Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гомохаррингтонин - селективный ингибитор элонгации полипептидной цепи на рибосомах эукариот
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Гомохаррингтонин - селективный ингибитор элонгации полипептидной цепи на рибосомах эукариот"
АКАДЕМИЯ НАУК КАЗ ССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И БИОХИМИИ Ш.М.А.АЙТЗИДМНА
На правах рукописи
УДК 547.217.94
ТуеОаева Роза Мухтаровна
Гомохаррингтонш - селективный ингибитор элонгации подшаптидной цепа на рбосомах вукариот
03.00.04 - Впохимия
Автореферат диссертации на соисканш ученой стопопи кандидата биологича скях паук
Алма - Ата, 1990
Работа выполнена в Институте молекулярной биологии в биохимии ии.и.А.А&тхоишп АН КазССР.
Научный руководитель!
Кпдидат биологических наук H.A. АЙТХОЖШЦ
Официальные оппоненты: доктор химических наук
профессор . А.А.Краевский
кандидат биологических наук Н.Г.Филимонов
Ведущая организация - Институт ядерной физшш
км.Б.П.Константинова АН СССР
ЛУ " декабря 1990 г, в
Защита состг-ттся * ЯТ " декабря 1990 г, в м часов на заседании Специализированного совета К 008.22.01 ш садите кандидатских диссертаций, при Институт молекулярной биологии и биохимии Им.Ы.А.АПтхоадша АН КазССР Ш адресу* ¿80012, Алма-Атп, ул. Мичурина 86.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан * Ноября 1990 г.
Ученый секретарь Специализированного ,
совета, доктор биологических паук Z^^ ^ р.М.кунг-^ва
Актуальность проблема. Проблема биосинтеза бежа на рибосомах составляет одну целтрзлышх задач колекулятмай биологии.В основе этого ггрсассса леют иелий.ряд есзикодсЯотвйй компонентов аппарата трансляции о рибосомой. Наряду с разработкой различных кодольных ожстом. позволяющих изучить определенные ставки трансляции, больиое значение приобретает выявление я исследование селективных ингибиторов белкового синтеза, так как их 1.ополы*сванио лаот возможность остановить динамический процесс трансляции на определенной стадии к исследовать ф^шециональпоо состояние взаимодойствукапх компонентов. Важными инструментами в исследовании механизмов белкового синтеза бактериальных скотом стали антибиотитки. В настоящее время для прокариотов существует почти полный набор ингибиторов, которые с больней или меньшой степенью эффективности позволяют остановить любую стадия трансляции. Основным недостатком известных сс итоний являемся ограниченная возможность их применения в эукаристичег'сих системах. Вместе с тем, в литературе документироьаш сведения об использовании в этих целях таких биологически активных всаеств как алкалоиды, токсина, флзвонопды и др. Среди алкалоидов выявлены ингибиторы биосинтеза белков, однако по всо они сочотают достаточную активность с высокой изблратольпостьи. Поэтому отп соединения не нашли широкого пркмопогог г. исследовательской практике. Кроме того, использование алкалоидов в пнгибиторпом анализе затруднен.- из-за недостаточности пааих знаний о молекулярных основах их дойствия. Алкалоид:;, выявлошшо как ингибиторы белкового синтеза, изучались в таких системах трансляции, которые дают возможность г -лучить только качественный результат. " настоят,ому вромоии разработали высокоэффективные модельные системы с использоваг~ем активных рибосом, индивидуальных препаратов тОТС, факторов трансляции, позболяшио на количественном урезне оцепить функциональное сог, ,-ол;г/1 рибосомы, котор л являотся главней кгавоньв длт многих ингябаторов трансляции. Поэтому исследование молекулярных механизмов действия алкалоидов и использование их в инптбиторном анализе кшеромолекул являотся актуальным и составляет важны» этан на пути к познании механизмов регуляции экспрессии эут:ариот1тчзского гонома.
Цель работа. Цель настоящей работы состояла в проведения
пкрлнпнга алкал,- ;жи для выявления соединения, обладающего выраязгшум дгЯсткмм ж» Споскнтсо белков и изучении механизма его дсйствкя с использованием боекдаточшя и модальных систем трансляции.
Научная новизна. Внсрзцз проведено систематическое. иссладосапкс влияния алкалоида гомохаррипгтепша на злонгацизо пэлппс,т,гкдпсй цепи, катадпяруокой рибосомами на распит обьоктог: Гнсчони кролика, плацзнтц человека, E.ooli, д^ошей, г>г.г^,лиг,;0к тоники) к кг-чел механизм ого действия,котсрий от^т-частся в солоктпвпо;,; подавлении стал/л транспоптидашк. О кепользеватази сскромгншшс непопулярно-биолмичоских методов показало, что алкалоид по влиязт па нсопзиматичоокоэ и КМа-заБисимое связивашо ИНДИВИДУОЛЬКОЙ rho-TPI2(rho с 803 рибосомами, но практкчоска полностью блокирует синтез ди.*л;шлалап;ша и образование ацетилф01щлаланил--пуромищта» 1!риорктотнш , '^ультатом работа являемся доказательство отсутствия влияния данного алкалоида на функциональную актив -ностъ 703 рибосом E.ooli. Впорвпо показано, что алкалоид конкурирует с пуромшншем " сайт го связывания совпадает или пора laucar -ся с акнептерпцу, участком поптидолтрансферазного центра 803 рибосома. Впорвио с помошыо оксповимонталыкх данных н математических истодов опрошена константа ого ассоциации с ö03 рибосомой чолоеокз.
практачоскоя цожост. , lio прямого гомехаррингтогеша раз.шастан обкпй подход' к изучение ингибиторов трансляции. Виявлон еллектпвнкй ингибитор адоптации подипептидпой нога по рибосомах эукарист, которвй рекомендован в ' качестве молекулярного инструмента для рс5:пая srpoitoro круга вопросов, связанных с изучвшим биосиг.тооа полапоктмдоь на рибосомах. Данине овнеокей ¡шгибирувдсЯ активности биосинтеза Солка алкалоидом в нормальных тканях, по-пашому много:», слодуот учитывать в практической медицине. Это свидетельствует о fbspiOcth и необходимости изучения механизмов действия биологически активных «¡одинокий но только в &ушшмонталышх исследованиях, ко и в практических целях.
Апрпбпнш; работы. Продотавлошшо в диссертации результат докладывалась на v всессэопом биохимическом егоз до (Кклв, 1900), могщународпгч симпозиуме по регуляции трансляции (Рига, 1039), республиканской кг.пйоренции "Актушнлмо проб-м-и
З&зико-хгоотческой биологии и биотехнологии" (Ал?.;а~Ата.1Э83), II двустороннем совотско-оморккапском симпозиуме • "Структура эукаристического генома и регуляция ого экспрессии" (Тбилиси,
1989), X двусторонней совотско-французском симпозиуме "Организация и экспрессия генома зукарист и прокатает" (Кисе,
1990) и опубликовали в 3 статьях.
Объеи и структура работы. Диссертация содорзтт . НО страниц машинописного токста.Б таблиц и 17 рисунков. Диссертация состоит из "Введения", "Обзора литературы", "Мзториалов и методов", "Гезультатов и их обсуждения", "Выводов". Список литературы включает I3S названий.
Обзор литература- Приводятся литературные данные о функциональном состоянии рибосош в нроцоссэ элонгации и влиянии некоторых ингибиторов на плантацию полипоптидной цопи. Экспериментальная часть. В раздело "Материалы и методы" описывается методики, позволягаяо провести . отбор алкалоидов, япгибирукшх биосинтез белсов в зародшзх псониш и возможности Окотрапсформопш алсалспдов ■ в клетке. Описаны методики трансляции поли(и) 700 и 80S рибосомами, выдоления функционально активных рибосом человека и их субчастиц, препаратов високообогащенпых PhQ-TPHKpho, AoPhe-TFHKPhs. Особоо внимание удалено выбору условий и проведении исследований по изучению влияния гомохаррипгтонинс! па фугоцпопаг пув активность рибосом в модельных системах: в матрично-завчеимом связывании индивидуальной Fhe-TPHKPho, синтезе ацетилфенилалашм-цуромици-на и дкфекилплшепю.
Результата н их обсуждение. Определения объекта ,д условия скрнизига алкалоидов, обладаивдх выраженным действием па биосинтез беякез in viro.
. Било испытано более 50 соединений, относящихся к различным группам алкалоидов, их аналогам и производным. Из широкого круга проблем m выбрали изучение ' действия алкалоидов ' на .биосинтез бедная. Первоначально пр''золили поиск алкалоидов, которые подавляют биосгаггоз белков in vivo, по по влияют па синтез ГЖ и ДЯК. .Исследования проводили на прорзстоютх зярояняах пгаениш сорта "Казахстанская-126". Били определены оптимальнее время включения радиоактивных предшественников ГЧП-уридиип, Лп-тимидила. {14СЗ-лейщтз (30 мин, 3 часа и 40 мил, соответственно). концентрация и время дойстш" я-тнтуомых
- б -
соединений. Одним из важных моментов, которые оледуе? учитывать при изучении действия алкалоидов ln vivo, является возмоянооть их бистрансформаши внутриклеточными оксидсрадуктазами и други.г.1 системами. Показано, что за короткие промежутки времени синтеза ГШ и белков з экспериментах in vivo но происходит расцепления алкалоидов, что позволяет отпасти наблюдаемые аффекта за счет дпйствйя исходных соедаошй. В результате первичного скрининга ' была еыявлош алкалоиды, подавляющие* Сиосинтео белков в опытах на прорастающих зародышах шэпицц. Из проверенных соединений только 16 аисалсздов обладали различной степенью ингибирования в системе in viro. Наибольшой активностью, как показано на рисЛ, отличались матриц, цатизип, гемохаррингтонпн. Последний практически полностью шгибирует биосинтез белков в прорастаиища аародыдах ппопицы.
Алкалоид цитизии, как било показано в пашой лаборатория, ингибйрует синтез белков,блокируя выход новообразованной РНК па " ядра в цитоплазму а -оотаво ядерных ркбонуклвопротеиднш: частиц. Изучаемые алкалоиды на влияла яа стабильность полисом. Их действие сравнивали с пирокатехолоа-шгибйтором ишшиащш» й результате действия которого происходит ИШСШШВанйэ 803 табосом. Большая часть радиоактивной метки находилась в соояавэ полисом, что свидетельствует о стабильности полисом, шдолэтш; нз зяро.'ряпей пшенмда, обработанных алкалоидами й контрольны*.
%
РпсЛ.Влияшо различных концентраций алкалоидов на синтез болзеов! Í- контроль,2 - и-оксад «атряна, 3-цитизин. 4 - матркп, Б - гомохаррипгтонин.
.„I , , ,1 , , л,--- .1—
о tú Ю* ¡0'* >й~* агммий. М
Влияние некоторых алкалоидов па синтез пояапсатидов 1п '.-и; ..
В результата проведенного поиска сроди алкалоидов, которыо существенно подавляли биосинтез балков и прорасти«яя:х вародадах Ш9ШШЫ, наиболее порспоктигпцмп ¿ля далшойксго анализа Сила определена алкалоида, представленные в табл.лю I. С использованием бвсклотсчинх с я с тс;.; трансляции Сил;: виявлопп наиболее фехтиппис ингибитор:: синтеза полппспг.шое, В таблице I суммированы результата сгсряпяпга алкалоидов, сбдздзязях паиболео выраженным действие;« на эндогенный синтез нолипоятадоз п лиаато ро-тккулопктоз кролика. В качестве :юптро«я (здесь и в псслодугаких экспериментах) использовались пробы. без алкалоида. Видно, что нэфалотакскн, гомохаррипгтеннп, пссвдоофодркл, сокурапип, каф-феин. тацэттип. пахикоряип, при концентрациях порядг.а ТТ"4 м более чем 50" аь.л:бировали эндогенный сиптсз подмпоптидоп. Эти данные согласуются с результ: "змп, полумягки для пвкото-р;г7 из них г, рас-тзу других авторов. Тот;. тонеттнл-аналог сру-тацеттиня (семейство АтагуШЛлссас). блокировал подипоптшдшй синтез при трансляций кГИК вируса зпдсмиокзр.й:та (Ляюпоз с4» а1.,197б). Пгтгклрпип.зхипспспп, сокуриташ ьлорвне асслодова-лкст. п иакоЯ работа. Пахикарпяп проявлял активность при достаточно внеокой .-.опцонтраикк, которая, пс-ависму мнении, выходит за продели Физиологической н-тни. Например, при концентрациях Порядка 10 "м алкалоид подавлял трансляция всего на 22%, а выраженное тайстпиэ проявлялось при ТО"11 М. Хпнслизи. лпевыо алкалоиды атггуотпфолип, дунзнил я группе которых относится и спяртеин-сульФат, иктибирозади ЕР-1 -зависимое связывание амина--зцил-тГШ с 005 рибосомами паыгглу (Хогсз с* а;., 1937). Но в дотаем слу-ле подобного действия алкалокдоз но наблюдается.
Матри:, который такяэ принадлежи™ к хгтоДйзигшотм елка лоидам, по ккпкйгрует синтоз полапептидов па глобипозей матрице. П то да время алкалоид педоздглт- трансляцию мПЕС паруса тп..с-,ч;;гЛ мозаики па 532 копиоптрашм Й^Ю-4 М. Атлогичппе рэлультлта получо№ л йосклеточнс''' система трапелтшй на пя-тстичлотсой пол;:(и)-матрино (таблп;з 2). Алкалоиды. «стерло болел члм ил Г^о« плтгг.пллл;; пндоттапыЯ с:п;тсз полипоптсшоп при концентрациях, анализировались в Сесклеточной спот-тмл синтеза пслк&1п1лсла1н:т:а на 803 рибосомах человека
ТАбЛЩЛ 1.
скрининг алкалоидов, обладающих вырахошш действием на синтез полипептидов в лизатв ретикулоцатов кролика.
ВКЛВЧЗШО (14С]ГЙе
имл/мин
алкалоид
контроль 0
матрин 2хЮ~7
2х10~~4
спартеин- 3x1
сульфат ЗхЮ~4
цефалотак- 2х1Г'7
син 2хЮ~4
гомохарринг- 1.ШО"7
тонин 1,бхю~4
галантин ю-7
ю-4
лупашн ю~7
ю-4
псевдовфед- ю-7
рш ю-4
секуриаий Ю-7
Ю-4
триакантин ю-7
ю-4
эхянопсин ю7
ю-4
тацоттий 10~7
ИГ4
кпффеин Ю""7
концентрация (Ы>
63 800 60 063
63 400 68 800
45 690
46 700 26 900 II 800
4 650 ,48 800 44 ООО 62 500 66 300 60 600 33 200 БЗ 780 30 740
64 860 41 460 Ы 570 60 200 43 200 30 220 39 ООО
X от контроля
продолжение таблицы I.
I 2 3 4
ю-4 21 400 34
пахикарпин Ю'7 50 ООО 78
10' 4 II 100 17
хо-3 8 400 13
и зародышей гапеници. Для этого получали фракционироЕапшо системы (sICXj), не содэряащис эндогенных матриц и рибосом, вносили поли (О) я высокоочищошше рибоссмы. Розультаты суммированы в таблице 2. Из данных таблица видно, что матриц не оказывает влияния на поли Ш)-зависимый синтоз полкфонилалашпт на 80S рибосомах- человека, одновременно существенно ипгибируя элонгацию на 80S рибосомах зародышей пвюпвцц. Этот факт сам по себе имеет важное значение и указывает па тошшо различия рибосом из растений и млотопктаизих. Тагам образом, из всох представленных на таблице алкалоидов, паиболое вырзгопшм действием на синтез полипоптидов обладает гомохаррингтонин. Он сочетает высокую избирательность с . достаточней эффоктив-йостью и ингибирует синтез полипоптидов как нт рибосомах растений, так и на рибосомах млекогмташих. Поэтому для нас наибольший интерес представляло изучение моханизма действия гомохаррингтошяа, Данные по действию которого представлены ниже. л
Йзучениа моханизма действия гемохарршгтоншм.
Влияние гомохаррингтонина на элонгацию полипоптадаой цепр.
На рис.2 представлены данные по влиянии гомохаррингтонина я родственного ему алкалоида цефалотаксина на трансляцию г лосиновой MPtíK в бесклвточшй системе лазатов ретинулоцитов кролика. Видно, что оба алкалоида способны подавлять эндогенный белковый синтез, однако гомохаррийгтояин иигибарует трансляцию глолшговых матриц дахе прй минимальной концентрации (
5хЮ~7М),
в то время как цвфалотаксин начинав? заметно йнгибировать при концентрациях ггоряякг, ю-4 М, причем даже при 1 мМ концентрации илгибировяние происходит всего пп 6055. В системе трансляция
- го -
ТАБЛИЦА 2,
Шкяпкс .-.лкалсидов на трансляция цели (и) рибосомами из шшенти человека и зародаой пщогааш.
алкалоид .............. 1 концентрация ■ включение [14clrho, % от контроля
eos человека 80S ш0)ш
контроль 0 reo 100
пахикар- ' 2,2x10"® 25 -
пин 2,2x10"" 17
каффоин 2.0XI0"6 85 61
2,2x10 ^ 78 БЗ ,
г" X ср- 1,6x1^"7 sa 20
рингтон. 1,6x104 ' 17 9
пяфало- 2,exio~G 93 ее
ТйКСИТ 2.GXIO"3 72 54
тацеттин i,cxia~7 L3 70
I.GXIO"4 73 " 53
спартбин CXlO'7 44
-сульфат OXlO-4 ■ S3
катрин IG"7 25
TO"4 85
10 6 - 90
TO"2 32
тал:(т/) рибосомам; человека (рис.2, :гр;и ;я I) шФолотаксшх не проявляет замэтиах кпгибируЕЩГх свойств, т.о. но подавляет трансляции на стадиях шпма элонгации. гомехоррингтоиян апгибируот трансляцию поля(и) как по рибосомах чолосока, так и на рибосомах паонкци (р *с.З, дСривио 2 и З.ссствстстьонпо). Если сравнить кр-.твиэ. продставлсипшо па рис.2 (I) и 3 (2), шю. что ахкало-ип с\"г/ ствекно ингабнруот синтез полнпаптддов п обеих бэсклето-ч:шх системах. В псовом случае алкалоид при концонтрпиях ггорл;р:а о 4 M подавляет эндогоннкй скнтсс ira 92,W, ¡три концентрации ю""'М - на ai .гя (рис.2,кривая I). со втором случае щж коицентшткг to"4 ?.' пиитас пслиаскмалагонш подавляется на 84%. при ïO~\\l па (ркс.з, кривая 2). Результат. получошшо i
система полн(и)-зависимсго синтеза полиФепалзлапипа на рибосома из зародыаюй пзспицы принципиально ne отличаются от вышеизложенных результатов. IIa рис.3 (кривая 3) представлена зависимость синтеза полифепилаланина на рибосомах из зародышей пкенд-цы.В данном случае кривая илгибировапия имеет резко шрагопннй характер и напоминает 1ср;твую I па рис.2. Уровень синтеза в контроле составлял 18 ооо имп/мин, количество ses рибосом в пробе -2,5 пмоль. Результаты согласуются с данными, полученными ранее на рибосомах из ретнкулоцитов 1фоин:а и дроажей (Carraoco ot al 1976), где харрингтогошоБЫо ал:салоиды сушоствспно подавляли полк (и)-завкси-.шй синтез полифонилалашша.
amotwua, M отлоиа.М
Рас.2. Ряс.З.
•Рис.2. Степень включения [14с]фспялзлашшз при трансляции гло-биновой мГШ в лизате рйикулошггов кролсез в присутствии различных концентраций гскохаррипгтонина -I и нефолотаксииа -2. Рис.3, степень включения [14с]фонилзлапипэ в полипептиднув.цопь при трансляции поли(У) 80s рибосомами из плаценты человека (I, 2) и зародышей пшеницы (3) в присутствии разлпчпых концентраций гомохаррингтонина ( Z.3) и цефалотаксина (I).
При изучений механизма действия алкалоида п системе кодон-зависимого синтеза полифепилаланина на 70з рибосомах E.ooli важным оказался факт, что гомохаррингтонйн практически не влияет на функциональную активис т, рибосом из E.ooll. Рис.4 убедительно деконегь.грует, что алкалоид пс ипгибпрует поли(и)--зависимый синтез полкфенилаланипа fia 703 рибосомах пря
участии факторов алонгации нмга и ИМЗ.
Гсмохаррингтсшн такаю на оказывает существенного действия на кодон-зависимую трансляцию в пээнзиаатических условиях, т.э. в отсутствию факторов элонгации. В'данном случае 70а рибосома
Рис.4. Кинетика по.»;tu)-зависимого синтеза полвфепилалаяина ш 705 рибосомах в. od 1 в присутствии факторов элонгации EP-Tu и ( в контроле I и в присутствии гомохаррингтошша 2. Рис,5. Кинетика поли(и)-оависимого синтеза пол-лфешлаланива рибосомами E.ooli в отсутстсие факторов элопгации.
Суммируя результаты, изложенные в данном разделе, можн заключить: I) гомехзрркнгтошш аффективно шггибирует сипта полипептидов, катализируемый 80S рибосомами человока, пшеницы 2) гомохпррингтипш но подавляет оштез полифопилаланина на 7С рибосомах из E.ooli.
Влияние гомохаррингтонниа на кодон-зашешов связывание mato-авд ¡-тРНК с 705 в воз рибосомами. Известно,ч о порвячшм механизмом подавления синтеза полипептидов для многих специфачесю ингибиторов, в том число и алкалоидов, являотся блокирование одного из тИШ-связыващих центров рибосомы, Одним из главных условий д"я проведения таких экспоридантов являотся иьличив индивидуальной тИЕ и функционально гатшпих рибосом. Простев шей модель» для ¿соличествэнного опредологам фупзсционалыюй ак лшности рибосом является связывание амипоацял- или йэптйдеЛ-тРШ в А- и P-cafiiax рибосомы а присутствий соотвотствуицей матрицы в шютичоиш-раввовосных условиях.
Для "аэнзшатичаского заполпоиия обоих А- и Р- сайтов 803 рибосомы одновременно, ах рибосомы титровали [14с]РЬо-трНК№п в присутствии' поли(и) и з отсутствие факторов трансляции. Связывание проводили при о°с в течение 40 мин. На .рис.6 приведена изотерма адсорбции rI4"]Pho-TPHKFhQ о все рибосомой из плаценты человека. Из, представленных данных видно, что максимальный уровень кодон-специфическога связывания РЬв-тРНКк'в составляет 0,7 моль на моль eos рибосом (рис.6) D условиях насыщения рибосом но PM-TPHKFhe определяли количество образовавшегося дифенилаланина (табл.3).
рве.6. Изотерма адсорбция (uo]№e-tfflttplla на 803 рибосомах человека: I - в присутствии и 2 -в отсутствие поли(и); 3 - в присутствии гомохар-рингтопина.
Из данных, представленных на рис.6 и таблицы 3 видно, что практически все связанные с рибосомами остатка Ию участвуют в образовании дифенилаланина (см. табл.3) Это свидетельствует о том,. что в условиях насыщения по Р1ш~тРНК происходит заполнение обоих сайтов sos рибосом - А и Р практически в равной степени; доля активных рибосом составляет 30-35 %■ ■ На образование дифенилаланина расходуется около 90S остатков Phe ( от общего количества остатков, связанных с воз рибосомами в виде fI4ojPhe -тГШ ). Из таблицы з видно, что гомохаррипгтошт но оказывает существенного влияния на бесфэкторпоо связывание tFHK с 803 рибосомой на обоих сайтах. Эти датшо, получегаше па рибосомах из плаценты человека, подтверждаются результатами зкоппримоптов un воз рибосомах из пячотг кролика и дркжой (таблипя 3).
[Phe-rPHt'J/LeOSI
ТАБЛИЦА 3.
Влияние гомохпррингтоилнв на ноэнзиматическое поли(и)-зависимое связывание f14с ] Р1ш - tHííAFhe с 80s рибосомами к синтез дифешлалшшна, а такта па оКР-1а-зависимоо связывание Phe Ч1ШАГ1г0 в А-сайте 80s рибосом •человека.
Рибосомы, Неэязиматпческое связывание еЕР-1а-зависимоэ связывание
плряботапдао п необработ. алкалоидом
Степонь связывания, МОЛЬ Phü-tWJA^0 па моль рибосом Синтоз (Phe)2, моль (Fha)g на моль рибосом •i 0 еЕ?-1а без еН?-1а
плацента 0,70 0,30 0,30 0,055
человека + 0,56 0,02 0,24 0,05
печень 1,80 0,47 - -
кролика 1- 1,71 0,03
E.noll 1,79 0,72 - -
+ 1,70 0,68
Saooh. 1,64 -
cor. + 1.24
Для того, чтобы учесть влияние ионов Mg2+ па титрование рибэсог в условиях неэпзпматического кодон-зависимого
сплппсатт, CCS рибосомы дроззюй титровались nic-TPHKrhe при 5 пМ и 25 mU концентрации испов Kg2^. Кз данных, представленных в таблице 4 видно, что присутствие ионов мсишя при минимальной л макет/, алыюй концентрации но оказывает существенного влияния на эффект алкалоида.
Влияние гомохаррингтошша издали такие в модельной системе кодон-сшцкфнческого, еЕР-1а-зависимого связывания Иге-тгше71'110 в А-сайте 80S рибосом человока, для того чтобы учос-, j возможность ингибирупвого действия алкалоида через фактор элон-гашш оЕМа или гидролиз GTT. Известно, что eEF-la-зависимое связывание Аа-тГНК происходит в А сайте рибосомы, о ели предварительно заполнен Р-сайт рибосомы попткдо-тИК или доацилиро-оютаюй тГШС. В палей работе для а тих целей использовалась cyiä-
- la -
Таблица 4.
Елияпиэ алкалоида гомохаррингтснипа на связывание [14ШРПе-тШСр'па с 803 рибосомами и с изолированными 403 субчастицамт из дрогаей 2 присутствии Б п-л и 25 вк Ыд"-1.
и2'' (Км)
25
Сбработашше и j необработанные !.. алкалоидом !
Стопсць связывания, моль rhc TPIKrhQ па моль
40S
еоз
0,23 0,20
0,63 О, СО
0,50 0,65
1,60 1,40
Кахдоо значение степени связывания получено из твех незави-с:г,ш ■ экспериментов. .
парная до сталированная тГЖ. Ялы отого рибосомы вначале инкубировали с полиса) и доаиилировзпнсй тГ1И, a затем получали тройной комплекс ог^-1 а. г1î РЬа--тИШИ1е, стр . Оба комплекса смешивали и стиранали связывание Г^сЛРЬе-тРПК1^ в А-сайте рибосома. О таблице 3 приведены результата данного эксперимента пра концентрации алкалоида Ю~4 и. видно (последний ст лбец). что эязииятичвекое связывание токко из подавляется алкалоидом. Тп;.-,-,; образом, р.зудьтатц данного раздела убодительно де-;,;с; .:тр;гг,у;г,т, "то гсксхарриггтсняц по оказывает существенного влияния из ппдиги)- зависимсо связывание Pho-TPHKFhe с 70S я 8D3 рибзег.кпми, как опг.имзтичосксо. ток и в присутствии Факторов злопгоиик. lf.'iG:r результата противоречат данным, полученным ра-h.-,î: па рибосомах ил тепшулецитов кроляса, где алкалоиды из с>-р>л<<-«ихиз liarriiwtonia почта полностью олашровада эиевмати-чегдао и ¡¡г.эпзпматичоское связывание тПК с рибосомами. (Fi-esno
et al.,1977). Вероятно, отлитая результатов обусловлены разными условия'« растворения алкалоидов: в названпей работе алкалогпи в форме оснований растворяли предварительно в диметилсульфокси-де я затом добавляли к рибоссмам. В нашей работо гомохаррингто-нин порзводали в форму хлоргидрата и использовали в буфере.
^¡гнбированиа алкалоидом стадии транспептадацин. Учитывая, что алкаловд не ингибировал сукоствошо связывание тИП( в обоих сайтах рибосомы, а продставленныо результаты указывают на подавление гомохаррингтошшом элонгации полшэптидноЯ цепи, следуктотм этапом исслодовапил было изучение влияния ал1салоида па транспептидацию. В качестве модели образования пстггидной связи использовали: I ) способность рибосом к синтезу дпфзнллаланина ' при одновременном наоазвматичесхом связывании двух молекул РЬе-тИШ1,110 70S и 80S рибосомами; 2) образогùîbio ацетилфанилзлапнл-пуромицина при обработке nypo;.„anniow комплекса COS- поли(и) • AoPhe-TPHK?hB. Результаты по синтезу дифенилаланипа приведены'в таблице 3. Как уже отмечалось ранее, уровень синтеза дифзпшташша на моль рибосом составляет 0,3, т.о. почти 00% остатков Phe, от количества, связанного с рибосомой, вовлечено в образование дипегттида.. В то и время, под влиянием гомохаррингтотша синтез дафенилалагоша блокируется почта па Порядок. Аналогичные результата получены на SOS рибосомах из печени кролика, где синтез дипептида от остатков меченого фенилаланина, связанного с рибосомами составляет 55$. Из таблицы видно, что в данном случае образование пептидной связи > также практически полностью ингибируется алкалоидом.
При сравнений результатов, представленных в таблице 3, видно,что степень связывания, вырахепная в ¡«оль íhe-iPKKPhe на моль рибосом существенно не уменьшается по сравнению с контролем. Из этой ze таблицы следует, что алкалоид на порядок подавляет синтез дифепилалапяна при этих условиях. Наблюдаемое незначительное уменьшение связывания в обоих сайтах рибосом можно объяснять вкладом большой субчастица рибосомы. Как показали дальнейшие исследования, сайт связывания алкалоида перекрывается о в5сцепторпым сайтом на БОз субчастицо.
На рисунке 7 представлены типичные хроматограммы гадролизатов инкубационных смесей по окончапии роакции синтеза двфвяилзланина на 80s и 70S рибосомах человека и E.ooii,
состЕвтстьонно. Видно, что под действием гомохаррипгтошша происходит практически полное шггибированиз синтеза дифенилаланина на рибосомах человека и .отсутствует подавление синтеза дипептила на рибосомах Е.соНЛРис. 7 А и Б)
i ь
■ а л\
il\ 1
■ i U ' • Ц VI Ж
.У&ьлшш... j.
Рис.7. Хроматогрвьш гидролизатов инкубационных смесей по окончании реакция синтеза дифенилаланина яа eos (А) и 70S (Б) рибосомах в системе бутаполгуксуспая:вода (4/1/Б).
Ita рис. 8 показана типичная зависимость ингибирования синтеза дифенилаланина при возрастаидей концентрации алкалоида. Заметный эффект гомохаррипгтонина проявляется при концентрации Ю_еМ и полное ингибировашо достигается при концентрации то-4«.
--JS—------
Рис.8. Зависимость количества образовавшегося дифенилаланина от концентрации гомохаррипгтонина.
amánnua, М
Получению р- зультатц согласуется с дашшми, полученными ранее в лаборатории Вазкоза (Carraaco.et ал.,1973), наблюдавшими ингибированио образования поптидпой связи во фрагмоптарной реакции, гдо в качества минимального субстрата использовался 3--копцобой фрагмонт TPffil - (C)U-A-C-C-A-f%)i0U-A0.
, Ингибируквое действие г; .¡охаррингтошша на транспоптвдациш наблвдалось по только в еистсмо синтеза дифопилалпшша, но и в системе образования ацот1и1фонилалонйл--пуро№Шкнз при обработка ПурОШЦКГОЫ КОМПЛОКСЗ 80С .ПОЛИ{и). AcPho-TPlKrh0. При нолучошш такого комплекса AoPhe-T?ilKrils орали в относительно низкой концентрации, при которой (как било показано рацое в аггалопгчной системе на рибосомах из почош' кролика) свяснваниэ происходит преимуЕоствсппо в пурогдшзш-роакттнюм Р-сайте рибооош fHotltlina it. ,et al,1?.3D). В ОТОЙ СИСТОМО используется способность антибиотика пуромпшпа служить аналогом з'-концобого фрагмента амгпгоаши-тПК, при условии, кегда f-сайт рибосома занят пойтшшл тШС. IIa ркс.Э представлена кинетика образования ацотилфозшалагаи-пуромшипа на рибосомах из печо:гл кролика. Свдао,что пуромишшовая роакция подавляется гомохаргиигтонином и почти все остатки AcFiic вовлочони в образованно ацетилфенилалашш-пуроишига. На основании продставлен-шх результатов можно Проднодсяить, что связнва;шо в Донорном сайта тшжо но подавляется алкалоидом.
; л
1 f,4
!
Oß ас
Рис.9. Кинетика образования аце тилФо пила лоты дутюмиципа на CG5 рибосомах печени кролика: I - в контроле: 2 -в присутствии алкалоида.
С--), связшзашю в контроле
(----),связьсппио в присутствии гемохаррянгтотша.
дрема, мин
IIa рис.Ю приволсш результате серии экспериментов по выяснению участков связисашя алкалоида с рибосомой. Для этого рибосоми а) прздБзригслыго инкубировали с алкалоидом, затем
проводили пурошциновую реакцию; 0) алкалоид добавляли к предварительно сформированному комплексу 80S.поли(и).Ao[14c]Fhe -тГНКрЬв чороз 10 ют после добаг-лсния пуромишта; в) гомохаррингтопип вносился в систему сразу so после образования соответствующего комплекса, до пуромиципа.
'О ю з„' 40 60 бремя, мин.
гасло,Кинетика образования ацетаи^пилаланил-пуромжшпа при обработке пурсмищшом комплексов 300 рибосом человека с AoPhe-tMJA?ha и полг'и) при 37°о: 1-в отсутствие гсмохаррияг-тотта; 2-рибосоm предынкубировапы с рлкалоидои;3-го...охорря-нгтопия добавлен л комплексу до пуромиципа; -4-алсалоид добавлен к такому sa комплексу чороз 10 мял после пуромицина.
Как видно из данных, приведешшх но рис. 10, алкалоид подавляет образованно ацетилфенилалзнлл-пуроьищша во всех трех случаях, т.о. независимо от времени его добавления в систему. Получайте результаты указывают, что гомохаррипгтонш кнгибиру-ет пуромишшовую реакции ,на 803 рибосомах чолошка тшсяо аффективно, как и на рибосомах печени кролика. Кроме того, алкалоид конкурирует с пуромицином за участок связывания в области пвп-тшшлтрапсфйразпого центра 80S рибосом. Эти дашщо согласуются с результатами, полученными ранее (Barbaoid. et al. 1974 !,гдо предполагается, что алкалоиды из семейства Cephalotaxun harta;-t nia являются KcmtypQtmncfit ингибиторами антибиотиков аяизоми-цина и тряходермияа. эти соединение аффективно блокируют транс-пептидадапо на рибосомах из дрояжзй и мипдалш: человека, конкурируя, в свою очоредь, с пуромицином за связывание Ь акцептор ном сайте рйбосош. Таким образсМ асть все основами считать,
<ш m ni
\
; РЛ
что сайт связывания гомохаррлнгтонина перекрывается ит совпадает с акцепторным сайтом поптвдилтрансферазного цонтра рибосом человека. Вместе с том ингибитор нз оказывал никакого действия на скптез анотилреш1лалиш--пуромшлша при обработке пу-ромиципом комплекса 7СЕ.полиШ). Ao[^4C]Phe-TM{PhB (рибосомы из E.ooli i. lía рис. II показало, что алкалоид практически по подавляет пуроыициновую реакцию в этой систоме.
Рас.II. Ктюшса образования аштдя&оцалашшл - пуромицина при обработке пуромиципом комплекса 7OS•НОЛИ(и)•AoPhe-tRNA^k® I - в присутствии алкалоида; 2 - в отсутствие алкалоида.
i w tí
0/№МЯ, мин
го )о
Дашше, получошшо в этом раздоло позволяют заключить ллодукцоо; во-первых, трапепептидация па 703 рибосомах Е.ооИ не затрагивается алкалоидом; во-вторых, ротация транспептида-ции почти полиостью блокируется гомохаррингтоншом как на рибосомах человека, так и на рибосомах печени кролика.. Этот факт сам по себе имеет вавное зпачонио, так как доказывает, что механизмы образования пептидной связи на рибосомах у млекопитающих не имеют принципиального отличия.
Определение сродства гшохарриигтошшз к 8ГЗ рибосомам человека Исходя из предполагаемого механизма ипгкбирования алкалоидом реакции образования ацетщфенилалапил пуромишта, была предпринята попытка определения константы связывания алкалоида с 80S рибосомой человека. Для этого получали экспериментальную кривую зависимости образования оцотилфепилоланил-пуромицина от концентрации алкалоида. Гозулътаты приведены на рисЛ2.
Z(t-eû)
Ркс.12. Зг лспыость количества сбразоваквогося ацзтилфэтишла-нил ■ пуро.лпжпа от концентрации гсмсхарркпгтопмга. а - концентрация алкалоида.
о ю'? ю'6 /Ою~* ¿о готтррингтэиин, M
41-
Исходя из данных, приведенных нз рисупко я предполагаемого механизма двйотбия алкалоида сотрудники Института биоорганичо-ской химии СО АН СССГ О.С. Федоровой Сила рассчитала капстанта ассоциации гомохаррлнгтопина с 00s рибосомой чодовока, равная (2,57^0,33 )хЮ7М . Взличинз этой kciictciitu свидетельствуот о высокой стэпспга сродства гокохаррипгтошша с рибосомой. Получогаша даяние позволяют утвергдать, что гемохаррингтеши: является солоктввшлл изй-ибиторсм элонгации пошюптидпюй цепи и может быть использован в цнгибиторнсм гшалпзо При изучении тонких механизмов трансляция.
1. Прс"допо сравнительное изучение дсйспхп алкалоидов ла бу.ссяятзз белков в высших оргиюзмах. Виявлон алколоид, избирательно подавлякщй элонгашш полапоптшшгй цепи па рибосомах эукариот - гагохаррингтонип.
2. Алкалоид исбяпатольно блокируэт оленгашгв па 803 рибосомах n~4emt кролика. плаценты человека, зародышей пеоницы. Гсмохар-рипгтогат но влияет па фушяйюпадьпуа активность 70s рибосом
E.ooli.
3. Алкалоид селективно иигпбяруот стадии транспемвдашш плантационного шпата рибосом;.
•1. Участок связывания гокохаррипгтешяш совпадает ила Пбрзкрпьоетсл с акцепторным сойтсл пстишкшраисферазтюго
ЕЫЗОДЦ
-2Z-
центра ßos рибосом. Алкалоид конкурируют о пуромицином за срязнватю в области акцепторного сайта поптидилтраисферазного центра.
Б. Гомохэрриягтспип связывается с SOS рибосомами человека с высокой константой ассоциации, равной (П,57-0,33) х ю7м~1.
Список работ, опубликованных но материалам диссертации:
1. Айтяоглна H.A., Туобаева I .М. "Влияние алкалоида матрина
на синтез белка"' (1936) Тезисы докладов и стендовых сообщений v биохимического съезда. Киев, т.2, 3-4.
2. Туобаева P.M., Долобаова O.K., Клышое Л.К., Айтхохина H.A. "Сравнительное изучение действия хинолизидииовых ал1{алоидов па синтоз белка и PIK" (1026) Известия АН КазССР, серия биол., 3, 33-37.
3. Tujübajcva R.Ii., Graifcr D.U., Earpova O.G. and Ajtlchozhina К.A. "Alkaloid homoharringtonine inhibits polypeptide ohain elongation on human ribocomes on the nton of peptide bond formation" (1900) ГЕЗЗ Lcttoro, 257, 254-256.
4. Ajtkhozhina H.A., Tujobaova R.M., Iamagulova O.A. "Alkaloids as moleoular tiolo for ctudy of gone oxproaaion" (1989) Abetraots of Seoond Bilateral Sympocium USSR USA "Struoture of E. ;aryotio Oonoroo and Regulation of its Exprooaion", Tbilisi, 46.
5. Graifer D.U., Earpova C.C. and Tujcba,1eva R.H. "Alkaloid homoharringtonino inhibits polypeptide ohain elongation on human ribooomee on the step of peptide bond formation" (193Э) AbstraotD of International Sympocium "Regulation, of Translation", Riga, 24.
C. Tujeba jeva R.M..AJtkhoshina N.A. "Homoharringtonino alkaloid offoot on various stop of poptido ohain oyolo on human pla-oenta ribooomca" (1939) AbBtraot of Republican Soientifio Conferenoo "liodorn probloma of phyoioo-ohemioal biology and biotechnology", Alma-Ata, 14. 7. Г~айфэр Д.М., Туебаева P.M., Матассва Н.Б., Федоровi 0.0., Карпова Г.Г., Айтхожипа H.A."Влияние алкалоидов группы Cophalotaxua harringtonia па олонгащш полипептидной цепи на рибосомах человека" (1990) Молекулярная биология, 6, 1679-1685. , ,„,
J*'
- Туебаева, Роза Мухтаровна
- кандидата биологических наук
- Алма-Ата, 1990
- ВАК 03.00.04
- Алкалоиды - ингибиторы биосинтеза макромолекул
- Безматричный синтез пептидов из аминоацил-тРНК на рибосомах Escherichia coli
- Исследование структуры белков P-выступа большой субчастицы архейной рибосомы
- Рибосомная супрессия и функционирование аппарата белкового синтеза у эукариот
- Биогенез рибосом и экспрессия вителлогенинового гена в печени цыплят