Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование АТРазной активности субчастиц рибосом печени кроликов.

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование АТРазной активности субчастиц рибосом печени кроликов."

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ Інститут молекулярної біології та генетики

г

ПАЛЬЧЕВСЬКИЙ Сергій Станіславовин

УДК 577.217.34 577.217.344 577.5.53 577.217.39

ДОСЛІДЖЕННЯ АТРазної АКТИВНОСТІ СУБЧАСТИНОК РИБОСОМ ПЕЧІНКИ КРОЛІВ

03.00.03 - молекулярна біологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі механізмів трансляції генетичної 'інформації Інститут) молекулярної біології та генетики НАН України (м. Київ).

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор академік НАН України Єльська Ганна Валентинівна,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, зав. відділом механізмів трансляції генетичної інформації.

доктор біологічних наук, провідний науковий співробітник відділу ензимології білкового синтезу Козлов Едуард Андрійович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України; кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник відділу біохімії м’язів Браткова Наталля Федорівна,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

Офіційні опоненти:

Провідна установа:

Київський університет імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії

Захист дисертації відбудеться іРСіЬіЦл 1998 р. о (О год. на засіданн спеціалізованої вченої ради Д 01.86.01 в Інституті молекулярної біології та генетикі НАН України за адресою: 252143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.

год. на засіданн

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці в Інституті молекулярної біологі та генетики НАН України.

Автореферат дисертації розіслано ^ 1МЯ______ 1998 р.

Вчений секретар спеціалізованої Вченої Ради кандидат біологічних наук

Л.Л. Лукаш

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Відомо, що біосинтез білка та структурно-функціональна організація трансляційного апарату еукаріот має деякі специфічні особливості. Так, в циклі елонгації поліпептидного ланцюга у дріжджів та деяких грибів беруть участь три фактори елонгації на відміну від двох - у прокаріот. Третій фактор (EF-3), відкритий в 1976 р. (Skogerson and Wakatama), є рибосомно-залежною АТРазою, яка може гідролізувати також GTP та, меншою мірою, піримідинові нуклеотиди (Dasmahapatra and Chakraburtty, 1981). Показано, що EF-3 стимулює EF-la-залежне зв'язування аа-тРНК з полі(Ц)-програмованою рибосомою, що супроводжується гідролізом АТР, беручи участь в селекції тРНК, спорідненої до кодону в А-сайті (Untará and Miyazaki, 1988) та полегшує дисоціацію деацильованої тРНК з E-сайта рибосоми (Triana-Alonso et al., 1995).

На відміну від розчинного фактора EF-3 рибосоми Tetrahymena pyriformis (Miyazaki and Kagiyaraa, 1990) та ряду ссавців містять міцно асоційовану ATP/GTPa3Hy активність (Grummt et al., 1974; Rodnina et al., 1994). Відкриття АТРази EF-3 дріжджів та існування АТРазної активності, асоційованої з 80S рибосомами деяких еукаріот, дало поштовх до порівняльного дослідження цих активностей (Uritani and Miyazaki, 1988; Rodnina et al., 1994). Висловлено припущення, гцо АТРазна активність 80S рибосом є аналогом EF-3 дріжджів і виконує ту ж саму функцію в циклі елонгації, але це припущення базується суто на непрямих доказах. Тому детальне вивчення властивостей та функціональної ролі АТРазної активності, міцно асоційованої з 80S рибосомами, є актуальним і має значення для більш повного розуміння особливостей біосинтезу білка у вищих еукаріот.

Мета і задачі дослідження. Мета даної роботи полягала в дослідженні та порівнянні АТРазної активності субчастинок 80S рибосом печінки кролів та з’ясуванні функціональної ролі АТРазної активності 80S рибосом в циклі елонгації. У відповідності з вищенаведеним необхідно було вирішити такі задачі:

1. Дослідити АТР аз ну активність субчастинок рибосом печінки кролів.

2. При наявності АТРазної активності, пов’язаної з обома субчастинками, встановити кінетичні параметри та порівняти властивості і активність ферменту субчастинок в умовах, які включають різний склад інкубаційного середовища, присутність інгібіторів АТРази або компонентів апарату трансляції.

3. Оптимізувати реконструйовану систему трансляції для встановлення функціональної ролі АТРазної активності 80S рибосом печінки кролів.

4. Вивчити функціональну роль АТРази 80S рибосом печінки кролів в циклі елонгації.

Наукова новизна та теоретичне значення одержанні результатів. Встановлено, що високоочищені 40S та 60S субчастинки еукаріотичних рибосом печінки кролів містять АТРазну активність, яка в сумі дорівнює активності 80S рибосом. Проведено порівняння каталітичних властивостей АТРази 40S та 60S субчастинок та вивчено вплив низки факторів на АТРазну активність обох субчастинок. Висунуто робочу гіпотезу про існування єдиної спільної АТРазної активності на 80S рибосомі, розміщеної на контактуючих поверхнях 40S та 60S субчастинок.

Вперше розроблено реконструйовану безклітинну білоксинтезуючу систему з печінки кроля, що містить в собі тільки гомологічні високоочищені компоненти апарату трансляції та характеризується високою швидкістю поліпептидного синтезу. Проведено оптимізацію роботи системи при фізіологічній концентрації Mg2+. '

При з’ясуванні ролі АТРази 80S рибосом печінки кролів в циклі елонгації встановлено її безпосередній вплив на взаємодію тРНК з E-сайтом постгранслокаційної рибосоми. АТРаза рибосом стимулює звільнення деацильованої тРНК з E-сайта і тим прискорює перехід рибосоми в претранслокаційний стан.

Схожість дії EF-3 дріжджів та АТРази 80S рибосом печінки кролів на звільнення Е-сайт-зв’язаної деацильованої тРНК дозволяє припустити їх. аналогічну роль в циклі елонгації еукаріот.

Отримані результати мають теоретичне значення, доповнюючи схему циклу елонгації поліпептидного ланцюга у вищих еукаріот функціонуванням АТРази 80S рибосом.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася в рамках плану науково-дослідних робіт відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за грантом № 5.3/16 Державного фонду фундаментальних досліджень по темі "З’ясування ролі АТРазної активності рибосом у біосинтезі білка в еукаріот" та за грантом UBA 200 Міжнародного Соросівського фонду.

Особистий внесок здобувача. Роботу виконано під керівництвом д.б.н., академіка Г.В. Єльської у тісному співробітництві з к.б.н. Г.В. Овчаренко та к.б.н. З.М. Петрушенко, з якими було опубліковано спільні роботи. Особистим внеском автора дисертації була участь у плануванні роботи, виконанні експериментів та обговоренні одержаних результатів. Експериментальні дані, наведені в дисертації, отримано за безпосередньої участі автора.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини, яка включає опис матеріалів та методів дослідження, виклад результатів, їх обговорення, висновків та списку цитованої літератури, який включає 191 найменування. Роботу викладено на 127 сторінках, включаючи 20 рисунків та 3 таблиці.

з

Апробація роботи. Матеріали дисертації доповідалися на міжнародній конференції по структурі та функції рибосоми (Victoria, Canada, 1995) та 16-му міжнародному робочому засіданні по тРНК (Wisconsin-Madison, USA, 1995).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 робіт у вітчизняних та закордонних журналах.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Субчастинки рибосом з печінки кролів отримували за методом (Falvey and Staehelin, 1970) з деякими модифікаціями, як в (Овчаренко и др., 1983). 80S рибосоми отримували реасоціацією 40S та 60S субчастинок у співвідношенні 1:1,2. Препарати сумарної тРНК з

печінки кролів та клітин дріжджів отримували за методом (Btungraber, 1962) з наступною

• ■ Phe •

хроматографією на ДЕАЕ-целюлозі. тРНК отримували хроматографією на БД-целюлозі

(Gillam and Tener, 1971). Сумарні препарати АРСаз та білкові фактори трансляції з печінки

кролів виділяли за модифікованим методом (як в Falvey and Staehelin, 1970). Деацильовані

тРНК^е та rPHKiMet було мічено заміною 5’-кінцевої фосфатної групи на [^Р]фосфат або

32

заміною 3’-кінцевого аденозину на мічений [ Р]аденозин, як описано в (Silberldang et al., 1977; Vlassov et al., 1981). Реакцію вимірювання кількості гідролізованої ATP проводили за методом (Parmeggiani and Sander, 1981). Фракцію активних рибосом визначали зв’язуванням

'і') Phe 14 Php

[ Р]тРНК та Ас[ С]РЬе-тРНК з 80S рибосомами в присутності полі(и). Обмін

[32Р]тРНКіМе1 ^ в Е-сайті посттранслокаційного комплексу на немічену деацильовану

тРНКі^е<; проводили додаванням 10-кратного надлишку останньої над кількістю рибосом в

інкубаційній суміші. Розрахунок констант термоінактивації та кінетичних констант

проводили за допомогою програми наукової та технічної графіки MicroCal Origin 2.8.

Met

Препарати гетерополімерних матриць MF-мРНК та MVF-мРНК, індивідуальних тРНКі , РЬе-тРНК^*16, АсРЬе-тРНК^® AcVal-тРНК^ було отримано співробітниками Інституту молекулярної генетики (Берлін), препарати eEF-la та eEF-2 - співробітниками відділу механізмів трансляції генетичної інформації ІМБіГ (Київ) і люб’язно надано для виконання частини досліджень по з’ясуванню функціональної ролі АТРази в циклі елонгації вищих еукаріот.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Вивчення АТРаіної активності 40S та 60S субчастинок рибосом з печінки кролів.

Попередні дослідження ОТРазної активності рибосом здійснювалися на препаратах цілісних 80S рибосом. Тому першим завданням даної роботи було встановлення наявності АТРазної активності в субчастинках рибосом вищих еукаріот (печінки кролів). Отримані результати свідчать, що 40S та 60S субчастинки, відмиті 0.66 М KCI+NH4CI після дисоціації 80S рибосом печінки кролів, спроможні гідролізувати АТР. У відсутності тРНК гідролітична

активність 40S субчастинок в 1,5-2,0 рази вище від активності 60S субчастинок (Рис. 1.1).

Рис. 1.1 Кінетика АТРазної активності 40S ( ■ ) та 60S ( • ) субчастинок рибосом печінки кролів.

Разом з тим сумарна ефективність гідролізу АТР окремими субчастинками дорівнює гідролітичній активності повної 80S рибосоми. Можливо, що каталітичний центр АТРази 80S рибосом складається з каталітичних центрів цього ферменту на 40S і 60S субчастинках, —або - при - розділенні - рибосомальних - субчастинок білок (білки),—що - відповідає за цю активність, залишається частково в складі 40S або 60S субчастинок. Для того, щоб перевірити чи є виявлена АТРазна активність безпосередньо активністю субчастинок, а не домішкою, була вжита спроба звільнити субчастинки рибосом від АТРази за допомогою високої концентрації LiCl (Рис. 1.2.). Обробка 0,8 М і 1,5 М LiCl приводить до втрати 30% та 60% гідролітичної активності 40S субчастинок відповідно, 60S субчастинки втрачають не більше 20% активності. При обробці 4,0 М концентрацією LiCl практично повністю втрачають АТРазну активність 40S субчастинки, при цьому зберігається 30% АТРазної активності 60S субчастинок. Різна ступінь зв’язку АТРази з 40S та 60S субчастинками, вірогідно, є наслідком різної структурної організації самих субчастинок та більш міцною асоціацією АТРази з 60S субчастинкою.

В процесі дослідження властивостей АТРази 40S та 60S субчастинок необхідно було вирішити питання - існує одна чи декілька АТРаз на рибосомі, які спільні та відмінні риси АТРазної активності субчастинок. При цьому виходили з таких припущень: 1) кожна

Час, хв

субчастинка має свою структурно та функціонально незалежну АТРазу; 2) АТРаза кожної субчастинки - частки одного ферменту 80S рибосоми з декількома сайтами, яка при дисоціації рибосом залишається зв’язаною як з 40S, так і з 60S субчастинками. Це є досить

вірогідним, якщо АТРаза знаходиться між контактуючими ділянками субчастинок в 80S рибосомі.

Рис. 1.2. Вплив обробки високої концентрації LiCl на АТРазну активність 4OS ( А ) та 60S ( Б ) субчастинок рибосом печінки кролів.

( ■ ) - без обробки IJCI ( • ) - оброблені O.SMLiCl ( ▲ ) - оброблені 1.5 MLiCl ( ♦ ) - оброблені 4.0МLiCl Дослідження АТРази субчастинок рибосом проводили в присутності певних чинників, за допомогою яких можна вивчати деякі характеристики каталітичної активності АТРази субчастинок. До першої групи можна віднести схожі характеристики: субстратна специфічність АТРаз субчастинок, оптимум концентрації NH4+, чутливість ферментів до метаванадату

амонію та величина Кщ Для субстрату АТР. Другу групу склали залежність від концентрації

2+ • •

Mg та поліамінів, стабільність АТРази 40S та 60S субчастинок при обробці LiCl,

чутливість ферменту до такого інгібітору як алкалоїд еметін та вплив різних функціональних форм тРНК на АТРазу субчастинок. Як з’ясувалось, фактори, що визначають другу групу властивостей, суттєво змінюють рівень АТРазної активності 40S субчастинок в порівнянні з АТРазною активністю 60S субчастинок. Підвищену чутливість АТРази 40S субчастинок на дію різних чинників можна пояснити більшою доступністю її просторової структури в порівнянні з АТРазою 60S субчастинки.

Стосовно субстратно! специфічності, АТРаза обох субчастинок рибосом є аналогічною АТРазі EF-3 дріжджів. Найбільший рівень інгібування АТРазної активності мав

Час, хв

Час, хв

місце в присутності аналогів АТР та GTP, що не гідролізуються - AMPPNP та GMPPNP; при цьому ефективність інгібування АТРази обох субчастинок аналогами, що не гідролізуються, схожа. Вплив нуклеотиддифосфатів ADP, GDP та трифосфатів СТР, UTP на АТРазну активність 40S та 60S субчастинок значно менший.

Найбільш важливими агентами, що впливають на конформацію рибосом, а відповідно

можуть впливати і на АТРазу рибосом, вважають двохвалентні катіони і, в першу чергу,

2+ • • • Mg . Максимальний рівень АТРазної активності 40S субчастинок спостерігали в інтервалі

5-7 мМ MgCl2, для 60S субчастинок максимальну активність було виявлено при більш

високій концентрації MgCl2 - біля 10 мМ. Оптимум АТРазної активності 6US субчастинок

чітко не виражений і не має

колоколоподібного характеру (Рис. 1.3).

Рис. 1.3. Залежність гідролізу АТР 40S ( ■ ) та 60S ( • ) субчастинками рибосом від концентрації MgCi>

Спермін та спермідін більш значною мірою впливають на активність АТРази 40S субчастинок - при наявності в системі 0,5 мМ сперміну та спермідіну ця активність зростає на 30-40%, при цьому активність АТРази 60S субчастинок практично не змінюється

(Рис. 1.4)______________________________ _____________________ _________________

Оптимум концентрації NH4CI однаковий для АТР аз 40S та 60S субчастинок рибосом і знаходиться в межах 100-150 мМ (дані не наведено).

МдСІ,, мМ

Поліаміни, мМ

Рис. 1.4. Вплив поліамінів (сперміну та спермідіну) на АТРазну активність 40S ( ■ ) та 60S ( • ) субчастинок рибосом.

Відомо, що рибосомальні субчастинки відрізняються сайтами зв’язування тРНК. Так, ці сайти на 40S субчастинці є частинами А- та Р- сайтів 80S рибосоми. Третій (Е-) сайт, пов’язаний з 60S

субчастинкою, формується при асоціації субчастинок в 80S рибосому. Тому було цікаво

вивчити вплив зв’язування з субчастинками рибосом деацильованої тРНК (кодон-

• РЬ^ *Pbft

специфічної тРНК й кодон-неспецифічних тРНК’ ) та аналогу пептидил-тРНК - AcPhe-

phe

тРНК на АТРазну активність субчастинок рибосом. Згідно з таблицею 1.1

Таблиця 1.1

Вплив тРНК па АТРазну активність 40S та 60S субчастинок рибосом печінки кролів.

Форма тРНК Концентрація Рівень гідролізу ATP, %

40S 60S

Контроль 100 100

контроль без полі(и) 100 100

тРНК'РІіе 1,2 мкМ 100 100

TPHKPhe 0,6 мкМ 110 100

TPHKPhe 1,2 мкМ 130 100

AcPhe-TPHKPhe 0,6 мкМ 140 100

Phe

додавання кодон-специфічної тРНК в концентрації 1,2 мкМ веде до 30% стимуляції

активності АТРази 40S субчастинок рибосом, активність АТРази 60S субчастинок при цьому Phe

не змінюється. AcPhe-тРНК вже в концентрації 0,6 мкМ підвищує АТРазну активність

40S субчастинок на 40% і не впливає на активність АТРази 60S субчастинок рибосом.

. . ■ -Phe

Контрольні експерименти показали , що ні полі(Ц), ні кодон-неспецифічні тРНК не

впливають на рівень гідролізу АТР обома субчастинками рибосом.

Відсутність ефекту різних форм тРНК на АТРазу 60S субчастинок можна пояснити

тим, що велика рибосомна субчастинка сама по собі не зв’язує жодної з форм тРНК, в той

час як 40S субчастинки рибосом з печінки кролів зв’язують по дві молекули аміноацил-,

• Phe

пептидил- або деацильованої тРНК. Зв’язування кодон-специфічної тРНК , а ще більше Phe

AcPhe-тРНК , яке відбувається за даних умов експерименту як з А-, так і з P-сайтом 40S субчастинки рибосоми, чітко стимулює АТРазну активність 40S субчастинки. Ці дані, певною мірою, свідчать про те, що функціонування АТРази може бути пов’язано з процесом взаємодії різних форм тРНК із рибосомою.

В наступних експериментах вивчався вплив деяких інгібіторів АТРаз і білкового синтезу на активність 40S та 60S субчастинок рибосом. Метаванадат амонію було обрано тому, що він є ефективним інгібітором таких АТРаз як Na+, К+-АТРази, міозинова АТРаза (Macara, 1980) і в той же час інгібує трансляцію в деяких еукаріотичних системах (Uritani and Miyazaki, 1988). З’ясувалось, що в присутності метаванадату амонію активність АТРази 40S та 60S субчастинок понижується однаково (Рис. 1.5, А). Знайдено, що іншим ефективним

інгібітором АТРази рибосом та їх субчастинок є еметін. Цікаво, що еметін інгібує синтез поліпептидів в білоксинтезуючих системах вищих еукаріот, але не впливає на EF-1-залежне зв'язування і EF-2-промотуєму транслокацію, а також не блокує транспептидацію (Vazquez, 1979). Отримані дані дають можливість припустити, що дія еметіну відбувається, принаймні частково, на рівні інгібування рибосомної АТРази. Характер кривих інгібування еметіном АТРазної активності обох субчастинок дещо відрізняється - 40S субчастинки більш чутливі до дії інгібітору (Рис. 1.5, Б).

Рис. 1.5. Вплив ванадату амонію (А) та еметіну (Б) на активність АТРази 40S ( ■ ) та 60S (• ) субчастинок рибосом.

Попередні дані вказують на те, що каталітичний центр АТРази повної рибосоми є гібридним і складається з двох центрів, які відрізняються своїми функціональними параметрами (Rodnina et al, 1994). На відміну від параметрів АТРази повної рибосоми, АТРазні центри обох субчастинок рибосоми характеризуються практично однаковою спорідненістю до субстрату - АТР, хоча каталітична активність центру АТРази 40S субчастинок дещо вище. Визначені в цій роботі величини Кш та k„t для обох субчастинок рибосом наведено в таблиці 1.2.

Таблиця 1.2

Кінетичні параметри АТРаз 4OS та 60S субчастинок рибосом печінки кролів.

Кт, мкМ к^хв 1

40S 149 7.5

60S 154 5.4

Цікаво, що каталітичні характеристики АТРаз субчастинок не відповідають кінетичним параметрам жодного з АТРазних центрів повної рибосоми. Однак, спостерігається деяка подібність в зміні гідролітичної активності ферменту 80S рибосоми та її субчастинок в присутності різних функціональних форм тРНК. Так, рівень АТРазної активності 40S субчастинки підвищується в присутності кодон-специфічної тРНК, за таких умов спостерігається активація одного з каталітичних центрів АТРази на 80S рибосомі. Від присутності тРНК (в інкубаційній суміші) не залежить як активність АТРази 60S субчастинки, так і другого каталітичного центру АТРазної активності 80S рибосоми. Враховуючи, що кінетичні характеристики обох центрів АТРази 80S рибосоми відрізняються від параметрів АТРаз субчастинок, можна припустити, що асоціація-дисоціація рибосом є суттєвою для структурно-функціональної організації АТРазних центрів. В той же час, здатність одного з центрів стимулюватися тРНК, очевидно, меншою мірою залежить від цілісності рибосоми і проявляється на рівні 40S субчастинки так само, як і на рівні 80S рибосоми.

Враховуючи все вищевикладене, припущення про існування єдиної спільної АТРази, яка розміщена на контактуючих поверхнях субчастинок, є більш вірогідним. При дисоціації рибосом фермент може залишатися зв’язаним частково з однією і, частково, з другою субчастинкою так, що в препараті є суміш 40S (або 60S) субчастинок вільних від АТРазної активності та зв’язаних з ферментом. АТРаза, що пов’язана з обома видами субчастинок, зберігає свою активність після дисоціації 80S рибосоми, беручи до уваги навіть можливі структурні зміни центрів АТРази або їх оточення в процесі дисоціації. Проте, необхідно відзначити, що ці зміни є істотними для функціонування АТРази, бо після дисоціації 80S рибосоми каталітичні параметри ферменту суттєво змінюються. Для остаточного вирішення питання про локалізацію АТРази на рибосомі та виявлення білків(а), що беруть участь у формуванні її каталітичних центрів, необхідні спеціальні структурні дослідження.

2. Функціональна роль АТРази 80S рибосом.

Дослідження ролі АТРазної активності в циклі елонгації поліпептидного ланцюга провадили на цілісних рибосомах із печінки кролів. Для цього, перш за все, було необхідно отримати реконструйовану безюгітинну систему трансляції на основі гомологічних компонентів. По-друге, цю систему необхідно було оптимізувати щодо швидкості поліпептидного синтезу за умов використання іонів та поліамінів в концентраціях, що відповідають фізіологічним. Розроблена в даній роботі реконструйована безклітинна

білоксинтезуюча система містила в собі високоочищені компоненти апарату трансляції з печінки кроля.

Характерною особливістю модельних систем, за допомогою яких вивчають

• 2+

поліпептидний синтез, є присутність в них досить високої концентрації іонів Mg . Вона

2+ • обумовлена тим, що оптимальна концентрація Mg для синтезу поліпептидів in vitro та

зв’язування тРНК на рибосомі для різних систем знаходиться в діапазоні від 8 до 25 мМ. При

• 2+ • зменшенні концентрації Mg в модельних системах відбувається падіння ефективності

синтезу поліпептидів та відповідне зменшення здатності рибосомальних сайтів зв’язувати

2+ + • тРНК. Внесення в Mg /NH4 систему з К coli поліамшів призвело до підвищення рівня

синтезу полі(РЬе) та відновлення здатності рибосом кількісно зв’язувати тРНК при низьких '2+

концентраціях Mg (Rheinberger and Nierhaus, 1987). В реконструйованій системі трансляції з печінки кролів були підібрані оптимальні концентрації іонів та поліамінів для синтезу полі(РЬе) та для зв’язування тРНК з програмованими рибосомами, які дорівнюють 100-150 мМ NH4CI, 4-5 мМ MgCl2, 0.6 мМ спермін, 0.8 мМ спермідін.

Швидкість в розробленій нами системі досягала 0.2-0.4 пептидних зв’язків за 1 с на рибосому, що характеризує отриману систему як найбільш ефективну серед відомих реконструйованих систем з вищих еукаріот. При вивченні функціонування рибосоми особливу актуальність набуває точне визначення кількості тРНК-зв’язуючих сайтів на рибосомі, що, перш за все, необхідно для визначення фракції активних рибосом. Вперше запропонований механізм білкового синтезу грунтувався на класичній двухсайтовій моделі, що постулює існування принаймні двох фізично та функціонально різних сайтів зв’язування тРНК на рибосомі (Watson, 1964). З часом, було показано, що рибосоми прокаріот (Rheinberger and Nierhaus 1980), архебактерій (Saruyama and Nierhaus, 1986), нижчих еукаріот (Triana-Alonso et al., 1995), еукаріот (Rodnina et al., 1988) спроможні зв'язати три молекули тРНК. Але нещодавно з’явилась публікація, в якій було повідомлено, що рибосоми вищих еукаріот мають на додаток до канонічних A-, Р-, Е- сайтів четвертий “S” сайт (Rodnina and Wintenneyer, 1992).

Тому нами було перевірено кількість сайтів зв’язування тРНК на 80S рибосомі з

печінки кролів. Перш за все було встановлено, який процент складає фракція активних

14 Phe

рибосом. Це визначення проводили за допомогою Ас[ CJPhe-тРНК - в присутності

• 14 Phe

полі(Ц) 1.66 молекули Ас[ С]РЬе-тРНК зв’язувалось з однією рибосомою (Рис. 2.1).

Оскільки з однією рибосомою може максимально зв’язатися дві молекули 14 Phe

Ас[ C]Phe-TPHK , то, очевидно, що активні рибосоми складають 83% від усіх рибосом в препараті.

Рис. 2.1. Титрування 80S рибосом печінки кролів Ac[,',C]Phe-mPHKpb' в присутності ( • ) тау відсутність (О) полі(Ц).

Відомо, що пептидил-тРНК може

займати тільки А- та Р-сайти полі(Ц)-

програмованих 80S рибосом, в той час, як

деацильована тРНК спроможна зв’язатися

з усіма можливими сайтами. Виходячи з

цього, кількість сайтів зв’язування тРНК

визначали по максимальній кількості молекул деацильованої тРНК, що можуть приєднатися

до однієї 80S рибосоми (Рис. 2.2). З’ясувалось, що в присутності полі(Ц) приблизно 2.4 32 Phe

молекул [ Р]тРНК зв’язується з однією 80S рибосомою, без полі(Ц) - 1.25 молекул [32Р]тРНКРЬе.

Рис. 2.2. Титрування 80S рибосом f32PJmPHKв присутності ( в ) та у відсутність ( О ) полі(Ц).

Беручи до уваги, що тРНК зв’язують тільки активні рибосоми, які складають 83%, одна рибосома приєднує 2,9 молекул тРНК, тобто 80S рибосома з печінки кролів має тільки три сайти зв’язування тРНК, що узгоджується з абсолютною більшістю даних, отриманих іншими авторами. Виходячи з того, що рибосоми бактерій, архебактерій, нижчих та вищих еукаріот містять три тРНК-зв'язуючих сайти, можна дійти висновку, що існування А, Р та Е сайтів є універсальною особливістю структури рибосом.

На цей час дослідження функціональної ролі АТРази на окремих етапах елонгації проведено тільки для EF-3 в системі трансляції дріжджів. З метою визначення функціональної ролі АТРази 80S рибосом, по аналогії з EF-3, було вивчено дисоціацію деацильованої тРНК з E-сайта рибосом в посттранслокаційному стані та можливий вплив рибосом-зв’язаної АТРази на “chasing“ деацильованої тРНК, зв’язаної з Е-сайтом.

пмоль/пробу

Необхідною передумовою цих досліджень є отримання рибосом у посттранслокаційному стані з сайт-специфічним розташуванням тРНК. З цією метою було отримано комплекс рибосома-мРНК, з яким зв’язували, у відповідності з послідовністю реакцій, що відбуваються поетапно в циклі елонгації, функціональні форми тРНК. Реакція транслокації пептидил-тРНК з А-сайта в Р-сайт з одночасним переміщенням деацильованої тРНК з Р-сайта в Е-сайт каталізується EF-2, який було отримано в високоочищеному стані. Було використано гетерополімерні мРНК, що дало змогу недвозначно визначати розташування індивідуальних тРНК у відповідних сайтах на рибосомі. В постгранслокаційних комплексах гетерополімерні мРНК містили в середині два (MF-mPHK), або три (MVF-мРНК) кодони, AUG для метіоніну (М), UUC для фенілаланіну (F) і GUC для валіну (V).

Як вже згадували, функціональне значення рибосомальної АТРази 80S рибосом печінки кролів на функціонування Е-сайта було вивчено прямою перевіркою дії цього ферменту на “chasing” деацильованої тРНК, зв’язаної з Е-сайтом. Для деацильованої тРНК властиве стабільне зв'язування з Е-сайтом 80S рибосом печінки кролів. Так, приблизно від 15 до 20 % [32Р]тРНКі^й, яка зв'язана з цим сайтом, може обмінюватися при додаванні неміченої TPHK¡^et в 10-кратному надлишку над рибосомами. Вивчення дії АТР на звільнення тРНК проводили на посттранслокаційному комплексі 80S рибосом, програмованих MVF-мРНК. В присутності 3 мМ АТР дисоціація [^Р]тРНКі^е1 з Е-сайта збільшувалась до 50 %, тобто гідроліз АТР робить зв'язок деацильованої тРНК з цим сайтом більш лабільним. З використанням посттранслокаційного комплексу, в якому 80S рибосоми, програмовані MF-mPHK, містили ["^P]tPHK¡^c* в Е-сайті та Ас[' ^С]РЬс-тРНКР^с в Р-сайті,

було вивчено залежність обміну деацильованої [32Р]тРНКі^еІ від концентрації АТР (Рис. 2.3).

Рис. 2.3. Ефективність обміну деацильованої f2P¡mPHK¡,’> зв’язаної з Е-сайтом пост-

транслокаційного комплексу при різних концентраціях АТР в присутності 10-кратного надлишку неміченої тРНКі,Л.

АТР, мМ

1 Val 14 php

Показано, що кількість молекул Ас[ Н]Уа1-тРНК або Acf С]РЬе-тРНК ,

зв’язаних з P-сайтом, залишалася незмінною, що свідчить про сайт-специфічний (пов’язаний

з обміном тРНК тільки на Е-сайті) ефект дії АТРазної активності. Згідно рис. 2.4, GTP

викликає значний, але нижчий рівень обміну тРНК на Е-сайті в порівнянні з АТР, в той час

як аналоги, що не гідролізуються, а саме AMPPNP та GMPPNP навіть зменшують

ефективність обміну приблизно до 5%. Це свідчить про те, що гідроліз ATP/GTP є

обов’язковим для виявлення впливу АТРази 80S рибосом печінки кролів на дисоціацію

деацильованої тРНК з Е-сайта.

Рис. 2.4. Залежність ефективності' обміну зв’язаної з Е-сайтом f2PJmPHKі** при 10-кратному надлишкові неміченої тРНК?'* в присутності 3 мМ ATP, GTP та їх аналогів, що не розщеплюються.

Відсутність так званого “S” сайту (Rodnina and Wmtermeyer, 1992), на який могла б бути спрямована дія АТРази, було поведено експериментами на посттранслокаціиному комплексі 80S*MVF-mPHK, що містив в Е-сайті [3^Р]тРНКі^й, а в Р-сайті Ас[3Н] Val-тРНК^. Спочатку проводили інкубацію

14 Phe

цього комплексу з потрійним комплексом eEF-la*GTP*[ С]РЬе-тРНК для фактор-іалежного зв’язування аа-тРНК з А-сайтом, а потім проводили повторний цикл транслокації, додаючи eEF-2 фактор. Після проведення фактор-залежної транслокації, згідно пуроміциновій реакції, 75% [^C]Phe знаходилося в Р-сайті, вірогідно, в формі дипептиду AcVal-Phe-тРНК. Аналіз цього посттранслокаційного комплексу виявив, що рівень [32Р]тРНК iMet, зв’язаної з рибосомою, значно зменшився - з v-0,46 до v=0.08. Це свідчить про те, що деацильована тРНК майже повністю дисоціює з рибосоми при наступному раунді глонгації, тобто функціонування Е-сайта на 80S рибосомі повністю відповідає прокаріотичній рибосомі і, таким чином, існування “S” (четвертого) сайта, що утримує тРНК протягом декількох циклів елонгації, нами не було підтверджено.

Встановлені особливості функціонування АТРази 80S рибосом печінки кролів, тевною мірою, узгоджуються з функціями АТРази EF-3 дріжджів, які обговорюються в

рамках трьохсайтової моделі елонгації (Triana-Alonso et al., 1995). Згідно моделі, А- та Е-сайти алостерично зв'язані негативною кооперативністю: зв'язування тРНК з одним сайтом зменшує спорідненість тРНК до другого і навпаки. Функціонування АТРази EF-3, що супроводжується гідролізом АТР, можливо, індукує конформаційні зміни в рибосомі і стимулює звільнення зв'язаної з E-сайтом дєацильованої тРНК з одночасним EF-la-залежним зв'язуванням аа-тРНК з A-сайтом. Імовірно, EF-3, синергічно функціонуючи з EF-la, стимулює перехід рибосоми з пост- до претранслокаційного стану, що супроводжується дисоціацією дєацильованої тРНК з Е-сайта.

Отримані нами дані разом з попередніми (Rodnina et al., 1994) свідчать про подібність роботи АТРаз EF-3 дріжджів та 80S рибосом вищих еукаріот, яка виражається у стимуляції ефективності обміну тРНК, зв'язаної з E-сайтом, та стимуляції EF-la-залежного зв'язування аа-тРНК з A-сайтом рибосоми. Це дає змогу вважати цілком імовірним, що АТРаза 80S рибосом вищих еукаріот, подібно EF-3, впливає на перехід рибосоми з пост- до претранслокаційного стану, тобто виконує ту ж саму функцію в циклі елонгації.

Безперечно, що остаточне розуміння молекулярних механізмів функціонування АТРази 80S рибосом вищих еукаріот в елонгаційному циклі потребує подальшого вивчення, зокрема, виявлення білка (білків), що відповідають за АТРазну активність й вивчення організації та взаємодії АТРазних центрів.

___________________________________ ВИСНОВКИ ____________ ________

1. Встановлено, що високоочищені 40S та 60S субчастинки еукаріотичних рибосом печінки кролів проявляють ендогенну АТРазну активність. Сума активностей АТРаз субчастинок дорівнює активності АТРази 80S рибосоми.

2. Вивчено вплив іонного середовища на АТРазну активність субчастинок та виявлено різницю в оптимальних концентраціях Mg2*: 5-6 мМ для 40S субчастинки та 10 мМ для 60S субчастинки.

3. Виявлено несуттєву різницю в кінетичних параметрах АТРази субчастинок, які становлять для 40S: к«* 7.5 хв'\ Кт 150 мкМ; для 60S: k«t 5.4 хв"\ Кт 155 мкМ.

4. Виявлено, що АТРаза 40S субчастинки, на відміну від АТРази 60S субчастинки, може бути стимульована різними формами тРНК, більш стимулюючий ефект притаманний пептидил-тРНК.

5. Досліджено вплив специфічних інгібіторів АТРаз та білкового синтезу (ванадату імонію та еметіну) на АТРаз ну активність субчастинок. Показано, що еметін більш :фективно інгібує АТРазну активність 40S субчастинок.

6. Вивчення функціональної ролі АТРазної активності 80S рибосом в циклі елонгації іало змогу припустити, що рибосомиа АТРаза, подібно EF-3 дріжджів, завдяки гідролізу VTP/GTP стимулює перехід рибосоми з пост- в претранслокаційний стан, чим полегшує (исоціаиію леацильованої тРНК з Е-сайта рибосоми і звязування аа-тРНК з А-сайтом.

СПИСОК РОБІТ, ІЦО ОПУБЛІКОВАНІ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

. Овчаренко Г.В., Пальчевский С. С., Ельская А. В. АТРазная активность 40S и 60S субъединиц рибосом печени кроликов // Укр. біохім. журнал. - 1997. - Т. 69. - № 3. -С. 17-22.

Пальчевский С.С. Использование полиаминов для создания высокоэффективной реконструированной системы биосинтеза белка из печени кролика // Биополимеры и клетка.- 1997.-Т. 13. -№ 1. - С. 18-21. і. El’skaya A.V., Ovcharenko G.V., Palchevskii S.S., Petrushenko Z.M., Triana-Alonso F.J.,

and Nierhaus K.H. Three tRNA binding sites in rabbit liver ribosomes and role of the intrinsic ATPase in 80S ribosomes from higher eukaryotes // Biochemistry. - 1997. - v. 36, № 34. -P. 10492-10497.

.. Серебряник А.И., Пальчевский C.C., Ельская A.B. Рибосомная АТРаза высших

эукариот. - К: 1997. - 32 с. (Препр. / НАН Украины. Ии-т молекулярной биологии и генетики).

. El’skaya A.V., Negrutskii B.S., Turkovskaya G.V., Ovcharenko G.V., Shalak V.F.,

Pal’chevskii S.S., Budkevich T.V. “Specific Features of Higher Eukaryotic Translation Machinery” // Frontiers in Translation. An International Conference on the Structure and Function of the Ribosome. - Victoria (Canada). - 1995. - P.168.

'. A. El’skaya, S. Pal’chevskii, F. Triana and K. Nierhaus. “Higher Eukaryotic tRNAs in the

Ribosomal Elongation Cycle” // 16th International tRNA Workshop. - University of Wisconsin-Madison (USA). - 1995. - P. 114.

АНОТАЦІЯ

Пальчевський С.С. Дослідження АТРазної активності субчастинок рибосом печінки кролів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 - молекулярна біологія. -Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 1998.

Дисертаційну роботу присвячено дослідженню спроможності високоочищених субчастинок еукаріотичної рибосоми гідролізувати АТР та встановленню призначення АТРазної активності в циклі елонгації вищих еукаріот. Проведено порівняння кінетичних параметрів АТРази 40S та 60S субчастинок, вивчено вплив інгібіторів, компонентів білоксинтезуючого апарату, стабільність АТРазної активності. Обгрунтовано припущення про існування єдиної АТРази на 80S рибосомі, яка знаходиться на контактуючих поверхнях 40S та 60S субчастинок. Розроблено реконструйовану безклітинну білоксинтезуючу систему з печінки кролів, що містить високоочищені гомологічні компоненти апарату трансляції. Отримані данні свідчать про те, що ендогенна АТРаза вищих еукаріот виконує подібну функцію з третім фактором елонгації дріжджів (EF-3), яка полягає в прискоренні переходу 80S рибосоми з пост- в претранслокаційний стан.

Ключові слова: субчастинки рибосом, АТРазна активність, цикл елонгації, EF-3 дріжджів.

___АННОТАЦИЯ ______________ ___

Пальчевский С.С. Исследование АТРазной активности субчастиц рибосом печени кроликов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология, Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 1998.

Диссертационная работа посвящена исследованию способности высокоочищенных субъединиц эукариотической рибосомы расщеплять АТР и установлению роли АТРазной активности в цикле элонгации высших эукариот. Проведено сравнение кинетических параметров АТРазы 40S и 60S субъединиц, изучено влияние ингибиторов, компонентов белоксиктезирующего аппарата, стабильность АТРазной активности. Высказано

предположение о существовании единой АТРазы на 80S рибосоме, расположеной на контактирующих поверхностях 40S и 60S субъединиц. Разработана реконструированная бесклеточная белоксинтезирующая система из печени кроликов, содержащая

псокоочищенные гомологичные компоненты аппарата трансляции. Полученные данные тдетельствуют о том, что эндогенная АТРаза высших эукариот выполняет сходную ункцию с третьим фактором элонгации дрожжей (EF-3), которая заключается в ускорении прохода 80S рибосомы из пост- в претранслокационное состояние.

Ключевые слова: субчастицы рибосом, АТРазная активность, цикл элонгации, EF-3 южжей.

SUMMARY

Pakhevskii S.S. Investigation of ATPase activity of the rabbit liver ribosomal subunits. -nnuscript.

Thesis for a degree of Doctor of Philosophy (Ph.D.) in Biology, specialization 03.00.03 -olecular Iliology, The Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of •.icnccs of Ukraine, Kiyv, 1998.

The ability of highly purified 40S and 60S subunits of rabbit liver ribosomes to hydrolyze IT has been investigated. The kinetic parameters of 40S and 60S subunit’s ATPases -have been spared and the effect of the inhibitors, translational components and stability of ATPases have cn studied. The data presented indicate the existence of one enzyme on the 80S ribosome which is :ated on the contacting surfaces of 40S and 60S subunits. A cell-free reconstructed protein-nthesizing system from rabbit liver has been created to elucidate a functional role of the ribosomal [Tase. The results seem to prove that the intrinsic higher eukaryotic ATPase fulfills the same iction as the yeast third elongation factor (EF-3), namely facilitates the release of the deacylated NA from the E site promoting the transition of 80S ribosomes from post- to pretranslocation state.

Key words: ribosomal subunits, ATPase activity, the elongation cycle, yeast EF-3.

Підписано до друку 09.04.98 р. Формат 60x90/16. Ум. друк. арк. 1,0. Обл.-вид. арк. 0,8. Наклад 100. Зам. 89.

Відділ оперативної поліграфі! Центру Міжнародної освіти 252005, м.Київ, вул. Червоноармійська, 57/3, к.101. 227-12-75, 227-37-86