКР-активной поверхности.

Анализ спектральных изменений, вызванных взаимодействием с ДНК, показал, что, как И в случае Нт, молекулы бис-Нт удерживаются в малой бороздке ДНК водородными связями между атомами азота амидных групп бис-Нт и атомами N-3 и 0-2 тимина и аденина ДНК соответственно. Наиболее важным для связывания оказалась комплементарность структуры конкретного бис-Нт и соответствующего участка олигонуклеотидной последовательности ДНК. Структурные изменения

бис-Нт (—»—»)

Рис. 11. Структура нетропсина (Нт) и бис-нетропсинов (бис-Нт). Структуры олигонуклеотидов, содержащих сайт связывания с топо1 (выделен серым) и участок последовательности, специфичной для каждого из бис-Нт (выделен жирным шрифтом). Идентичные фрагменты были введены в плазмидную ДНК при исследовании ингибирующсй активности бис-Нт.

Олигонуклеотид (ОЛИГ-1), специфичный к бис-Нт(<—»V_

5' -ТТТТЩЦи»СГЧИИВгТТС-3•

3' -ААМкАТТПЩЦЦЦр^С-б' <->

Олигонуклеотид (ОЛИГ-2), специфичный к бис-Нт(—><—): 51 -ЙААЛАТТГГСТ^ИИвГТТО-З'

з' -ттггамшЦННИН№с~5'

-X-

Олигонуклеотид (ОЛИГ-3), специфичный к бис-Нт(—»—>): 51 -тттттттттст - Дй№"гт в - з1

бис-Нт проявляются в основном в изменении торсионных углов амидных групп, связывающих пиррольные элементы бис-Нт (спектральные проявления - изменения положений спектральных линий Amide I и Amide Ш). Наиболее существенным, с точки зрения изменения структуры ДНК, являются изменения конформации фуранозного кольца фосфодиэфирной цепи, связанного с гуанином: показано, что в результате связывания бис-Нт кольцо реорганизуется от конформации С2'-endo/anti к конформации CY-exofanti (спектральные маркеры - относительные интенсивности линий в дублетах /б8о//б7о и ¡тг^пт)- В случае специфического связывания искажения структур бцс-Нт и ДНК минимальны, но они существенно возрастают в случаях неспецифического связывания (табл. 4).

Сопоставление этих результатов с данными, полученными биохимически (табл. 4), показывает, что степень структурных изменений, индуцированных взаимодействием с бис-Нт, коррелирует с ингибирующей активностью последнего в отношении действия топо!. Следует особо отметить, что искажения структуры ДНК

Таблица 4. Сопоставление изменений относительных интенсивностей линий в дублетах 680/670 см'1 и 1333/1340 см"1 в КР спектрах комплексов олигонуклеотид/бис-Нт и изменения эффективности щепления ДНК ферментом

'бис-Нт(<—►) бис-Нт(~><—) бис-Нт(—>■—>) В отсутствие бис-Нт

ОЛИГ-1

hifjhia* 0,17*** 0,33 0,10 0,09

^1333^1340 0,20 0,30 0,12 0,09

D/Do** 0,56 0,37 0,84 1,00

ОЛИГ-2

IsuJhia 0,35 0,18 0,11 0,10

hmlhvo 0,32 0,19 0.12 0,10

D/Do 0,27 0,65 0,89 1,00

ОЛИГ-3

hitJhiü 0,39 0,32 0,18 0,16

hmlhiw 0,40 0,25 0,22 0,20

D/Do 0,48 0,75 1,00 1,00

♦Линии 680 и 1333 см относятся к колебаниям фуранозного кольца в конформации С2'-ешЬ/апН, связанного с гуанином, линия 670 см'1 - колебания фуранозных колец. СГ-ехо/апи гуанина и ОТ-епйо/апН тимина; линия 1340 см'1 - колебания фуранозного кольца С1 '-ехо!апН гуанина плюс колебания аденина (1342 см"'), **О/О0- величина, обратная эффективности ингибирования действия топо1: О - содержание фрагмента ДНК, расщепленного в сайте с соответствующей последовательностью в присутствии бис-Нт, О0 - то же в отсутствие бис-Нт. **'Жирным выделены специфичные пары

наблюдаются не только в области связывания бис-Нт с ДНК, но и вблизи нее: гуанин находится вне пределов области, покрываемой бис-Нт (рис. 11). А поскольку эта область является областью взаимодействия фермента с ДНК, полученный результат - прямое доказательство доминирующей роли геометрического фактора в процессе ингибирования топо!.

Глава 6. Конструирование соединений, сочетающих функции супрессоров и ядов топоизомеразы I. Конъюгат нетропсин-каптотецин: структура и свойства

Две основные причины ограничивают клиническое применение соединений из группы СРТ: (1) в физиологических условиях значительная доля этих соединений находится в неактивной карбоксилатной форме, и (2)' нестабильность промежуточного комплекса обусловливает необходимость поддерживать высокую концентрацию лекарства и, следовательно, требует долговременной обработки

опухолевых тканей. В то же время супрессоры образуют прочные комплексы с ДНК. Кроме того, как показано в настоящей работе, присутствие типичного супрессора Нт определенным образом модулирует ингибирующее действие соединений из класса СРТ. Анализ полученных результатов по взаимодействию супрессоров и ядов топо1 с ДНК и ферментом позволил сформулировать принципы конструирования гибридных соединений, объединяющих достоинства супрессоров и ядов топо1.

(1) Геометрия по крайней мере одной из возможных конформаций гибридной молекулы должна позволять ей встраиваться в малую бороздку ДНК на участке с определенной последовательностью и реализовывать таким образом функцию супрессора фермента.

(2) Фрагменты молекулы должны иметь возможность взаимодействовать между собой, образуя замкнутую форму. При этом активные группы супрессорной части молекулы должны быть экранированы и их взаимодействие с ДНК затруднено.

СРТ-фрагмент коньюгата

Нт-фрагмент коньюгата

Фрагмент ДНК:

Ё- с 31-GCGCTTAAGCGC-5 '

5 ' -CGCGAATTCGCG-3 '

Рис. 12. Структура молекулы коньюгата СРТ-Нт (А). Пунктиром показаны водородные связи. Расчет по методу AMI.

Структура комплекса коньюгата СРТ-Нт с ДНК (Б). Конъюгат (показан темным) встраивается в малую бороздку ДНК (показана светлым) на участке: 3'-TTAAG-5'.

(3) В формировании замкнутой формы должно участвовать лактонное кольцо СРТ-фрагмента гибридной молекулы так, чтобы за счет изменения физико-химических свойств время сохранения биологически активной лактонной формы гибридного соединения было увеличено.

(4) Так как встраивание производных СРТ в ДНК-ферментный комплекс опосредуется через лактонную часть молекулы, супрессорный фрагмент должен быть присоединен к хинолиновой части СРТ-фрагмента.

Пример соединения, в котором реализованы сформулированные принципы, представлен на рис. 12.

Изменение концентрации закрытой (лактонной) формы соединения определяется уравнением:

= kclose ' сореп (О ~ ^ореп ' сrióse (О W

где корт и kdose - скорости прямой (открытие лактонного кольца) и обратной (его закрытие) реакций; сореп и. с£/отв - концентрации открытой и закрытой форм соединения. Решая уравнение (8) получим зависимость концентрации закрытой (лактонной) формы соединения от времени определяется выражением:'

Cclose(t)-T}~-ÁKeqe-h(9) здесь к = кореп + kc¡ose, сумма скоростей прямой и обратной реакций, а Кеч =

kopeijkclose

- отношение этих скоростей. Значение Кщ отражает соотношение концентраций закрытой и открытой форм соединения в равновесном, состоянии, а к - скорость прихода к этому состоянию.

Экспериментально для определения отношения концентраций закрытой и открытой форм использовалась флуоресцентная спектроскопия. Было обнаружено, что спектры флуоресценции двух форм нового соединения существенно отличаются между собой. Это позволило определить отношение cci„Jc (или copeJc) разложением зависимости интенсивности флуоресценции от длины волны F(X) на функции Fd0JX) и Fopm(X), соответствующие спектрам флуоресценции закрытой и открытой формам конъюгата:

Celóse 'Fclosed) + сореп 'Fopen(k), (10)

где С = Cchse + Copen ■

В результате показано, что значение К^ для конъюгата мало отличается от К^ для других производных СРТ. Однако, с прикладной точки зрения, более важным является параметр к. В результате внутримолекулярных взаимодействий гидролиз конъюгата идет существенно медленнее (рис.13) по сравнению с другими производными СРТ (для конъюгата 1цг~ 10 часов, против = 20-40 минут для других производных СРТ). Таким образом, новое соединение существенно дольше сохраняет биологически активную форму.

о О

0.8-

1 <4 N,

\ РНЙ4 \ \ /^^

ь V ■ \ pt+ао^Ч, \ \/ rf. . \ ^ V» . \

\ с • 4 в \ _____________

" " - - -

100

Время, мин

0.8

0 2

Рис. 13. Изменение во времени содержания лактонной формы СРТ (о и •) и конъюгата СРТ-Нт (□ и ■) в физиологических условиях (фосфатно-солевой буфер, PBS, рН=7,4) - сплошная линия (• и ■) и в щелочных условиях при рН=10 - пунктир (о и а).

Влияние конъюгата СРТ-Нт на каталитическую активность топо1

Использовались модельные ДНК-субстраты, содержащие сайты, узнаваемые ферментом (СРТ-независимые чайты), последовательности специфического связывания производных нетропсина и СРТ-зависимые сайты (щепление в которых индуцируется присутствием СРТ).

Показано, что конъюгат в случае его высокой концентрации подавляет щепление в СРТ-независимых сайтах, но дает эффект усиления щепления в СРТ-зависимых. Уменьшение концентрации конъюгата ведет к исчезновению эффекта усиления щепления в СРТ-зависимых сайтах. Но щепление в СРТ-независимых сайтах

продолжает подавляться. Эти результаты показывают, что СРТ- и Нт-фрагменты гибридной молекулы сохраняют свои функциональные способности модулировать щепление ДНК ферментом.

Цитотоксичность кокьюгата СРТ-Нт

Цитотоксичность СРТ-Нт определялась по шести линиям опухолевых клеток. По четырем из них конъюгат показал значения IС50, сопоставимые со значениями 1С50, определенными по СРТ. Значение 1С}0 коньюгата против клеток СаОУЗ (аденокарцинома яичников) оказалось ниже, чем у СРТ, что демонстрирует более высокую активность коньюгата (примерно в 5 раз по сравнению с СРТ). Это означает, что новое соединение обладает потенциальными возможностями противоопухолевого лекарственного соединения.

Выводы

(1) Разработан комплексный подход к изучению молекулярных механизмов действия ингибиторов человеческой ДНК топоизомеразы I, основанный на совместном применении спектроскопии поглощения, флуоресценции, кругового и линейного дихроизма, КР и ГКР в сопоставлении с методами расчета структуры, электронных и колебательных параметров биологических молекул и с биохимическими данными. Возможности подхода продемонстрированы на примерах типичных супрессоров топо1 (бис-нетропсины) и яда топо1 - клинически важного соединения из семейства камптотецина - топотекана (ТРТ).

(2) Исследованы молекулярные механизмы действия супрессоров топо1. Обнаружено, что взаимодействие с бис-нетропсинами индуцирует структурные изменения ДНК вне участка взаимодействия лиганд-ДНК, но на участке связывания ДНК-фермент. Показано, что структурные изменения, индуцируемые связыванием лиганда на участке ДНК-белкового взаимодействия, коррелируют с биологической активностью лиганда.

(3) На примере производного камптотецина - топотекана исследованы молекулярные механизмы действия соединений - ядов топо1. Предложена методика отнесения полос в спектрах КР, основанная на использовании разных ионных состояний молекулы ТРТ и расчетных данных. Выявлены спектральные признаки участия во взаимодействиях отдельных фрагментов молекулы ТРТ, определена структура димеров ТРТ в растворе и комплексов ТРТ с ДНК. Предложена методика оценки степени димеризации ТРТ, основанная на сопоставлении данных флуоресценции и ГКР. Показано, что связывание с ДНК индуцирует димеризацию лиганда. На основе данных оптической спектроскопии предложена молекулярная модель взаимодействия ТРТ с ДНК, согласно которой, димеры ТРТ связывают две и более молекулы ДНК.

(4) Предложен подход к конструированию соединений, объединяющих достоинства супрессоров и ядов топо1. Синтезировано новое соединейие - конъюгат нетропсина с камптотецином, обладающее высокой стабильностью лактонной формы. Показано, что соединение обладает свойствами как супрессора, так и яда топо! и эффективно в клеточной линии CaOV3 (аденокарцинома яичников).

(5) Исследованы нелинейно-оптические свойства нового класса ГКР-активных поверхностей, формируемых по технологии трековых мембран (острийные структуры и системы полых микротрубок). На основе данных, полученных методами генерации гигантской второй гармоники оптического излучения, комбинационного рассеяния и определения линейных оптических свойств этих новых структурированных поверхностей, выявлены основные закономерности, связывающие оптические свойства данных поверхностей, геометрические характеристики поверхностных неоднородностей и параметры материала поверхностей. Показана возможность формирования структур с заданными оптическими свойствами. Показано, что основную роль в усилении эффекта КР на этих поверхностях играет дальнедействующий электромагнитный механизм. Использование разработанных ГКР-активных систем позволяет записывать спектры ГКР пикограммовых количеств биологических макромолекул.

\ РОС. НАЦИОНАЛЬНА* |

33 1 БИБЛИОТЕКА. ]

I С. Петер*»»»" J

. 03 tttt «*»_I

Список основных публикаций автора по теме диссертации

1. Апель П.Ю., Мчедлишвили Б.В., Петухов А.В., Олейников В.А., Покровская

- З.Д. Применение мембран в качестве матриц для изготовления поверхности

специальной формы термическим распылением металлов.- Тезисы докл. XIII Всесоюзной конф. по электронной микроскопии. М., с.548-549,1987.

2. Куделина И.А., Мурзина Т.В., Мчедлишвили Б.В., Олейников В.А., Петухов А.В., Соколов К.В, Резонансы локализованных плазмонов полых металлических цилиндров в гигантском комбинационном рассеянии и генерации гигантской второй гармоники.- Поверхность. Физика, химия, механика. No. 10, с.75-80, 1991.

3. Мчедлишвили Б.В., Березкин В.В., Васильев А.Б., Олейников В.А. Ядерные фильтры и структуры на их основе,- В кн.:"Физическая кристаллография", М., Наука, с.43-58,366 С, 1992.

4. Виленский А.И., Олейников В.А., Мчедлишвили Б.В., Васильев А.Б., Апель П.Ю. Структурные изменения в полиэтилентерефгалате при производстве ядерных мембран.- Химия высоких энергий. Т.26, No.l, с.59-62,1992.

5. Виленский А.И., Олейников В.А., Мчедлишвили Б.В. Исследование структуры

треков ионов Хе в полиэтилентерефгалате.- Химия высоких энергий. Т.26, i

No.4, с. 12-16, 1992.

6. Ермушев А.В., Мчедлишвили Б.В., Олейников В.А., Петухов А.В. Поверхностное усиление локальных световых полей и эффект "громоотвода". -Квантовая электроника. Т. 20, № 5, с. 503-509,1993.

7. Mchedlishvili B.V., Beryozkin V.V., Oleinikov V.A., Vilensky A.I., Vasilyev A.B. Structure, physical and chemical properties and applications of nuclear filters as new class of membranes.- Journal of Membrane Science. V. 79, p. 285-304, 1993.

8. Олейников B.A., Соколов K.B., Набиев И.Р. Микроанализ веществ методом спектроскопии ГКР с использованием технологии трековых мембран. - Журн. прикл. спектроскопии. Т. 59, № 5-6, с. 458-464,1993.

9. Oleinikov V.A., Nabiev I.R., Sokolov K.V., Ozga P., Manfait M. Practical substrates and techniques for analytical testing, identification and structural studies of biological, biomedical and related organic molecules by surface-enhanced Raman spectroscopy.-In: Spectroscory of Biological Molecules, ed. by T.Theophanides, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, p. 393-394,1994.

10. Виленский А.И., Олейников B.A., Купцова И.В., Марков Н.Г., Мчедлишвили Б.В., Гусинский Г.М. Треки высокоэнергетичных ионов в полиимиде: I. Свойства полиимида, облученного высокоэнергетичными ионами .- Химия высоких энергий. Т. 28, № 4, с. 285-289,1994.

11. Виленский А.И., Марков Н.Г., Олейников В.А., Купцова И.В., Кушин В.В., Блинов В.Ф., Загорский Д.Л., Донцова Э.П., Мчедлишвили Б.В. Треки высокоэнергетичных ионов в полиимиде: П. Травление треков. Изготовление

трековых мембран из полиимида. • Химия высоких энергий. Т. 28, № 5, с. 359363, 1994.

12. Виленский А.И., Марков Н.Г., Олейников В.А., Загорский Д.Л., Мчедлишвили Б.В. Треки высокоэнергетичных ионов в полиимиде: III. Исследование процесса травления, структуры треков и формы пор в трековых мембранах из полиимида. - Химия высоких энергий. Т. 28, № 6, с. 449-453,1994.

13. Oleinikov V.A., Tolmachyova Yu.V., Berezkin V.V., Vilensky A.I., Mchedlishvili B.V. Polyethileneterephthalate track membranes with conical pores: etching by water-alcohol alkali solutionns. - Radiation Measurements, V. 25, No. 1-4, pp. 713-714, 1995.

14. Денисенко Г.А., Малашкевич Г.Е., Олейников B.A., Войтович А.П., Базылев А.Г., Мчедлишвили Б.В., Стренк В. Влияние металлической поверхности на люминесценцию физсорбированных соединений европия. - Жури, прикл. спектроскопии. Т. 62, № 6, с. 130-134,1995.

15. Маскевич С.А., Свекло И.Ф., Феофанов А.В., Януль А.И., Олейников В.А., Громов С.П., Федорова О.А., Алфимов М.В., Набиев И.Р., Кивач JI.H. ГКР-активные субстраты на основе тонких серебряных пленок отожженных при высоких температурах: сравнительное изучение методами атомно-силовой микроскопии и спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния. -Оптика и спектроскопия. Т. 81, вып. 1, с. 95-102,1996.

16. Feofanov A., Ianoul A., Oleinikov V., Gromov S., Fedorova О., Alfimov M., Nabiev I. Surface-enhanced resonance Raman spectra of photochromic crown ether styril dyes, their model chromophores and their complexes with Mg2+. - Journ. of Physical Chemistry. V. 100, No. 6, p. 2154-2160,1996.

17. Крюков Е.Ю., Феофанов А. В., Олейников В. А., Верещетин В.В., Зайцев С.Ю., Громов С.П., Федорова О.А., Маскевич С.А., Кивач Л.Н., Зубов В.П., Набиев И. Р., Алфимов М.В. Агрегация и фотоизомеризация амфифильного краун-содержащего стирилового красителя в монослоях на границе раздела фаз. -Известия АН. Серия химическая., № 10, с. 2490-2496,1996.

18. Феофанов А.В., Олейников В.А., Тузиков А.Б., Януль А.И., Крюков Е.Ю., Соколов К.В., Бовин Н.В., Набиев И.Р. Спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния сиалозидов и их производных. - Биоорганическая химия. Т. 22, № 9, с. 706-716,1996.

19. Denisenko'G., Malashkevich G.E., Tziganova T.V., Galstyan V.G., Voitovich A.P., Pershukevich P.P., Kalosha I.I., Basilev A.G., Mchedlishvili B.V., Strek W. and Oleinikov V.A. Influence of Silver Surface Structure on Luminescence Characteristics of Europium Doped Polymer Films. - Acta Physica Polonica A. V. 90, No.l, p. 121126,1996.

20. Феофанов A.B., Олейников B.A., Тузиков А.Б., Януль А.И., Крюков Е.Ю., Бовин Н.В., Набиев И.Р. Исследование сиалированных неогликоконъюгатов

методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния. Биоорганическая химия. Т. 23, № 11, с. 910-918,1997.

21. Olelnikov V., Feofanov A., Ianoul A., Krydkov Е., Shiyan S., Bovin N.. Nabiev I. The structure of carbohydrate chains of alpha 1-acid glycoprotein. Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy study. - European Biophys. Journ.. V. 26. No. 1. p. 30,1997.

22. Oleinikov V.A., Kovner M.A., Feofanov A.V., Tarabara V.V., Kryukov E.Yu., Nabiev I. Interpretation of Raman and SERS spectra of alpha-methil glycoside N-acetilneuraminic acid. - In the book: Spectroscopy of Biological Molecules: Modern Trends. Eds. P. Carmona, R. Navarro and A. Hernanz. Kluger Academic Publishers. Dordrecht/Boston/London, p. 281-282, 1997.

23. Олейников B.A., Феофанов A.B., Шиян С.Д., Тузиков А.Б., Крюков Е.Ю., Януль А.И., Бовин Н.В., Набиев И.Р. Особенности структурной организации углеводных цепей в а!-кислом гликопротеине и псевдогликопротеинах по данным спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния, Биоорганическая химия. Т. 24, К® 6, с. 412-421,1998.

24. Oleinikov V., Kryukov Б., Kovner М., Ermishov М., Tuzikov A., Shiyan S., Bovin N., and Nabiev I. Sialylation sensitive bands in the Raman spectra of oligosaccharides and glycoproteins. - Journ. Molecular Structure. V. 480-481, p. 475-480, 1999.

25. Oleinikov V.A., Kovner M.A., Kryukov E.Yu., Kudelina I.A., Shiyan S.D., Bovin N.V., Nabiev I.R. Effect of carbohydrate moiety on the secondary structure of aracid glycoprotein. Raman scattering and circular dichroic spectroscopy study. - In: Spectroscopy of Biological Molecules: New Directions, Eds. J. Greve, G.J. Puppels, C. Otto, Kluwer Academic Publisher, p. 335-336, 1999.

26. Ermishov M., Sukhanova A., Kryukov E., Grokhovsky S., Zhuze A., Oleinikov V., Jardillier J-C., Nabiev I. Raman and Surface-Enhanced Raman Scattering Spectroscopy of Bis-Netropsins and Their DNA Complexes. - Biopolymers: Biospectroscopy. V. 57, No. 5, p. 272-281, 2000.

27. Oleinikov V., Mochalov K., Sukhanova A., Ermishev M., Grokhovskiy S., Zhuze A.L., Jardillier J.-C., Nabiev I. Raman Spectroscopy of DNA-Topotecan Complexes. - Proc. XVTIth Int. Conf. on Raman Spectroscopy, Beijing, China, p. 1012-1013, 2000.

28. Streltsov S., Sukhanova A., Mikheikin A., Grokhovsky S., Zhuze A., Kudelina I., Mochalov K., Oleinikov V., Jardillier J.-C. and Nabiev I. Structural basis of topotecan-DNA recognition probed by (low linear dichroism, circular dichroism and Raman spectroscopy. - Journ. Phys. Chem. В. V. 105, p. 9643-9652, 2001.'

29. Стрельцов C.A., Гроховский С.Л., Куделина И.А., Олейников В.А., Жузе A.J1. Взаимодействие топотекана - ингибитора ДНК-топоизомеразы I с двунитевыми полидезоксирибонуклеотидами. I. Димеризация топотекана в растворе. -Молекулярная биология. Т. 35, № 3, с. 432-441,2001.

30. Streltsov S.A., Grokhovskii S.L., Kudelina I.A., Oleinikov V.A., Zhuze A.L. The Behavior of the DNA Topoisomerase I Inhibitor in Aqueous Solution. - Journ. Biomolecular Structure and Dynamics. V. 18, No. 6, p. 913-914,2001.

31. Nabiev I., Mochalov K., Ustinova O., Sukhanova A., Jardillier J.-C., Oleinikov V. The structure of clevable ternary complexes of human DNA topoisomerase I, DNA and topotecan in solution probed by Raman and CD spectroscopy. - Anticancer Research. V. 21, No. ЗА, p. 1551-1552,2001.

32. Мочалов К. E., Устинова О. А., Стрельцов С. А., Гроховский С. Л., Жузе А. Л., Набиев И. Р., Суханова А. В., Олейников В. А. Спектроскопия комбинационного рассеяния топотекана, ингибитора ДНК топоизомеразы I. -Оптика и спектроскопия. Т. 93, № 4, с. 537-545, 2002.

33. Мочалов К.Е., Стрельцов С.А., Ермишов М.А., Гроховский СЛ., Устинова О.А., Суханова А.В., Жузе A.JI., Набиев И.Р., Олейников В.А. Спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния комплексов топотекана с ДНК: связывание с ДНК индуцирует димеризацию топотекана. - Оптика и спектроскопия. Т. 93, № 3, с. 454-462,2002.

34. Oleinikov V., Sukhanova A., Mochalov К., Ustinova О., Kudelina I., Bronstein I., Nabiev I. DNA binding induces conformational transition within the humane DNA topoisomerase I in solution. - Biopolymers: Biospectroscopy. V. 67, No. 6, p. 369375, 2002.

35. Стрельцов C.A., Михейкин A.JI., Гроховский C.JI., Олейников В.А., Жузе А.Л. Взаимодействие топотекана - ингибитора ДНК-топоизомеразы I с двунитевыми полидезоксирибонуклеотидами. III. Узкая бороздка - место связывания топотекана с ДНК. - Молекулярная биология. Т. 36, № 3, с. 511-524,2002.

36. Стрельцов С.А., Михейкин А.Л., Гроховский С.Л., Олейников В.А., Куделина И. А., Жузе А.Л. Взаимодействие топотекана - ингибитора ДНК-топоизомеразы I с двунитевыми полидезоксирибонуклеотидами. IV. Топотекан связывается преимущественно с GC-парами оснований ДНК. - Молекулярная биология. Т. 36, № 5, с.912-930,2002.

37. Зайцев С. Ю., Волченкова Т. А., Устинова О.А., Коштиго Т.В., Баггетто Л. Г., Флёри Ф., Мадулет К., Набиев И.Р., Олейников В. А. Исследование методом Лэнгмюра-Блоджетт влияния Р-гликопротеина на свойства липидных монослоев. - Биофизика. Т. 47, вып. 6, с. 1073-1079,2002.

38. Sukhanova A., Grokhovsky S., Ermishov М., Mochalov К., Zhuze A., Oleinikov V., Nabiev 1. DNA structural alterations induced by bis-Netropsins modulate human DNA topoisomerase I cleavage activity and poisoning by camptothecin. - Biochem. Pharmacology. V. 64, No. 1, p. 87-98, 2002.

39. Sukhanova A., Venteo L., Devy J., Artemyev M., Oleinikov V., Pluot M., Nabiev I Highly Stable Fluorescent Nanociystals as a Novel Class of Labels for Immunohistochemical Analysis of Paraffin-Embedded tissue Sections. - Laboratory Investigations / Brief Methods. V. 82, No. 9, p. 1259-1261, 2002.

40. Tuzikov A.B., Chinarev A.A., Gambaryan A.S., Oleinikov V.A., Klinov D.V., Matsko N.B., Kadykov V.A., Ermishov M.A., Demin I.V., Demin V.V., Rye P.D., Bovin N.V. Polyglycine II Nanosheets: Supramolecular Antivirais? - ChemBioChem. V. 4, p. 147-154,2003.

41. Олейников B.A., Устинова O.A., Мочалов К.Е., Ермишов М.А., Гроховский С.Л., Жузе А.Л., Суханова A.B., Набиев И.Р. Кинетика лактон/карбоксилатного перехода гибридной молекулы камптотецин-нетропсин. - Биофизика. Т. 48, № 3, с. 436-442,2003.

Авторские свидетельства и патенты

1. Куделина И.А., Кузнецов В.И., Мчедлишвили Б.В., Набиев И.Р., Олейников В.А., Соколов К.В., Шестаков В.Д. Способ распознавания структуры и ингредиентов вещества. Авт.св. N0.1673929,1991.

2. Марков Н.Г., Виленский А.И., Олейников ВА., Мчедлишвили Б.В., Донцова Э.П. Способ изготовления трековых мембран из полиимида. Патент РФ № 2036204, приоритет 30.10.1992.

Подписано в печать 20 октября 2003 г. Заказ &51 Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии МИФИ Москва, Каширское шоссе, 31

§ 17 09 4

Содержание диссертации, доктора физико-математических наук, Олейников, Владимир Александрович

Введение

Список сокращений

Глава 1 Современное состояние проблемы

1.1 ДНК топоизомераза I человека

1.2 Ингибиторы ДНК топоизомеразы I человека

1.2.1 Соединения-"яды" ДНК топоизомеразы I человека

1.2.2 Соединения-супрессоры ДНК топоизомеразы I человека

1.2.3 Гибридные ДНК-расщепляющие соединения

1.3 Методы оптической спектроскопии в исследовании действия и ингибирования ДНК топоизомеразы I

1.4 Спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния света

1.4.1 Электромагнитный механизм усиления

1.4.2 "Химические" или "молекулярные" механизмы усиления

1.4.3 Экспериментальные методы получения спектров гигантского комбинационного рассеяния биологических объектов

1.5 Выводы из анализа литературных данных и постановка задач исследования

Глава 2 Новые технологии приготовления поверхностей с регулируемыми неоднородностями. Разработка новых типов ГКР-активных поверхностей

2.1 Электромагнитные механизмы усиления КР на поверхностных неоднородностях

2.2 ГКР-активные поверхности на основе острийных структур

2.3 Резонансы локализованных плазмонов в системе полых металлических цилиндров

2.4 Спектры ГКР биологических молекул: чувствительность и информативность метода

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оптическая спектроскопия в исследовании молекулярных механизмов действия и создании новых противоопухолевых препаратов-ингибиторов ДНК топоизомеразы 1 человека"

ДНК топоизомераза I (топо1) является внутриядерным ферментом жизненно необходимым для функционирования всех без исключения клеток эукариот. Он играет ключевую роль во всех аспектах топологических изменений структуры ДНК, обеспечивая релаксацию суперскрученной ДНК для ее репликации и транскрипции.

Структурно-функциональные исследования топо1 приобрели особое значение, когда стало ясно, что фермент является основной клеточной мишенью для многих известных соединений с противоопухолевой и противомикробной активностью. Это открытие вызвало интенсивный поиск природных и создание новых синтетических соединений способных специфически взаимодействовать с молекулой ДНК и/или фермента и тем самым влиять на каталитическую активность топо1. Это влияние может проявляться либо путем модулирования узнавания ДНК ферментом (т.н. супрессоры топо1), либо путем одновременного взаимодействия с ферментом и с ДНК, приводящего к образованию долгоживущих ДНК-белковых, так называемых "расщепленных" комплексов, провоцирующих образование разрывов ДНК и гибель раковых клеток (т.н. яды топо1).

Изучение молекулярных механизмов действия ДНК-специфичных лигандов на ферментативный катализ с участием топо1 необходимы для разработки принципов направленного конструирования селективных ингибиторов фермента топо1 как новых противоопухолевых препаратов. Такой подход делает реальным приложение результатов исследования в медицине. Поэтому решение указанной проблемы актуально не только с фундаментальной, но и с практической точки зрения.

Ключом к решению этой задачи является разработка комплексного биофизического подхода к исследованию молекулярных механизмов взаимодействия биологических молекул в условиях, близких к физиологическим, в которых биологические молекулы сохраняют свою активность. Среди физических методов, дающих информацию о структуре сверхмолекулярных комплексов, выделяется оптическая спектроскопия, позволяющая проводить исследования в этих условиях. Среди методов оптической спектроскопии наиболее информативным является метод спектроскопии комбинационного рассеяния (КР) света, позволяющий селективно регистрировать сигналы отдельных молекулярных групп как лигандов, так и их мишеней в составе сверхмолекулярных комплексов. Спектры КР содержат детальную информацию о структуре молекул и позволяют регистрировать малые структурные изменения, индуцированные межмолекулярными взаимодействиями. Основным недостатком метода спектроскопии КР в его "традиционной" форме является низкая чувствительность, что вызывает необходимость применения спектроскопии резонансного КР и разработки новых методических подходов, основанных на спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (ГКР). Построения корректных моделей взаимодействия лиганд-мишень требует использования комбинированного подхода, основанного на использовании методов оптической спектроскопии и сопоставления получаемых результатов с теоретическими данными и данными биохимических исследований.

Экспериментально-методической основой настоящей работы явилось развитие комплексного подхода с использованием спектроскопии флуоресценции и поглощения, кругового и линейного дихроизма, а также спектроскопии КР, резонансного КР и ГКР. Совокупность данных, полученных этими методами, позволяет охарактеризовать структурные предпосылки молекулярных механизмов образования комплексов противоопухолевых ингибиторов топо1 с ДНК, выработать подход к направленному синтезу новых ингибиторов с улучшенными свойствами, синтезировать ингибиторы нового типа и предложить структурную модель их взаимодействий с ДНК и ферментом. Параллельные эксперименты по анализу цитотоксичности позволяют провести корреляцию структурно-функциональных данных с противораковой активностью новых соединений.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы - исследование молекулярных механизмов действия противоопухолевых препаратов - ингибиторов ДНК топоизомеразы I человека, действующих по принципу супрессоров либо ядов фермента и создание на основе понимания этих механизмов новых агентов, объединяющих достоинства обоих классов соединений.

Задачи работы включают:

-исследование молекулярных механизмов действия ядов фермента (на примере соединения из класса камптотецина - топотекана);

- исследование молекулярных механизмов действия супрессоров фермента (на примере производных нетропсина - бис-нетропсинов различной структуры);

Научная новизна.

В настоящей работе впервые:

1) Исследованы нелинейно-оптические свойства нового типа ГКР-активных поверхностей, реализующих усиление по дальнодействующему электромагнитному механизму усиления сигнала КР и позволяющие улучшить предел детекции биологических молекул на 2-3 порядка.

2) Исследованы молекулярные механизмы действия ингибиторов ДНК топоизомеразы I человека: типичного яда фермента, клинически важного аналога камптотецина - топотекана, а также типичных супрессоров, производных нетропсина - бис-нетропсинов. В частности, определена геометрия взаимодействия топотекана с ДНК и показано, что связывание с ДНК стабилизирует активную форму топотекана, выявлены молекулярные детерминанты, определяющие действие топотекана, показано, что взаимодействие с топотеканом приводит к формированию комплексов, содержащих две и более молекулы ДНК, предложена молекулярная модель комплекса топотекан-ДНК.

3) Выявлены основные механизмы ингибирования активности топо1 производными нетропсина - бис-нетропсинами разной структуры. Показано, что ключевую роль в ингибировании топо1 играют изменения структуры ДНК, индуцированные связыванием производным нетропсина. Показано, что присутствие бис-нетропсинов способно стимулировать формирование тройного комплекса ДНК/ топо1/камптотецин, усиливая, таким образом, ингибирующее действие камптотецина.

4) Предложен новый подход к конструированию противоопухолевых соединений нового типа, обладающих комбинированными свойствами супрессоров топо1 и соединений специфически связывающийся в тройной комплекс. Синтезированы и исследованы свойства гибридного соединения камптотецин-нетропсин.

На защиту выносятся следующие положения и результаты

1) Комплексный подход к изучению молекулярных механизмов действия ингибиторов ДНК топоизомеразы I человека, основанный на применении комбинации методов оптической спектроскопии, методов расчета структуры, электронных и колебательных состояний биологических молекул в сопоставлении с биохимическими данными.

2) Модели молекулярных механизмов действия соединений -супрессоров ДНК топоизомеразы I человека

3) Молекулярная модель взаимодействия клинически важного производного камптотецина - топотекана, ингибитора ДНК топоизомеразы I человека с ДНК. Методика интерпретации линий в спектрах КР топотекана, основанная на использовании разных ионных состояний топотекана; методика оценки степени димеризации молекулы в растворе и в комплексах с ДНК по данным спектроскопии ГКР и флуоресценции.

4) Подход к конструированию противоопухолевых соединений нового типа, обладающих комбинированными свойствами супрессоров топо1 и соединений - ядов фермента, специфически связывающихся в тройной комплекс.

5) Методика приготовления структурированных ГКР-активных поверхностей нового типа; выявленные закономерности, связывающие геометрические и электрические характеристики структурированных поверхностей с их оптическими свойствами; механизмы усиления эффекта КР на таких поверхностях; новый класс ГКР-активных подложек, позволяющих записывать спектры КР пикограммовых количеств биологических молекул.

Практическая значимость:

Список сокращений бис-Нт - бис-нетропсин;

ГКР - гигантское комбинационное

Нт - нетропсин;

СРТ - камптотецин (camptothecin); ПП - поверхностные плазмоны; Топо! - ДНК топоизомераза I рассеяние; КД - круговой дихроизм; КР - комбинационное рассеяние; ЛДП - линейный дихроизм в потоке; ЛП - локализованные плазмоны;

ТРТ - топотекан (topotecan); ЭСИ - эффект сил изображения. человека;

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Олейников, Владимир Александрович

ВЫВОДЫ

1) Разработан комплексный подход к изучению молекулярных механизмов действия ингибиторов ДНК топоизомеразы I человека, основанный на совместном применении спектроскопии поглощения, флуоресценции, кругового и линейного дихроизма, КР и ГКР в сопоставлении с методами расчета структуры, электронных и колебательных параметров биологических молекул и с биохимическими данными. Возможности подхода продемонстрированы на примерах типичных супрессоров топо1 (бис-нетропсины) и "яда" топо1 - клинически важного соединения из семейства камптотецина - топотекана (ТРТ).

2) Исследованы молекулярные механизмы действия супрессоров топо1. Обнаружено, что взаимодействие с бис-нетропсинами индуцирует структурные изменения ДНК вне участка взаимодействия лиганд-ДНК, но на участке связывания ДНК-фермент. Показано, что структурные изменения, индуцируемые связыванием лиганда на участке ДНК-белкового взаимодействия, коррелируют с биологической активностью лиганда.

3) На примере клинически важного производного камптотецина -топотекана (ТРТ) исследованы молекулярные механизмы действия соединений - "ядов" топо1. Предложена методика отнесения полос в спектрах КР, основанная на использовании разных ионных состояний молекулы ТРТ и расчетных данных. Выявлены спектральные признаки участия во взаимодействиях отдельных фрагментов молекулы ТРТ, определена структура димеров ТРТ в растворе и комплексов ТРТ с ДНК. Предложена методика оценки степени димеризации ТРТ, основанная на сопоставлении данных флуоресценции и ГКР. Показано, что связывание с ДНК индуцирует димеризацию лиганда. На основе данных оптической спектроскопии предложена молекулярная модель взаимодействия ТРТ с ДНК.

4) Предложен подход к конструированию соединений, объединяющих достоинства супрессоров и "ядов" топо1. Синтезировано новое соединение -конъюгат нетропсина с камптотецином, обладающее высокой стабильностью лактонной формы. Показано, что это соединение обладает свойствами как супрессора, так и "яда" топо1 и эффективно в клеточной линии СаОУЗ (аденокарцинома яичников).

5) Исследованы нелинейно-оптические свойства нового класса ГКР-активных поверхностей, формируемых по технологии трековых мембран (острийные структуры и системы полых микротрубок). На основе данных, полученных методами генерации гигантской второй гармоники оптического излучения, комбинационного рассеяния и определения линейных оптических свойств этих новых структурированных поверхностей, выявлены основные закономерности, связывающие оптические свойства поверхностей, геометрические характеристики поверхностных неоднородностей и параметры материала поверхностей. Показана возможность формирования структур с заданными оптическими свойствами. Показано, что основную роль в усилении эффекта КР на этих поверхностях, играет дальнедействующий электромагнитный механизм. Использование разработанных ГКР-активных систем позволяет записывать спектры ГКР пикораммовых количеств биологических макромолекул.

БЛАГОДАРНОСТИ

Считаю своим приятным долгом выразить глубокую благодарность д.х.н., профессору Игорю Руфаиловичу Набиеву, д.х.н. Борису Викторовичу Мчедлишвили, члену корреспонденту РАН, д.ф.-м.н, Льву Александровичу Грибову, д.ф.-м.н., профессору Михаилу Аркадьевичу Ковнеру за постоянный интерес к работе и всестороннюю поддержку, за обсуждения планов и результатов работы, за высказанные критические замечания.

Хочу также поблагодарить за помощь, оказанную при выполнении работы и доброжелательный критицизм: сотрудников Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова: к.б.н. Алену Владимировну Суханову, к.ф.-м.н., Константина Евгеньевича Мочалова, м.н.с. Ольгу Александровну Устинову, Михаила Александровича Ермишова;

- сотрудников Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта: к.х.н. Алексея Львовича Жузе, к.х.н. Сергея Львовича Гроховского, к.ф.-м.н. Сергея Анатольевича Стрельцова;

- сотрудников Института кристаллографии им. А.В.Шубникова: к.х.н. Александра Исааковича Виленского, к.ф.-м.н. Андрея Владимировича Петухова, к.ф.-м.н. Владимира Викторовича Березкина

6.7. Заключение.

Сформулирован подход к конструированию нового класса производных СРТ, основанный на создании гибридных соединений, свойства которых регулируются их внутримолекулярными взаимодействиями. За счет этого реализована возможность управления одним из важнейших свойств производных СРТ - скоростью гидролиза лактонного кольца камптотецинового фрагмента. Этот результат является важным также и с прикладной точки зрения, поскольку противоопухолевую активность показывает только лактонная форма соединений камптотецинового ряда, и увеличение времени существования активной формы является путем повышения эффективности противораковых агентов этого семейства.

Синтезированная гибридная молекула - конъюгат СРТ с Нт, ингибирует действие топо1 по двум различным механизмам, определяемым как Нт, так и СРТ частями гибридной молекулы. Доминирующий механизм действия той или другой части конъюгата определяется последовательностью участка ДНК, с которым конъюгат связан и с которым взаимодействует топо1. То есть при достаточной длине ДНК на ней должны найтись участки последовательностей, способных инициировать действие как одной, так и другой частей конъюгата.

Во-первых, это означает, что синтезируемые конъюгаты способны подавлять действие топо1 по механизму формирования тройных комплексов, то есть направленно ингибировать именно топо1 и, таким образом, эффективно работать в клеточных линиях с высокой концентрацией топо1. Во-вторых, полученные конъюгаты способны ингибировать действие и других ферментов, взаимодействующих с ДНК. В этом случае механизм действия конъюгатов основан на заполнении малой бороздки ДНК и создании стерических препятствий во взаимодействии фермент-ДНК. Таким образом, конъюгаты должны быть также эффективны в линиях СРТ-резистентных клеток, где резистентность опосредуется низкой концентрацией топо!, а ее функцию выполняют другие ферменты.

Библиография Диссертация по биологии, доктора физико-математических наук, Олейников, Владимир Александрович, Санкт-Петербург

1. Акципетров О.А., Баранова И.М., Мишина Е.Д., Петухов А.В., "Эффект громоотвода" при генерации гигантской второй гармоники, Письма в ЖЭТФ, 40, № 6, 240-242, (1984).

2. Акципетров О.А., Баранова И.М., Ильинский Ю.А., Вклад поверхности в генерацию отраженной второй гармоники для центросимметричных полупроводников., ЖЭТФ, 91, в. 1(7), 287-297,(1986).

3. Акципетров О.А., Кулюк JI.JI., Петухов А.В., Струмбан Э.Е., Цыцану В.И., Нелинейно-оптический метод исследования и контроля микронеоднородности поверхности металлов и полупроводников., Письма в ЖТФ, 12, в. 22, 1345-1349, (1986).

4. Бугреев Д.В., Бунева В.Н., Синицина О.И., Невинский Г.А., Механизм узнавания суперскрученной ДНК эукариотическими топоизомеразами первого типа. I Взаимодействие ферментов с неспецифическими олигонуклеотидами. Биоорганич. химия, 29, № 2, 163-174, (2003).

5. Виленский А.И., Олейников В.А., Мчедлишвили Б.В., Васильев А.Б., Апель П.Ю., Структурные изменения в полиэтилентерефталате при производстве ядерных мембран, Химия высоких энергий, 26, 59-62, (1992).

6. Виленский А.И., Олейников В.А., Мчедлишвили Б.В., Исследование структуры треков ионов Хе в полиэтилентерефталате, Химия высоких энергий, 26,12-16, (1992).

7. Виленский А.И., Олейников В.А., Купцова И.В., Марков Н.Г., Мчедлишвили Б.В., Гусинский Г.М., Треки высокоэнергетичных ионов в полиимиде: I. Свойства полиимида, облученного высокоэнергетичными ионами, Химия высоких энергий, 28, 285-289, (1994).

8. Гигантское комбинационное рассеяние / Ред. Р. Ченг и Т. Фуртак. Пер. с англ., М., Мир., 408 С, (1984).

9. Грибов JI.A., Дементьев В.А., Моделирование колебательных спектров сложных соединений на ЭВМ, Москва, "Наука", (1989).

10. Грибов J1.A., Баранов В.И., Зеленцов Д.Ю., Электронно-колебательные спектры многоатомных молекул. Теория и методы расчета, Москва, "Наука", (1997).

11. Грибов JI.A., Муштакова С.П. Квантовая химия, М. Гардарики, 390 с, (1999).

12. Емельянов В.И., Коротеев Н.И., Эффект гигантского комбинационного рассеяния света молекулами, адсорбированными на поверхности металла, Успехи физ. наук, 135, 345-361,(1981).

13. Ермушев А.В., Мчедлишвили Б.В., Олейников В.А., Петухов А.В., Поверхностное усиление локальных световых полей и эффект "громоотвода"., Квантовая электроника, 20, N.5, 503-509,.(1993).

14. Кантор Ч., Шиммел П., Биофизическая химия, том 2, Пер. с англ., Москва, "Мир", (1984).

15. Куделина И.А., Кузнецов В.И., Мчедлишвили Б.В., Набиев И.Р., Олейников В.А., Соколов К.В., Шестаков В.Д., Способ распознавания структуры и ингредиентов вещества. Авт.св. No.l673929, (1991).

16. Маринюк В.В., Лазоренко-Маневич Р.П., О сечении комбинационного рассеяния адсорбированного на серебре пиридина., Электрохимия, 14, 1019-1023, (1978).

17. Макаров В.Л., Стрельцов С.А., Венгеров Ю.Ю., Хорлин А.А., Гурский Г.В., Пространственная структура комплекса ДНК с олигопепимидом дансилгидразином тривалина, Молекулярная биол., 17,1089-1101, (1983).

18. Марков Н.Г., Виленский А.И., Олейников В.А., Мчедлишвили Б.В., Донцова Э.П., Способ изготовления трековых мембран из полиимида. Патент РФ № 2036204, (1992).

19. Мчедлишвили Б.В., Березкин В.В., Васильев А.Б., Олейников В.А., Ядерные фильтры и структуры на их основе.- В кн.:"Физическая кристаллография", М., Наука, 43-58, 366 С, (1992).

20. Набиев И.Р., Ефремов Р.Г., Чуманов Г.Д., Гигантское комбинационное рассеяние и его применение к изучению биологических молекул., Успехи физ. наук., 154, в. 3, 459-494,(1988).

21. Невинский Г.А., Важная роль слабых взаимодействий при узнавании ферментами протяженных молекул ДНК и РНК, Мол. биология, 29, в. 1, 16-37, (1995).

22. Никулин А.А., Петухов А.В., Гигантская вторая гармоника на шероховатой поверхности металла: флуктуационный механизм диффузности и деполяризации излучения., Докл. АН СССР, 304, № 1, 87-91, (1989).

23. Олейников В.А., Соколов К.В., Набиев И.Р., Микроанализ веществ методом спектроскопии ГКР с использованием технологии трековых мембран, Журн. прикл. спектроскопии, 59, №.5-6,458-464, (1993).

24. Олейников В.А., Устинова О.А., Мочалов К.Е., Ермишов М.А., Гроховский C.JL, Жузе A.JI., Суханова А.В., Набиев И.Р. Кинетика лактон/карбоксилатного перехода гибридной молекулы камптотецин-нетропсин, Биофизика, 48,436-442, (2003).

25. Флеров Г.Н., Синтез сверхтяжелых элементов и применение методов ядерной физики в смежных областях, Вестн. АН СССР, 4, 35-49, (1984).

26. Якубовская Е.А., Куделина И.А., Бронштейн И.Б., Габибов А.Г., Новый подход к исследованию кинетики топоизомеразы, Докл. Акад. Наук., 361, 837-838, (1998).

27. Якубовская Е.А., Габибов А.Г., Топоизомеразы. Механизмы изменения топологии ДНК, Мол. биология, 33, № 3, 368-384, (1999).

28. Abelson, Н.Т., Penman, S., Selective interruption of high molecular weight RNA synthesis in HeLa cells by camptothecin, Nature New Biol., 237,144-146, (1972).

29. Albrecht M.G., Creighton J.A., Anomaly intense Raman spectra of pyridine on silver electrode., J. Amer. Chem. Soc., 99, 5215-5217, (1977).

30. Andoh, Т., Ishii, K., Suzuki, Y., Ikegami, Y., Kusunoki, Y., Takemoto, Y., Okada, K., Characterization of a mammalian mutant with a camptothecin-resistant DNA topoisomerase I, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 5565-5569, (1987).

31. Armand, J.P., Ducreux, M., Mahjoubi, M., Abigerges, D., Bugat, R., Chabot, G., Herait, P., de Forni, M., Rougier, P., СРТ-11 (irinotecan) in the treatment of colorectal cancer, Eur. J. Cancer., 31A, 1283-1287, (1995).

32. Arvind P.K., Hood E., Metiu H., Angular resonances in the emission from a dipole located near a grating, Surf. Sci., 148, 411-418, (1984).

33. Aussenegg F.R., Lippitch M.E., SERS of pyridine adsorbed on the silver surface, Chem. Phys. Lett., 59,214-216, (1978).

34. Bailly, C., Riou, J.F., Colson, P., Houssier, C., Rodrigues-Pereira, E., Prudhomme, M., DNA cleavage by topoisomerase I in the presence of indolocarbazole derivatives of rebeccamycin, Biochemistry, 36, 3917-3929, (1997).

35. Bailly, С., Chaires, J.B., Sequence-specific DNA minor groove binders. Design and synthesis of netropsin and distamycin analogues, Bioconjug. Chem., 9, 513-538, (1998).

36. Barber, P.W., Chang, R.K., Massoudi, HM Electrodynamic calculations of the surface-enhanced electric intensities on large Ag spheroids, Phys. Rev. В., 27, 7251-7261, (1983).

37. Beamer, L.J., Pabo, C.O., Refined 1.8 A crystal structure of the lambda repressor-operator complex, J. Mol. Biol., 227,177-196, (1992).

38. Benevides, J.M., Li, Т., Lu, X.J., Srinivasan, A.R., Olson, W.K., Weiss, M.A., Thomas, G.J., Jr., Protein-directed DNA structure II. Raman spectroscopy of a leucine zipper bZIP complex, Biochemistry, 39, 548-556, (2000).

39. Bergqvist, S., O'Brien, R., Ladbury, J.E., Site-specific cation binding mediates TATA binding protein-DNA interaction from a hyperthermophilic archaeon, Biochemistry, 40, 2419-2425 (2001).

40. Bonven, B.J., Westergaard, O., DNase I hypersensitive regions correlate with a site-specific endogenous nuclease activity on the r-chromatin of Tetrahymena, Nucleic Acids Res., 10, 7593-7608,(1982).

41. Bonven, B.J., Gocke E., Westergaard, O., A high affinity topoisomerase I binding sequence is clustered at DNAase I hypersensitive sites in Tetrahymena R-chromatin, Cell, 41, 541-551, (1985).

42. Boyd, G.T., Rasing, Th., Leite, J.R.R., Shen, Y.R., Local-field enhancement on rough surfaces of metal, semimetals, amd semiconductors with the use of optical second-harmonic generation., Phys. Rev., B, 30, 519-526, (1984).

43. Brodsky A.M., Uibakh M.J., Dependence of light reflection from metals on adatom characteristics. Phys. State Solid, 83, 633-644, (1977).

44. Burke, T.G., Mi, Z., The structural basis of camptothecin interactions with human serum albumin: impact on drug stability., J. Med. Chem., 37,40-46, (1994).

45. Burstein E., Chen Y.J., Chen C.Y., Giant Raman scattering by adsorbed molecules on metal surfaces, Solid State Commun., 29, 565-570, (1979).

46. Champoux, J. J., DNA is linked to the rat liver DNA nicking-closing enayme by a phosphodiester bond to tyrosine, J, Biol, Chem., 256, 4805-4809, (1981).

47. Champoux, J.J., DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism, Annu. Rev. Biochem., 70,369-413, (2001).

48. Chen, A.Y., Yu, С., Gatto, В., Liu, L.F., DNA minor groove-binding ligands : a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8131-8135, (1993).

49. Chen C.Y., Burstein E., Surface electromagnetic - wave - enhanced Raman scattering from overlayers on metals, Phys. Rev. Lett., 45, 1287-1291, (1980).

50. Chen, C.K., de Castro, A.R.B., Shen, Y.R., Surface enhanced second harmonic generation., Phys. Rev. Lett., 46,145-148, (1981).

51. Chen, W.P., Rithie, G., Burstein, E., Exitation of surface electromagnetic waves in attenuated total reflaction prism configurations, Phys. Rev. Lett., 37, 993-997, (1976).

52. Chillemi, G., Castrignano, Т., Desideri, A., Structure and Hydration of the DNA-Human Topoisomerase I Covalent Complex, Biophys. Journ., 81, 490-500, (2001).

53. Chillemi, G., Fioranil, P., Benedetti, P., and Desideri, A., Protein concerted motions in the DNA-human topoisomerase I complex, Nucleic Acids Res., 31,1525-1535, (2003).

54. Chourpa, I., Millot, J.-M., Sockalingum, G.D., Riou, J.F., Manfait, M., Kinetics of lactone hydrolysis in antitumor drugs of camptothecin series as studied by fluorescence spectroscopy, Biochim Biophys Acta, 1379, 353-366, (1998).

55. Chourpa, I., Riou, J-F., Millot, J-M., Pommier, Y., Manfait, M., Modulation in kinetics of lactone ring hydrolysis of camptothecins upon interaction with topoisomerase I cleavage sites on DNA, Biochemistry, 37, 7284-7291, (1998).

56. Chumanov G.D., Efremov R.G., Nabiev I.R., Surface-enhanced Raman spectroscopy of biomolecules. Part I. Water-soluble proteins, dipeptides and amino acids., J.Raman Spectrosc., 21,43-48, (1990).

57. Covey, J.M., Jaxel, C., Kohn, K.W., Pommier, Y., Protein-linked DNA strand breaks induced in mammalian cells by camptothecin, an inhibitor of topoisomerase I, Cancer Res., 49, 50165022, (1989).

58. Dallavalle, S., Delsoldato, Т., Ferrari, A., Merlini, L., Penco, S., Carenini, N. Perego, P., De Cesare, M., Pratesi, G., Zunino, F., Novel 7-substituted camptothecins with potent antitumor activity, J. Med. Chem., 43, 3963-3969, (2000).

59. Dancey, J., Eisenhauer, EA., Current perspectives on camptothecins in cancer treatment, Br. J. Cancer., 74, 327-338, (1996).

60. Das, S., Gersten, J.I., Surface shape resonances, Phys. Rev. В., 25, 6281-6290, (1982).

61. Das, S., Gersten, J.I., Electronic Raman scattering from spherical particles, Phys. Rev. B. Condens. Matter., 37, 6063-6072, (1988).

62. Deng, H., Bloomfield, V.A., Benevides, J.M., Thomas, G.J., Jr., Dependence of the Raman signature of genomic B-DNA on nucleotide base sequence, Biochemistry, 50, 656-666, (1999).

63. Dewar, M.J.S., Zoebisch, E.G., Healy, E.F., Stewart, J.P., AMI: a new general purpose quantum mechanical molecular model., J. Am. Chem. Soc., 107, 3902-3909, (1985).

64. Dickerson, RE., DNA bending: the prevalence of kinkiness and the virtues of normality, Nucleic Acids Res., 26,1906-1926, (1998).

65. Dornhaus R., Benner R.E., Chang R.K., Chabay I., Surface plasmon contribution in SERS, Surf. Sci., 101, 367-373, (1980).

66. Durig, J.R., Far-infrared absorption, vibrational spectra and structure of beta-propiolactone, Spectrochem. Acta, 19,1225-1233, (1963).

67. Efrima S., Metiu H., Classical theory of light scattering by a molecule located near a solid surface, Chem. Phys. Lett., 60, 59-64, (1979).

68. Efrima S. The effect of large electric field gradients on the Raman optical activity of molecules, adsorbed on metal surfaces, Chem Phys. Lett., 102, 79-82, (1983).

69. Efrima S., Yogev D., Raman scattering from silver metal "liquid-like" films, In: Eleventh international conference on Raman spectroscopy, eds. R.J.H. Clark and D.A. Long, John Wiley, New York, 179-180 (1988).

70. Fang, S.D., Wang, L.K., Hecht, S.M., Inhibitors of DNA topoisomerase I isolated from the roots of Zanthoxylum Nitidum, J. Org. Chem., 58, 5025-5027, (1993).

71. Fassberg, J., Stella, V.J., A kinetic and mechanistic study of the hydrolysis of camptothecin and some analogues. J. Pharmaceutical Sciences, 81, 676-684, (1992).

72. Fischer, B.E., Spohr, R., Production and use of nuclear tracks: imprinting structure on solids, Rev. Mod. Physics, 55,907-948, (1983).

73. Fleishmann, M., Hendra, P.J., McQuillan, A. J., Raman spectra from electrode surfaces., J. Chem. Soc. Chem., Commun., p. 80, (1973).

74. Fleishman M., Hendra, P.J., McQuillian A.J., Raman spectra of pyridine adsorbed at silver electrode, Chem. Phys. Lett., 26, 163-166, (1974).

75. Fleishman M., Hendra, P.J., McQuillian A.J., Paul R.L., Reid E.S., Raman spectroscopy at electrode electrolyte interfaces, J. Raman Spectrosc., 4,269-274, (1976).

76. Fleishman M., Hendra, P.J., Hill I.R., Pemble M.E., Enhanced Raman spectra from species formed by the coadsorption on halide ions and water molecules on silver electrode, J. Electroanalyt. Chem., 117, 243-255, (1980).

77. Fujii, N., Yamashita, Y., Mizukami, Т., Nakano, H., Correlation between the formation of cleavable complex with topoisomerase I and growth-inhibitory activity for saintopin-type antibiotics, Mol. Pharmacol., 51, 269-276, (1997).

78. Fujimori, A., Harker, W.G., Kohlhagen, G., Hoki, Y., Pommier, Y., Mutation at the catalytic site of topoisomerase I in CEM/C2, a human leukemia cell line resistant to camptothecin, Cancer Res., 55, 1339-1346,(1995).

79. Gatto, В., Sanders, M.M., Yu, С., Wu, H.Y., Makhey, D., LaVoie, E.J., Liu, L.F., Identification of topoisomerase I as the cytotoxic target of the protoberberine alkaloid coralyne, Cancer Res., 56,2795-2800, (1996).

80. Gersten J.I., Birke R.L., Lombardi J.R., Theory of enhanced light scattering from molecules adsorbed on the metal solution interfaces, Phys. Rev. Lett., 43, 147-150, (1979).

81. Gersten, J.I., Nitzan, A., Electromagnetic theory of enhanced Raman scattering by molecules absorbed on rough surfaces., J. Chem. Phys., 73,3023-3037 (1980).

82. Gil, M., Nunes, J.L., Palafox, M. A., Iza, N., FTIR study of five complex beta-lactam molecules., Biopolymers, 62,278-294, (2001).

83. Gilmour, D.S., Elgin, S.C., Localization of specific topoisomerase I interactions within the transcribed region of active heat shock genes by using the inhibitor camptothecin, Mol. Cell Biol., 7, 141-148, (1987).

84. Gololobov, G., Chemova, E., Schourov, D., Smirnov, I., Kudelina, I., Gabibov, A., Cleavage of Supercoiled Plasmid DNA by Autoantibody Fab Fragment: Application of the flow linear dichroism technique, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 254-257, (1995).

85. Goodsell, D., Корка, M.L., Dickerson, R.E., Deoxyribonucleic acid. Brookhaven Protein Data Bank. Identification code: NT-lOld, (1994)

86. Gribov, L.A., Reichstat, M.M., Force density method for chemical bond characterization, J. Mol. Structure, 183,121-133, (1989).

87. Griffin, J.H., Dervan, P.B., Sequence-specific chiral recognition of right-handed double-helical DNA by (2S,3S)- and (2R,3R)-dihydroxybis(netropsin)succinamide., J. Am. Chem. Soc., 108, 5008-5009, (1986).

88. Grokhovsky, S.L., Zubarev, V.E., Sequence-specific cleavage of double-stranded DNA caused by X-ray ionization of the platinum atom in the Pt-bis-netropsin DNA complex, Nucl. Acids Res., 19, 257-264, (1991).

89. Grokhovsky, S.L., Surovaya, A.N., Burckhardt, G., Pismensky, V.F., Chernov, B.K., Zimmer, C., Gursky, G.V., DNA sequence recognition by bis-linked netropsin and distamycin derivatives. FEBS Lett., 439, 346-350, (1998).

90. Gromova, I., Kjeldsen, E., Sveistrup, J., Alsner, J., Christiansen, K., Westergaard, O., Characterization of an altered DNA catalysis of a camptothecin-resistant eukaryotic topoisomerase I., Nucleic Acids Res., 21, 593-600, (1993).

91. Grygon, C.A., Spiro, T.G., Ultraviolet resonance Raman spectroscopy of distamycin complexes with poly(dA)-poly(dT) and poly(dA-dT): role of H-bonding, Biochemistry, 28, 4397-4402, (1989).

92. Gupta, M., Fujimori, A., Pommier, Y., Eukaryotic DNA topoisomerases I, Biochem. Biophys. Acta., 1262, 1-14, (1995).

93. Hofricher, J., Eaton, W.A., Linear dichroism of biological chromophores, Annu. Rev. Biophys. Bioeng., 5, 511-560, (1976).

94. Jackson, J. В., Westcott, S. L., Hirsch, L. R., West, J. L., Halas, N. J., Controlling the surface enhanced Raman effect via the nanoshell geometry., Applied Phys. Lett., 82, 257-259, (2003).

95. Jaenmaire D.J., Van Duyne R.P., Surface Raman spectroelectrochemistry. Part I, Heterocyclic, aromatic and aliphatic amines adsorbed on anodized silver electrodes., J. Electroanalyt. Chem., 84, 1-20, (1977)

96. Jaxel, C., Capranico, G., Kerrigan D., Kohn, K.W., Pommier Y., Effect of local DNA sequence on topoisomerase I cleavage in the presence or absence of camptothecin, J. Biological Chem., 266, 20418-20423, (1991).

97. Jha S.S., Kirtley J.R., Tsang J.C., Intensity of Raman scattering from molecules adsorbed on metal gratings, Phys. Rev. Ser. B, 22, 5187-5191, (1980).

98. Katahira, M., Sugeta, H., Kyogoku, Y., A new model for the bending of DNAs containing the oligo(dA) tracts based on NMR observations, Nucleic Acids Res., 18, 613-618, (1990).

99. Kaufmann S., DNA topoisomerases in chemotherapy, Cancer Cells, 3, 24-27, (1991).

100. Kehrer, D.F., Soepenberg, O., Loos, W.J., Verweij, J., Sparreboom, A., Modulation of camptothecin analogs in the treatment of cancer: a Review, Anticancer Drugs. 12, 89-105, (2001).

101. Kerrigan, J.E., Pilch, D.S., A structural model for the ternary cleavable complex formed between human topoisomerase I, DNA and camptothecin, Biochemistry, 40, 9792-9798, (2001).

102. Khorlin, A.A., Krylov, A.S., Grokhovsky, S.L., Zhuze, A.L., Zasedatelev, A.S., Gursky, G.V., Gottikh, B.P., A new type of AT-specific ligand constructed of two netropsin-like molecules, FEBS Lett., 118, 311-314, (1980).

103. Kim, J.L., Burley, S.K., 1.9 A resolution refined structure of TBP recognizing the minor groove of TATAAAAG, Nat. Struct. Biol., 1, 638-653, (1994).

104. Kim, J.S., Sun, Q., Gatto, В., Yu, C., Liu, A., Liu, L.F., LaVoie, E.J., Structure-activity relationships of benzimidazoles and related heterocycles as topoisomerase I poisons. Bioorg. Med. Chem., 4,621-630, (1996).

105. Kirtley J.R., Jha S.S., Tsang J.C., To the theory of SERS effect on the meal/air interfaces, Solid State Commun., 35, 509-512, (1980).

106. Kissinger, C.R., Liu, B.S., Martin-Blanco, E., Kornberg, T.B., Pabo, C.O., Crystal structure of an engrailed homeodomain-DNA complex at 2.8 A resolution: a framework for understanding homeodomain-DNA interactions, Cell, 63, 579-590, (1990).

107. Kjeldsen, E., Bonven, B.J., Andoh, Т., Ishii, K., Okada, K., Bolund, L., Westergaard, O., Characterization of a camptothecin-resistant human DNA topoisomerase I, J. Biol. Chem., 263, 3912-3916,(1988).

108. Kjeldsen, E., Svejstrup, J.O., Gromova, I.I., Alsner J., Westergard, O., Camptothecin inhibits both the cleavage and religation reactions of eukaryotic DNA topoisomerase I, J. Mol. Biol., 228, 1025-1030,(1992).

109. Корка, M.L., Yoon, С., Goodsell, D., Pjura, P., Dickerson, R.E., The molecular origin of DNA-drug specificity in netropsin and distamycin., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1376-1380, (1985).

110. Корка, M.L., Yoon, C., Goodsell, D., Pjura, P., Dickerson, R.E., Binding of an antitumor drug to DNA, Netropsin and C-G-C-G-A-A-T-T-BrC-G-C-G., J. Mol. Biol., 83, No. 4, 553-563, (1985).

111. Krogh, S., Mortensen, U.H., Westergaard, O., Bonven, B.J., Eukaryotic topoisomerase I-DNA interaction is stabilized by helix curvature, Nucleic Acids Res., 19, 1235-1241, (1991).

112. Kwon, K, Stivers, J.T., Fluorescence spectroscopy studies of vaccinia type IB DNA topoisomerase. Closing of the enzyme clamp is faster than DNA cleavage, J. Biol. Chem., 277,345-352, (2002).

113. Madden, K.R., Champoux, J.J., Overexpression of human topoisomerase I in baby hamster kidney cells: hypersensitivity of clonal isolates to camptothecin, Cancer. Res., 52, 525-532, (1992).

114. Madden, K., Stewart, L., Champoux, J.J., Preferential binding of human topoisomerase I to superhelical DNA, EMBO Journ., 14, 5399-5409, (1995).

115. Martin, J.C., Wartell, R.M., O'Shea, D.C., Conformational features of distamycin-DNA and netropsin-DNA complexes by Raman spectroscopy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 54835487, (1978).

116. Mathijssen, R.H.J., Loos, W.J, Verweij, J., Sparreboom A., Pharmacology of topoisomerase I inhibitors Irinotecan (CPT-11) and topotecan. Current Cancer Drug Targets, 2, 103-123, (2002).

117. McCall S.L., Platzman P.M., Wolff P.A., Raman scattering from chemisorbed molecules at surfaces, Phys. Rev. Ser. A, 77, 381-383, (1980).

118. Mchedlishvili B.V., Beryozkin V.V., Oleinikov V.A., Vilensky A.I., Vasilyev A.B., Structure, physical and chemical properties and applications of nuclear filters as new class of membranes, Journ. Membrane Science, 79, 285-304, (1993).

119. McPhail, A.T., Sim, G.A., The structure of camptothecin: X-ray analysis of camptothecin iodoacetate, J. Chemical Society B, No. 8, 923-928, (1968)

120. Mlinsky V.V., Makarov A.A., Oleinikov V.A., The application of nuclear track membranes for ion sampling to mass-spectrometer, Radiation Measurements, 25, 741-742, (1995).

121. Nabiev, I., Sokolov, K., Manfait, M., Surface-Enhanced Raman Spectroscopy and its Biomedical Applications. In the book: "Biomolecular Spectroscopy", Part A, ed. by R. J. H. Clark and R. E. Hester, John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, 267-338, (1993).

122. Nechipurenko, Yu.D., Mikheikin, A.L., Streltsovl, S.A., Zasedatelev, A.S., Nabiev, I.R., Mixed mode of ligand-DNA binding results in S-shaped binding curves. J. Biomolecular Structure & Dynamics, 18, 703-708, (2001).

123. Ni F., Cotton T.M., Chemical procedure for preparing surface enhanced Raman scattering active silver films, Anal. Chem., 58, 3159-3163, (1986).

124. Nie, S., Emory, S.R., Probing Single Molecules and Single Nanoparticles by Surface-Enhanced Raman Scattering, Science, 275, 1102-1106,(1997).

125. Norden, В., Kubista, M., Kurucsev, Т., Linear dichroism spectroscopy of nucleic acids, Quart. Rev. Biophys., 25,51-170, (1992).

126. Nyquist, R.A., Fouchea, H.A., Hoffman, G.A., Hasha, D.L., Infrared study of P-propiolactone in various solvent systems and other lactones, Appl. Spectroscopy, 45, 860-867, (1991).

127. Oldenburg, S.J., Westcott, S.L., Averitt, R.D., Halas, N.J., Surface enhanced Raman scattering in the near infrared using metal nanoshell substrates, J. Chem. Phys., Ill, 4729-4735, (1999).

128. Spectroscory of Biological Molecules, edited by T. Theophanides, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 393-394, (1994).

129. Oleinikov V.A., Tolmachyova Yu.V.,Berezkin V.V.,Vilensky A.I., Mchedlishvili B.V., Polyethileneterephthalate track membranes with conical pores: etching by water-alcohol alkali solutionns, Radiation Measurements, 25, 713-714, (1995).

130. Oleinikov V.A., Makarov A.A., Application of secondary structures prepared on the base of track membrane technique for scanning tunneling microscopy, Radiation Measurements, 25, 699-702, (1995).

131. Oleinikov, V., Feofanov, A., Ianoul, A., Kryukov, E., Shiyan, S., Bovin, N., Nabiev, I., The structure of carbohydrate chains of alpha 1-acid glycoprotein. Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy study, European Biophys. Journ., 26, 30, (1997).

132. Oleinikov, V., Kryukov, E., Kovner, M., Ermishov, M., Tuzikov, A., Shiyan, S., Bovin, N., Nabiev, I., Sialylation sensitive bands in the Raman spectra of oligosaccharides and glycoproteins, J. Molecular Structure, 480-481, 475-480, (1999).

133. Oleinikov, V., Mochalov, K., Sukhanova, A., Ermishev, M., Grokhovskiy, S., Zhuze, A.L., Jardillier, J.C., Nabiev, I. Raman Spectroscopy of DNA-Topotecan Complexes. Proc. XVIIth Int. Conf. on Raman Spectroscopy, Beijing, China, 1012-1013, (2000).

134. Oleinikov V. Mochalov, K., Ustinova, O., Zhuze, A., Streltsov, S., Sukhanova, A., Jardillier J.-C., Nabiev, I., Raman spectroscopy study of DNA binding by topotecan, inhibitor of DNA topoisomerase I, Anticancer Research, 21, 1552-1553, (2001).

135. Oleinikov, V., Sukhanova, A., Mochalov, K., Ustinova, O., Kudelina, I., Bronstein, I., Nabiev, I., DNA binding induces conformational transition within the human DNA topoisomerase I in solution, Biopolymers: Biospectroscopy, 67, No. 6, 369-375, (2002).

136. Pabo, C.O., Sauer, R.T., Transcription factors: structural families and principles of DNA recognition, Annu. Rev. Biochem., 61, 1053-1095, (1992).

137. Patel, D.J., Shapiro, L., Sequence-dependent recognition of DNA duplexes. Netropsin complexation to the AATT site of the d(G-G-A-A-T-T-C-C) duplex in aqueous solution, J. Biol. Chem., 261,1230-1240, (1986).

138. Perini, R., Caserta, M., Di Mauro, E., DNA tridimensional context affects the reactivity of eukaryotic DNA topoisomerase I, J. Mol. Biol., 231, 634-645, (1993)

139. Pettinger В., Wenning U., Kolb D.M., Raman and reflectance spectroscopy of pyridine adsorbed on single crystalline silver electrodes, Ber. Bunges. Phys. Chem., 82, 37-41, (1980).

140. Pommier, Y., Kohlhagen, G., Kohn, K.W., Leteurtre, F., Wani, M.C., Wall, M.E., Interaction of an alkylating camptothecin derivative with a DNA base at topoisomerase I-DNA cleavage sites, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 8861-8865, (1995).

141. Pommier, Y., Gupta, M., Valenti, M., Nieves-Niera, W., Cellular resistance to camptothecin, In: "The camptethecin: from discovery to the patient", The New-York Academy of Sciences, New-York, 60-73, (1996).

142. Pommier, Y., Pourquier, P., Fan, Y., Strumberg, D., Mechanism of action of eukariotic DNA topoisomerase I and drugs targeted to the enzyme, Biochem. Biophys, Acta, 1400, 83-106, (1998).

143. Porter, S.E., Champoux, J.J., Mapping in vivo topoisomerase I sites on sminian virus 40: assymetric distribution of sites on replicating molecules, Mol. Cell Biol., 9, 541-550, (1989).

144. Porter, S.E., Champoux, J.J., The basis for camptothecin enhancement of DNA breakage by eukaryotic topoisomerase I, Nucleic Acids Res., 17, 8521-8532, (1989).

145. Prescott, В., Steinmetz, W., Thomas, G.J.,Jr., Characterization of DNA structures by laser Raman spectroscopy, Biopolymers, 23, 235-256, (1984).

146. Redinbo, M.R., Stewart, L., Kuhn, P., Champoux, J J., Hoi, W.G.J., Crystal structures of human topoisomerase I in covalent and noncovalent complexes with DNA, Science, 279, 1504-1513,(1998).

147. Redinbo, M.R., Champoux, J.J., Hoi, W.G.J., Novel insights into catalytic mechanism from a crystal structure of human topoisomerase I in complex with DNA, Biochemistry, 39, 68326840, (2000).

148. Rodger, A., Norden, В., Circular dichroism and linear dichroism. Ed. Oxford University Press, (1997)

149. Slichenmyer, W.J., Rowinsky, E.K., Donehower, R.C., Kaufmann, S.H., The current status of camptothecin analogues as antitumor agents, J. Natl. Cancer Inst., 85,271-291, (1993).

150. Staker, B.L., Hjerrild, K., Feese, M.D., Behnke, C.A., Burgin, A.B. Jr., Stewart, L„ The mechanism of topoisomerase I poisoning by a camptothecin analogue, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 24, 15387-15392, (2002).

151. Stewart, L., Ireton, G.C., Champoux, J.J., The domain organization of human topoisomerase I, J. Biol. Chem., 271, 7602-7608, (1996).

152. Stewart, L., Ireton, G.C., Champoux, J.J., Reconstitution of human topoisomerase I by fragment complementation, J. Mol. Biol., 269, 355-372, (1997).

153. Stewart, L., Redinbo, M.R., Qiu, X., Hoi, W.G.J., Champoux, J.J., A Model for" the Mechanism of Human Topoisomerase I, Science, 279,1534-1541, (1998).

154. Storl, K., Storl, J., Zimmer, C., Lown, J.W., Minor-groove binders are inhibitors of the catalytic activity of DNA gyrases, FEBS Lett., 317,157-162, (1993).

155. Sukhanova, A., Grokhovsky, S., Zhuze, A., Roper, D., Bronstein, I. Human DNA-topoisomerase I activity is affected by bis-netropsin's binding to DNA minor groove, Biochem. Mol. Biol. Intl., 44, 997-1010,(1998).

156. Tang J., Albrecht A.C., Plasmon polaritons in the single small metal particles, Raman Spectroscopy. Theory and Practice / Ed. Szymanski, New York, Plenum Press, 2, 33-61, (1980).

157. Tanizawa, A., Kohn, K.W., Pommier, Y., Induction of cleavage in topoisomerase I c-DNA by topoisomerase I enzymes from calf thymus and wheat germ in the presence and absence of camptothecin, Nucleic Acids Res., 21,5157-5166, (1993).

158. Thomas G.J., Jr., Tsuboi, M., Raman spectroscopy of nucleic acids and their complexes, Adv. Biophys. Chem., 3,1-70, (1993).

159. Tsang J.C., Avouris Ph., Kirtley J.R., Surface enhanced Raman scattering and surface plasmons, J. Electron. Spectr., 29, 343-348, (1983).

160. Ueba H., Effective resonance light scattering from adsorbates molecules, J. Chem. Phys., 73, 725-732, (1980).

161. Ulukan, H., Swaan, P.W., Camptothecins: a review of their chemotherapeutic potential, Drugs, 62,2039-2057, (2002).

162. Uphaus R.A., Cotton T.M., Mobius D., Surface enhanced resonance Raman spectroscopy of synthetic dyes and photosythetic pigments in monolayer and multilayer assemblies, Thin Solid Films, 132, 173-185, (1985).

163. Vidugiris, G.J., Gudavicius, A.V., Razumas, V.J., Kulys, J.J., Structure-potential dependence of adsorbed enzymes and amino acids revealed by the surface enhanced Raman effect, Eur. Biophys. J., 17,19-23, (1989).

164. Wall, M.E., Wani, M.C., Cooke, C.E., Palmer, K.H., Mcphail, A.T., Sim, G.A., The isolation and structure of camptothecin, a novel alkaloidal leukemia and tumor inhibitor from Camptotheca acuminate, J. Am. Chem. Soc., 88,3888-3890, (1966).

165. Wang, C.C., Dervan, P.B., Sequence-specific trapping of topoisomerase I by DNA binding polyamide-camptothecin conjugates. J. Am Chem. Soc., 123, 8657-8661, (2001).

166. Wang, J.C., DNA topoisomerases, Ann. Rev. Biochem., 54, 665-697, (1985).

167. Wang, J.C., DNA topoisomerases, Ann. Rev. Biochem., 65, 635-692, (1996).

168. Wang, J.C., Cellular roles of DNA topoisomerases: a molecular perspective, Nature, 3,430-440, (2002).

169. Wang, L.K., Rogers, B.D., Hecht, S.M., Inhibition of topoisomerase I function by coralyne and 5,6-dihydrocoralyne, Chem. Res. Toxicol., 9,75-83, (1996).

170. Wang, Z., Zimmer, C., Lown, J.W., Knippers, R., Effects of bifunctional netropsin-related minor groove-binding ligands on mammalian type I DNA topoisomerase, Biochem. Pharmacol., 53, 309-316, (1997).

171. Wartell, R.M., Harrell, J.T., Characteristics and variations of B-type DNA conformations in solution: a quantitative analysis of Raman band intensities of eight DNAs, Biochemistry, 25, 2664-2671, (1986).

172. Weber W.H., Ford G.W., Optical electric-field enhancement at a metal surface arising from surface-plasmon excitation, Opt. Lett., 6,122-124, (1981).

173. Werner, M.H., Huth, J.R., Gronenborn, A.M., Clore, G.M., Molecular basis of human 46X,Y sex reversal revealed from the three-dimensional solution structure of the human SRY-DNA complex, Cell, 81,705-714, (1995).

174. Yamachita M., Tsuji M., Simple theory for surface-plasmon-polariton resonance on sinusoidal metal surface application to SERS, J. Phys. Soc., Japan, 52, 2462-2471, (1983).

175. Yamashita Y, Kawada S, Fujii N, Nakano H., Induction of mammalian DNA topoisomerase I and II mediated DNA cleavage by saintopin, a new antitumor agent from fungus, Biochemistry, 30, 5838-5845, (1991).

176. Yamashita, Y., Fujii, N., Murakata, C., Ashizawa, Т., Okabe, M., Nakano, H., Induction of mammalian DNA topoisomerase I mediated DNA cleavage by antitumor indolocarbazole derivatives, Biochemistry, 31, 12069-12075, (1992).

177. Yang, D., Strode, J.T., Spielmann, H.P., Wang, A.H.-G., Burke, T.G., DNA interactions of two clinical camptothecin drugs stabilize their active lactone forms, Am. Chem. Soc., 120, 29792980, (1998).

178. Yao, S., Murali, D., Seetharamulu, P., Haridas, K., Petluru, P.N.V., Reddy, D.G., Hausheer, F.H., Topotecan lactone selectively binds to double- and single-stranded DNA in the absence of topoisomerase I, Cancer Res., 58, 3782-3786, (1998).

179. Zerner, M.C., Loew, G.H., Kirchner, R.F., Mueller-WesterhofF, U.T., An intermediate neglect of differential overlap technique for spectroscopy of transition-metal complexes. Ferrocene, J.Am.Chem.Soc., 102, 589-599, (1980).

180. Zhao, R., Al-Said, N.H., Sternbach, D.L., Lown, J.W., Camptothecin and minor-groove binder hybrid molecules: synthesis, inhibition of topoisomerase I, and anticancer cytotoxicity in vitro, J. Med. Chem., 40, 216-225, (1997).

181. Zimmer C, Wahnert U., Nonintercalating DNA-binding ligands: specificity of the interaction and their use as tools in biophysical, biochemical and biological investigations of the genetic material., Prog. Biophys. Mol. Biol., 47,31-112, (1986).

Информация о работе

Олейников, Владимир Александрович
доктора физико-математических наук
Санкт-Петербург, 2003
ВАК 03.00.02

Диссертация

Оптическая спектроскопия в исследовании молекулярных механизмов действия и создании новых противоопухолевых препаратов-ингибиторов ДНК топоизомеразы 1 человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы