Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аффинная модификация 80S рибосом из плаценты человека производными олигорибонуклеотидов в составе комплексов, полученных в бесклеточной белоксинтезирующей системе

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Аффинная модификация 80S рибосом из плаценты человека производными олигорибонуклеотидов в составе комплексов, полученных в бесклеточной белоксинтезирующей системе"

р Г Б од

о к № Российская Академия наук

Сибирское отделение НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

на правах рукописи удк 577.217.34

МАТАСОВА НАТАЛЬИ БОРИСОВНА

АФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ 80S РИБОСОМ ИЗ ПЛАЦЕНТЫ ЧЕЛОВЕКА ПРОИЗВОДНЫМИ ОЛИГОРИБОНУКЛЕОТИДОВ В СОСТАВЕ КОМПЛЕКСОВ, ПОЛУЧЕННЫХ В БЕСКЛЕТОЧНОЙ БЕЛОКСИНТЕЗИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЕ.

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск, 1995 г.

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

Научный руководитель: д.х.н., проф. Г.Г.Карпова

Официальные оппоненты: д.б.н., проф. С.Н.Загребелъный

к.х.н. Н.Д.Кобец

Ведущая организация; Санкт-Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН Отделение молекулярной и

радиационной биофизики

Защита состоится _19Э5 года в ча-

сов на заседании диссертационного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, г.Новосибирск-90, проспект акад. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан "¿¿¿¿^/Сё^¡Лляяд г.

Ученый секретарь диссертационного совета к.х.н.

О.С.Федорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из фундаментальных проблем молекулярной биологии является изучение механизма биосинтеза белка, основной этап которого - трансляция - осуществляется на рибосомах. Для прокариотических рибосом хорошо и достаточно подробно- изучены все стадии инициации и элонгации белкового

синтеза, имеется множество данных о структурной организации и -------------

расположении на рибосоме различных функциональных центров (Оакез et al., 1990; Карпова, Кнорре, 1991; Rinke-Appel et al., 1993; Bhangu et al., 1994). Более сложный процесс трансляции, происходящий в эукариотических системах, изучен хуже, а рибосомы человека на момент начала настоящей работы не были исследованы вовсе. Для изучения процесса трансляции на рибосомах человека необходимо иметь в препаративных количествах функционально активные рибосомы и другие индивидуальные компонента аппарата трансляции. Практически единственной нормальной тканье человека, доступной в больших количествах, является послеродовая плацента. Однако серьезным недостатком этой ткани является высокое содержание в ней РНКазной активности, что существенно осложняет выделение функционально активных рибосом, содержащих целую рРНК.

В 1989 г нами была описана методика выделения функционально активных 40S и 60S субчастиц из замороженной плаценты человека, содержащих практически полный набор рибосомных белков (Бабкина и соавт., 1989). Однако рРНК в субчастицах была деградировала. В связи с этим на первый план выдвигалась проблема разработки методики выделения функциональйо активных рибосомных субчастиц из плаценты человека, содержащих целую рРНК.

Взаимодействие рибосомы с мРНК и аминоацил-тРНК, осуществляющееся с помощью различных белковых факторов, является центральным событием на всех стадиях трансляции. Чтобы установить, как мРНК и аминоацил-тРНК взаимодействуют с рибосомой в процессе трансляции и как рибосома координирует функционирование этих биополимеров, необходимо иметь информацию о структурных элементах рибосомы, взаимодействующих с компонентами аппарата трансляции (или окружапцих их) на различных этапах биосинтеза белка. Наиболее информативным подходом для решения этой проблемы является метод аффинной модификации рибосом реакционно способными производными компонентов аппарата трансляции (аналогами мРНК, тРНК, атр, OTP и т.д.) в составе модельных комплексов, имитиру-вдих различные функционально значимые состояния рибосом. С ис-

пользованием этого подхода получено множество данных о структурно- функциональной топографии рибосом E.coli (Карпова, Кнорре, 1991; Bhangu et al., 1994; Rinke-Appel et al., 1993).

Эукариотические рибосомы изучены в этом отношении гораздо слабее, причем подавляющая часть исследований выполнена в упрощенных модельных системах, когда взаимодействие мРНК и тРНК (или их аналогов) с рибосомой осуществляется без участия факторов трансляции. Единственным функционально-значимым состоянием рибосом, которое может быть получено в таких системах, является претранслокационное состояние с кодон-антикодоновыми взаимодействиями одновременно вР-и A-сайтах (в р-сайте таких комплексов находится деацилированная тРНК, а в А-сайте - дипептидил-тРНК), Недавно в нашей лаборатории в составе таких комплексов с использованием алкилируицих производных олигоуридилатов была изучена область кодон-антикодоновых взаимодействий 80S рибосом из плаценты человека (Malygln et al., 1994), в с помощью реак-ционноспособных производных олигорибонуклеотидов AUGUn (п=0,3) был исследован мЕНК-связывапций центр рибосом из плаценты человеке в составе 40S комплексов инициации, образованных в присутствии эукариотического фактора инициации eIF-2 (Mundus et al., 1993).

Цель работы. Целью настоящей работы явилось:

а) выделение рибосомных субчастиц из плаценты человека, содержащих интактную рРНК;

б) создание бесклеточной белоксинтезирупцей системы, содержащей 60S рибосомы из плаценты человека, синтетические мРНК (или их реакционноспособные аналоги), белковые факторы и другие компоненты эукариотического аппарата трансляции;

в) изучение аффинной модификации 80S рибосом из плаценты человека реакционноспособными аналогами мРНК- [4-N-(2-хлорзтил)-N-метиламино)бензилметил-5'-фосфамидными производными олигорибонуклеотидов t32P]pAUGUn (п= О, 3, б) И 2',3'-о-[4-N-(2-ХЛОр-этил)-ы-метиламино]бензилиденовым производным AUGU3t32P]pC в составе комплексов, полученных в белоксинтезирушей системе.

Научная новизна. Впервые изучена аффинная модификация 80S рибосом из плаценты человека аналогами мРНК - производными олигорибонуклеотидов [32P]pAUGUn (п= 0, 3, 6) с алкилирупцей группой на 5'-конце и производным AUGUj[32PjpC с алкилирупцей группой на 3'-конце в составе комплексов, полученных в белоксинтезирупцей системе. Использование этих аналогов мРНК позволило

просканировать область рибосомы, расположенную с 5'-стороны по отношению к декодирующему сайту и получить информацию о структурных элементах рибосомы, расположенных вблизи 3'-стороны ко-дона, связанного с тРНК в Р-сайте. На основании полученных результатов" изданных по аффинной модификации рибосом производными олигоуридилатов предложена схема расположения "матрицы" на 80S рибосомах, согласно которой 5'-сторона кодона, связанного в Р-сайте, находится вблизи участков 18S рРНК внутри фрагмента 975-1172, а З'-сторона этого же кодона - вблизи белка S3a. Не фиксированная кодон-антикодоновым взаимодействием 5'-сторона матрицы образует петлю (или изгиб), что позволяет ей контактировать со структурными элементами рибосомы (последовательностями 18S рРНК внутри фрагментов 593-674 и 1748-1869 и белками S3 и S3a), которые расположены вблизи 3'-стороны участка кодон-антикодсновых взаимодействий.

Практическая ценность. Разработан метод выделения рибосомных субчастиц из плаценты человека, содержащих интактную рРНК, основанный на использовании свежей, без предварительного замораживания и хранения, плаценты. Для изучения механизма биосинтеза белка на эукариотических рибосомах создана бесклеточная белок-синтезирувдая система, состоящая из 80S рибосом из плаценты человека, синтетической матрицы (или ее реакционноспособного аналога) и фракционированного лкзата из ретикулоцитов кролика, не содержащего эндогенных рибосом.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликованы четыре печатные работы. Результаты работа докладывались на Германо-Российском рабочем совещании по биотехнологии (Берлин, 1994).

Структура работы. Диссертация 'изложена на 175 страницах, состоит из введения, трех глав, выводов и списка цитируемой литературы. В главе I представлены сведения о структурно-функциональной организации эукариотических рибосом (проанализированы данные за последние 20 лет). Глава 2 представляет собственные исследования и обсуждение результатов. Экспериментальная часть описана в главе 3.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I.Выделение 4QS и 6QS рибосомных субчастиц из плаценты человека. содержащих интактную рРНК

Для выделения полисом и рибосомных субчастиц использовали нормальную послеродовую плаценту без предварительного замораживания и хранения. Промежуток времени между родами и гомогенизацией ткани не превышал 30 мин. Основные стадии выделения рибосомных субчастиц состояли в следующем.

1).Гомогенизация предварительно отмытой от крови ткани в охлажденном до 2°с буфере, содержащем гепарин и циклогексимид, и последующее низкоскоростное центрифугирование гомогената. Полученный таким образом постмитохондриальный супернатант (ПМС) инкубировали в присутствии дезоксихолата натрия.

2).Фракционирование ПМС, обработанного дезоксихолатом натрия, с помощью высокоскоростного центрифугирования через двухступенчатый градиент концентрации сахарозы. Такая процедура позволяет отделить активные, синтезирующие белок полисомы от нетранслирупцих рибосом, мембран и не связанных с полисомами нуклеаз, а, следовательно, уменьшить вероятность деградации рРНК на стадии выделения полисом. Выход полисом составляет 3000 ед.А2£0/кг плаценты, что в 1,5-3 раза превышает значения, известные из .литературных источников. В качестве ингибиторов нук-леаз на этой стадии выделения использовали гепарин и циклогексимид.

3).Инкубация раствора полисом с пуромицином для диссоциации полисом на субчастицы. В качестве ингибитора связанных с полисомами нуклеаз на этой стадии использовали РНКазин из плаценты человека.

Рис.1. Типичный профиль седиментации рибосом в градиенте концентрации сахарозы (10 - 30$) в буфере, содержащем з шм Mg2"*" и 500 тМ к+, по окончании инкубации полисом в присутствии 0,4 гаМ пуромици-на; стрелками указаны положения пиков ?0S рибосом, 50S и 30S субчастиц Е.coli при аналогичных условиях центрифугирования

4).Разделение рибосомных субчастиц в градиенте плотности сахарозы. Типичный профиль седиментации представлен на рис Л. Выход 40S и 60S субчастиц на 1кг плаценты составляет 200-300 и 500-600 едг Agg0 соответственно, что в 2-4 раза превышает значения, известные из литературных источников. -_______

В процессе выделения субчастиц на каждой стадии была про ала- — - —_____

лизирована целостность рРНК (в ткани, ПМС, лолисомах и субчастицах). Было продемонстрировано, что высокомолекулярная рРНК присутствует кис в незамороженной,,, так и в замороженной ткани, однако субчастицы с нативной рРНК удалось выделить лишь из незамороженной ткани {рис.2). По-видимому, это объясняется тем, что в процессе замораживания - оттаивания инактивируется плацентарный ингибитор нуклеаз - РНКазин, а наличие целой рРНК в замороженной плаценте связано с тем, что при выделении РНК из ткани гомогенизация происходит одновременно с депротеинизацией, что сводит к минимуму время, в течение которого может происходить деградация РНК. При использовании незамороженной ткани, благодаря присутствующему в ней РНКазину, степень деградации РНК-на стадии гомогенизации ткани чрезвычайно низка, что позволяет выделить полисомы с недеградированной рРНК."

Рис.2. Анализ препаратов рРНК электрофорезом в 1% агарозе, окраска бромистым этидием. 1,2- препараты рРНК из 40S (I) и 60S (2) субчастиц, выделенных из незамороженной ткани; 3, 4 - препараты рРНК из 403 (3) и 60S (4) субчастиц, выделенных из замороженной ткани; 5 -16S рРНК из е.coli; 6 - суммарная рРНК из Е.coli

В выделенных препаратах субчастиц были также проанализированы рибосомные белки. Полученные электрофореграммы хорошо согласовывались с опубликованными ранее результатами по разделению рибосомных белков из плаценты человека.

2.Функциональная активность выделенных препаратов субчастиц Функциональная активность выделенных препаратов субчастиц была исследована в энзиматическсй и неэнзиматической системах.

Для количественной оценки активности рибосом в не энзимати-ческой системе было изучено связывание С^СЗРЬе-тРНКр*1® с 80S рибосомами, полученными ре'ассоциацией 40S и 60S субчастиц, в присутствии родственной матрицы - поли(О), 13 mM Mg2+ и 125 тМ к+. Связывание было полностью кодон-специфично. Предельная степень связывания при 25°С составляла 1,5 моль [14С]РЬе-тРНКРЬе на моль рибосом, что соответствует их 75*-вой активности (стопроцентной активности рибосом соответствует связывание 2 моль [C14]Phe-TPHKPhe на моль 80S рибосом).

Для проверки функциональной активности рибосом в знзимати-ческой системе обычно изучают поли(Ш-зависимый синтез полифе-нилаланина. В связи с чрезвычайно высокой эндонуклеазной активностью ткани в качестве . источника факторов трансляции, ÏPHK и аминоацил-тРНК-синтетаз использовали не плацентарную белок-синтезирупдую систему, а фракционированный лизат из ретикулоци- ' тов кролика, не содержащий эндогенных рибосом (S100). Из рети-кулоцитного лизата ультрацентрифугированием удаляли белок-синтезирупцие полисомы, 803 рибосомы и субчастицы (при добавлении к такому лизату меченой аминокислоты, меченой аминокислоты и рибосом или аминокислоты и матрицы не наблюдалось синтеза полипептидных цепей). Препараты eos рибосом, полученных реассо-циацией 40S и SOS субчастиц, были способны в присутствии поли(и) и S100 включать в кислотонерастворимую фракцию от 15 до 80 моль остатков í14C]Phe в расчете на I моль 80S рибосом при 25°с. Все эксперименты были выполнены на рибосомах, которые в пересчете на 1 моль включали до 20 остатков [14c]Phe в полипептидную цепь при 25°с.

Для идентификации сайта связывания поли[14 сЗфенилаланил-тРНК на рибосомах соответствупций' комплекс по окончании трансляции выделяли центрифугированием. При этом было показано, что количество остатков [14c]Phe, связанного с 80S рибосомами, полностью соответствует количеству [14C]Phe, включаицемуся в кислотонерастворимую фракцию, и составляет примерно 20 моль [14C]Phe на моль 80S рибосом. В отсутствие S100 не наблюдается какого-либо заметного включения [14c]Phe во фракцию eos рибосом. После обработки такого комплекса пуромицином (антибиотиком, взаимодействующим с пептидил-тРНК, связанной в Р-сайте, с образованием пептидилпуромицина) практически вся радиоактивность обнаруживается в пептвдияпуромицине, что свидетельствует о локализации пептидил-тРНК в.Р-сайте. Следовательно, по окон-

чаши трансляции поли(и) образуются посттранслокационные комплексы рибосом: eos-поЛи(и)• (FÍie ^-тРНК**116 (в Р-сайте).

з.исследованиё'взаимодействия аналогов мРНК - олигорибонук-^леотидов, содержащих и не содержащих AUG-кодонг с 60S рибосомами в присутствии S10Q

Фракционированный ретикулоцитный лизат, не содержащий эндогенных рибосом (S100), был использован для изучения взаимодействия аналогов матрицы - блигорибонуклеотидов, содержащих и не содержащих AUG-коцон, и соответствующих им тРНК с 8ÓS рибосомами (см. табл. I). Было показано, что 30-40-кратного избытка олигорибонуклэотида по отношению к рибосомам достаточно для

Таблица I

Связывание аналогов мРНК и соответствующих им остатков аминокислот с 80S рибосомами в присутствии S1CO. (Относительное стандартное отклонение, рассчитанное по результатам не менее трех независимых экспериментов, не превышало 10$)

Матрица Наличие Связывание Количество свя- количество ос-

S 100 матрицы*■ занных остатков татков аминокис-

моль/моль аминокислоты , лоты в пептидил-

80S моль/моль 80S пуромицине ,

моль/моль 80S

[14C]Phe [35S]Met [14Phe] [35S]Met

AüGUg + 0,95 1,80 0,89 1 ,60 0,84

AUGUg - <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1

AUGU3 + Or 81 0,80 0,92 0,75 0,80

AUGU3 - <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1

(РШ6 + 0,80 1,62 - 1,50 -

(pü)g - <0,1 <0,1 - <0,1 -

полиШ) - + - 20 - 16 -

поли (Ü7 - 0,2 - 0,2 -

-зр

* - использовались олигорибонуклеотиды, меченные ** - использовались немеченые олигорибонуклеотиды

насыщения 80S рибосом соответствующим аналогом мРНК. Количество остатков [14C]Phe, найденное в комплексе 80S рибосом с AUGUg, практически совпадает с количеством остатков, найденным в комп-

лек се с (pu)6, и почти в два раза выше, чем в комплексе с ' AUGUj. Такая же хорошая корреляция наблюдается между количеством остатков t14C]Phe и [35S], найденным в соответствующих комплексах 80S рибосом с augü3 и augug. В отсутствие S100 практи-' чески, не удается зарегистрйровать какого-либо заметного включения [ис]Рье или [35s3ííet во фракцию 80S рибосом, связывания матрицы также не наблюдается. На основании этого можно заклю-\ чить, что включение остатков [14CJPhe и (35S]Met во фракцию 80S рибосом, наблюдаемое в присутствии S100, обусловлено кодон-зависимым связыванием [14C]Phe-TPHKPhe и [35s]Met-TPHKMet с 80S рибосомами под действием факторов трансляции.

- Для идентификации сайта связывания пептидил-тРНК на 60S рибосомах в присутствии олигорибонуклеотидов соответствуйте комплексы. как и в случае споли(и), обрабатывали пуромицином.' Практически вей [1-4с] и [35s] радиоактивная метка обнаруживалась в пептидилпуромицине (см. табл.1). Следовательно, при ис- , пользовании аналогов мРНК, содержащих, два' или более кодона, 1 образуются посттранслокационные комплексы¡ 80S рибосома»аналог мРНК-пептидил-тРНК (в Р-сайте). Таким образом, при использовании в качестве матриц олигорибонуклеотидов типа _ AUGUn могут , быть получены комплексы 80S рибосом, различающиеся расположени-, ем кодона AUG в 5'-области мРНК-связывающего центра (т.е. комплексы с разным расстоянием меаду кодоном AUG и зоной кодон-антикодоновых взаимодействий).

4.Аффинная модификация 80S рибосом производными олигорибонуклеотидов в составе комплексов, полученных в • белок-синтезирующей системе

V

Рис.3. Реакционноспособные аналоги мРНК с алкилирующей группой на 5'-конце (А) -[4-N-(2-хлорэтил)-ы-ме тилами- -но]бензилметил-5' -фосфамидные производные олигорибонуклеотидов [32P]pAUGUn (п=0,3,6) -И . на З'-конце (Б)- 2',3'-0-[4--N-(2-хлорэтил )-ы-метиламино]-бензилиденовое производное AUGU3[32P]pC (Б)

С|-СНГСН2 4:6,3.6 к д Ь о ои pUp6(pU)„

0 -Рч Б

V? V

tf-CHj

CH2-CH2-CI

На рис.3 представлены реакционноспособные аналоги мРНК, которые были использованы в настоящей работе для аффинной модификации eos рибосом.

~ 4.1.Связывание схксн^н(сн:)[32РЬАШип и AUGtU[3gP]pC>CH]RCl

с eos рибосомами в присутствии S10Q___

В присутствии sioo и 30-кратного избытка реагента по отношению к рибосомам (Ю-7М) степени связывания CXRCH2N(CH3)t32P]pAUGUn составляли 0,32, 0,26 и 0,18 моль на моль 80S рибосом-(п = 0, 3 и б соответственно), а степень связывания AUGU3t32P]pC>CHRCi составляла 0,12 моль реагента на, моль .80S рибосом. Связывание зависело от наличия S100 и практически ве наблюдалось в присутствии соответствующего немеченого олигорибонуклеотида. ' На примере clRCHgNíCH^pAUGUg

было показано, что количество остатков [14c]Phe, найденное в комплексе 80S рибосом, составляло 0.34 и примерно в два раза превышало количество остатков f35s]Met (0,18) на рибосому. В отсутствие S100 включения [14c]Phe или [35S]Met во фракцию 80S рибосом не наблюдалось. При использовании AUGU^pOCHRCl с 80S рибосомами связывались эквивалентные количества остатков [14c}Phé и [35S]Met (0,10 и 0,12 моль.на моль 808 рибосом соответственно). При обработке соответствующих комплексов пуромици-ном практически вся связанная с 80S рибосомами [14С] или [35s] радиоактивная метка удалялась в виде пептидилпуромицина. Следовательно, при TPHK-ЗавИСИМОМ связывании ClRCH^NtCHj)pAUGUn и AUGU^pOCHECl с 80S рибосомами в присутствии S100 образуются комплексы 80S рибосом с вакантным A-сайтом (т.е. комплексы с пептидил-тРНК или аминоацил-тРНК (в случае C1RCH2N(CH3)PAUG) в Р-сайте).

4.2.Ковалентное присоединение реакционноспособных производных олигорибонуклеотидов к 80S рибосомам -Для ковалентного присоединения аналогов мРНК к SOS рибосомам комплексы, полученные в ^ присутствии sioo и ClRCH2N(CH3)[32P]pAÜGUn (п= О, 3, б) ИЛИ AUGU3(32P]pC>CHRCl, выдерживали при 25°С в течение времени, соответствующего полному превращению реагентов в активную промежуточную частицу. В контрольных экспериментах было показано, что на протяжении всего времени инкубации не происходит диссоциации аналогов матрицы из соответствующих комплексов. По окончании инкубации соответствующие комплексы разрушали и анализировали распределение модификации между рибосомными субчастицами (см. табл.2).

Таблица 2

Аффинная модификация, 80S рибосом ClRCHgN(CH3)[32P]pAUGUn (п=0,3,6) и AUGU3[32P]pC>CHHCl (ошибка в определении степеней связывания и модификации составляет приблизительно 10$)

Реагент Добавляемые Связыва- Ковалентно

компоненты ние, моль присоединен-

реагента/ ный реагент.

_ /моль 80S моль/моль

субчастиц

S100 pAUGIL 1 40S 60S

ClECHgNÍCHj) [32P]pAUG + 0,32 0,28 0,03

+ + 0,07 0,СЗ

- _ 0,09 0.03

CIRCHgN(СН3)[32Р]pAUGU3 + - 0,26 0,24 0,02

+ + 0,04 0,02

- - 0,06 0,02

С1ЕСНрЫ(СН3)[32P]pAUGU6 + - 0,18 0,17 0,02

+ + 0,02 0,02

- - 0.02 0,02

AUG03t32P]pC>CHRCl + 0,12 0,10 0,02

+ + 0,02 0,02

- - 0,03 0,02

Практически весь связанный в комплекс с 802 рибосомами реагент расходуется на модификацию 40S субчастиц: 94$, 92$ и 87$ -ь случае ciRCHgNiCHj)[32P]pAUGUn при п = О, 3 и б соответственно и .91$ - в случае AUGU^[32Р]p0CHRCl. Модификация 40S субчастиц сильно зависит от наличия S100 в реакционной смеси и значительно ингибируется избытком соответствующего немеченого олиго-рибонуклеотида. Следовательно, ковалентное присоединение аналогов мРНК к 40S субчастицам протекает в составе специфических комплексов вблизи мРНК-связывавдего центра.

4.3.Анализ распределения радиоактивной метки между 18S*pPHK

и рибосомными белками Для анализа распределения радиоактивной метки между рРНК и белками рибэсомные субчастицы разделяли на фракции рРНК и белков (данные приведены в табл.3). Видно, что модификации подвергаются как рРНК, так и белки. В случае 5,'-производных pAUGUn с увеличением длины олигоуридилатной части реагента происходит

Таблица 3

Распределение радиоактивной метки между рРНК и белками в ----- составе 40Б субчастиц, модифицированных С11?СН2Л(СН3)[32Р]рАиотп (п = 0, 3, 6) и Аши3[32РЗрС>СНЕС1. (.Ошибка ь определении относительной степени модификации приблизительно 5%)

Реагент Относительная степень модификации, «

18S рРНК, Рибосомные белки

C1RCH2N(CH3)[32P]pAÜG CIECH^N(СН3)132Р]pAUGU3 CXECHgN(CHj)[32PIpAUGUg AUGU3 [32P jpOCHECI ' 95« 30« 16« 8$ 5« 70% 84« 92«

уменьшение доли алкилированной 18S рРНК и'увеличение доли модифицированных рибосомных белков. Особенно резкий скачок наблода-ется при переходе от производного рАШ к производному pAüGU^. В комплексе рибосом, образованном с участием augu3[32Р]рС>СНЕС1, модификации подвергаются в основном рибосомные белки.

4.4.Идентификация фрагментов 18S рРНК. содержащих сайты модификации реакционноспособными производными мРНК

Идентификацию фрагментов ias рРНК, содержащих сайты ковален-тного присоединения аналогов мРНК, проводили только в случае ciECHgN(CH-j)pAUGUn (n = о, 3, б), относительная степень модифи-ка!ши 18S рРНК которыми составляла 95«, 30« и 16« соответственно, Фрагменты 18S рРНК, содержащие мишени для алкилирования аналогами матрицы, были установлены методом блот-гибридизации модифицированной и частично гидролизованной 18S рРНК с фрагментами рестрикции íes рДНК, иммобилизованными на капроновой мембране. Во всех случаях по окончании гибридизации мембраны обрабатывали раствором РНКазь> А. После такой обработки лишь фрагменты рРНК, полностью занятые в образовании дуплексов, остаются связанными с фрагментами рДНК на мембране. Радиоактивная метка, обнаруживаемая в участке, соответствующем определенному фрагменту рестрикции, указывает на существование сайта аффинной модификации 18S рРНК внутри фрагмента, соответствующего данному фрагменту рестрикции. Радиоавтографы мембран с фрагментами рДНК, гибридизованными с модифицированной 18S рРНК (несущей метку J Р) приведены на рис.4. Данные по идентификации районов 18S рРНК, которые подвергаются модификации 5'-производными оли-горибонуклеотидов [32Р]рАтси (п=о, з, 6), приведены в табл. 4.

Таблица 4

Фрагменты 18S рРНК, содержащие сайты ковалентного присоединения ClKCHgN{CEj) [32Р]pAUGUn (п= О, 3, 6)

Реагент Этносительная Модифицируемые

степень модифи- фрагменты 18S рРНК

кации 18S рРНК

CIRCON (СН3 ) [32P ]pAUG ClRCHgN(CH3)[32РIpAUGU, СlRCHgN(СН3) [ 32Р 3рAUGUg 95% 30« 16* í , 975-1172 . 975-1172 593-674, 975-1172, 1748-1869

Модификация 18S рРНК CIRCON (СН3)pAUG, фиксированным на рибосоме кодон-антикодоновым взаимодействием в Р-сайте, происходит внутри фрагмента 975-1172 (относительная степень модификации 95%). Ранее внутри этого же фрагмента были локализованы сайты ковалентного присоединения drchgn(ch3)pAUG в составе 40S комплекса инициации (Mundus et al.', 1993) и ClRCHgN(CH3)pUn (n= 3, 4 ) в составе комплекса с 80S рибосомами и Phe-TPHKphe (Malygin et al., 1994). При удалении реакционноспособной группы на три нуклеотидных звена от зоны .кодон-антикодоновых взаимодействий (комплекс 80S рибосом с circh2n(ch3)paugu3) модификация внутри фрагмента 975-1172 сохраняется, хотя относительная степень модификации 18S рРНК падает до 30$., В этом случае во взаимодействие 5'-концевого фрагмента аналога матрицы с рибосомой в значительной степени вовлекаются рибосомные белки. В посттранслокационном комплексе 80S рибосом с clRCHgN(CH3)pAUGUg относительная степень модификации. 18S рРНК падает до 16%. Модификация 18S рРНК распределяется внутри фрагментов 975-1172, 593-674 и 1748-1869. Следует отметить, что модификация внутри двух последних фрагментов характерна для производных олигорибо-нуклеотидов с алкилирупцей группой на 3'-конце (Булыгин и со- ' авт., 1992; Munüua et al., 1993).'

На основании этих данных можно, предположить, что 5'-сторона матрицы (удаленная от зоны кодон-антикодоновых взаимодействий, по-крайней мере, на шесть нуклеотидных звеньев) располагается на рибосоме недалеко от районов 593-674 и 1748-1869 18S рРНК, находящихся вблизи 3'-стороны мРНК-связывапцего центра, а также то, что эти районы и район 975-1172 сближены внутри 40S субчас-

тида, находящейся в составе посттрвнслокационного комплекса 80S рибосомы.

"(a) HaelII Sau3a (б) HaelII Sau3a

MspI | Alnl ¡~ " - MapI | AluI

552

341 - 0СЭ ! 370 341 370

552

279 - 279

121

121 g~--ч

(B) HaelII Sau3a MbpT~T~A1UI~T~

341 frn» 370

242 ^^ 279

121 ese»

fe»

118 95

- Рис.4.Блот-гибридизация по Саузерну фрагментов рестрикции рДНК с 18S рРНК, модифицированной CXRCHgNÍCH^) [32P]pAUGUn (п= о (а), з (б) и 6 (в)), радиоавтограф

4.5.Идентификация модифицируемых рибосомных белков Идентификацию модифицированных 'рибосомных белков проводили для 3'- и 5'-производных AUGU3 И 5'-производного pAUGUg, при использовании которых наблюдалась достаточно высокая относительная степень модификации рибосомных белков: 92«, 70$ и 84$ соответственно. Кодифицированные' 40S субчастиш разделяли на фракции белков и рРНК центрифугированием в градиенте плотности сахарозы в присутствии SDS, рибосомные белки (немодифицировэнные и модифицированные) выделяли из верхних фракций градиента

осаждением ацетоном и анализировали одномерным электрофорезом в ПААГ в присутствии SDS (Laerrmli, 1970) с последующей радиоавто-графиой. На рис.5 представлена электрофореграмма рибосомных белков, выделенных из модифицированных 40S субчастиц, и соот-' ветствугщий ей радиоавтограф. Сопоставляя данные радиоавтографии с электрофореграммой рибосомных белков, можно было предположить, что при модификации всеми типами реагентов радиоактивная'метка находится в полосах, соответствующих группе белков

S3a, S2, S6, S4, S3b и S3. В случае' с AUGU^[ 32P ]pOCHRC 1 слабая радиоактивная , метка наблюдается также и в полосе, соответствующей белкам S26, si5a и его.

1 2 3 4 5

S3á ____~ _ S3

52, ------- " r- ^¡^¿ш^Улг, s6

53, S4, S^h^r^-aBw ШЦ^Щ'гЗ, S4, S3b

S26, S20, S15a^ ' ~ S20, S15a

Рис.о. Анализ рибосомных белков, выделенных из 40s субчастиц, модифицированных ClRCHgN(CH3)l32P]pAUGUn, п=б (2), 3 (3) и augu3 [ 32р ] pOCHRC 1 (4), одномерным гель-электрофорезом по Лэммли (Laemmli, 1970); I, 5 - гель "после прокрашивания Coomas-sie Brilliant Blue G-250; 2, 3, 4 - радиоавтографы

Дальнейшая идентификация модифицированных белков была проведена с помощью иммунологического анализа в группе др. Шталя (Центр молекулярной медицины им. Макса Дельбрюкка, Берлин-Бух, Германия). Между рибосомными белками крысы и человека довольно высокая гомология (примерно 90$) (Wittmann-biebold. et al,, 1990), что позволило для иммунопреципитации человеческих рибосомных белков использовать суммарные поликлональные антитела кролика против рибосомных белков из печени крыс. В процессе анализа соответствующие иммуносорбенты-были добавлены к препаратам суммарного белка, выделенным из модифицированных различными реагентами 40S субчастиц. Белки, связавшиеся с иммуносор-бентом, параллельно разделяли гель-электрофорезом по Лэммли,

переносили на нитроцеллвлозную мембрану и просчитывали радиоактивность на приборе Phospho imager.' Результаты 'анализа приведены в табл.5. Видно, что модификации clECHgNCCHg)[32P]pAUGOn (n= 3, б) подвергаются белки S3 и S3a примерно в одинаковой степе-

Таблица 5

Рибосомные белки, модифицируемые производными олигорибонук-леотидов в составе посттранслокационных комплексов. (Ошибка в определении относительной степени модификации составляет приблизительно 5«)

Реагент Относительные степени модификации (в «)

белков в составе 40S субчастиц рибосомных белков

S3a S3 S26 -

AUGU3t32P]pC>CHECl ClRCH2N(CH3H32P)pAUGU3 C1ECII2N(CH3 ) [ 32Р JpAUGUg 92« 70% 84« 91« 56« 47« 6» 44« 53« 3«

ни. В комплексе 80S рибосом с AüGU3[32P]pC>CHRCl основной мишенью алкилирсвания является белок S3a- (относительная степень

модификации 91«}.

5.Схема расположения матрицы на рибосоме на различных стадиях элонгации В ходе элонгадионного цикла рибосома постоянно переходит из посттранслокационного состояния в претранслокационное. В составе претранслокационного комплекса в Р-сайте рибосомы находится деацилированная тРНК, а в А-сайте - пептидил-тРНК. В посттранс-локационном состоянии А-сайт рибосомы вакантен, а в Р-сайте связана пептидил-тРНК.

На основании результатов, полученных в настоящей работе, и данных по аффинной модификации рибосом из плаценты человека производными олигоуридилатов и АТОип (Ма1уа1л е1; а1., 1994; мипйиБ et а!., 1993) предложена схема расположения матрицы на рибосоме на различных стадиях элонгации (см, рис.5). При этом мы полагаем, что окружение матрицы, фиксированной кодон-антикодоновым взаимодействием в Р-сайте, существенно не зависит от состояния тРНК, локализованной в Р-сайте (аминоацил- или пептидил-тРНК). Согласно предложенной схеме в посттранслокаци-онном состоянии рибосомы, когда А-сайт свободен, 3'-сторона

р-сайт А-сайт

(свободен)

Р-сайт А-сайт

1748 1869 593 674

Рис. 4. Схема расположения различных стадиях элонгации

матрицы на 80S рибосомах на

кодона, связанного с молекулой- тРНК в Р-сайте, расположена вблизи нуклеотидных остатков G-1763/G1764 (Malygin et al., 1994) и белка S3a. Область вблизи 5'-стороны кодона, взаимодействующего с тРНК в Р-сайте, формируют нуклеотидные остатки 18S рРНК внутри фрагмента 975-1172 (возможно, остатки А-1058, С-1057, С-1026 и А-1025 согласно данным (Malygin et al., 1994). Когда рибосома находится в претранслокационном состоянии, эту же область формируют белок S26 и в меньшей степени нуклеотидный остаток с-1057; 3'-сторона кодона, связанного с молекулой пеп-тидил-тРНК в А-сайте, расположена вблизи G-1702 18S рРНК и белков S3 и S3a (Malygin et al., 1994). После одного шага транслокации не фиксированная кодон-антикодоновым взаимодействием с тРНК 5'-сторона кодона, ранее находившегося в Р-сайте, по-прежнему находится вблизи фрагмента 975-1172, но, по-видимому, благодаря некоторому изгибу, способна дотягиваться до белков S3 и БЗа, расположенных вблизи 3'-стороны зоны декодирования^ Очередной шаг транслокации приводит к тому, что не фик-

сиров энная кодон-аятикодоновым взаимодействием 5'-сторона матрицы контактирует в основном только с рибосомными компонентами, расположенными вблизи у -стороны участка декодирования (белками S3 и S3a и нуклеотидныш остатками, внутри фрагментов 593-674 и 1748-1869 18S рРНК), то есть делает петлю или изгиб, - ......_

ВЫВОДЫ

1.Впервые разработан метод выделения рибосомных субчастиц из плаценты человека, содержащих интактную рРНК, основанный на использовании свежей (без предварительного замораживания и хранения) плаценты.

2.Создана функционально активная белоксинтезирущая система, содержащая 80S рибосомы из плаценты человека и синтетические мРНК. В качестве источника факторов трансляции использован ли-зат из ретикулоцитов кролика, не содержащий эндогенных рибосом. В этой системе изучено связывание аналогов мРНК - олигорибонук-леотидов pAUGUn {п=0,3,б) с 80S рибосомами. Показано, что при использовании аналогов мРНК, содержащих два или более кодона, образуются посттранслокационные комплексы: 80S рибосома • аналог мРНК • пептидил-тРНК (в Р-сайте), различающиеся расстоянием между кодоном AUG и зоной кодон-антикодоновых взаимодействий.

3.Впервые изучена аффинная модификация 80S рибосом реакциои-носпособными аналогами мРНК - [4-Ы-(2-хлорэтил)-Ы-метилами-но]бензилметил-5'~фосфамидными производными [32P]pAUGUn (п= О, 3, 6) и 2'-з'-о-[4-к-(2-хлорэтил)-ы-метиламино]бензилиденовым производным AUGU3[32p]pc в составе комплексов, полученных в белоксинтезируодей системе. Использование производных pAUGUn (п -О, 3, 6) с алкилирущей группой на 5'-конце позволило проска-нировать область 80S рибосомы, расположенную с 5'-стороны по отношению к зоне декодирования, с помощью производного AUGU3C с реакционно способной группой на у -конце получена информация о структурных элементах рибосомы, расположенных вблизи у-стороны кодона, связанного в Р-сайте.

а}.Модификации во всех случаях подвергаются в основном 4CS субчастицы.

б).Показано, что распределение модификации между 18S рРНК и белками с 5'-стороны мРНК-связываодего центра зависит от длины олигонуклеотидной части матрицы, не фиксированной кодон-антикодоновым взаимодействием. В комплексе рибосом, образованном с участием 5'-производного pAUG, основной мишенью модифика-

дай является 18S рРНК. В посттранслокационннх комплексах с 5'-производными pAUGUn (п = 3. 6), а также с 3'-производным AUGU-jC, модификации подвергаются в основном рибосомные белки.

в).Идентифицированы фрагменты 18S рРНК, внутри которых локализованы сайты ковалентного присоединения производных олигори-бонуклеотидов pAUGOn (п=0, 3, б) с алкилирупцей группой на 4 5'-конце. Во всех трех случаях наблюдается модификация внутри фрагмента 975-1172, а в случае п = 6 наблюдается модификация также и внутри фрагментов 593-674 и 1748-1869.

г).Идентифицированы рибосомные белки, подвергапдиеся модификации производными олигорибонуклеотидов. Установлено, что белки S3a ■ и S3 алкилируются в сопоставимой степени производными pAUGOn (п = 3, 6} с модифицирующей группой на 5'-конце. В случае производного AUGU-jC с алкилирупцей группой на 3'--конце основной мишенью модификации является белок S3a; белки S3 и S26 модифицируются в незначительной степени.

д).На основании полученных результатов и данных по аффинной модификации 80S рибосом производными олигоуридилатов в составе комплексов, образованных с участием РЬе-тРНК?*16, предложена схема расположения матрицы на рибосоме на различных стадиях элонгации.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

I.Matasova N.B., Graifer D.M., Myltseva S.7., Vladimirov S.N., Zenkova M.A., Karpova G.G. ' " Isolation of ribosomal sub-units containing intact rRNA from human placenta. Estimation of functional activity of 80S ribosomea. //Analytical Biochem. 1991. V.198. N2. P.219-223.

й.Матасова H,В., Зенкова M.А., Мыльцева C.B., Карпова Г.Г. Выделение рибосомных субчастиц из плаценты человека, содержащих интактную рРНК, и определение функциональной активности рибосом. //Молекуляр. биология. 1991. Т.25. Вып.1. С.91-98.

3.Матасова Н.Б., Веньяминова А.Г., Врацких Л.В., Репкова М.Н., Ямковой В.И., Карпова Г.Г. Взаимодействие аналогов мРНК -олигорибонуклеотидов AUGU3> AUGUg и (pU)g с 80S рибосомами из плаценты человека в присутствии родствешшх тРНК и белок-синтезирущей системы. //Молекуляр. биология. 1993. Т.27. Вып.2. С.342-347.

4,МатасоЕа Н.Б., Владимиров С.Н., Булыгин К.Н., Веньяминова А.Г., Врацких Л.В., Мундус Д.А., Репкова М.Н., Ямковой В.И.,

Карпова Г.Г. Структурные элементы бое рибосомы, расположенные вблизи 5'-области мРНК-связывапцего центра. //Молекуляр. биология. 1994. Т.28. Вып.4. С.918-985.