Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтетическое дейтерирование и его применение к исследованию структуры и динамики макромолекул методом нейтронного рассеяния

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Щербакова, Инна Вячеславовна

ВВЕДЕНИЕ.

РАЗДЕЛ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Принципы биосинтетического дейтерирования.

1.1 Влияние тяжелой воды на биологические объекты.

1.1.1 Влияние атомов дейтерия на биологические макромолекулы. Водородный обмен.

1.1.2 Влияние тяжелой воды на белки, клетки и ткани.

1.1.3 Фармакологическое использование тяжелой воды и дейтерированных компонентов.

1.2 Выращивание биологических культур на дейтерированных средах.

1.2.1 Выращивание биологических культур на богатых дейтерированных средах.

1.2.2 Выращивание биологических культур на синтетических дейтерированных средах.

1.2.3 Методы определения уровня включения дейтерия.

Глава 2. Рассеяние нейтронов и структура макромолекул.

2.1 Свойства нейтронов. Их получение, проведение и регистрация.

2.1.1 Свойства нейтронов.

2.1.2 Получение нейтронов.

2.1.3 Регистрация нейтронов.

2.2. Взаимодействие нейтронов с веществом.

2.2.1 Упругое и неупругое рассеяние нейтронов.

2.2.2 Рассеяние нейтронов одной частицей.

2.2.3 Малоугловое рассеяние нейтронов.

2.2.4 Контраст в малоугловом рассеянии нейтронов.

2.3. Получение структурной информации из данных по упругому когерентному рассеянию.

2.3.1 Алгоритм получения структурной информации из данных малоуглового рассеяния нейтронов.

2.3.2 Структурные параметры.

2.3.3 Определение формы макромолекул.

2.3.4 Метод сферических гармоник.

2.4. Методы вариации контраста.

2.4.1 Использование Н2О/D2O смесей.

2.4.2 Двойное изотопическое замещение.

2.4.3 Тройное изотопическое замещение.

2.4.4 Метод триангуляции.

2.4.5 Спин-спиновый метод вариации контраста.

Глава 3. Рассеяние нейтронов и динамика макромолекул.

3.1. Динамика макромолекул из данных по рассеянию нейтронов.

3.1.1. Методы исследования динамики макромолекул.

3.1.2. Неупругое рассеяние нейтронов и динамика белков.

3.1.3. Упругое некогерентное рассеяние нейтронов. Динамический структурный фактор.

РАЗДЕЛ II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 4. Материалы и методы

4.1. Выращивание бактериальной массы на синтетических средах.

4.1.1. Выращивание бактериальной массы Escherichia coli.

4.1.2. Выращивание бактериальной массы Thermus thermophilus.

4.1.3. Выращивание бактериальной массы Cryobacterium sahae.

4.2 Методы выделения и очистки рибосом.

4.2.1. Выделение 70S рибосом Escherichia coli.

4.2.2. Выделение 70S рибосом Cryobacterium sahae.

4.2.3. Выделение 30S рибосомных субчастиц Thermus thermophilus.

4.3 Определение доли включения дейтерия в разные компоненты клетки.

4.3.1. Выделение рибосомных РНК и белков.

4.3.2. Определение включения 14С-метки из нуклеотидов в рибонуклеиновый и белковый компоненты клетки.

4.3.3. Определение уровня включения дейтерия в рибонуклеиновый и белковый компонент рибосом.

4.4. Методы определения качества препаратов.

4.4.1. Седиментационный анализ.

4.4.2. Денатурирующий электрофорез РНК.

4.4.3. Двумерный электрофорез рибосомных белков.

4.5. Измерение нейтронного рассеяния.

4.5.1 Измерение малоуглового рассеяния нейтронов.

4.5.2 Измерение упругого некогерентного рассеяния нейтронов на спектрометре IN13.

Глава 5. Результаты и обсуждение.

5.1. Система для биосинтетического дейтерирования различных компонентов рибосомы.

5.1.1. Разработка метода получения полностью дейтерированных рибосом и рибосомных субчастиц Thermus thermophilus в препаративных количествах.

5.1.2. Разработка метода направленного включения дейтерия в белковый компонент рибосом Escherichia coli в процессе выращивания.

5.1.3. Разработка метода направленного включения дейтерия в рибонуклеиновый компонент рибосом Escherichia coli в процессе выращивания.

5.1.4. Получение тотально дейтерированных нуклеозид-5'-монофосфатов.

5.2. Структурные исследования макромолекул методом упругого когерентного рассеяния нейтронов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биосинтетическое дейтерирование и его применение к исследованию структуры и динамики макромолекул методом нейтронного рассеяния"

В последние годы впечатляющий прогресс в структурной биологии определялся успехами двух методов: рентгеновской кристаллографии и ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Этими методами к настоящему времени получено более 10 ООО пространственных структур биологических макромолекул с атомным разрешением. Однако для применения метода рентгеноструктурного анализа необходимы высококачественные кристаллы, получить которые не всегда возможно, а метод ЯМР применим для изучения структуры белков с молекулярной массой до 50 кДа.

Малоугловое рассеяние является методом исследования структуры макромолекул низкого разрешения (10 - 1000 А) в растворе. Основным достоинством этого метода является возможность его применения в широком диапазоне условий и отсутствие ограничений, связанных с размерами частиц (Feigin & Svergun, 1987). Интенсивность рассеяния от монодисперсного разбавленного раствора макромолекул пропорциональна сферически усредненному рассеянию от одной частицы. Это сферическое усреднение, являющееся следствием хаотической ориентации макромолекул в растворе, приводит к существенной потере информации о структуре макромолекулы. Потому метод малоуглового рассеяния традиционно считается не только методом низкого разрешения, но и низкоинформативным методом.

Для исследования структуры сложных макромолекулярных комплексов, состоящих из нескольких компонентов, наиболее подходящим является метод рассеяния нейтронов . Его применение на практике позволяет менять контраст, т.е. рассеивающие свойства частицы по отношению к растворителю, в очень широких пределах, что принципиально важно для получения сведений о ее внутренней структуре и форме. На практике контраст можно менять либо за счет изменения плотности амплитуд рассеяния растворителя, либо за счет изменения плотности амплитуд рассеяния изучаемого объекта (макромолекулы). В первом случае атом дейтерия, амплитуда рассеяния которого отлична от амплитуды рассеяния атома водорода не только по величине, но и по знаку, заменяет атом водорода в так называемых легкообмениваемых положениях. Однако такой обмен является обратимым и неполным. Необмениваемые атомы водорода, которых в биологических макромолекулах около 3/4, могут быть замещены на дейтерий лишь в процессе выращивания бактериальной массы на дейтерированных средах (биосинтетическое дейтерирование). Большинство способов вариации контраста в нейтронном рассеянии требует полного биосинтетического дейтерирования макромолекулы или ее части. Это позволяет в разной степени контрастировать компоненты частицы для изучения их структуры или делать макромолекулу однородной в рассеянии нейтронов.

Кинетическая энергия тепловых нейтронов сравнима с тепловой энергией при комнатной температуре. При взаимодействии с макромолекулой эта энергия расходуется на возбуждение тепловых колебаний и может быть точно измерена. Потому рассеяние нейтронов является идеальным методом для изучения динамики макромолекул. Один из вариантов этого метода, метод упругого некогерентного рассеяния нейтронов, базируется на том, что амплитуда некогерентного рассеяния атомов водорода в 40 раз больше, чем амплитуда когерентного и некогерентного рассеяния любых других атомов, включая дейтерий. Поскольку в биологических макромолекулах приблизительно 50% всех атомов составляют атомы водорода, то исследование некогерентной составляющей позволяет охарактеризовать среднеквадратичное отклонение ядер атомов водорода. Как и в случае когерентного рассеяния, замена водорода на дейтерий приводит к существенному уменьшению вклада водородных атомов в рассеяние.

Этот метод успешно применяется для изучения динамики белков, а нами он впервые использован для исследования динамики такого сложного макромолекулярного ансамбля, как рибосома.

Целью нашей работы была демонстрация современных возможностей нейтронного рассеяния на дейтерированных образцах для получения информации о структуре и динамике биологических макромолекул. Реализации этой цели потребовала решения следующих задач:

1. Разработка общего метода культивирования Thermus thermophilics на дейтерированных средах, конечной целью которого было получение малой (30S) рибосомной субчастицы в препаративных количествах для ее структурных исследований.

2. Исследование структуры 30S рибосомной субчастицы Thermus thermophilics методом малоуглового рассеяния на дейтерированных и протонированных образцах.

3. Разработка метода направленого включения дейтерия в рибонуклеиновый и белковый компоненты рибосом Escherichia coli в процессе культивирования микроорганизмов.

4. Исследование роли флуктуационной подвижности макромолекул в температурной адаптации микроорганизмов методом упругого некогерентного рассеяния

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Щербакова, Инна Вячеславовна, Пущино

1. Гогия З.В., Юсупов М.М., Спирина Т.Н. Структура рибосом Thermus thermophilus. 1. Метод выделения и очистки рибосом.- Мол.биол., 1986, т.20, N 2, 519-526.

2. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. -М.:Мир, 1984, т.2., с.437-445

3. Орехович В.А. Современные методы биохимии,- М: Высшая школа, 1964, с.236-250.

4. Свергун Д.И., Фейгин J1.A. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. -М.: Наука, 1986. с. 280

5. Широков В.А. Кристаллизация и предварительные кристаллографические исследования 70S рибосом Thermus thermophilus. Дисс. на соискание ученой степени канд. биол.наук. Пущино, 1994

6. Abrahamsson S., Dim-Nguyen N., Hellgren L. G., Vincent J.G. Patent SE 42601 IB, 1982.

7. Adams W.H. & Adams D.G. Effect of deuteration on hematopoiesis in the mouse. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1988, v. 244, 633 - 639

8. Anderson E. H. Proc.Natl.Acad.U.S.A., 1946, v. 32, 120.

9. Anderson C.M., Zucker F.H., Steitz T. Space-filling models of kinase clefts and conformation changes. Science, 1979, v.204, 375 - 380

10. Andjus P.R.& Vucelic D. D20-induced cell exitation. J. Membr. Biol, 1990, v.l 15, 123-127

11. Andjus P.R, Kataev A.A., Alexandrov A.A., Vucelic D., Berestovsky G.N. . D20-induced ion cannel activation in Characeae at low ionic strength. J. Membr. Biol., 1994, v.142,43-53.

12. Avery M.A., Bonk J.D., Mehrota S. Deuterated antimalarials: synthesis of trideutero-artemisinin, dihydroartemisinin, and arteether. J. Labelled Compd. Radiopharm., 1996, v.38, 249-254.

13. Bachor R., Shea C.R., Gilles R., Hasan T. Photosensitized destruction of human bladder carcinoma cells treated with chlorine ев- conjugated microspheres. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1991, v.88, 1580 - 1584

14. Bai Y., Milne J.S., Mayne L., Englander S.W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins, 1993, v. 17, 75-86.

15. Bai Y., Sosnick Т., Mayne L., Englander S.W. Protein folding intermediates studied by native-state hydrogen exchange. Science, 1995, v. 269, 192-197.

16. Bauer A.L., Jachimczak P., Blesch A., Baur J., Hessdorfer В., Haase A., Bogdahn U. Selective killing and growth arrest of malignant tumor cells by deuterium oxide. -Tumordiagnost. Ther., 1995, v. 16, 61 68

17. Bee M. Quasielastic neutron scattering: Prinsciples and applications in solid state chemistry, biology and materials science. Adam Hilger, Bristol and Philadelphia, 1988

18. Bicout D.J., Zaccai G. Protein flexibility from the dynamical transition: a force constant analysis. Biophys J., 2001, v. 80, 1115-1123.

19. Carlstedt B.C., Grespi H.L., Blake M.L., Katz J.J. Biosynthesis of deuterated benzylpenicillins. III. Relative antibiotic potency of highly deuterated benzylpenicillin. -J. Pharm. Sci., 1973, v.62, 856 857

20. Connelly G.P., Bai Y., Jeng M.F., Englander S.W. Isotope effects in peptide group hydrogen exchange. Proteins, 1993, v. 17, 87-92.

21. Cooper A., Dryden T.F. In: The Enzyme catalysis process: energetics, mechanism and dymamics. Plenum Press (New York), 1988, pp.159-165

22. Coward W.A. Deuterium method for measuring milk intake in babies. Lancet, 1979, v. 2(8137), 309

23. Cusack S. Large-amplitude motions in biological systems In: - In: Neutron and synchrotron radiation for condensed matter studies. Volume III. Application to Soft Condenced Matter and Biology. Les editions de physique, Springer-Verlag, 1994, p.279 -296.

24. Cusack S., Doster W. Temperature dependence of the low frequency dynamics of myoglobin. Measurement of the vibrational frequency distribution by inelastic neutron scattering. Biophys. J., 1990, v. 58, 243-251.

25. Cusack S., Smith J., Finney J., Tidor В., Karplus M. Inelastic neutron scattering analysis of picosecond internal protein dynamics. Comparison of harmonic theory with experiment. J. Mol. Biol., 1988, v. 202, 903-908.

26. Cusack S., Bernet-Colominas C., Hartlein M., Nassar N., Leberman R. A second class of synthetase structure revealed by X-ray analysis of Escherichia coli seryl-tRNA synthetase at 2.5 A. Nature, 1990, v.347,249 - 255

27. Darbyshire J.F., Gillette J.R., Nagata K., Sugiyama K. Deuterium isotope effect on A-ring and D-ring metabolism of testosterone by CYP2C11: evidence for dissociation of activated enzyme-substrate complexes. Biochemistry, 1994, v. 33, 2938 - 2944.

28. Dellerue S., Petrescu A.J., Smith J.C., Bellissent-Funel M.C. Radially softening diffusive motions in a globular protein. Biophys. J., 2001, v. 81, 1666-1676.

29. Deraniyagala S.A., Adediran S.A, Pratt R.F. p-Secondary and solvent deuterium kinetic isotope effect and the mechanism of base- and acid catalized hydrolysis of penicillanic acid. J. Org. Chem., 1995, v. 60, 1619 - 1625.

30. Doster W., Cusack S., Petry W. Dynamical transition of myoglobin revealed by inelastic neutron scattering. Nature, 1989, v. 337, 754-756

31. Edington B.V., Whelan S.A., Hightower L.E. Inhibition of heat shock (stress) protein induction by deuterium oxide and glycerol: additional support for the abnormal protein hypothesis of induction. Cell Physiol., 1989, v. 139, 219-228.

32. Eigen M. Proton transfer, acid-base catalysis, and enzymatic hydrolysis. Angew. Chem., 1964,v. 3, 1-19.

33. Eisenberg D. & Kauzmann W. The structure and properties of water. Oxford University Press, New York, 1969

34. Elsing С., Hirlinger A., Renner E.L., Lauterburg B.H., Meier P.J., Reichen J. Solvent isotope effect on bile formation in the rat. Biochem. J., 1995, v. 307, 175- 181.

35. Englander S.W. Measurement of structural and free energy changes in hemoglobin by hydrogen exchange methods. Ann. NY Acad. Sci., 1975, v. 244, 10-27.

36. Englander J.J., Kallenbach N.R., Englander S.W. Hydrogen exchange study of some polynucleotides and transfer RNA. J. Mol. Biol., 1972, v. 63, 153-169.

37. Englander S.W., Kallenbach N.R. Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids. Q. Rev. Biophys., 1984, v. 16, 521-655.

38. Englander J.J., Rogero J.R., Englander S.W. Protein hydrogen exchange studied by the fragment separation method. Anal. Biochem., 1985, v. 147, 234-244.

39. Englander S.W., Englander J.J., McKinnie R.E., Ackers G.K., Turner G.J., Westrick J.A., Gill S.J. Hydrogen exchange measurement of the free energy of structural and allosterlc change in hemoglobin. Science, 1992, v. 256, 1684-1687.

40. Faber H. R. & Matthews B. W. A mutant T4 lysozyme displays five different crystal conformations. Nature, 1990, v. 348,263- 266

41. Fan L., Zgurskaya E.I., Shcherbakova I., Serdyuk I.N. Determination of deuterium incorporation into RNA and protein components of the E.coli ribosome at biosynthetic deuteration by small-angle neutron scattering.- J.Appl.Cryst., 1997, v. 30, 59-64.

42. Feigin L.A. & Svergun D.I. Structure Analysis by Small Angle X-ray and Neutron scattering. Plenum Press, 1987

43. Ferraboschi P., Grisenti P., Santaniello E. A facile synthesis of pentadeuterated Domiodol from glycerol-1,1,2,3,3,5d J. Labelled Compd. Radiopharm., 1994, v.34, 303306.

44. Findling K.L., Yoshida Т., Fee J.A. A chemically defined medium for the large-scale culture of Thermus thermophilus.- J.Biol.Chem., 1984, v.259, 123-125.

45. Fitter J., Heberle J. Structural equilibrium fluctuations in mesophilic and thermophilic alpha-amylase. Biophys. J., 2000, v. 79, 1629-1636.

46. Foldesi A., Trifonova A., Kundu M.K., Chattopadhyaya J. The synthesis of deuterionucleosides. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2000, v. 19, p. 1615-1656

47. Foster A.B. Deuterium isotope effects in study of drug metabolism. TIPS, 1984, v. 5, 524-527.

48. Foster A.B. Deuterium isotope effects in the metabolism of drugs and xenobiotics: implifications for drug design. Adv. Drug Res., 1985, v.14, 1-40.

49. Frank J., Zhu J., Penczek P., Li Y., Srivastava S., Verschoor A., Radermacher M., Grassucci R., Lata R.K., Agrawal R.K. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature, 1995, v. 376, 441-444.

50. Gerstein M., Schulz G., Chothia C. Domain closure in adenylate kinase. Joints on either side of two helices close like neighboring fingers. J. Mol. Biol., 1993, v. 229, 494 -501

51. Glatter O., Kratky O. Small-angle X-ray scattering. Academic Press, London, 1982

52. Gornall H., Bardavill J.S., David L.- J.Biol.Chem., 1949, v. 177, 751.

53. Gueron M., Leroy J.L.: Base pair opening in double stranded nucleic acids. In : Nucleic Acids and Molecular Biology. Edited by Eckstein F, Lilley DMJ. Berlin: Springer-Verlag; 1992, p. 1-22.

54. Guinier A. & Fournet A. Small Angle Scattering of X-rays. Wiley, NY, 1955

55. Hardy S.J.S., Kurland C.G., Voynow P., Mora G. The ribosomal proteins of Escherichia coli. I. Purification of the 30S ribosomal proteins. Biochemistry, 1969, v.8, 2897-2905.

56. Hatanaka H. Clinical results of neutron capture therapy. In: Neutron beam design: development and performance for neutron capture therapy. Basic life science. Vol. 54. Pergamon Press, New York 1989, p. 15-21.

57. Henry G.O., Sykes B.D. Determination of the rotational dynamics and pH dependence of the hydrogen exchange rates of the arglnine guanidlno group using NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR 1995, v. 6, 59-66.

58. Hernandez G., LeMaster D.M. Reduced temperature dependence of collective conformational opening in a hyperthermophile rubredoxin. Biochemistry, 2001, v. 40, 14384-14391.

59. Hinz H.R., Harris N.J., Giovanella B.C., Ezell E.L., Liehr J.G. Stabilities of 3H- and 2H-labelled camptothecins. J. Labelled Compd. Radiopharm., 1996, v. 38, 733 - 742.

60. Hunt J.F., McCrea P.D., Zaccai G., Engelman D.M. Assessment of the aggregation state of integral membrane proteins in reconstituted phospholipid vesicles using small angle neutron scattering. J. Mol. Biol., 1997, v. 273, 1004-1019.

61. Hvidt A., Nielsen S.O. Hydrogen exchange in proteins. Adv. Protein Chem., 1966, v. 21,287-386.

62. Ibel К. Comparison of neutron and X-ray scattering of dilute myoglobin solutions. J Mol Biol., 1975, v.95, 255

63. Itoh T.J. & Sato H. The effect of deutarium oxide (2Ii20) on the polymerization of tubulin in vitro. Biochim. Biophys Acta, 1984, v. 800, 21 -27

64. Jaenicke R. Do ultrastable proteins from hyperthermophiles have high or low conformational rigidity? Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, v. 97, 2962-2964

65. Joseph D., Petsko G.A., Karplus M Anatomy of a conformational change: hinged "lid" motion of the triosephosphate isomerase loop. Science, 1990, v. 249, 1425-1428

66. Karplus M., Petsko G.A. Molecular dynamics simulations in biology. Nature, 1990, v. 347, 631-639.

67. Katz J.J. The biology of heavy water Sci. Am., 1960, v. 203, 106-115.

68. Katz J.J. Chemical and biological study with deuterium. 39th Annual Priestly Lecture, Pennsylvania State University, University Park Pa., 1965, pp. 1 110

69. Katz J.J.& Crespi H.L. Deuterated organisms: cultivation and uses (Living organisms of unusual isotopic composition can be used for magnetic resonance studies).- Science, 1966, v.151, 1187-1194.

70. Kirkpatrick S., Gelatt C.D., Vecci M.P. Optimization by simulated annealing, 1983, v. 220, 671-680

71. Kossiakoff A. A. Protein dynamics investigated by the neutron diffraction-hydrogen exchange technique. Nature ,1982, v. 296, 713-721.

72. Kozin M. B. & Svergun D. I. Automated matching of high- and low-resolution structural models. J. Appl. Cryst., 2001, v. 34, 33-41

73. Kozin M. В., Volkov V.V., Svergun D.I. ASSA, a program for three-dimensional rendering in solution scattering from biopolymers J. Appl. Cryst., 1997, v.30, 811-815

74. Kresheck G.C., Schneider H., Scheraga H.A. The effect of D20 on the thermal stability of proteins. Thermodynamic parameters for the transfer of model compounds from H20 to D20. J. Phys. Chem., 1965, v. 60, 3132-3144

75. Kushner D.J. What is halophilic and what is archaeal? Proceedings of Workshop on Biology and Geochemistry of Hypersaline environments, Jerusalem, Israel, June 22- 26, 1997. CRC press, Boca Raton, Fla. pp. 215-225

76. Kushner D.J., Baker A., Dunstall T.G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds.- Can. J. Physiol. Pharmacol., 1999 vol. 77(2), 7988

77. Laissue J.A., Altermatt H.J., Bally E., Gebbers J.O. Protectionof mice from whole body gamma irradiation by deuteration of drinking water: hematologic findings. Exp. Hematol., 1987, v. 2, 177-189

78. Lamprecht J., Schroeter D., Paweletz N. Dearangement of microtubule arrays in interphase and mitotic PtK2 cells treated with deuterium oxide (heavy water). J. Cell Sci., 1991, v.98,463-473.

79. Landwall P.& Holme T. Removal of inhibitors of bacterial growth by dialysis culture. J.Gen.Microbiol., 1977, v.103, 345-352.

80. Larsen D.L., Grist K.L. A synthesis of partially deuterated cholesterol.- In: Neutron scattering for the analysis of biological structures. Brookhaven national laboratory, Upton, New York, 1976, V-3 V-ll.

81. Laskar P.A. & Mrtek R.G. Synthesis and biological activity of deuteriobenzyn-d7-penicillin. J. Pharm. Sci, 1970, v.59,1727-1731.

82. Lederer H., May R.P., Kjems J.K., Schaefer W.,Crespi H.L., Heumann H. Deuterium incorporation into Escherichia coli proteins. A neutron scattering study of DNA-depended RNA polymerase.-Eur.J.Biochem., 1986, v. 156, 655-659.

83. Lehnert U., Reat V., Weik M., Zaccai G., Pfister C. Thermal motions in bacteriorhodopsin at different hydration levels studied by neutron scattering: correlation with kinetics and light-induced conformational changes. Biophys J., 1998, v. 75, 19451952.

84. Liepins A. 1993 Patent US 5223269.

85. Liepinsh E., Otting G., Wuthrich K. NMR spectroscopy of hydroxyl protons in aqueous solutions of peptides and proteins. J. Biomol. NMR, 1992, v. 2, 447-465.

86. Linderstrom-Lang K.U. Deuterium exchange and protein structure. In: Symposium on Protein Structure. Edited by Neuberger A. London: Methuen; 1958, p. 23-34.

87. Loh S.N., Prehoda K.E., Wang J., Markley J.L. Hydrogen exchange in unligated and ligated staphylococcal nuclease. Biochemistry, 1993, v. 32, 11022-11028.

88. Mabic S. & Castagnoli N. Ragioselective synthesis of deuterated analogs of the neurotoxin MPTP. J. Labelled Compd. Radiopharm., 1996, v. 38, 255 - 262.

89. Madjar J.-J., Mishel S., Cozzone A.J., Reboud J.-P. A method to identify individual protein in four different two-dimensional gel-electrophoresis system: application to Escherichia coli ribosomal proteins. Anal.Biochem., 1979, v. 92,174 - 182.

90. Marsland D., Tilney L.G., Hirshfield M. Stabilizing effect of D20 on the microtubular componets and needle like form of heliozoan axopods: a pressure temperature analysis. -J. Cell. Physiol., 1971, v. 77, 187-194.

91. Massou S., Puech V., Talmont F., Demange P., Lindley N.D., Tropis M., Milon A. Heterologous expression of a deuterated membrane-integrated receptor and partial deuteration in methylotrophic yeasts. J. Biomol. NMR, 1999, v. 14, 231-239

92. May R.P., Nowotny V., Nowotny P., Voss H., Nierhaus K.H. Inter-protein distances within the large subunit from Escherichia coli ribosomes. EMBO J., 1992, v. 11, 373378.

93. Merk & Co., Inc. 1977. US Patent 4028405

94. Miller A.T. & van Alstyne H.M Heavy water: a distinctive and essential component of CANDU. Atomic Energy of Canada Ltd. Rep. 10962 , 1994.

95. Miller D.W., Dill K.A. A statistical-mechanical model for hydrogen exchange in globular proteins. Protein Sci., 1995, v. 4, 1860-1873.

96. Moore P.B. The preparation of deuterated ribosomal materials for neutron scattering.-Methods in Enzymology, 1979, v.LIX, part G, 639-655.

97. Moore P.B. Small-angle scattering. Information content and error analysis. J. Appl. Cryst., 1980, v. 13,168-175

98. Morgan W.D., Kragt A., Feeney J. Expression of deuterium-isotope-labelled protein in the yeast pichia pastoris for NMR studies. J. Biomol. NMR, 2000, v. 17, 337-347

99. Nona D.A., Blake M.I., Crespi H.L., Katz J.J. Effect of deuterium oxide on the culturing of Penicillium janczewskii. III. Antifungal activity of fully deuterated griseofulvin. J. Pharm. Sci., 1968, v. 57, 1993-1995

100. Northrop D.B. Deuterium and tritium kinretic isotope effects on initial rates. -Methods EnzymoL, 1982, v. 87, 607-625

101. Nowotny P., Nowotny V., Voss H., Nierhaus K.H. Preparation and activity mesurements of deuterated 5OS subunits for neutron scattering analysis.- Methods Enzymol., 1988, v. 164, 131-147.

102. Orban J., Alexander P., Bryan P. Hydrogen-deuterium exchange in the free and immunoglobin G-bound protein G B-domain. Biochemistry, 1994, v. 33, 5702-5710.

103. Perrett S., Clarke J., Hounslow A.M., Fersht A.R. Relationship between equilibrium amide proton exchange behavior and the folding pathway of barnase. Biochemistry, 1995, v. 34, 9288-9298.

104. Petrescu I., Lamotte-Brasseur J., Chessa J.P., Ntarima P., Claeyssens M., Devreese В., Marino G., Gerday C. Xylanase from the psychrophilic yeast Cryptococcus adeliae. -Extremophiles, 2000, v. 4, 137 144.

105. Press W.H., Teukolsky S.A., Wetterling W.T. Numerical Recipes. University Press, Cambridge, USA (1992), p. 973.

106. Proud'hon В., Pietrobon D., Hess P. Direct mesurement of proton transfer rates to a group controlling the dihydropyridine-sensitive Ca channel. Nature (London), 1987, v. 329, 243-246.

107. Rae H.K. Canada's heavy water story. In: Chemical engineering in Canada: a historical perspective. Canadian Society of Chemical Engineering, Ottawa, Ont., 1991, p. 334-361

108. Rasmussen B.F., Stock A.M., Ringe D., Petsko G.A. Crystalline ribonuclease A loses function below the dynamical transition at 220 K. Nature, 1992, v. 357, 423-424.

109. Richards F.M. Packing defects, cavities, volume fluctuations,and access to the interior of proteins, including some general comments on surface area and protein structure. -Carlsberg Res. Commun., 1979, v. 44,47-63.

110. Rogers M.A.J. & Snowden P.T. Lifetime of 02 in liquid water as determined by time-resolved infrared luminescence measurements. J. Am. Chem. Soc., 1982, v. 104, 5541 -5543.

111. Scheraga H. A. Deuterium exchange studies and protein structure.- Brookhaven Symp.Biol., 1970, v. 26, 71-88.

112. Scherm R. & Fak B. Neutrons. In: Neutron and synchrotron radiation for condensed matter studies. Volume I. Theory, Instruments and methods. Les editions de physique, Springer-Verlag, 1993, p. 113-143.

113. Schluenzen F., Tocilj A., Zarivach R, Harms J., Gluehmann M., Janell D., Bashan A., Bartels H., Agmon I., Franceschi F., Yonath A. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 angstroms resolution. Cell, 2000, v. 102, 615-623.

114. Shannon C.E. & Weaver W. The mathematical theory of communication. University of Illinois Press, Urbana, 1949.

115. Smith J.C. Protein dynamics: comparison of simulations with inelastic neutron scattering experiments. Q. Rev. Biophys., 1991, v. 24, 227-291.

116. Smith J. C., Cusack S., Brooks В., Pezzeca U., Karplus M. J. Chem. Phys., 1986, v. 85,3636

117. Smith J. Inelastic and quasi-elastic neutron scattering. In: Neutron and synchrotron radiation for condensed matter studies. Volume IV. Structure and Dynamics of Biomolecules. Les editions de physique, Springer-Verlag, 1999

118. Sosa-Peinado A., Mustafi D., Makinen M.W. Overexpression and biosynthetic deuterium enrichment of TEM-1 beta-lactamase for structural characterization by magnetic resonance methods. Protein Expr. Purif., 2000, v. 19, 235-245

119. Stuhrmann H.B. Interpretation of small-angle scattering functions of dilute solutions and gases. A representation of the structures related to a one-particle scattering function -Acta Cryst., 1970, v. A26, 297 306

120. Stuhrmann H.B. Macromolecules in dilute solutions. In: Neutron and synchrotron radiation for condensed matter studies. Volume III. Application to Soft Condenced Matter and Biology. Les editions de physique, Springer-Verlag, 1994, p.l 17 - 144.

121. Stuhrmann H.B., Schulz G.V., Kirste R.G. Conformational changes of sperm whale metmyoglobin during reversible denaturation in the 7 to 1 pH range. Z. Naturforsch В., 1969, v. 24, 1385-92.

122. Stuhrmann H.B., Haas J., Ibel K., Koch M.H.J., Crichton R.R. Low angle neutron scattering of ferritin studied by contrast variation. J.Mol.Biol., 1976, v.100, 399-413.

123. Svergun D.I. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria J. Appl. Cryst., 1992, v.25, 495 - 503

124. Svergun D.I. A direct indirect method of small-angle scattering data treatment J. Appl. Cryst., 1993, v.26, 258 - 267

125. Svergun D.I. Restoring three-dimensional structure of biopolymers from solution scattering J. Appl. Cryst., 1997, v. 30, 792 - 797

126. Svergun D.I Restoring low resolution structure of biological macromolecules from solution scattering using simulated annealing. Biophys. Journal, 1999,v. 76, 2879-2886

127. Svergun, D. I. Advanced solution scattering data analysis methods and their applications. J. Appl. Cryst., 2000, v. 33, 530-534

128. Svergun D.I. & Stuhrmann H.B. New developments in direct shape determination from small-angle scattering. 1. Theory and model calculations. Acta Crystallographica, 1991, v. A47, 736-744

129. Svergun D.I., Semenyuk V.A., Feigin L.A. Small-angle-scattering-data treatment by the regularization method. Acta Crystallographica, 1988, v. A44, 244 - 250

130. Svergun D., Barberato C., Koch M. H. J. CRYSOL a Program to Evaluate X-ray Solution Scattering of Biological Macromolecules from Atomic Coordinates. - J. Appl. Cryst., 1995, v. 28,768 -773

131. Svergun D.I., Volkov V.V., Kozin M.B., Stuhrmann H.B. New developments in direct shape determination from small-angle scattering. 2. Uniqueness - Acta Crystallographica, 1996, v. A52, 419-426

132. Svergun D.I., Volkov V.V., Kozin M.B., Stuhrmann H.B., Barberato C., Koch M. H. J. Shape determination from solution scattering of biopolymers J. Appl. Cryst., 1997c, v.30, 798 - 802

133. Teitelbaum H., Englander S.W. Open states in native polynucleotides. Hydrogen exchange study of cytosine containing double helices. J. Mol. Biol, 1975, v. 92, 55-78.

134. Teitelbaum H., Englander S.W. Open states in native polynucleotides. Hydrogen exchange study of adenine containing double helices. J. Mol. Biol., 1975b, v. 92, 79-92.

135. Thomson J.F. Biological effect of deuterium. Pergamon Press, Macmillan, New York, 1963.

136. Tsuzuki H., Harada Т., Mukumoto M., Mataka S., Tsukinoki Т., Kakinami Т., Nagano Y., Tashiro M. Ultrasound-assisted reduction of cyanides to deuterated aliphatic amines. -J. Labelled Compd. Radiopharm., 1996, v.38, 385-394.

137. Unno K. & Okada S. Deuteration causes the decreased induction of heat-shok proteins and increased sensitivity to heat denaturation of protein in Chlorella. Plant Cell Physiol., 1994, v. 35, 197-202

138. Unno К., Shimba S., Okada S. Modification of thermal response of Chlorella elipsoidea by deuteration. Chem. Pharm. Bull., 1989, v.37, 3047-3049

139. Urey H.C., Brickwedde F.G., Murphy G.M. A hydrogen isotope of mass 2. Phys. Rev., 1932, v. 39, 164

140. Utsumi H. & Elkind M.M. Caffeine and D20 medium interact in affecting the expression of radiation induced potentially lethal damage. Int. J. Radiact. Biol., 1991, v. 60, 647-655

141. Vasdev S., Gupta I.P., Sampson C.A., Longerich L., Parai S. Deuterium oxide normalizes blood pressure and elevated cytosolic calcium in rats with ethanol-induced hypertension. Can. J. Cardiol., 1993, v. 9, 802-808.

142. Vasdev S., Prabhakaran V.M., Whelan M., Ford C.A., Longerich L., Parai S. Fructose-induced hypertension, hypertriglyceridemia and elevated cytosolic calcium in rats: prevention by deuterium oxide. Artery, 1994, v. 21, 124-147.

143. Vasilescu V. & Katona E. Deuteration as a tool in investigating the role of water in the structure and function of exitable membranes. Methods Enzymol., 1986, v. 127, 662678.

144. Wagenknecht Т., Carazo J.M., Radermacher M., Frank J. Three-dimentional reconstruction of the ribosome from E.coli.-Biophis. J., 1989, v.55, 465-477.

145. Wallace S.A., Mathur J.N., Allen B.J. The influence of heavy water on boron requirements for neutron capture therapy. Med. Phys., 1995, v.22, 585-590.

146. Webb P. & Threadgill M.D. Labelled compouns of intrest as antiturmour agents. II (1). Synthesis of 2Hand 3H isotopomers of RSU 1069 and Ro 03-8799 (Pimonidazole) J. Labelled Compd.Radiopharm., 1990, v. 28, 257-264.

147. Willumeit R., Diedrich G., Forthmann S., Beckmann J., May R.P., Stuhrmann H.B., Nierhaus K.H. Mapping proteins of the 50S subunit from Escherichia coli ribosomes. -Biochim. Biophys. Acta, 2001, v. 1520, 7-20.

148. Woodward C.K., Simon I., Tuchsen E. Hydrogen exchange and the dynamic structure of proteins. -Mol. Cell. Biochem., 1982, v. 48, 135-160.

149. Zaccai G. Small angle neutron scattering.- In: Neutron and synchrotron radiation for condensed matter studies. Volume IV. Structure and Dynamics of Biomolecules. Les editions de physique, Springer-Verlag, 1999

150. Zaccai G. How soft is a protein? A protein dynamics force constant measured by neutron scattering. Science, 2000, v. 288, 1604-1607.

151. Zhang Y., Paterson Y., Roder H. Rapid amide proton exchange rates in peptides and proteins measured by solvent quenching and two-dimensional NMR. Protein Sci., 1995, v. 4, 804-814.