Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Алкалоиды - ингибиторы биосинтеза макромолекул

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Алкалоиды - ингибиторы биосинтеза макромолекул"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. а А. ЭНГЕЛЬГАРДТА <-

АЛКАЛОИДЫ - ИНГИБИТОРЫ БИОСИНТЕЗА МАКРОМОЛЕКУЛ

Специальность - 03.00.03 молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

МОСКВА, 1090

На правах рукописи УДК 577. 217. 347: Б47. 94

АЙТХОЖИНА

НАГИМА АБЕНОВНА

20.c2.5O

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии и биохимии имени Ы. А. Айгхожина АН КазССР

Официальные оппоненты: академик АМН СССР, доктор биологических наук

профессор И. Б. ЗБАКЖИЯ

доктор биологических наук к Я. ЛЭВЮВА

доктор химических наук

профессор А. А. КРАЕВСКИЯ

Ведущая организация - Институт молекулярной биологии и генетики АН УССР.

Защита состоится "_"_1990 г. в_часов

на ааседании Специализированного совета Д. 002.79. 01 по защите докторских диссертаций при Институте молекулярной биологии имени Е А. Энгельгардта АН СССР по адресу: 117984, Мэсква В-334, ул. Вавилова, д. 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии АН СССР.

Автореферат разослан "_"_1990 г.

Ученый секретарь Специализированного совета канд. хим. наук А. М. Крицын

' ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение биосинтеза белка и нуклеиновых кислот составляет одну из центральных задач молекулярной биологии. В выяснении механизмов этих сложных многостадийных процессов. требующих кооперативного взаимодействия множества компонентов, широкое распространение получил ингибиторный анализ. Имеется ряд соединений, которые избирательно или, по крайней мере, преимущественно подавляют то или иное звено метаболизма макромолекул в клетке, в результате чего можно остановить процесс и изучить отдельные компоненты во взаимодействии с другими. Значительный вклад в решение этих проблем внесли антибиотики пуроми-цин, спарсомицин, кордицепин, хлорамфеникол, линкомицин, анизо-мицин. Они составили эпоху в медицине, и в то же время ингибиторный анализ стал одним из важнейших инструментов в моле-кулярно-биологических исследованиях бактерий. С их помощью было установлено, что образование пептидной связи в рибосоме происходит без участия каких-либо трансферных факторов и катализируется самой рибосомой. Установлено, что для образования пептидной связи достаточно 3' -концевых фрагментов аминоацил-тРНК и пепти-дил-тРНК. На основе этого были разработаны фрагментарные реакции транспептидации, позволившие изучить количественные параметры взаимодействия модельных субстратов с пептидилтрансферазным центром (ПТЦ) рибосом. Основным недостатком существующего набора ингибиторов является немногочисленность агентов для использования на эукариотических организмах, действие большинства из них проявляется на бактериальных системах. Вместе с тем известно, что механизмы реализации генетической информации различных классов организмов при ряде сходств обнаруживают и некоторые Фундаментальные отличия. Поэтому поиски новых высокоэффективных инги-

1

Ситоров, изучение молекулярных основ их действия являются актуальными и составляют важный этап на пути к познанию механизмов регуляции экспрессии эукариотического генома

Перспективными источниками для выявления таких соединений являются биологически активные вещества, синтезируемые в растениях - токсины и алкалоиды. Показано, что токсины белковой природы абрин и рицин ингибируют синтез белка в результате нарушения структурной организации 60S рибосомных субчастиц (Olsnes et al, 1984). Среди алкалоидов выявлены ингибиторы синтеза ДНК и белка, данные обобщены в обзорах (Краевский, 1978; Vazquez, 1979). Однако, широкое использование алкалоидов в ингибиторном анализе синтеза макромолекул затруднено из-за ограниченности имеющихся соединений и недостаточности наших знаний о молекулярных основах действия, особенно на растениях, что в определенной степени связано с методическими трудностями при работе с последними. Имеющиеся в литературе сведения базируются главным образом на результатах, полученных на животных объектах (печень крыс, лизаты ретикулоци-тов кролика) и на трансформированных клетках (Hela, миелома). Вместе с тем, исследование действия алкалоидов на экспрессию растительного генома крайне необходимо для решения таких важных аспектов регуляции, как механизмы активации синтеза макромолекул при прорастании и торможения при переходе в стадию запасания и покои, роли биологически активных соединений в этих процессах, видоспецифичности, фитоиммунитета Проведение подобных исследования необходимо для решения практических задач повышения эффективности полностью бесклеточной биотехнологии синтеза белка, развиваемой в последние годы, а также направленного использования алкалоидов в медицине и сельском хозяйстве.

Цель исследования. Целью настоящей работы явились поиски

2

среди алкалоидов соединений, обладающих выраженным действием на синтез белка и нуклеиновых кислот, изучение молекулярных основ их их действия, исследование возможности направленного транспорта алкалоидов с терапевтически ценными свойствами, в частности, противоопухолевыми, для усиления цитотоксического действия.

. Научная новизна работы. В настоящей работе впервые выявлены и исследованы новые селективные ингибиторы синтеза белка -нарцеин, гомохаррингтонин, матрин, действие которых проявляется на стадии элонгации полипептидной цепи . Однако, механизмы их действия различаются. Нарцеин подавляет связывание модельных пен-тануклеотидных субстратов с донорным сайтом пептидилтрансферазно-го центра 80S рибосом, гомохаррингтонин - с акцепторным сайтом, что в обоих случаях приводит к нарушению образования пептидной связи. Изучены количественные параметры взаимодействия алкалоидов с 80S рибосомами. Показано, что хинолиэидиновый алкалоид матрин препятствует реакции транспептидации. Полученные в работе данные по устойчивости к ингибирухлцему действию алкалоидов рибосом из растений-продуцентов расширяют представления о функциональной роли биологически активных соединений в регуляции внутриклеточных процессов и мехализмов устойчивости к токсинам.

Впервые выявлен ингибитор одного из важных этапов биосинтеза белка - ядерно-цитоплазматического транспорта мРНК - алкалоид цитизин. Установлено, что подавление синтеза белка алкалоидом в клетках печени крыс и зародышей пшеницы является следствием значительного снижения выхода мРНК из ядра в цитоплазму. При этом не нарушается трансляция мРНК, внутриядерный синтез и про-цессинг РНК. Обнаруженный одинаковый эффект цитизина на выход ин— формосом из растительных и животных организмов указывает на общий механизм ядерно-цитоплазматического транспорта мРНК в эукари-отических клетках.

Показана возможность получения белков ядерных информосом, свободных от РНК, что, во-первых, полностью доказывает постулированную ранее структурную организацию ядерных РНП частиц, содержащих про-мРНК; во-вторых, открывает широкие перспективы для использования их в модельных системах изучения освобождения мРНК в цитоплазму.

Приоритетным результатом работы является сочетанное изучение действия алкалоидов в растениях в экспериментах in vivo (влияние на включение радиоактивных предшественников синтеза белка и нуклеиновых кислот, стабильность полисом, прорастание семян, транспорт в клетку, возможность биотрансформации и др.) и in vitro - на трансляцию различных матриц мРНК, реакцию транспепти-дации с использованием модельных субстратов, непосредственно контактирующих с катализирующим образование пептидной связи ПГЦ 80S рибосом.

Изучено влияние алкалоида кофеина и его аналогов на активность ряда ДНК-полимераз.

Впервые синтезированы С-10 дипептидные и N-ацилированные аминокислотные производные противоопухолевого алкалоида колхицина, обладающие низкой токсичностью и высокой биологической активностью. На их основе синтезированы иммуноконъюгаты.

Практическая ценность работы заключается в выявлении новых ингибиторов синтеза макромолекул, которые рекомендованы для использования в качестве молекулярных инструментов для решения широкого круга вопросов, связанных с регуляцией синтеза белка и нуклеиновых кислот, ядерно-цитоплазматического транспорта мРНК, дифференциальной экспрессии генов в связи с устойчивостью к биологически активным соединениям.

Бесклеточные системы трансляции и транспорта мРНК из заро-

4

дышей люпина используются для молекулярно-биологических исследований наряду с системами из зародышей пшеницы. Химические производные колхицина позволяют значительно поднять эффективность цитотоксического действия в результате направленного транспорта в опухолевые клетки.

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты докладывались на международных, всесоюзных и региональных симпозиумах и конференциях, в том числе IV и V всесоюзных биохимических съездах (Ленинград. 1979; Киев, 1986), 16, 17 и 19 конференциях ФЕБО (Москва, 1984; Западный Берлин. 1986; Рим, 1989), всесоюзном симпозиуме "Реализация наследственной информации" (Паланга, 1980),III международной конференции по химии и биотехнологии природных биологически активных соединений (София, 1985) II и IV конференции биохимиков Средней Азии и Казахстана (4рунзе, 1976; Ашхабад, 1986), международном симпозиуме по регуляции трансляции (Рига, 1989), IX советско-индийском симпозиуме по химии природных соединений (Рига, 1989), республиканской конференции "Актуальные проблемы физико-химической биологии и биотехнологии" (Алма-Ата, 1989), П двустороннем советско-американском симпозиуме "Структура эукариотического генома и регуляция его экспрессии" (Тбилиси, 1989).

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Алкалоидам называют специфические низкомолекулярные вещества из растений, обладающие свойствами оснований. В настоящее время число алкалоидов с установленной структурой составля-эт не менее 7000. Они представляют собой азотсодержащие, как правило, гетероциклические соединения, обладающие широким спектром 5иологической активности. Исследования в области алкалоидов дол-

6

гое время были направлены на выделение, идентификацию, установление химической структуры и изучение фармакологических свойств. Среди них найдены соединения, являющиеся ценными лекарственными препаратами: морфин, атропин, папаверин, кодеин, колхицин, вйн-бластин и многие другие. Стероидные алкалоиды служат исходным сырьем для синтеза гормональных препаратов типа кортизона и его аналогов. Теперь установлено, что алкалоиды принимают активное участие в жизнедеятельности растений, вовлекаясь в общий обмен, окислительно-восстановительные реакции, реакции метилирования и трансметилирования. Накопились данные, указывающие на их участие в регуляции биохимических процессов, протекающих в ядре, мембране и т.д. (Садыков, 1978; Ловкова, 1981; Wink, 1980). Их по праву относят к низкомолекулярным биорегуляторам растительного про-исхоадения. Наличие сложных структур и многообразие пространственных форм обеспечивают высокую скорость и специфичность их действия.

Одним из интенсивно развивающихся в последнее время направлений является изучение действия алкалоидов на синтез белка и нуклеиновых кислот. Алкалоиды, выделенные из растений семейства амариллисовых - нарциклазин, ликорин, тацеттин, обладают противоопухолевым действием, являющимся следствием ингибирования синтеза белка (Buer et al, 1978; Kukhanova et al, 1984). Сангвинарин, модифицируя конформацию спирали ДНК при взаимодействии с ней по принципу интеркаяяции, подавляет ДНК-зависимьй синтез РНК (Беляева и др., 1984). Алкалоид берберин образует комплекс с участком двойной спирали ДНК с константой связывания 10~6М, при этом с такой константой связывается одна молекула берберина на 8 пар оснований. Предполагается, что алкалоид ингибирует автономную репликацию эписомальной ДНК. Эметин и тубулозин, выделенные из экстра-

6

ктов Pogonus tubulosus и Alangium lamarckli, подобно антибиотику циклогексимиду подавляют синтез белка в эукариотических клетках в бесклеточной системе трансляции, однако механизмы их действия различаются. Алкалоиды являются эффективными ингибиторами EF-2-зависимой трансляции и в отличие от циклогекси'мида не влияют на К+-индуцируемую неэнзиматическую транслокацию (Jimenez et al, 1977).

Для использования в ингибиторном анализе соединения должны отвечать следующим требованиям: 1. избирательность подавления определенного этапа синтеза макромолекул; 2. общность действия по отношению к большим группам живых существ, клеток, органелл, прокариотам или эукариотам, нормальным или трансформированным; 3. способность проникать через клеточные мембраны и не инакти-вироваться во вне- и внутриклеточных средах организма.

1. Объекты исследований и условия скрининга алкалоидов, обладающих выраженным действием на синтез макромолекул Было испытано более 90 соединений, относящихся к различит группам алкалоидов, их аналогам, производным. Из широкого круга проблем мы выбрали изучение действия алкалоидов на синтез белков и нуклеиновых кислот. Исследования проводили на клетках печени крыс, зародышей пшеницы и люпина. Были определены: оптимальное время включения радиоактивных предшественников С-3 И-уридина, (^НЗ-тимидина.Г^И-лейцина (30 мин, 3 часа и 40 минут, соответственно), концентрации и время действия испытуемых соединений. Одним из важных моментов, которые следует учитывать при изучении действия алкалоидов in vivo, является возможность их биотрансформации внутриклеточными оксидоредуктазными и другими системами. Известно, что при введении в организм радиоактивных препаратов алкалоидов метка через некоторое время обнаруживается не только

7

б суммарной фракции алкалоидов, но и в свободных аминокислотах, пигментах, органических кислотах, белках и т. д. Скорость расщепления основных структур до простейших гетероциклов или алифатических соединений для разных алкалоидов различна Было показано, что за короткие промежутки времени синтеза РНК и белков в экспериментах in vivo не выявлено продуктов расщепления алкалоидов, что позволяет отнести наблюдаемые эффекты эа счет действия исходных соединений. Однако, следует отметить, что через 2 часа на хроматограммах появляются первые следовые количества продуктов биотрансформации алкалоидов и это необходимо учитывать в опытах с продолжительной экспозицией с алкалоидами (например, в системах синтеза ДНК, рибосомальных РНК, тРНК и т. д. ). В результате первичного скрининга среди испытанных соединений были выявлены алкалоиды, обладающие ингибирующим или стимулирующим действием. Например, в присутствии пиридинового алкалоида анабазина в концентрациях от Б х 10~* до 10"6 W в зародышах пшеницы наблюдалось стимулирование синтеза РНК на 30-40% по сравнению с контролем. Софоридин, N-окись матрина и ряд других приводили к увеличению синтеза РНК до 60-70Z (рис.11). Однако,при переходе на бесклеточные системы синтеза РНК и белков стимулирующая активность не проявлялась. Возможно, это связано с системой опосредованных эффектов, носящих вторичный характер или функциональным состоянием клетки в целом. Подобные результаты приводятся в ряде работ. Как правило, авторы сравнивают такое влияние алкалоидов с действием фитогормонов, но экспериментального подтверждения пока не получено.

В результате проведенных исследований перспективными для дальнейшего анализа были выбраны следующие алкалоиды: кофеин, ликорин, нарцеин, гомохаррингтонин, матрин и цитизин. С исполь-

8

зованием бесклеточных систем синтеза нуклеиновых кислот и белков и фрагментарных реакций трансляции были изучены молекулярные основы их действия.

2. Ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот 2.1. Действие кофеина и его аналогов на активность ДНК-полимераз

Относительно действия кофеина в литературе имеются довольно противоречивые данные. К. Tatsumi с соавторами (1984) показали подавление матричной активности ДНК-полимераз в культуре эмбриональных клеток слюнных желез в противоположность данным (Solsberg et al, 1978). Имеются косвенные данные об участии кофеина в процессах репарации (Dimitrov et al, 1979). В опытах in vivo не было выявлено сильного ингибирования синтеза ДНК в первые часы прорастания зародышей пшеницы. Исследование процессов репликативного синтеза ДНК в клетке значительно облегчается тем, что к настоящему времени выделены и очищэны до гомогенного состояния ферменты, катализирующие эти процессы (Wahl et al, 1984; Атражев, Куханова, 1985). Для сравнительного анализа действия кофеина на ДНК-полимеразы различной функциональной активности были использованы бесклеточные системы синтеза ДНК, катализируемые ДНК-полимеразой I из Е. coli и ДНК-полимеразой «I из тимуса теленка, ответственными за репликацию ДНК, и ДНК-полимеразой ß из печени крыс, ответственной за репаративный синтез ДНК. Включение меченого дезоксирибонуклеозидтрифосфата-[^^]-дГТФ в ДНК в пробах без алкалоида принимали за 100%. Чувствительной к кофеину оказалась реакция, катализируемая ДНК-полимеразой р (рис. 1). Аналоги кофеина - теофилин и димер теофилина - аминофилин, отличающиеся количеством и положением метильных групп в пуриновом кольце, не проявляли ингибирующего действия на активность фермента,

9

что указывает на высокую селективность подавления.

При добавлении алкалоидов к инкубационной смеси через 5,10, 1Б минут после начала реакции ингибируюшего действия алкалоида не наблюдалось. Возможно, что действие кофеина связано его взаимодействием с отдельными компонентами инкубационной смеси и дальнейшим выключением их из реакции. Ддя проверки такой возможности были проведены опыты по инкубации алкалоида отдельно с матрицей-затравкой, ферментом, инкубационной системой без ДНК-полимеразы или субстрата, либо обоих компонентов и т. д. с последующим добавлением их в инкубационную смесь. Результаты показали, что местом

__ р

Концентрация, мМ х ю

32

Рис. 1. Включение С РЗ-дГТФ в ДНК, катализируемой ДНК-полимеразой 1 из Е. col i (1). ДНК-полимеразой <¿ (2), ДНК-полимеразой^ 3) под действием кофеина (а) и теофилина (б). Здесь и далее на рисунках за 100% приняты данные контроля без добавления алкалоидов.

действия кофеина является ДНК-матрица. Об этом свидетельствуют данные по обратимости действия алкалоида при повышении концентрации матрица-затравка. Суммируя полученные результаты и имеющееся к настоящему времени литературные данные, можно заключить, что кофеин является ингибитором репаративного синтеза ДНК. Отсутствие заметного влияния алкалоида на синтез ДНК in vivo, no-види-

мому, связано с преобладанием в первые часы прорастания зародышей пшеницы репликативного синтеза над репаративным.

2. 2. Действие ликорина на синтез РНК Как мы отмечали ранее, ингибиторов синтеза РНК в высших организмах имеется очень мало. Широко используемый oL -аманитин обладает чрезвычайно высокой токсичностью, что исключает возможность использования его в опытах in vivo. Поэтому поиск новых ингибиторов синтеза РНК остается актуальным. Как показано на рис.2, при инкубации зародышей пшеницы с ликорином наблюдалось сильное ингибирование синтеза РНК, начиная с концентрации Ю-^М. Аналогичные данные получены в клетках печени крыс. Алкало-

100

алкалоид, М

Рис.2. Еключение С3Н1-тимидина (1), С14 С]-лейцина (2) и С3Ш-

25 50 75 100 алкалоид, мкМ

Рис.З. Синтез РНК, катализируемый РНК-полимеразой Е. со) i (1) и

уридина (3) в прорастающие заро- РНК-полимеразой II из тимуса дыши пшеницы в присутствии раз- теленка (2) в присутствии возрас-личных концентраций ликорина таюших концентраций алкалоида

ид не подавлял синтез ДНК. В гораздо меньшей степени, чем блокирование синтеза РНК, происходило снижение синтеза белка

В бесклеточных системах синтеза РНК в присутствии четырех рибонуклеозидтрифосфатов выявлено сильное подавление активности

И

РНК-полимераэы II из печени крью (рис.3). Эги данные подтверждаются результатами анализа новообразованной in vivo РНК из печени крыс и зародышей пшеницы. Седиментационное распределение в градиенте сахарозы РНК, выделенной из ядер клеток этих тканей после инкубации с ингибирующими синтез концентрациями алкалоида, выявило по сравнению с контролем незначительное количество высокомолекулярной пре-мРИК с константой седиментации до 100S. Аналогичные данные были получены при электрофорезе препаратов РНК в 1,4£-ном агарозном геле. Синтез рибосомальных РНК при этом не отличался от контрольных. В отличие от клеток печени крыс и зародышей пшеницы, клетки Е.coll, обработанные алкалоидом, продолжали, как и в контрольных пробах, расти и включать ["'ш-уридин. Ингибирова-ние синтеза РНК не превышало 10%. На рис.3 (кривая 1), приведены данные по влиянию ликорина на активность РНК-полимеразы I из Е. coli. Результаты этих экспериментов свидетельствуют о том, что алкалоид может быть использован для изучения синтеза РНК в эука-риотических клетках. Важно, что препарат проявляет свое ингибиру-ющее действие при достаточно низких концентрациях, ингибирование синтеза РНК на 50Х достигается при концентрации 5 х 10-8М. Ранее этот алкалоид был известен как ингибитор синтеза белка. Было показано. что ликорин в концентрации 1,5 мМ связывается с донорным сайтом ПТЦ 80S рибосом и таким образом препятствует взаимодействию с ним модельных пентануклеотидных субстратов, что приводит к ингибированию транспептидации (Kukhanova et al, 1983). Действие алкалоидов одновременно на синтез двух ключевых соединений в клетке является интересным и требует дальнейшего изучения.

3. Ингибиторы синтеза Редка 3.1. Нарцеин - ингибитор донорного сайта ПТЦ 80S рибосом

3. 1.1. Действие нарцеина на трансляцию мРНК Результаты экспериментов in vivo показали, что нарцеин не оказывает существенного влияния на синтез ДНК и РНК в зародышах пшеницы. В концентрации б х 10~6 М наблюдалось снижение синтеза белков на 65-70%. Ыы попытались определить стадию трансляции, которая чувствительна к этому алкалоиду. В бесклеточной системе синтеза белков из зародышей пшеницы нарцеин проявил достаточно сильное действие на трансляцию РНК вируса табачной мозаики, полиса)"'' РНК из зародышей пшеницы и поли(и)-направляемый синтез полифенилаланина (рис. 4).

Рис. 4. Ингибирование нарцеином трансляции РНК ЕГМ (1) и поли(А)-содержащей РНК зародышей пшеницы (2). Реакционная смесь содержала в конечном объеме 50 мкл следующие компоненты: 20 мМ трис-НС1, рН 7.6, 50 мМ КС1, 2 мМ Мг(Ас)2,1 мМ АТФ, 0.1 мМ ГТФ, 25 мкл Эзо, 2 мкКюри/мл [14С1-лейцина, 5 мкг РНК. Инкубация при 30°С в течение 1.5 ч сопровождалась гидролизом аминоацил-тРНК и осадце-10 нием 10% трихлоруксусной кислотой.

алкалоид, М

Ингибирование синтеза полифенилаланина может свидетельствовать об отсутствии действия алкалоида на инициацию трансляции. Дополнительное подтверждение этому было получено в опытах с выделением и последующим анализом в 15-30% градиенте сахарозы полисом из контрольных и обработанных алкалоидом прорастающих зародышей пшеницы. В отличие от пирокатехола, который, как известно, вызывает накапливание одиночных 80S рибосом и является инги-

13

битором инициации полипептидного синтеза - нарцеин не влиял на количество и профиль распределения полисом в сахарозном градиенте, указывая на их стабильность.

3.2. Дизико-химические характеристики взаимодействия

нарцеина с ПТЦ 80S рибосом Было сделано предположение, что ингибирование синтеза белка связано с элонгацией полипептида. Для проверки этого предпо- ' ложения были проведены опыты по действию алкалоида на каталитическую способность 80S рибосом растений во фрагментарной реакции транспептидации между минимальным донором pA-MeW и пентануклео-тидным акцептором С- А- С- С- А- [1 ^ С]Phe. Особенностью этой реакции является использование вместо целых молекул пептидил-тРНК и ами-ноацил-тРНК их 3'-концевых фрагментов, непосредственно контактирующих с ПТЦ рибосом, что исключает влияние других участков тРНК на связывание с рибосомой. Реакция разработана для 70S рибосом Е. coli (Monro et al. 1967; Cerna et al, 1973; Pestka, 1972); 80S рибосом печени крыс (Krayevsky et al, 1979) и зародышей пшеницы (Sikorskl et al, 1982) и используется наряду с пуроммциновой для изучения особенностей функционирования ПТЦ рибосом. Было показано, что нарцеин не ингибирует образование пептидной связи .

Как продемонстрировано на рис. 5, нарцеин практически полностью подавляет перенос на пуромицин остатка ацетидлейцина из С-АС--С-А[14С] Leu»Ас в системе с 80S рибосомами из зародышей пшеницы (кривая 1) и совершенно не влияет на систему с 70S рибосомами Е. coli (кривая 2). Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что нарцеин не является ингибитором реакции транспептидации. Вместе с тем, в присутствии нарцеина не происходит реакция между пентануклеотидным донорным субстратом С-А-С-C-A-[14C]Leu«-Ac и минимальным акцептором пуромицином. Аналогич-

14

ные данные были получены ранее М. Кухановой с соавторами (КикЬапоуа еЬ а1, 1983) при изучении механизма действия противоопухолевых алкалоидов группы нарциклазина - ликорина, унгерина и тацеттина. Авторами было четко продемонстрировано, что алкалоид

алкалоид, М

Рис.5. Действие нарцеина на образование С-А-С-С-А-С14С]Leu-пуро-мицина в присутствии 80S рибосом зародышей пшеницы (1) и 70S рибосом Е.coli (2).

этой группы ликорин блокирует связывание С-А-С-С-А-114С] Leu-Ас с донорным сайтом 80S рибосом из зародышей пшеницы. Этот алкалоид в настоящее время является первым и единственным описанным в литературе соединением, прямо блокирующим связывание модельных субстратов с донорным сайтом эукариотических рибосом без видимого влияния на акцепторный сайт. Использование ликорина в качестве селективного ингибитора донорного участка пептидилтрансферазного центра позволило впервые определить константы связывания модельных акцепторов с акцепторным участком в условиях термодинамического равновесия. Показано, что связывание акцепторных участков происходит кооперативно, в то время как донорные субстраты связываются с ПТЦ рибосом в двух копиях,причем сродство к донорному как

15

минимум в три раза выше (Ка- 3,2 х 10 Ы , Ка- 1,2 х 10 М ), но кооперативных эффектов не наблюдается. Несомненно, что изучение количественных характеристик взаимодействия субстратов с ПТЦ рибосом в совокупности с качественными характеристиками имеет важное значение для установления структуры и функционирования активных центров рибосом, вкладе пептидилтрансферазного центра в процесс элонгации пептида. Поэтому представляло интерес изучение связывания С-А-С-С-А-С 14C]Leu»Ac 80S рибосомами зародышей пшеницы в присутствии нарцеина и сравнения механизмов действия двух алкалоидов. На рис. 6 приведены в координатах Скэтчарда изотермы адсор-14

бции С-А-С-С-А-[ С]Leu-Ас на 80S рибосомах зародышей пшеницы в контрольных условиях, в присутствии 1 мМ нарцеина и 0,5 мМ гоуге-ротина. В работе использовали рибосомы, очищенные центрифугированием в градиенте плотности сахарозы, доля активных рибосом составляла 70Z. Для определения константы ассоциации (Ка) субстрата было проведено две серии опытов. В первой, рибосомы титровали лиг -андом, во-второй - постоянное количество лиганда титровали рибосомами. В обоих случаях Ка были практически одинаковыми, а доля субстрата, активного в связывании с рибосомами, составляла 80-90Z. Известно, что при гомогенной адсорбции графики представляют собой прямые, пересечение с осью абцисс характеризуют число мест связывания (п). При наличии нескольких мест адсорбции лиганда с различающимися Ка график отклоняется от прямой. Константы ассоциации субстратов с акцепторным и донорним сайтами ПТЦ 80S рибосом зародышей пшеницы определяли как это било предложено ранее (Kukhanova et al, 1979). Анализ полученных данных позволяет сделать вывод о том, что в контрольных условиях взаимодействие донора С-А-С-С-А-[ Leu-»Ас на 80S рибосомах происходит с сильной и слабой константой связывания и суммарным числом мест связывания, близким к 2.

16

В присутствии нарцеина связывание происходит по одному акцепторному участку с Ка -1,1 х 106 М~1,а в присутствии гоугеротина по одному донорному участку с Ка - 1,0 х 107 М"\рис. 6). На основании полученных данных можно заключить, что алкалоид ингибирует взаимодействие C-A-C-C-A-Leu»Ac с донорным сайтом, не оказывая существенного влияния на акцепторный сайт. Это свойство алкалоида селективно ингибировать донорный сайт ПГЦ было использовано в опытах по определению константы связывания пентануклеотидных доноров, отличающихся природой аминокислотного остатка С-А-С-С-А-С14С]Pho, C-A-C-C-A-[14C]Leu И С-А-С-С-А-С14 CI Val.

Рис. 6. Связывание С-А-С-С-А-[14С1Leu»Ac с 80S рибосомами 1 - контроль; 2 - в присутствии 1 мМ нарцеина; 3 - в присутствии 0,5 мМ гоугеротина ^ - количество молей лиган-да на моль рибосом, С-концент-рация свободного лиганда в растворе.

Постановка таких экспериментов была вызвана тем, что в литературе имелись данные о наличии в ПТЦ специальных гидрофобных участков для связывания боковых ароматических радикалов фенилаланина Существование таких участков должно было проявиться в увеличении сродства к ПГЦ фенилаланинового субстрата Однако сравнение констант ассоциации указанных акцепторов, как и в опытах с ликорином, показало, что они различаются не более, чем на порядок. Найденные различия в Ка не настоль велики, чтобы можно было говорить о наличии в акцепторном сайте специальных участков для связывания боковых радикалов аминокислотных остатков. Таким образом, среди

17

природных биологически активных соединений найден еще один селективный ингибитор донорного участка 80S рибосом зародышей пшеницы. Механизм его действия на каталитическую активность пептидилтранс-феразного центра по ряду кинетических параметров совпадает с описанным ранее ингибитором лг.корином. Таким образом, впервые показано, что специфичный в модельных системах фрагментарных реакций синтеза белков, алкалоид оказывается эффективным при переходе к основному обьекту - зародышам пшеницы, что проявляется в ингиби-ровании синтеза белка в опытах in vivo и бесклеточной системе трансляции.

3.2. Механизмы действия гомохаррингтонина К началу наших исследований было известно, что алкалоиды из Cephalotaxus harringtonia - харрингтонин, гомохаррингтонин, изохаррингтонин и цефалотаксин ингибируш синтез белков в некоторых эукариотических клетках. При изучении механизмов действия алкалоидов результаты, полученные разными авторами, оказались, однако весьма противоречивы. В работах (Tscherne et al,1975; Huang, 1976) было показано ингибирование трансляции на уровне инициации в интактных клетках и их лизатах. Д. Вазкез с соавторами (1977, 1979) получили данные, указывающие на блокирование алкалоидами спарсомицин-индуцированного связывания (С)U-А-С-С-А-Е^НЗLeu-Ac к 60S субъединицам рибосом из дрожжей и ретикулоцитов кролика и эн-зиматического и неэнзиматического связывания Phe-TPHKPhe к рибосомам. По нашему мнению, наиболее прямой и однозначный подход, который может быть использован для решения этой проблемы, заключается в количественной характеристике взаимодействия компонентов. Проведение таких работ составило задачу очередной серии экспериментов. Было изучено действие гомохаррингтонина на трансляцию эндогенной мРНК, на неэнзиматическое и eE!F-l<£-зависимое связывание

18

индивидуальной Phe-TPHKphe с 80S рибосомами из плаценты человека в присутствии поли(и), синтез дифеналанина и образование ацетил-фенилаланил-пуромицина при обработке пуромицином комплекса Ac-Phe -TPHKphe с рибосомами и поли(11).

3.2.1. Действие гомохаррингтонина и цефалотаксина на синтез полипептидов

Влияние возрастающих концентраций гомохаррингтонина и цефалотаксина на синтез белков в бесклеточной системе из лизатов ретикулоцитов кролика представлено на рис. 7.

Рис. 7. Влияние гомахаррингто-нина (1) и цефалотаксина (2) на трансляцию глобиновой мРНК в бесклеточной системе из лизатов ретикулоцитов кролика.

Видно, что эффективность цефалотаксина значительно ниже гомохаррингтонина и ингибирование трансляции мРНК не превышает 16% от контроля. Аналогичные данные были получены в системе синтеза полифенилаланина на поли(Ш-матрице. Было показано, что алкалоиды не влияют к', аминоацилирование тРНК, инициацию трансляции, что свидетельствует о действии гомохаррингтонина на более поздней стадии трансляции - элонгации. Эти данные отличаются от полученных ранее в лаборатории Д. Вазкеза, где показано, что оба алкалоида эффективно ингибируют синтез полипептидов. Более того, 5ыло сделано предположение, что алкалоиды вызывают распад полисом и кажущийся эффект ингибирования стадии инициации (Fresno

19

10~7 10~6 ID"5 10~4

алкалоид, М

et al, 1977).

3. 2.2. Гомохаррингтонин специфически ингибирует элонгацию

Установление подавления синтеза белка на уровне элонгации позволило поставить вопрос о механизмах действия гомохаррингто-нина на образование пептидной связи в 80S рибосомах. В отличие от экспериментов по изучению взаимодейотвия нарцеина с 1ГГЦ 80S рибосом, мы использовали для этих целей не модельные акцепторные и донорные субстраты - pA-Met-f и С-А-С-С-А-[ 14ClLeu*Ac, а индивидуальную Phe-TPHKphe, которая была применена в обсуждаемой работе, что позволило бы провести сравнительный анализ результатов, полученных в гомогенной системе. Очевидной стала необходимость изучения действия гомохаррингтонина на поли(11)-зависимое неэнзиматическое связывание РЬе-тРШ11*10 с акцепторным и доно-рным сайтом 80S рибосом и образование дифенилаланина в этих условиях. С этой целью 80S рибосомы титровали [14C]-Phe-TPHKPhe в присутствии поли( U) и отсутствии факторов трансляции для заполнения молекулами тРНК обоих сайтов рибосом; затем в условиях насыщения рибосом по Phe-TPHKphe определяли качество образовавшегося дипептида. Результаты этих экспериментов приведены на рис.8 и таблице 1.

о, в 0,4

3 6 9

РЬе-ТРНК ph6/803

Рис. 8. Титрование 80S рибосом из плаценты человека Phe-TPHKphe . (о) - в присутствии поли(1)), (•) - в отсутствии матрицы. -уровень связывания Phe-тРНКР*16 в моль на моль 80S рибосом.

Из представленных данных видно, что максимальный уровень поли(U)-зависимого связывания Phe-TPHKphe составляет 0,7 моль на моль 80S рибосом (рис. 8). Практически все связанные с рибосомами остатки Phe участвуют в образовании дифенилаланина (табл.1).

Таблица 1.

Влияние гомохаррингтонина на неэнзиматическое поли(1!)-зависимое и eEF-Id-зависимое связывание t14C]Phe-TPHKphe с 80S рибосомами из плаценты человека и синтез дифенилаланина.__

: Неэнзиматическое : eEF-lc*. -зависимое*

:_связывание_: связывание_

: уровень : синтез (Phe^: с eEF-1 : без Рибосомы : связывания: (моль/моль : : eEF-1

: (моль Phe-: рибосом : :

: тРНК/моль : : :

_: рибосом) :_:_:_

Необработанные 0,70 0,30 0,30 0,05

Прединкубирован-

ные с гомохарринг-

тонином_0,56_0,02_0,24_0,05

phe

* Для определения энзиматического связывания Phe-тРНК в акцепторном сайте 7 пмолей 80S рибосом инкубировали с 0,6 0Е„,_ по-

260

ли(11) в течение 5 мин при 37°С для заполнения донорного сайта, затем инкубацией с eEF-1 .t^ClPhe-TPHK^H ГТФ в течение 15 мин получали тройной комплекс. После смешивания обоих комплексов и инкубации определяли связывание [14CJPhe-TPHKph0 с рибосомами фильтрацией на нитроцеллюдозных фильтрах.

Эти данные свидетельствуют о том, что в условиях насыщения по phe

Phe-rPHK происходит заполнение обоих сайтов 80S рибосомы прак-

21

тически в равной степени; доля активных рибосом составляет 35%. Для выяснения действия алкалоида на эти процессы рибосомы предварительно инкубировали с 0,1 мМ гомохаррингтонина в течение 10 мин при 20°С. За 100% принимали количество синтезированного ди-поптида в отсутствие алкалоида.

Как следует из данных таблицы 1, гомохаррингтонин в концентрации 0,1 мМ в отличие от описанных ранее данных незначительно

phe

влияет на неэнзиматичеекое связывание Phe-TPHK с рибосомами

14 phe

и не блокирует eEF-Ы -зависимое связывание [ ClPhe-TPHK

в акцепторном сайте 80S рибосом. Вместе с тем, гомохаррингтонин практически полностью подавляет транспептидацию, образование дифенилаланина в опытах с прединкубированными с алкалоидом рибосомами Оолее чем на порядок ниже по сравнению с контролем. Инги-

бирующее действие гомохаррингтонина на транспептидацию наблюда-

14

лось и в системе синтеза ацетилС СЗдифенилаланил-пуроыицина (рис;9). Последний образуется при обработке 1 мМ пуромицином

14 rjJiG

комплекса 80S поли(Щ Act ClPhe-TPHK . Для образования комплекса, как было показано ранее С. Кирилловым с соавторами (Kiril-lov et al, 1981) в аналогичной системе из рибосом печени кролика, Ac-Phe-TPHKphe брали в относительно низкой концентрации для преимущественного связывания в донорном пуромицин-реактивном сайте

14

рибосом. Как видно из рис.9, синтез [ С] ацетилфенилаланин-пуро-мицина (кривая 2) полностью ингибируется в случае прединкубирова-ния с гомохаррингтонином до образования тройственного комплекса. Синтез значительно ингибируется при добавлении алкалоида к комплексу через 10 мин после инкубации с пуромицином (кривая 4) и практически нацело блокируется, когда гомохаррингтонин добавляли к комплексу до пуромицина (кривая 3).

0,24

Рис. 9. Кинетика образования

И-ацетилфенилаланил-пуромици-на при обработке пуромицином комплексов плацентарных рибосом с АсР1те-тРНКр11е и поли(и). Уровень связывания Ас-РЬе-

1

TPHKph9 составлял 0,26 моль/ моль 80S рибосом. Контроль (1); 80S рибосомы прединкуби-рованы с алкалоидом (2). Алкалоид добавляли к комплексу 80S

0,12

через 10 мин после инкубации с пуромицином (4).

поли(и) АсРЬе-тРНК phe до (3) и

10 20

Время, мня

зо бо

Сравнительный анализ этих данных позволяет предположить, что алкалоид конкурирует с пуромицином за место связывания в акцепторном сайте ГГГЦ рибосомы. В этом отношении наши результаты совпадают с данными из лаборатории Д-Вазкеза, проводивших конкурентное связывание С 3НЗ-анизомицина и [14С]-триходермина (ингибиторов акцепторного сайта 1ТГЦ) с пуромицином в присутствии алкалоидов группы харрингтонина на рибосомах из миндалин человека и дрожжей. На основе данных, представленных на рис. 10, были определены константы связывания гомохаррингтонина с рибосомами, равными соответственно, 106 3 х 106 М-1.

Таким образом, из двух алкалоидов - гомохаррингтонина и цефалотаксина только гомохаррингтонин эффективно ингибирует синтез белка в бесклеточных системах трансляции. Алкалоид не оказывает существенного влияния на кодон-зависимое связывание тРНК к рибосоме (знзиматическое и неэнзиматическое) и ингибирует синтез дифенилаланина при неэнзиматическом связывании и образовании

Рис.10. Влияние гомохаррингтонина на синтез дифе^-нилалаиина (а)

и ацетилфенилаланид-пуромицина (б). ■) - уровень связывания Ас-14

t С'] -Phe - т РНК/ моль рибосом.

ацетилфенилаланил-пуромицина в составе комплекса 80S AcPhe-TPHKphe поли( U). to механизму действия гомохаррингтонин является ингибитором акцепторного сайта ПТЦ 80S рибосом. Возможно, что показанное в ранее проведенных работах ингибирование и гомохаррин-гтонином, и цефалотаксином всех стадий трансляции и связывания Phe-TPHKphe с рибосомами является следствием растворения алкало-дов в 0,52 диметилсульфоксиде (ДМСО). Как показали контрольные эксперименты, ДМСО при такой концентрации вносит значительный вклад в процесс ингибирования. Учитывая это, в данной работе алкалоид переводили в форму хлоргидрата и растворяли в ТКЫ-буфере, в котором проводили все реакции связывания. В заключение следует отметить, что в литературе документированы сведения об использовании алкалоида в качестве противоопухолевого препарата. Подученные данные о высокой ингибирующей синтез бедка активности гомохаррингтонина в нормальных тканях, по нашему мнению, следует учитывать в практической медицине. Кроме того, это ещз раз свидетельствует о важности и необходимости изучения молекуляр-

24

них механизмов действия алкалоидов не только для использования регуляции биосинтеза макромолекул, но и в практических целях.

3. 3. Изучение действия хинолизидиновых алкалоидов на синтез Оелка Алкалоиды этой группы широко представлены в растениях семейства Fabaceae, содержат бициклические системы хинолизидина. Подробно изучена химическая структура, определены конфорыацион-ные состояния, получены полусинтетические производные. Сравнительному изучению действия лупанина, ангустифолина и 13-ОН-ангус-тифолина, их производных и солей (перхлораты, диперхлораты, хлориды, иодиды) на аминоацилирование и связывание Phe-тРНК к 80 S рибосомам растений были посвящэны работы Т. Твардовски с соавторами (Twardowski et al. 1981, 1989; Korcr et al, 1987). Было показано, что в концентрациях всех алкалоидов от 0,05 до 10 uU происходит ингибирование связывания [14С)-Phe-TPHK с рибосомами в присутствии поли(и). Эта группа алкалоидов и полученные авторами данные являются единственными, описанными в литературе. Более 20 соединений, относящихся к группе ыатрина, спартеина, цитизи-

на и люлинина были испытаны нами на синтез ДНК, РНК и белка в

-8 -4

системах in vivo и in vitro в концентрациях от 10 до^Ю Ы. Ни одно из соединений не влияло на синтез ДНК и активность ДНК-поли-мераз. На рис. 11 приведены данные по синтезу РНК и белка в клетках прорастающих зародышей пшеницы в присутствии некоторых из них. Видно, что N-окись матрина на 70% стимулировала синтез РНК. Однако в бесклеточных системах, как указано в разделе 1, такой активности не п^влялось. Алкалоиды матриц и цитизин в среднем на 60% блокировали синтез белка в концентрации 10~6-10~4 Ы. Подобно нарцеину они не влияли на. аминоацилирование тРШ и инициацию транс-

25

.100

ф

ф

50

1 \ б

/ V 1

к-г^аг-Чч^---§ 2 —__4

—• 3 ---8 2

\» X

• - 1

___1_ .1......1_

10

.-6

Ю-5 10~4

10"? Ю-5 10~4

Концентрация, М

Рис.11. Влияние различных концентраций хинолизидиновых алкалоидов на синтез РНК (а) и белков (б) в прорастающих зародышах пшеницы. 1-матрин; 2-И-окись матрина; 3-цитизин; 4-Н-метилцитиэин. ляции. Как показано на рис. 12, матрин ингчбирует реакцию образования пептидной связи во фрагментарной реакции транспептидации, для сравнения приведены данные по цитизину.

% 100

50

0,4 0,8

алкалоид, мМ

Рис.12. Действие матрина (1) и цитизина (2) на образование пептидной связи во фрагментарной реакции транспептидации. За 100Х принято образование продукта реакции Г-теЬ-рЬв в пробах бее алкалоида.

В связи с изучением хинолизидиновых алкалоидов представилась возможность проверить действие алкалоида спартеина на синтев макромолекул в растении - продуценте алкалоида. Семена люпина желтого Ьиртиэ 1и1еиэ с низким содержанием алкалоидов (0,05%), сорт "Новозыбковский - 274", и высокгм (до 3%), сорт "К 1470".

26

оказались очень удобным объектом для выделения зародышей и компонентов трансляционного аппарата Было показано, что спартеин на 80-90% ингибировал прорастание семян пшеницы, в то время как прорастание семян высокоалкалоидного люпина оставалось на уровне контроля. При этом степень ингибирования прямо зависела от содержания алкалоидов. Включение [14С]-лейцина в зародыши пшеницы было на порядок ниже, чем в зародыши люпина Для более детального изучения механизмов действия алкалоида использованы традиционные бесклетощше системы из зародышей пшеницы и оптимизирована система из люпина Эффективность трансляции бесклеточной системы из люпина была высокой, для РНК ВТМ включение составляло 260 пмолей на 1 мкг РНК матрицы, что позволяет рекомендовать ее для молеку-лярно-биологических исследований наряду с системой из зародышей ' пшеницы. Эксперименты по трансляции мРНК (РНК ВТМ, поли(А)+РНК из зародышей пшеницы и люпина) показали высокую чувствительность к ингибиругацему действию алкалоида бесклеточной системы из зародышей пшеницы. Включение С14 С]-лейцина в ней снижалось как минимум в 10 раз по сравнению с люпиновой. Замена рибосом из зародышей . пшеницы рибосомами из зародышей высокоалкалоидных сортов люпина восстанавливала синтез белка, что свидетельствует об устойчивости рибосом из горького люпина к действию спартеина

Таким образом, кроме описанных в литературе ингибиторов связывания Phe-TPHK с 80S рибосомами из зародышей пшеницы и люпина (лупанин, ангустифолин, 13-ОН-ангустифолин) выявлен алкалоид спартеин - ингибитор функциональной активности рибосом растений, не продуцирующих его. Изучение действия алкалоидов на растения с различным их содержанием позволило выявить видоспеци-фическое действие алкалоидов, по крайней мере, хинолизидиновой группы.

4. Цитиаин - ингибитор транспорта мРНК в цитоплазму эукариотических клеток 4.1. Влияние цитизИиа на синтез полипептидов фи изучении действия хинолизидиновых алкалоидов на синтез макромолекул нами был выявлен алкалоид цитизин, который значительно ингибировал синтез белков (рис.116). Включение [3Н)-урвди-на и t3Ю-тимидина в контрольных (100%) и обработанных алкалоидом пробах отличалось незначительно, указывая на отсутствие подавления цитизином синтеза РНК и ДНК (рис. 11а). Далее мы попытались выяснить, какая стадия синтеза белков чувствительна к цити-вину. Алкалоид не вызывал заметного ингибирования трансляции РНК ВГЫ, поли(А)-содержащей РНК и поли(1)). Как мы уже отмечали в предыдущем разделе.алкалоид не влиял на реакцию связывания С-А-С-С-А-С1^ С] LetKAc с пуромицином, катализируемую 80S рибосомами растений и 70S рибосомами Б. col i.

Данные об отсутствии действия алкалоида на синтез белков

Рис.13. Распределение в 1030% градиенте плотности сахарозы полисом, выделенных из контрольных (1) и обработанных цитизином (2) и пирокатехолом (3) зародышей пшеницы. Зародыши предварительно инкубировали с t^Hl-уридином (0,5 мкКюри/ммоль) и 0,1 мМ цитизина в течение 30 мин. Центрифугирование в роторе SW-50 при 38000 об/мин в течение 3 часов.

имп мин

2000

1000

°-о-о-о-о-°-о-о-о

ю го

фракции

30

были также получены в реакции транспептидации с минимальным донором. На рис. 13 показано, что алкалоид не нарушает структурную организацию полисом, выделенных из прорастающих зародышей пшеницы после инкубации с цитизином. Следует однако отметить, что количество полисом, активно включенных в трансляцию новообразованной мРНК, ниже в материале, полученном из обработанных алкалоидом клеток.

4. 2. Изучение действия цитизина на выход новообразованной мРНК в цитоплазму Одним из возможных мест действия алкалоида могли быть ядерные мембраны или их компоненты. В результате такого взаимодействия может нарушаться ядерно-цитоплазматический транспорт мРНК, который, как известно, является одним из важных этапов синтеза белка Для проверки такой возможности из зародышей пшеницы, прединкубированных в течение 30 мин с 0,1 мМ цитизина и [^НЗ-уридином, и контрольного материала выделяли ядра и экстрагировали в течение 15 мин на холоде буфером, содержащим 20 мМ трис-HCl, pH 7,6, 25 мМ KCl, 4 мЫ MgCl2, 2 мЫ CaClg, 3 мМ 2-мер-каптозтанола. 2,5% фикола Инкубационную смесь анализировали в градиенте плотности сахарозы и CsCl (рис. 14а, рис.15), соответственно. Видно, что большая часть радиоактивного материала высвобождается в виде мРНН частиц с гетерогенным распределением в сахарозном градиенте с коэффициентами седиментации до 120S и

3

плавучей плотностью в CsCl 1,4 г/см , характерными для описанных ранее информосом растений. Однако количество экстрагируемого материала в опытных пробах было значительно ниже контрольных. Аналогичные данные были получены на клетках печени крыс, меченных [1^С1-оротовой кислотой (рис.146). Не исключено, что подобное действие алкалоида может быть связано с нарушением внутри-

29

имп мин

5000

2500

а - А 6

/ ,

- / о-о 7°\ и г ь • > 1 о-о-о-о- 1 \ Лг I о 1 / \ / /\ иу, 1 О \ '41

1 0

20

10

20

30

30

фракции

Рис.14. Седиментационное распределение материала, экстрагированного иг ядер вародшаей пшеницы (а) и печени крыс (б), в присутствии (1) и отсутствии (2) 0,1 мМ цитизина Центрифугирование в 10-60% (а) и 15-30% (б) градиенте сахарозы при 38000 об/мин в течение 90 мин при 3°С.

- 4000

2000

фракции

Рис. 15. Распределение материала, Рис. 16. Анализ РНК, выделенной

экстрагированного из ядер зародышей пшеницы в присутствии (1) и отсутствии (2) цитизина. в градиенте плотности СбС1. Плавучая плотность СбС1 (3).

из ядер печени крыс, после инкубации при 043(1) и 20°С (3) в присутствии 0,1 мМ цитизина в течение 20 мин; (2)-контроль без добавления цитизина

ядерного процессинга РНК, в результате которого снижается образование мРНК, готовой к выходу из ядра и последующей трансляции в цитоплазме. Поэтому следующим этапом нашей работы было изучение влияния цитизина на процессинг мРНК. Для этого были использованы бесклеточные системы транспорта мРНК из зародышей пшеницы и печени крыс, разработанные Х-Дощановым и соавторами (1981) и Т.Уэббом (Palayoor et al, 1981). Особенностью этих модельных систем является возможность экстрагировать информосомы, содержащие прошедшие процессинг мРНК, в отличие от экспериментов ln vivo, где по мнению авторов, в основном высвобождаются прочно связанные с хроматином информосомы. РНК из нечени крыс и зародышей пшеницы метили радиоактивными предшественниками в присутствии 150 мкг/кг актиномицина Д для подавления синтеза ядрышковой РНК, выделенные ядра инкубировали с 0,1 мМ алкалоида при 0°С в течение 15 мин для связывания алкалоида, затем при 20° - 20 мин с добавлением 6 мМ АТФ и цитоплазматического экстракта для выхода инфор-мосом. Затем из ядер депротеиниэацией в системе фенол-хлороформ выделяли РНК и анализировали седиментационные свойства и функциональную активность. Результаты этих экспериментов приведены на рис. 16. Основная часть ядерной РНК в этих условиях.представлена в виде материала с коэффициентом седиментации 12-18S, содержит на 3'-конце длинные поли(А) последовательности и способна к трансляции в бесклеточной системе из зародышей пшеницы. Следовательно, в присутствии алкалоида не нарушается процессинг новообразованной РНК, а происходит накапливание "созревшей" мРНК в отличие от контроля, в котором на фоне нормального транспорта выявляется значительно меньшее количество мРНК Таким образом, ингибирование синтеза белков алкалоидом цитизином является следствием значительного снижения выхода мРНК в цитоплазму. Этим,

31

по-видимому, можно объяснить и уменьшение функционально активных полисом, показанное на рис. 13.

В связи с тем, что продуцентом цитизина является растение люпин желтый, представляло интерес изучение влияния алкалоида на аналогичные процессы в клетках собственного продуцента Однако не было выявлено существенных различий в подавлении цитизином выхода новообразованной мРНК из ядер зародышей пшеницы (не продуцирующих алкалоиды) и люпина желтого в составе ядерных информосом. В результате проведенных экспериментов впервые вьщелены и изучены физико-химические характеристики информосом из нового растительного источника - люпина желтого. Показано совпадение свойств с описанными ранее у информосом из зародышей пшеницы (гетерогенное распределение в градиенте сахарозы, плавучая плот-

з

ность в СзС1, равная 1,4 г/см , чувствительность к действию низких концентраций РНКазы, устойчивость к ЭДТА и т. д.), которые являются единственным растительным объектом, в котором они подробно охарактеризованы. Доказательство существования информосом в растениях люпина дополняют данные об универсальности существования РНК в высших растениях в виде информосом.

4. 3. Выделение и изучение физико-химических свойств белков ядерных РНП частиц - информоферов, свободных от РНК Ядерно-цитоплазматический транспорт мРНК является одним из важных участков регуляции экспрессии генома К настоящему времени этот вопрос остается совершенно неисследованным, хотя процессы, происходящие по обе стороны ядерной мембраны (в ядре и цитоплазме), интенсивно изучаются. Известно, что практически вся про-мРНК клеточных ядер входит в состав комплексов с белковыми частицами-информоферами, образуя ядерные информосомы и их мономеры - ЗОЭ частицы(рис. 17а). Инфэрмоферы участвуют в транс-

32

порте информационной РНК, а именно: в снятии новообразованной РНК с матрицы, в последующих ее превращениях, ведущих к образованию мРНК и переносу в цитоплазму. На последнем этапе ядерно-цитоплазматического транспорта зрелая мРНК "переодевается" на ядерной мембране, происходит смена белков ядерных РНП частиц -информоферов, на какие-то иные структуры. Обнаруживаются ли ин-формоферы в ядерных порах, с какими компонентами они взаимодействуют? Для выяснения этих вопросов необходимо иметь белки информоферов, свободные от РНК. Попытки выделить их обработкой зрелых 30S РНП частиц РНКазой, приводили к агрегации белка частиц. Нам удалось обработкой 2 М NaCl 30S частиц из печени крыс достичь диссоциации информосом на РНК и белок, при этом белок остается в растворе. При центрифугировании в градиенте сахарозы основная часть меченного белка седиментировала в виде гомогенного пика примерно с той же скоростью, что и исходные 30S частицы (рис.176). С использованием двойной метки (t12^J)-белка и [14С]-РНК) продемонстрировано отсутствие меченной РНК в зоне 30S частиц (рис. 17в). Анализ этого материала в градиенте плотности CsCl показал плавучую плотность белков информоферов, равной 1,34 г/см3 (рис. 18), не обнаружено присутствия РНК , которая осаждается на дно пробирки (плотность >1,5 г/см3 ). В электронном микроскопе свободные информоферы выглядят как глобулы с диаметром 200 Я, практически не отличимые от исходных 30S частиц. Являются ли информоферы чисто белковыми частицами или после удаления меченой пре-мРНК в них присутствуют другие типы стабильных РНК или ДНК? Плавучая плотность (1,34 г/см3 ), пик поглощения в сахарозном градиенте при 230 нм и отсутствие материала при 260 нм характеризует информоферы как белковые структуры, не содержащие РНК.

33

2000

1000 -

м

имп мин

12000

8000

4000

10 20

10 20

фракции

10 20

Рис.17. Седиментационное распределение в 10-301 градиенте сахарозы: а - ядерного экстракта из клеток асцитного рака Эрлиха, • - радиоактивность Г3 НЗ-РНК; б - свободных информоферов иэ клеток асцитного рака Эрлиха, о - радиоактивность С14СП -белка; в -свободных информоферов из печени крыс,» - радиоактивность,С14С] - РНК; о - радиоактивность, С 12^3-белка.

имп мин 2000

1000

'Г

ю

фракции

20

Рис. 18. Распределение свободных информоферов в градиенте плотности СбС1. Свободные информоферы получали ультрацентрифугированием в сахарозном градиенте, фиксировали 2Х СНг0 и наслаивали на преформированный градиент СэС1 (1,5-1,2 г/см3). Центрифугирование в роторе £>У-50 ( 45000 об/мин, 18 ч, 2° С): 1-радиоактивность [12 ^3-белка; 2-радиоактивность С14СЗ-РНК, 3-плотность СзС1.

При этом каждый информофер состоит из нескольких десятков идентичных цепей информатина. При электрофорезе в полиакрилами-дном геле свободных информоферов после обработки мочевиной в присутствии меркаптоэтанола вся радиоактивность белков обнаруживалась в полосе информатина Важным свойством, информоферов явилась их способность к легкой ассоциации со своей или экзогенной РНК при диализе от 2 М NaCl к исходному буферу. При этом в зависимости от добавленной РНК образовывались либо исходные 30S частицы, либо олигомеры.

Таким образом, при удалении РНК белки ядерных РНП частиц сохраняют высокую молекулярную массу, гомогенность, глобулярную форму и размеры, легко ассоциируют с РНК при обратном диализе. Эти результаты имеют важное теоретическое значение для доказательства поверхностной локализации РНК на информоферах, доступности для атаки ферментами процессинга и обмена на другие белки или включение в неизвестные пока структуры на ядерной мембране. Исследование функции информоферов требует разработки бесклеточных систем, осуществляющих те или иные этапы транспорта мРНК. В настояние время продолжаются работы по моделированию транспорта мРНК из ядра в цитоплазму с использованием ингибитора цитизи-на, белков-информоферов и цитозоля.

5. Синтез и биологическая активность аминокислотных производных колхицина Для ряда алкалоидов с установленный механизмом действия и высокой биологической активностью характерна высокая токсичность, что ограничивает их использование в молекулярно-биологи-ческих исследованиях и практической медицине. Это относится к алкалоидам группы Vi пса (винбластин, винкристин. виндизин) и Colchicum autumale (колхицин, колхамин), обладающим высокой про-

35

тивоопухолевой активностью. Для решения этих проблем ранее рядом исследователей были получены различные химические модифицированные производные колхицина,главным образом при замене метоксигрупп

А-кольца и С-10 метоксигрулпы С-кольца, а также Н-ацетильной группы. К сожалению, в большинстве случаев изменение химической структуры соединения приводило к снижению биологической активности, а в некоторых случаях - к полной потере (Саргаго еЪ а1, 1984). .

Задача этого этапа нашей работы заключалась в целенаправленном изменении биологических свойств путем химической модификации молекулы алкалоида, изучении взаимосвязи структуры и биологической активности синтезированных производных колхицина

Для химической реакции колхицина с аминокислотными остатками и белками предварительно синтезировали ряд химических модицифицированных производных колхицина путем нуклеофильного замещения его С-10 метоксигруппы на аминогруппу глицина, и эти-лендиамина (рис.19, соединения II и IV). С целью выяснения влияния природы аминокислотных остатков, связанных с колхицином,' и способа их связывания были синтезированы два класса соединений: 1. дипептидные производные колхицина-путем конденсации колхици-дилглицина со свободной аминогруппой метиловых или этиловых эфиров глицина и др. (рис. 19,соединения типа III); 2. И-заме-щенные аминокислотные производные - путем образования амидной связи между аминогруппой И.р -аминоэтиламиноколхицида и карбоксильной группой И-ацилированных глицина и др. (рис.18 соедине-

36

ннсосн,

снз°Т Ц

в 3 '

КН0 СНСООВ» СН3°

■кнсосн,

KHCHjCOOH

II. Колхицкиилгдидан (ColGlyOH)

3

I.Колхицин

R

hechgcohhchcoor1

III. Лкпептицные производные колхицина

1.ColGlyGlyOEt 5-ColGlyTyrOSt

2.ColGlyLeuOMe 6.ColClyPheOMe

3.ColGlylLeuOEt 7.ColGlyTrpOMe

4.ColGlyValOEt 8.ColGlyGluOEt

•HHCOCH,

m^cHgCHjira 1У. N, /J-Аминоэтиламино-

колхецид1

(FUcNH^HCONHCHgCHjHH в

У. N-Ациламинокислотные производные колхицина

Рис.19 Схема синтеза производных колхицина

ния типа V). Продукты реакции очипэли жидкостной хроматографией на окиси алюминия и силикагеле. Структуру полученных соединений подтверждали электрофорезом, ЯМР и УФ-спектроскопией. В УФ области спектра для колхицина характерно поглощение с двумя максимумами при 248 и 352 нм (рис.20). Замена С-10 метоксигруппы

Рис. 20. УФ-спектры колхицина (1), колхицидилглицина . и ди-пептидных производных колхицина (2).

на алкиламиногруппу проявляется смещением максимума поглощения при 352 в сторону длинных волн и появлением плеча при 372 нм и нового максимума при 408 нм.

В ЯМР-спектрах соединений II и IV присутствовали все сигналы, характерные для колхицина, кроме сигнала С-10 метоксигруппы при 4.08 м.д. Сигналы С-1, С-2 и С-3 метоксигрупп и М-ацетиль-ной группы остатка колхицина в этих соедиениях наблюдаются в виде синглета при 3,71, 3,89, 4.03 и 2,11 м. д., соответственно. Сигнал протона при С-4 проявляется при 4,60 м.д. Суммируя эти данные, можно заключить, что в ходе химической реакции основное ядро алкалоида не нарушается, сохраняются все три метоксигруппы А-кольца алкалоида и И-ацетильная группа и сопряжение А- и С-колец. УФ-спектры дипептидных и Ы-ацилированных производных были

38

одинаковыми и не отличались от спектров соединений II и IV. В ЯМР-спектрах соединений типа III и V все основные сигналы были идентичны таковым соединений II и IV. Дополнительно к этим сигналам в спектрах метиловых эфиров дипептидных производных наблюдается сигнал эфирной метоксигруппы при 3,61 и 3,81 м. д в зависимости от природы аминокислоты. Сигнал эфирной этоксигруппы в соединениях 1,2,4,8 (тип Ш), проявляется при 4,18 м. д. в виде квадруплета и при 1,31 м. д. в виде триплета Сигналы ацетильной группы остатка аминокислотЬ в соединениях типа V проявляются при 2,04 м. д. в виде синглета Сигналы ароматических протонов остатков триптофана, фенилаланина и тирозина наблюдаются в интервале 6,70-7,60 м. д. Эти данные подтверждают, что полученные соединения являются аминокислотными производными колхицина с общей структурой III и V (рис.18). Биологическую активность производных колхицина определяли на культуре клеток мышиной миеломы, HeLa и СНО в среде DMEM (Sigma) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка по их способности ингибировать включение (■'ш-тими-дина в ДНК (Вилсон и др. 1989). Результаты, приведенные на рис. 21, свидетельствуют о том, что дипептидные производные колхицина с одинаковой активностью ингибировали синтез ДНК в клетках мышиной миеломы и HeLa Однако дл# клеток СЮ для такого же эффекта потребовалась в 10-15 раз более высокая концентрация этих соединений. Цитотоксичность дипептидных и N-ацилированных аминокислотных производных зависела от природы аминокислотного остатка, спиртовой компоненты, образующей сложноэфирную группу с пептидным остатком, и от способа связывания алкалоида с аминокислотой. Наибольшей активностью обладали метиловые эфиры колхицидилглицилтрии-тофана (ИД^д- 0,8 х 1СГ?) и колхицидилглициллейцина (ИД50- 0,25 х 10 Изспрог.иловый эфир колхицидилглицилтриптофана (ИД.0,8 х

39

- 1« с, и

Рис. 21. Цитотоксичность дилептидных производных колхицина на клетках а) мышиной миеломы и б) ОНО. 1-колхицин, 2-СоШ1уОН, 3-СоШ1уТгрОМе, 4-СоШ1уЬеи0Ме, 5-Со161уШу0ЕЬ.

10"5) оказался на порядок менее активным, чем метиловый и этиловый эфиры того же соединения (ИД50- 0,8 х 10~7 и 1,1 х 1С-7, соответственно). Н-Ацилированные аминокислотные производные колхицина, несмотря на достаточную аффинность (25-40%) этих соединений, оказались менее активными, чем эфиры дипептидных производных колхицина Значение ИД50 для этих соединений были выше 1 х 10"6 М.

Известно, что в основе молекулярного механизма действия колхицина лежит аффинное связывание его с тубулином, что приводит к нарушению полимеризации тубулина в микротрубочки и деления клеток. В литературе имеются данные о прямой зависимости цитото-ксичности и аффинного связывания химических производных колхицина и его природных аналогов (Вгозз1 еЬ а1, 1983; ОишопЬ еЪ а1,1986). Для дипептидных производныфх колхицина такой зависимости не наблюдалось. Несмотря на большую аффинную специфичность Со161у61уОЕЬ и СоШ1уУа10ЕЬ по сравнению с другими производными значения ИД5()

40

1тих соединений были на порядок больше Со161уТгрОМе,Со161уЬеиОМе. 1рирода сложноэфирной спиртовой группы в соединениях Со161уТгрОМе, :оШ1уГгрОЕЬ и Со161уТгр01рг не влияет на их аффинное связывание 28,32 и ЗОХ, соответственно),хотя по цитотоксичности метиловый и >тиловые эфиры были на порядок более активными, чем изопропиловый ¡фир. По-видимому, такая разница в цитотоксическом действии связа-га с какими-то дополнительными факторами, обусловленными струк-•урной особенностью последних.

Таким образом, разработанные нами способы модификации кол-:ицина и изучение физико-химических и биологических свойств его 1Минокислотных и дипептидных производных показали, что введение ютатков различных аминокислот и пептидов в структуру алкалоида юзволяет целенаправленно изменить его свойства На их основе ¡ыли синтезированы иммуноконъюгаты,обеспечивающие направленный 'ранспорт колхицина в опухолевые клетки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования по поиску новых высокоэффективных ингибиторов :интеза макромолекул, проведенные в настоящей работе, позволили швить ряд новых соединений, которые существенно расширили име-ицийся к настоящему времени набор ингибиторов для эукариотичес-мх организмов. Установление механизмов их действия позволяет юпользовать в дальнейшей работе для изучения регуляции синтеза ажнейших соединений в клетке - белков и нуклеиновых кислот.

Для кофеина и гомохаррингтонина получены новые дополнитель-ые данные о молекулярных основах действия, что позволяет ис-ользовать их целенаправленно. Существенно более сильное дейс-вие на синтез РНК, чем описанное ранее в литературе ингибирова-ие синтеза белка, показано для ликорина.

Низкая концентрация, при которой проявляется сильное ингиби-

41

рующее действие (10~7- Ю-0 М) в клетках растений и животных, а также отсутствие токсичности позволяет рассматривать его как перспективное соединение для изучения синтеза РНК, особенно в опытах in vivo.

Значительное внимание в работе было уделено действию алкалоидов на различные этапы синтеза белков в растениях (трансляция мРНК, функциональная активность рибосом, транспептидация и др.).

Наши предположения о возможном участии алкалоидов в регуляции внутриклеточных процессов в растениях-продуцентах нашли подтверждение в экспериментах по отсутствию ингибирования прорастания семян, синтеза белка и функциональной активности рибосом зародышей люпина с высоким содержанием алкалоидов. Эти данные следует рассматривать как один из первых этапов изучения проблемы устойчивости к токсинам на молекулярно-биологическом уровне и видоспеци-фическом действии алкалоидов.

Реализация идеи полностью бесклеточной биотехнологии сталкивается с проблемами повышения эффективности бесклеточных систем трансляции, необходимости специфичных ингибиторов отдельных стадий. Вместе с тем, такие бесклеточные системы сами по себе являются мощным инструментом в изучении молекулярных механизмов реализации генетической информации в живых клетках.

Регуляция генной экспрессии не ограничивается транскрипцией и процессингом про-мРНК. Она может происходить на этапе ядерно-цитоплазматического транспорта мРНК, на уровне трансляции и, наконец, путем контроля жизни белков. Транспорт мРНК из ядра в цитоплазму является одним из важных этапов регуляции экспрессии эу-кариотического генома До сих пор остается неясным, каким образом осуществляется выход мРНК из ядра в цитоплазму. Какое участие принимает в этом процессе ядерная мембрана, как происходит обмен

42

ядерных белков - информоферов с цитоплазматическими белками? Возможно, что алкалоиды и белки информоферы в сочетании с бесклеточными системами, позволяющими моделировать эти процессы, будут способствовать расширению наших знаний в этой пока недостаточно изученной области регуляции биосинтеза белка.

Получены прямые данные, подтверждающие постулированную ранее структурную организацию ядерных РНП частиц, содержащих про-мРНК. Возможность получения информоферов в свободном состоянии без нарушения структуры, равно как и легкое присоединение РНК к белку при удалении диссоциирующего агента, указывает на поверхностную локализацию про-мРНК. Учитывая, что длина цепи РНК, приходящаяся на один информофер (3000-4000 I), намного больше, чем окружность информофера ( 6Q0K), можно допустить, что РНК делает несколько витков около одного информофера Что дает подобная организация РНП-частиц, в чем ее биологический смысл? Во-первых, резкое сокращение линейных размеров вытянутой РНК. Во-вторых, доступность всей молекулы РНК ферментам процессинга и разным ре-гуляторным факторам, облегчению созревания мРНК.

ВЫВОДЫ

I. Впервые проведено широкое сравнительное изучение действия алкалоида на 'синтез макромолекул в эукариотических клетках. Выявлены селективные ингибиторы синтеза белка и нуклеиновых кислот.

И. Изучены молекулярные механизмы их действия. Показано, что:

1. нарцеин является ингибитором донорного сайта пептидил-трансферазного центра 80S рибосом. Связывание с ним алкалоида блокирует взаимодействие пентануклеотидных субстратов с донорным гайтом, что приводит к нарушению транспептидации;

2. гомохаррингтонин не влияет на неэнзиматическое и eEF-lX-зависимое связывание Phe-TPHKphe, но практически полностью подав-

43

ляет синтез дифенилаланина и образование N-ацетилфенилаланид-пу-ромицина. Сайт связывания алкалоида совпадает с акцепторным участком ПГЦ 80S рибосом;

3. в основе действия хинолизидинового алкалоида матрина лежит ингибирование реакции образования пептидной связи;

4. алкалоид ликорин подавляет активность РНК-полимеразы II, кофеин - ДНК-полимеразы ß.

III. Выявлен ингибитор ядерно-цитоплаэматического транспорта мРНК-алкалоид цитизин. Показано, что:

1. алкалоид не влияет на синтез ДНК, РНК, трансляцию и. про-цессинг мРНК, но блокирует выход мРНК в цитоплазму эукариотичес-ких клеток;

2. ядерные мРНК в клетках растений с высоким содержанием алкалоидов находятся в составе информосом.

IV. Впервые разработан способ выделения белков ядерных РНП-частиц, - информоферов, свободных от РНК. Изучение их свойств подтвердило локализацию РНК на поверхности белковых глобул.

V. Показана избирательность действия . алкалоидов на функциональную активность рибосом не только про- и зукариотических организмов, но и внутри видов растений, продуцирующих и непроду-циругацих алкалоиды. Возможно, что резистентность рибосом из продуцента алкалоида наряду с другими факторами лежит в основе малоизученных вопросов устойчивости к токсинам и взаимодействия растение-растение (явление аллелопатии).

VI. Синтезированы аналоги колхицина, модифицированного пептидными остатками. Выявлены некоторые закономерности - структура. : активность. Молекулярный механизм их действия связан с адсорбцией на тубулине и различной степенью проницаемости через клеточные мембраны.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Луканидин Е. М., Кульгускин R Е , Айтхожина Н. А., Комароми Л., Тихоненко А. С., Георгиев Г. П. "Ядерные рибонуклеопротеи-ды, содержащие информационную РНК. 10. Выделение свободных информоферов и их свойства" (1973) Молекулярная биология, 7, 360-367.

Самарина 0. П. , Просвирнин Е Е , Айтхожина Н. А. "Ядерные РНП, содержащие про-мРНК Природа частиц, содержащих Б'- и З'-кон-цевые структуры" (1979) Молекулярная биология, 13, 192-204. Айтхожина Н. А., Долобаева С. К. , Клышев Л. К. "Влияние анабазина на синтез макромолекул" (1984) Известия АН КазССР, серия биол., 4, 13-16.

Ajtkhozhlna N. A. "Inhibition of translation by alkaloid narcelne" (1985) In: Communications of Third International Conference on Chemistry and Biotechnology of Biologically ActIvbNatural Products, Sofia, 4, 116-120. Ismgulova 6. A., Ajtkhozhlna N. A. "Incorporation and biotransformation of alkaloids during incubation with wheat embryos" (1985) In : Communication of Third International Conference on Chemistry and Biotechnology of Biologically Active Natural Products, Sofia, 6, 465-468.

Айтхожина H. A. , Туебаева P. M. "Влияние алкалоида матрина на синтез белка" (1986) Тезисы докладов и стендовых сообщений V Всесоюзного биохимического съезда. Киев, т. 2, 3-4. Туебаева Р. М. , Долобаева С. К., Клышев JL К., Айтхожина Н. А. "Сравнительное изучение действия хинолизидиновых алкалоидов на синтез белка и РНК" (1986) Известия АН КазССР, серия биол. , 3, 33-37.•

8. Ajtkhozhina N. A., Ismagulova G. A. "Informosomes release from plant cell in the presence of alkaloid" (1986) Abstracts of 18th FEBS, West Berlin, 161.

9. Ajtkhozhina N. A., Takenov Zh.A. "Informosomes from Lupinus llteus" (1988) In: Biology of lupins (ed. T.Twardowskl), Poznan, 646-650.

10. Ajtkhozhina N. A.. Ismagulova G. A. "Cytisine Inhibition of informosome release from wheat embryo nuclei" (t908) FEBS Letters, 234, 181-184.

11. Айтхожина EA. "Действие кофеина и его аналогов на активность ДНК-полимераз" (1988) Вестник АН КазССР, 10, 59-63.

12. Ajtkhozhina N. А., Tujebaeva R. М., Ismagulova G. A. "Alkaloids as molecular tools for study of gene expression" (1989) Abstracts of Second Bilateral Synposlum USSR-USA "Structure of Eucaryotlc Genome and Regulation of Its Expression", Tbilisi, 46.

13. Takenov Zh. A., Lydvicova E. C., Ajtkhozhina N. A. "Immunochemical study of proteins extracted from Lupinus luteus seeds during imbibition and germination" (1989) Abstracts of Physico-chemical Biology and Biotechnology", Alma-Ata, 93.

14. Есболаев E. 0. , Александрова Л. А., Айтхожина H. A. "C-10 дипеп-тидные производные колхицина" (1989) Химия природных соединений, 1, 91-95.

15. Esbolaev Е. О., Tojbaeva К. А., Ajtkhozhina N. A. "Structure and cytotoxicity of dlpeptlde derivatives of colchicine" (1989) In: Proceedings of Fifth International Conferense on

Chemistry and Biotechnology of Biologically Active Natural Products, Varna, 2, 184-188.

16. AJtkhczblna N. A. "Interaction of narceine with 80S plant

и

ribosomes" (1989) In: Proceedings of Fifth International Conference on Chemistry and Biotechnology of Biologically Active Natural Products, Varna, 4, 407-411.

17. Есболаев E. 0. , Тойбаева К A., Айтхозшна E А. "Цитотоксичес-кая активность дипептидных производных колхицина" (1989) Известия АН КазССР, серия биол., 5 , 83-86.

¡8. Ajtkhozhlna N. А., Ismagulova (1 А., Takenov Zh. A. "Lupin alkaloids as inhibitors of translation in plant cells" (1989) Abstracts of International Symposium "Regulation of Translation", Riga, 26.

19. Ajtkhozhlna N. A. "Action of Cephalotaxus harringtonla alkaloids on protein synthesis in plant cells" (1989) Abstracts of 19th FEBS, Rome, 332.

JO. Такенов Ж. A., Клышев Л. К., Айтхожина Е А. "Биосинтеа и молекулярные основы действия хинолизидиновых алкалоидов на синтез макромолекул" (1989) Вестник АН КазССР, 5, 54-62.

21. Esbolaev Е. О. , Ajtkhozhlna N. А. , Alexandrova L. А. , Kondratjeva N. "Synthesis amino acid derivatives of colchicine and their cytotoxicity" (1989) Abstract^, of IXth Soviet-Indian Symposium on the Chemistry of Natural Products, Riga, 74.

12. Айтхожина H. A., Исмагулова Г. А. "Действие цитизина на транспорт мРНК в цитоплазму эукариотических iслеток (растений и животных)" (1989) Молекулярная биология. 23, 1124-1129.

¡3. Tujebaeva R. М. , Graifer D. М. , Karpova G. Q. and Ajtkhozhlna N. A. "Alkaloid homoharrlngtonine inhibits polypeptide chain elongation on human ribosomes on the step of peptide bond formation" (1989) FEBS Letters, 257, 254-256.