Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Состояние энергетических функций митохондрий и хлоропластов растений при воздействии экстремальных факторов среды

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Состояние энергетических функций митохондрий и хлоропластов растений при воздействии экстремальных факторов среды"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ ЭКС ПЕРИМЕ НТАЛЬНО И БИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ «БИОЛОГ»

На правах рукописи УДК 577.3581.12 + 581.17.

САФАРОВ КАРИМ ДЖОН

СОСТОЯНИЕ ЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ ФУНКЦИЙ МИТОХОНДРИЙ И ХЛОРОПЛАСТОВ РАСТЕНИЙ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ СРЕДЫ

г 03.00.12 — физиология растений

03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Ташкент — 1994

Работа выполнена на кафедре физиологи и растении Ташкентского государственного университета.

Научный консультант: члсн-коррсспондснт АН Республики

Узбекистан проф. К.АСЫМОВ А. К.

Официальные оппоненты:

член-корр. АН РУз, доктор биологических наук, профессор А. П. ИБРАГИМОВ

акад. АСХН Туркменистана, доктор биологических наук, профессор Д. А. АГАКИШИЕВ

член-корр. УзАСХН, доктор биологических наук, профессор С. Р. РА ХМАН КУЛОВ

Ведущая организация — Институт биохимии АН Республики

Узбекистан

Защита диссертации состоится ал в 9 часов на заседании специализированного совета Д 015.19.21 по присуждению ученой степени доктора биологических наук в Институте экспериментальной биологии растении НПО «Биолог» АН Республики Узбекистан по адресу: 700143, Ташкент, ул. Ф. Ходжаева, 28. Институт экспериментальной биологии растении НПО «Биолог» АН РУз.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экспериментальной биологии растений НПО «Биолог» АН РУз.

Автореферат разослан /4 Ля&о^А. 1994 г.

Ученый секретарь Специализированною совета, доктор биологических наук

Ф. Р. НУРИТДИНОВА

ОЕЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблеш. Неблагоприятное воздействие факторов среды (экстремальные температуры,радиация,инсоляция,разнокачественные засоления,засуха и др.) приводят к различный нарушения!! нормального хода физиолого-биохшических процессов растений. !&огочисленние дашиэ указызаат, что разные по устойчивости растения качественно однотипно реагируют на неблагоприятные воздействия факторов среди, но вместе с тем отличаются как по степени нарушений, вызываемых одинаковой величиной стрессора, так и уровней изменений цетаболизиа. (Генкель,1967; Строгонов, 1967; Жолкевич,19б8; Удовенко, 1973,1975,1989; Бал-нокип и др.,1979,1989; Саляев,1935; Зауралов,1986; Серсенбаез, 1966; Поляков,Кефели,1987; Деева,1987{ Войников,1987; Иванова •и др. ,I9$9;lewitt ,1965,Cieesenaa ,1988; Клцшев,1989; Азимов, 1989).

Особый интерес при исследовании устойчивости растений представляет изучение систем, обеспечивающих энергией разнообразные синтетические процессы. С состоянием этих систем связаны рост,развитие и продуктивность, а.тага® репарационные процессы после повревдений. Специализированные мембранные образования растений - хлоропласт преобразуют энергию световых квантов в процессах фотофосфорилировакия, 'митохондрии - генерируют энергии макроэргическнх соединений в процессах окислительного фосфоршшрования. Уровни и соотношения интенсивностоЯ энергетических процессов и,следовательно, фотосинтеза н дыхания, в конечной счете, определяя? особеш:ости физиолого-бнохи-мического состояния растений, Нроио тогд, фотосинтез и дыхание являются поставщиками энергетических и пластических интермедиа«« тов, необходимых для многих процессов жизнедеятельности клетки. Следовательно, адаптация растительного организма к факторам окружающей среды в первую очередь требует соответствия адекватного к ним мощности и рзгуляторных возможностей внутриклеточных механизмов превращения энергии.

Разработка современных ыетодов исследования, переход к изучению биологических процессов на клеточном и субклеточном уровнях дали возможность исследователя« решить вопроси по

выявлению нарушений б энергетических системах при действии различных экстремальных факторов среды. В настоящее время накоплено большое количество данных о влиянии экстремальных факторов на основные физиолого-биохимические процессы растений, однако действие стрессоров на энергетические процессы растительных клеток изучено недостаточно. Это обстоятельство явилось основанием для исследования энергетических систем растительных клеток в норме и при стрессе.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось выяснение состояния процессов трансформации энергии в .растительных ¡слетках при действии экстремальных факторов: гамма-радиации, низких положительных температур, разнокачественного засоления, а также особенностей транспортных процессов на внутренней мембране митохондрий и механизмов их регуляции цитоплаз-матнческими факторами.

Исходя из этого в задачи исследований входило:- получение препаратов функционально активных митохондрий из гкпокотилей проростков маша и из кор-1ей проростков хлопчатника и изучение их свойств;

- выяснение основных закономерностей определяющих факторов чувствительности митохондрий к различным воздействиям;

- сравнительное исследование действия экстремальных факторов среды на фотохимическую активность хдоропластов;

- изучение влияния экстремальных факторов на содержание плас-тидных пигментов в листьях;

- исследование транспортных процессов во внутренней мембране митохондрий и механизма их регуляции цитоплазматическими факторами.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование состояния снергетических систем растительных клеток при действии экстремальных факторов: гаша-радиации, низких положительных температур, разнокачественного засоления. Впервые предложены модифицированные методики выделения нативных митохондрий из гипокотиля маша VI корешков хлопчатника.

Выявлены основные закономерности взаимосвязанных изменений интенсивностей окислительного и фотосингетического фосфо-рилирования в растительной клетке при различных воздействиях.

Установлены суцественныз изменения в содержании пластид-ных пигментов в листьях проростков маша н хлопчатника при воздействия различных экстремальных факторов.

В различных органах проростков хлопчатника впервые обнаружен частично очж;ен цитоплазматический фактор, который разобщает окислительное фосфорклирование и индуцирует рН-за-писшшй электрофоретическкй транспорт неорганически:: анионов и метаболитов через внутреннюю мембрану митохондрий. .Анализ полученных данных позволяет сделать вывод о том, что активность цитоплазматипеского фактора регулируется изменением функционального состояния клетки.

На защиту и обсуждение взносятся следующие положения:

1. При действии га!.2ла-раднацш1 на проростки наша основные изменения энергетического обмена в основном сводятся к следующей;/:

а) низкие дозы облучения стииулируот окисление субстратов в .митохондриях, а также циклического фотофосфорилированнк и ■ реакция Хилла в хлоропльстах;

б) высокие дезы облучения угнетая? как окисление субстратов в митохондриях, так и реакцию Хилла и циклического фото-фосфорнлипсвания з хлоропласта*. В митохондриях поБре.-эдаящее действие облучения презде всего проявляется на уровне первого пункта сопряжения окислительного фосфорилиропания, а в хлоро-пластах на уровне нециклического переноса электронов.

2. При действии низких положительных температур во все сроки воздействия скорость окисления субстратов в митохондриях увеличивается, хотя в хлоропласта^ в начальные сроки воздействия (2-1 ч) подавляется реакция Хилла с последующей стимуляцией при продолжающемся воздействии охлаждения, в то время как изменения скорости циклического фотофосфорилирования носят фазовый характер.

3. Действие засоления питательной среды «а растения проявля- • ется как в стимуляции дыхания «итохондрий в 3-метаболическом состоянии, так и в снижении эффективности окислительного фос-г форилировання, которое усиливается по мере увеличения сроков воздействия к степени засоления. Изменения фотохимической активности хлоропластоп хлопчатника зависят от типа и степени

засоления питательного субстрата, а также от возраста проростков.

4. Впервые показано наличие в цитоплазме органов хлопчатника водорастворимых регуляторов окислительного фосфорилирования, действие которых проявляется на уровне транспортных систем, осуществлявшее перенос ионов К+ и фосфата через внутреннш кгыбрану митохондрий. Эти регуляторы могут в частности опосредовать действие засоления на функциональное состояние митохондрий.

Практическая ценность и рекомендации по применению. . . -

Установленные в работе закономерности взаимосвязанных изменений в биоэнергетических процессах позволяют в дальнейшем широко использовать оценку этих параметров для изучения механизмов действия различных факторов на растения, а также при разработке методов повышения устойчивости растений. Модифицированные методы получения препаратов функционально активных митохондрий из проростков маша и хлопчатника могут использоваться при выполнении научно-исследовательских работ в области биоэнергетики. Ряд методик и результаты работы применят-ются в лабораториях Института физиологии и биофизики АН РУз и ИНЭБР АН РУз, а также при проведении спецкурсов на биологическом факультете ТашГУ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научных конференциях ТахГУ (1973-1989гг.), на Всесоюзном симпозиуме "Биоэнергетика при лучевом поражении кивых организмов" (Ленинград,1973), на Ш Всесоизном биохимическом съезде (Рига,

1974), на ХП Ыевдународном ботаническом конгрессе (Ленинград,

1975), на конференциях биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (2<рунзе,197б; Ашхабад,1985; ТаткентД991), на Всесооз-ных симпозиумах "Влияние радиации на регуляторныа процессы в клетке" (Пущино,1976), "Роль и механизмы действия биологически активных соединений-в гамма-облученноы организме" (Пущино,1978\ "Радиочувствительность и процессу восстановления у животных и растений" (Ташкент,1979), на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва,1982), на I Конференции биохимиков Узбекистана (Ташкент, 1986), на 1У Всесоюзном симпозиуме "Физиологические и биохимические основы солеустойчивости растений"(Ташкент, 1986),

на Ботаническом съезде (Алма-Ата,1988), на Всесоюзной конференции "Синергизм действия ионизирующей радиации и других физических и химических факторов на биологические системы" (Пу-щино,1988), на 1У съезде физиологов Узбекистана (Ташкент, 1988), на Втором съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Минск,1990), на I съезде физиологов растений Узбекистана (Ташкент,1991), на совместном заседании кафедр физиологии растения, биохимии и биофизики биологического факультета ТашГУ (Ташкент,1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 53 работы.

Объем работы. Диссертация изложена на 329 отраницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав и зак-'лючения, выводов и списка использованной литературы, включающего 445 наименований. Работа иллюстрирована 34 таблицами и .47 рисунками.

, МАТЕРИАЛЫ и шода ШОЩОВАНШ

В опытах использовали проростки маша (Phaseolus aureus L.) сорта ВИР-628 и хлопчатника (Qoasyplum hirsutum L. ) сорта Ю8-Ф, выращенные на питательной смеси U. А.Белоусова (1975) в терыостатируемых условиях.: Действие низких положительных температур на проростки осуществляли в холодильнике-термостате ХТ-2. Для создания различных типов и степени засоления использовали методику Ю.М.Лебедева (I960) с применением питательной смеси Белоусова. В другой серии опытов использовали изоосмотические растворы хлористого и сернокислого натрия. Облучение проростков маша проводили гамма-лучами Со на установке ГУБЭ (ИБФ АН CGCP) с мощностью 750 р/мин.

Митохондрии выделяли из гипокотилей проростков маша по модифицированной нами методике (Сафаров и др.,1975), из корешков хлопчатника по методике (Сафаров и др.,1985). Ыито- ■ хоядрии из печени крыс вццеляли по методу Шнейдера (Schneider, 1948). Окисление и фосфоршшрование в изолированных митохондриях изучали полярографически с помощью закрытого совмещенного платинового электрода типа Кларка, изготовленного по методике С.А.Гуланяна и др. (1973). Коэффициенты дыхательного

я

контроля и ДЦФ/О рассчитывали по Чансу и Вильямсу ( Chance, Williams,1956). Белок суспензии митохондрий определяли с помочь» амидо-черного (Бузун и др.,1982) и по Лоури ( Lowry et ai.,1951). Определение активности сукцинат- и малатдегидроге-назы митохондрий осуществляли по методу Ells (1959).

Ддя выделения функционально активных хлоропластов из листьев ыа®& и хлопчатника использовали методику В.Ф.Гаври-ленко к Й.В.Будаговской (1972), модифицированную нами. Содер-. жашие хлорофилла в. изолированных хлоропластах определяли по Арнону Urnon ,1949); интенсивность циклического фотофосфорили-рования определяли ка хермостатируемой установке по убыли неорганического фосфата в феде инкубации; неорганический фосфат - по Я.Х.Туракулову и др.(1967). О восстановительной активности изолированных хлоропластов судили по скорости реакции Хилла с феррицианидом калия по методу В.Ф.Гавриленко и др. (1975). Содержание пластидных пигментов определяли по общепринятой методике, их количество рассчитывали по формулам, предложенным Д.Ветттейном OVettstem, 1957).

Действие •цитоплазыатических модуляторов на проницаемость внутренней мембраны митохондрий для катионов и анионов оценивали по кинетике набухания деэнергизованных митохондрий в изо-осмотических растворах соответствующих солей (^ Nour,Sciiool-werth,I984). Набухание митохондрий измеряли по изменению оптической плотности при длине волны 540 нм. В этих экспериментах митохондрии преинкубировались с цитоплазматическиет факторами или беэ них 2 минуты при 25°С в 0,5 мл среды кккубаасаи. Набухание митохондрий' инициировалась добавлением 3 мл среда инкубации. Составы сред праинкубации и инкубации различны в зависимости-ov эксперимента и даны-в подписях и рисунках.Рас-чет концентраций,ионизированного Са^+лри использовании Са2+-ЭГТА буферов проводили на ЭВМ EC-I022 по программе на Fortran 1У (Robertson et al,I983). Термостабильную фракции цитоплазмы выделяли из печени йамцов белых бесйорбдных крыс и из различных органов проростков хлопчатника сорта 108-Ф'(Сафаров и др., 1986,1989)..

Частичную очистку термостабильной фракции цитоплазмы из печени крысы и из различных органов проростков хлопчатника

прозодияи понооЗненной хроматографией на колонке с ДЭАЭ -цэллэяозой.

Определение нейтральных Сахаров в очищенных фракциях цк-тоглазматического фактора проводилось по Винцяеру (Готтшелк, 1931). Тонкослойна хроматоррефга очищенных фракций цитоплаз-иаткческого фактора проводили на силикагеле 1-3 5/40 ( СЬа-иаро1, Чехо-Словакня) в системе растворителей изопропенол:

0.5 % СаСЯ-э*(05:15). Хроматогррлмы проявляли пара«!! Пода или концентрированней серной кислотой (К:!рхнер,1901).

РЕЗУЛЬТАТУ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСЩДШШ

1. ДЕЙСТВИЕ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ НА ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ ШШЩРИЙ. '

Иодификация окислительной активности является одним из наиболее ранних и симптоматических проявлений происходящих физиолоро-биохшических сдвигов и обусловлена прямым кли опо-ерздованнш' воздействием на структуру и функции митохондрий. Исследование состояния эпос органелл, процессов регуляции их метаболизма представляет собой первоочередную задачу при анализе механизмов действия на растения факторов среди.

1.1. ДЕЙСТВИЕ ГАША-РАДИАЦИИ НА СЖШГГЕЛЬНУЮ И ФОСФОРИЛИЕШ-

ЩУЮ АКТИВНОСТЬ НИТОХОВДРИй НАША.

Установление закономерностей изменения дыхания после облучения имеет исключительно важное значение для познания первичного механизма радиационного поражения живого организма.

Нами показана зависимость изменения окислительного фос-форшшрования (ОФ) при облучении растений не только от дозы облучения, но и от используемого субстрата. При окислении сукцината значительно возрастает скорость дыхания митохондрий в состоянии 4, вследствие этого в зависимости от дозы облуче* ния понижается ДК, и следовательно, ослабляется механизм регуляции дыхания. Однако это может и не сопровождаться резким снижением общей продуктивности АТФ, о чем свидетельствует сравнительно более высокая устойчивость коэффициента АДФ/0 и возрастание скорости фосфорилирущего дыхания (\Гз). При доза

облучения Ю Гр заметно возрастает скорость дыхания митохондрий п сост.З и сост.4 и, хотя величгла ДК понижается н АД$/0 остается высоким. При 20 Гр, несмотря на снижение ДЦФ/0 (переход о "свободно-сопряженное" состояние), скорость дихания в сост.З и 4 резко возрастает. Это приводит, d конечном счете, к больней скорости образования АТьБ, чей при прочном сопряжении и меньшем значении При дальнейшем увеличении доза облуче-чип вследствие ноешгсшш скорости дыхания в сост.4 механизм дыхательного контроля исчезает (ДК=1), в результате чего рас-чзт ДЦФ/О становится невозможным. При использовании палата к . H/VJJi в качестве субстратов, с отличие от картины наблвдаиией-сп при окислении сунцината, скорости дыхания митохондрий в сост.З н А при относительно высоких дозах облучения (100 п 250 Гр) закатно снвгаотся. Стимулирующая доза (10 Гр) вь'зыза-ет уяеличеннз кпенснвности окисления с одновреиегзшм пошгле-ннеи продукции АТФ.

Набяэдяамые изкз^еяля в прэцессах н фосфордзнро-

вання, вероятно, cocnir/^vr з результате-как нарушений структурной орт лик зсхраг мшшшдрйЯ, гак и -.шен&шя обмена вещестэ в облучзнннх растсшшх. Кгходя из er сто нагл! ¡;сследо:;;и;1! изменения окисяпггшюй и фосфотска^ущеЯ активности (¡нгохондркй б разлкчнкз срок; после обяуче:шя проростков одной и то!! ко доэоЯ J-радиации 100 Гр). Пр:: этом бшо обнаружено, -что при окислеш','! сущаната игпэсрздатвзннэ посхе обдучмнш судаствсп» них изменений в гктизюстк цктскгакдриЛ на наЗлздазтсл» и лгаь через 4 ч посла сбяучзнкя наатупаэт рззобгзииг 0Q. При окис-леншх палата сразу после обдукинл ^вслмчкваотся скорость дыхания в сост.З и угзличкаозтся вапцтага ДК к АЦ&/0. Эти . изщ'нопил п дальнеЕаом нося? фазоваЗ характер. При изучении 05 ведвяеппнх ;зз проростков штоховдрнй, облучонних дозой 500 Гр, отмечало, что облучзнккэ «¡¡тохо;:др;.ч: "стареэт" быстрее, чги необлучзнкпз. Ачалопгскга данные получены и ка митохондриях кивоздак тканей (Роиснцов п др'. ,1969).

Анализ сукцгиатоксндазноП активности митохондрий и их сукцинатдегцдрогеиазноП актигаости (при использовании промежуточного переносчика электронов феиазишетасульфата конечный окцептор ДХЗЙЗ) показывают, что обо активности резко

увеличиваются при сравнительно высоких дозах облучения. В то не время малатоксидазная актик-юсть существенно снижается, на фоне резкого увеличения активности НДР. На основании этих данных можно заключить, что при облучении сравнительно высокими дозами ^-радиации нормальный поток электронов по дыхательной цепи нарушается, причем в цепи переноса электронов одним из "узких мест" иохет явиться звено некду внутримитохондриальниц НАД и местом вхождения сукцината в дыхательную цепь.

1.2* ВЛИЯНИЕ НИЗКИХ ПОЛОШИТЕЛЬШХ ТЕНПЕРАОТ НА ОКИСЛИТЕЛЬНУЮ

И ФОСМРШИРЩУВ ЖГИВНОСТИ МИТОХОНДРИЙ ХЛОПЧАТНИКА.

Многие этапы, с помощью которых реализуется на внутриклеточном уровне влияние низких положительных температур (НПТ), -исследованы недостаточно. Практически отсутствуя? сведения о' действии НПТ на дыхание и энергетический обмен хлопчатника. В связи с вкиеизлояешым нами было нсследовано влияние НПТ на 'энергетические функции митохондрий проростков хлопчатника.

Во всех вариантах эксперимента ШГ вызывали увеличение скорости окисления сукцината и малата митохондриями, причем стимуляция скорости окислительного фосфорилировашм э разных вариантах могла происходить без существенного изменения коэффициентов ДО и ДДФ/О на фона их уменьшения или дане увелнчз-иия. Следует отметить, что в контрольных растениях по мере увеличения их возраста наблюдалось сшгсеииз скорости окисления сукцината и малага митохондриями. Наиболее сильная стимуляция окисления сукцината и малата при действии НПТ проявлялась при 96-часовом воздействии. По-видимому, увеличение скорости дыхания и синтеза АТФ является одним из механизмов адаптации растений к действию пониженных температур, НПТ действуют на окисление малата и сукцината митохондриями по-разному: скорость окисления малата изменяется незначительно, однако величины коэффициентов ДК и ДЦФ/0 увеличиваются, скорость окисления сук-цинатй повышается, тогда как ДК и ДДФ/0 в основном снижаются. Под влиянием НПТ значительно изменяется- активность ряда дегид-рогеназ митохондрий хлопчатника. Так, активность СДГ после 34-и 48-часового воздействия НПТ увеличивается, в то время как активность ВД1 через 24 ч возрастает, а при 48- и 72-часовом

действии пониженной температуры резко снюхается. Обнаруженные изменения могут быть обусловлены не-только кинетическими пара- ^ метрами ферментативных реакций при различных температурах, но и связаны с изменением свойств биологичзских мембран и состоянием микроакружения ферментов. Результатом этого может быть изменения проницаемости мембран митохондрий для субстратов, нарушение сродства субстратов к соответствующим ферментам и т.д. Необходимо отметить, что максимальная активность изучаемых ферментов наблюдалась при использовании различных концентраций субстратов или разных периодов температурного воздой-ствия. Особенно заметно изменяются НДЦ-зазисимые дегидрргена-зы. Полученные результаты4-позволяют заключить, что НПТ оказывают существенное влияние как на окислительную, так и фосфо-рилирующую активность митохондрий хлопчатника.

1.3. ИЗУЧЕНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ И ФОСЗОРШШРУКЦЕЙ АКТИВНОСТИ

МИТОХОНДРИЙ ХЛОПЧАТНИКА ПРИ ЗАСОЛЕНИИ.

Несмотря на большое количество работ, посвященных проблеме солеустойчнвости растений, вопросы об энергетической эффективности дыхания и её интенсивности у растений при действии солей освещены'в литературе недостаточно. Кроме того имевшиеся данные являются весьма противоречивыми, что обусловлена воз-' растными и видовыми особенностями растений, разлтеиши условий выращивания и проведения опытов, разнотипностью использосакнпх ' иетодов и критериев и т.д. В этой связи наш изучено действие засоления на функциональную активность митохондрий хлопчатника.

Обнаружено, что изменения окислительной н фосфорилирующей. активности митохондрий хлопчатника зависят как от типа и степени засоления питательной среды» так и от продолжительности его бездействия. Так, скорость окисления сукцкната митохондриями проростков хлопчатника, выраженных при сульфатном засолении, повидается по мере увеличения степени засоления. Сильное сульфатное засолений Ее приводят к снижению скорости окисления сукцината митохондриями, выделенными из 5- и б-дневных проростков хлопчатника.

Слабое хлорздное засоление вызывает резкое увеличение

всех вариантах опыта ниже, чей в контроле, причем наблюдается ' четкая корреляция между степенью засоления и снижением интенсивности изученного процесса. У 6-дневных.проростков во всех вариантах сульфатного засоления штенсивность циклического <ЕФ ниже контроля, а в 9-дневном возрасте слабое сульфатное засоление увеличивало штенсивность ФФ (более чем в % раза), тогда как при среднем и сильном засолении она сильно подавляется. Такая же картина наблюдается у 12- и 15- дневных проростков.

Скорость реакции Хилла такие изменяется в зависимости от продолжительности, типа и степени солевого воздействия. Так, в начальных сроках определения среднее и сильное сульфатное, засоление угнетает активность реакции Хилла.

Таким образом, результаты исследований действия хлорид-ного и сульфатного засоления на фотохимическую активность хлоропласта в хлопчатника показали существенные изменения изученных показателен. Полученные нами результаты согласуются с ■данными литературы (Гснчаршс и др. ,1971; Лапина,Бекмухамедсва, 1973;Н1п<а et а1, 1979), которые свидетельствуют о том, что изменения фотофосфорилнручщей актигности хлоропластов определится качеством засоления: хлориды существенно усиливают,а сульфаты - сникают её.- Ичгибирущее действие сульфата на фото-фосфорилируищуо активность хлоропластов может быть связано с разобщающим влиянием сульфат-ионов.

Резюмируя результаты экспериментов по влиянию экстремальных факторов на фотохимическую активность хлоропластов цолно сделать заключение о том, что изменение структурно-функционального состояния хлоропластов является, по-видимому, первичной универсальной реакцией фотосинтетлческого аппарата в ответ на изменения условий среды. При этом в основе реакции хлоропластов, как структуры специализированной для осуществления фотосинтеза, на действие разнообразных раздражителей леяит какой-то общий регуляторный механизм.

В результате проведенных нами исследований установлено, ' что воздействие фактора низкой напряженности приводит к интенсификации как циклического фотофосфорллироваяия, так и скоростей реакции Хилла. Увеличение продукции АТФ приводит а свою очередь к интенсификации биосинтеза яизненно-ваяных

соединений, поддержания активной структуры хлоропластов, результатом чего является повышение интенсивности фотосинтеза. Сравнительный анализ получешшх данных позволяет заключить, что среди исследованных показателей реакция Хилла более чувствительна к воздействие экстремальных факторов.

Ш. ВЛИЯНИЕ ЭНСТРЕЫАЛЬШХ ФАКТОРОВ НА СОДЕРЖАНИЕ ПМСТИДНЫХ ПИРНЕНТОВ В МСТЬЯХ РАСТЕНИЯ."

При выяснении механизма повраздаащего действия экстре- -машшх факторов на растения исследователи изучали прежде всего действие зтих факторов на содержание и состояние плас-тндных пигментов. Анализ этих данных свидетельствует о противоречивости сведений: нет единого ьшения дата относительно количественнюс изменений содержания хлорофиллов при воздействии определешшго фактора на растения. В этой связи нами изучено влияние ^-радиации, НПТ и засоления на содержание плас-тидных пигментов в листьях растений.

3.1. ДЕЙСТВИЕ ГША-РАДИАЩШ НА СОДЕРЖАНИЕ ПЛАСТЯДНЫХ

ПИГМЕНТОВ В ЛИСТЬЯХ мм.

'Облучение гамма-лучами проростков ыаиа приводит к существенному изиенешса содержания пластидкых пигментов в листьях. Так, содержание хлорофиллов "а" и "б" при сравнительно малцх дозах облучения через 24 часа заметно у вслушается, а при больших дозах - снижается. При о^ои особых различий в изменении содержания :5ег.ду хлорофшшши "а" и "б" не наблюдается: оба они изменяется практически в одинаковой степени, гак что соотношение мзаду ними варьирует в пределах 2,2-2,4.

Содержание -каротиноидов в листьях проростков маша при облучении возрастает, причем обнаружена коррелятивная связь неяду дозой обяучгш;я и поБшением сунмы каротиновдов. При дозе облучения в 250 Гр юг содержанЛе увеличивается в 1,6 раз. Повышение содержания карогияоццов в листьях проростков маша при облучоикп, по-видимоиу, является одной из защитно-приспособительных реакций растения на воздействие экстремальных факторов.

3.2. ВЛИЯНИЕ НПГ НА СОДЕРЖАНИЕ ПЛАСТВДШХ ПИГМЕНТОВ

В ЛИСТЬЯХ ХЛОПЧАТНИКА.

Гезультаты наших опытов показали, что при действии НПТ на проростки хлопчатника содеряание пластидных пигментов подвержено значительным изменениям. Так, содеряание хлорофилла "а" в течение первых суток действия НПТ существенно изменяется через 24 ч, оно резко возрастает, на вторые сутки оказывается ниже контроля, затем вновь повышается. В последующие двое суток содержание хлорофилла "а" опять снижается, в дальнейшем стабильно превышая контроль.

Содеряание хлорофилла "б" также возрастает в начальные сроки определения. В' последующем оно, как и в случае хлорофилла "а", также превышает контроль. При 96-часовом воздействии НПТ содержание как хлорофилла "а", так и хлорофилла "б" снижается. Содержание каротиноидов в листьях проростков хлопчатника при действии НПТ повышается. Причем такая тенденция обнаружена нами во все сроки определения. Повышение содержания каротиноидов в листьях проростков хлопчатника при действии НПТ, вероятно, является одной из защитно-приспособительных реакций растения в ответ на экстремальные воздействия.

3.3. СОДЕШАНИЕ ПДАСЩДНЫХ ПИГМЕНТОВ В ЛИСТЬЯХ ХЛОПЧАТНИКА

В НОРМЕ И ПРИ ЗАСОЛЕНИИ. '

I ■

Результаты исследований по определению содержания.пластидных пигментов в листьях проростков хлопчатника при воздействии хлоридного и сульфатного засоления свидетельствуют о существенных изменениях содержания пигментов. Так, содеряание хлорофилла "а" во всех вариантах.опыта и во все сроки определения ниже, чем в контроле. Наибольшее уменьшение содержания хлорофилла "а" наблюдается во всех вариантах хлоридного засоления у 15-дневных проростков. Снижение содержания- хлорофил- ' лов "а" и "б" находится, в основном, в прямой зависимости от степени засоления. При изучении влияния хлоридного засоления на содержание каротиноидов показано, что отсутствует строгая корреляция между степенью засоления, продолжительностью воздействия и содержанием каротиноидов в листьях хлопчатника.

Сульфатное засоление оказывает также существенное влияние на содержание пигментов. Так, наибольшее снижение содержания хлорофиллов наблюдается у 6-дневных проростков. Однако, в отличие от хлорвдного, при сульфатном засолении у проростков хлопчатника в других сроках определения не обнаруживается■ прямой зависимости между содержанием хлорофилла "а" и степенью засоления. В начальных.сроках определения наблюдается некоторое снижение содержания каротинойдов, а с увеличением сроков воздействия солей их уровень возрастает. Обнаруженные нами различия в действии изученных ионов на содержание пластидных.. пигментов в листьях проростков хлопчатника, по-видимому^ обусловлены различной степеньЬ токсичности ионов хлора и сульфата для растений.

Резюмируя приведенные в этой главе результаты исследований, нужно отметить, что содержание пластидных пигментов в листьях изменяется с возрастом, а также под влиянием изученных факторов. При воздействии фактора меньшей интенсивности или дозы количество хлорофиллов возрастает, в дальнейшем происходит уменьшение их количества.

Изменения в содержании хлорофиллов в листьях растений могут быть вызваны превде всего разбалансированием процессов синтеза и распада пигментов, а также изменениями свойств ли-попротеидного компонента мембран хлоропластов. Наблюдаемое снижение содержания хлорофиллов может быть объяснено с позиций метаболической гетерогенности хлорофиллов, при этом, предполагается преобладание процессов распада в условиях действия стресс-факторов. Общее содержание хлорофиллов определяется соотношением скоростей их образования и разрушения, которые в свою очередь находятся в прямой зависимости от физиологического состояния растения.

В результате проведенных нами экспериментов показано увеличение содержания кароткнондов в листьях проростков маша и хлопчатника при воздействии изученных факторов. Такое повышение содержание каротиноидов в листьях при воздействии стресс-факторов,. очевидноявляется одной из защитно-приспособительных реакций растения в ответ на экстремальные воздействия.

1У. ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАНСПОРТНЫХ ПРОЦЕССОВ ВО ВЫСПРЕННЕЙ ШБРАНЕ МИТОХОВДРИЙ И МЕХАНИЗМ ИХ РЕГУЛЯЦИИ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕШИ! ШГОРДШ.

Идентификация механизмов физиологической регуляции функционального состояния митохондрия является одной из наиболее актуальных: проблем современной физиологии клетки. Основным методическим подходом к изучении физиологической регуляции функционального состояния митохондрий являются эксперименты in vitro с митохондриями, выделенными из органов растений или пивотных, находящихся в различных физиологических состояниях. Процедура выделения митохондрий предполагает отшзашгэ этих органелл от компонентов цитоплазмы. В то же время клеточная регуляция функционального состояния митохондрий может осуществляться только через цитоплазму. В последние годы с использованием реконструированных модельных систем, включазщшс - в себя не только изолированные митохондрии, но и цитоплазму либо её компоненты, показено наличие низкомояекуллрных регуляторов функционального состояния шгаохондрий в цитоплазме различных органов животных (Туракулов н-др. ,1977; Гайнутдинов и др.,1981). Ранее в литературе не рассматривался вопрос о наличие ннзкоиолекулярШхцитоплазматических регуляторов функционального состояния митохондрий в органах растений.

В связи с этим основной цел'ьо этого раздела работы явилось выяснение вопросов о наличии в цитоплазме органов растений регуляторов окислительного фосфорилирования, механизме их действия на митохондрии н о возмолшости физиологической регуляции энергетического обмена в органах растений изменением концентрации или активности цитоплазматических регуляторов функционального состояния митохондрий.

Из представленных в таблице 3 данных видно, что при добавлении термостабильиоП фракции цитоплазмы (ТФЦ), полученной из корней проростков хлопчатника к митохондриям наблюдается 1 разобщение окислительного фосфорилирования. При пропускании ТФЦ через колонку с ДОАЭ-целлюлозой активность фактора, разобщающего окислительное фосфорилирование, выявляется'во фракции, которая не связывается на колонке.

Таблица 3

Разобщение окислительного фосфорилирования цитоплаз-матичесшы фактором из корней проростков хлопчатника

!Скорость дыхания митохондрий! !

Условия !нг«атом О/мин на мг белка ! !

эксперт- I--------------! ДК ! -ДЦФ/0

мента ' V3 ' I V4 I '

Митохондрии из печени крысы

I 70,Oil,0 I2,8iI,I 5,5iO,I 2,б±0,2.

II 68, Oil, I 48,5il,2 1,440,1 1,3£),1 Митохондрии из корней проростков хлопчатника

I 50,2il,3 20,Oil,I 2,5i0,2 2,3±0,I

II 5I,2iI,6 32,Oil,4 I,6i0,2 I,7±0,2

Примечание: Среда инкубации митохондрий содержала: 0,12 М KCl, 3 мМ глутамата, I мМ малата, I мМ К^НРО^, 5 i.ii! трлс-HCI, pH 7,4. Митохондрии - 2 мг белка/мл среды инкубации. ЩИ - 100 нмоль, объем ячейки -1,6 мл.

I - без добавок

II —частично очищенная термостабильная фракция цитоплазмы из корней проростков хлопчатника-0,1 мл.

Фактор, разобщающий-ОФ, был активен как в экспериментах с митохондриями, выделенными из проростков хлопчатника, так и с митохондриями печени крысы (табл.3). Известно, что за редким исключением (система транспорта ионов Са^+ в митохондрии) (Martins,Veroeai 1985) не выявляются качественные различия систем транспорта катионов и метаболитов в митохондриях из органов яивотных и растений (Palcor ,I979;lEügcloff ,1932; Elton ,Stewart Д983;Ьа Houe ,Sohoolw6rth ,1979,1984 11 др.). Поэтому часть экспериментов по выяснения механизма действия • фракций из цитоплазмы органов растений и животных проводилась нами с митохондриями печени крысы, которые отличаются от митохондрий растений большей стабильностью при хранении и в меньшей степени повреждаются при выделении. Для выяснения

механизма действия фактора, разобщающего окислительное фосфо-рнлкропсние, было изучено его действие на проницаемость внутренней мембраны митохондрий для катионов и анионов. Показано, что частично очищенная Т<Щ из корней проростков хлопчатника, которая разобщает Ш, в отличив от классических разобщителей 03» (2,4-дав, FCCP) на индуцирует набухание дезнергкзованных митохондрий в среде с йН^КОд. Ранее было показано, что и частично очищенная ТФЦ печени крысы таксе не вызывает набухание цитохондрий в среде с ifH^tiO^ (¡Ьп.!уха:;едов,1990). Следовательно, разобщение 01» частично очищении:.'.!! Т5Ц из корней хлопчатника н из печени крысы нэ обусловлено наличием в этих фракциях регуляторов, ивдуцнрувщих высокуа протонную проницаемость внутренней мембраны митохондрий по типу FCCP. Как показано на рис.1, .частично очищенная ТЩ из корней проростков хлопчатника шаду-цирует набухание деекергизавйшых митохондрий в изоосмоткчес-ких растворах K^iPO^ и KCI в присутствии валнкомицина.- Следовательно, ТЩ из корнзй хлопчатника ¡гндуцнрует транспорт ионов фосфата и хлора через внутрзгагш мгнбрану китохондриЯ, так кате набухание митохондрий з этих условиях лкшшфуется транспортом аниона. В отношении транспорта иоисэ фосфата очевидно, что фактор индуцирует з^ектрофорзтипзский транспорт ионов, не сви-. занкый с функционированием злектронзйтрального 2н~/Н+перенос-чика. Во-первых, это следует из того,что ингибитор .Фн""/Н+пе-реносчика tiEJ не влияет на кинетику набухания митохондрий, sm-дуцированного цитоплазматичзскш фактором (рис.1), во-вторых, в условиях этого эксперимента набухание митохондрий может быть обусловлено электрофоретическим, но не электронейтральным тра«» нспортом ионов фосфата. В случае электронейтрального транспорта фосфата будут не скомпенсированы перенос зарядов и протонов через внутренний мембрану митохондрий (La Noue et al, 1979).

Доказательством того, что ТФЦ индуцирует электрофорети-ческий транспорт анионов через внутреннею мембрану митохондрий служат условия проявления его действия на набухание митохондрий в изоосмотических растворах аммонийных солей исследованных анионов.

Как показано на рис.2, ТФЦ не оказывает влияния на кинетику набухания деэнергизованных митохондрий в изоосмотических растворах NH^CI и («H^^PO/J. Следовательно, в отношении

%40 А 1 Б

I мин

Рис Л. Кинетика набухания деэнергизованных митохондрий печени крысы(Т) и из корней проростков зслопчатника(П) в изо-осмотических растворах К^НРО^А) и KCl (Б) в присутствии частично очищенной ТФЦ из корней проростков хлопчатника.

Митохондрии - 1,4 мг белка. .

Среда преинкубации ыитохондрий содержала 0,12 М KCl, 0,5 ыМ MgCL>,.I0 ыМ трио, pH 7,4.

Среды инкубации содержали: А - 0,08 И KgHP04, Б - 0,12 М KCl и кроме того I ыМ ЭДГА, по 0,7 мкг/ш1 белка митохондрий роте- ' нона и антшицина, 0,6 ыкг/мг белка митохондрий валиномицина, 5 мМ три»; pH 7,6.

I без добавок; 2 - + частично очищенная ТФЦ (0,1мл); 3 -+ частично, очищенная ТФЦ (0,1 (40 нмоль/мг белка ми-

тохондрий за 30 секунд до окончания преинкубации).

конов фосфата, фактор не изменяет активности переносчика, осуществляющего электронейтрольный перенос фосфата в митохондрии вместе с ионом Н+, Тем не менее, если в среду инкубации

Рис.2. Влияние частично очищенной ТФЦ из корней проростков хлопчатника на набухание митохондрий печени крысы в изоосмотических растворах (ВД^^НРО^А) и Ш^СПБ) в присутствии 1шгибиторов дыхания.

Условия преинкубации те же,что и на рис.1. Среды инкубации содержали: А - 0,08 М (ИН^зНРО^, Б - 0,12 Н и кроме того I мМ ЭДГА, по 0,7 мкг/кг белка митохондрий ротенона и антимищша, 5 мМ трис, рН 7,6.

I - без добавок; 2-4- частично очищенная ТФЦ (0,1мл); 3 - + частично очищенная фракция ТЩ (0,1мл) (в среде инкубации Ю_бМ РССР). '

А - во всех экспериментах за 30 секунд до конца преинкубации митохондрий в ячейку добавляли!!ЕМ (40 нмоль/мг белка митохондрий) . .

добавлен разобщитель С® РССР, то ТЩ в присутствии N01 индуцирует набухание деэнергизованных митохондрий даже в изоос-мотическом растворе фосфата аммония. При набухании митохондрий в среде, с фосфатом аммония перенос зарядов и протонов • скомпенсировав в случае функционирования электронейтрального Фн"/Н+ переносчика. В случае электрофоретического транспорта ионов фосфата, компенсация не наблюдается и митохондрии не набухают в отсутствии разобщителя Оф (Ьа Моие вt а1, 1979).

Совокупность полученных нами данных свидетельствует о том, что цитоплазматический фактор из корней проростков хлоп-

чатника индуцирует электрофоретический транспорт ионов фосфата и хлора через внутреннюю мембрану митохондрий.

Действие ТФЦ на электрофоретический транспорт ионов хлора и фосфата проявляется не только в экспериментах с митохондриями печени крысы, но и в экспериментах с митохондриями, выделенными из корней хлопчатника. Следовательно, в митохондриях корней проростков хлопчатника функционирует система, осуществляющая электрофоретический транспорт ионов фосфата и ■ хлора, но чувствительность этих митохондрий к действию ТФЦ ниже, чем у митохондрий крысы.

В условиях, энергизсции митохондрий, в отличие от экспериментов с деэнергизованными митохондриями, система злектро-форетического транспорта фосфата долкна функционировать в направлении из митохондрий, согласно мембранному потенциалу, Совместное функционирование этой транспортной систегш и электронейтрального <&Г/Н+ переносчика ко&ет приводить к индукции переноса ионов Н+в митохондрии (рис.3) и к разобщению окислительного фосфортшрования (табя.З). Известно, что электрофоретический транспорт анионов через внутреннюю мембрану митохондрий осуществляется рН-зав^скг-'оП порой для анионов ( Selsyn et al ,1977,1979).

Эксперименты по действию ТФЦ на транспорт ионов фосфата н хлора указывают на возможность регуляции активности рН-зави-симой поры для анионов фактором из цитоплазмы корней проростков хлопчатника. В связи с тем, что транспорт анионов через , рН-завксимуа пору для анионов не специфичен, можно было предложить, что фактор из цитоплазмы корней хлопчатника ыояет индуцировать электрофоретический транспорт не только ионов фосфата и хлора, но и метаболитов.

Как показано на рис.4 митохондрии практически не набухают в изоосиотических растворах аммонийных солей малата,цитрата и оксалоацетата при рН 7,0. Отсутствие набухания митохондрий в этих условиях обусловлено отсутствием ионов фосфата в среде инкубации, так как переносчик дикарбоновых кислот осуществляет обмен дикарбоновых кислот на ионы фосфата (Ьа Houe, Sohoolworth, 1984). В среде с цитратом аммония митохондрии не набухают если в среду инкубации не добавлены фосфат и

малат, так как переносчик трикарбоновых кислот осуществляет обнен цитрата на малат (Ьа Поие ^сЬооЪуег^ ,19845.

При увеличении рН среды шпсубацпи наблядается сильное увеличение скорости набухания митохондрий о изоосмотических растворах аммониГлыж солей наследованных нами метаболитов (рис.4).

II

III

У SH2

Н+ V I Н+ ' °2

т 'Iii ,

I - электронтранспортная цепь.

II - электронейтральннй ФП/Н+ nepe\»c4viK.

III - электрофоретический транспорт Фн, индуц'гоованный цитоплазма-тпчзеккм фактором.

Рис.3. Схема фосфатного цикла, индуцируемого цитоплазматичес-кт фактором, во- внутренней мембране знергизованных митохондрий.

Аналогичный эффект наблюдается и в экспериментах по набух и иго митохондрий в изоосмоткческих растворах калиевых солей малата, цитрата я оксалоацетата в присутствии валиномици-на. Как показано на рис.4, преинкубацня митохондрий в присутствии ГФЦ приводит к увеличения скорости набухания митохондрий э изоосмотических растворах как алмоннйных.так и калиевых солей цитрата, оксалоацетата и малата. Следует отметить, что для проявления действия фактора на набухание митохондрий а аммонийных средах необходимо добавление разобщителя 0Ф,хотя

%10/шш I

—I-,-1—-—I |-(-1-» «-1-»--

7,0 7,2 7,6 7,2 . 7,6 7,2 7,6

Рис.4. Влияние рН на набухание митохондрий в изоосмотнческих . растворах аммонийных(1) и калиавых(И) солей метаболитов, индуцированных цитоплазмагическим фактором.

Митохондрии (1,4 ыг бедка) преинкубировали с очицешивл фактором из корней проростков хлопчатника и без добавок в тех не условиях, что и на рис.1.

Среды инкубации содержали 1Л - 0,06 II цитрата аммония, 1Б -0,08 Ы палата аммония, 1В - 0,08 11 оксалоацетата ешония, 2А - 0,06 М цитрата калия, 2Б - 0,08 Ы палата калия, 2В -0,08 Ы оксалоацетата калия и кроме того все среды содержали I цМ ЭДТА, по 0,7 ыкг/ыг белка митохондрий ротенона и анти-иицина, 5 ы'Л трнс. Среды с калиевыми солями метаболитов содержали такие по 0,6 мкг/иг белка митохондрий валиномицина.

в калиевых средах в присутствии валиномицина стимуляция набухания митохондрий фактором проявлялась в отсутствии РССР в среде инкубации (рис.4). Следовательно, ТФЦ индуцирует элек-трофоретический транспорт метаболитов через внутреннюю мембрану митохондрий. Увеличение рН среды инкубации митохондрий

усиливает действие фактора на электрофоретический транспорт метаболитов, причем наблюдается аддитивность в действии фактора и увеличения рН на транспорт метаболитов.

Наши 'данные об индукции электрогенного транспорта метаболитов увеличением рН среды инкубации были подтверждены и другими авторами ( 5аг11а,Веа»1з ,1986; ,1987). Возможно, что активация рН-зависимой поры для анионов цитоплазматическим фактором необходима не только для разобщения ОФ, но и для перераспределения метаболитов между матриксом митохондрий и цитоплазмой.

Все описанные нами выше эксперименты проводились с частично очищенной термостабильной фракцией цитоплазмы, полученной из корней проростков хлопчатника. На следующем этапе работы нами была определена активность фактора, индуцирующего электрофоретический транспорт -метаболитов и фосфата, в термостабильной фракции цитоплазмы из разных органов проростков хлопчатника и проведено сравнительное исследование цитоплазма-тических факторов корней хлопчатника и печени крысы. Выделение и частичная очистка ГФЦ из всех органов проводились по.одной методике.

Преинкубация митохондрий с частично очищенной ТФЦ, полученной из гипокотиля и листьев проростков хлопчатника индуци- . рует набухание дезнергизованных митохондрий в иэоосмотическом растворе фосфата калия в присутствии валиномицкна (рис.5). Стимуляция набухания митохондрий частично очищенной ТФЦ исследованных нами органов проростков хлопчатника наблюдалась и в экспериментах со средами, содержащими изоосмотические растворы' цитрата и малага калия. В связи с тем, что кинетика набухания митохондрий в этих условиях определяется кинетикой электрофоретического транспорта аниона в митохондрии, полученные нами данные позволяют заключить, что в цитоплазме всех.исследованных камй органов хлопчатника имеется фактор, регулирующий транспорт анионов через внутреннюю мембрану митохондрий. Активность фактора в ЗЩ из .гипокотилей и листьев хлопчатника выше, чем активность фактора в термостабильной фракции цитоплазмы корней проростков. Нами также обнаружено, что уже через 24 ч после замачивания семян хлопчатника в воде в

0,1

"Ч

I мин

2

и!

-о 4

2

3

4

Рис.5. Действие частично очищенной ТЗЩ из различных органов проростков хлопчатника на набухание ыигохондрий в изоос-мотичаских растворах КНСОд(А), цитрага(Б), ыалата(В) калия и {{¿НРО^Г) в присутствии вали-номицина и ингибиторов дыхания.

А - среда инкубации: 0,12 М КНСОд + 2-Ю Ы 2-ацетилаыино-

1,3,4 - тиадиазол-5-сульфамида Б - среда инкубации: 0,06 и цитрата калия В - среда инкубации: 0,08 М ыалата калия и кроме того все среды содержали I мМ ЭДТА, по 0,7 ыкг/мг белка митохондрий ратенона и антиыицина, 0,6 мкг/мг белка митохондрий валиномицина, 5 >¿4 трис. Р - среда инкубации та же, что й на рис. 1А.

цитоплазме обнаруживается фактор, регулирующий функциональную активность митохондрий.

Таким образом, цитоплазматический фактор, регулирующий Транспорт анионов через внутреннюю мембрану митохондрий, достаточно универсален, так как его активность обнаруживается в различных органах растений и животных.

Обращает на себя внимание то обстоятельство, что макси-«альн&я активность растительного и животного ТФЦ проявляется

в различных условиях иреинкубации с митохондриями. Добавление ионов Ы^* в среду иреинкубации митохондрий усиливает действие фактора из корней проростков хлопчатника на электрофоретичес-кий транспорт ионов фосфата, НСОд1" и цитрата через внутреннюю мембрану митохондрий. В экспериментах с фактором из печени крыс добавление тех яе концентраций ионов в среду инкубации не -усиливало, а ослабляло действие фактора на митохондрии. Добавление гхе I иМЭДТА в среду преинкубации ингибиро-вало злектрофорстнческпй транспорт анионов, индуцированный фактором из корней хлопчатника и увеличивало скорость электро-форетического транспорта анионов, индуцированного фактором из печени крысы.

Таким образом, низкие концентрации ионов обладают противоположным действием в экспериментах с факторами, выделенными из корней хлопчатника.и из печени крысы. В связи с тем, что эксперименты с растительную и тшвотным факторами про-видились одновременно на митохондриях печени криси, очевидно, что наблюдаемый аффект обусловлен действием ионов не на нитохондрни, а на сам цитоплазматический фактор, Ионы • играют определенную роль во время преинкубации, на начальных . этапа;: Еза'модейс'гзия растительного фактора с митохондриями. Возможно это свидетельствует о наличии структурных различий цитоплсоматических факторов растительного и животного происхождения. Существует различие и в селективности анионтранс-портирукщнх систем, регулируемых этими факторами. При действии на митохондрии фактора из корней проростков хлопчатника сильнее всего индуцируется электрогешый транспорт ионов фосфата и хлора, и на/лого слабее проявляется действие этого фактора на электрофоретический транспорт ионов НСОд"*, цитрата и малата. Фактор из цитоплазмы печени крысы, напротив, сильнее индуцирует злектрофоретнческий транспорт ионов НСОд" и . метаболитов, чем электрогенный транспорт конов фосфата и хлора. •

Таким образом, 6 экспериментах с факторами печени крысы и корней проростков хлопчатника наблюдается различное соотяо-иение скоростей электрофоретичесного транспорта ионов фосфата и хлора с одной стороны, и ионов НСОд" и метаболитов с другой

стороны. Эти экспериментальные денные позволяют сделать вывод о том, что во внутренней мембране митохондрий существуют,как ыинимум, две транспортные системы, одна из которых осуществляет электрогенный транспорт ионов фосфата и хлора, а вторая-электрофоретический транспорт ионов НСО^- и метаболитов.

Нами была проведена серия экспериментов, целью которых явилось выяснение вопроса о наличии в цитоплазме органов растений регулятора, аналогичного низкомолекулярному фактору из цитоплазмы печени крысы, активирующему Са -зависимый транспорт ионов К+ через внутреннюю мембрану" митохондрий. Как показано на рис.6-, частично очищенная Т<Щ из корней проростков хлопчатника вызывает Набухание митохондрий печени крысы в среде с кбск , которое усиливается суб-минромоляршаш концентрациями ионов Са^+. В присутствии цитоплазматического фактора наблюдается снижение пороговой концентрации ионизированного Са^+, при которой индуцируется электрофоретический транспорт ионов К+ через внутреннюю мембрану митохондрий. Результаты этого эксперимента свидетельствуют о том, что низкомолекулярный фактор, индуцирующий Са^+-зависимый транспорт ионов К+ в митохондриях печени крысы, присутствуют не только в органах животных, но и.в органах растений.

Таким образом, физиологическая регуляция транспорта ионов К+ в митохондрии может осуществляться двумя способами: во-первых, изменением активности Или концентрации термостабильного фактора, индуцирующего транспорт ионов К+ в митохондрии; во-вторых, увеличением концентрации ионов Са^+ в цитоплазме, которое усиливает действие фактора на митохондрии.

Нами показано, что очищенный цитоплазматический фактор из корней проростков хлопчатника, который индуцирует рН-зави-симый транспорт анионов через внутреннюю мембрану митохондрий не оказывает влияния на Са^+-зависимый транспорт ионов К+ в митохондрии. В связи с этим нами был сделан вывод о том, что рН-зависиный транспорт анионов и Са**+-зависимый транспорт ионов К+ в митохондриях осуществляются двумя различными регуляторами из цитоплазмы.корней проростков хлопчатника.

Нами был разработан метод выделения и очистки фактора из корней проростков хлопчатника, индуцирующего Са^'-зависи-ыый транспорт ионов К4" в митохондрии. Методика очистки

• резкому снижению скорости реакции Хилла с феррицианидом. При дальнейшем увеличении продолжительности воздействия температуры скорость реакции Хилла увеличивается во все сроки определения, в то время как изменение интенсивности циклического фотофосфоршшрования характеризуется 3-образной кривой. Установлено сшгсенш интенсивности циклн-ческогй фотофосфорилкроваиия с ФКС у изолированных хлоро-и пластои хлопчатника с'увелпченнам возраста проростков.

6. Исследована динамика содержания пластидннх пигментов в листьях проростков хлопчатника в норне и при действии по-ииженных: температур. Содержание каротшоидов в листьях проростков хлопчатника при действии пониженной температуры возрастает во все сроки определения. Отмечено повышение содержания хлорофиллов с возрастом проростков хлопчатника.

7. При изучении влияния хлоридного и сульфатного засоления на функциональную активность митохондрий хлопчатника показано, что окислительное и фосфорилирующее активности митохондрий изменяются в зависимости от типа и степени засоления, а такяе продолжительности его воздействия. Сравнительный анализ оксид азной и фо сформирующей активности митохондрий хлопчатника в норма и при засолении показал, что в условиях засоления нормальный поток электронов по дыхательной цепи' нарушается.

8. Показано резкое увеличение интенсивности циклического фотофосфоршшрования при хлоридноы засолении в начальные -сроки воздействия. С. увеличением возраста проростков наблюдается прямая корреляция меяду степенью засоления и снижением интенсивности изученного процесса. Засоление в зависимости от его степени и природы в разной мере изменяет скорость реакции Хилла: при слабом и средней хлорндном засолении повышается» а при сильном - снижается. Изменение, скорости реакции Хнлла при сульфатном засолении также зависит, от возраста проростков и степени засоления.

9. Исследована динамика содержания-пластидннх пигментов' в листьях проростков хлопчатника в норме и при действии засоления. Выявлена определенная закономерность между влиянием засоления на содержание пигментов, фотохимической ак-

тивностью хлоропластов и возрастом проростков хлопчатника.

10. Впервые из корней проростков хлопчатника выделен и частично очищен цитоплазматический фактор, разобщающий окислительное фосфорилирование и индуцирующий электрофоретичес-кий транспорт неорганических анионов и метаболитов через внутреннюю мембрану митохондрий. В энергизованных митохондриях цитоплазматический фактор из корней проростков хлопчатника индуцирует во внутренней мембране митохондрий анионные циклы, что и является причиной разобщения окислительного фо сформирования.

11. Электрофоретический транспорт анионов и метаболитов через внутреннюю мембрану митохондрий, индуцируемый цитоплазма-тическш фактором из корней проростков хлопчатника, осу- •

_ ществляется рН-зг£висимой порой для анионов внутренней мембраны митохондрий.

12. Активность цитоплазматического фактора, разобщающего окислительное фосфорилирование, в корнях пророатков хлопчатника зависит от изменения физиологического состояния расте-. ния. При хлоридном и сульфатном засолении наблюдается сильное снижение активности этого фактора в цитоплазме. Очевидно, что одним из механизмов приспособления растений к условиям засоления является увеличение сопряжения окислительного фосфоршшрования в результате снижения активности цитоплазматического фактора, индуцирующего электрофоретический транспорт анионов через внутреннюю мембрану митохондрий. ■

По теме диссертации опубликовано 53 работ, основные из них:

1. Сафаров К.С.,Касымов А.К. Влияние радиации на окислительное фосфорилирование митохондрий маша ^Научные труды ТашГУ, В.469. 1974. С.24-26.

2. Сафаров К.С..Зайцева М.Г..Касымов А.К. Свойства митохондрий гипокотиля маша, выделенных в сахарозо-фосфатной среде/Физиология растений. 1975. Т;22. В.5. С.936.

3. Файэиева М.Н..Сафаров К.С..Касимов А.К. Влияние низких положительных температур на фотохимическую активность хлоропластов хлопчатника/1'Тез.докл.I Всесоюзного биофизичес-

кого съезда. T.2. M. 1982. С.270.

4. Мухачедов Л.Л. .Сатаров К.С. Влияние разнокачественного засолсшил на содержание пигментов и фотохимическую активность хлороштстов хлопчатника,/ Науч. труды ТашГУ № 678. "Некоторые проблеск современной биологии4.1982. С.23-29.

5. Файэиеоа М.Н. ,Сафаров К.С.,Касимов А.К. Фотохимическая активность изолированных хлоропластов хлопчатника' при воздействия низких положительных температур/ Докл.АН УзССР.

№ 9.1984. С.54-55.

6. Касымоз А. К.,Софаров К.С. Дыхание и окислительное фосфо-рилированио в митохондриях клеток облученных млекопитающих/ И.чформ.бюллетень Научного Совета АН СССР по проблемам радиобиологии. 1? 30.IS84. С.38-40.

7. Оайзнева H.М.,Сафаров К. С.,Касимов А.К. Влияние низких по-лояштелыгах температур на содержание пвастидных пигментов э листьях проростков хлопчатника/Узбекский биологический журнал. S I. 1985. С.23-25.

8. Касжоз Л.К. ,Сафароз К. С. Влияние рядасцяи на знергетнчес-kjis систем» растений. Ташкент.<2аи. 1985. 64 с.

9. Сборов К.С. ,1!ухе;гадов ,Л.Д. ,Кспоп B.D. ,5аЯзяева П.М. Получений нптнгны:: митохондрий лз ::срней проростков хлопчатника/ Зизшлогия растений. 1S85. Т.32. 3.5, C.I0I6-I023.

Ю. Гсйнутдгаюв М.Х.,Сафароя К.С.,Конов В.В..Касимов А.К. Цп-топлазматический гликопептид из гипокотнля.проростков хлопчатника, индуцирующий электрогешшй транспорт фосфата через внутреннюю мембрану митохондрий/Докл.АН УзССР. J? 2. 1906. С. 55-56. '

11. Гайнутдинов Н.Х.,Конов В.В.,Сафаров,К.С..Касымов А.К. Электрогенный транспорт метаболитов через внутреннюю мембрану митохондрий печени крыс, индуцированный увеличением рН и цитоплазиатическим гликопепгндом/ Биохимия. Т.51. В.З. 1986. С.287-395.

12. Гайнутдинов Н.Х, .Ишмухамедов Р.Н.,Конов В.В., Лучен ко М.Б., Мирмахмудова С.И.',Сатаров К.С.,Каси.моп А.К. Регуляция окислительного фосфорилирования, транспорт ионов К+ и объема матрикса митохондрий цитоплазматическим гликопеп-тидом и ионами Са2+/ Биохимия. Т.53. №2. 1988.0.1^5-204.

13. Сафаров К. С. ,Касимов А.К. ,Белен;:цкая М.А. .Гизатуллина 3.3..Захарова Т.Н. »Шшухамедов Р.Н.,Конов В.В. .Гайнутди-нов Ц.Х. Низкоиолекулярный внутриклеточный фактор органической природы из корней проростков хлопчатника,разобщающий окислительное фосфоршшрование/ Физиология растений,

1989. Т.36. В.З. С. 512-519.

14. Мухаыадов A.A. .Сафаров К.С. Дасымов А.К. Влияние разнокачественного засоления на дэгидрогеназнуо активность митохондрий хлопчатника/Узбекский биологический журнал.

1990. № 5. Со21-23.

15. Гайнутдинов Ü.X..Захарова Т.Н. »Исмухамедов Р.Н,.Конов В.В., Сафаров К. С. Выделение низномолекулярных цитоплазматичес-ких регуляторов из печени крыси, кндуцкрувцнх электрофо- . ретическнй транспорт ионов К+ и фосфата через внутреннюю мембрану митохондрий^БиохимияЛ990. Т.55. В.7. C.I257-1265. • - •

' 16. Сафаров К.С. Физиологическая регуляция функционального состояния митохондрий хлопчатника/ Тезисы докл. I съезда физиологов растений Узбекистана. Т. 1991. С. 35.

17. Сафаров К.С. Влияние различных факторов среды на энергетические системы растительных клеток/Вопросы экологии растений.Т., Университет, 1992. C.2I-2B.

18. Гайнутдинов Ы.Х., Конов В.В. .йшухвыедов Р.Н. .Захарова Т.Н., Хапилова Ii.А. .Сафаров К.С. Эффективный диаметр поры во внутренней мембране митохондрий печени крысы и селективность транспорта одновалентных катионов при действии суб-микромолярных концентраций ионов или А 23187 и ЭДГА/ Биохимия.1992. Т.57. B.II. C.I6I8-I626..

К.Сафаров

УСИШМКЛАР МИТОХОНДРИЯ ВА ХЛСРОШЕАСТЛАРИ ЭНЕРГЕТИК ФУНКЦИШРИНИНГ муда ЗКСТРЕЛАЛ ШЛЛАРИ ТАЪСИРИДАГИ холати

Уошшислар чидаклилигдни тадцвдот кялиада гурла биосинтетик ^цраёнларна энергия (Зшган ташинловча тизшларнд урганшп мухим едашипта эгадир. Усии, ршкшшняш ва тикланйш жараёшгари хавда

^осилдорлак шу тизамнанг холатига борлшдаф,

Усишяк хужапралард энергетик тазимларига экстремал оым-лар: гамма-радиация, паст мукобал )?арораг, турли шурланшл таъсирлари атрофлача тадгдак вдлинда. Руза усагаюга илдизвдан ва мош усшгаларидан натив мигохоцдраялар апфатяш усуллари ишлаб чакиддя.

Мош .усимталари энергетик алмашанувида гамма-радиация таъ-сирада 1суйадага асосяй узгарлпшар юзага колади: нурланшнаяг " ласт мавдорларя митохонцряяларда субстрат оксэдланишяня, хло-ропластларда циклик фотофосфорланаш ва Хилл реакциясини тез-латаци; нурланишшнг ювдри маедорлари эса, аксинча, бу жараён-ларни секанлаитирада. Нурланишшнг салбяй таъсяри митоховдрия-ларда оксвдланшали фосфорланашнинг биринча дункти дараяасада, хлородластларда эса ноциклик фотофосфорланйш дараяасада кучяи намоён буладя.

Паст муцобил харорат таъсирднинг урганилган барча муддат-ларода матоховдрияда субстратлар оксадлашшинянг тазлашаши ку-' затиладя, хлоропластда эса таьсдрншг боплангач даврида (24с) Хилл реакциям сэкинлашсада, квйакчаатк кескин ортадй, вдюШк фогофосфорланиш тззлягднинг узгаршш з-куришшяда буладя.

Озуца мухигака шурлаштнаш? усшшшса таъсира митохондрия нафас олдшина З-иетаб'олик холати твзлигдщщг ортяшада хавда шурланаш даражаси ва муддатингиг ортшшга богами холда оксадланишлк фосфордазви самарадоршпшанг1 каиайяшвда намоён булади. Хлорошасетар фогохяматиЗ аксявяигшшнг узгариша озу-вд ыудашякг шурлашшг гуря ва дарааасшта *авда усшгалар ёши-га. богашк булади.

Рузанянг гурла оргаюгарвда оксидааяишш фосфорланишнанг сувда эрувчан регулеторларя б'орлтш ва уяарнинг тазсяря. што-хондрая.ички мембранаса аргала К ва фосфат яонлари транспорта даражасада- намоён булдаи аншвшвди.

Руза усшлталарм иязшзяаряяан гаразаш;ан цитоплазмами фактор таъсирвда юзага келадяган кятоховдрая ячкя тлзмбраяася орвдля анион ва мэтаболятларяянг зявотрофоретяк транспорта дчкя мембранадаги ашошгарна утказувча рН га бо гляк йуллар оркали булада. Руза илдизларадаги окевдланишлй фосфорланяшня ажратуглл цитоплазмагяк факторнднг активлиги усшдашсни фазяо-

логик ^олагяшнг узгаришига богаивдир.

Шундай дашб, усишикнинг гурли ноиулай омилларга даюя-мосланиш реакцаялари. сифатида цшишк фотофосфорланишнанг нис-батан катга чвдамлилигини, штохондрияларнинг паст энергетик холатга утшшни, хужайра органеллаларининг функционал актив-лигина бошкарувчи кофакторлар полати ва мивдоршшнг узгаршш-ни курсатищ мумкин. Бошлангич даврда хукайра уз энергетик ба-лансини тугишга интшшб, эксгремал ошлнинг зарарли таъсиршш й'укотшига интилади. Бироц ошшшнг таъсир муддатини ортипш цобайшща репарация учун энергетик- оарфларнинг купайяши ва тукималартнт кушиша АТЗ> сингеэлай олшсддги стрессда бузи-лиш жараёнларида тазлат'адп.

Safarov К. '•

THE ENERGETIC FUNCTIONS STATE OF MITOCHONDRIA

AND CHLOBOPLASÏ3 OF PLANTS UMDER THE INFLUENCE OF EXTHEM FACTORS OF ENVIEOMSHT '

The systems which are providing energy Ъу different systematic prooesse are of speoial interests in investigations of the plants resistanse. Growths, development and productivity and also the systems of reparation after impair are relates with theee processes.

The studies of the oostate of energetic systems of plant's oells after influencing by extrem faotors: y-irradiation, low positive temperatures, different quality salinity were oarried out. йог the first time the modified methods of isolation of native mitoohondria from the Phaseolus aureus hypoootyles and cotton roots were described.

The major ohanges in energetio exchange after the treatment of Phaseolus aureus seedling by y-irradiation are following: first of all the low doses of irradiation are stimulating Of substrates oxidation in altoohondrla, as well as the rate of oyollos photophosphorylation and Hill's reaction in ohloroplasto; eeoond of all, the high doses of irradiation are inhibiting the " oxidation of substrates in mitoohondria as well as the reaotion Of Sill and cyollo photophosphorylatlon In chloroplasts. MoreOver In mitoohondria the impairing aotiozi of irradiation is more ,■

strong on the level of the first coupling point of oxidative phosphorylation and in ohloroplasts - nonoyolio electron's transport.

The rats of sustrate3 oxidation in mitochondria increased during the aotion of low positive temperatures. At the same time in ohloropla3ts at the early stages of aotion (24 h) the Hill reaotion is inhibiting with the following stimulation during oontinulng aotion of ooollng, but the rate changes of oyolio photopho3phorylations are phases dependent.

The nutrient medias salinity is stimulating the plants mi-toohondria respiration in 3-metabollo state as well as is decreasing with the period oi aotion and the level of salinity. The ohanges of photochemical activity of cotton chloroplaata are depending on the type and level of sallvity of nutrient substanoe, and on the age of seedlings also.

For the first time the water soluble regulators of oxidative phosphorylation were determined in the oytoplasms of ootton tissues. The aotion of these faotors at the level of. transport system whioh are trasporting K+ions and phosphate through.the inner membrane's of mitochondria. The eleotrophoretio transport of anions ■ and metabolites through the inner membrane of mitoohondria induoed by oytoplasnatio faotor from ootton sedlifcg's roots is.carryed out Dy pH-depending pore fore for the anions of inner mitochondrial membrane. The aotlvity of the oytoplasnatio faotor whioh is uncoupling the oxidative phosphorylation In the ootton roots is depending on ohangas of the physiological state of plant.

Thus, defenoe-adaptation reactions of plants to the extreme factors ave following: the hlgn level of reslstanoe of oyclio pho-tophosphorylation and transition of mitoohondrias to low-energy state*, the ohanges of the nature and the concentration of oofao-tors regulating the functional activity of oell organella. In the early period the oell try to keep the energetio balance and thereby to widerstand to the de3trolng aotion of the'extreme faotor. But the increasing the energotio expenditures on the reparation and the inability to generate additional AEP in tissues during the Increasing the periods of faotor aotion are able to accelerate the processes of impairing In Stress./^tfflifc)''