Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование транслирующих рибосом, избирательно меченых дейтерием, методом малоуглового нейтронного рассеяния

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование транслирующих рибосом, избирательно меченых дейтерием, методом малоуглового нейтронного рассеяния"

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУХБЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УССР

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ АН УССР

На правах рукописи

ГУЛЯМОВА" Дильнора Эргашевна

УДК 547.963.3

ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАНСЛИРУЮЩИХ РИБОСОМ, ИЗБИРАТЕЛЬНО МЕЧЕНЫХ ДЕЙТЕРИЕМ, МЕТОДОМ МАЛОУГЛОВОГО НЕЙТРОННОГО РАССЕЯНИЯ

03. 00. 03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 1991

Работа выполнена в Институте белка АН СССР. Научный руководитель : доктор фазкко - иагеыатических наук, профессор И. Н. Сердвк

Официальные оппоненты : Доктор физико-матеыатических наук Л. А. Фзйтан. ДОКТОр биологических наук

В.Д. Васильев

Ведущая организация : Объединенный институт ядерных исследований АН СССР.

£-Г

Зафгга состоится UX'-Ju. pltl 1991 года в ¡0 часов на заседашш СнецаашзироЕанного Совета Д 016.II.01 при Институте молекулярной биологии и генетики АН УССР по адресу : 252627, Киев-143, ул. Заболотного, 150.

С диссертацией mosho ознакомиться в библиотеке Института колзкулярной биологии и гепатит АН УССР-. Автореферат разослан 1991 года

УчанкЭ секретарь Специализированного Совета ДОКТОР кедацинсюп наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМИ. Изучение механизма биосинтеза белка на рибосоме является фундаментальной проблемой молекулярной биологии. Одной из интереснейших задач, связанных с синтезом белка на рибосоме, является установление взаимосвязи между той или иной стадией синтеза белка со структурными изменениями в рибосомной частице. Решение этой задачи наиболее уместно при исследовании стадии транслокации, т. к. экспериментально установлено, что стадия транслокации сопровождается перемещением крупных лигандов на-рибосоме, а именно, освобождением деацилированной тРНК из Р-участка, переходом пептидил- тРНК из А- участка в Р-участок и сдвигом матричного полинуклеотида на один кодон.

Рядом авторов были выдвинуты модели, согласно которым, движущим механизмом транслокации является конформационное изменение самой рибосомной частицы ¡Бр1г1п, 1969, Вге1;с11ег,19б9]. Так, модель А.С.Спирина базируется на идее о том, что периодическая подвижность рибосомннх субчастиц относительно друг друга является приводным механизмом транслокации. Из модели следует, что компактность рибосомы в- двух, функциональных состояниях (до транслокации- в пре-транслокационном состоянии и после транслокации - в пост-транслокационном состоянии) должна отличаться.

Наличие изменений в структуре рибосомы при транслокации было показано в работе [ЭрШп ег а1., 198Т1, в которой транслирующие 7Ш рибосомы, полученные с использованием метода твердофазной системы трансляции в двух функциональных состояниях, были исследованы методом вариации контраста в нейтронном рассеянии. Установлено изменение компактности рибосомы при транслокации порядка 3 2.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ состояла в исследовании вопроса, является ли наблюдаемое изменение компактности рибосомной частицы при транслокацш результатом смещения рибосомных субчастиц относительно друг друга, или изменение затрагивает только одну из субчастиц ? Для решения этого вопроса методом нейтронного рассеяния необходимо, чтобы в рибосомной частице одна- субчастица отличалась от другой по своим свойствам в рассеянии нейтронов. Наиболее простой путь получения рибосомных частиц с такими свойствами состоит в реконструкции рибосом из протонированных и дейтерированвых субчаствд, т. е. в получении гибридных-изотопных рибосомных частиц. Дейтерарованные рибосомнне частицы можно

получить путем выращивания клеток E.coll на среде, содержащей Вг0. Выращивание клеток Е. coll на среде, содержащей 79% • Бг0 и Н-глюкозу в качестве источника углерода, позволяет получать рибосомные частица, в которых плотности амплитуд рассеяния РНК и белка близки. Такие рибосомные частицы в 31% Ъ£0 в смеси H£Q-D£0 однородна в рассеянии нейтронов. Таким образом, исследуя различные гибридные-изотопные частицы, в которых дейтерированная субчастица "невидима" в- рассеянии нейтронов, можно оценить вклад цротонированной субчастицы в рассеяние, и следовательно в •наблюдаемое изменение кошактности рибосомы при транслокации.

Для решения этой задачи нами были сконструированы следующие типы рибосошшх частиц. Рибоссмная частица, состоящая' из протонированных субчастиц - 70S t(H)-30S*(H)-50S). Еибосомная частица, состоящая из дэйтернрованннх субчастиц - 70S С(D)-30S*(B)-50SI. Рибосомная частица, состоящая из дейтерированной 30S субчастицы и протонированной БШ субчастицы -70S [(D)-30S*(H)-60S]. Рибосомная частица, состоящая из реконструированной из дейтерированной I6S РНК и протонированных белков 30S субчастицы и дейтерированной 50S су0частицы-703 С((D)-PHK' (Н)-Белок)-303*(В)-503].

Научная новизна Впервые проведено систематическое исследование компактности различных гибридных-изотопных частиц, находящихся в пре- и пост-транслокационном состояниях. Показано, что процесс транслокации сопровождается изменением компактности белкового компонента 30S субчастицы и менее выраженным изменением компактности РНК- ового компонента 50S субчастицы. При этом, вероятно, также происходит изменение расстояния между центрами инерции субчастиц рибосомы.

Полученные результаты могут быть использованы при построении молекулярных моделей транслокации.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИЯ. Диссертационная работа состоит из трех частей : обзора литературы, • экспериментальной части и результатов. В обзоре литературы представлен анализ экспериментальных данных по структурной динамике транслирующей рибосомы и компонентов аппарата трансляции. В главе 2 экспериментальной части описаны материалы и методы, использованные в настоящем исследовании. Глава.3 посвящена результатам работы по исследованию компактности гибридных-изотопных рибосом и их обсуждению. Работа иллюстрирована II рисунками и б таблицами.

- э -

ШБЛпКДШЯ. По теш диссертации опубликованы 2 печатные работы!

глдвд 2. (¿атеншы и метода.

Еырагявснве В. coli (ÜSE-500). Бактерии выращивали в условиях жидкой культура на синтетической среда»М-Э, содержащей глюкозу в качестве источника углерода. Для получеши дейгерированных и протонированных бактерий вырэциваниз проводили на средах, содержащих в качества растворителя IDgO} и [Н20], соответственно. В I литре срэды содержалось : KHgPO^-6 гр.- Iîa2HP04-I4 rp. NaCl-I гр. ГШдС1-2гр. СаС1г-2Н20- 0,015 гр. EgS04*7H20-0,025 гр, [Н1]-глюкоза-4 гр.

На I л среда добавляй! 50 мл инокулята, выращенного на среде такого гге состава. Бактерии выращивали при 37° С с интенсивной аэрацией до 2/3 логарш&.аческой фазы и промывали на холода физиологическим раствором < 0.14 M NaCl), а затем буфером 10 мМ тряс HCl (рН-7.4), содержащим 10 MM Mg012> 22 (Л ШДС1, 0.1 мМ EDÎA. После промывок бактериальную массу отжимали

центрифугированием (ID ООО od/мин. 30 мин), замораживали в жидком азоте и хранили при - 70° С. Важно отметить, что DgO вызывает замедление роста клеток Е. coli. Время генерации клеток Е. coll увеличивается вдвое.

Бэдзлашэ 70S рзбоссн и pzôocosesx субчастац. Дейтерированные и протонированше 703 рибосомы получали согласно методу, описанному в работе tGavrilova et al., -19763. Процэдуру промывки рибосом высокой концентрацией соли проводили дважды. Рибосомы хранили в присутствии 10 % глицерина при - 70° С.

Рибосомные 30S и 50S субчастицы разделяли путем зонального центрифугирования в сахарозном градиента (7%-45%) в буфере 0.01 M трис HCl (рН-7.4), содержащем 0.001 M %С1„ и NH Cl, в зональном роторе В-Х1У.

Степень гомогенности выделенных препаратов рибосом и рибосомных субчастиц определяли с помощью аналитического ультрацэнтрифугирования. Активность препаратов рибосом определяли по включению меченого фенилаланияа б -пептид в бесклеточной системе трансляции. Нами установлено, что активность дейтерированных рибосом не отличается от таковой протонированных рибосом.

Выделение препаратов суммарной дейтерированной и

Рис Л. Профили седиментационного распределения :1-препарат исход -шх [В1-ЗШ субчастиц , 2-прела -рат [ДЫбв РНК, 3 -препарат реконструированных С (11)-РНК • (Н)-БелокЗ - ЗОБ субчастиц . Седиментация (в буфере 10 мМ тряс НС1 рН-7.4), содержащем 10 мМ М8С1г, 100 мМ №„01, 0.001 мМ ЕКГА) в аналитической ультрацентрифуге УЦА-10, оборудованной УФ-оптикой СССР); скорость ротора 40 ООО об/ мин, температура 20°С, интервал сканирования Л мин.

9

седине нтоиия

протонированной тРНК. Препарат суммарной тРНК получали методом феноль-ной депротеинизации из супернатан-та после осаждения рибосом из грубого экстракта, согласно методу, описанному в работе Шо11еу et а1., 1961]. Осадок тРНК растворяли в буфере 50 мМ

СНдСООИа (рН-5.5), содержащем О Л М КаС1, 0.5 мМ КИТА и наносили на колонку с ОЕАЕ -целлюлозой (1.5 х 15 см для 50 мг тРНК), уравноввшанную предварительно тем же буфером. После нанесения образца колонку промывали ацетатным буфером, но содержащим 0.3 М КаС1 до поглощения элюата при 260 нм не более 0.05 о.е./мл. Элюцию тРНК осуществляли ацетатным буфером, содержащим 0.8 М ЛаС1. тРНК из водного раствора осаждали охлажденным этанолом в присутствии СН3С00Ка. Осадок тРНК растворяли в воде, добавляли равный объем 0.2 М трис (рН-8.0) и инкубировали при 37°С (I час). В этих условиях происходит деацилирование тРНК. После деацилирования тРНК осавдали охлажденным этанолом. Осадок тРНК растворяли в воде и использовали для амшюацилирования или лиофильно высушивали для хранения.

Реконструкция рибосоиной ЗОЭ субчастица из дейтерированной 163 РНК и протонированных белков проводили, согласно методу, описанному в работе [ТгаиЬ ег а1., 1968].

Рис.2. Кинетика синтеза полифе-нилаланина в бесклэточной системе трансляции. I-препарат контрольных 70S [Н] рибосом, 2-препарат 70S рибосом с реконструированной 30S субчастицей.

Получение дейтерированной I6S РНК. К 30S субчастицам, находящимся в буфере 10 мМ трис HCl (рН-7.4), содержащем IG мМ MgCl2> 100 мМ Ш401, О.ОХ мМ EDTA добавляли водонасыщенный фенол и 2% додецилсульфата натрия (SDS) (в соотношении объемов 30S субчастица : фенол : SDS = I : 1.2 : 0.1). Реакционную смесь встряхивали при 20°С (40 мин). Водную фазу, содержащую I6S РНК собирали. Депротвшшзированную I6S РНК осавдали из водного раствора и триады промывали охлажденным этанолом. I6S РНК хранили при -20° С в прецшштировшом под этанолом виде. Степень гомогенности препаратов I6S РНК анализировали с помощью аналитического ультрацентрифугирования. На рис.1 (2) представлена седиментограмма препарата I6S РНК в буфере трис НОХ (РН-7.4), содержащем 100 Ш NaCl, 0.1 мМ EDTA.

Получение препарата тотального белка. Тотальный белок получали обработкой 30S субчастиц 2 M ЫС1 в присутствии 4M мочевины непосредственно перед реконструкцией. РНК из этой смеси удаляли высокоскоростным центрифугированием (46 ООО об/мин, 5-6 часов). Препарат белка диализовали против буфера 20 мМ трис HCl (рН-7.4-), содержащего 20 мМ MgCl2, 500 мМ KOI, 0.01 мМ EDTA, 6 мМ ß-меркаптоэтанола.

Препарат дейтерированной I6S FHK диализовали против буфера 20 мМ трис Н01 (рН-7.4), содержащего 20 Ш MgCl2, 0.1 мМ EDTA, 6 мМ ß-меркаптоэтанола. Буфер 20 мМ трис HCl (рН-7.4), содержащий 20 мМ MgClg, 330 мМ KCl, 0.1 мМ ЕИГА, 6 мМ ß-меркаптоэтанола (буфер для реконструкции) прогревали при 42°С (.15 мин). Далее_в буфер для реконструкции одновременно добавляли I объем раствора РНК и 2 объема раствора белка. Соотношение белок :РНК при этом составляло 2:1. Смесь инкубировали при 42°р ,(3Р мин)- Концентрирование

Время, мин

реконструированных 30S субчастиц осуществляли путем осаждения полиэтиленгликолем (Мод.вес 6 ООО).

На рис.1 (3) приведена седиментограмма, образующихся при реконструкции 30S субчастиц и различных рябонуклеопротеидов в буфере трис HCl (РН-7.4-), содержащем 10 мМ MgCl2, 100 мМ KH^Cl, 0.1 мЫ ЮТА. Процентное содержание реконструированных 30S субчастиц в препарате, рвсчитаннов из данной седиментограммы составляет w 60 %.

Активность 70S рибосом с реконструированной. 30S субчастицей по включению меченого фенилаланина в пептид в бесклеточной системе трансляции составляла от 70 до 40 % по отношению к контрольным рибосомам (ом. рис.2).

Получение транслирующих рибосои, находящихся в пре- и пост-трйнслокационноы состояниях, и тестирование их активности оуществляли согласно методу разработанному в Институте белка АН ССОР [Вагапот, 1985]. Протонироваяные и дейтерированные субчастицы смешивали в эквимолярном соотношении для получения следующих типов 70S рибосомных частиц : [<H)-30S*(H)-50S], [(D)-30S*(D)-50S1, [(D)-30S«(H)-50S], [(H)-30S*(D)-50S), I((D) -РНК-(H)- Белок)- 30S* (D)-50S] Из перечисленных типов 70S рибосомных частиц получали препараты транслирующих рибосом.

При получении на колонке пре-транслокационных 70S рибосом, состоящих из протонированных субчастиц [ (H)-30S*(H)-50S ], через колонку пропускали Ptie-[H]-tENA. Во всех остальных случаях через колонку . пропускали Phe-[DJ-tífflA. В результате, в исследуемых препаратах в Р-участке рибосом всегда находилась либо ÍHl-tRNA, либо пептидил-[Hl-tKNA. В A-участке пре-транслокационных TOS [(H)-30S*(H)-50S3 рибосом находилась пептидил [Hl-tRNA, а в 70S t(D>—30S*(D)-50S), 7 OS l(H)-30S*(D)-50S), 70S l <D)-30S*(B)-50S] рибосомах - пептидил - [Dl-tRNA.

Измерения рассеяния нейтронов. Измерения рассеяния

нейтронов гибридных-изотопных транслирующих 70S рибосом были проведены в■' малоугловой камере D-II [Ibel, 1975], реактора Института Лауэ-Ланжевена в г. Гренобле (Франция) в условиях, описанных ранее [Splrin et al., 1987]. Измерения рассеяния нейтронов препаратами нетранслиру гадах 70S рибосом были проведены на импульсном реакторе „ИБР-2 COatanevich, 1988] Объединенного Института ядерных исследований в г. Дубне (СССР). Измерения проводили в кварцевых кюветах с длиной оптического пути I мм.

- ? -

Рис. 3. Зависимость интенсивности нейтронного рассеяния от вектора рассеяния Q в координатах Гиньв (lnl от Q2) для трех типов гибридных-изотопных частиц в прэ- и лост-транслокационном состояниях : I- C(D)-30S * (H)-50S) в 91% D.,0; 2~ [(D)- 30S * (D)- 50S] в HgO; 34((D)-PHK •(Н)-Белок)-30Б* (D)-50S1 В 96% D£0.

Время измерений- от 15 до 60 мин в камере D11 и от 60 до 80 мин в камере реактора ИВР-2. Во время всех экспериментов температура поддерживалась равной 6°С. Длина волны падающих нейтронов к в камере 211 равнялась 0.98 нм, диапазон векторов рассеяния Q составлял от 0.10 до 0.71 нм-1 (Q = 47t(Sin9A), где 9 - величина, равная половине от угла рассеяния). В камере реактора ИБР-2 нейтронный импульс содержал нейтроны с' длиной волны, распределенной, согласно закону Максвелла, с максимумом при Л.=0.12 нм. Рассеяние нейтронов измерялось в области векторов рассеяния Q от 0.13 до 0.8 нм~1.

Значение радиусов инерции получали методом, основанном на приближении Гинье CGulnier, 1955].

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ОБЩАЯ НЕЙТРОННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТРАНСЛИРУЮ® РИБОСОМ.

Из всей совокупности экспериментальных данных по нейтронному рассеянии рибосомных частиц, (выполненных с 1984-1988 гг.) были отобраны данные, в которых- зависимость логарифма интенсивности (In I) от вектора рассеяния (Q2) в области малых углов подчиняется закону Гинье. Это свидетельствует об отсутствии агрегатов в исследуемом препарате частиц. Анализ показал, что этим условиям удовлетворяет только часть экспериментов, которые представлены в таблице I (всего 13 экспериментов).

В качестве примера на рис.3 приводятся зависимости

Q2 • Ю"4

Таблица I. Экспериментальные значения радиусов инерции гибридных-изотопных 703 рибосомных частиц в пре-транслокационном и гост-транслокационном состояниях и точки компенсации составляющих их компонентов (в % Т>г0).

Эксперимент Доля Бг0 в смеси нго-1)го Точки компенсации вЛ)Ог Радаусы инерции I (и их ошибки (£

ЗСБ РНК белок ЬШ РНК белок ЯРЕ ПОСТ

I 0 70 42 70 42 87.9 + 0.8 88.3 ± 0.7

2 16 70 42 70 42 86.8 + 0.4 87.3 ± 0.4

3 83 70 42 70 42 98.4 + 0.8 101.0 ± 0.9

4 94 70 42 70 42 96.0 + 0.4 97.7 ± 0.4

5 97 70 42 70 42 95.1 + 0.3 96.4 ± 0.3

6 0 91 91 70 42 90.3 + 1.2 91.2 ± 1.2

7 91 91 91 70 42 87.7 + 0.3 87.6 ± 0.3

8 96 91 91 70 42 88.8 + 0.3 88.5 ± 0.3

9 98 91 91 70 42 89.6 4- 0.3 90.0 ± 0.3

10 0 91 91 91 91 91.6 + 0.4 92.9 ± 0.3

II 0 91 91 91 91 91.2 + 0.4 92.7 ± 0.5

12 45 91 91 91 91 91.6 0.6 93.0 ± 0.7

13 96.5 93 42 93 93 93.7 + 0.6 96.4 ± 0.6

интенсивности нейтронного рассеяния от вектора рассеяния 0 в координатах Гинье (1п I от О2) для трех типов гибридных-изотопных 70Э частиц в двух функциональных состояниях: I- С(В)-303*(Н)-5СВ ] в 91% Й20; 2-Е(1))-305*(Б)-503 ] в Н20; З-С(Б)-РНК-(Н)-Белок)-303*-

Рис. 4. Зависимость квадратного корня из интенсивности нейтронного рассеяния, деленная на концентрации- (С) (в мг/мл), на пропускание- (Т), на толщину кюветы- (1) (в 'см), от доли DgO в смеси HgO-D£0, транслирующих гибридных-изотопных рибосомных частиц : I-70S [(D)-30S * (D)-50S), 2- 70S С(Н)-30S«(D)-50S], 3-70S [(DJ-30S*(Н)-50S], 4-T0S [(H)-30S*(H)-5ÛS!, 5-70S [((D)-PHH•(Н)-Белок)-ЗСБ*(D)-5QS] в прв-транслокационном и пост-транслокационном состояниях ; («)- нетранслирующие 70S рибосомы.

(D)-50s] в 96% D20. Как видно из

приведенных графиков, Гинье- зависимости представляют собой прямые линии. В области самых малых углов подъем интенсивности отсутствует.

Зависимости квадратного корня из величины нормализованной Интенсивности нейтронного рассеяния-I(о), разделенной на концентрацию рибосом в препарате - 0, пропускание -Т и толщину кюветы -1, от доли В20 в смеси H20-D20, для транслирующих и не транслирующих рибосом, представлены на рис.4. При этом Ко) -интенсивность рассеяния, экстраполирована к нулевому вектору рассеяния. Рассмотрение данных этого рисунка приводит к следующим выводам.

Во-первых,•■■интенсивность рассеяния транслирующих рибосом для двух типов 7QS рибосомных частиц

С (H)-30S*(H)-50S), [ (D)-3QS*(D)-50S] практически не отличается от таковой для не транслирующих рибосомных частиц, полученных обычной магниевой ассоциацией рибосомных субчастиц.

Во-вторых, амплитуда рассеяния транслирующих рибосом в пост-транслокационном состоянии в пределах экспериментальной погрешности (±3 %) совпадает с таковой для пре-транслокационного состояния. Это дает основание провести прямую линию для данного типа частиц по экспериментальным точкам в двух функциональных

Рис. 5. Схематическое изображение 70S рибосомной частицы. 1,2 и 3,4- радиусы инерции РБК-ового и белкового компонентов 30S и 50S субчастиц, соответственно. Ь - расстояние между центрами инерции оубчаатиц рибосомы.

состояниях.

В третьих, прямые линии, проведенные для каждого из четырех типов рибо-сомных частиц, параллельны друг другу. Это свидетельствует о том, что при дей-терировании объем рибосомной частицы не изменяется. Прямые пересекают ось абс цисс в точке, которая соответствует точ ке компенсации рибосомной частицы : случае транслирующих 70S t(H)-30S * (H) 50S] рибосом в точке, соответствующей 59,5 % D£0, в случае транслирующих 70S [(D)-30S*(H)-50S) рибосом в точке, соответствукщей 71 % D20, в случае транслирующих 70S [(H)-30S*(D)-50S] рибосом в точке, соответствующей 81.0 % D20, и в случае транслирующих 70S [(D)-30S*(D)-50S] рибосом в точке, соответствующей Э1% D£0. Экспериментальные значения точек компенсации вышеперечисленных рибосомных частиц совпадают с точками компенсации, рассчитанными, исходя из точек компенсации белкового и РНК-ового компонентов протонированных (42% и 70%) и дейтерированных (91% и 91%) рибосомных частиц. Точка компенсации препарата 70S [((Б)-РШ • (H)-BeJOK-30S*(D)-50Sl рибосом получена проведением через ее экспериментальное значение Vi (о)/СТ1 прямой, параллельной прямым для других типов рибосомных частиц, и равна 86 % DgO в смеси HgO1 DgO, что также близко к рассчитанной точке компенсации.

ГЕОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПИСАНИЕ РИБОСОМЫ.

Для геометрического описания рибосомы, состоящей из двух субчасткц, каждая из которых состоит из РНК и "белка, необходимо 10 параметров (4 радиуса инерции и 6 расстояний между центрами инерции компонентов см. рис. 5). Число параметров

может быть существенно уменьшено за счет следующего обстоятельства. Из исследований по нейторонному рассеянию изолированных 30S и 50S субчастиц известно, что расстояния Ь12= L13«0. Отсюда следует, что задача сводится к определению только 5 параметров (4 радиусов инерции компонентов рибосомы и I расстояния между центрами инерции субчастиц).

ЧИСЛО ПАРАМЕТРОВ, КОТОРЫЕ МОЕЮ ИЗВЛЕЧЬ ИЗ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ДАННЫХ.

Уравнение, описывающее зависимость измеряемого в экспериментах Е2 от контраста, для любой частицы имеет вид :

г

где ее три коэффициента имеют следующий смысл : Rgj, - радиус инерции частицы при "бесконечном контрасте", коэффициенты А и В2 связаны ' с характером распределения нейтронной плотности в частице. Как было указано вше в работе исследованы 4 типа частиц 70S[(H)-30S*(H)-50S1, 70SC(D)-30S*(H)-50S3, TOSt(D)-30S*(D)-50S], 70S[((D)-PHK Н-0елок)-30*(Б)-503] (см. рис. 6). Очевидно, что для всех частиц величина Bg^ должна быть одинакова, а величины А и В2 должны отличаться. Суммируя неравные нулю коэффициенты и учитывая, что первый коэффициент одинаков для всех частиц, получаем, что максимальное число независимых параметров (а это и есть число независимых уравнений), которые можно извлечь из исследований четырех таких частиц, равно 5.

САМОСОГЛАСОВАННОСТЬ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ДАННЫХ.

Зависимости R2 от обратного контраста 1/(Ар) (график Штурманна) для различных типов транслирующих рибосом представлены на рис.7. Эти зависимости, по-существу, иное представление данных таблицы I. Из рисунка видно, что для протонированных 70S[(H)-30S*(H)-503) и дейтерированных 70S С(D)-30S*(D)-50S) рибосом графики зависимости й| от обратного контраста представляют прямые, в то же время, для других типов гибридных-изотопных частиц - параболы.

Рис.6.(а)-Схематиче ское изображение четырех типов гибридных-изотопных 7СЙ рибосомных частиц. Цифры в каждой из субчастиц означают контраст, при котором компонент частицы "невидим" в рассеянии нейтронов, (б) - Параметры, которые можно извлечь из исследования каждого типа частиц.

Анализ, приведенный в предыдущем разделе, показал, что максимальное число независимых уравнений равно 5 и, следовательно, 8 проведенных экспериментов "информационно избыточны". Однако, эти дополнительные эксперименты очень важны по двум причинам. Во-первых, их исключение ведет к существенному росту погрешности в определяемых параметрах. Во-вторых, дополнительные эксперименты позволяют судить о самосогласованности имеющихся экспериментальных данных.

Первым свидетельством самосогласованности имеющихся экспериментальных данных является то обстоятельство, что эксперименты, выполненные при различных контрастах для рибосом каждого типа попадают либо на одну и ту же параболу, либо прямую линию (см. рис.7). Вторым свидетельством является пересечение парабол и прямых линий на рис.7 в одной и той же точке, которая соответствует одному и тому жз радиусу инерции Н^ "при бесконечном контрасте" для всех типов рибосом (в одном из функциональных состояний), последнее свидетельствует также о структурной идентичности различных гибридных-изотопных рибосом.

Единственный эксперимент, который не может быть проверен на самосогласованность, это эксперимент для препарата 70S рибосом с реконструированной ЗОБ субчастицей, поскольку он исследован только при одном контрасте. Поэтому мы не можем быть уверены в достоверности абсолютных значений радиусов инерции данной 70S рибосомной частицы.

|(H)-30S.(№5QS1

Rj» , А,*О, В? =0

|(D)-30S'1H)-50S| Rj«, A,*O, Bj*0

(а)

|(0}-30S"(0)-5QS| R^oo, Л,= 0, Bj =0

|(D,H)-50*S"(0)-50S1 RS». A«*0. Вг4*0 (3)

_ то _

lo —

Рис.7. Зависимость квадрата радиуса инерции от обратного контраста в координатах Штурманна (R| от U(P4acT - Ррасгв) для транслирующих гибридных - изотопных рибосомных частиц : Í -70S [(H)-30S*(H)-50SJ,Î -70Sf (D)-30S* (H)-50S],$ -70Sl(D)-30S*(В)-50S], ï-TOS t<(D>— РНК'(H)-Белок)-30* (D)-50S1 для пре- и пост- функциональных состояний.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ 70S РИБОСОМ В ПРЕ-ТРАНСЛОКАЩОННОМ И ПОСТ-ТРАНСЛОКАЦИОННОМ СОСТОЯНИЯХ.

Результаты решения системы уравнений с использованием стандартного метода наименьших квадратов представлены в Таблице 2 (1графа). В первой графе этой таблицы содержатся параметры и их ошибки, полученные стандартным методом наименьших квадратов. Отсюда видно, что изменение радиуса инерции белкового компонента малой субчастицы четко выявляется при транслокации. Об изменении радиусов инерции других 4 параметров трудно судить из-за относительно больших ошибок. Распеределение величин ошибок таково, что они минимальны для белкового компонента и максимальны для РНК-ового комопнента. Такое распределение является прямым следствием выбора экспериментальных условий, поскольку в большинстве уравнений таблицы I вклад белковото компонента в рассеяние в несколько раз больше вклада РНК-ового компонента.

Во второй графе таблицы 2 приведен результат решения системы с использованием регуляризованной процедуры по методу Ловсена-Хансена. В качестве стабилизатора были выбраны отклонения радиусов инерции компонентов рибосомы и расстояния между центрами инерции субчастиц от их значений, полученных в экспериментах с изолированными субчастицами и нетранслирующими

рибосомами.

Таблица 2. Результаты решения системы уравнений (I). RgR-30S, EgP-30S и RgR-50S, RgP-50S - радиусы инерции РНК-овго И белкового кошонентов 30S и 50S субчастиц, соответственно. L -расстояние между центрами инерции субчастиц. .

N Функц. сост. RgR30S (8) RgP30S (2) RgE50S (8) RgP5ÛS (2) L (2)

I ПРЕ ПОСТ 89.3 - I6.I 91.0 ± 15.6 88.9 ± 1.4 92.1 ± 1.3 60.4 í 6.8 56.8 ± 7.3 103.7 i 3.3 104.9 i 3.3 79.4 ¿ II.7 83.6 í II.I

2 X О ПРЕ ПОСТ 66 2 69.5 ± 3.9 69.2 ± 3.9 82 8 87.6 ¿ 1.0 90.8 ± 1.0 66 2 67.0 - 1.8 64.9 í 1.5 100 S 100.2 t 0.8 100.9 ± 0.8 100 8 91.6 - 2.6 96.2 ~ 2.3

Радиус

инерции РНК 30S субчастицы" - R R30S = 66 8, радиус инерции белка 30S субчастицы - R.P30S = 82 S^ радиус инерции РНК 50S субчастицы - BUHÓOS = 66 2, радиус инерции белка 50S субчастицы - RgP5Q3 = 100"2 и расстояние мааду центрам! инерции субчастиц - L = 100 1.

Как видно из данных этой графы, использование процедуры Ловсена -Хансена позволяет существенно уменьшить ошибки в вычисляемых параметрах. Кроме четко выявляющегося "изменения радиуса инерции белкового компонента малой субчастицы и радиуса инерции РНК-ового компонента большой субчастицы, наблюдается также изменение расстояния между центрами инерции субчастиц. Однако к выводу об изменении расстояния L между центрами инерции субчастиц следует относиться с известной долей осторожности. Поскольку мы не уверены в достоверности абсолютных значений параметров 70S рибосомной частицы с реконструированной 30S субчастицей.

К аналогичному выводу можно придти, не привлекая абсолютные значения радиусов инерции 70S рибосомных частиц, а анализируя только разности между значениями радиусов инерции 70S рибосомы в двух состояниях. Результат такого анализа показал, что даже при жестком наложении ограничений на минимизацию решения разница в

параметрах между пре- и пост-состояниями четко выявляется.

Полученный результат мало чувствителен также к величинам стабилизатора. Его изменение на 3 2 в ту или другую сторону практически не изменяет как абсолютные величины 5 параметров, так и их ошибки.

Таким образом, из наших экспериментальных данных вытекает следующая динамическая модель рибосомы. По-видимому, рибосома колеблется между двумя основными конформационными состояниями с различными геометрическими размерами. Малая субчастица рибосомы является активной пульсирующей частью рибосомы. Движение ее "головки" относительно большой субчастицы составляет главный механический акт транслокации. При таком движении изменяется радиус инерции малой субчастицы и радиус инерции большой субчастицы рибосомы. При этом, вероятно, также изменяется расстояние между субчастицами рибосомы.

вывода.

1. Из клеток E.coll, выращенных на среде, содержащей тяжелую ■ воду, получены 703 рибосомы, отличающиеся от обычных рибосом

по своим свойствам в рассеянии нейтронов.

2. Методом твердофазной системы трансляции получены транслирующие гибридные-изотопные рибосомныэ частицы, включая рибосошую частицу, в которой малая субчастица реконструирована из дейтерированной I6S РНК и протонированных белков.

3. Транслирующие гибридные - изотопные рибосомные частицы, находящиеся в двух функциональных состояниях исследованы методом малоуглового нейтронного рассеяния. Показано, что

а) Обьем рибосомной частицы не изменяется при дейтерировании.

б) Радиус инерции рибосомы при "бесконечном контрасте" (средний размер частицы) для разных типов частиц совпадает для каждого из функциональных состояний.

в) Из набора экспериментальных данных для различных транслирующих гибридных-изотопных частиц рассчитаны радиусы инерции белкового и РНК-ового- компонентов для 3ÓS и 50S субчастиц. Их величины близки к таковым измеренным для изолированных 30S'и 50S субчасгиц.

4. При переходе рибосомы из пре-транслокационного состояния в пост-транслокационное состояние происходит :

а) Увеличение размера белкового компонента малой субчастицы (порядка 3 X). При этом наблюдается менее выраженное уменьшение размера РНК-ового компонента большой субчастицы (порядка 2 2).

б) Вероятно, происходит увеличение расстояния между центрами инерции субчастиц рибосомы (порядка 4 8).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ.

1. И.Н. Сердюк, СЛ. Агаларов, Д.Э. Гулямова. О роли температуры в процессе реконструкции рибосомной ЗОБ суСчастицы. -Докл. АН СССР, 1984 г., т.278, N5, стр. 1247-1250.

2. В.И. Баранов, Д.Э.Гулямова, Т.Н. Цалкова, И.Н. Сердюк. Изучение транслирующих гибридных-изотопных рибосомных частиц методом нейтронного' рассеяния. -Биополимеры и клетка, 1990, т.6, N6, стр. 51-55.

08.91 г. Зак. 3474Р Тир. 125 экз. Уч.изд.л. 1,0 Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ШЦ АН СССР